JPH06503956A - 腫瘍細胞に対する標的決定ＩｇＥエフェクター細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍細胞に対する標的決定１ｇＥエフェクター細胞本発明は結合分子に関する。

特に、本発明はＩｇＥエフェクター機能を助力することができる結合分子、それ らの調製方法及び宿主哺乳類、特にヒトにおける癌細胞及び多細胞腫瘍の破壊へ のそれらの使用に関する。特に、本発明は、■又は複数タイプのＦｃε１／セプ ターを結合できる結合ドメインを含む分子に関する。

本発明はさらに、前記結合分子が活性成分である医薬製剤及びそれらの調製方法 にも関する。

ＩｇＥエフェクター機構の利用性をより十分に理解するために、まず、ＩｇＨの 生物学のいくつかの観点を説明することが必要である。

ＩｇＥは２種のＨ鎖及び２種のし鎖から成る。Ｌ鎖はすべての抗体イソタイプの し鎖をコードする遍在性カッパ及びラムダ遺伝子種に由来する。ニブシロン（ε ）Ｈ鎖はＩｇＨのために決定的であり、モしてＮ−末端可変ドメインＶＨ及び４ 種の不変ドメインＣε１−Ｃε４を含む。他の抗体インタイブに関して、可変ド メインは抗原特異性を付与し、そして不変ドメインはイソタイプ特異的エフェク ター機能を助力する。

ｆｇＥは、それが補体を固定できず、そして単核細胞及び好中球の表面上に発現 されるＦｃレセプターＦｃＲ１，ＲＩＩ及びＲｍに結合しないことにおいて、よ り多くのＩｇＧイソタイプとは異なる。しかしながら、それは、肥満細胞及び好 塩基球上の“高い親和性”レセプター　（ＦｃεＲＩ、　Ｋａ、１０’Ｍ−’） 　、及び炎症細胞（マクロファージ、好酸球、血小板）及びＴ及びＢリンパ球上 に発現される“低親和性”レセプター、Ｆｃｅ　ＲＩＩ　（ＫＡ、１０’Ｍ−’ ）とヒショウニ特異的ニ相互作用できる。それらのレセプター相互作用を担当す るＩｇＢ上の部位は、Ｃεε上上のペプチド配列の地図で表わされ、そして明白 である。Ｆｃｅ　ＲＩ部位は、Ｇｉｎ　３０１とＡｒｇ　３７Ｂとの間の残基に より創造される割れ目に存在し、そしてＣε２とＣε３ドメインとの間に連結部 を含む［：Ｈｅ１ｍ、　Ｂ、など、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３１．１８０ 〜１８３　〕。

Ｆｃε　ＲＩＩ結合部位は、残基Ｖａｌ　３７０のまわりのＣε３内に位置する ＣＶｅｒｃｅｌｌｉ、　Ｄ、など、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ　３３８．６４９ 〜６５１　）　、　２種のレセプターを区別する主な差異は、Ｆｃｅ　ＲＩがモ ノマーＣεを結合し、そしてＦｃｅ　ＲＩＩが二量体化されたＣεを単に結合し 、すなわち２種のＣε鎖が関連すべきであることである。ＩｇＥはインビボでグ リコジル化されるが、これはＦｃｅ　ＲＩ及びＦｃｅ　ＲＩＩへのその結合のた めには必ずしも必要でない。結合は、グリコジル化の存在下で実際、わずかに強 い［Ｖｅｒｃｅｌｌｉ、　Ｄ、など、　（１９８９）前記〕。

先進国において、ＩｇＢイソタイプはアレルギーに最っとも頻繁に関連し、ここ で無害な抗原、たとえば花粉及びハウスダストに対して向けられたＩｇＢ抗体は ぜんそく及び花粉症の徴候を導びくタイプＩ過敏症反応を仲介する。ＩｇＨに対 する実質的にすべての現在の研究は、それらの不適切な免疫応答を阻害する手段 に向けられる〔たとえばＨｅ１ｍ、　Ｂ、など、　（１９８８）ｅｔ、前記、、 Ｖｅｒｃｅｌｌｉ　Ｄ、など、　（１９８９）ｅｔ、前記〕。

しかしながら、一般的には、ＩｇＢは寄生虫感染を攻撃するように展開すると思 われる（なぜならば、大部分、それはこの目的に対して十分に適合され、そして 他には適合されないからである）。多細胞病原体による感染を攻撃することにお けるＩｇＨの効能は、第二世界におけるヒト及び家畜の住血吸虫、腸内寄生虫に より例示される。

