KR20100014869A

KR20100014869A - Ｃｘｃｒ3에 대한 인간화 항체

Info

Publication number: KR20100014869A
Application number: KR1020097017964A
Authority: KR
Inventors: 로저 스미스; 팔라니사미 카나카라즈; 빅토르 로쉬케
Original assignee: 테바 바이오파머수티컬스 유에스에이, 아이엔씨.
Priority date: 2007-02-01
Filing date: 2008-01-29
Publication date: 2010-02-11
Also published as: US20130274447A1; WO2008094942A2; CA2677163A1; CN101796073B; EP2115006A2; JP5371780B2; WO2008094942A8; US20100047238A1; US8435522B2; JP2010517531A; AU2008210589A1; CN101796073A; IL199974A0; WO2008094942A3; AU2008210589B2

Abstract

수용체 CXCR3에 특이적으로 결합하는 인간화 항체(humanized antibody)가 개시된다. 상기 인간화 항체는 길항제일 수 있고 CXCR3 기능과 연관된 상태를 치료 또는 진단하기 위해 이용될 수 있다.

인간화 항체, CXCR3, VH, VL, VK, 항원.

Description

ＣＸＣＲ3에 대한 인간화 항체{Humanized antibodies against CXCR3}

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 참조에 의해 그 개시가 전체로 본 명세서에 포함된, 2007년 2월 1일에 출원된 미국 임시출원 제60/898,709호에 기초하여 우선권을 주장한다.

케모카인(chemokine)과 그 수용체 간의 상호작용은 백혈구 이동(leukocyte)의 조절에서 중요한 단계이다. 케모카인은 또한 세포-관련 사이토카인 반응의 유도 및 강화를 포함한, 화학주성(chemotaxis)과 무관한 다양한 효과들을 매개한다.

인간 세포 표면 단백질 CD183은 IPlO(interferon-g-inducible 10 kDa protein), Mig(monokine induced by interferon-g) 및 I-TAC(interferon-inducible T cell a-chemoattractant)를 포함한 3개의 케모카인에 대한 선택성을 갖는 G 단백질-연결 수용체(G-protein-coupled receptor)이다. 이 3개의 케모카인은 하나의 아미노산 잔기가 4개의 고도로 보존된 Cys 잔기 중 최초 2개를 분리하는 것인, "CXC" 케모카인의 구조적 서브패밀리에 속한다. 역사적으로, CD183은 3번째로 발견된 CXC 케모카인 수용체이고, 따라서, CD183은 통상적으로 "CXCR3"으로 표시된다. 케모카인의 CXCR3으로의 결합이 백혈구 이동(leukocyte traffic)에 관여된 세포 반응, 가장 두드러지게는 인테그린 활성화, 세포골격 변화(cytoskeletal change) 및 화학주성 이동(chemotactic migration)을 유도한다. CXCR3은 작동/메모리(effector/memory) T 세포 및/또는 다양한 종류의 염증 조직(inflamed tissue)에 존재하는 T 세포(예를 들면, T-헬퍼 1 세포 또는 Th1 세포 및 CD8⁺ Tc1 세포) 상에서 발현된다. 또한, IPlO, Mig 및 I-TAC은 통상적으로 염증 병변에 있는 국소 세포(local cell)에 의해 생성되어, CXCR3과 그의 케모카인이 백혈구의 염증 부위로의 동원(recruitment)에 참여한다는 것을 시사한다. 따라서, CXCR3은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론씨병, 염증성 장 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환, 건선, 타입 1 당뇨병 및 이식 거부증과 같은, 다양한 염증성 및 면역 질환과 장애의 치료 및 진단에서 이용될 수 있는, 항체 및 길항제의 개발을 위한 표적이다. CXCR3은 B-세포 림프종의 아집단(subset)에서 발현되기 때문에, CXCR3은 또한 림프종 및 백혈병의 치료 및 진단을 위한 표적이 될 수 있다.

요약

케모카인 수용체 CXCR3(GenBank gi:4504099 참조)에 특이적으로 결합하는 항원-결합 폴리펩티드 분자(antigen-binding polypeptide)가 개시된다. 상기 폴리펩티드는 인간화 중쇄 가변 영역( humanized heavy chain variable region) 및 인간화 경쇄 가변 영역(humanized light chain variable region)을 포함한다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 프레임워크(FR) 영역을 포함하면서, 부모 단일클론 항체(parental monoclonal antibody)의 항원-결합 특이성을 유지할 수 있다. 인간화 중쇄 가변 영역 및/또는 인간화 경쇄 가변 영역은 CDR을 제외하고, 약 90% 이상 인간화된다(바람직하게는 약 95% 이상 인간화되고, 보다 바람직하게는 약 98% 이상 인간화되고, 훨씬 더 바람직하게는 약 100% 이상 인간화된다). 상기 항원-결합 폴리펩티드는 단일클론 항체 공여체(예를 들면, 마우스 단일클론 항체 공여체)로부터 유래될 수 있고 단일클론 항체(예를 들면, 마우스 단일클론 CDR)로부터 유래된 CDR을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 CXCR3 수용체에 대한 길항제로 기능할 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 항원-결합 폴리펩티드는 CXCR3에 특이적으로 결합하고, (a) (1) 아미노산 서열 (NYMAS)을 포함하는 CDR-Hl; (2) 아미노산 서열(TISSGGGYTYYPDSLKG)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 (HGAPMTTVITYAPYYF{D,Y}Y)을 포함하는 CDR-H3;을 포함하는 인간화 항체 중쇄 가변 영역; 및 (b) (1) 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열(YTSNLAP)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 (QQFTTSPYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 인간화 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 아미노산 서열 (HGAPMTTVITYAPYYFYY)을 포함하는 CDR-H3을 포함할 수 있다.

상기 폴리펩티드의 일부 구체예에서, (1) 상기 CDR-Hl은 아미노산 서열 (NYMAS)로 구성되고; (2) 상기 CDR-H2는 아미노산 서열 (TISSGGGYTYYPDSLKG)로 구성되며; (3) 상기 CDR-H3은 아미노산 서열(HGAPMTTVITYAPYYF{D,Y}Y)로 구성되고; (4) 상기 CDR-Ll은 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)로 구성되고; (5) 상기 CDR-L2는 아미노산 서열 (YTSNLAP)로 구성되며; 및 (6) 상기 CDR-L3은 아미노산 서열 (QQFTTSPYT)로 구성된다. 예를 들면, 상기 CDR-H3은 아미노산 서열 (HGAPMTTVIT YAPYYFYY)로 구성될 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는

의 인간화 항체 중쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는

의 인간화 항체 중쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 폴리펩티드는

의 인간화 항체 경쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는

또는

의 인간화 항체 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.

또한, 인간화 항체 중쇄 가변 영역이 개시된다. 상기 인간화 항체 중쇄 가변 영역은: (1) 아미노산 서열 ({N,S,Y}YAMS)을 포함하는 CDR-Hl; (2) 아미노산 서열 ({T,A,Y}I{S,Y}{S,G,T,Y}{G,S}{G,Y}G{F,S,Y}TYY{P,A}DS{L,Y,V}KG)를 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 {H,Y}{G,Y}{A,Y}PM{T,Y}T{V,Y}ITY{A,Y}PYYFYY)을 포함하는 CDR-H3을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인간화 항체 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 가질 수 있다.

또 다른 예에서, 인간화 항체 중쇄 가변 영역은: (l) 아미노산 서열 (NYAIS)을 포함하는 CDR-Hl; (2) 아미노산 서열 (TYSSGGVYTYYRDSLKG)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 (HGAAMTTVITYAPFYFYY)을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 예를 들면, 상기 인간화 항체 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 인간화 항체 중쇄 가변 영역은: (l) 아미노산 서열 (YYAMS)을 포함하는 CDR-Hl; (2) 아미노산 서열 (TIYSGGSYTFYPDSLEG)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 (HGAPMSTEITYAPYYFYY)을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 예를 들면, 상기 인간화 항체 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 인간화 항체 중쇄 가변 영역은 (l) 아미노산 서열 (NYAMS)을 포함하는 CDR-Hl; (2) 아미노산 서열 (TIYSGGGYTFYLDSLKG)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 (HSYPMTTVITYAPYYFYY)을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 예를 들면, 상기 인간화 항체 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을

포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 인간화 항체 중쇄 가변 영역은 (l) 아미노산 서열 (NYAMS)을 포함하는 CDR-Hl; (2) 아미노산 서열 (TISSGGGYTYYPDSLKG)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 (HGAPMTTVITYAPYYFYY)을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 예를 들면, 상기 인간화 항체 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 인간화 항체 중쇄 가변 영역은 (l)아미노산 서열 (NYAMS)을 포함하는 CDR-Hl; (2) 아미노산 서열 (TISSGGGYTYYPDSLKG)을 포함하는 CDR-H2; 및 (3) 아미노산 서열 (HGAPMTTVITYAPYYFYY)을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 예를 들면, 상기 인간화 항체 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함할 수 있다.

