ES2210829T3 - Composicion y proceso inmunologico utilizados para modificar transitoriamente la melina del sistema nervioso central de mamiferos para estimular la regeneracion neuronal. - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende las siguientes cantidades terapéuticamente eficaces de: (a) uno o más anticuerpos, humanos o quiméricos, fijadores del complemento o sus fragmentos, que enlazan a un epitope de mielina en humanos; y (b) una o más proteínas del complemento o sus fragmentos; en la que el enlace de dichos anticuerpos a la mielina provoca la fractura transitoria y/o demielinación transitoria de neuronas en los humanos.

Description

Composición y proceso inmunológico utilizados para modificar transitoriamente la mielina del sistema nervioso central de mamíferos para estimular la regeneración neuronal.

Esta invención se refiere a composiciones y sus métodos de uso para promover el crecimiento y/o regeneración del tejido nervioso dentro del sistema nervioso central (CNS, por las siglas de su expresión inglesa, Central Nervous System).

Lesiones del CNS

Aproximadamente 1,100 nuevas lesiones de la médula espinal ocurren cada año en Canadá; sobre 10,000 por año ocurren en los Estados Unidos. Estos números son cinco veces superiores si uno también incluye a los pacientes que sufren lesiones cerebrales que involucran la inhibición del crecimiento de neuronas que sigue a una lesión traumática del cerebro. El número de pacientes con lesiones crónicas de la médula espinal en América del Norte está en el orden de 300,000. De nuevo, este número es superior cinco veces si uno incluye a los pacientes que padecen lesión del cerebro que involucran la inhibición del crecimiento de las neuronas que sigue a una lesión traumática del cerebro.

Las lesiones de la médula espinal producen a menudo una pérdida permanente de movimiento voluntario por debajo del sitio de la lesión. Principalmente jóvenes y otras personas saludables se vuelven parapléjicas o tetrapléjicas debido a lesiones de la médula espinal. Hay un estimado de 200,000 tetrapléjicos en los Estados Unidos. Dada la magnitud de cuidados requeridos, no es difícil figurarse el porqué los costes del cuidado médico, asociados al cuidado de pacientes con el sistema nervioso central (CNS) dañado pueda estar alrededor de los \textdollar10 mil millones al año en América del Norte.

El CNS (cerebro y médula espinal) está constituido por neuronas y neuroglias, como astrocitos, microglia, y oligodendrocitos. Las neuronas tienen típicamente dos tipos de procesos: dendritas que reciben el contacto sináptico de los axones de otras neuronas; y axones a través de los que cada neurona se comunica con otras neuronas y efectores. El axón de una neurona del CNS está envuelto en una vaina de mielina.

En los vertebrados superiores, los axones dentro del CNS poseen una capacidad limitada de reparación después de una lesión. Las neuronas del CNS con axones dañados (axotomizadas) de los mamíferos adultos no exhiben una regeneración sustancial de axones, en contraste con las neuronas dentro del CNS embrionario o neonatal, o dentro del sistema nervioso periférico adulto (PNS, por las siglas de su expresión inglesa, Peripheral Nervous System) (Saunders et al. (1992) Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. 250:171-180; Schwab and Bartoldi (1996) Physiol. Rev. 76:319-370; Steeves et al., (1994) Prog. Brain Res. 103:243-262)). De hecho, es probable que la fractura completa de los axones del CNS impida la recuperación. Aunque las fibras axotomizadas próximas al cuerpo celular de las neuronas inicien un crecimiento regenerador, éste se aborta posteriormente a una distancia corta (1-2 mm) y a menudo es seguido por una degeneración retrógrada. Aunque los axones del CNS no volverán a crecer en el entorno de la médula espinal adulta, los injertos de nervios periféricos en el CNS proporcionan un entorno favorable, a través del cual los axones del CNS se regenerarán (May et al., Cajal's Degeneration and Regeneration of the Nervous System, History of Neuroscience Series # 5 (NY and Oxford: Oxford Univ Press, 1991) at 769). Estos resultados indican que las neuronas del CNS adulto retienen propiedades intrínsecas de crecimiento y, dadas unas condiciones favorables del entorno, son capaces de reactivar con éxito programas de crecimiento.