侵入する住血吸虫は、細胞毒性Ｔ細胞の作用に対して耐性であるが［Ｂｕｔｔｅ ｒｗｏｒｔｈ、　Ａ、　Ｅ、など、（１９７９）Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌ　１２２． １３１４−１３２１）　、Ｌかし抗体依存性細胞介在細胞毒性（ＡＤＣＣ）反応 における炎症細胞により破壊され得る［Ｃａｐｒｏｎ、　Ａ、など、（１９８６ ）Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｔｏｄａｙ　７．１５−１８）。

インビトロにおいて、免疫血清とのＡＤＣＣの反応は、ＩｇＨに少なくとも一部 依存する。なぜならば、不適切な骨髄腫１ｇＢ競争体及び抗−Ｆレセプター抗体 を包含する、ＩｇＢの選択的消耗は、好酸球、マクロファージ及び血小板により 殺害能力をひじように激的に低めるからである。ＩｇＨにより開始される細胞毒 性応答はひじように激しい。

ＩｇＨのエフェクター性質は表１及び２に要約されている。一定のＩｇＧサブク ラスはまた、好酸球（但し、血小板又はマクロファージにはよらない）によりＡ ＤＣＣを指図することができるが、但し、好酸球が、たとえばアレルギー性疾患 を有する供与体から“活性化”される場合においてのみである［Ｋｈａｌ　ｉｆ ｅ、　Ｊ、など、　（１９７９）Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４２．４４２２〜 ４４２７）。しかしながら、炎症細胞は、抗体イソタイプが結合されることにま ったく異なって依存して応答できる。例えば、ＩｇＧにより引き起こされる好酸 球はカチオン性タンパク質を開放するが、しかし好酸球ペルオキシダーゼはほと んど開放せず、そしてＩｇＢにより引き起こされた細胞に関しては前記の逆であ る［Ｃａｐｒｏｎ、　Ａ、など。

前記］。それらの発見は、他のイソタイプに対立するものとしてＩｇＢが、いく つかの治療用途に現想的に適合されるユニーク且つ破壊的な免疫応答を呼び寄せ るｔｉ概念を強化するように作用する。

寄生虫及びアレルゲン、すなわちＩｇ［！応答の好ましい標的により共有される 通常の性質は、両者が免疫システムの細胞よりも多くなる傾向があることである 。多くの外来性物体の破壊は、免疫処理、すなわち食作用の通常の手段がそれ自 体では無効果であるので、免疫システムのために困難な問題を提供する。

本出願者は、固体腫瘍が多くの多細胞寄生体の問題に類似する問題を提供し、そ して腫瘍の抗原に対するＩｇＢのような応答が腫瘍の破壊をもたらすことを現実 化した。本出願者は、ＩｇＥエフェクター機能の阻害よりもむしろ、それらの機 能をインビボで活性的に助力できる治療剤が相当な有用性を有するであろうこと をさらに現実化した。本発明の１つの観点は、ＩｇＥエフェクター機能をインビ ボで助力できる配列を組込むような抗原特異的結合分子の使用に関する。

本発明の第２の観点は、ＩｇＢエフェクター機能が癌細胞及び固体腫瘍の現場で の破壊、及び宿主本体中への再導入のために意図された宿主組織の外植体におい て特に効果的であろうことである。

癌細胞を殺害するためへのモノクローナル抗体の使用は、その処理の効能が循環 抗体への癌細胞の接近能力及び天然のエフェクター機構又は抗体に結合される毒 素又は放射性同位体による殺害の有効性に依存するので、制限された効力を有す る（Ｍｅｎａｒｄ、　Ｓ、　、　Ｃａｎｅｖａｒｉ。

Ｓ、　ａｎｄ　Ｃｏｌｎａｇｈｉ、Ｍ、１（１９９０）Ｉｎｔ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｍａｒｋｅｒｓ、４．　１３１〜１３４　；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ、　Ｉ　ａｎｄ 　Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ、に、Ｅ。（１９８９）　Ｉｎｔ、　Ｊ　Ｒａｄ、　Ａｐ ｐｌ、　ＩｎｓｔｒａｍB １６、６１３〜６１６を参照のこと〕。標的抗原をもはや発現しない腫瘍細胞の 逃避により引き起こされる問題がまた存在し、そして従って殺害に対して耐性が ある。癌療法のために今日まで使用されて来たほとんどの抗体は、イソタイプの ＩｇＧのものである。