또한, 인간화 항체 경쇄 가변 영역이 개시된다. 상기 인간화 항체 경쇄 영역은 (1) 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)을 포함하는 CDR-Ll; (2) 아미노산 서열 (YTSNLAP)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 (QQFTTSPYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 (1) 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)을 포함하는 CDR-Ll; (2) 아미노산 서열 (YTSNLAP)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 (QQFTTSPYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 (1) 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)을 포함하는 CDR-Ll; (2) 아미노산 서열 (YTSNLAP)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 (YQFTTSPYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 (1) 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)을 포함하는 CDR-Ll; (2) 아미노산 서열 (YTSNLAP)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 (QQYTTSPYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 (1) 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)을 포함하는 CDR-Ll; (2) 아미노산 서열 (YTSNLAP)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 (QQFTTYPYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 (1) 아미노산 서열 (RAS{S,Q}SV{K,S}SY{(M,L}{Y,A})을 포함하는 CDR-Ll; (2) 아미노산 서열 ({Y,D}{T,A}SN{L,R}A{P,T})을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 (Q,Y}Q{F,Y}TT{S,Y}PYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 예를 들면, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 (1) 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 (YTSNLAP)을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 (QQFTTSPYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 예를 들면, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함할 수 있다.

또 다른 예에서, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 (1) 아미노산 서열 (RAS{S,Q}SV{K,S}SY{M,L}{Y,A})을 포함하는 CDR-L1; (2) 아미노산 서열 ({Y,D}{T,A}SN{L,R}A{P,T})을 포함하는 CDR-L2; 및 (3) 아미노산 서열 (Q,Y)Q{F,Y}TT{S,Y}PYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 예를 들면, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함할 수 있다.

전술된 인간화 중쇄 및 인간화 경쇄는 CXCR3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 폴리펩티드에 존재할 수 있다.

상기 항원 결합 폴리펩티드는 항체 분자, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, 및 scFv 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드는 항체 분자이다. 항체 분자는 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 포함하는 키메라 항체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 항체는 IgG 분자(예를 들면, IgGl 또는 IgG4 분자)일 수 있고, 상기에서 폴리펩티드는 IgG 분자의 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 scFv 분자일 수 있다. 예를 들면, 상기 scFv는 L은 리더 서열(leader sequence)이고; VH는 인간화 항체 중쇄 가변 영역이며; X는 연결 폴리펩티드(linking polypeptide)이고; VK는 인간화 항체 경쇄 가변영역인 것인 NH₂-L-VH-X-VK-COOH 및 NH₂-L-VK-X-VH-COOH로 구성된 군으로부터 선택된 식을 가질 수 있다.

상기 항원-결합 폴리펩티드는 또한 치료제 또는 진단제에 접합되거나 또는 융합될 수 있다. 예를 들면, 치료제는 세포독성제(cytotoxic agent), 방사성 표지, 면역조절제(immunomodulator), 호르몬, 효소, 올리고뉴클레오티드, 광활성 치료제(photoactive therapeutic agent), 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 진단제의 예는 방사성 표지, 광활성 진단제, 초음파-증강제(ultrasound-enhancing agent) 또는 비-방사성 표지(non-radioactive label)를 포함할 수 있다.

상기 항원-결합 폴리펩티드는 CXCR3의 길항제일 수 있다. 통상적으로, 상기 폴리펩티드는 CXCR3의 작용제(agonist)가 아니다.

상기 항원-결합 폴리펩티드는 특이성 및 높은 친화도로 CXCR3 수용체에 결합한다. 통상적으로, 상기 폴리펩티드는 약 10⁶M^-1이상의 친화도 상수(affinity constant)(바람직하게는 약 10⁷M^-1이상, 보다 바람직하게는 10⁸M^-1이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 10⁹M^-1 이상)로 CXCR3에 결합한다.

전술된 항원-결합 폴리펩티드 및 담체(예를 들면, 희석제 또는 부형제)를 포함하는 약제학적 조성물이 개시된다. 상기 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 바와 같은 추가적인 치료제 또는 진단제를 더 포함할 수 있다.

또한, 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 개시된 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질병 또는 상태를 치료 또는 진단하는 방법이 개시된다. 예를 들면, 상기 약제학적 조성물은 염증성 질환 또는 상태, 면역 질환 또는 상태, 및/또는 악성(malignant) 질환 및/또는 상태를 치료 또는 진단하기 위해 투여될 수 있다. 질병 및 상태의 예는 자가면역 질환(예를 들면, 루푸스), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 관절염(예를 들면, 류마티스 관절염), 다발성 경화증, 이식 거부증, 중추신경계 손상, 크론씨병(Crohn's disease), 건선, 타입 1 당뇨병 및 백혈병 또는 림프종(예를 들면, 만성 림프성 백혈병 (CLL))을 포함할 수 있다.

또한, 전술된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 개시된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 적합한 숙주 세포에서 상기 코딩된 폴리펩티드를 발현하기 위해 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 따라서, 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드를 제조하는 방법은: a) 코딩된 폴리펩티드를 발현하기 위해 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환된 세포를 배양하는 단계; 및 b) 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

바람직한 구체예의 상세한 설명

정의

본 명세서에 기재된 항체는 전장(full-length)(즉, 천연적으로 발생하는(naturally occuring) 또는 정상적인 면역글로불린 유전자 단편 재조합 방법에 의해 형성된) 면역글로불린 분자(예를 들면, IgG 항체) 또는 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인(즉, 특이적으로 결합하는) 부분, 예를 들면, 항체 단편을 의미한다.

항체 단편은 F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv, scFv 등과 같은 항체의 부분이다. 구조에 관계없이, 항체 단편은 완전한 항체(intact antibody)에 의해 인식되는 동일한 항원과 결합한다. 용어 "항체 단편(antibody fragment)"은 또한 복합체를 형성하기 위해 특정 항원에 결합하는 것에 의해 항체처럼 작용하는 합성 또는 유전적으로 조작된 단백질을 포함한다. 예를 들면, 항체 단편은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된 "Fv" 단편과 같은, 중쇄 영역으로 구성된 단리된 단편, 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 것인 재조합 단쇄(single chain) 폴리펩티드 분자("scFv 단백질"), 및 과가변 영역(hypervariable region)를 닮은 아미노산 잔기들로 구성된 최소 인식 단위(minimal recognition unit)를 포함한다.

인간화 항체(humanized antibody)는 하나의 종으로부터 유래된 항체, 예를 들면, 설치류 항체로부터의 CDR이 설치류 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 사슬로부터 인간 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 또는, 인간 중쇄 및 가변 도메인의 아미노산 서열의 적어도 일부를 포함하도록 돌연변이된("인간화 비율(percent humanization)"로 지칭됨) 인간 중쇄 및 가변 도메인으로 전달된 것인 재조합 단백질이다. 항체 분자의 불변 도메인(constant domain)은 인간 항체의 불변 도메인으로부터 유래될 수 있다.

본 명세서에서 사용된, "인간화 비율(percent humanization)"은 인간화 도메인과 생식계통 도메인(germline domain) 간의 프레임워크 아미노산 차이(즉, 비-CDR 차이)를 결정하고, 그 수치를 아미노산의 총 갯수로부터 차감하고, 이를 아미노산의 총 갯수로 나누고, 100을 곱하는 것에 의해 계산된다.

본 명세서에서 사용된, "CDR"은 항체 중쇄의 가변 도메인(VH) 또는 항체 경쇄의 가변 도메인(VL 또는 VK)에 존재하는 "상보성 결정 영역(complementarity determining region)"을 의미한다. 각 가변 도메인은 3개의 CDR을 포함하고, 중쇄 가변 도메인에 존재하는 것들은 CDR-Hl, CDR-H2, 및 CDR-H3로 표시되고, 경쇄 가변 도메인에 존재하는 것들은 CDR-Ll, CDR-L2, 및 CDR-L3으로 표시된다. 본 명세서에서 Kabat 번호매김(numbering) 체계가 이용된다. 따라서, CDR-Hl은 31번 아미노산에서 시작되고(즉, 최초 시스테인 잔기 후 약 9개의 잔기들), 약 5개 내지 7개의 아미노산을 포함하며, 다음 티로신 잔기에서 종료된다. CDR-H2는 CDR-H1의 종료 후 15번째 잔기로부터 시작되어 약 16개 내지 19개의 아미노산을 포함하고, 다음 아르기닌 또는 라이신 잔기에서 종료된다. CDR-H3은 CDR-H2의 종료 후 33번째 잔기로부터 시작되어 3개 내지 25개의 아미노산을 포함하고, X는 임의의 아미노산인 서열 W-G-X-G로 종료된다. CDR-Ll은 24번 아미노산에서 시작되고(즉, 시스테인 잔기 후), 약 10개 내지 17개의 아미노산을 포함하며, 다음 티로신 잔기에서 종료된다. CDR-L2는 CDR-L1의 종료 후 약 16번째 잔기로부터 시작되어 약 7개의 잔기를 포함한다. CDR-L3은 CDR-L2의 종료 후 약 33번째 잔기에서 시작되고, 약 7개 내지 11개의 잔기를 포함하고, X는 임의의 아미노산인 서열 F-G-X-G로 종료된다.

본 명세서에 개시된 항원-결합 폴리펩티드는 방사성 표지, 면역조절제, 호르몬, 광활성 치료제, 약물 또는 독소일 수 있는 세포독성제, 및 이들의 조합을 포함할 수 있는 치료제에 접합되거나 융합될 수 있다. 약물은 항유사분열제(antimitotic), 안티키나아제(antikinase), 알킬화제, 항대사산물(antimetabolite), 항생제(antibiotic), 알칼로이드, 혈관신생억제제( antiangiogenic), 세포자사제(apoptotic agent) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 약제학적 특성을 갖는 약물을 포함한다. 보다 구체적으로, 이 약물들은 질소 머스타드(nitrogen mustard), 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아, 트리아젠, 폴산 유사체(folic acid analog), COX-2 저해제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 항생제, 효소, 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin), 백금 배위 착체(platinum coordination complex), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 치환된 우레아, 메틸 히드라진 유도체, 아드레노코르티코이드 저해제(adrenocortical suppressant), 길항제, 엔도스타틴, 탁솔, 캄포테신, 안트라사이클린(anthracycline), 탁산, 및 이들의 유사체, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명에 의해 포괄되는 독소는 리신(ricin), 아브린(abrin), 알파 독소, 사포린(saporin), 리보뉴클레아제(RNase), 예를 들면, 온코나아제(onconase), DNase I, 스태필로콕코스 장독소-A(Staphylococcal enterotoxin-A), 포크위드 항바이러스 단백질(pokeweed antiviral protein), 겔로닌(gelonin), 디프테리아 독소, 슈도모나스 외독소, 및 슈도모나스 내독소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

면역조절제는 사이토카인, 줄기세포 성장 인자, 림프독소(lymphotoxin), 조혈 인자(hematopoietic factor), 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor, CSF), 인터페론(IFN), 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴(thrombopoietin) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 특히 유용한 것은 종양괴사인자(TNF)와 같은 림프독소, 인터루킨(IL)과 같은 조혈 인자(hematopoietic factor), 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF) 또는 과립구 대식구-콜로니 자극 인자(GM-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 또는 인터페론-감마와 같은 인터페론, 및 "S1 인자"로 지칭되는 것과 같은 줄기세포 성장 인자이다. 보다 구체적으로, 면역조절제는 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-IO, IL-12, IL-18, IL-21, 인터페론-감마, TNF-알파 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

본 명세서에 개시된 항원-결합 폴리펩티드는 진단제(diagnostic agent)에 접합되거나 또는 융합될 수 있다. 진단제는 광활성 진단제 또는 60 내지 4,000 keV의 에너지를 갖는 방사성 표지, 또는 비-방사성(nonradioactive) 표지를 포함할 수 있다. 방사성 표지는 바람직하게는 감마-방출 동위원소, 베타-방출 동위원소, 및 양전자-방출 동위원소(positron-emitting isotoe)이고, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹²³I, ¹²⁴1, ⁸⁶Y, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ^lllIn, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ^99mTc, ^94mTc, ¹⁸F, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ⁷⁶Br 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 진단제는 조영제(contrast agent), 예를 들면, 망간, 철, 또는 가돌리늄과 같은 조영제를 포함할 수 있다.

도 1은 마우스 항-CXCR3 mAb에 의한 125I-IP-10의 Th1 세포로의 결합의 저해 를 보여준다. Ab#l - 5D4A; Ab#2 - 8A5A; Ab#3 - 19G2; Ab#4 - V36E5A; Ab#5 - V44D7A; Ab#6 - 37B5A; Ab#7 - 21A4A; Ab#8 - V15F4A; Ab#9 - V3G6A; Ab#10 - 23E12A; Ab#l 1 - 35C4; Ab#12 - 39E10.

도 2는 마우스 항-CXCR3 mAb에 의한 IP-10-유도 Th1 세포 이동의 저해를 보여준다. Ab#l - 5D4A; Ab#2 - 8A5A; Ab#3 - 19G2; Ab#4 - V36E5A; Ab#5 - V44D7A; Ab#6 - 37B5A; Ab#7 - 21A4A; Ab#8 - V15F4A; Ab#9 - V3G6A; Ab#10 - 23E12A.

도 3은 Th1 세포(상부 패널), CXCR3+/NSO 세포(중간 패널), 및 CXCR-/NSO 세포(하부 패널)로의 마우스 항-CXCR3 mAb의 FACS 분석을 보여준다.

도 4는 마우스 항-CXCR3 mAb 및 인간화 항-CXCR3 mAb에 의한 케모카인(chemokine)의 CXCR3으로의 결합의 저해를 보여준다.

도 5는 마우스 항-CXCR3 mAb 및 인간화 항-CXCR3 mAb에 의한 케모카인 매개 화학주성의 저해를 보여준다.

도 6은 5개의 항-CXCR3 클론의 VH 도메인의 정렬을 보여준다.

도 7은 5개의 항-CXCR3 클론의 VK 도메인의 정렬을 보여준다.

도 8은 항-CXCR3 클론 V44D7의 VH 도메인과 가장 근접하게 발현된 인간 IgG 및 생식계통(germline) VH의 정렬을 보여준다.

도 9는 항-CXCR3 클론 V44D7의 VH 도메인의 완전한 인간화를 위해 요구되는 아미노산 서열 변화의 위험 평가를 보여준다. 요구되는 아미노산 변화는 하기에 주요 서열로 표시되고 인간 VH3-23으로의 정렬로부터 유래되었다. 생식계통 유전자 및 발현된 항체는 GenBank accession no. AAD53829로 기재된다.

도 10은 항-CXCR3 클론 V44D7의 VH 도메인의 완전한 인간화를 위해 요구되는 아미노산 서열 변화의 위험 평가를 보여준다. 요구되는 아미노산 변화는 하기에 주요 서열로 표시되고 인간 VH3-23으로의 정렬로부터 유래되었다. 생식계통 유전자 및 발현된 항체는 GenBank accession no. AAD53829로 기재된다.

도 11은 항-CXCR3 클론 V3G6의 VK 도메인과 가장 근접하게 발현된 인간 IgG와 생식계통 VK의 정렬을 보여준다.

도 12는 항-CXCR3 클론 V3G6의 VK 도메인의 완전한 인간화를 위해 요구되는 아미노산 변화의 위험 평가를 보여준다.

도 13은 상업용 CXCR3mAb에 의한 마우스 CXCR3mAb의 CSCR3⁺ NSO 세포로의 결합의 저해를 보여준다. 약 0.5nM Eu-CXCR3mAb가 비표지(unlabeled) 상업용 CXCRmAb의 다양한 농도의 존재 하에 CXCR3에 의해 형질감염된 NSO 세포와 인큐베이션되었다. Eu-CXCR3mAb의 CXCR3⁺ NSO 세포로의 결합의 투여량-의존적 저해가 관찰되었다.

도 14는 Th1 세포 상에서 CXCR3의 발현을 보여준다. Th1 및 Th2 세포는 제대혈로부터 생성되었고, CXCR3 및 CCR4 발현은 FACS에 의해 결정하였다. CXCR3은 Th1 세포에만 존재했다.

도 15는 ¹²⁵I-CXCLlO 결합 분석법을 보여준다. Th1 세포를 다양한 농도의 CXCRmAb의 부재 또는 존재 하에 96-웰 플레이트에서 ¹²⁵I-CXCLlO과 인큐베이션하였다. 세포 결합(cell-bound) ¹²⁵I-CXCLlO을 오일 컬럼에 의해 유리 방사성(free radioactivity)으로부터 분리하고 감마 카운터(gamma copunter)로 카운팅하였다. Prizm 소프트웨어를 이용하여 IC₅₀ 값을 계산하였다. 주요한 후보는 녹색으로 표시하였다.

도 16은 ¹²⁵I-CXCLlO 결합 분석법을 보여준다. Th1 세포를 다양한 농도의 CXCRmAb의 부재 또는 존재 하에 96-웰 플레이트에서 ¹²⁵I-CXCLlO와 인큐베이션하였다. 세포 결합 ¹²⁵I-CXCLlO을 오일 컬럼에 의해 유리 방사성으로부터 분리하고 감마 카운터로 카운팅하였다. Prizm 소프트웨어를 이용하여 IC₅₀ 값을 계산하였다. 주요한 후보는 녹색으로 표시하였다.

도 17은 Eu-CXCR3mAb의 Th1 세포로의 결합을 보여준다. Th1 세포들을 10배 과량의 비표지 CXCR3mAb의 부재 또는 존재 하에 증가되는 농도의 Eu-CXCR3mAb와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션(실온에서 1시간) 후에, 세포에 결합된 Eu-CXCR3mAb를 3회 세척하는 것에 의해 유리 상태의 유로피움(Europium)으로부터 분리하고 Vctor2 형광 광도계(fluorometer)를 이용하여 플레이트를 판독하였다.

도 18은 CXCR3mAb 하이브리도마 상층액에 의한 ¹²⁵I-CXCLl1의 Th1으로의 결합의 저해를 보여준다. Th1 세포들을 96 웰 플레이트에서 다양한 CXCRmAb 하이브리도마 상층액의 부재 또는 존재 하에 실온에서 1시간 동안 ¹²⁵I-CXCLl1과 인큐베이션시켰다. 세포 결합 ¹²⁵I-리간드를 오일 컬럼에 의해 유리 상태의 방사성활성(free radioactivity)으로부터 분리하고 감마 카운터로 계측하였다. 추가적인 개발을 위해 CXCLl1의 Th1 세포로의 결합을 저해한 7개의 하이브리도마 상층액을 선택하였다.

도 19는 CXCR3mAb 하이브리도마 상층액에 의한 ¹²⁵I-CXCLl0의 Th1으로의 결합의 저해를 보여준다. Th1 세포들을 96 웰 플레이트에서 다양한 CXCRmAb 하이브리도마 상층액의 부재 또는 존재 하에 ¹²⁵I-CXCLl0과 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포 결합 ¹²⁵I-리간드를 오일 컬럼에 의해 유리 상태의 방사성활성으로부터 분리하고 감마 카운터로 계측하였다. 추가적인 개발을 위해 CXCLl0의 Th1 세포로의 결합을 저해한 7개의 하이브리도마 상층액을 선택하였다.

도 20은 마우스 CXCR3mAb가 랫트 Th1 세포와 교차반응하지 않는다는 것을 보여준다. 마우스 CXCR3mAb의 분극된(polarized) 랫트 Th1 세포에 대한 반응성을 결정하기 위해 FACS 분석을 수행하였따. 토끼 항-마우스 CXCR3 Ab만 랫트 Th1 세포에 결합했다. 마우스 항-인간 CXCR3Ab는 랫트 Th1 세포에 결합하지 않았다. 대조군으로서, 마우스 항-CXCR3mAb의 인간 Th1 세포로의 결합이 도시된다(하단 패널).

도 21은 인간화 CXCR3Ab에 의한 Eu-CXCR3mAb 저해를 보여준다. Th1 세포들을 다양한 농도의 인간화 CXCRmAb의 부재 또는 존재 하에 96 웰 플레이트에서 Eu-CXCR3mAb와 인큐베이션시켰다. 인큐베이션(실온에서 1시간) 후에, 세포 결합 Eu-CXCR3mAb를 3회 세척하는 것에 의해 유리 상태의 유로피움으로부터 분리하고 Vctor2 형광 광도계를 이용하여 플레이트를 판독하였다. Prizm 소프트웨어를 이용 하여 IC₅₀ 값을 계산하였다. Ab1는 IgGl 백본에 인간화 항-CXCR3 V44D7 VH Lead #5 아미노산의 중쇄 서열과 인간화 항-CXCR3 V44D7 VK Lead #1 아미노산(비공식 서열 목록 참조)의 경쇄 서열을 갖는다. Ab2는 IgGl 백본에 인간화 항-CXCR3 V44D7 VH Lead #5의 중쇄 서열과 인간화 항-CXCR3 V44D7 VK Lead #7의 경쇄 서열(비공식 서열 목록 참조)을 갖는다. 인간화 Ab(IgG4)는 IgG4 백본에 인간화 항-CXCR3 V44D7 VH Lead #5의 중쇄 서열과 본래의 마우스 항-CXCR3 V44D7 VK의 경쇄 서열을 갖는다.

도 22는 인간화 CXCR3Ab에 의한 Eu-CXCLlO의 억제를 보여준다. Th1 세포를 다양한 농도의 인간화 CXCRmAb의 부재 또는 존재 하에 96-웰 플레이트에서 Eu-CXCLlO과 인큐베이션시켰다. 인큐베이션(실온에서 1시간) 후에, 세포 결합 Eu-CXCLlO을 3회 세척하는 것에 의해 유리 유로피움으로부터 분리하고 Vctor2 형광 분석기를 이용하여 상기 플레이트를 판독하였다. Prizm 소프트웨어를 이용하여 IC₅₀ 값을 계산하였다.

도 23은 인간화 CXCR3Ab에 의한 CXCLIO-유도 Th1 세포 화학주성의 억제를 보여준다. ChemoTx 96-웰 플레이트(Neuro Probe, Inc)에서 화학주성 분석을 수행하였다. 하단 웰(bottom well)에 약 29 ㎕의 CXCLlO 또는 완충액 대조군을 첨가하였다. 다양한 농도의 인간화 항체의 부재 또는 존재 하에 25 ㎕의 Th1 세포 현탁액을 직접 필터의 웰에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 인큐베이션 후, 세포 역가 glo(cell titer glo) 방법(Promega)에 의해, 하부 웰로 이동한 세포들을 측정하였다.

도 24는 Th1 세포에서 Ca⁺⁺ 흐름의 분석을 보여준다. Th1 세포에 Fluo-4,AM (Molecular Probes)를 부하하고 표시된 바와 같은 다양한 마우스 CXCR3mAb 항체로 자극하였다. FLIPR에 의해 세포내 Ca⁺⁺의 증가를 결정하였다.

하이브리도마 기술을 이용한 마우스 IgG ₁ ,k CXCR-3 결합 항체의 분리

BALB/c 마우스를 CXCR-3을 발현하는 NSO 세포로 면역화시켰다. 통상적인 절차로, 50㎕의 RIBI 아쥬반트(Sigma) 중의 5X10⁶개의 세포를 뒷발바닥(rear footpad)에 주사하였다(발바닥당 25㎕). 2주 간격으로 RIBI 아쥬반트에 의한 2회의 추가적인 주사 후에 뒤이어 PBS 중의 최종 추가 접종(final boost)을 수행하였다. 3일 후에, 마우스를 희생시키고, 그들의 오금 림프절(poplietal lymph node)을 수집하고 융합을 위해 림프구를 분리하였다. PEG/DMSO (Sigma)를 융합제(fusion agent)로 이용하여, 림프구를 5:1의 비로 P3X63Ag8.653 형질세포종 세포와 융합시켰다. 융합 세포들을 선택적 HAT 배지에 재현탁시키고 96 웰 플레이트의 웰 당 10⁶개의 세포로 접종하였다. HAT 선택에서 생존한 하이브리도마부터의 상층액을 대상으로 ELISA에 의해 마우스 IgG의 존재에 대해 스크리닝을 수행하였다. IgG 생성 하이브리도마를 확인하고 그들의 상층액을 CXCR3 발현 NSO 세포(CXCR3⁺NSO)에 결합하는 항체에 대해 FACS에 의해 더 스크리닝하였다. 그 후, CXCR3 특이적 클론을 식별하기 위해, CXCR3⁺NSO 세포 결합에 대해 양성으로 확인된 하이브리도마를 대상으로 CXCR3⁺NSO와 PC-NSO(벡터 대조군) 세포로의 차등적 결합에 대해 스크리닝을 수행하였다. CXCR3 특이적 하이브리도마를 제한 희석(limiting dilution)에 의해 2회 서브클로닝하였다. 하이브리도마 서브클론을 무혈청 배지에서 확장시키고, 유력 후보(lead candidate)를 선별하기 위해 프로테인-A 컬럼 상에서 항체를 정제하고 특성을 더 규명하였다.

인간화 전략(Humanization Strategy)

항-CXCR3 항체의 인간화의 하나의 목표는 90-100%의 본래의 결합 친화도 및 특이성을 유지하는 60-80% 인간화 VH 및 VK 도메인을 수득하는 것이었다. 결합 친화도 및 특이성을 유지하면서 항체를 더 인간화하기 위해 VH 및 VK의 개별적인 고 위험 위치(high risk position)의 부위-지향성 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)을 이용하였다.

CDR 그래프팅(grafting) 및 구조 기반 분석 및 가변 영역 리서페이싱(variable region resurfacing)에 의해 인간화를 수행하였다. (Jones et al, NATURE (1986) May 29-Jun. 4;321(6069):522-5; Roguska et al, PROTEIN ENGINEERING, 1996, 9(10):895-904; 및 Xoma, Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3-D Structure. PROTEIN ENGINEERING, 1994, Vol.7, pg 805 참조). 1차 항체 서열 및 3-D 구조 데이터를 이용하여 결합 친화도 및 특이 성을 유지하기 위해 필요한 주요한 프레임워크 잔기들을 확인하였다. 9개의 상이한 Fab 및 IgG 분자들의 3-D 구조를 분석하였다(리간드의 존재 또는 부재 하에, 인간 및 마우스). 마우스 항-CXCR3 V44 VH 및 VK를 가장 근접한 인간 생식계통 유전자(germline gene)에 정렬시킨 후에, 결합 및 면역원성에 대한 잠재적인 영향에 대해 각 위치의 아미노산을 평가하였다. 이 정보를 이용하여 각 위치에서의 돌연변이에 대해 저 위험(low risk), 중 위험(moderate risk), 또는 고 위험(high risk)을 할당하였다. 전반적으로, 고 위험 위치를 피하면서, 저 위험 위치 및 중 위험 위치들만 돌연변이시켰다.