Tratamientos actuales de lesiones de la médula espinal

Existen varias terapias actuales para el tratamiento de las lesiones de la médula espinal. Se ha utilizado terapias de intervención que incluyen antagonistas opiáceos, hormonas liberadoras de tirotropina, enfriamiento local de la médula, infusión de dextrana, obstrucción adrenérgica, corticoesteroides y oxígeno hiperbárico, pero son de un valor clínico cuestionable.

Se han sugerido trasplantes de nervios periféricos como puentes a través de lesiones del CNS ((David and Aguayo (1981) Science 214:931-933, Houle (1991) Exp. Neurol 113:1-9; Richardson et al., (1984) J. Neurocitol. 13:165-182; Richardson et al (1980) Nature 284:264-265. Xu et al., (1995) Exp. Neurol. 138:261-276; Ye and Houle (1997) Exp. Neurol. 143:70-81). Recientemente se han usado trasplantes de células olfatorias para promover la regeneración de proyecciones de corticoespinales lesionadas en la rata (Li et al., (1997) Science 277: 2000 - 2002). Un reciente estudio (Cheng et al., (1996) Science 273:510-513) empleó un enfoque combinatorio que amplió un trabajo anterior (Siegal eta!., (1990) Exp. Neurol. 109: 90-97): después de la transección de médula espinal de ratas adultas, se usaron injertos periféricos para conectar tractos de sustancia blanca a la sustancia gris central de manera tal, como para regenerar directamente fibras fuera de un entorno inhibitorio, y en la más permisiva sustancia gris.

Las patentes de los EE.UU. Nº 5.650.148 y 5.762.926 describen un método para tratar una lesión al CNS injertando células donantes en el CNS que se ha modificado para producir moléculas como neurotrofinas.

El uso de células nerviosas trasplantadas también tiene un valor clínico limitado: aunque los axones podrán crecer en el tejido trasplantado, éstos no podrán crecer fuera del tejido trasplantado hacia al CNS debido a la sustancia inhibitoria en el CNS.

Esta revisión de métodos actuales para el tratamiento de lesiones de la médula espinal indica que aún persiste la necesidad de medios para promover el recrecimiento, la reparación y regeneración de neuronas en el CNS de mamíferos, tanto en situaciones agudas como crónicas.

Mielina

Se ha sugerido que el fracaso de los axones del CNS para regenerarse después de una lesión está asociado con la presencia de mielina. La vaina de mielina que envuelve un axón está compuesta de membranas compactas de plasma de células de Schwann y oligodendrocitos. Aunque su composición se parece a la de cualquier otra membrana de plasma en que contiene lípidos, proteínas y agua, las proporciones relativas y disposiciones de estos componentes son únicas de la mielina. La mielina en el CNS se produce por oligodendrocitos y se caracteriza por expresión de la proteína básica de mielina (MBP, por las siglas de su expresión inglesa, Myelin Basic Protein). La MBP sólo está asociada con la mielina y es una de las primeras proteínas expresadas al ataque de mielinización de las fibras de axones del CNS. El Galactocerebrósido (GaIC) es el mayor esfingolípido producido por los oligodendrocitos. El GaIC comprende aproximadamente 15 por ciento del total de lípidos existentes en la mielina humana y es muy conservado en las especies. Aunque el GaIC se expresa en la superficie de los cuerpos celulares de los oliogodendrocitos, éste se expresa en mayor concentración en la superficie de las membranas de la mielina (Ranscht et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 2709-2713.)