ＩｇＥエフェクター機構は癌療法には使用されたことがないが、しかし本出願者 は、それが特に固体腫瘍に対して驚くべき効能があるであろうと信じている。Ｉ ｇＥエフェクター機構は、ひじょうに細胞毒性であり、そして多くの非協力的な 外来性病原体又はアレルゲンを処理するために特異的に発生すると思われる。さ らに、炎症工程は局在するが、それらは標的の表面へよりも、むしろその接近性 に制限されない。これは、腫瘍の部位でいくらかの正常な細胞の破壊をもたらす が、しかし好都合な観点は、この特徴が、大部分の細胞が本明細書に提供される 分子の抗原特異的結合ドメインにより認識される抗原を発現する限り、変異細胞 による突破を不適切にするであろうことである。

ＩｇＥエフ主クダクターの特定部位への標的化を可能にするためには、特異的結 合分子がＦｃεレセプターと特異的相互作用できる配列を包含するか又はその配 列に関連することが必要である。好ましくは、抗原結合ドメイン及びＦｃεレセ プターと特異的相互作用できる配列が、たとえば化学結合又は組換えＤＮＡ技法 を用いて共有的に関連される。抗原結合ドメインは、Ｆｃεレセプター、例えば ＩｇＥ抗体と特異的相互作用できる配列と自然に関連され得る。

結合分子は、所望する標的、たとえば腫瘍抗原と結合相互作用できるいづれかの 化合物であり得る。たとえば、結合分子はペプチド、レセプター又はそのフラグ メント、又はリザンドであり得る。最つとも好ましくは、結合分子は１又は複数 の抗体可変ドメインを含んで成る。抗体可変ドメインは、いづれかの源、たとえ ばハイブリドーマ技法により生成されるモノクローナル抗体及び組換えＤＮＡ方 法により完全に又は部分的に生成されるものに由来する〔国際特許出願ＰＣＴ／ ＧＢ９１１０１１３４　；　Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ、ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ １１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３４９、２９３〜２９９〕　。

■又は複数の抗体可変ドメイン及びＦｃεレセプターと特異的相互作用できる配 列が融合タンパク質として生成されるように、抗体可変ドメインをコードする核 酸フラグメントが生成され得、そしてＦｃεレセプターと特異的相互作用できる 配列をコードする核酸フラグメントに結合され得るいくつかの手段が存在するこ とは当業者に明らかであろう。好ましくは、Ｈ及びＬ鎖可変ドメインは、適切な オリゴヌクレオチドブライマーを用いてｍＲＮＡ又はＤＮＡのポリメラーゼ鎖増 幅（ＰＣＲ）により生成され、そして発現ベクター中に連結されＷｉｎｔｅｒ　 Ｇ、ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３４９．２９ ３〜２９９　；　Ｍａｒｋｓ　Ｊ。

核又は真核細胞におけるクローニングのために存在でき、モしてＦｃεレセプタ ーと特異的相互作用できるドメインをコードするＤＮＡ配列を含むことができる 。発現ベクターにおけるＦｃεレセプターと特異的相互作用できる配列は特定の 用途に構築される。そのような変更は標準のＤＮＡ操作技法［Ｓａｍｂｒｏｏｋ 、Ｊ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｉｓ。

Ｔ、　（１９８９）“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”、第２版、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）及び／又はＰＣＲ連結により容易に導入さ れ得る。

従って、本発明は、すべての又は選択されたエフェクター機能をインビボで助力 することにおいてＩｇＢを模倣する結合分子を供給する。ＩｇＥ介在のエフェク ター機能を誘導する基本出来事は、エフェクター細胞の表面上でのＦｃεレセプ ターの凝集である。これは通常、標的上の局在される抗原への抗原特異的１ｇＢ イソタイプ抗体の結合、続いて、ＦｃεレセプターによるＩｇＢ　Ｆｃεの結合 を通してエフェクター細胞上でのＦｃεレセプターの局在化により引き起こされ る。これはＩｇＢ依存性機構であり、そして本発明の１つの態様においては、適 切な抗原（たとえば腫瘍細胞表面マーカー、例えばＥｒｂＢ２）に対して特異的 な抗体が標準方法（Ｈａｒｌｏｗ、Ｅ、　ａｎｄ　Ｌａｎｅ、Ｄ、（１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）により単離 され、そしてそれがＩｇＥイソタイプとして単離されなければ、抗体クラススイ ッチング（Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ、前記）により又はより好ましくは 、組換え方法（Ｗｉｎｔｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、前記）によりＩｇＥ イソタイプに転換され得る。