이 과정 후에 중쇄는 마우스 중쇄(CDR 제외) 대비 98% 인간화되었다. 그 후, Y115D 치환을 포함한, CDR3의 각 위치에서 일대일로(pairwise)티로신을 내포시키는 것에 의해, 친화도 성숙 전략(affinity maturatio strategy)을 수행하였고, 이는 평균적으로 친화도의 2배 증가를 가져왔다. 2개의 유력 후보에서 이용되었던 중쇄는 97번 및 98번 위치에 2개의 추가적인 돌연변이를 포함하여, CDR을 제외하고는 100% 인간화되었다. 경쇄에 대한 동일한 전략에 따라, VK를 A14 생식계통 유전자에 정렬시키고 저 위험 및 중 위험 위치들을 돌연변이시켰다. 이 생식계통 유전자가 정상적인 인간에서 드물게 발현되는 것으로 보인다는 것을 결정한 후에, L6 생식계통을 주형(template)으로 이용하여 상기 과정을 반복하였다.

NCBI에 의해 후원되는 "Blast for Ig sequences" 웹사이트를 이용하여 본 연구에서 이용된 마우스 VH 및 VK 영역에 가장 근접한 정합(match)을 식별하였다. MRC의 V-base 웹사이트(V-base website)를 이용하여 인간 생식계통 서열을 확인하 였다.

인간 생식계통 VH와 VK 유전자가 마우스 서열 VH 및 VK 서열에 대해 최적 정합(best match)으로 선택되었다. 마우스 VH 서열의 경우, 인간 생식계통 서열 VH3-23 (V-base에 표시됨)이 최적 정합으로 확인되었다: VH3-23 생식계통

마우스 VK 서열의 경우, 인간 생식계통 서열 Al4 및 L6(V-base에 표시됨)이 최적 정합으로 확인되었다: L6 생식계통

; 및 A14 생식계통

하이브리도마 세포주로부터 마우스 항-CXCR3 VH 및 VK 도메인의 클로닝 및 서열결정

하이브리도마 세포를 펠렛화시키고 PBS로 3회 세척하고 제조사의 프로토콜에 따라 트리졸(Trizol) 시약(Invitrogen, Cat. No. 15596-026)을 이용하여 RNA를 추출하였다. 제조사의 프로토콜에 따라, 5' RACE 키트(Rapid Amplification of cDNA Ends, Invitrogen, Cat. No. 18374-058)를 이용하여, 전체 RNA를 cDNA로 전환시켰다. 요약하면, RNA를 랜덤 헥사머 프라이머(random hexamer primer), Random N6에 라이게이션시키고 superscript II RNAase H 음성 역전사 효소를 이용하여 제1 가닥 cDNA를 생성하였다. 상기 키트에 제공된 GlassMax 스핀 카트리지를 이용하여 cDNA를 정제하고 상기 cDNA를 5' 말단에 C 염기쌍을 추가하기 위해 dCTP의 존재 하에 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase)와 반응시켰다. dC-테일 cDNA(dC-tailed cDNA)를 상기 dC 테일에 대해 특이적인 고정 프라이머(anchor primer) 및 VH에 대한 마우스 불변 중쇄 1(CH1) 및 VK에 대한 불변 카파(CK)의 고도로 보존된 DNA 서열에 혼성화되는 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시켰다. 결과물인 PCR 산물을 온전한 VH 또는 VK 도메인에 상응하는 정확한 크기에 대해 전기영동에 의해 분석하고 정제하고 제조사의 프로토콜에 따라 Topo TA 벡터(Invitrogen Cat. No. 45-0071)에 라이게이션시켰다. 세균으로 형질전환 후에, 정확한 크기의 삽입물을 포함하는 클론으로부터 DNA를 준비하고 제조사의 프로토콜에 따라 Big Dye 종결자 서열결정 반응 믹스(Applied Biosystems, Part No. 4336699) 및 3700 ABI/Prism DNA 분석기를 이용하여 DNA 서열을 결정하였다.

마우스 항-CXCR3 항체의 인간화

먼저, 전술된 바와 같이 생성된 결합 데이터 및 서열 데이터에 근거하여, 단일 유력 마우스(lead murine) 항-CXCR3 항체, V44D7을 확인하였다. 이 항체로부터의 VH 및 VK 도메인의 아미노산 서열을 현재 이용가능한 공개 데이터베이스(즉 NCBI의 Blast for IgG 및 MRC의 V-base)를 이용하여 모든 공지된 인간 생식계통 VH 및 VK 도메인에 정렬시켰다. 프레임워크 영역 내의 정렬에 초점을 맞추어, 높은 상 동성의(highly homologous) 인간 생식계통 VH 도메인, VH3-23, 및 두 개의 상이한 인간 생식계통 VK 도메인, A14 및 L6을 확인하였다. 마우스 서열이 상기 인간 생식계통과 상이한 프레임워크 내의 위치들에서, 반복적 과정(iterative process)을 이용하여 마우스 프레임워크를 전환시키거나 또는 돌연변이시켜서 마우스 서열을 상응하는 인간 생식계통 프레임워크에 정합시켰다. 또한, VH 및 VK의 CDR3에서 특정 잔기들을 티로신에 의한 교체에 의해 돌연변이시켜서(즉, 친화도를 성숙시켜서) 잠재적으로 프레임워크 잔기 변화에 따른 친화도 상실을 보완하였다. 중첩되는 합성 DNA 올리고뉴클레오티드의 패널을 이용한 중합효소 연쇄 반응 방법에 의해 친화도 성숙되고 인간화된 마우스 VH 및 VK 도메인을 생성하였다. 합성 유전자 설계 과정의 일부로, 코돈 최적화 전략(codon optimization strategy)을 이용하였고, 즉, 유전자 발현을 위해 포유동물 세포에 의해 우선적으로 이용되는 각 아미노산에 대한 트리플렛 코드를 각 위치에 내포시켰다. 합성 VH 및 VK 도메인을 상응하는 도메인이 완전한 인간 IgG1, G4, 또는 카파 항체 백본에서 발현될 수 있게 하는 특화된 포유동물 발현 벡터로 클로닝시켰다. 제조사의 프로토콜에 따라 IgG1 또는 G4 구조물(construct)과 카파 구조물을 리포펙타민(Invitrogen)에 의해 293F 세포 내로 동시-형질감염(co-transfection)시켜 인간화 항체의 소규모 생산을 달성하였다. 일시적 형질감염(transient transfection)으로부터의 상층액을 프로테인 A 또는 G 수지를 통해 통과시키고 IgG를 세포 기반 분석(cell based assay)에서의 테스팅을 위한 균질도(homogeneity)까지 정제하였다.

에피토프 경쟁 연구

유로피움(Europium, Eu) 표지-마우스 CXCR3mAb를 이용하여 다양한 상업적 CXCR3mAb를 경쟁적 결합 분석에서 테스트하였다. 다양한 상업적 출처로부터의 CXCR3mAb는 Eu-CXCR3mAb의 CXCR3으로의 결합을 저해했다. 이 데이터는 마우스 CXCR3mAb 및 상업적 항체들이 CXCR3 상의 중첩되는 에피토프(overlapping epitope)에 결합한다는 것을 나타낸다(도 13).

항체 친화도

하기를 포함한, ¹²⁵I- 및 Eu-표지 케모카인 및 Eu-표지 CXCR3mAb 및 Th1 화학주성 분석법을 이용한 다양한 경쟁적 결합 분석법에 의해 마우스 및 인간화 CXCR3mAb의 결합 친화도 및 활성을 결정하였다: ¹²⁵I-CXCLlO 결합 분석법; ¹²⁵I-CXCLl1 결합 분석법; Eu-CXCLlO 결합 분석법; Th1 화학주성 분석법; 및 Eu-마우스 CXCR3mAb 결합 분석법.

Th1 세포

모든 결합 분석법에서 제대혈로부터 생성된 일차 Th1 세포를 이용하였다. 문헌에 개시된 바와 같이, FACS 분석에서 CXCR3 발현이 Th1 세포 상에서만 관찰되었고, Th2 세포 상에서는 관찰되지 않았다(도 14). Th2 세포는 특이적으로 CCR4를 발현했다.

¹²⁵ I-CXCL10 및 ¹²⁵ I-CXCL11 결합 분석법

방사성표지된 CXCL10 및 CXCL11의 Th1 세포로의 결합을 저해하는 능력에 근거하여 마우스 CXCR3mAb 항체의 결합 친화도를 결정하였다(도 15, 16, 18, 및 19, 및 표 1). 이 결합 연구 및 화학주성 분석법에 근거하여, 이 마우스 CXCRmAb를 추가적인 연구를 위해 선택하였다.

표 1. 항-CXCR3 mAb의 특성 규명

Ab#l - 5D4A; Ab#2 - 8A5A; Ab#3 - 19G2; Ab#4 - V36E5A; Ab#5 - V44D7A; [0076] Ab#6 - 37B5A; Ab#7 - 21A4A; Ab#8 - V15F4A; Ab#9 - V3G6A; Ab#10 - 23E12A; Ab#l 1 - 35C4; Ab#12 - 39E10.

Eu-CXCRmAb 포화 결합 분석법(saturation binding assay)

유로피움 표지된 마우스 CXCR3 항체를 이용한 직접적인 포화 결합 분석법(direct saturation binding assay)에 의해 마우스 CXCR3 항체의 CXCR3으로의 결합 친화도를 결정하였다. 하나의 마우스 CXCR3mAb를 이용한 이 분석법의 예가 도 17에 도시된다. 이 연구로부터의 데이터는 Eu-CXCR3mAb의 CXCR3으로의 결합이 특이적이고 1 나노몰 미만(subnanomolar)의 Kd(0.47 nM)의 결합 친화도로 포화가능하다는 것을 보여주었다.

항체 특이성

Eu-이차 항체 (DELFIA)를 이용한 CXCR3⁺ 및 CXCR3-NSO 막에 의한 차별적 스크리닝 분석법(differential screening assay)에 의해 마우스 항체 하이브리도마(20000)를 스크리닝하였다. CXCR3⁺ 막에 결합한 항체(~2000)를 CXCR3⁺/CXCR3^-NSO 및 Th1 세포를 이용하여 FACS에 의해 더 테스트하였다. CXCR3mAb의 CXCR3 발현 세포로의 특이적 결합의 예가 도 3에 도시된다.

종 교차 반응성(Species Cross Reactivity)

FACS에 의해 부모 마우스(parental mouse) CXCR3mAb를 분극화된 랫트 Th1 세포로의 결합에 대해 테스트하였다. 토끼 항-마우스 CXCR3 Ab(양성 대조군)만이 랫 트 Th1 세포에 결합했다. 도 20에 도시된 바와 같이, 마우스 부모 CXCR3mAb는 랫트 Th1 세포에 결합하지 않았다.

생물학적 활성

결합 분석법: CXCR3mAb는 ¹²⁵I-표지 IP-10 및 -I-Tac의 일차 Th1 세포로의 결합을 특이적으로 억제했다. 표지된 Mig를 이용할 수 없었기 때문에, Mig는 결합 분석법에서 테스트되지 않았다. 화학주성 분석법: CXCR3mAb는 CXCR3 케모카인에 의해 매개되는 Th1 세포 이동을 억제했다.

결합 분석법 및 화학주성 분석법에 의해 인간화 항체를 테스트하였다. Eu-CXCRmAb 경쟁적 결합 분석법의 결과가 도 21에 도시된다. Eu-CXCLlO 결합 분석법의 결과가 도 22에 도시된다. Th1 화학주성 분석법의 결과가 도 23에 도시된다.

CXCR3 수용체의 촉진(agonism)에 대해 테스트된 마우스 항체

Th1 세포에서 Ca 동원(mobilization)을 유도하는데 있어서의 촉진적 활성(agonistic activity)에 대해 마우스 CXCR3mAb를 테스트하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, Ca⁺⁺ 흐름(flux)의 유도에서 작용제 활성을 보이는 항체는 없었다.

표 2. 결합 및 화학주성 분석법으로부터 결정된 상이한 인간화 항체의 IC_5O 값

표 2에서, Ab1은 IgG1 백본에 인간화 항-CXCR3 V44D7 VH Lead #5 아미노산의 중쇄 서열과 인간화 항-CXCR3 V44D7 VK Lead #1의 경쇄 서열을 갖는다(비공식 서열목록 참조). Ab2는 IgG1 백본에 인간화 항-CXCR3 V44D7 VH Lead #5의 중쇄 서열과 인간화 항-CXCR3 V44D7 VK Lead #7의 경쇄 서열을 갖는다(비공식 서열목록 참조). Ab3은 IgG1 백본에 인간화 항-CXCR3 V44D7 VH Lead #5 아미노산의 중쇄 서열과 인간화 항-CXCR3 V44D7 VK Lead #2의 경쇄 서열을 갖는다(비공식 서열목록 참조). Ab4는 IgG1 백본에 인간화 항-CXCR3 V44D7 VH Lead #5의 중쇄 서열과 인간화 항-CXCR3 V44D7 VK Lead #3의 경쇄 서열을 갖는다(비공식 서열목록 참조). Ab5는 IgG1 백본에 인간화 항-CXCR3 V44D7 VH Lead #5 아미노산의 중쇄 서열과 인간화 항- CXCR3 V44D7 VK Lead #4의 경쇄 서열을 갖는다(비공식 서열목록 참조). Ab6은 IgG1 백본에 인간화 항-CXCR3 V44D7 VH Lead #5 아미노산의 중쇄 서열과 인간화 항-CXCR3 V44D7 VK Lead #5의 경쇄 서열을 갖는다(비공식 서열목록 참조).

SEQUENCE LISTING <110> COGENESYS, INC. <120> HUMANIZED ANTIBODIES AGAINST CXCR3 <130> 075977-0193 <140> PCT/US08/052356 <141> 2008-01-29 <150> 60/898,709 <151> 2007-02-01 <160> 84 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Asn Tyr Met Ala Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Leu Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Asp or Tyr <400> 3 His Gly Ala Pro Met Thr Thr Val Ile Thr Tyr Ala Pro Tyr Tyr Phe 1 5 10 15 Xaa Tyr <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Arg Ala Ser Ser Ser Val Lys Tyr Met Tyr 1 5 10 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 9 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 35 40 45 Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Leu Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys His Gly Ala Pro Met Thr Thr Val Ile Thr Tyr Ala Pro Tyr Tyr 100 105 110 Phe Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Ile or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Thr, Phe or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Leu or Met <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Leu, Ala or Val <220> <221> 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Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 His Ser Tyr Pro Met Thr Thr Val Ile Thr Tyr Ala Pro Tyr Tyr Phe 1 5 10 15 Tyr Tyr <210> 28 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 28 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Tyr Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Phe Tyr Leu Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys His Ser Tyr Pro Met Thr Thr Val Ile Thr Tyr Ala Pro Tyr 100 105 110 Tyr Phe Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 29 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 29 Glu Val Gln 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Lys Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Thr Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Ser or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Lys or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Met or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Tyr or Ala <400> 37 Arg Ala Ser Xaa Ser Val Xaa Ser Tyr Xaa Xaa 1 5 10 <210> 38 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Glu or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Asn or Val <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Leu or Met <220> <221> MOD_RES <222> (46)..(46) <223> Trp or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(48) <223> Tyr or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> Asn or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (70)..(70) <223> Tyr or Phe <220> <221> MOD_RES <222> (88)..(88) <223> Gln or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (90)..(90) <223> Phe or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (93)..(93) <223> Ser or Tyr <400> 41 Xaa Xaa Val Xaa Thr Gln Ser Pro Ala Phe Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Lys Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Lys Leu Xaa Ile Xaa 35 40 45 Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Xaa Asp Xaa Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Xaa Gln Xaa Thr 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cttattactg ccagcagttt actacttccc cgtacacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaacg g 321 <210> 54 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 54 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Lys Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Thr Ser Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 55 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (91)..(93) <223> This region may encompass 'TAC' or 'TCA' <220> <221> modified_base <222> (148)..(150) <223> This region may 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (31)..(31) <223> Tyr or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (50)..(50) <223> Tyr or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (52)..(52) <223> Ser or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (53)..(53) <223> Gly or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (57)..(57) <223> Phe or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (61)..(61) <223> Pro or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (64)..(64) <223> Leu or Tyr <400> 56 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Xaa Ile Xaa Xaa Ser Gly Gly Xaa Thr Tyr Tyr Xaa Asp Ser Xaa 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys His Asp Ala Leu Met Thr Thr Val Ile Thr Tyr Ala Pro Ser 100 105 110 Tyr Phe Tyr Tyr Trp Gly 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Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys <210> 79 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (99)..(108) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (110)..(111) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (113)..(114) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (116)..(116) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (123)..(123) <223> Any amino acid <400> 79 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Tyr 100 105 110 Xaa Xaa Asp Xaa Trp Gly Gln Gly Thr Thr Xaa Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 80 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Met or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Val or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Lys or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Lys or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (40)..(40) <223> Thr or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (42)..(42) <223> Glu or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (44)..(44) <223> Arg or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (49)..(49) <223> Ala or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(75) <223> Ala or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (80)..(80) <223> Phe or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (84)..(84) <223> Ser or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (88)..(88) <223> Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (97)..(97) <223> Val or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (98)..(98) <223> Arg or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (123)..(123) <223> Leu or Val <400> 80 Glu Val Xaa Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Xaa Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Xaa Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Xaa Pro Xaa Lys Xaa Leu Glu Trp Val 35 40 45 Xaa Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Leu 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa Lys Asn Thr Leu Xaa 65 70 75 80 Leu Gln Met Xaa Ser Leu Arg Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Xaa Xaa His Gly Ala Pro Met Thr Thr Val Ile Thr Tyr Ala Pro Tyr 100 105 110 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Xaa Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 81 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 81 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Lys Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Thr Ser Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 82 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 82 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 83 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (30)..(31) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(78) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (91)..(94) <223> Any amino acid <400> 83 Asp Xaa Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Xaa Xaa Tyr 20 25 30 Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Xaa Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 84 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Glu or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Asn, Val or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Leu or Met <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Ile or Phe <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Met or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Ala or Val <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Leu or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Met or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Asn or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser or Pro <220> <221> MOD_RES <222> (40)..(40) <223> Asp or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (41)..(41) <223> Ala or Gln <220> <221> MOD_RES <222> (42)..(42) <223> Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (59)..(59) <223> Ala or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (69)..(69) <223> Ser or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (71)..(71) <223> Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(72) <223> Leu or Phe <220> <221> MOD_RES <222> (77)..(77) <223> Met, Leu or Val <220> <221> MOD_RES <222> (79)..(79) <223> Gly or Ala <400> 84 Xaa Xaa Val Xaa Thr Gln Ser Pro Ala Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Xaa Xaa Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Lys Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Xaa Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Asn Xaa Tyr Xaa Xaa Thr Ile Ser Ser Xaa Glu Xaa Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Thr Ser Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105

