CN101796073A - 针对cxcr3的人源化抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了特异性结合CXCR3受体的人源化抗体。所述人源化抗体可为拮抗剂，并且其可用于治疗或诊断与CXCR3功能相关的疾病。
Description
相关申请书的交叉参考
本申请要求于2007年2月1日提交的美国临时申请第60/898,709号的优先权，该临时申请的公开内容在此全部引作参考。
发明背景
趋化因子及其受体之间的相互作用是控制白细胞迁移的重要步骤。趋化因子还介导许多不依赖趋化性的效应，包括诱导和增强细胞相关的细胞因子应答。
人细胞表面蛋白CD183为G蛋白偶联受体，对包括IP10(γ干扰素诱导性10kDa蛋白)、Mig(γ干扰素诱导性单核因子)、以及I-TAC(干扰素诱导性T细胞a-化学引诱物)的三种趋化因子具有选择性。这三种趋化因子属于“CXC”型趋化因子的结构亚家族，在“CXC”型趋化因子中，四个高度保守的Cys残基的前两个Cys残基之间隔有单个氨基酸残基。从历史上来看，CD183是被发现的第三个CXC趋化因子受体，因此，通常将CD183称为“CXCR3”。趋化因子与CXCR3的结合诱导包括白细胞迁移(leukocyte traffic)、最为突出的是整联蛋白的活化、细胞骨架的改变和趋化性移行在内的细胞应答。CXCR3表达于效应性/记忆性T细胞上和/或多种类型炎症组织的T细胞(例如，T-辅助1细胞即Th1细胞和CD8+Tcl细胞)中。另外，Ip10、Mig和I-TAC通常由炎症病灶处的局部细胞产生，提示CXCR3及其趋化因子参与了白细胞到炎症位点的募集作用。因此，CXCR3是抗体和拮抗剂的开发靶标，所述抗体和拮抗剂可用于治疗和诊断各种炎症性和免疫疾病和病症，例如类风湿性关节炎、多发性硬化症、局限性肠炎和炎症性肠病、慢性阻塞性肺病、银屑病、I型糖尿病和移植排斥。由于CXCR3在B细胞淋巴瘤的亚群上表达，因此CXCR3还可作为治疗和诊断淋巴瘤和白血病的靶标。
发明简述
本文公开了特异性结合趋化因子受体CXCR3(参见GenBank gi：4504099)的抗原结合性多肽分子。所述多肽包含人源化重链可变区和人源化轻链可变区。例如，所述多肽在基本保留母体单克隆抗体的抗原结合特异性的同时，可包含人抗体的轻链可变区及重链可变区的框架(FR)区。除CDR之外，所述人源化重链可变区和/或人源化轻链可变区为至少约90％人源化(优选至少约95％人源化、更优选至少约98％人源化、甚至更优选至少约100％人源化)。所述抗原结合性多肽分子可来源于单克隆抗体的供体(例如，小鼠单克隆抗体的供体)，并且可包含所述单克隆抗体的CDR(例如，小鼠单克隆的CDR)。所述多肽可起到CXCR3受体拮抗剂的作用。
在某些实施方案中，特异性结合CXCR3的抗原结合性多肽包含：(a)人源化抗体重链可变区，其包含：(1)包含氨基酸序列(NYMAS)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列(TISSGGGYTYYPDSLKG)的CDR-H2；和(3)包含氨基酸序列(HGAPMTTVITYAPYYF{D，Y}Y)的CDR-H3；以及(b)人源化抗体轻链可变区，其包含：(1)包含氨基酸序列(RASSSVKYMY)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列(YTSNLAP)的CDR-L2；和(3)包含氨基酸序列(QQFTTSPYT)的CDR-L3。所述多肽可包含含有氨基酸序列(HGAPMTTVITYAPYYFYY)的CDR-H3。
在某些实施方案的多肽中：(1)CDR-H1由氨基酸序列(NYMAS)组成；(2)CDR-H2由氨基酸序列(TISSGGGYTYYPDSLKG)组成；(3)CDR-H3由氨基酸序列(HGAPMTTVITYAPYYF{D，Y}Y)组成；(4)CDR-L1由氨基酸序列(RASSSVKYMY)组成；(5)CDR-L2由氨基酸序列(YTSNLAP)组成；(6)CDR-L3由氨基酸序列(QQFTTSPYT)组成。举例而言，所述CDR-H3可由氨基酸序列(HGAPMTTVITYAPYYFYY)组成。
在某些实施方案中，所述多肽包含人源化抗体重链可变区({E，D}{I，N，V}V {L，M}TQSPA{T，F，I}{L，M}S{L，A，V}{S，T}{L，P}GE{R，K}{A，V}T{L，M，I}{S，T，N}CRASSSVKYMYWYQQK{S，P}{G，D}{Q，A}{A，S}P{R，K}L{L，W}I{Y，K}YTSNLAPG{I，V}P {A，S}RFSGSGSG{T，N}{D，S}{F，Y}{T，S}{L，F}TISS{M，L}E{A，G，P}ED{F，A}A{V，T}YYC{Q，Y}QFTT{S，Y}PYTFGGGTKLEIKR)例如，所述多肽可包含人源化抗体重链可变区(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPKGLEWVSTISS GGGYTYYPDSLKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGAPMT TVITYAPYYFYYWGQGTTVTVS S)在某些实施方案中，所述多肽包含人源化抗体轻链可变区(E{I，N}VLTQSPA{T，F，I}{L，M}S{L，A，V}{S，T}{L，P}GE{R，K}{A，V}T{L，M，I}{S，T，N}CRASSSVKYMYWYQQK{S，P}{G，D}{Q，A}{A，S}P{R，K}L{L，W}IYYTSNLA PG{I，V}P{A，S }RFSGSGSG{T，N}{D，S}{F，Y}{T，S}{L，F}TISS{M，L}E{A，G}ED{F，A }A{V，T }YYCQQFTTSPYTFGGGTKLEIKR)例如，所述多肽可包含人源化抗体轻链可变区(EIVLTQSPATLSLSLGERATLSCRAS SSVKYMYWYQQKSGQAPRLLIYYTSNL APGIPARFSGSGSGTDFTLTISSMEAEDFAVYYCQQFTTSPYTFGGGTKLEIKR)、或(ENVLTQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVKYMYWYQQKPDQAPKLWIYYTS NLAPGVPSRFSGSGSGNDYTFTISSLEAEDAATYYCQQFTTSPYTFGGGTKLEIKR)。
本文还公开了人源化抗体重链可变区。所述人源化抗体重链区可包含：(1)包含氨基酸序列({N，S，Y}YAMS)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列({T，A，Y}I{S，Y}{S，G，T，Y}{G，S}{G，Y}G{F，S，Y}TYY{P，A}DS{L，Y，V}KG)的CDR-H2；和(3)包含氨基酸序列({H，Y}{G，Y}{A，Y}PM{T，Y}T{V，Y}ITY{A，Y}PYYFYY)的CDR-H3。例如，所述人源化抗体重链可变区可包含氨基酸序列(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS{N，S，Y }YAMSWVRQAPGKGLEWVS{T，A，Y}I{S，Y}{S，G，T，Y}{G，S}{G，Y}G{F，S，Y}TYY{P，A}DS{L，Y，V}KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK{H，Y}{G，Y}{A，Y}PM{T，Y}T{V， Y}ITY{A，Y}PYYFYYWGQGTTVTVSS)
在另一个实例中，人源化抗体重链可变区包含：(1)包含氨基酸序列(NYAIS)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列(TYSSGGVYTYYRDSLKG)的CDR-H2；和(3)包含氨基酸序列(HGAAMTTVITYAPFYFYY)的CDR-H3。例如，所述人源化抗体重链可变区可包含氨基酸序列(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAISWVRQAPGKGLEWVSTYS SGGVYTYYRDSLKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGAAM TTVITYAPFYFYYWGQGTTVTVSS)
在另一个实例中，人源化抗体重链可变区包含：(1)包含氨基酸序列(YYAMS)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列(TIYSGGSYTFYPDSLEG)的CDR-H2；和(3)包含氨基酸序列(HGAPMSTEITYAPYYFYY)的CDR-H3。例如，所述人源化抗体重链可变区可包含氨基酸序列(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYAMSWVRQAPGKGLEWVSTI YSGGSYTFYPDSLEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGAPM STEITYAPYYFYYWGQGTTVTVSS)
在另一个实例中，人源化抗体重链可变区包含：(1)包含氨基酸序列(NYAMS)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列(TIYSGGGYTFYLDSLKG)的CDR-H2；和(3)包含氨基酸序列(HSYPMTTVITYAPYYFYY)的CDR-H3。例如，所述人源化抗体重链可变区可包含氨基酸序列(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVSTI YSGGGYTFYLDSLKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHSYP MTTVITYAPYYFYYWGQGTTVTVSS)
在另一个实例中，人源化抗体重链可变区包含：(1)包含氨基酸序列(NYAMS)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列(TISSGGGYTYYPDSLKG)的CDR-H2；和(3)包含氨基酸序列(HGAPMTTVITYAPYYFYY)的CDR-H3。例如，所述人源化抗体重链可变区可包含氨基酸序列(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTI SSGGGYTYYPDSLKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGAP MTTVITYAPYYFYYWGQGTTVTVSS)
在另一个实例中，人源化抗体重链可变区包含：(1)包含氨基酸序列(NYAMS)的CDR-H1；(2)包含氨基酸序列(TISSGGGYTYYPDSLKG)的CDR-H2；和(3)包含氨基酸序列(HGAPMTTVITYAPYYFYY)的CDR-H3。例如，所述人源化抗体重链可变区可包含氨基酸序列(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTI SSGGGYTYYPDSLKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGAP MTTVITYAPYYFYYWGQGTTVTVSS)
本文还公开了人源化抗体轻链可变区。所述人源化抗体轻链区可包含：(1)包含氨基酸序列(RASSSVKYMY)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列(YTSNLAP)的CDR-L2；和(3)包含氨基酸序列(QQFTTSPYT)的CDR-L3。例如，所述人源化抗体轻链可变区可包含氨基酸序列(EIVLTQSPATLSLSLGERATLSCRASSSVKYMYWYQQKSGQAPRLLIYYTSNL APGIPARFSGSGSGTDFTLTISSMEAEDFAVYYCQQFTTSPYTFGGGTKLEIKR)
在另一个实例中，人源化抗体轻链可变区包含：(1)包含氨基酸序列(RASSSVKYMY)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列(YTSNLAP)的CDR-L2；和(3)包含氨基酸序列(QQFTTSPYT)的CDR-L3。例如，所述人源化抗体轻链可变区可包含氨基酸序列(EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVKYMYWYQQKPGQAPRLLIYYTSNL APGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFTTSPYTFGGGTKLEIKR)。
在另一个实例中，人源化抗体轻链可变区包含：(1)包含氨基酸序列(RASSSVKYMY)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列(YTSNLAP)的CDR-L2；和(3)包含氨基酸序列(YQFTTSPYT)的CDR-L3。例如，所述人源化抗体轻链可变区可包含氨基酸序列(EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVKYMYWYQQKPGQAPRLLIYYTSNL APGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCYQFTTSPYTFGGGTKLEIKR)
在另一个实例中，人源化抗体轻链可变区包含：(1)包含氨基酸序列(RASSSVKYMY)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列(YTSNLAP)的CDR-L2；和(3)包含氨基酸序列(QQYTTSPYT)的CDR-L3。例如，所述人源化抗体轻链可变区可包含氨基酸序列(EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVKYMYWYQQKPGQAPRLLIYYTSNL APGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYTTSPYTFGGGTKLEIKR)
在另一个实例中，人源化抗体轻链可变区包含：(1)包含氨基酸序列(RASSSVKYMY)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列(YTSNLAP)的CDR-L2；和(3)包含氨基酸序列(QQFTTYPYT)的CDR-L3。例如，所述人源化抗体轻链可变区可包含氨基酸序列(EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVKYMYWYQQKPGQAPRLLIYYTSNL APGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFTTYPYTFGGGTKLEIKR)
在另一个实例中，人源化抗体轻链可变区包含：(1)包含氨基酸序列(RAS{S，Q} SV{K，S}SY{M，L}{Y，A})的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列({Y，D}{T，A}SN{L，R}A{P，T})的CDR-L2；和(3)包含氨基酸序列(Q，Y}Q{F，Y}TT{S，Y}PYT)的CDR-L3。例如，所述人源化抗体轻链可变区可包含氨基酸序列(EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAS{S，Q}SV{K，S}SY{M，L}{Y，A}WYQQKPGQAPRLLIY{Y，D}{T，A}SN{L，R}A{P，T}GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC{Q，Y}Q{F，Y}TT{S，Y}PYTFGGGTKLEIKR)
在另一个实例中，人源化抗体的轻链可变区包含：(1)包含氨基酸序列(RASSSVKYMY)的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列(YTSNLAP)的CDR-L2；和(3)包含氨基酸序列(QQFTTSPYT)的CDR-L3。例如，所述人源化抗体轻链可变区可包含氨基酸序列(ENVLTQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVKYMYWYQQKPDQAPKLWIYYTS NLAPGVPSRFSGSGSGNDYTFTISSLEAEDAATYYCQQFTTSPYTFGGGTKLEIKR)