Hay una evidencia creciente que la presencia de mielina del CNS puede retardar o puede inhibir el crecimiento regenerador de algunos axones afectados del CNS (Schwab and Bartoldi (1996) Physiol. Rev. 76:319-370), ésto incluye varios ejemplos de familias vertebradas extendidas (Schwegler et al., (1995) J. Neurosci. 15:2756-2767; Steeves et al., (1994) Prog. Brain Res. 103:243-262). Tanto el CNS de los vertebrados más inferiores (por ejemplo, la lamprea), como el CNS de los vertebrados superiores (por ejemplo, pájaros y mamíferos) exhiben una regeneración sustancial de los axones después de la una esión (Davis and McClellan (1994) J. Comp. Neurol. 344:65-82; Hasan et al., (1993) J. Neurosci. 13:492-507; Hasan et al., (1991) Restor. Neurol. Neurosci. 2: 137-154; Iwashita et al., (1994) Nature 367:167-170; Saunders et al., (1992) Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. 250:171-180; Treherne et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:431-434; Varga et al., (1995) Eur. J. Neurosci. 7:2119-2129). El fenotipo común para todos estos ejemplos positivos de regeneración es un CNS, al que le falta la mielina por completo (lamprea) o tiene un desarrollo incompleto de la mielina en el momento de la lesión (polluelos embrionarios, oposum neonato y ratas). La aparición durante el desarrollo de mielina está en correlación en tiempo con la pérdida de regeneración por los axones lesionados del CNS. Además, el crecimiento robusto de neuronas fetales trasplantadas en el CNS adulto (Bregman et al., (1993) Exp. Neurol. 123:3-16; Li and Raisman (1993) Brain Res. 629:115-127; Yakovleff et al., (1995) Exp. Brain Res. 106:69-78) puede atribuirse parcialmente sea a una falta de receptores para inhibidores de la mielina en esa fase de su diferenciación, y/o a una capacidad de sobreponerse a cualquiera señales inhibitorias de la mielina.

Se han identificado moléculas específicas asociadas con la mielina como mediadores putativos de esta actividad inhibitoria, que incluyen la glicoproteína, asociada a la mielina (McKerracher et al., (1994) Neuron. 13:805-811; Mukhopadhyay et al., (1994) Neuron. 13:757-767), y N135/250, una proteína derivada de la mielina, todavía no identificada (Bandtlow y Schwab (1991) Soc. Neurosci. Abstr. 17:1495; Caroni y Schwab (1988) J. Cell Biol. 106:1281-1288; Caroni y Schwab (1988) Neuron 1:85; Crutcher (1989) Exp. Neurol 104:39-54; Savio y Schwab (1989) J. Neurosci. 9: 1126-1133; Schwab y Caroni (1988) J. Neurosci. 8:2381-2393); IN-1 (Brosamle, et al., (1998) Abst. Soc Neurosci., 24:1559; NI35/250 (Huber et al., (1998) Abst. Soc Neurosci., 24:1559; NI-220/250 (van der Haar et al., (1998) Abst. Soc Neurosci., 24:1559; arretina, Janani et al., (1998) Abst. Soc Neurosci., 24:1560; y NOGO (Chen et al., (1998) Abst. Soc Neurosci., 24:1776.

Los esfuerzos experimentales para bloquear funcionalmente la inhibición asociada a la mielina que involucra la N135/250, usando un anticuerpo de la N135/250, el IN-1, han facilitado alguna regeneración anatómica de axones corticoespinales (Bregman et al., (1995) Nature 378:498-501; Caroni y Schwab (1988) Neuron. 1:85-96; Schnell y Schwab (1990) Nature 343:269-272).

La fractura inmunológica de la mielina madura dentro de la médula espinal de aves (Keirstead et al., (1995) J. Neurosci. 15:6963-6974), y el retraso del comienzo de la mielinización del CNS en aves y mamíferos (Keirstead et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:11664-11668; Keirstead et al., (1997) Brain. Res. Bull. 44: 727-734; Varga et al., (1995) