ES2388970T3 - Moléculas recombinantes de lubricina y usos de las mismas - Google Patents

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Abstract

Una proteína aislada que comprende las ID. SEC. Nº: 7, 11, 15, 19 ó 23.

Description

Moléculas recombinantes de lubricina y usos de las mismas
La invención se refiere a nuevas moléculas recombinantes de lubricina y a sus usos como lubricantes, agentes antiadhesivos y/o complementos intraarticulares para, por ejemplo, articulaciones sinoviales, menisco, tendón, peritoneo, pericardio y pleura.
Antecedentes de la invención
El funcionamiento óptimo de las articulaciones sinoviales depende de unos coeficientes de fricción extremadamente bajos entre los tejidos articulares. Normalmente, se mantiene una superficie contigua y bien lubricada sobre el cartílago articular. Sin embargo, en la artrosis, una reducida lubricación contribuye a la degradación y la fibrilación de la matriz del cartílago; éstas a su vez contribuyen a la disfunción y el dolor articular. Una lubricación reducida también conduce a una disfunción y a un dolor articular y a otras formas de artritis, incluyendo la artritis reumatoide.
Para otros tejidos (por ejemplo, tendones), una superficie lubricada también contribuye a un funcionamiento óptimo. Además de requerir una superficie lubricada, la función normal del tendón requiere la prevención de la adhesión celular a las superficies del tendón. En la lesión y la reparación de un tendón flexor, por ejemplo, la formación de adhesiones en el tendón es la complicación más habitual.
La proteína lubricina natural está relacionada con la proteína precursora del factor estimulante de los megacariocitos (megakaryocyte stimulating factor, MSF). PRG4 (proteoglucano 4) es el nombre del MSF que ha sido aceptado para la base de datos de Nomenclatura de Genes Humanos UCL/HGNC/HUGO. La proteína PRG4 (es decir, la proteína precursora del MSF) se describe en los documentos US6433142 y US20020137894. El polipéptido codificado por el exón 6 del gen PRG4 está muy glucosilado y parece ser necesario para que la proteína relacionada con el PRG4 sirva como lubricante, por ejemplo, entre las superficies del cartílago articular.
Algunos estudios indican que la glucoproteína PRG4 también es sintetizada por los sinoviocitos íntimos que recubren las vainas de los tendones; es muy probable que la glucoproteína también se origine en los tenocitos (Rees y col., 2002). La glucoproteína está presente de forma prominente en las regiones fibrocartilaginosas del tendón. De una forma complementaria a su función de líquido sinovial, la glucoproteína puede jugar un importante papel citoprotector en los tendones evitando la adhesión celular a las superficies de los tendones, así como proporcionando lubricación durante la función normal del tendón.
El exón 6 del gen PRG4 (también denominado "lubricina") codifica para aproximadamente 76-78 repeticiones de secuencias de tipo KEPAPTT y 6 repeticiones de secuencias de tipo TTTX. La variación en el número de secuencias repetidas comparables en proteínas recombinantes de lubricina según la presente invención permite el desarrollo de bioterapéuticos mejorados para aumentar la lubricación en articulaciones y para contrarrestar una adhesión indeseada entre tejidos.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a nuevas moléculas recombinantes de lubricina y a su uso como lubricantes, agentes antiadhesivos y/o complementos intraarticulares.
Con objeto de optimizar los parámetros de expresión y de investigar la necesidad funcional de aproximadamente todas las 76-78 secuencias de tipo KEPAPTT, se diseñaron constructos de expresión de lubricina que permitían la síntesis de proteínas recombinantes de lubricina con diversos grados de sustitución de oligosacáridos unidos por O. Esto se consigue incorporando cifras variables de las secuencias de tipo KEPAPTT en el "núcleo" de un constructo de ADNc formado por los exones 1 hasta 5, las regiones flanqueantes 5’ y 3’ del exón 6, y los exones 7 hasta 12. La inserción repetitiva de "casetes de ADNc sintético" que codifican para 40 secuencias múltiples de tipo KEPAPTT facilita la generación de constructos recombinantes de lubricina de diferentes tamaños. El foco inicial de estos estudios fue sobre el constructo PRG4-Lub:1 (que contiene el ADN del " casete sintético 1 de ADNc" (ID. SEC. Nº: 1), que codifica para cuatro secuencias KEPAPTT).
Las proteínas recombinantes de lubricina de la presente invención comparten una estructura primaria con varias isoformas de la lubricina humana natural (véanse los documentos WO 010 7068, US6743774, US20040072741 y WO0064930). De entre las 45 isoformas caracterizadas, cada isoforma difiere en la composición de los exones del gen que codifica para la estructura primaria de la isoforma. Por ejemplo, los exones 1 hasta 12 del gen PRG4 codifica para la isoforma V0, que representa la isoforma completa, mientras que los exones 1 hasta 4 y 6 hasta 12 codifican para la isoforma V1, que carece únicamente de un segmento codificado por el exón 5. Los exones 1 hasta 3 y 6 hasta 12 codifican para la isoforma V2, que carece de los segmentos codificados por los exones 4 y 5. Finalmente, los exones 1, 3 y 6 hasta 12 codifican para la isoforma V3, que carece de los segmentos codificados por los exones 2, 4 y 5. Probablemente existan otras isoformas, y se han descrito algunas proteínas mutantes relacionadas (véase el documento US20020086824).
En particular, la presente invención proporciona una proteína recombinante de lubricina que comprende secuencias repetitivas de tipo KEPAPTT. En las formas de realización preferidas, la invención proporciona una proteína aislada que comprende las ID. SEC. Nº: 7, 11, 15, 19 ó 23. En formas de realización relacionadas adicionales, la invención proporciona polinucleótidos aislados que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican para la proteína
5 recombinante de lubricina. En formas de realización preferidas, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la proteína. En formas de realización relacionadas adicionales, la invención proporciona un polinucleótido aislado con una identidad de al menos el 80%, el 85%, el 90% el 95%, el 97%, el 98% o el 99% con las ID. SEC. Nº: 6, 10, 14, 18 ó 22 sobre la longitud completa de la secuencia.
10 Tabla 1. Identificación de Secuencias con Identificadores de Secuencia
ID. SEC. Nº:
Identificación
1
Secuencia de nucleótidos del casete sintético 1 de ADNc: 155 bases
2
Traducción de la ID. SEC. Nº: 1: 51 aminoácidos
3
Secuencia de nucleótidos del casete sintético 2 de ADNc: 125 bases
4
Traducción de la ID. SEC. Nº: 3: 41 aminoácidos
5
vector pTmed2 que contiene el constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:1: 8049 bases
6
Constructo de ADNc recombinante PRG4-Lub:1: 2946 bases
7
Secuencia de aminoácidos de la proteína completa PRG4-LUB:1: 981 aminoácidos
8
Inserto de ADN Lub:1 DNA del casete sintético 1 de ADNc: 157 bases
9
51 aminoácidos codificados por el inserto de ADN Lub:1 (4 secuencias KEPAPTT entre S373 y E425 en la ID. SEC. Nº: 7)
10
Constructo de ADNc recombinante PRG4-Lub:2: 3024 bases
11
Secuencia de aminoácidos de la proteína completa PRG4-LUB:2: 1007 aminoácidos
12
Inserto de ADN Lub:2 del casete 1 de ADNc y una secuencia del casete sintético 2 de ADNc: 235 bases
13
77 aminoácidos codificados por el inserto de ADN Lub:2 (6 secuencias KEPAPTT entre S373 y E451 en la ID. SEC. Nº: 11)
14
Constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:3: 3117 bases
15
Secuencia de aminoácidos de la proteína PRG4-LUB:3 completa: 1038 aminoácidos
16
Inserto de ADN Lub:3 del casete sintético 1 de ADNc y dos secuencias del casete sintético 2 de ADNc: 328 bases
17
108 aminoácidos codificados por el inserto de ADN Lub:3 (9 secuencias KEPAPTT entre S373 y E482 en la ID. SEC. Nº: 15)
18
Constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:4: 3210 bases
19
Secuencia de aminoácidos de la proteína PRG4-LUB:4 completa: 1069 aminoácidos
20
Inserto de ADN Lub:4 del casete sintético 1 de ADNc y tres secuencias del casete sintético 2 de ADNc: 421 bases
21
139 aminoácidos codificados por el inserto de ADN Lub:4 (12 secuencias KEPAPTT entre S373 y E513 en la ID. SEC. Nº: 19)
22
Constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:5: 3303 bases
23
Secuencia de aminoácidos de la proteína PRG4-LUB:5 completa: 1100 aminoácidos
24
Inserto de ADN Lub:5 del casete sintético 1 de ADNc y cuatro secuencias del casete sintético 2 de ADNc: 514 bases
25
170 aminoácidos codificados por el inserto de ADN Lub:5 (15 secuencias KEPAPTT entre S373 y E544 en la ID. SEC. Nº: 23)
26
Secuencia de aminoácidos "APTTPKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTT KEPAPTTPKEPAPTTTK" (45 aminoácidos) de la proteína preferida PRG4-LUB:N
27
Secuencia de aminoácidos "KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP"(31 aminoácidos) repetida N-1 veces en la proteína preferida PRG4-LUB:N
28
Secuencia de aminoácidos "EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (22 aminoácidos) que se une a la ID. SEC. Nº: 26 hasta (N-2) repeticiones de la ID. SEC. Nº: 27 en la proteína preferida PRG4-LUB:N, donde N � 3.
29
Secuencia de aminoácidos "KEPKPAPTTP" (10 aminoácidos) de la proteína preferida PRG4-LUB:N donde N � 2.
La invención también proporciona formas de realización relacionadas con una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína recombinante de lubricina en un portador farmacéuticamente
3 5
aceptable. En algunas formas de realización, la composición comprende adicionalmente hialuronano o hilano.
También se describe en este documento un procedimiento para tratar a un sujeto que comprende: obtener una composición de una proteína recombinante de lubricina; y administrar dicha composición a un tejido del sujeto. En formas de realización relacionadas de este procedimiento, el tejido se elige del grupo formado por cartílago, membrana sinovial, menisco, tendón, peritoneo, pericardio y pleura. En formas de realización relacionadas adicionales de este procedimiento, el procedimiento comprende adicionalmente una etapa elegida del grupo formado por: proporcionar un anestésico al sujeto; proporcionar un fármaco antiinflamatorio al sujeto; proporcionar un antibiótico al sujeto; aspirar fluido del sujeto; lavar tejido del sujeto; obtener imágenes del tejido del sujeto. En otras formas de realización relacionadas, al sujeto se elige del grupo consistente en un ratón, una rata, un gato, un perro, un caballo y un ser humano.
En otras formas de realización, la invención también proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica para una proteína recombinante de lubricina, donde el polinucleótido está unido operativamente a una secuencia de control de la expresión. En formas de realización relacionadas, la invención proporciona un procedimiento para producir una proteína recombinante de lubricina que comprende: hacer crecer células transformadas con el vector de expresión en medio de cultivo líquido; y recoger la proteína recombinante de lubricina del medio. La etapa de recolección de la proteína puede comprender adicionalmente: concentrar la proteína filtrando el medio a través de una membrana; recoger la proteína retenida en la membrana; y solubilizar la proteína recogida en una disolución salina tamponada que contiene clorhidrato de L-arginina con una concentración que varía entre 0,1 y 2,0 M.
En este documento también se describe un anticuerpo aislado específico para una proteína recombinante de lubricina.
Otras características y ventajas de la invención serán apreciables a partir de la siguiente descripción de las formas de realización preferidas de las mismas, y a partir de las reivindicaciones.
Descripción detallada de la invención
La presente invención también engloba polinucleótidos que son homólogos de las formas de realización específicas descritas en este documento, por ejemplo, con una identidad de secuencia de al menos el 80%, el 85%, el 95%, el 97%, el 98% o el 99% con las secuencias de ADN especificadas. La invención describe adicionalmente polinucleótidos con una secuencia de ácidos nucleicos capaz de hibridar con toda la longitud de un dominio funcional del complemento de las secuencias de ADN especificadas en condiciones de elevada rigurosidad. La invención también incluye proteínas codificadas por estos polinucleótidos homólogos o hibridantes.
Con objeto de definir más claramente las formas de realización de la presente invención, se proporcionan las siguientes definiciones.
Definiciones. La frase "secuencia repetitiva de tipo KEPAPTT" significa una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos el 90%, el 93%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o mayor con: (a) la secuencia "APTTPKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTTKE-PAPTTPKEPAPTTTK" (ID. SBEQ. Nº: 26; 45 aminoácidos) y con al menos una sustitución unida por O, (b) la secuencia "KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (ID. SEC. Nº: 27; 31 aminoácidos) y con al menos una sustitución unida por O; o (c) la secuencia "EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (ID. SEC. Nº: 28; 22 aminoácidos) y con al menos una sustitución unida por O. Una secuencia repetitiva de tipo KEPAPTT puede tener preferiblemente dos, tres, cuatro o más sustituciones unidas por O.
Aunque existen varios procedimientos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos, el término "identidad" es bien conocido por los artesanos expertos y tiene un significado definido con respecto a un procedimiento específico dado. La identidad de secuencia descrita en este documento se mide usando la herramienta BLAST 2 SEQUENCES disponible a través del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/; véase también Tatusova y Madden (1999)). Para las secuencias de aminoácidos, los parámetros usados son expect = 1000; word size = 2; filter = off; y otros parámetros establecidos en los valores por defecto. Estos mismos parámetros se usan para las secuencias de ácidos nucleicos excepto word size = 8. Los valores por defecto para las comparaciones entre secuencias de aminoácidos son: Matrix = BLOSUM62; open gap = 11; extension gap = 1 penalties; y gap x dropoff = 50. Los valores por defecto para las comparaciones entre secuencias de ácidos nucleicos son: reward for a match = 1; penalty for a mismatch = -2; strand option = both strands; open gap = 5; extension gap = 2 penalties; y gap x dropoff = 50.
Una sustitución unida por O de lubricina recombinante puede ser una sustitución con el oligosacárido lubricante �-(13)-Gal-GalNac, o con otras fracciones, incluyendo fracciones de carbohidratos artificiales naturales (tales como sulfato de queratán o sulfato de condroitina). En algunas formas de realización, la sustitución unida por O puede ser con fracciones que contribuyen a una capacidad de la lubricina recombinante de actuar como portador del fosfolípido activo de superficie (surface active phospholipid, SAPL) o de tensioactivos (Hills, 2002). El porcentaje de glucosilación o de sustitución se determina en peso (peso en seco).
Las condiciones de elevada rigurosidad, cuando se usan con referencia a una hibridación de ADN:ADN, comprenden unas condiciones equivalentes a la unión o hibridación a 42˚C en una disolución consistente en 5X de SSPE (43,8 g/l de NaCl, 6,9 g/l de NaH2PO4 • H2O y 1,85 g/l de EDTA, pH ajustado a 7,4 con NaOH), 0,5% de SDS, 5X de reactivo de Denhardt y100 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido de un lavado en una disolución que comprende 0,1X de SSPE, 1,0% de SDS a 42˚C cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud.
Se dice que los polipéptidos u otros compuestos descritos en este documento están "aislados" cuando están en unas preparaciones que tienen al menos un 50% en peso (peso en seco) del compuesto de interés. Se dice que los polipéptidos u otros compuestos descritos en este documento son "sustancialmente puros" cuando están en preparaciones que tienen al menos un 80% en peso (peso seco) del compuesto de interés. Los polipéptidos u otros compuestos descritos en este documento se dice que son "homogéneos" cuando están en preparaciones que tienen al menos un 95%, y preferiblemente un 99%, en peso (peso en seco) del compuesto de interés. La pureza se mide mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida reductora y una tinción con azul de coomassie realzada, seguida por la densidad óptica de restos de bandas (es decir, midiéndose la pureza de la proteína mediante densitometría óptica).
"Exento de pirógenos" significa exento de contaminantes que provocan fiebre, incluyendo endotoxinas. La medición de los contaminantes debe realizarse mediante pruebas estándar aplicables establecidas por la Food and Drug Administration de EE.UU..
Según se usa en este documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad total de cada componente activo de la composición farmacéutica o procedimiento pertinente que es suficiente para mostrar un beneficio significativo al paciente, es decir, tratamiento, curación, prevención o mejora del estado clínico pertinente,
o un aumento en la tasa de tratamiento, curación, prevención o mejora de dichos estados. Cuando se aplica a un principio activo individual, administrado individualmente, el término se refiere a ese ingrediente individual. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los principios activos que dan como resultado un efecto terapéutico, ya sea administrados en combinación, sucesivamente o simultáneamente.
Las formas de realización de la presente invención pueden usarse como complementos intraarticulares. La complementación intraarticular con compuestos no derivados de lubricina se ha practicado como terapia articular. Por ejemplo, clínicamente se usa la "viscocomplementación" con hialuronano polimérico e hilanos de pesos moleculares mayores (tales como el fluido viscoelástico SYNVISC® "Hylan G-F 20"- distribuido por WYETH® Pharmaceuticals) para tratar el dolor de rodilla asociado con la artrosis. Esta viscocomplementación ha mostrado un significativo valor terapéutico, particularmente para reducir el dolor en pacientes con carga de peso (Wobig y col., 1998).
El Hylan G-F 20 se genera mediante la reticulación de varias moléculas de hialuronano obtenidas a partir de crestas de gallos o de pollos. La viscocomplementación con Hylan G-F 20 puede ser significativamente más eficaz para aliviar el dolor que la viscocomplementación con hialuronano de menor peso molecular (Wobig y col., 1999). Además, el alivio del dolor mediante la viscocomplementación con Hylan G-F 20 puede ser particularmente preferible frente a la administración de AINES para aquellos pacientes que no toleran los AINES (por ejemplo, en pacientes con un elevado riesgo de complicaciones gastrointestinales; Espallargues y Pons, 2003). Aunque la viscocomplementación con Hylan G-F 20 25 es una terapia segura y bien tolerada que proporciona una disminución a corto plazo (es decir, hasta los 3-6 meses tras el tratamiento) de los síntomas dolorosos mientras mejora la función articular, la terapia puede no impedir significativamente la eventual necesidad de la sustitución de la rodilla en pacientes con artrosis (Espallargues y Pons, 2003).
Ejemplo 1: clonación de lubricina recombinante
Constructos. En algunas formas de realización, el constructo de ADN de base para la generación de moléculas recombinantes de lubricina está formado por el codón Met (ATG) hasta el sitio de restricción BssHII (G^CGCGC) de la ID. SEC. Nº: 6 (es decir, los números de bases desde el 1 hasta el 1123) y el sitio de restricción BspEI (T^CCGGA) hasta el codón de detención (TAA) de la ID. SEC. Nº: 6 (es decir, los números de bases desde el 1269 hasta el 2946). Estas secuencias, es decir, los números de bases desde el 1 hasta el 1123 y del 1269 hasta el 2946 de la ID. SEC. Nº: 6, codifican para los aminoácidos M1 hasta el S373 (codificados por los exones 1 hasta 5 y aproximadamente 174 codones flanqueantes 5’ del exón 6) y E848 hasta P1404 (codificados por aproximadamente 293 codones flanqueantes 3’ del exón 6 y los exones 7 hasta 14) de la lubricina natural completa (es decir, PRG4). La porción del exón 6 ausente del constructo de ADN de base corresponde a la secuencia de ADN que codifica para los aminoácidos A374 hasta P847 del PRG4 natural (474 aminoácidos ausentes de aproximadamente los 940 aminoácidos codificados por el exón 6). Esta secuencia de aminoácidos ausente es rica en secuencias de tipo KEPAPTT.
La secuencia de ADN del casete sintético 1 de ADNc (ID. SEC. Nº: 1) se añade BssHII/BspEI al constructo de base para hacer el constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:1 (ID. SEC. Nº: 6). La ID. SEC. Nº: 6 está formada por el inserto de ADN Lub:1 (ID. SEC. Nº: 8; que codifica para los 51 aminoácidos de la ID. SEC. Nº: 9 con sus cuatro secuencias KEPAPTT) entre el ADN que codifica para los aminoácidos M1 hasta S373 y el ADN que codifica para
E848 hasta P1404 del PRG4 natural. En otras palabras, en lugar de A374 hasta P847 (474 aminoácidos) del PRG4 natural, la lubricina recombinante PRG4-LUB:1 incluye 51 aminoácidos que forman cuatro secuencias KEPAPTT perfectas y aproximadamente tres secuencias KEPAPTT imperfectas.
La secuencia de ADN del casete sintético 2 de ADNc (ID. SEC. Nº: 3) se añade Bsu36I/BspEI al constructo PRG4Lub:1 para hacer el constructo de ADNc PRG4-Lub:2 (ID. SEC. Nº: 10). El constructo de ADNc PRG4-Lub:1 tiene un sitio de restricción Bsu36I (CC^TNAGG, es decir, CC^TAAGG; números de base 1225 hasta 1231 de la ID. SEC. Nº: 6). Cuando se añade el casete sintético 2 de ADNc al constructo de ADNc PRG4-Lub:1, este sitio Bsu36I se destruye, pero el casete sintético 2 contiene otro sitio de restricción interno Bsu36I (CC^TNAGG, es decir, CC^TAAGG; números de base 92 hasta 98 de la ID. SEC. Nº: 3). Consecuentemente, puede crearse un constructo PRG4-Lub:N+1 añadiendo el casete sintético 2 de ADNc Bsu36I/BspEI al constructo previo PRG4-Lub:N en este sitio de restricción interno Bsu36I proporcionado por el casete sintético 2 de ADNc.
Los casetes de ADNc se sintetizan como oligonucleótidos monocatenarios y se hibridan entre sí para producir un fragmento de ADN bicatenario con extremos adherentes. Es por esto que los sitios terminales BssHII, Bsu36I y BspEI parecen incompletos. En el casete sintético 1 de ADNc (ID. SEC. Nº: 1), una secuencia limitada por los sitios de restricción flanqueantes remanentes BssHII (G^CGCGC) y BspEI (T^CCGGA) incluye un sitio de restricción interno Bsu36I (CC^TNAGG, es decir, CC^TAAGG); los sitios de restricción están subrayados a continuación:
La ID. SEC. Nº: 2, que es una traducción de la ID. SEC. Nº: 1, incluye cuatro secuencias KEPAPTT que son coincidencias perfectas (destacadas a continuación):
El casete sintético 2 de ADNc (ID. SEC. Nº: 3) tiene similarmente un sitio de restricción remanente 5’-terminal Bsu36I (es decir, CC^TNAGG, evidenciado únicamente por la secuencia TAA), un sitio de restricción remanente 3’-terminal BspEI (T^CCGGA), y el sitio de restricción interno Bsu36I (CC^TNAGG); los sitios de restricción están subrayados a continuación:
La ID. SEC. Nº: 4, que es una traducción de la ID. SEC. Nº: 3, incluye tres secuencias KEPAPTT que son coincidencias perfectas (destacadas a continuación):
El constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:1 (ID. SEC. Nº: 6) en el vector pTmed2 (constructo más vector igual a la ID. SEC. Nº: 5) está flanqueado por los sitios de restricción SalI (G^TCGAC; números de base 1027 hasta 1032 de la ID. SEC. Nº: 5) y NotI (GC^GGCCGC; números de base 3984 hasta 3991 de la ID. SEC. Nº: 5). El sitio SalI incorpora una secuencia Kozak de inicio de la traducción modificada (CCCACC; números de base 1032 hasta 1037 de la ID. SEC. Nº: 5) antes del codón de inicio de la traducción ATG (números de base 1038 hasta 1040 de la ID. SEC. Nº: 5). Entre los sitios de restricción BssHII (G^CGCGC; números de base 2155 hasta 2160 de la ID. SEC. Nº:
5) y BspEI (T^CCGGA; números de base 2306 hasta 2311 de la ID. SEC. Nº: 5) se encuentra el sitio de clonación interno Bsu36I (CC^TNAGG, es decir, CC^TAAGG; números de base 2262 hasta 2268 de la ID. SEC. Nº: 5).
El constructo de ADNc PRG4-Lub:1 (ID. SEC. Nº: 6) es traducido en la proteína PRG4-LUB:1 (ID. SEC. Nº: 7). El inserto entre S373 y E425 (es decir, E848 del PRG4 natural) de la proteína completa PRG4-LUB:1 (ID. SEC. Nº: 7)son los 51 aminoácidos de la ID. SEC. Nº: 9. Éstos son traducidos desde el inserto de ADN Lub:1 (ID. SEC. Nº: 8) e incluyen cuatro secuencias KEPAPTT perfectas. Entre el sitio de restricción BssHII (G^CGCGC; números de base 1118 hasta 1123 de la ID. SEC. Nº: 6) y el sitio de restricción BspEI (T^CCGGA; números de base 1269 hasta 1274 de la ID. SEC. Nº: 6) se encuentra el sitio de clonación interno Bsu36I (CC^TNAGG, es decir, CC^TAAGG; números de base 1225 hasta 1231 de la ID. SEC. Nº: 6).
Como en el constructo recombinante PRG4-Lub:1 del vector pTmed2, el constructo recombinante de ADNc PRG4Lub:2 (ID. SEC. Nº: 10) del vector pTmed2 está flanqueado por los sitios de restricción SalI (G^TCGAC) y NotI (GC^GGCCGC); el sitio SalI incorpora una secuencia Kozak de inicio de la traducción modificada (CCCACC) antes del codón de inicio de la traducción ATG (números de base 1 hasta 3 de la ID. SEC. Nº: 10). De forma similar, el constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:3 (ID. SEC. Nº: 14), el constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:4 (ID. SEC. Nº: 18) y el constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:5 (ID. SEC. Nº: 22) del vector pTmed2 están flanqueados cada uno por los sitios de restricción SalI (G^TCGAC) y NotI (GC^GGCCGC); el sitio SalI incorpora una secuencia Kozak de inicio de la traducción modificada (CCCACC) antes del codón de inicio de la traducción ATG (números de base 1 hasta 3 de las ID. SEC. Nº: 14, 18 y 22, respectivamente).
En el constructo de ADNc PRG4-Lub:2, el sitio de clonación interno Bsu36I (CC^TNAGG, es decir, CC^TAAGG; números de base 1318 hasta 1324 de la ID. SEC. Nº: 10) se encuentra entre los sitios de restricción BssHII (G^CGCGC; números de base 1118 hasta 1123) y BspEI (T^CCGGA; números de base 1347 hasta 1352). El constructo PRG4-Lub:2 (ID. SEC. Nº: 10) es traducido en la proteína PRG4-LUB:2 (ID. SEC. Nº: 11). El inserto entre S373 y E451 (es decir, E848 del PRG4 natural) de la proteína PRG4-LUB:2 completa ID. SEC. Nº: 11) son los 77 aminoácidos de la ID. SEC. Nº: 13. Estos son traducidos desde el inserto de ADN Lub:2 (ID. SEC. Nº:12). En lugar de A374 hasta P847 (474 aminoácidos) del PRG4 natural, los 77 aminoácidos de la lubricina recombinante PRG4-LUB:2 forman seis secuencias KEPAPTT perfectas y aproximadamente cuatro secuencias KEPAPTT imperfectas.
En el constructo de ADNc PRG4-Lub:3, el sitio de clonación interno Bsu36I (CC^TNAGG, es decir, CC^TAAGG; números de base 1411 hasta 1417 de la ID. SEC. Nº: 14) se encuentra entre los sitios de restricción BssHII (G^CGCGC; números de base 1118 hasta 1123) y BspEI (T^CCGGA; números de base 1440 hasta 1445). El constructo PRG4-Lub:3 (ID. SEC. Nº: 14) es traducido en la proteína PRG4-LUB:3 (ID. SEC. Nº: 15). El inserto entre S373 y E482 (es decir, E848 del PRG4 natural) de la proteína PRG4-LUB:3 completa (ID. SEC. Nº: 15) son los 108aminoácidos de la ID. SEC. Nº: 17. Éstos son traducidos desde el inserto de ADN Lub:3 (ID. SEC. Nº:16). En lugar de A374 hasta P847 (474 aminoácidos) del PRG4 natural, los 108 aminoácidos de la lubricina recombinante PRG4-LUB:3 forman nueve secuencias KEPAPTT perfectas y aproximadamente cinco secuencias KEPAPTT imperfectas.
En el constructo de ADNc PRG4-Lub:4, el sitio de clonación interno Bsu36I (CC^TNAGG, es decir, CC^TAAGG; números de base 1504 hasta 1510 de la ID. SEC. Nº: 18) se encuentra entre los sitios de restricción BssHII (G^CGCGC; números de base 1118 hasta 1123) y BspEI (T^CCGGA; números de base 1533 hasta 1538). El constructo PRG4-Lub:4 (ID. SEC. Nº: 18) es traducido en la proteína PRG4-LUB:4 (ID. SEC. Nº: 19). El inserto entre S373 y E513 (es decir, E848 del PRG4 natural) de la proteína PRG4-LUB:4 completa (ID. SEC. Nº: 19) son los 139aminoácidos de la ID. SEC. Nº: 21. Éstos son traducidos desde el inserto de ADN Lub:4 (ID. SEC. Nº: 20). En lugar de A374 hasta P847 (474 aminoácidos) del PRG4 natural, los 139 aminoácidos de la lubricina recombinante PRG4-LUB:4 forman doce secuencias KEPAPTT perfectas y aproximadamente seis secuencias KEPAPTT imperfectas.
En el constructo de ADNc PRG4-Lub:5, el sitio de clonación interno Bsu36I (CC^TNAGG, es decir, CC^TAAGG; números de base 1597 hasta 1603 de la ID. SEC. Nº: 22) se encuentra entre los sitios de restricción BssHII (G^CGCGC; números de base 1118 hasta 1123) y BspEI (T^CCGGA; números de base 1626 hasta 1631). El constructo PRG4-Lub:5 (ID. SEC. Nº: 22) es traducido en la proteína PRG4-LUB:5 (ID. SEC. Nº: 23). El inserto entre S373 y E544 (es decir, E848 hasta) de la proteína PRG4-LUB:5 completa (ID. SEC. Nº: 23) son los 170 aminoácidosde la ID. SEC. Nº: 25. Éstos son traducidos desde el inserto de ADN Lub:5 (ID. SEC. Nº: 24). En lugar de A374 hasta P847 (474 aminoácidos) del PRG4 natural, los 170 aminoácidos de la lubricina recombinante PRG4-LUB:5 forman quince secuencias KEPAPTT perfectas y aproximadamente siete secuencias KEPAPTT imperfectas.
Importantemente, el proceso de insertar el casete sintético 2 de ADNc puede repetirse indefinidamente. Cada repetición da como resultado la adición de tres secuencias KEPAPTT perfectas. Al igual que las lubricinas recombinantes PRG4-LUB:2 hasta PRG4-LUB:5 se construyen de esta forma mediante el uso de secuencias de inserto, se construyen las lubricinas recombinantes PRG4-LUB:6 hasta PRG4-LUB:N. La Tabla 2 proporciona un resumen de las secuencias del inserto nBssHII/BspE1.
Tabla 2. Secuencias del inserto BssHII/BspE1
INSERTO DE LUB
ID. SEC. Nº Secuencias (los sitios de restricción están subrayados en los insertos de ADN; las secuencias KEPAPTT están destacadas que los insertos de proteína)
Lub:1
8
LUB:1
9
Lub:2
12
LUB:2
13
Lub:3
16
LUB:3
17
Lub:4
20
LUB:4
21
Lub:5
24
LUB:5
25
Aunque hemos ejemplificado el constructo de ADN de base con un PRG4 completo que contiene los 12 exones (menos una porción central del exón 6), también pueden emplearse variantes de empalme del PRG4, dependiendo de las diversas actividades y de la longitud deseada. Adicionalmente, pueden emplearse diferentes enzimas de restricción en una estrategia análoga, siempre que su ubicación esté convenientemente localizada dentro de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la proteína PRG4. En otras formas de realización, el constructo de base de ADN carece de la secuencia del exón 6 natural, pero incluye una o más de las secuencias del exón 1 hasta el exón 5 o de las secuencias del exón 7 hasta el exón 12 del gen natural de PRG4. En otras formas de realización, el constructo de base de ADN es idéntico a las secuencias del MSF recombinante descritas en los documentos US6433142 o US20020137894, excepto porque están ausentes parte o todas las secuencias del exón 6.
La invención proporciona constructos de ADNc que codifican para lubricinas recombinantes que son clonadas en los sitios de restricción SAlI (G^TCGAC; números de base 1027 hasta 1032 de la ID. SEC. Nº: 5) y NotI (GC^GGCCGC; números de base 3984 hasta 3991 de la ID. SEC. Nº: 5) del vector de expresión eucariota pTmed2 como una forma de realización preferida (por ejemplo, el constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:1 en el vector de expresión pTmed2 está localizado en la ID. SEC. Nº: 5 en los números de base 1038 hasta 3983). El sitio SalI incorpora la primera base de una secuencia Kozak de inicio de la traducción modificada (CCACC; número de base 1032 de la ID. SEC. Nº: 5) antes del codón de inicio de metionina (ATG; números de base 1038 hasta 1040 de la ID. SEC. Nº: 5). Otras formas de realización de la invención incluyen otras combinaciones de sitios de restricción y otros vectores de expresión.
En una forma de realización preferida, el proceso repetitivo hace uso del casete sintético 1 de ADNc (ID. SEC. Nº: 1) del vector de expresión pTmed2, que está flanqueado por los sitios de restricción para BssHII (G^CGCGC) y BspEI (T^CCGGA), y el casete sintético 1 de ADNc, que incluye un sitio de restricción interno Bsu36I (CC^TNAGG, es decir, CC^TAAGG; números de base 107 hasta 113 de la ID. SEC. Nº: 1). Para la generación repetitiva de constructos de lubricina recombinantes que contienen secuencias de tipo KEPAPTT en esta forma de realización preferida, se insertó el casete sintético 2 de ADNc (ID. SEC. Nº: 3) entre los sitios Bsu36I y BspEI del constructo recombinante. El casete sintético 2 de ADNc (ID. SEC. Nº: 3) está flanqueado por un sitio Bsu36I modificado remanente (TAAAG) y un sitio BspEI (ACTCCGG) remanente. También incluye un sitio de clonación interno Bsu36I (CC^TNAGG, es decir, CC^TAAGG; números de base 92 hasta 98 de la ID. SEC. Nº: 3). Después de clonar el casete sintético 2 de ADNc en los sitios Bsu36I y BspEI de un constructo de lubricina recombinante, el sitio de clonación Bsu36I del constructo original se destruye, dejando un único sitio de clonación Bsu36I en el nuevo constructo.
En esta forma de realización preferida, la secuencia de aminoácidos "APTTPKEPAPTT TKSAPTTPKEPAPTTTKEPAPTTPKEPAPTTTK" (ID. SEC. Nº: 26; 45 aminoácidos) permanece como parte de cada proteína PRG4-LUB:N (donde N = un número entero de 1 o más). Además, la secuencia de aminoácidos "KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (ID. SEC. Nº: 27; 31 aminoácidos) está codificada por el inserto de ADN que pasa a ser parte de cada constructo de ADNc de PRG4-Lub:N+1 mediante la adición de un casete sintético 2 de ADNc Bsu36I/BspEI a un constructo de ADNc PRG4-Lub:N. Para la proteína PRG4-LUB:N, donde N es un número entero mayor o igual a 3, la secuencia de aminoácidos "EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (ID. SEC. Nº: 28; 22 aminoácidos) une la ID. SEC. Nº: 26 a (N menos 2) repeticiones de la ID. SEC. Nº: 27 en las formas de realización preferidas. Adicionalmente, la secuencia de aminoácidos "KEPKPAPTTP" (ID. SEC. Nº; 29; 10 aminoácidos) muestra inmediatamente el último inserto de repetición de la ID. SEC. Nº: 27 en las formas de realización preferidas de la proteína PRG4-LUB:N, donde N es un número entero mayor o igual a 2.
Debido a que forman al menos dos secuencias KEPAPTT, la ID. SEC. Nº: 26, la ID. SEC. Nº: 27 y la ID. SEC. Nº: 28 se designan cada una en este documento como una "secuencia repetitiva de tipo KEPAPTT" (el N terminal de la ID. SEC. 28 se une a un residuo K, de forma que la ID. SEC. Nº: 28 forma dos secuencias KEPAPTT en las proteínas PRG4-LUB:N).
Consecuentemente, para la proteína recombinante de lubricina PRG4-LUB:N (donde N es igual a un número entero de 1 o más), la proteína PRG4-LUB:N comprende la ID. SEC. Nº: 26 en una forma de realización preferida. Adicionalmente, para la proteína recombinante de lubricina PRG4-LUB:N (donde N es igual a un número entero de 2
o más), la proteína PRG4-LUB:N también comprende la ID. SEC. Nº: 27 en una forma de realización preferida. La ID. SEC. Nº: 27 se repite (N menos 1) veces en cada proteína PRG4-LUB:N en estas formas de realización preferidas. En la PRG4-LUB:2, la ID. SEC. Nº: 26 y la ID. SEC. Nº: 27 se solapan (es decir, comparten una secuencia KEPAPTT).
En otras formas de realización preferidas donde N es un número entero mayor o igual a 3, la proteína recombinante de lubricina comprende los 22 aminoácidos de la ID. SEC. Nº: 28 que se unen a los 45 aminoácidos orientados N terminalmente de la ID. SEC. Nº: 26 hasta (N menos 2) repetición(es) de los 31 aminoácidos de la ID. SEC. Nº: 27, donde los 10 aminoácidos de la ID. SEC. Nº: 29 están C terminal con respecto a la última repetición de 31 aminoácidos de la ID. SEC. Nº: 27.
Tabla 3. Frecuencias de secuencia en las proteínas PRG4-LUB preferidas
Proteína PRG4-LUB
inserto Nterminal de la ID. SEC. Nº: 26 ID. SEC. Nº: 28 >- - < ID. SEC. Nº: 27 >- - < inserto Cterminal de la ID. SEC. Nº: 29 repeticiones KEPAPTT
-LUB:1
1 0 0 0 4
-LUB:2
1 0 1 1 6
-LUB:3
1 1 1 1 9
-LUB:4
1 1 2 1 12
-LUB:5
1 1 3 1 15
-LUB:N
1 1 N-2 1 3 x N
Las proteínas PRG4-LUB:N tienen en general (3 veces N) repeticiones de la secuencia KEPAPTT en las formas de realización preferidas, donde N es igual al número de secuencias repetitivas de tipo KEPAPTT. La lubricina recombinante PRG4-LUB:5 (con 3 x N = 3 x 5 = 15 copias de la secuencia KEPAPTT en las formas de realización preferidas) es la mayor lubricina recombinante PRG4-LUB:N cuya secuencia se detalla en este documento.
Ejemplo 2: expresión y purificación de la proteína ’lub’
Se expresó el constructo de ADNc PRG4-Lub:1 (ID. SEC. Nº: 6; que contiene la secuencia del casete sintético 1 de ADNc) en una línea celular CHO DUKX preadaptativa transfectada de forma estable, purificada a partir de medio condicionado, y solubilizada en PBS que contiene clorhidrato de L-arginina 500 mM como sigue.
Se expresó el constructo de ADNc PRG4-Lub:1 en una línea celular CHO DUKX transfectada de forma estable y se recogió el medio condicionado. Se concentra un volumen de dos litros de este medio condicionado bajo gas nitrógeno comprimido (40 psi) usando una unidad de filtración AMICON® M2000™ dotada con una membrana de disco de 10 kDa de límite de peso nominal molecular (nominal molecular weight limit, NMWL), de 30 kDa de NMWL
o de 100 kDa de NMWL PALL FILTRON® OMEGA™. El medio se concentró hasta aproximadamente un volumen de 100 ml, que se aspiró desde la membrana de disco. La membrana de disco se extrajo entonces de la unidad de filtración AMICON® M2000™. El retenido "mucinoso", que se había acumulado en la superficie de la membrana de disco, se recogió usando un raspador celular y se transfirió a tubos de microcentrífuga. Las muestras de los tubos de microcentrífuga se centrifugaron aproximadamente a 12.000 x g durante 10 minutos, y se retiró el sobrenadante acuoso. Las pellas remanentes "enriquecidas en lubricina" se disolvieron en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene clorhidrato de L-arginina 500 mM. La concentración de clorhidrato de L-arginina puede variar entre 100 mM y 2,0 M.
Usando el procedimiento anterior, se recogen las glucoproteínas PRG4-LUB:2 hasta PRG4-LUB:5 (y las proteínas PRG4-LUB:N, donde N = un número entero no negativo de 6 o más, así como otras glucoproteínas que contienen secuencias de tipo KEPAPTT), directamente desde las membranas de disco, es decir, sin purificar el concentrado remanente por encima de las membranas de disco. Esto es, estas glucoproteínas recombinantes de lubricina se aíslan directamente a partir de las membranas de disco de 10 kDa de NMWL, de 30 kDa de NMWL o de 100 kDa de NMWL de las unidades de filtración PALL FILTRON® OMEGA™. En algunos casos, estas glucoproteínas también pueden purificarse a partir del concentrado remanente por encima de las membranas de disco mediante técnicas cromatográficas o técnicas electroforéticas, o ambas. Las proteínas y glucoproteínas recombinantes de lubricina también pueden purificarse usando cromatografía y otras técnicas conocidas en la materia (como, por ejemplo, las descritas en el documento US6433142 para proteínas MSF; véase también: Deutscher, 1990; y Scopes, 1994).
Ejemplo 3: inmunohistoquímica
Se investigó adicionalmente la fuente celular de lubricina en articulaciones normales y artrósicas usando técnicas inmunohistoquímicas. Además, se examinó la presencia de lubricina en otras superficies tisulares, pleura, pericardio, peritoneo y meninges, según los siguientes procedimientos.
Se obtuvieron cartílago y membrana sinovial artrósicos mediante consentimiento informado de pacientes que experimentaron cirugía de sustitución de rodilla. Otros tejidos examinados fueron membrana sinovial, cartílago, pleura, pericardio, peritoneo, meninges, cerebro, tendón y ligamentos normales humanos y de primate no humano (non-human primate, NHP), y menisco, cartílago, membrana sinovial, ligamento y tendones normales y artrósicos caninos. Los tejidos se fijaron en paraformaldehído al 4% inmediatamente después de su recogida o después de 24 horas de incubación en medio con y sin complemento de monensina (5 µM). Para los estudios inmunohistoquímicos, los tejidos se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 24 horas y se obtuvieron secciones en parafina de 6-8 micrómetros. Se congeló un subconjunto de tejidos en compuesto de congelación de tomografía de coherencia óptica (OCT) y se cortaron a intervalos de 5 a 10 micrómetros, seguido de fijación en acetona.
Los análisis inmunohistoquímicos e immunofluorescentes utilizaron un anticuerpo policlonal purificado de conejo anti-lubricina humana (Ab 06A10) generado mediante inmunización con una forma truncada de lubricina recombinante y la purificación en una columna de proteína A. Se usó el anticuerpo CD 16 (NEOMARKERS®,
Fremont CA) para identificar macrófagos (receptor III de Fcy). Se usó el anticuerpo CD106/VCAM-1 (NEOMARKERS®) para marcar fibroblastos en secciones criostáticas. Para las secciones de control se usó consecutivamente una concentración equivalente de RIgG (VECTOR LABS™, CA), MIgG1 (DAKO®) y MIgG2a (DAKO®). Se usó el Sistema de Tecnología de Dextrano (ENVISION+™; DAKO®) para visualizar la unión del anticuerpo y las secciones se contratiñeron con alum-hematoxilina de Mayer. La inmunofluorescencia se realizó usando los anteriores anticuerpos primarios y se sondearon con anticuerpos secundarios de cabra (Alexa Dyes -MOLECULAR PROBES™, Oregon) con pigmento Alexa de cabra anti-ratón a 546 nm y pigmento Alexa de cabra anti-ratón a 488 nm. La unión fluorescente del anticuerpo se detectó con un microscopio fluorescente NIKON®.
La lubricina se detectó a lo largo de las superficies del cartílago y la membrana sinovial articular humanos normales y artrósicos. Una gruesa capa de lubricina recubría completamente la superficie artrósica fibrilada. La inmunofluorescencia con CD106 mostró una fuerte tinción de la membrana celular de los fibroblastos íntimos de la membrana sinovial; la proteína lubricina también se visualizó como una tinción en las células sinoviales. Una doble inmunotinción de CD106 + lubricina mostró claramente una colocalización en los fibroblastos íntimos de la membrana sinovial. La tinción de CD16 de los macrófagos sinoviales demuestra la presencia de estas células a lo largo de las capas de la membrana sinovial, pero no había colocalización con lubricina.
La tinción de tejidos articulares de NHP y caninos (normales y artrósicos) con el anticuerpo de lubricina mostró lubricina recubriendo la capa superficial de la membrana sinovial, el cartílago, el menisco y los tendones. El cartílago de NHP también mostró una fuerte inmunorreactividad no sólo en las células de la zona superficial sino también en las células de la zona de transición, sin la adición de monensina para aumentar las reservas intracelulares de glucoproteína. El revestimiento celular del peritoneo, el pericardio y la pleura también mostraron la expresión de lubricina, aunque no se observó inmunorreactividad en las meninges ni en el cerebro.
En resumen, la membrana sinovial, el tendón, el menisco y el cartílago tanto normales como artrósicos estaban recubiertos por una sustancial capa de lubricina. La glucoproteína está claramente presente en tejidos de articulaciones artrósicas. La doble tinción inmunofluorescente de membrana sinovial artrósica humana demostró que los sinoviocitos de los fibroblastos íntimos eran los responsables de la síntesis de lubricina.
La localización de la proteína lubricina fuera del tejido articular no se ha descrito previamente. Se mostró claramente una capa superficial de lubricina en la pleura pulmonar, el pericardio y el peritoneo. Se considera que la lubricina tiene una función lubricante en la articulación sinovial, pero puede tener múltiples funciones incluyendo, pero no limitándose a, la lubricación y funciones antiadhesivas en otros tejidos. La complementación de estos otros tejidos con lubricina es una bioterapia englobada en esta invención.
Ejemplo 4: lubricina recombinante como lubricante mecánico
La lubricina recombinante podría usarse generalmente como un lubricante, por ejemplo, con precintos y rodamientos y similares. Por ejemplo, el documento US3973781 titulado "Self-lubricating seal", el documento US4491331 titulado "Grooved mechanical face seal", el documento US4560174 titulado "Multi lip seal" y el documento US4973068 titulado "Differential surface roughness dynamic seals and bearings," describen cada uno precintos de diseños variables. La lubricina recombinante podría usarse como lubricante con estos precintos.
En particular, la lubricina recombinante puede usarse como lubricante de dispositivos médicos, prótesis e implantes, particularmente cuando se requiere un lubricante biocompatible. Además, las aplicaciones no tienen por qué ser médicas, pero podrían incluir aplicaciones en contextos medioambientalmente sensibles en los que puede ser deseable un lubricante biocompatible.
Ejemplo 5: composiciones de lubricina recombinante
Una lubricina recombinante de la presente invención puede usarse en una composición farmacéutica cuando se combina con un portador farmacéuticamente aceptable. Dicha composición también puede contener (además de la proteína y un portador) diluyentes, agentes de relleno, sales, tampones, estabilizantes, solubilizantes y otros materiales bien conocidos en la materia. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere en la eficacia de la actividad biológica del (los) principio(s) activo(s). Las características del portador dependerán de la vía de administración. La composición farmacéutica de la invención también puede contener citocinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos tales como M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL4, IL-5, IL6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, trombopoyetina, factor de células madre y eritropoyetina. La composición farmacéutica puede contener adicionalmente otros agentes que, bien mejoran la actividad de la proteína, o bien complementan su actividad o uso en el tratamiento. Dichos factores adicionales y/o agentes pueden incluirse en la composición farmacéutica para producir un efecto sinérgico con la proteína de la invención, o para minimizar efectos secundarios. Por el contrario, la proteína de la presente invención puede incluirse en formulaciones de la citocina, linfocina, otro factor hematopoyético, trombolítico o antitrombótico, o del agente antiinflamatorio en particular, para minimizar efectos secundarios.
El uso de la proteína lubricina recombinante para el complemento intraarticular en combinación con el previamente descrito hialuronano polimérico (HA) e hilanos de pesos moleculares mayores es particularmente preferido. Otras combinaciones preferidas para su uso en el complemento intraarticular incluyen el uso de la proteína lubricina
recombinante con anestésicos (por ejemplo, lidocaína), esteroides (por ejemplo, hexacetónido de triamcinolona) o radioisótopos (por ejemplo, itrio). Otras combinaciones preferidas para el uso de una complementación intraarticular pueden incluir preparaciones celulares autólogas (por ejemplo, de condrocitos, sinoviocitos cultivados, o células madre, derivadas tanto autóloga como heterólogamente).
Una lubricina recombinante de la presente invención puede ser activa en multímeros (por ejemplo, heterodímeros u homodímeros) o en complejos consigo misma o con otras proteínas. Como resultado, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender una proteína de la invención en dicha forma multimérica o complejada.
Una composición farmacéutica de la invención puede estar en forma de un complejo de la(s) proteína(s) recombinante(s) de lubricina de la presente invención junto con antígenos proteicos o peptídicos. El antígeno proteico y/o peptídico proporcionará una señal estimulante a los linfocitos B y T. Los linfocitos B responderán al antígeno a través de su receptor de inmunoglobulina superficial. Los linfocitos T responderán al antígeno a través del receptor celular T (TCR) tras la presentación del antígeno por parte de las proteínas del MHC. El MHC y las proteínas relacionadas estructuralmente, incluyendo aquellas codificadas por los genes del MHC de clase I y de clase II en células hospedadoras, servirán para presentar el (los) antígeno(s) peptídico(s) a los linfocitos T. Los componentes antigénicos también podrían suministrarse como complejos purificados de MHC-péptido solos o con moléculas coestimulantes que pueden señalizar directamente a los linfocitos T. Alternativamente, pueden combinarse anticuerpos capaces de unirse a las inmunoglobulinas superficiales y a otras moléculas de los linfocitos B, así como anticuerpos capaces de unirse al TCR y a otras moléculas de los linfocitos T, con la composición farmacéutica de la invención.
Una composición farmacéutica de la invención puede estar en forma de un liposoma en el que la proteína de la presente invención se combina, además de con otros portadores farmacéuticamente aceptables, con agentes anfipáticos tales como lípidos que existen en forma de agregados tales como micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos o capas laminares en disolución acuosa. Los lípidos adecuados para la formulación liposómica incluyen, sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares y similares. La preparación de dichas formulaciones liposómicas está en el nivel del experto en la materia, según se desvela, por ejemplo, en los documentos US4235871, US4501728, US4837028 y US4737323.
En la práctica del procedimiento de tratamiento o el uso de la presente invención, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de la presente invención a un sujeto (por ejemplo, un mamífero) con una dolencia que se debe tratar. La proteína de la presente invención puede administrarse según el procedimiento de la invención bien sola o bien en combinación con otras terapias tales como tratamientos que emplean citocinas, linfocinas, otros factores hematopoyéticos o complementos basados en células. Cuando se coadministra con una o más citocinas, linfocinas, otros factores hematopoyéticos o complementos basados en células, la proteína de la presente invención puede administrarse bien simultáneamente con la(s) citocina(s), linfocina(s), otro(s) factor(es) hematopoyético(s), factores trombolíticos o antitrombóticos o complementos basados en células, o secuencialmente. Sí se administra secuencialmente, el médico responsable decidirá la secuencia apropiada de administración de la proteína de la presente invención en combinación con la(s) citocina(s), linfocina(s), otro(s) factor(es) hematopoyético(s), factores trombolíticos o antitrombóticos o complementos basados en células.
La administración de la proteína de la presente invención usada en la composición farmacéutica o en la práctica del procedimiento de la presente invención puede llevarse a cabo de varias formas convencionales, tales como inyección cutánea, subcutánea, intraperitoneal, parenteral o intravenosa, o en algunos casos, mediante digestión oral, inhalación, aplicación tópica. Generalmente se prefiere la administración a un paciente mediante inyección en el tejido articular (Schumacher, 2003).
Cuando se administra por vía oral una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de la presente invención, la proteína de la presente invención estará en forma de un comprimido, cápsula, polvo, disolución o elixir. Cuando se administra en forma de comprimido, la composición farmacéutica de la invención puede contener adicionalmente un portador sólido tal como gelatina o un coadyuvante. El comprimido, la cápsula y el polvo contienen desde aproximadamente el 5 hasta el 95% de la proteína de la presente invención, y preferiblemente desde aproximadamente el 25 hasta el 90% de la proteína de la presente invención. Cuando se administra en forma líquida, puede añadirse un portador líquido tal como agua, vaselina, aceites de origen animal o vegetal tal como aceite de cacahuete, aceite mineral, aceite de soja o aceite de sésamo, o aceites sintéticos. La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener adicionalmente disolución salina fisiológica, dextrosa u otra disolución de sacáridos, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene desde aproximadamente el 0,5 hasta el 90% en peso de proteína de la presente invención, y preferiblemente desde aproximadamente el 1 hasta el 50% de proteína de la presente invención.
Cuando se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de la presente invención mediante inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, la proteína de la presente invención está en forma de una disolución acuosa exenta de pirógenos parenteralmente aceptable. La preparación de dichas disoluciones de proteína parenteralmente aceptables, con la debida consideración al pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, está en la pericia de la materia. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea
debería contener, además de la proteína de la presente invención, un vehículo isotónico tal como cloruro sódico para inyección, Ringer para inyección, dextrosa para inyección, dextrosa y cloruro sódico para inyección, Ringer-lactato para inyección u otro vehículo según se sabe en la materia. La composición farmacéutica de la presente invención también puede contener estabilizantes, conservantes, tampones, antioxidantes u otros aditivos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, la inyección en asociación con, o en combinación con, lidocaína u otros anestésicos, esteroides o adrenocorticoides, HA y/o hilanos, o radioisótopos, están todas englobadas por la presente invención.
La cantidad de proteína de la presente invención en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y la gravedad de la dolencia que se va a tratar, y de la naturaleza de los tratamientos anteriores a los que se ha sometido el paciente. Finalmente, el médico responsable decidirá la cantidad de proteína de la presente invención con la que tratar a cada paciente individual. Inicialmente, el médico responsable administrará dosis bajas de la proteína de la presente invención y observará la respuesta del paciente. Pueden administrarse dosis mayores de la proteína de la presente invención hasta que se obtiene el efecto terapéutico óptimo para el paciente, y en ese punto la dosis ya no se incrementa más. Se contempla que las diversas composiciones farmacéuticas usadas en la práctica del procedimiento de la presente invención deberían contener desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 100 mg (preferiblemente aproximadamente 0,1 mg hasta aproximadamente 10 mg, más preferiblemente aproximadamente 0,1 mg hasta aproximadamente 1 mg) de proteína de la presente invención por kg de peso corporal, dependiendo del procedimiento de administración y del tratamiento terapéutico exacto implementado.
Si se administra por vía intravenosa, la duración de la terapia intravenosa usando una composición farmacéutica que comprende la lubricina recombinante de la presente invención variará, dependiendo de la gravedad de la enfermedad que se va a tratar y del estado y de la potencial respuesta idiosincrática de cada paciente individual. Se contempla que la duración de cada aplicación de la proteína de la presente invención puede estar en el intervalo de 12 a 24 horas de administración intravenosa continua. Finalmente, el médico responsable decidirá la duración apropiada de la terapia intravenosa usando la composición farmacéutica de la presente invención.
Para las composiciones de la presente invención que son útiles para la terapia del hueso, cartílago tendón o ligamento, el procedimiento terapéutico incluirá administrar la composición por vía tópica, sistémica o local como un implante o dispositivo. Cuando se administra, la composición terapéutica para su uso en esta invención está, por supuesto, exenta de pirógenos en una forma fisiológicamente aceptable. Además, la composición puede ser deseablemente encapsulada o inyectada en forma viscosa para administrarla en el sitio del hueso, cartílago o tejido dañado. La administración tópica puede ser adecuada en algunos contextos de curación de heridas y reparación de tejidos. Los agentes terapéuticamente útiles que también pueden incluirse opcionalmente en la composición según se describió anteriormente, pueden, alternativa o adicionalmente, administrarse simultánea o secuencialmente con la composición que comprende la proteína recombinante de lubricina de la invención en los procedimientos de la invención. Preferiblemente, la composición incluye una matriz capaz de suministrar la composición que contiene la proteína en el sitio del hueso y/o el cartílago dañados, posiblemente capaz de proporcionar una estructura para el desarrollo del hueso y del cartílago, y óptimamente capaz de ser resorbida en el cuerpo. Dichas matrices pueden estar formadas por materiales actualmente en uso para otras aplicaciones médicas implantadas.
Si se usa una matriz, la elección del material de la matriz se basa en la biocompatibilidad, la biodegradabilidad, las propiedades mecánicas, el aspecto cosmético y las propiedades de interfase. La aplicación particular de las composiciones definirá la formulación apropiada. Las potenciales matrices para las composiciones pueden ser sulfato cálcico, fosfato tricálcico, hidroxiapatito, ácido poliláctico, ácido poliglicólico y polianhídridos biodegradables y químicamente definidos. Otros materiales potenciales son biodegradables y biológicamente bien definidos, tales como colágeno óseo o dérmico. Otras matrices adicionales están formadas por proteínas puras o componentes de la matriz extracelular. Otras potenciales matrices no son biodegradables y están químicamente definidas, tales como hidroxapatito sinterizado, biovidrio, aluminatos u otros materiales cerámicos. Las matrices pueden estar formadas por combinaciones de cualquiera de los tipos de materiales mencionados anteriormente, tales como ácido poliláctico e hidroxiapatito, o colágeno y fosfato tricálcico. Los biocerámicos pueden alterarse en su composición, tal como en calcio-aluminato-fosfato, y procesarse para alterar el tamaño de poro, el tamaño de partícula, la forma de partícula y la biodegradabilidad.
En composiciones adicionales, las proteínas de la invención pueden combinarse con otros agentes beneficiosos para el tratamiento del defecto, herida o tejido del hueso y/o del cartílago en cuestión. Estos agentes incluyen varios factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), los factores de crecimiento transformantes (TGF-a y TGF-) y el factor de crecimiento insulinoide (IGF).
Las composiciones terapéuticas también son actualmente valiosas para aplicaciones veterinarias. Particularmente, animales domésticos tales como gatos y perros, animales de laboratorio tales como ratones y ratas, así como caballos, además de seres humanos, son particularmente sujetos o pacientes deseados para dicho tratamiento con proteínas recombinantes de lubricina de la presente invención.
El régimen de dosificación de una composición farmacéutica que contiene la proteína que se va a usar en la
regeneración tisular será determinado por el médico responsable teniendo en consideración varios factores que modifican la acción de las proteínas, por ejemplo, la cantidad de peso tisular deseada que se va a formar, el sitio de la lesión, el estado del tejido lesionado, el tamaño de la herida, el tipo de tejido lesionado (por ejemplo, cartílago o tendón), la edad, el sexo y la dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, el momento de la administración y otros factores clínicos. La dosis puede variar según el tipo de matriz usada en la reconstitución y con la inclusión de otras proteínas en la composición farmacéutica. Por ejemplo, la adición de otros factores de crecimiento conocidos, tales como IGF I (factor de crecimiento insulinoide I), a la composición final, también puede afectar a la dosis. El progreso puede ser controlado mediante una evaluación periódica del crecimiento y/o la reparación tisular/ósea, por ejemplo, mediante rayos X, determinaciones histomorfométricas y marcaje con tetraciclina.
Los polinucleótidos de la presente invención también pueden usarse para la terapia génica. Dichos polinucleótidos pueden introducirse bien in vivo o bien ex vivo en células para su expresión en un sujeto (por ejemplo, un mamífero). Los polinucleótidos de la invención también pueden administrarse mediante otros procedimientos conocidos para la introducción de un ácido nucleico en una célula u organismo (incluyendo, sin limitación, en forma de vectores víricos
o de ADN desnudo).
Las células también pueden cultivarse ex vivo en presencia de ácidos nucleicos o proteínas de la presente invención con objeto de proliferar o de producir un efecto deseado o una actividad en dichas células. Las células tratadas pueden introducirse entonces in vivo con propósitos terapéuticos.
Ejemplo 6: anticuerpos anti-lubricina
La proteína recombinante de lubricina de la invención también puede usarse para inmunizar animales para obtener anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan específicamente con la proteína, o en algunas formas de realización, sus homólogos naturales. Dichos anticuerpos pueden obtenerse usando bien la proteína recombinante de lubricina completa o bien fragmentos de la misma como un inmunógeno. Los péptidos inmunógenos pueden contener adicionalmente un residuo de cisteína en el carboxilo terminal, y están conjugados con un hapteno tal como hemocianina de lapa californiana (KLH). Los procedimientos para sintetizar dichos péptidos son conocidos en la materia (por ejemplo, como en Merrifield, 1963; y Krstenansky y col., 1987). Los anticuerpos monoclonales que se unen a la proteína recombinante de lubricina de la invención pueden ser útiles agentes diagnósticos para la inmunodetección de proteínas relacionadas. Los anticuerpos monoclonales neutralizantes que se unen a estas proteínas relacionadas también pueden ser terapéuticos útiles para ambos estados asociados con la lubricina o, en algunos casos, en el tratamiento de algunas formas de cáncer en las que puede estar implicada una expresión anormal de la lubricina (por ejemplo, en sinoviomas).
Además de los anticuerpos que están dirigidos al núcleo polipeptídico de una proteína recombinante de lubricina, es deseable un anticuerpo dirigido a la porción de azúcar o a un complejo de glucoproteína de la proteína recombinante de lubricina. Con objeto de generar anticuerpos que se unen a la lubricina recombinante glucosilada (pero no a la forma desglucosilada), el inmunógeno es preferiblemente un glucopéptido, cuya secuencia de aminoácidos abarca una gran porción glucosilada de la lubricina recombinante, por ejemplo, una secuencia repetitiva de tipo KEPAPTT. También se usan como inmunógenos glucopéptidos más cortos, por ejemplo, de 8-15 aminoácidos de longitud, dentro de la misma región altamente glucosilada. Los procedimientos para generar anticuerpos contra biomoléculas altamente glucosiladas son conocidos en la materia (por ejemplo, según describen Schneerson y col., 1980).
Ejemplo 7: administración de lubricina recombinante
Para la administración de la lubricina recombinante se usan procedimientos estándar. Para la administración intraarticular, la lubricina recombinante se suministra en la cavidad sinovial a una concentración en el intervalo de 20
-
500 µg/ml en un volumen de aproximadamente 0,1 - 2 ml por inyección. Por ejemplo, se inyecta 1 ml de una lubricina recombinante a una concentración de 200 - 300 µg/ml en la articulación de la rodilla usando una aguja fina (por ejemplo, de calibre 14 - 30, preferiblemente de 18 - 26). Las composiciones de la invención también son útiles para su administración por vía parenteral, tal como intravenosa, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal y, en las formas de realización preferidas, en las superficies del peritoneo, el pericardio o la pleura.
Una ubicación adecuada de la aguja es crítica para la eficacia de la proteína recombinante de lubricina que se administra mediante inyección en terapias articulares (Schumacher, 2003). La ubicación adecuada de la aguja puede facilitarse mediante el uso de tecnología de ultrasonidos. Las inyecciones con éxitos son más habituales tras haber realizado con éxito una aspiración de fluido. Se ha sugerido una metodología supralateral en la bolsa suprarrotuliana para proporcionar el acceso más fiable al espacio articular de la rodilla. Además de administrar la lubricina recombinante mediante inyección intraarticular, pueden administrarse los ácidos nucleicos que codifican para la lubricina recombinante (por ejemplo, en aplicaciones de terapia génica) en una cavidad sinovial mediante una inyección intraarticular.
Para prevenir adhesiones quirúrgicas, las lubricinas recombinantes descritas en este documento se administran en forma de un gel, una espuma, una fibra o un textil. Una lubricina recombinante formulada de dicha forma se coloca sobre y entre las interfases tisulares lesionadas o expuestas con objeto de evitar la formación de adhesión entre las superficies yuxtapuestas. Para ser eficaz, el gel o la película deben permanecer en su sitio y evitar el contacto tisular
durante un tiempo lo suficientemente largo, de forma que cuando el gel finalmente se disperse y los tejidos entren en contacto, ya no tendrán tendencia a adherirse. La lubricina recombinante formulada para la inhibición o la prevención de la formación de adhesión (por ejemplo, en forma de una membrana, un textil, una espuma o un gel) se evalúa para la prevención de adhesiones postquirúrgicas en un modelo de abrasión cecal de rata (Goldberg y col., 1993). Las composiciones se colocan alrededor de ciego de rata erosionado quirúrgicamente, y se comparan con controles no tratados (animales cuyos ciegos fueron erosionados pero que no recibieron ningún tratamiento). Una reducción en la cantidad de formación de adhesión en el modelo de rata en presencia de la formulación recombinante de lubricina comparada con la cantidad en ausencia de la formulación indica que la formulación es clínicamente eficaz para reducir la formación de adhesión tisular. Sin embargo, en los contextos en los que se desea una adhesión tisular (por ejemplo, cuando se desea la curación de fisuras del cartílago), es mejor evitar el uso de lubricina recombinante. Al proporcionar lubricación a las superficies del cartílago se deteriora la integración cartílago-cartílago (Schaefer y col., 2004).
Las lubricinas recombinantes también se usan para recubrir extremidades y articulaciones artificiales antes de su implantación en un mamífero. Por ejemplo, dichos dispositivos pueden sumergirse o bañarse en una disolución de lubricina recombinante, por ejemplo, siguiendo los procedimientos descritos en los documentos US5709020 o US5702456. Sin embargo, debería tenerse cuidado durante el uso in vivo de lubricina recombinante para proporcionar lubricación cerca de prótesis. Se ha informado de que hay asociada una notable regulación por incremento en la expresión del gen PRG4 (es decir, la expresión del gen MSF) con un aflojamiento de la prótesis; la lubricina podría alterar la fuerte interacción entre el hueso y la prótesis, y contribuir así a un aflojamiento de la prótesis (Morawietz y col., 2003).
Ejemplo 8: modelo de artrosis
Con objeto de evaluar la eficacia de la administración intraarticular de preparaciones de lubricina, se prepara un modelo murino de artrosis/erosión del cartílago. Para la inducción quirúrgica de la artrosis, los ratones se anestesiaron con 250 mg/kg de tribromoetanol intraperitoneal (SIGMA® Chemical), y se prepararon la rodillas para una cirugía aséptica. Se realiza una incisión longitudinal medial al ligamento rotuliano, se abre la cápsula articular y se identifica el ligamento meniscotibial (que ancla el menisco interno a la meseta tibial). En un subconjunto de animales no se realizan manipulaciones adicionales, y este grupo se considera con una operación simulada. En el grupo experimental, el ligamento meniscotibial interno se transeccciona dando como resultado una desestabilización del menisco interno (DMM). En ambos animales, con operación simulada y con una DMM, se suturan próximamente la cápsula articular y la capa subcutánea por separado y la piel se cierra mediante la aplicación del adhesivo tisular NEXABAND® S/C (Abbott, North Chicago, IL). Se administra buprenorfina (BUPRENEX®; Reckitt & Coleman, Kingston-upon-Hull, UK) antes y después de la operación.
Las preparaciones de lubricina recombinante se administran mediante una inyección intraarticular usando una aguja de calibre 30. Se administran inyecciones de 5-10 microlitros por articulación de la rodilla una semana después de la cirugía. Opcionalmente se administran inyecciones adicionales sobre una base semanal. Los animales se sacrifican con dióxido de carbono 4 semanas después de la operación y 8 semanas después de la operación.
Con objeto de evaluar la progresión y la gravedad de la artrosis, se colocan articulaciones de rodilla intactas en paraformaldehido al 4% durante 24 horas, y después en EDTA/polivinilpirrolidona descalcificado durante cinco días. Las articulaciones se sumergen en parafina y se obtienen secciones frontales de 6 mm a través de la articulación completa. Los cortes se tiñen con verde de safranina O-fast y se clasifican en intervalos de 70 mm a través de la articulación usando una modificación de un sistema de clasificación semicuantitativo (Chambers y col., 2001) en el que "0" = cartílago normal; "0,5" = pérdida de safranina O sin cambios estructurales; "1" = superficie articular áspera y pequeñas fibrilaciones; "2" = fibrilación inferior hacia la capa inmediatamente por debajo de la capa superficial y alguna pérdida de la lámina superficial; "3" = leve (<20%); "5" = moderada (20-80%); y "6" = grave (>80%) pérdida de cartílago no calcíficado. Las puntuaciones de "4" (erosión ósea) no son una característica de este modelo. Todos los cuadrantes de la articulación (meseta tibial interna, cóndilo femoral interno, meseta tibial lateral y cóndilo femoral lateral) se puntúan por separado. Se puntúa un mínimo de 12 niveles por parte de observadores a ciegas para cada articulación de rodilla. Las puntuaciones se expresan como la puntuación histológica máxima encontrada en cada articulación o la suma de las puntuaciones histológicas. La suma de las puntuaciones representa las puntuaciones aditivas para cada cuadrante de la articulación en cada sección histológica a lo largo de la articulación. Este procedimiento de análisis permite la valoración de la gravedad de las lesiones, así como del área superficial del cartílago afectado con lesiones de tipo artrósico (Glasson y col., 2004).
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<223> Secuencia de nucleótidos del casete sintético 1 de ADNc.
<400> 1
<210> 2
<211> 51
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Traducción de la ID. SEC. Nº: 1.
<400> 2
<210> 3
<211> 125
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos del casete sintético 2 de ADNc.
<400> 3
<210> 4
<211> 41
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Traducción de la ID. SEC. Nº: 3.
<400> 4
<210> 5
<211> 8049
<212> ADN
<213> Artificial
15 <220>
<223> Vector pTmed2 que contiene el constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:1.
<400> 5
<210> 6
<211> 2946
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:1.
<400> 6
<210> 7
<211> 981
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de aminoácidos de la proteína PRG4-LUB:1 completa.
<400> 7
<210> 8
<211> 157
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Inserto de ADN Lub:1 del casete sintético 1 de ADNc.
<400> 8
10 <210> 9
<211> 51
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
15 <223> 51 aminoácidos codificados por el inserto de ADN Lub:1 (4 secuencias KEPAPTT entre S373 y E425 de la ID. SEC. Nº: 7).
<400> 9
<210> 10
<211> 3024
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:2.
<400> 10
<210> 11
<211> 1007
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de aminoácidos de la proteína PRG4-LUB:2 completa.
<400> 11
<210> 12
<211> 235
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Inserto de ADN Lub:2 del casete sintético 1 de ADNc y una secuencia del casete sintético 2 de ADNc.
<400> 12
10 <210> 13
<211> 77
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
15 <223> 77 aminoácidos codificados por el inserto de ADN Lub:2 (6 secuencias KEPAPTT entre S373 y E451 de la ID. SEC. Nº: 11).
<400> 13
<210> 14
<211> 3117
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:3.
<400> 14
<210> 15
<211> 1038
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de aminoácidos de la proteína PRG4-LUB:3 completa
<400> 15
<210> 16
<211> 328
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Inserto de ADN Lub:3 del casete 1 sintético de ADNc y dos secuencias del casete sintético 2 de ADNc.
<400> 16 <210> 17
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 108 aminoácidos codificados por el inserto de ADN Lub:3 (9 secuencias KEPAPTT entre S373 y E482 de la ID. SEC. Nº: 15)
<400> 17
10 <210> 18
<211> 3210
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 15 <223> Constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:4.
<400> 18
<210> 19
<211> 1069
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de aminoácidos de la proteína PRG4-LUB:4 completa.
<400> 19
<210> 20
<211> 421
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Inserto de ADN Lub:4 del casete sintético 1 de ADNc y tres secuencias del casete sintético 2 de ADNc.
<400> 20
10 <210> 21
<211> 139
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
15 <223> 139 aminoácidos codificados por el inserto de ADN Lub:4 (12 secuencias KEPAPTT entre S373 y E513 de la ID. SEC. Nº: 19)
<400> 21
<210> 22
<211> 3303
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Constructo recombinante de ADNc PRG4-Lub:5
<400> 22
<210> 23
<211> 1100
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de aminoácidos de la proteína PRG4-LUB:5 completa.
<400> 23
<210> 24
<211> 514
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Inserto de ADN Lub:5 del del casete sintético 1 de ADNc y cuatro secuencias del casete sintético 2 de ADNc
<400> 24
10 <210> 25
<211> 170
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
15 <223> 170 aminoácidos codificados por el inserto de ADN Lub:5 (15 secuenciasKEPAPTT entre S373 y E544 de la ID. SEC. Nº: 23)
<400> 25
<210> 26
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de aminoácidos "APTTPKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTT KEPAPTTPKEPAPTTTK" (45 aminoácidos) de la proteína preferida PRG4-LUB:N
<400> 26
<210> 27
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial
15 <220>
<223> Secuencia de aminoácidos "KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (31 aminoácidos) repetidos N-1 veces en la proteína preferida PRG4-LUB:N
<400> 27
<210> 28
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de aminoácidos "EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (22 aminoácidos) que se une a la ID. SEC. Nº: 26 hasta (N-2) repeticiones de la ID. SEC. Nº: 27 en la proteína preferida PRG4-LUB:N donde N = 3 o más.
<400> 28
10 <210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
15 <223> Secuencia de aminoácidos "KEPKPAPTTP" (10 aminoacids) de la proteína preferida PRG4-LUB:N donde N = 2 o más.
<400> 29

Claims (21)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una proteína aislada que comprende las ID. SEC. Nº: 7, 11, 15, 19 ó 23.
  2. 2.
    Una proteína aislada que comprende la ID. SEC. Nº:7.
  3. 3.
    Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la proteína de la reivindicación 1 ó 2
  4. 4.
    El polinucleótido de la reivindicación 3 en el que el polinucleótido comprende las ID. SEC. Nº: 6, 10, 14, 18 ó 22.
  5. 5.
    Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una proteína recombinante de lubricina y con una identidad de al menos el 95% con las ID. SEC. Nº: 6, 10, 14, 18 ó 22 a lo largo de la longitud completa de la secuencia.
  6. 6.
    El polinucleótido de la reivindicación 5 que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para una proteína recombinante de lubricina y con una identidad de al menos el 99% con las ID. SEC. Nº: 6, 10, 14, 18 ó 22 a lo largo de la longitud completa de la secuencia.
  7. 7.
    Una proteína recombinante de lubricina codificada por el polinucleótido de la reivindicación 5 ó 6.
  8. 8.
    La proteína de las reivindicaciones 1, 2 ó 7 en la que la proteína está unida por O con -(1-3)-Gal-GalNac.
  9. 9.
    Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 en un portador farmacéuticamente aceptable.
  10. 10.
    La composición de la reivindicación 9 que comprende adicionalmente hialuronano o hilano.
  11. 11.
    Una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 para su uso en el tratamiento de un sujeto.
  12. 12.
    Una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 para su uso en el tratamiento de un sujeto mediante su administración a un tejido del sujeto.
  13. 13.
    Una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 para el uso de la reivindicación 11 en el que el tejido se elige del grupo que consiste en cartílago, membrana sinovial, menisco, tendón, peritoneo, pericardio y pleura.
  14. 14.
    Una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 para el uso de la reivindicación 11 en el que el tejido es cartílago.
  15. 15.
    Una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 para el uso de la reivindicación 11 en el que dicho uso comprende adicionalmente proporcionar un anestésico al sujeto; proporcionar un fármaco antiinflamatorio al sujeto; proporcionar un antibiótico al sujeto; aspirar fluido del sujeto; lavar tejido del sujeto; y obtener imágenes del tejido del sujeto.
  16. 16.
    Una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 para el uso de la reivindicación 11 en el que el sujeto se elige del grupo que consiste en un ratón, una rata, un gato, un perro, un caballo y un ser humano.
  17. 17.
    Una proteína de la reivindicación 1, 2 ó 7 para el uso de la reivindicación 11 en el que el sujeto es un ser humano.
  18. 18.
    Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6 unido operativamente a una secuencia de control de la expresión.
  19. 19.
    Un procedimiento para producir una proteína recombinante según la reivindicación 1, 2 ó 7 que comprende:
    hacer crecer células transformadas con el vector de expresión de la reivindicación 18 en medio de cultivo líquido; y recoger la proteína recombinante del medio.
  20. 20.
    El procedimiento de la reivindicación 19, en el que la recolección de la proteína comprende:
    concentrar la proteína filtrando el medio a través de una membrana; recoger la proteína retenida en la membrana; y solubilizar la proteína recogida en una disolución salina tamponada que contiene clorhidrato de L-arginina con una concentración que varía entre 0,1 y 2,0 M.
  21. 21.
    El procedimiento de la reivindicación 20 en el que la concentración de clorhidrato de L-arginina es 0,5 M.
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