在另一个实例中，人源化抗体轻链可变区包含：(1)包含氨基酸序列(RAS{S，Q}SV{K，S}SY{M，L}{Y，A})的CDR-L1；(2)包含氨基酸序列({Y，D}{T，A}SN{L，R}A{P，T})的CDR-L2；和(3)包含氨基酸序列(Q，Y}Q{F，Y}TT{S，Y}PYT)的CDR-L3。例如，所述人源化抗体轻链可变区可包含氨基酸序列((E，D)(N，V)V(L，M)TQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVKYMYWYQQKPDQAPKL(W，L)I(Y，K)YTSNLAPGVPSRFSGSGSG(N，T)D(Y，F)TFTISSLEAEDAATYYC(Q，Y)Q(F，Y)TT(S，Y)PYTFGGGTKLEIKR)。
前述人源化重链和人源化轻链可存在于特异性结合CXCR3的抗原结合性多肽中。
所述抗原结合性多肽可选自以下的抗体分子：Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、以及scFv分子。在某些实施方案中，多肽为抗体分子。抗体分子可包括含有人重链恒定区和人轻链恒定区的嵌合抗体。例如，所述抗体分子可为IgG分子(例如IgG1分子或IgG4分子)，其中所述多肽包含IgG分子的重链恒定区及轻链恒定区。所述多肽可为scFv分子。举例而言，scFv可选自下式：NH2-L-VH-X-VK-COOH和NH2-L-VK-X-VH-COOH；上式中，L为前导序列；VH为人源化抗体重链可变区；X为连接多肽；VK为人源化抗体轻链可变区。
所述抗原结合性多肽可进一步与治疗药物或诊断药物缀合或融合。例如，治疗药物可选自：细胞毒剂、放射性标记、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活化治疗药物或其组合。诊断药物的实例可包括：放射性标记、光活化诊断药物、超声促进剂或非放射性标记。
所述抗原结合性多肽可为CXCR3的拮抗剂。通常所述多肽并非CXCR3的激动剂。
所述抗原结合性多肽与CXCR3受体特异地并以高亲和力结合。通常所述多肽与CXCR3以至少约106M-1(优选至少约107M-1、更优选至少约108M-1、甚至更优选至少约109M-1)的亲和常数结合。
本文还公开了包含前述抗原结合性多肽和载体(例如稀释剂或赋形剂)的药物组合物。所述药物可进一步包含本文所公开的另外的治疗药物或诊断药物。
本文还公开了治疗或诊断疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予所公开的药物组合物。例如，可给予所述药物组合物以治疗或诊断炎症性疾病或病症、免疫疾病或病症和/或恶性疾病或病症。疾病或病症的实例可包括：自身免疫病(例如狼疮)、炎性肠病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、关节炎(例如类风湿性关节炎)、多发性硬化症、移植排斥、中枢神经系统损伤、局限性肠炎、银屑病、1型糖尿病和白血病或淋巴瘤(例如慢性淋巴细胞白血病(CLL))。
本文还公开了编码前述多肽的多核苷酸。所述多核苷酸可有效连有用于使所编码多肽在合适的宿主细胞中表达的启动子。因此，制备由重组多核苷酸所编码的多肽的方法可包括：a)培养转化有重组多核苷酸的细胞，以表达所编码多肽；和b)回收如此表达的多肽。
附图简述
图1阐述了鼠抗CXCR3mAb对125I-IP-10与Th1细胞结合的抑制作用。Ab#1-5D4A；Ab#2-8A5A；Ab#3-19G2；Ab#4-V36E5A；Ab#5-V44D7A；
Ab#6-37B5A；Ab#7-21A4A；Ab#8-V15F4A；Ab#9-V3G6A；Ab#10-23E12A；Ab#11-35C4；Ab#12-39E10。
图2阐述了鼠抗CXCR3mAb对IP-10诱导的Th1细胞迁移的抑制作用。Ab#1-5D4A；Ab#2-8A5A；Ab#3-19G2；Ab#4-V36E5A；Ab#5-V44D7A；Ab#6-37B5A；Ab#7-21A4A；Ab#8-V15F4A；Ab#9-V3G6A；Ab#10-23E12A。
图3阐述了鼠抗CXCR3mAb与Th1细胞(上图)、CXCR3+/NSO细胞(中图)、和CXCR-/NSO细胞(下图)结合的FACs分析结果。
图4阐述了鼠抗CXCR3mAb和人源化抗CXCR3mAb对趋化因子与CXCR3结合的抑制作用。
图5阐述了鼠抗CXCR3mAb和人源化抗CXCR3mAb对趋化因子介导的趋化性的抑制作用。
图6阐述了5个抗CXCR3克隆的VH结构域的比对结果。
图7阐述了5个抗CXCR3克隆的VK结构域的比对结果。
图8阐述了抗CXCR3克隆V44D7的VH结构域与表达最接近的人IgG VH和人种系VH的比对结果。
图9阐述了使抗CXCR3克隆V44D7的VH结构域完全人源化所需的氨基酸改变的风险评估。所述所需的氨基酸改变于主要序列之下出示，其通过与人VH3-23进行比对得出。种系基因和所表达抗体描述于GenBank登录号AAD53829中。
图10阐述了使抗CXCR3克隆V44D7的VH结构域完全人源化所需的氨基酸改变的风险评估。所述所需的氨基酸改变于主要序列之下出示，其通过与人VH3-23进行比对得出。种系基因和所表达抗体描述于GenBank登录号AAD53829中。
图11阐述了抗CXCR3克隆V3G6的VK结构域与表达最接近的人IgG VK和人种系VK的比对结果。
图12阐述了使抗CXCR3克隆V3G6的VK结构域完全人源化所需的氨基酸改变的风险评估。
图13阐述了市售CXCR3mAb对小鼠抗CXCR3mAb与CXCR3+NSO细胞结合的抑制作用。在各个浓度的未标记市售CXCRmAb的存在下，将约0.5nM的Eu-CXCR3mAb与转染有CXCR3的NSO细胞一同温育。观察到Eu-CXCR3mAb与CXCR3+NSO细胞结合的剂量依赖性抑制。
图14阐述了CXCR3在Th1细胞上的表达。Th1细胞和Th2细胞从脐带血中获得，通过FACS来确定CXCR3和CCR4的表达情况。CXCR3只存在于Th1细胞中。
图15阐述了125I-CXCL10结合试验。在96孔板中，不存在或存在各个浓度CXCRmAb下，Th1细胞与125I-CXCL10一同温育。通过油柱将结合有125I-CXCL10的细胞与非放射性细胞分离，并用γ计数仪计数。用Prizm软件计算IC50值。主要的侯选抗体(lead candidate)用绿色突出显示。
图16阐述了125I-CXCL11结合试验。在96孔板中，不存在或存在各个浓度CXCRmAb下，Th1细胞与125I-CXCL11一同温育。通过油柱将结合有125I-CXCL11的细胞与非放射性细胞分离，并用γ计数仪计数。用Prizm软件计算IC50值。主要的候选抗体用绿色突出显示。
图17阐述了Eu-CXCR3mAb与Th1细胞的结合情况。不存在或存在10倍过量的未标记CXCR3mAb下，Th1细胞与浓度不断增大的Eu-CXCR3mAb一同温育。温育后(室温下一小时)，通过洗涤三次，将结合有Eu-CXCR3mAb的细胞与无铕的细胞分离，并用Vctor2荧光计读板。
图18阐述了CXCR3mAb杂交瘤上清液对125I-CXCL11与Th1结合的抑制作用。在96孔板中，不存在或存在各种CXCR3mAb杂交瘤上清液下，将Th1细胞与125I-CXCL11室温温育1小时。通过油柱将结合有125I-配体的细胞与非放射性细胞分离，并用γ计数仪计数。选出7种抑制CXCL11与Th1细胞结合的杂交瘤上清液，作进一步的开发。
图19阐述了CXCR3mAb杂交瘤上清液对125I-CXCL10与Th1结合的抑制作用。在96孔板中，不存在或存在各种CXCR3mAb杂交瘤上清液下，将Th1细胞与125I-CXCL10室温温育1小时。通过油柱将结合有125I-配体的细胞与非放射性细胞分离，并用γ计数仪计数。选出7种抑制CXCL10与Th1细胞结合的杂交瘤上清液，作进一步的开发。
图20阐述了小鼠CXCR3mAb与大鼠Th1细胞之间不存在交叉反应。进行FACS分析以确定小鼠CXCR3mAb对极化的大鼠Th1细胞的反应性。只有兔抗鼠CXCR3Ab与大鼠Th1细胞结合。鼠抗人CXCR3Ab并不与大鼠Th1细胞结合。作为对照，小鼠抗CXCR3mAb与人Th1细胞的结合情况也显示出来(下图)。
图21阐述了人源化CXCR3Ab对Eu-CXCR3mAb的抑制作用。在96孔板中，不存在或存在各个浓度人源化CXCRmAb下，Th1细胞与Eu-CXCR3mAb一同温育。温育后(室温下一小时)，通过洗涤三次，将结合有Eu-CXCR3mAb的细胞与无铕的细胞分离，并用Vctor2荧光计读板。用Prizm软件计算出IC50值。Ab1具有IgG1骨架中的人源化抗CXCR3V44D7VH主要#5的重链氨基酸序列和人源化抗CXCR3 V44D7 VK主要#1的轻链序列(参见非正式序列表)。Ab2具有IgG1骨架中的人源化抗CXCR3 V44D7 VH主要#5的重链氨基酸序列和人源化抗CXCR3V44D7VK主要#7的轻链序列(参见非正式序列表)。人源化Ab(IgG4)具有IgG4骨架中的人源化抗CXCR3 V44D7 VH主要#5的重链氨基酸序列和原始小鼠抗CXCR3 V44D7 VK的轻链序列。
图22阐述了人源化CXCR3Ab对Eu-CXC10的抑制作用。在96孔板中，不存在或存在各个浓度人源化CXCRmAb下，Th1细胞与Eu-CXCL10一同温育。温育后(室温下一小时)，通过洗涤三次，将结合有Eu-CXCL10的细胞与无铕的细胞分离，并用Vctor2荧光计读板。用Prizm软件计算出IC50值。
图23阐述了人源化CXCR3Ab对CXCL10诱导的Th1细胞趋化性的抑制作用。趋化性测定在ChemoTx 96孔板(Neuro Probe，Inc)中进行。将约29μL的CXCL10或缓冲液对照加入底孔(bottom well)。不存在或存在各个浓度人源化抗体下，将25μL的Th1细胞悬液直接加入过滤器的孔上。在37℃下温育2小时后，通过细胞滴度glo法(Promega)测定迁移至底孔的细胞。
图24阐述了Th1细胞内Ca++流(flux)的分析结果。使Th1细胞负载Fluo-4，AM(分子探针)，用所述各种小鼠CXCR3mAb抗体进行刺激。细胞内Ca++的升高情况通过FLIPR来确定。
优选实施方案详述
定义
本文所述抗体是指全长的(即天然存在的或由正常免疫球蛋白基因片段经重组过程所形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)或具有免疫活性的(即特异性结合的)免疫球蛋白分子部分，比如抗体片段。
抗体片段是抗体的一部分，例如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、FV、scFv等等。不考虑结构，抗体片段与完整抗体所识别的相同抗原相结合。术语“抗体片段”还包括任何合成蛋白或基因工程蛋白，所述蛋白作用类似于抗体，通过与特定抗原结合形成复合物。例如，抗体片段包括：由可变区组成的分离片段(例如由重链可变区和轻链可变区组成的“Fv”片段)、其中轻链可变区和重链可变区由连接肽相连的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)、和由模拟高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位。
人源化抗体是一种重组蛋白，其中来自一个物种的抗体(例如啮齿类动物抗体)的CDR，从啮齿类动物抗体的重链可变区和轻链可变区中转换到人重链可变结构域和轻链可变结构域中，或转换到已诱变为包含至少一部分人重链可变结构域和轻链可变结构域的氨基酸序列(正如由“人源化百分率”所示)的重链可变结构域和轻链可变结构域中。所述抗体分子的恒定结构域可从人抗体的恒定结构域得到。
本文所用的“人源化百分率”通过确定在人源化结构域和种系结构域之间构架氨基酸差异(即非-CDR差异)的数目，从氨基酸总数减去该数目，然后除以氨基酸总数，并乘以100来计算。
本文所用的“CDR”意指存在于抗体重链的可变结构域(VH)或抗体轻链的可变结构域(VL或VK)中的“互补决定区”。每个可变结构域包含三个CDR，那些存在于重链可变结构域中的CDR称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，而那些存在于轻链可变结构域中的CDR称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。本文使用的是Kabat编号系统。就以上的CDR而言，CDR-H1起始于大概第31个氨基酸(即第一个半胱氨酸残基后大概9个残基)处，包含约5-7个氨基酸，终止于下一个酪氨酸残基处。CDR-H2起始于CDR-H1末端后的第15个残基处，包含约16-19个氨基酸，终止于下一个精氨酸残基或赖氨酸残基处。CDR-H3起始于CDR-H2末端后的大概第33个氨基酸残基处，包含3-25个氨基酸，终止于序列W-G-X-G，其中X为任意氨基酸。CDR-L1起始于大概第24个残基(即在半胱氨酸残基后)处，包含约10-17个氨基酸，并且终止于下一个酪氨酸残基处。CDR-L2起始于CDR-L1末端后的大概第16个残基处，包含约7个残基。CDR-L3起始于CDR-L2终止后的大概第33个残基处，包含约7-11个残基，终止于序列F-G-X-G处，其中X为任意氨基酸。
本文所公开的抗原结合性多肽可与治疗药物缀合或融合，所述治疗药物可包括：放射性标记、免疫调节剂、激素、光活化治疗药物、细胞毒剂(其可为药物或毒素)及其组合。药物可包括那些治疗性药物，这样的药物选自：抗有丝分裂药、抗激酶、烷化剂、抗代谢药、抗菌素、生物碱、抗血管生成药、细胞凋亡剂及其组合。更具体地，这些药物选自：氮芥、氮丙啶衍生物、磺酸烷基酯、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、COX-2抑制剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗生素、酶、表鬼臼毒素、铂配位络合物、长春花生物碱、经取代的尿素、甲肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、拮抗剂、内皮抑素、紫杉醇、喜树碱、蒽环霉素、紫杉烷类及其类似物、和它们的组合。本发明所包含的毒素可选自：蓖麻毒、相思豆毒蛋白、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNase)例如onconase、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。
免疫调节剂可选自：细胞因子、干细胞生长因子、淋巴细胞毒素、血细胞生成因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、促红细胞生成素、促血小板生成素及其组合。特别有用的是淋巴细胞毒素(例如肿瘤坏死因子(TNF))、血细胞生成因子(例如白细胞介素(IL))、集落刺激因子(例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、干扰素(例如干扰素-α、干扰素-β或干扰素-γ)、以及干细胞生长因子(例如称为“SI因子”)。更具体地，免疫调节剂可包含IL-I、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素-β、TNF-α或其组合。
本文所公开的抗原结合性多肽可与诊断药物缀合或融合。诊断药物可包括：能量在60-4,000千电子伏特(keV)之间的光活化诊断药物或放射性标记、或非放射性标记。优选所述放射性标记为γ同位素、β同位素、和正电子发射同位素，并且所述放射性标记选自：125I、131I、123I、1241、86Y、186Re、188Re、62Cu、64Cu、111In、67Ga、68Ga、99mTc、94mTc、18F、11C、13N、15O、76Br及其组合。诊断药物可包含造影剂，例如锰、铁或钆。
实施例
利用杂交瘤技术分离小鼠IgG
1
，k CXCR-3结合抗体
用表达CXCR-3的NSO细胞对BALB/c小鼠进行免疫。在典型步骤中，向后脚垫内(25ul/脚)注射含5X106细胞的50ul RIBI佐剂(Sigma)。每间隔2周，给予另外的两剂RIBI佐剂中的注射液，然后给予PBS中的最后一次增强剂量。三天后处死小鼠，收获其腘淋巴结并分离其淋巴细胞用于融合。淋巴细胞与P3X63Ag8.653浆细胞瘤细胞按5∶1的比例，用PEG/DMSO(Sigma)作为融合剂来进行融合。融合后将细胞重悬于选择性HAT培养基中，按106细胞每孔接种于96孔板中。根据小鼠IgG的存在情况，用ELISA筛选经HAT选择而存活的杂交瘤的上清液。鉴定产IgG的杂交瘤并将其上清液进一步通过FACS分析筛选出与表达CXCR3的NSO细胞(CXCR3+NSO)结合的抗体。然后，将鉴定为与CXCR3+NSO细胞结合呈阳性的杂交瘤进行筛选，选出与CXCR3+NSO细胞和PC-NSO(载体对照)细胞结合有差异的杂交瘤，以鉴定出CXCR3特异性克隆。通过有限稀释将CXCR3特异性的杂交瘤进行两次亚克隆。在无血清的培养基中使杂交瘤亚克隆增殖，在蛋白-A柱上纯化抗体，并进一步表征以挑选出主要侯选抗体。
人源化策略
使抗CXCR3抗体人源化的一个目标是获得保留了90-100％的原有结合亲和力和结合特异性的60-80％人源化VH结构域和人源化VK结构域。在保持结合亲和力和结合特异性的同时，用VH和VK中的各个高风险位置的定点诱变进一步使抗体人源化。
通过CDR移植、基于结构的分析和可变区表面重建(resurface)来进行人源化(参见Jones等，NATURE(1986)5月29日-6月4；321(6069)：522-5；Roguska等，PROTEIN ENGINEERING，1996，9(10)：895-904；以及Xoma，对小鼠抗体构架的人源化以及3D结构的保留(Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3-DStructure.)PROTEIN ENGINEERING，1994，第7卷，第805页)。利用抗体的一级结构序列和3-D结构数据来确定维持结合亲和力和结合特异性所需的关键构架残基。对九种(9)不同的Fab分子和IgG分子(人和小鼠，有或无配体)的3-D结构进行分析。在将鼠抗CXCR3V44VH和VK与最接近的人种系基因进行比对后，评估每个位置上氨基酸对结合和免疫原性的潜在影响。用该信息对每个位置的突变赋予低、中或高风险值。一般而言，只有低风险位置和中风险位置才能突变，而要避免高风险位置。
在经过以上步骤后，所述重链相对于小鼠重链(除CDR之外)有98％被人源化。然后通过在CDR3的每个位置上掺入成对的酪氨酸来进行亲和力成熟策略，包括平均提高两倍亲和力的Y115D的取代。2种侯选抗体中所用的重链包含两个在97位和98位的另外突变，使其100％的人源化(忽略CDR不计)。在对轻链进行相同策略后，将该VK与A14种系基因进行比对，并对低和中风险位置进行突变。在确定该种系基因在正常人中极少表达后，用L6种系作为模板，重复该过程。
用NCBI中提供的″Blast for Ig sequences″网页鉴定与本研究中所用小鼠VH区和VK区最匹配的VH区和VK区。用MRC的V-base网页确定人种系序列。
根据与小鼠VH序列和VK序列的最佳匹配序列来选择人种系VH基因和VK基因。对于小鼠VH序列，确定人种系序列VH3-23(如V-base中所命名)为最佳匹配序列：VH3-23种系(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEQVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK)对于小鼠VK序列，确定人种系序列A14和L6(如V-base中所命名)为最佳匹配序列：L6种系(EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP)；和A14种系(DVVMTQSPAFLSVTPGEKVTITCQASEGIGNYLYWYQQKPDQAPKLLIKYASQSISGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLEAEDAATYYCQQGNKHP)由杂交瘤细胞系克隆鼠抗CXCR3VH结构域和VK结构域并测序
将杂交瘤细胞沉淀，用PBS将其洗涤3次，并用Trizol试剂(Invitrogen，产品目录号15596-026)按照生厂商的方案来提取RNA。用5′RACE试剂盒(快速扩增cDNA末端(Rapid Amplification of cDNAEnds)，Invitrogen，产品目录号18374-058)按照生厂商的方案来将总RNA转换为cDNA。简而言之，将RNA连接到随机六聚体引物RandomN6上，用superscript II RNAase H阴性反转录酶(negative reversetranscriptase)制备第一条cDNA链。用该试剂盒中提供的GlassMax离心柱来纯化cDNA，然后将cDNA与TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)在dCTP的存在下进行反应，使cDNA的5′端附上C碱基对。对于VH而言，具有dC尾的cDNA用特异性针对dC尾的锚定引物和能与小鼠重链恒定区1(CH1)的高度保守的DNA序列杂交的基因特异性引物来进行PCR扩增；而对于VK而言，用特异性针对dC尾的锚定引物和能与小鼠κ恒定区(CK)的高度保守的DNA序列杂交的基因特异性引物来进行PCR扩增。所得PCR产物通过凝胶电泳来分析相对于完整VH结构域或VK结构域的正确大小，然后将其纯化并按照生厂商的方案将产物连接至Topo TA载体(Invitrogen产品目录号45-0071)中。在将质粒转化到细菌后，从含有正确大小插入片段的克隆中制备DNA，并用Big Dye末端测序反应混合仪(Applied Biosystems，Part No.4336699)和3700ABI/Prism DNA分析仪按照生厂商的方案来确定该DNA的序列。
小鼠抗CXCR3抗体的人源化
首先，根据上述得到的结合数据和序列数据鉴定单个主要的(lead)小鼠抗CXCR3抗体，V44D7。利用目前有效的公共数据库(即NCBI的Blast for IgG以及MRC的V-base)，将该抗体的VH结构域和VK结构域的氨基酸序列与所有已知的人种系VH结构域和VK结构域的氨基酸序列进行比对。通过观察构架区内氨基酸的比对结果，确定了高度同源的人种系VH结构域即VH3-23以及两个不同的人种系VK结构域即A14和L6。在构架中小鼠序列与人种系序列不同的那些位置，用反复的方法转换或突变小鼠构架，使之与相对应的人种系构架相匹配。另外，VH和VK中CDR3的某些残基通过用酪氨酸置换来进行突变(即亲和力成熟)，潜在地有助于弥补由于改变构架残基而造成的亲和力的任何缺损。用一组重叠的合成DNA寡核苷酸，通过聚合酶链式反应法得到亲和力成熟并人源化的小鼠VH结构域和VK结构域。作为合成基因设计方法的一部分，使用密码子最优化策略，即对于每个氨基酸而言，将优选被哺乳动物细胞用于基因表达的三联体密码引入每个位置。将合成VH结构域和VK结构域克隆至特化的哺乳动物表达载体中，该表达载体使相应的结构域能够在完整的人IgG1、G4或κ抗体骨架中表达。通过用lipofectamine(Invitrogen)按照生厂商的方案将IgG1构建体或G4构建体与κ构建体共转染至293F细胞中，进行人源化抗体的小批量制备。将瞬时转染的上清液通过蛋白A或G树脂，纯化IgG至均一，用于在以细胞为基础的测定中进行检测。
抗原表位竞争研究
在竞争性结合试验中，使用铕(Eu)标记的小鼠CXCR3mAb检测各种市售的CXR3mAb。各种商业来源的CXCR3mAb抑制Eu-CXCR3mAb与CXCR3的结合。该数据表明小鼠CXCR3mAb和市售抗体结合到CXCR3的重叠表位上(图13)。
抗体亲和力
通过各种竞争性结合测定，用125I-标记的趋化因子和Eu-标记的趋化因子以及Eu-标记的CXCR3mAb来测定小鼠CXCR3mAb和人源化CXCR3mAb的结合亲和力和结合活性。Th1趋化性测定包括：125I-CXCL10结合测定、125I-CXCL11结合测定、Eu-CXCL10结合测定、Th1趋化性测定和Eu-小鼠CXCR3mAb结合测定。
Th1细胞
从脐带血中获得的初始Th1细胞用于所有的结合测定。如参考文献中所描述，只在Th1细胞而非Th2细胞上观察到CXCR3的表达，如通过FACS分析所确定(图14)。Th2细胞特异性表达CCR4。
125
I-CXCL10和
125
I-CXCL11结合测定
小鼠CXCR3mAb抗体的结合亲和力根据其抑制放射性标记的CXCL10和CXCL11对Th1细胞结合的能力来确定(图15、16、18和19以及表1)。根据这些结合情况研究和趋化性测定，选出三种小鼠CXCRmAb作进一步研究。表1抗CXCR3mAb的表征
Ab#1-5D4A；Ab#2-8A5A；Ab#3-19G2；Ab#4-V36E5A；Ab#5-V44D7A；
Ab#6-37B5A；Ab#7-21A4A；Ab#8-V 15F4A；Ab#9-V3G6A；Ab#10-23E12A；Ab#11-35C4；Ab#12-39E10.
Eu-CXCRmAb饱和结合测定
小鼠CXCR3抗体与CXCR3的结合亲和力通过用铕标记的小鼠CXCR3抗体的直接饱和结合测定来确定。用一种小鼠CXCR3mAb的该测定的实例如图17所示。该研究的数据表明Eu-CXCR3mAb与CXCR3的结合具有特异性，而且在低于纳摩尔级Kd(0.47nM)的结合亲和力下饱和。
抗体特异性
小鼠抗体杂交瘤(20000)通过差示筛选测定，用含Eu-第二抗体(DELFIA)的CXCR3+和CXCR3-NSO膜进行筛选。结合在CXCR3+膜上的抗体(约2000)进一步用CXCR3+/CXCR3-NSO和Th1细胞通过FACS进行检测。CXCR3mAb与CXCR3表达细胞特异性结合的实例在图3中出示。
种间交叉反应性
通过FACS检测母本小鼠CXCR3mAb对极化的大鼠Th1细胞的结合情况。只有兔抗鼠的CXCR3Ab(阳性对照)与大鼠Th1细胞结合。如图20所示，小鼠的母本CXCR3mAb并不结合大鼠Th1细胞。
生物学活性
结合测定：CXCR3mAb特异性抑制了125I-标记的IP-10和125I-I-Tac与初始Th1细胞的结合。由于标记的Mig无效，因此没有在结合试验中对其进行检测。趋化性测定：CXCR3mAb抑制了CXCR3趋化因子介导的Th1细胞迁移。
通过结合测定和趋化性测定来检测人源化抗体。Eu-CXCRmAb竞争性结合测定的结果显示于图21中。Eu-CXCL10结合测定的结果显示于图22中。Th1趋化性测定的结果显示于图23中。
小鼠抗体的CXCR3受体激动作用检测
检测小鼠CXCR3mAb的诱导Th1细胞内钙转运的激动活性。如图24中所示，无任何抗体显示出任何诱导Ca++流的激动活性。表2.不同人源化抗体在结合测定和趋化性测定中所确定的IC50值 
N.D.＝未确定
在表2中，Ab1具有IgG1骨架中的人源化抗CXCR3V44D7VH主要#5的重链氨基酸序列和人源化抗CXCR3V44D7VK主要#1的轻链序列(参见非正式序列表)。Ab2具有IgG1骨架中的人源化抗CXCR3V44D7VH主要#5的重链序列和人源化抗CXCR3V44D7VK主要#7的轻链序列(参见非正式序列表)。Ab3具有IgG1骨架中的人源化抗CXCR3V44D7VH主要#5的重链氨基酸序列和人源化抗CXCR3V44D7VK主要#2的轻链序列(参见非正式序列表)。Ab4具有IgG1骨架中的人源化抗CXCR3V44D7VH主要#5的重链序列和人源化抗CXCR3V44D7VK主要#3的轻链序列(参见非正式序列表)。Ab5具有IgGI骨架中的人源化抗CXCR3V44D7VH主要#5的重链氨基酸序列和人源化抗CXCR3V44D7VK主要#4的轻链序列(参见非正式序列表)。Ab6具有IgGI骨架中的人源化抗CXCR3V44D7VH主要#5氨基酸的重链序列和人源化抗CXCR3V44D7VK主要#5的轻链序列(参见非正式序列表)。
Claims (98)
1.一种特异性结合CXCR3的抗原结合性多肽，所述多肽包含：
(a)人源化抗体重链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列(NYMAS)的CDR-H1；
(2)包含氨基酸序列(TISSGGGYTYYPDSLKG)的CDR-H2；和
(3)包含氨基酸序列(HGAPMTTVITYAPYYF{D，Y}Y)的CDR-H3；以及
(b)人源化抗体轻链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列(RASSSVKYMY)的CDR-L1；
(2)包含氨基酸序列(YTSNLAP)的CDR-L2；和
(3)包含氨基酸序列(QQFTTSPYT)的CDR-L3。
2.权利要求1的多肽，其中CDR-H3包含氨基酸序列(HGAPMTTVITYAPYYFYY)。
3.权利要求1或2的多肽，其中CDR-H3包含氨基酸序列(HGAPMTTVITYAPYYFDY)。
4.权利要求1-3中任一项的多肽，其中：
(1)CDR-H1由氨基酸序列(NYMAS)组成；
(2)CDR-H2由氨基酸序列(TISSGGGYTYYPDSLKG)组成；
(3)CDR-H3由氨基酸序列(HGAPMTTVITYAPYYF{D，Y}Y)组成；
(4)CDR-L1由氨基酸序列(RASSSVKYMY)组成；
(5)CDR-L2由氨基酸序列(YTSNLAP)组成；而
(6)CDR-L3由氨基酸序列(QQFTTSPYT)组成。
5.权利要求1-4中任一项的多肽，其中所述CDR-H3由氨基酸序列(HGAPMTTVITYAPYYFYY)组成。
6.权利要求1-5中任一项的多肽，其中所述人源化抗体重链可变区包含氨基酸序列(EV{M，Q}L{V，L}ESGGGLV{K，Q}PGGSL{K，R}LSCAASGFTFSNYAMSWVRQ{T，A}P{E，G}K{R，G}LEWV{A，S}TISSGGGYTYYPDSLKGRFTISRDN{A，S}KNTL{F，Y}LQM{S，N}SLR{S，A}EDTAVYYC{V，A}{R，K}HGAPMTTVITYAPYYF{D ，Y}YWGQGTT{L，V}TVSS)。
7.权利要求6的多肽，其中所述人源化抗体重链可变区包含氨基酸序列(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPKGLEWVSTISS GGGYTYYPDSLKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGAPMT TVITYAPYYFYYWGQGTTVTVSS)。
8.权利要求1-7中任一项的多肽，其中所述人源化抗体轻链可变区包含氨基酸序列({E，D}{I，N，V}V{L，M}TQSPA{T，F，I}{L，M}S{L，A，V}{S，T}{L，P}GE{R，K}{A，V}T{L，M，I}{S，T，N}CRASSSVKYMYWYQQK{S，P}{G，D}{Q，A}{A，S}P{R，K}L{L，W}I{Y，K}YTSNLAPG{I，V}P{A，S}RFSGSGSG{T，N}{D，S}{F，Y}{T，S}{L，F}TISS{M，L}E{A，G，P}ED{F，A}A{V，T}YYC{Q，Y}QFTT{S，Y}PYTFGGGTKLEIKR)。
9.权利要求8的多肽，其中所述人源化抗体轻链可变区包含氨基酸序列(EIVLTQSPATLSLSLGERATLSCRASSSVKYMYWYQQKSGQAPRLLIYYTSNL APGIPARFSGSGSGTDFTLTISSMEAEDFAVYYCQQFTTSPYTFGGGTKLEIKR)。
10.权利要求8的多肽，其中所述人源化抗体轻链可变区包含氨基酸序列(ENVLTQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVKYMYWYQQKPDQAPKLWIYYTS NLAPGVPSRFSGSGSGNDYTFTISSLEAEDAATYYCQQFTTSPYTFGGGTKLEIKR)。
11.权利要求1-10中任一项的多肽，其中所述多肽选自以下的抗体分子：Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、以及scFv分子。
12.权利要求11的多肽，所述多肽分子为抗体分子。
13.权利要求12的多肽，其中所述抗体为包含人重链恒定区和人轻链恒定区的嵌合抗体。
14.权利要求12或13的多肽，其中所述抗体为IgG分子(例如IgG1分子或IgG4分子)。
15.权利要求1的多肽，其中所述多肽为scFv分子。
16.权利要求15的多肽，其中所述scFv选自下式：NH2-L-VH-X-VK-COOH和NH2-L-VK-X-VH-COOH；上式中，L为前导序列；VH为人源化抗体重链可变区；X为连接多肽；VK为人源化抗体轻链可变区。
17.权利要求1-16中任一项的多肽，所述多肽与治疗药物或诊断药物缀合。
18.权利要求17的多肽，其中所述治疗药物选自：细胞毒剂、放射性标记、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活化治疗药物或其组合。
19.权利要求18的多肽，其中所述诊断药物选自：放射性标记、光活化诊断药物、超声促进剂或非放射性标记。
20.权利要求1-19中任一项的多肽，其中所述多肽为CXCR3的拮抗剂。
21.权利要求1-20中任一项的多肽，其中所述多肽并非CXCR3的激动剂。
22.权利要求1-21中任一项的多肽，其中所述多肽与CXCR3以至少约106M-1(优选至少约107M-1、更优选至少约108M-1、甚至更优选至少约109M-1)的亲和常数结合。
23.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-22中任一项的多肽和载体。
24.权利要求23的药物组合物，所述药物组合物进一步包含另外的治疗药物或诊断药物。
25.一种治疗或诊断炎症性疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予权利要求23或24中任一项的组合物。
26.一种治疗或诊断免疫疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予权利要求23或24中任一项的组合物。
27.一种治疗或诊断恶性疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予权利要求23或24中任一项的组合物。
28.权利要求24-27中任一项的方法，其中所述疾病或病症选自：自身免疫病(例如狼疮)、炎症性肠病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、关节炎(例如类风湿性关节炎)、多发性硬化症、移植排斥、中枢神经系统损伤、局限性肠炎、银屑病、白血病或淋巴瘤(例如慢性淋巴细胞白血病(CLL))。
29.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-22中任一项的多肽。
30.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码包含人源化抗体重链可变区的多肽，所述人源化抗体重链可变区包含：
(1)包含氨基酸序列(NYMAS)的CDR-H1；
(2)包含氨基酸序列(TISSGGGYTYYPDSLKG)的CDR-H2；和
(3)包含氨基酸序列(HGAPMTTVITYAPYYF{D，Y}Y)的CDR-H3。
31.权利要求30的多肽，其中所述人源化抗体重链可变区包含氨基酸序列(EV{M，Q}L{V，L}ESGGGLV{K，Q}PGGSL{K，R}LSCAASGFTFSNYAMSWVRQ{T，A}P{E，G}K{R，G}LEWV{A，S}TISSGGGYTYYPDSLKGRFTISRDN{A，S}KNTL{F，Y}LQM{S，N}SLR{S，A}EDTAVYYC{V，A}{R，K}HGAPMTTVITYAPYYF{D ，Y}YWGQGTT{L，V}TVSS)。
32.权利要求31的多肽，其中所述人源化抗体重链可变区包含氨基酸序列(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPKGLEWVSTISS GGGYTYYPDSLKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGAPMT TVITYAPYYFYYWGQGTTVTVSS)。
33.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码包含人源化抗体轻链可变区的多肽，所述人源化抗体轻链可变区包含：
(1)包含氨基酸序列(RASSSVKYMY)的CDR-L1；
(2)包含氨基酸序列(YTSNLAP)的CDR-L2；和
(3)包含氨基酸序列(QQFTTSPYT)的CDR-L3。
34.权利要求33的多核苷酸，其中所述人源化抗体轻链可变区包含氨基酸序列({E，D}{I，N，V}V{L，M}TQSPA{T，F，I}{L，M}S{L，A，V}{S，T}{L，P}GE{R，K}{A，V}T{L，M，I}{S，T，N}CRASSSVKYMYWYQQK{S，P}{G，D}{Q，A}{A，S}P{R，K}L{L，W}I{Y，K}YTSNLAPG{I，V}P{A，S}RFSGSGSG{T，N}{D，S}{F，Y}{T，S}{L，F}TISS{M，L}E{A，G，P}ED{F，A}A{V，T}YYC{Q，Y}QFTT{S，Y}PYTFGGGTKLEIKR)。
35.权利要求34的多核苷酸，其中所述人源化抗体轻链可变区包含氨基酸序列(EINVLTQSPATLSLSLGERATLSCRASSSVKYMYWYQQKSGQAPRLLIYYTS NLAPGIPARFSGSGSGTDFTLTISSMEAEDFAVYYCQQFTTSPYTFGGGTKLEIKR)。
36.权利要求34的多核苷酸，其中所述人源化抗体轻链可变区包含氨基酸序列(ENVLTQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVKYMYWYQQKPDQAPKLWIYYTS NLAPGVPSRFSGSGSGNDYTFTISSLEAEDAATYYCQQFTTSPYTFGGGTKLEIKR)。
37.一种重组多核苷酸，所述多核苷酸包含与权利要求29-36中任一项的多核苷酸有效连接的启动子序列。
38.一种分离的细胞，所述细胞转化有权利要求37的多核苷酸。
39.一种制备由权利要求37的重组多核苷酸所编码多肽的方法，所述方法包括：
a)培养转化有重组多核苷酸的细胞，以表达所编码多肽；和
b)回收如此表达的多肽。
40.一种人源化抗体重链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列({N，S，Y}MAS)的CDR-H1；
(2)包含氨基酸序列
({T，A，Y}I{S，Y}{S，G，T，Y}{G，S}{G，Y}G{F，S，Y}TYY{P，A}DS{L，Y，V}KG)的CDR-H2；和
(3)包含氨基酸序列
{H，Y}{G，Y}{A，Y}PM{T，Y}T{V，Y}ITY{A，Y}PYYFYY的CDR-H3。
41.权利要求40的人源化抗体重链可变区，其包含氨基酸序列(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS{N，S，Y}YAMSWVRQAPGKGLEWVS{T，A，Y}I{S，Y}{S，G，T，Y}{G，S}{G，Y}G{F，S，Y}TYY{P，A}DS{L，Y，V}KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK{H，Y}{G，Y}{A，Y}PM{T，Y}T{V， Y}ITY{A，Y}PYYFYYWGQGTTVTVSS)。
42.一种人源化抗体重链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列(NYAIS)的CDR-H1；
(2)包含氨基酸序列(TYSSGGVYTYYRDSLKG)的CDR-H2；和
(3)包含氨基酸序列(HGAAMTTVITYAPFYFYY)的CDR-H3。
43.权利要求42的人源化抗体重链可变区，其包含氨基酸序列(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAISWVRQAPGKGLEWVSTYS SGGVYTYYRDSLKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGAAM TTVITYAPFYFYYWGQGTTVTVSS)。
44.一种人源化抗体重链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列(YYAMS)的CDR-H1；
(2)包含氨基酸序列(TIYSGGSYTFYPDSLEG)的CDR-H2；和
(3)包含氨基酸序列(HGAPMSTEITYAPYYFYY)的CDR-H3。
45.权利要求44的人源化抗体重链可变区，其包含氨基酸序列(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYAMSWVRQAPGKGLEWVSTI YSGGSYTFYPDSLEGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGAPM STEITYAPYYFYYWGQGTTVTVSS)。
46.一种人源化抗体重链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列(NYAMS)的CDR-H1；
(2)包含氨基酸序列(TIYSGGGYTFYLDSLKG)的CDR-H2；和
(3)包含氨基酸序列(HSYPMTTVITYAPYYFYY)的CDR-H3。
47.权利要求46的人源化抗体重链可变区，其包含氨基酸序列(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMSWVRQAPGKGLEWVSTI YSGGGYTFYLDSLKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHSYP MTTVITYAPYYFYYWGQGTTVTVSS)。
48.一种人源化抗体重链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列(NYAMS)的CDR-H1；
(2)包含氨基酸序列(TISSGGGYTYYPDSLKG)的CDR-H2；和
(3)包含氨基酸序列(HGAPMTTVITYAPYYFYY)的CDR-H3。
49.权利要求48的人源化抗体重链可变区，其包含氨基酸序列(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTI SSGGGYTYYPDSLKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGAP MTTVITYAPYYFYYWGQGTTVTVSS)。
50.一种人源化抗体重链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列(NYYAMS)的CDR-H1；
(2)包含氨基酸序列(TISSGGGYTYYPDSLKG)的CDR-H2；和
(3)包含氨基酸序列(HGAPMTTVITYAPYYFYY)的CDR-H3。
51.权利要求50的人源化抗体重链可变区，其包含氨基酸序列(EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSTI SSGGGYTYYPDSLKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGAP MTTVITYAPYYFYYWGQGTTVTVSS)。
52.一种人源化抗体轻链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列(RASSSVKYMY)的CDR-L1；
(2)包含氨基酸序列(YTSNLAP)的CDR-L2；和
(3)包含氨基酸序列(QQFTTSPYT)的CDR-L3。
53.权利要求52的人源化抗体轻链可变区，其包含氨基酸序列(EIVLTQSPATLSLSLGERATLSCRASSSVKYMYWYQQKSGQAPRLLIYYTSNL APGIPARFSGSGSGTDFTLTISSMEAEDFAVYYCQQFTTSPYTFGGGTKLEIKR)。
54.一种人源化抗体轻链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列(RASSSVKYMY)的CDR-L1；
(2)包含氨基酸序列(YTSNLAP)的CDR-L2；和
(3)包含氨基酸序列(QQFTTSPYT)的CDR-L3。
55.权利要求54的人源化抗体轻链可变区，其包含氨基酸序列(EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVKYMYWYQQKPGQAPRLLIYYTSNL APGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFTTSPYTFGGGTKLEIKR)。
56.一种人源化抗体轻链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列(RASSSVKYMY)的CDR-L1；
(2)包含氨基酸序列(YTSNLAP)的CDR-L2；和
(3)包含氨基酸序列(YQFTTSPYT)的CDR-L3。
57.权利要求56的人源化抗体轻链可变区，其包含氨基酸序列(EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVKYMYWYQQKPGQAPRLLIYYTSNL APGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCYQFTTSPYTFGGGTKLEIKR)。
58.一种人源化抗体轻链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列(RASSSVKYMY)的CDR-L1；
(2)包含氨基酸序列(YTSNLAP)的CDR-L2；和
(3)包含氨基酸序列(QQYTTSPYT)的CDR-L3。
59.权利要求58的人源化抗体轻链可变区，其包含氨基酸序列(EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVKYMYWYQQKPGQAPRLLIYYTSNL APGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYTTSPYTFGGGTKLEIKR)。
60.一种人源化抗体轻链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列(RASSSVKYMY)的CDR-L1；
(2)包含氨基酸序列(YTSNLAP)的CDR-L2；和
(3)包含氨基酸序列(QQFTTYPYT)的CDR-L3。
61.权利要求60的人源化抗体轻链可变区，其包含氨基酸序列(EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVKYMYWYQQKPGQAPRLLIYYTSNL APGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFTTYPYTFGGGTKLEIKR)。
62.一种人源化抗体轻链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列
(RAS{S，Q}SV{K，S}SY{M，L}{Y，A})的CDR-L1；
(2)包含氨基酸序列({Y，D}{TA}SN{L，R}A{P，T})的CDR-L2；和
(3)包含氨基酸序列({Q，Y}Q{F，Y}TT{S，Y}PYT)的CDR-L3。
63.权利要求62的人源化抗体轻链可变区，其包含氨基酸序列(EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAS{S，Q}SV{K，S}SY{M，L}{Y，A}WYQQKPGQAPRLLIY{Y，D}{T，A}SN{L，R}A{R，T}GIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYC{Q，Y}Q{F，Y}TT{S，Y} PYTFGGGTKLEIKR)。
64.一种人源化抗体轻链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列(RASSSVKYMY)的CDR-L1；
(2)包含氨基酸序列(YTSNLAP)的CDR-L2；和
(3)包含氨基酸序列(QQFTTSPYT)的CDR-L3。
65.权利要求64的人源化抗体轻链可变区，其包含氨基酸序列(ENVLTQSPAFLSVTPGEKVTITCRASSSVKYMYWYQQKPDQAPKLWIYYTS NLAPGVPSRFSGSGSGNDYTFTISSLEAEDAATYYCQQFTTSPYTFGGGTKLEIKR)。
66.一种人源化抗体轻链可变区，其包含：
(1)包含氨基酸序列(RAS{S，Q}SV{K，S}SY{M，L}{Y，A})的CDR-L1；
(2)包含氨基酸序列({Y，D}{T，A}SN{L，R}A{P，T})的CDR-L2；和
(3)包含氨基酸序列(Q，Y}Q{F，Y}TT{S，Y}PYT)的CDR-L3。
67.权利要求66的人源化抗体轻链可变区，其包含氨基酸序列({E，D}{N，V}V{L，M}TQSPAFLSVTPGEKVTITCRAS{S，Q}SV{K，S}SY{M，L}{Y， A}WYQQKPDQAPKL{W，L}I{Y，K}{Y，D}{T，A}SN{L，R}A{P，T}GVPSRFSGSGSG{N，T}D{Y，F}TFTISSLEAEDAATYYC{Q，Y}Q{F，Y}TT{S，Y}PYTFGGGTKLEIKR)。
68.一种特异性结合CXCR3的抗原结合性多肽，所述多肽包含权利要求40-51中任一项的人源化重链和权利要求52-67中任一项的人源化轻链。
69.权利要求68的多肽，所述多肽包含权利要求48或49的人源化重链和权利要求52或53的人源化轻链。
70.权利要求68的多肽，所述多肽包含权利要求48或49的人源化重链和权利要求64或65的人源化轻链。
71.权利要求68的多肽，所述多肽包含权利要求48或49的人源化重链和权利要求54或55的人源化轻链。
72.权利要求68的多肽，所述多肽包含权利要求48或49的人源化重链和权利要求56或57的人源化轻链。
73.权利要求68的多肽，所述多肽包含权利要求48或49的人源化重链和权利要求58或59的人源化轻链。
74.权利要求68的多肽，所述多肽包含权利要求48或49的人源化重链和权利要求60或61的人源化轻链。
75.权利要求68-74中任一项的多肽，其中所述多肽选自以下的抗体分子：Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段以及scFv分子。
76.权利要求75的多肽，其中所述多肽为抗体分子。
77.权利要求76的多肽，其中所述多肽为包含人重链恒定区和人轻链恒定区的嵌合抗体。
78.权利要求76或77的多肽，其中所述抗体为IgG分子(例如IgG1分子或IgG4分子)。
79.权利要求75的多肽，其中所述多肽为scFv分子。
80.权利要求79的多肽，其中所述scFv选自下式：NH2-L-VH-X-VK-COOH和NH2-L-VK-X-VH-COOH；上式中，L为前导序列；VH为人源化抗体重链可变区；X为连接多肽；VK为人源化抗体轻链可变区。
81.权利要求68-80中任一项的多肽，所述多肽与治疗药物或诊断药物缀合。
82.权利要求81的多肽，其中所述治疗药物选自：细胞毒剂、放射性标记、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光活化治疗药物或其组合。
83.权利要求81的多肽，其中所述诊断药物选自：放射性标记、光活化诊断药物、超声促进剂或非放射性标记。
84.权利要求68-83中任一项的多肽，其中所述多肽为CXCR3的拮抗剂。
85.权利要求68-84中任一项的多肽，其中所述多肽并非CXCR3的激动剂。
86.权利要求68-85中任一项的多肽，其中所述多肽与CXCR3以至少约106M-1(优选至少约107M-1、更优选至少约108M-1、甚至更优选至少约109M-1)的亲和常数结合。
87.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求68-86中任一项的多肽和载体。
88.权利要求81的药物组合物，所述药物组合物进一步包含另外的治疗药物或诊断药物。
89.一种治疗或诊断炎症性疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予权利要求87或88的组合物。
90.一种治疗或诊断免疫疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予权利要求87或88的组合物。
91.一种治疗或诊断恶性疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予权利要求87或88的组合物。
92.权利要求89-91中任一项的方法，其中所述疾病或病症选自：自身免疫病(例如狼疮)、炎症性肠病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、关节炎(例如类风湿性关节炎)、多发性硬化症、移植排斥、中枢神经系统损伤、局限性肠炎、银屑病、白血病或淋巴瘤(例如慢性淋巴细胞白血病(CLL))。
93.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求40-51中任一项的人源化重链可变区。
94.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求52-67中任一项的人源化轻链可变区。
95.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求68-86中任一项的多肽。
96.一种重组多核苷酸，所述多核苷酸包含与权利要求93-95中任一项多核苷酸有效连接的启动子序列。
97.一种分离的细胞，所述细胞转化有权利要求96的多核苷酸。
98.一种制备由权利要求96的重组多核苷酸所编码多肽的方法，所述方法包括：
a)培养转化有重组多核苷酸的细胞，以表达所编码多肽；和
b)回收如此表达的多肽。
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