ＩｇＥ特異的エフェクター機構が抗原特異的態様で活性化され得るＩｇＥ依存性 ルートが存在する。たとえば、複数の抗原結合特異性を有する二特異的抗体分子 （Ｗｉｎｔｅｒ　ａｎｄ　１Ｊｉｌｓｔｅｉｎ、前記）を含む調製物が使用され 得る。その二特異的抗体の１つの武装は標的抗原に対して特異的であり、そして 他はｌ又は複数のＦｃεレセプターに対する特異性を有する。この態様において 、標的抗原及びＩｇＥエフェクターの機構は接近せしめられ、モしてＦｃεレセ プターは、抗体による標的抗原との会合を通して凝集される。そのような手段は 、過剰発現されたマーカータンパク質、たとえば乳癌におけるｃｅｒｂ　Ｂ　− ２プロト癌細胞を有するそれらの癌に対して特に適切である（Ｓｔｙｌｅｓ。

Ｊ、Ｍ、など、、　（１９９０）　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　４５．３２ ０〜３２４　：］　ｏもう１つの態様は、適切な抗原のための特異性を有する抗 体融合分子及びＩ又は複数のＦｃεレセプターに結合するペプチド配列の構成で ある。そのペプチド配列は、ＩｇＢ抗体の一部分を結合するＦｃεレセプターに 由来する。

本明細書に開示される結合分子は原核又は真核宿主において製造され得る。好ま しくは、その物質は原核宿主、たとえばＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）において製造 される。他方、容易に発酵された原核生物、たとえばＥ、コリにおける生成は費 用に関して好都合であるけれども、それらは真核細胞、たとえばＣＨＤ細胞にお いて生成され得る。

分子は、−末鎖融合タンパク質として又はヘテロ−マルチマータンパク質として 生成され、ペリプラズムに標的を向けられ、増殖培地中に分泌され、又は不溶性 タンパク質として細胞質に生成され、そして活性コンホメーシヨンにインビトロ で再生され得る（Ｈｕｓｔｏｎ。

Ｊ、　Ｓ、など、　（１９８８）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＩＪＳＡ　８５．５８７９〜５８８３　；Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ、　Ｒ， など（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９．１３６２〜１３６７　；イ ギリス特許第２１３７６３１Ｂ号、ヨーロッパ特許出願ＥＰ３２４１６２）。

従って、本発明は、腫瘍抗原に結合できる第１結合ドメイン及び免疫システムの 細胞上のＦｃεレセプターに結合できる第２結合ドメインを含んで成る分子を供 給し、それによって、前記分子は、前記抗原を発現する腫瘍細胞に対してＩｇＢ エフェクター機構を仲介することができる。前記第１及び／又は第２結合ドメイ ンは、天然に存在する結合ドメインと完全に又は一部相目する合成の類似体であ り得る。第２結合ドメインは、ヒト又は動物からのＩｇＥのＣＥ鎖と完全に又は 一部相目の類似体であるポリペプチド配列を含んで成る。

分子はまた、Ｆｃｅ　ＲＸ及びＦｃｅ　ＲＩＩレセプターのいづれか又は両者を 結合できる。分子は、第２結合ドメインを有することができ、ここでそのポリペ プチド配列は、治療を受けるヒト又は動物患者のＣ鎖のポリペプチド配列に類似 し又は同一である。第１及び第２結合ドメインは、免疫グロブリンから誘導でき る。第１及び第２結合ドメインは免疫グロブリン可変ドメインから誘導できる。

第１結合ドメインは免疫グロブリン可変ドメインから誘導でき、そして第２結合 ドメインは免疫グロブリンネ変領域から誘導できる。

分子はＩｇＥイソタイプの抗体であり得る。分子は、キメラ分子であり得、ここ で第１結合ドメインはＩｇＢ以外のイソタイプの免疫グロブリンから誘導でき、 そして前記第２結合ドメインはイソタイプＩｇＢの免疫グロブリンから誘導でき る。

本発明はまた、上記に定義されたような分子を含む培養培地、腹水、血清又は医 薬のサンプルを供給する。本発明はまた、癌の処置のための医薬を調製するため に上記のような分子を用いての方法も提供する。そのような方法は、一定の癌の ための分子の治療的活性量を決定し、そしてその適切な量と１又は複数の薬理学 的に許容できる賦形剤とを混合することを含んで成る。

本発明はまた、患者に上記のような分子を含む医薬を投与することを含んで成る 、動物又はヒト患者を処理するための方法も提供する。動物又はヒトから外植さ れた組織をエクス　ビボ（ｅｘ　ｖｉｖｏ）で処理するための方法が同様にして 提供される。

本発明はまた、上記のような分子を製造するための組換え方法を提供する。その 方法は、前記第１及び第２結合ドメインのいづれか又は両者をコードするヌクレ オチド配列を得、また適切な調節配列を組込む１又は複数の発現ベクターにヌク レオチド配列を挿入し、その１又は複数の発現ベクターにより宿主細胞を形質転 換し、それらが前記第１及び／又は第２結合ドメインとして前記ヌクレオチド配 列を発現する条件下で宿主細胞を増殖し、そして前記第１及び／又は第２結合ド メインを回収することを含んで成る。前記宿主細胞はＥ、コリであり得る。ヌク レオチド配列は、ポリメラーゼ鎖反応の使用により得られる。

誘発をより十分に理解するために、次の例が与えられるが、それらは本発明を例 示するものであって、制限するものではない。

例 癌細胞の細胞表面成分に対して向けられた抗体特異性の単離及び免疫グロブリン Ｅクラス抗体中へのその転換はとんどの場合、ハイブリドーマ技法を用いて単離 された細胞表面マーカーに対して所望する特異性を有するモノクローナル抗体は 異なったサブクラスのものであろう。たとえば、ＣＡＭＰＡＴＨシリーズの抗体 （Ｇ、Ｈａｌｅなど、　（１９８３）Ｍｏｌｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　１ ．３０５〜３１９）はリンパ球上の細胞表面マーカーに対して方向づけられ、そ してリンパ腫の処理に治療的に使用されて来たその１つはいくつかのサブクラス のモノクローナル抗体を含むが、しかしＩｇＥサブタイプは含まない。

ハイブリドーマ技法により誘導された、細胞表面マーカに対して所望する特異性 を有するモノクローナル抗体をＩｇＥサブタイプに転換するために、前記抗体の Ｈ及びＬ鎖の可変領域をコードするＤＮＡを、適切なプライマー、たとえばＴ、 　Ｃ１ａｃｋｓｏｎなど（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３５２．６２４〜６２８に より記載されるプライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応を用いて別々に増幅する 。次に、Ｈ鎖可変領域を、スチッキーフィート変異誘導（ｓｔｉｃｋｙｆｅｅｔ 　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｔ、Ｃ１ａｃｋｓｏｎ　＆　Ｇ、Ｗｉｎｔｅｒ。

（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１７．１０１６３〜１０ １７０）のような技法により、免疫グロブリンＥの不変ドメインをコードするベ クター、たとえばｐＳＶ−Ｖ’ＮｐＨＥ　（Ｍ、　Ｓ、　Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒな ど、Ｎａｔｕｒｅ　３１４．２６８〜２７０．１９８５）中にサブクローンし、 前記ベクターに含まれる可変領域と増幅によりちょうど生成された癌細胞表面マ ーカーに対して特異的なＨ鎖可変領域とを置換する。他方、可変領域を置換する ための適切な制限部位を、部位特異的突然変異誘発により導入しくＪ、Ｒ，５ａ ｙｅｒｓ　＆　Ｆ。

Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９８９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　：　Ａ　 Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　２７９〜２９５ページ、　Ｔ、　Ｃｒ ｅｉｇｈｔｏｎ出版者、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ）、そして新規可 変領域を挿入する。Ｌ鎖可変ドメインを、０ｒｌａｎｄｉなど（１９８９）前記 により記載されるようにして発現ベクター、たとえばｐｓｉ−ｈｙｇ−Ｈｕｃｋ 中にサブクローン化する。次に、挿入体を含む２種のベクターを、適切な制限酵 素により線状化し、そして電気穿孔法（Ｈ，Ｐｏｔｔｅｒなど。

（１９８４）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ 、　８１．７１６１〜７１６３）により非分泌性骨髄腫原ＮＳＯ（Ｊ、Ｆ、Ｋｅ ａｒｎｅｙなど、　（１９７９）Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、　１２３．１５４８〜 １５３０）中にコトランスフェクトする。抗生物質選択に続いて、細胞を、たと えば１２５Ｉ−抗−ＩｇＥ抗体による固定された腫瘍細胞の単層上での固相ラジ オイムノアッセイを用いて、適切なＩｇＢイソタイプを含む抗体の分泌について 及び細胞表面マーカーに対する特異的結合についてスクリーンする。次に、適切 な特異性の［ｇＥ抗体を分泌する細胞を培養し、治療用途のために十分な量で抗 体分子を生成する。ネズミハイブリドーマ技法から誘導されたそのような抗体は 、インビボ療法のために使用される前、“ヒト適合（ｈｕｍａｎｉｓｅｄ）”（ Ｌ。

Ｒｉｅｃｈｍａｎｎなど、Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２，３２３〜３２７　 ）される必要がある。

細胞表面マープアーに対しで向（ｊられる特異性を有するヒト抗体を使ＩＶ１す るこ、Ｆが好まし、い。ヒトモ、ツクローナール抗体は製造するのにこれまで難 かし、かった。ｙらに、自己細胞−Ｆ、の細胞表面マーカーに対１）τ向けらね る細胞発現抗体は晴乳類においてりＩ’ｆｆ−ン的に欠失され、そ（，５て従っ て、１％＋へのために利用でき！肩代、ファージ抗体技法（Ｊ、　Ｄ、　Ｍａｒ ｋｓなど、　（１９９１）、１．　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２２２、ｂ８１・− ５９’７）は、この問題に刻する可能性ある解決策を提供する。免疫化されてい ないヒトに由来するファージ表示ライブラリィ−の使用は、ヒトが暴露されてい ない外来性抗原のみならず、また循環自己抗原、すなわち腫瘍壊死因子に対する 抗体の単離を可能にした（Ｊ、　Ｄ、　Ｍａｒｋｓなど（１９９１）前記）。こ れは、それらのライブラリィ−からの腫瘍細胞マーカーに対して向けられた抗体 を単離することの予想を生ぜしめる。各類の種々のクローンを含むファージ表示 ライブラリィ−を、Ｍａｒｋｓなど（１９９１）前記により記載しているように して製造する。それらはファージ上に発現される一重鎖Ｆｖフラグメントのライ ブラリィ−の生成を説明するが、しかしＦａｂ又はＦｖフラグメントのライブラ リィ−が代わりのものとして使用され得る。腫瘍細胞マーカーに対して特異的で ある抗体を選択するためには、抗体ライブラリィ−をまず、腫瘍細胞に結合し、 たとえばリン酸緩衝溶液により洗浄し、非特異的結合ファージを除去し、そして 特異的に結合されたファージを、ｒｈＤ抗原を発現する血液細胞に対してバンニ ングすることによって、血液細胞のｒｈＤ抗原に対して向けられた抗体の富化の ためにｐＨ２，８のクエン酸塩緩衝液を用いて溶離する。ファージの集団を、正 常な細胞に対するファージ集団を見出し、そして細胞に結合しなかったファージ を選択することによって、正常な細胞に結合する抗体を発現する集団のために消 耗することができる。これは、腫瘍細胞に対してバンニングする前又は後で行な われ得る。腫瘍がクローン化された形で利用できる、細胞表面マーカーをコー・ −ドする癌遺伝子、たとえば乳癌に包含されるｅｒｂ−２癌原遺伝子により引き 起こされる場合、他の方法が利用できる。細胞系を前記癌遺伝子により形質転換 し、（してファージライブラリィ−を形質転換されなかった細胞に対して消耗し 、そして細胞表面マーカーに対（、て特異的なファージを前記形質転換された細 胞を用いて選択する。クローン化された細胞表面マーカータンパク質が精製され た形で利用できる場合、ライブラリィ−は、たとえば被覆された管上でバンニン グすることによって、マーカータンパク質に対して直接的にバンニングされ得る 。従って、それらの方法のいづれかにより単離されたファージクローンを、癌細 胞の単層を用いての１２ｓＩ−抗バクテリオファージｆｄを用いる固相ラジオイ ムノアッセイのような方法により腫瘍細胞に対しての特異的結合について個々に スクリーンする。次に、ＶＨ及びＶＬドメインを、所望する特徴を有する腫瘍細 胞に特異的に結合する選択されたファージクローンからポリメラーゼ鎖反応によ り個々に増幅する。

ＶＨドメインを、ｐＳＶ−ＶＮＰＨＥ中に、及びＶＬドメインをｐｓＶ−ｈｙｇ −Ｈｕｃｋ中にクローン化し、ＮＳＯ中にトランスフェクトシ、そして細胞を上 記のようにしてスクリーンする。ファージ表示のための抗体フラグメントは、他 方、マウス免疫グロブリン遺伝子、たとえばヒト腫瘍物質により免疫化されたマ ウスに由来する。このようにして生成された抗体は、インビボでの治療用途のた めには、ヒト適合される必要がある。

このシステムの開発は、Ｅ、コリからの、ＩｇＨエフェクター機能を有する抗体 を発現し、そして分泌することである。今日まで、完全な抗体、たとえばＥ、コ リから免疫グロブリンＥを発現することは不可能であった。しかしながら、Ｆａ ｂフラグメントが発現され、そして分泌された（Ａ、　５ｋｅｒｒａなど、（１ ９９０）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｌｅｒｓ　２７１．２０３〜２０６）。上記のように して得られた抗体からのＶＨドメインを融合ベクター中にクローニングすること によってＩｇＢエフェクター機能を保持する相当のフラグメントを構築すること が可能である。このベクターは、エフェクター機能を提供する免疫グロブリンＥ ドメイン、すなわち低い親和性レセプターの場合、ＣＨ３及びＣＨ２又はＣＨ４ （Ｄ。