Claims

하기를 포함하는, CXCR3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 폴리펩티드:

(a) 하기를 포함하는 인간화 항체 중쇄 가변 영역:

(1) 아미노산 서열 (NYMAS)을 포함하는 CDR-Hl;

(2) 아미노산 서열(TISSGGGYTYYPDSLKG)을 포함하는 CDR-H2; 및

(3) 아미노산 서열 (HGAPMTTVITYAPYYF{D,Y}Y)을 포함하는 CDR-H3; 및

(b) 하기를 포함하는 인간화 항체 경쇄 가변영역:

(1) 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)을 포함하는 CDR-L1;

(2) 아미노산 서열(YTSNLAP)을 포함하는 CDR-L2; 및

(3) 아미노산 서열 (QQFTTSPYT)을 포함하는 CDR-L3.
제1항에 있어서, 상기 CDR-H3은 아미노산 서열 (HGAPMTTVITYAPYYFYY)을 포함하는 것인 폴리펩티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CDR-H3은 아미노산 서열 (HGAPMTTVITYAP YYFDY)을 포함하는 것인 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

(1) 상기 CDR-Hl은 아미노산 서열 (NYMAS)로 구성되고;

(2) 상기 CDR-H2는 아미노산 서열 (TISSGGGYTYYPDSLKG)로 구성되며;

(3) 상기 CDR-H3은 아미노산 서열 (HGAPMTTVITYAPYYF{D,Y}Y)로 구성되고;

(4) 상기 CDR-Ll은 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)로 구성되며;

(5) 상기 CDR-L2는 아미노산 서열 (YTSNLAP)로 구성되고; 및

(6) 상기 CDR-L3은 아미노산 서열 (QQFTTSPYT)로 구성되는 것인 폴리펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-H3은 아미노산 서열 (HGAPMTTVITYAPYYFYY)로 구성된 것인 폴리펩티드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함하는 것인 폴리펩티드.
제6항에 있어서, 상기 인간화 항체 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함하는 것인 폴리펩티드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함하는 것인 폴리펩티드.
제8항에 있어서, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함하는 것인 폴리펩티드.
제8항에 있어서, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함하는 것인 폴리펩티드.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 항체 분자, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, 및 scFv 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
제11항에 있어서, 상기 분자는 항체 분자인 것인 폴리펩티드.
제12항에 있어서, 상기 항체는 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 포함하는 키메라 항체인 것인 폴리펩티드.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 항체는 IgG 분자(예를 들면, IgGl 또는 IgG4 분자)인 것인 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 scFv 분자인 것인 폴리펩티드.
제15항에 있어서, 상기 scFv는 NH₂-L-VH-X-VK-COOH 및 NH₂-L-VK-X-VH-COOH로 구성된 군으로부터 선택된 식을 가지며; 상기에서 L은 리더 서열(leader sequence)이고; VH는 상기 인간화 항체 중쇄 가변 영역이며; X는 연결 폴리펩티드(linking polypeptide)이고; VK는 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역인 것인 폴리펩티드.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제 또는 진단제에 접합된 것인 폴리펩티드.
제17항에 있어서, 상기 치료제는 세포독성제(cytotoxic agent), 방사성 표지, 면역조절제(immunomodulator), 호르몬, 효소, 올리고뉴클레오티드, 광활성 치료제(photoactive therapeutic agent), 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
제18항에 있어서, 상기 진단제는 방사성 표지, 광활성 진단제, 초음파-증강제(ultrasound-enhancing agent) 또는 비-방사성 표지(non-radioactive label)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
제1항 내지 제19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 CXCR3의 길항제인 것인 폴리펩티드.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 CXCR3의 작용제(agonist)가 아닌 것인 폴리펩티드.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 약 10⁶M^-1이상(바람직하게는 약 10⁷M^-1이상, 보다 바람직하게는 10⁸M^-1이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 10⁹M^-1 이상)의 친화도 상수로 CXCR3에 결합하는 것인 폴리펩티드.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제23항에 있어서, 추가적인 치료제 또는 진단제를 더 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제23항 또는 제24항의 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 또는 상태를 치료 또는 진단하는 방법.
제23항 또는 제24항의 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역 질환 또는 상태를 치료 또는 진단하는 방법.
제23항 또는 제24항의 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 질환(malignant disease) 또는 상태를 치료 또는 진단하는 방법.
제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 상태는 자가면역 질환(예를 들면, 루푸스), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 관절염(예를 들면, 류마티스 관절염), 다발성 경화증, 이식 거부증, 중추신경계 손상, 크론씨 병(Crohn's disease), 건선, 및 백혈병 또는 림프종(예를 들면, 만성 림프성 백혈병 (CLL))으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
(1) 아미노산 서열 (NYMAS)을 포함하는 CDR-Hl;

(2) 아미노산 서열(TISSGGGYTYYPDSLKG)을 포함하는 CDR-H2; 및

(3) 아미노산 서열 (HGAPMTTVITYAPYYF{D,Y}Y)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 인간화 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제30항에 있어서, 상기 인간화 항체 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
재31항에 있어서, 상기 인간화 항체 중쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
(1) 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)을 포함하는 CDR-L1;

(2) 아미노산 서열(YTSNLAP)을 포함하는 CDR-L2; 및

(3) 아미노산 서열 (QQFTTSPYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 인간화 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제33항에 있어서, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
제34항에 있어서, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
제34항에 있어서, 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역은 아미노산 서열

을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
제29항 내지 제36항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
제37항의 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환된 단리된(isolated) 세포.
제37항의 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:

a) 상기 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환된 세포를 배양하여 상기 코딩된 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및

b) 상기 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
(1) 아미노산 서열 ({N,S,Y}MAS)을 포함하는 CDR-Hl;

(2) 아미노산 서열 ({T,A,Y}I{S,Y}{S,G,T,Y}{G,S}{G,Y}G{F,S,Y}TYY{P ,A}DS{L,Y,V}KG)을 포함하는 CDR-H2; 및

(3) 아미노산 서열 ({H,Y}{G,Y}{A,Y}PM{T,Y}T{V,Y}ITY{A,Y}PYYFYY)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 인간화 항체 중쇄 가변 영역.
제40항에 있어서, 아미노산 서열

을 포함하는 것인 인간화 항체 중쇄 가변 영역.
(1) 아미노산 서열 (NYAIS)을 포함하는 CDR-Hl;

(2) 아미노산 서열 (TYSSGGVYTYYRDSLKG)을 포함하는 CDR-H2; 및

(3) 아미노산 서열 (HGAAMTTVITYAPFYFYY)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 인간화 항체 중쇄 가변 영역.
제42항에 있어서, 아미노산 서열

을 포함하는 것인 인간화 항체 중쇄 가변 영역.
(1) 아미노산 서열 (YYAMS)을 포함하는 CDR-Hl;

(2) 아미노산 서열 (TIYSGGSYTFYPDSLEG)을 포함하는 CDR-H2; 및

(3) 아미노산 서열 (HGAPMSTEITYAPYYFYY)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 인간화 항체 중쇄 가변 영역.
제44항에 있어서, 아미노산 서열

을 포함하는 것인 인간화 항체 중쇄 가변 영역.
(1) 아미노산 서열 (NYAMS)을 포함하는 CDR-Hl;

(2) 아미노산 서열 (TIYSGGGYTFYLDSLKG)을 포함하는 CDR-H2; 및

(3) 아미노산 서열 (HSYPMTTVITYAPYYFYY)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 인간화 항체 중쇄 가변 영역.
제46항에 있어서, 아미노산 서열

을 포함하는 것인 인간화 항체 중쇄 가변 영역.
(1) 아미노산 서열 (NYAMS)을 포함하는 CDR-Hl;

(2) 아미노산 서열 (TISSGGGYTYYPDSLKG)을 포함하는 CDR-H2; 및

(3) 아미노산 서열 (HGAPMTTVITYAPYYFYY)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는, 인간화 항체 중쇄 가변 영역.
제48항에 있어서, 아미노산 서열

을 포함하는 것인 인간화 항체 중쇄 가변 영역.
(1) 아미노산 서열 (NYAMS)을 포함하는 CDR-Hl;

(2) 아미노산 서열 (TISSGGGYTYYPDSLKG)을 포함하는 CDR-H2; 및

(3) 아미노산 서열 (HGAPMTTVITYAPYYFYY)을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 인간화 항체 중쇄 가변 영역.
제50항에 있어서, 아미노산 서열

을 포함하는 것인 인간화 항체 중쇄 가변 영역.
(1) 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)을 포함하는 CDR-L1;

(2) 아미노산 서열 (YTSNLAP)을 포함하는 CDR-L2; 및

(3) 아미노산 서열 (QQFTTSPYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는, 인간화 항체 경쇄 가변 영역.
제52항에 있어서, 아미노산 서열

을 포함하는 것인 인간화 항체 경쇄 가변 영역.
(1) 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)을 포함하는 CDR-L1;

(2) 아미노산 서열 (YTSNLAP)을 포함하는 CDR-L2; 및

(3) 아미노산 서열 (QQFTTSPYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는, 인간화 항체 경쇄 가변 영역.
제54항에 있어서, 아미노산 서열

을 포함하는 것인 인간화 항체 경쇄 가변 영역.
(1) 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)을 포함하는 CDR-L1;

(2) 아미노산 서열 (YTSNLAP)을 포함하는 CDR-L2; 및

(3) 아미노산 서열 (YQFTTSPYT))을 포함하는 CDR-L3을 포함하는, 인간화 항체 경쇄 가변 영역.
제56항에 있어서, 아미노산 서열

을 포함하는 것인 인간화 항체 경쇄 가변 영역.
(1) 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)을 포함하는 CDR-L1;

(2) 아미노산 서열 (YTSNLAP)을 포함하는 CDR-L2; 및

(3) 아미노산 서열 (QQYTTSPYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는, 인간화 항체 경쇄 가변 영역.
제58항에 있어서, 아미노산 서열

을 포함하는 것인 인간화 항체 경쇄 가변 영역.
(1) 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)을 포함하는 CDR-L1;

(2) 아미노산 서열 (YTSNLAP)을 포함하는 CDR-L2; 및

(3) 아미노산 서열 (QQFTTYPYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는, 인간화 항체 경쇄 가변 영역.
제60항에 있어서, 아미노산 서열

을 포함하는 것인 인간화 항체 경쇄 가변 영역.
(1) 아미노산 서열 (RAS{S,Q}SV{K,S}SY{(M,L}{Y,A})을 포함하는 CDR-L1;

(2) 아미노산 서열 ({Y,D}{T,A}SN{L,R}A{P,T})을 포함하는 CDR-L2; 및

(3) 아미노산 서열 (Q,Y}Q{F,Y}TT{S,Y}PYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는, 인간화 항체 경쇄 가변 영역.
제62항에 있어서, 아미노산 서열

을 포함하는 것인 인간화 항체 경쇄 가변 영역.
(1) 아미노산 서열 (RASSSVKYMY)을 포함하는 CDR-L1;

(2) 아미노산 서열 (YTSNLAP)을 포함하는 CDR-L2; 및

(3) 아미노산 서열 (QQFTTSPYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는, 인간화 항체 경쇄 가변 영역.
제64항에 있어서, 아미노산 서열

을 포함하는 것인 인간화 항체 경쇄 가변 영역.
(1) 아미노산 서열 (RAS{S,Q}SV{K,S}SY{M,L}{Y,A})을 포함하는 CDR-L1;

(2) 아미노산 서열 ({Y,D}{T,A}SN{L,R}A{P,T})을 포함하는 CDR-L2; 및

(3) 아미노산 서열 (Q,Y}Q{F,Y}TT{S,Y}PYT)을 포함하는 CDR-L3을 포함하는, 인간화 항체 경쇄 가변 영역.
제66항에 있어서, 아미노산 서열

을 포함하는 것인 인간화 항체 가변 영역.
제40항 내지 제51항 중 어느 한 항의 인간화 중쇄 및 제52항 내지 제67항 중 어느 한 항의 인간화 경쇄를 포함하는, CXCR3에 특이적으로 결합하는 항원 결합 폴리펩티드.
제68항에 있어서, 제48항 또는 제49항의 인간화 중쇄 및 제52항 또는 제53항의 인간화 경쇄를 포함하는 것인 폴리펩티드.
제68항에 있어서, 제48항 또는 제49항의 인간화 중쇄 및 제64항 또는 제65항의 인간화 경쇄를 포함하는 것인 폴리펩티드.
제68항에 있어서, 제48항 또는 제49항의 인간화 중쇄 및 제54항 또는 제55항의 인간화 경쇄를 포함하는 것인 폴리펩티드.
제68항에 있어서, 제48항 또는 제49항의 인간화 중쇄 및 제56항 또는 제57항의 인간화 경쇄를 포함하는 것인 폴리펩티드.
제68항에 있어서, 제48항 또는 제49항의 인간화 중쇄 및 제58항 또는 제59항의 인간화 경쇄를 포함하는 것인 폴리펩티드.
제68항에 있어서, 제48항 또는 제49항의 인간화 중쇄 및 제60항 또는 제61항의 인간화 경쇄를 포함하는 것인 폴리펩티드.
제68항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 항체 분자, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')₂ 단편, 및 scFv 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
제75항에 있어서, 상기 분자는 항체 분자인 것인 폴리펩티드.
제76항에 있어서, 상기 항체는 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 포함하는 키메라 항체인 것인 폴리펩티드.
제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 항체는 IgG 분자(예를 들면, IgGl 또는 IgG4 분자)인 것인 폴리펩티드.
제75항에 있어서, 상기 분자는 scFv 분자인 것인 폴리펩티드.
제79항에 있어서, 상기 scFv는 NH₂-L-VH-X-VK-COOH 및 NH₂-L-VK-X-VH-COOH로 구성된 군으로부터 선택된 식을 가지며; 상기에서 L은 리더 서열이고; VH는 상기 인간화 항체 중쇄 가변 영역이며; X는 연결 폴리펩티드이고; VK는 상기 인간화 항체 경쇄 가변 영역인 것인 폴리펩티드.
제68항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제 또는 진단제에 접합된 것인 폴리펩티드.
제81항에 있어서, 상기 치료제는 세포독성제, 방사성 표지, 면역조절제, 호르몬, 효소, 올리고뉴클레오티드, 광활성 치료제, 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
제81항에 있어서, 상기 진단제는 방사성 표지, 광활성 진단제, 초음파-증강제 또는 비-방사성 표지로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
제68항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 CXCR3의 길항제인 것인 폴리펩티드.
제68항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 CXCR3의 작용제가 아닌 것인 폴리펩티드.
제68항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 약 10⁶M^-1이상(바람직하게는 약 10⁷M^-1이상, 보다 바람직하게는 10⁸M^-1이상, 훨씬 더 바람직하게는 약 10⁹M^-1 이상)의 친화도 상수로 CXCR3에 결합하는 것인 폴리펩티드.
제68항 내지 제86항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 및 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제81항에 있어서, 추가적인 치료제 또는 진단제를 더 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제87항 또는 제88항의 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 또는 상태를 치료 또는 진단하는 방법.
제87항 또는 제88항의 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역 질환 또는 상태를 치료 또는 진단하는 방법.
제87항 또는 제88항의 조성물을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 악성 질환 또는 상태를 치료 또는 진단하는 방법.
제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 상태는 자가면역 질환(예를 들면, 루푸스), 염증성 장 질환(IBD), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 관절염(예를 들면, 류마티스 관절염), 다발성 경화증, 이식 거부증, 중추신경계 손상, 크론씨병(Crohn's disease), 건선, 및 백혈병 또는 림프종(예를 들면, 만성 림프성 백혈병 (CLL))으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제40항 내지 제51항 중 어느 한 항의 인간화 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제52항 내지 제67항 중 어느 한 항의 인간화 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제68항 내지 제86항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제93항 내지 제95항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드.
제96항의 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환된 단리된 세포.
제96항의 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:

a) 상기 재조합 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환된 세포를 배양하여 상기 코딩된 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및

b) 상기에서 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.