Ｖｅｒｅｅｌｉなど（１９８９）前記）及び高い親和性レセプターの場合、ＣＨ ２及びＣＨ３（Ｂ、Ｈｅ１ｍなど（１９８８）前記）との直接的な融合の生成を 可能にするＩｇＥ配列をコードする。次に、それらのＶＨ−［ｇＥドメイン融合 は、ＣＬドメイン又はそれが同時発現されるＶＨドメインに融合される同じＩｇ Ｂ不変ドメインのいづれかにより融合されるその対応するＶＬドメインと組合し て発現される。他方、ＶＨ−１ｇＥドメイン融合及びＶＬ−１ｇＥ融合は組換え ＤＮＡ技法により一緒にアセンブルされ得、そしてそのアセンブルされた遺伝子 が発現ベクター、たとえばｐＵｃ１１９又はｐＨＥＮ　Ｉ中にクローン化される （ＨＢ２１５１　（たとえばＨ，Ｒ，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍなど、（１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１９．４１３３〜４１５１においてＦａ ｂフラグメントについて記載されるような）における発現による）。Ｅ。

コリにおけるＩｇＥ融合の発現の手段の成功の機会は、グリコジル化がそのレセ プターへの免疫グロブリンＥの結合のために必要とされない事実により増強され る。

他方、ＩｇＥ不変ドメインの小さな方のフラグメントと共にエフェクター機能を 保持することが可能である。特に、ヒトＩｇＥＣＨ２及びＣＨ３ドメインの連結 部を拡張するペプチド、すなわちＧｌｎ３０１−Ａｒｇ３７６はＦｃεＲ１（高 い親和性）レセプターに結合するためにＩｇＥエフェクター機能活性の約３０％ を保持する（Ｈｅ１ｍなど、　（１９８８）前記）。抗体可変ドメインに融合す るために小さな方のフラグメント、たとえハＧｌｎ３０１−Ａｒｇ３７５を使用 することが所望される。このフラグメントの使用は、特に好都合である。なぜな らば、それはモノマー形て活性的であり、そしてそれは、Ｅ、コリからのエフェ クター機能を保持しながら都合良く発現されて来たからである。それはまた、Ｃ Ｈドメイン２〜４を含む大きなフラグメントの一部としてＥ、コリに発現された 。従って、Ｇｌｎ３０１−Ａｒｇ３７５フラグメントは、抗体フラグメントのＶ Ｈドメイン又はＶＨ及びＶＬドメインの両者に融合されても、エフェクター機能 を提供するはずである。さらに、他方、ＦａｂフラグメントのＣＨＩドメインか らの拡張体としての融合体としてＧ１ｎ３０Ｉ−Ａｒｇ３７５を発現することが 可能である。

小さなフラグメント、たとえばＧ１ｎ３０Ｉ成するためには、上記と同じ手段が 使用され、すなわち前記フラグメントは融合タンパク質の生成を可能にするため にベクターにコードされ、又はＶＨ−１ｇＥ　Ｇ１ｎ３０Ｉａローニングする前 、−緒にアセンブルされ得る。

低い親和性のＦｃε　Ｒｎレセプターに結合するフラグメントのための情況はよ り複雑である。なぜならば、レセプターのための結合部位はＣＨ３ドメイン内に 存在するが、ＣＨ２又はＣＨ４ドメインのいづれかが、その領域を二量体化し、 そしてレセプター機能を得るために必要とされるからである。従って、ＶＨ及び ＶＬドメインの両者との融合体が製造される必要があり、そしてその融合体はＣ Ｈ３及びＣＨ２又はＣＨ４ドメインの両者を含む必要がある。

国際調査報告 ｌ１ＩＩ−―電番ｅｅ＊ｌ＾−ｅ１−電Ｉｓ陶−１ａ、ＰＣＴ／田９１１０２３ ０３−一器・Ｉ−耐＾−１−−昧ＰＣＴ／鑓９Ｉ１０２３０３国際調−ｉＦ報告 ７゛”′“−°゛′”１ｌｔａ　ｌ１ｌｕｌ　Ｉｎ”ｉｃｙ−ｍｂｗ”′°°゛ ゛′°１°″″″ｄ“−°“ｃｔ＋ｈ＋ｄ”ｎＤｏｔＡｖｐ香香高V′鍔メ部” １°゛°〜ｌ’！Ａ　＋＊ＨｎＴｈｅｌ＋＋＋＋ｅａ＋鴫ｅｈ＋ｏｒ＋ｍｌ＋１ ｉｓｌａａｅ＋ｓｖｈａ−ｎｍｎ曙Ｐ１１１ν儒１−−イエ１−１１ｈｎフロン トページの続き （５１）　Ｉｎｔ．　Ｃ１．　”　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３ ９５　ＡＤＵ　Ｄ　９２８４−４Ｃ４７／４８　Ｚ　７４３３−４Ｃ ＣＯ７Ｋ　１５１０６　８５１７−４ＨＣ１２Ｎ　１５／６２ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ　１：１９） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ、ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ，　ＢＢ，　ＢＧ，　ＢＲ，　ＣＡ，　ＣＨ，　Ｃ３，　ＤＥ 。

ＤＫ，　ＥＳ，　ＦＩ，　ＧＢ，　ＨＵ，　ＪＰ，　ＫＰ，　ＫＲ，　ＬＫ，Ｌ Ｕ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，Ｎｏ，ＰＬ，ＲＯ、ＳＤ，ＳＥ，ＳＯ，ＵＳ ＦＩ （７２）発明者　チスウェル，デビット　ジョンイギリス国，パツキンガム、エ ムグー１８２エルデイー、ミドル　クレイトン　サンドヒル　ハウス　１

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．腫瘍抗原に結合できる第１結合ドメイン、及び免疫システムの細胞上のＦｃ εレセプターに結合できる第２結合ドメインを含んで成る分子であって、それに よって前記分子は前記抗原を発現する腫瘍細胞に対するＩｇＥエフェクター機構 を仲介することができることを特徴とする分子。
2. ２．前記第１及び第２結合ドメインが免疫グロブリンから誘導でき、又は天然に 存在する免疫グロブリンドメインの合成類似体又は前記ドメインの一部である請 求の範囲第１項記載の分子。
3. ３．前記第１及び第２結合ドメインの両者が免疫グロブリン可変ドメインから誘 導できる請求の範囲第１又は２項記載の分子。
4. ４．前記第１結合ドメインが免疫グロブリン可変ドメインから誘導でき、そして 前記第２結合ドメインが免疫グロブリン不変領域から誘導できる請求の範囲第１ 又は２項記載の分子。
5. ５．前記ＩｇＥイソタイプの抗体である請求の範囲第１，２又は４項のいづれか １項記載の分子。
6. ６．キメラ分子であり、前記第１結合ドメインがＩｇＥ以外のインタイプの免疫 グロブリンから誘導でき、そして前記第２結合ドメインが前記インタイプＩｇＥ の免疫グロブリンから誘導できる請求の範囲第１〜４のいづれか１項記載の分子 。
7. ７．請求の範囲第１〜６項のいづれか１項記載の分子を含む、培養培地、腹水又 は血清のサンプル。
8. ８．請求の範囲第１〜６項のいづれか１項記載の分子を含んで成る医薬。
9. ９．癌の処理のための医薬を調製するために請求の範囲第１〜６のいづれか１項 記載の分子を用いることを含んで成る方法。
10. １０．請求の範囲第８項記載の医薬を動物又はヒト患者に投与することを含んで 成る、前記患者を処理するための方法。
11. １１．動物又はヒト患者から外植された組織をエクス　ビボ処理するための方法 であって、請求の範囲第１〜６のいづれか１項記載の分子、請求の範囲第６項記 載のサンプル又は請求の範囲第８項記載の医薬を前記組織に適用することを含ん で成る方法。
12. １２．請求の範囲第１〜６のいづれか１項記載の分子を製造するための方法であ って、 前記第１及び第２結合ドメインの一部又はすべてのいづれか又は両者をコードす るヌクレオチド配列を得：適切な調節配列をまた組込む同じ又は異なった発現ベ クター中に前記ヌクレオチド配列を挿入し； 前記同じ又は異なった発現ベクターにより１又は複数の宿主細胞を形質転換し； 前記形質転換された宿主細胞を、前記第１及び／又は第２結合ドメインとして前 記ヌクレオチド配列を発現する条件下で増殖せしめ；そして 前記第１及び／又は第２結合ドメインを回収することを含んで成る方法。
13. １３．前記宿主細胞が原核細胞である請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．前記原核細胞がＥ．コリである請求の範囲第１３項記載の方法。
15. １５．前記宿主細胞が真核細胞である請求の範囲第１２項記載の方法。
16. １６．前記真核細胞がネズミ骨髄腫細胞ＮＳＯ又はチャイニーズハムスター卵巣 細胞である請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．前記ヌクレオチド配列がポリメラーゼ鎖反応の使用により得られる請求の 範囲第１２又は１３項記載の方法。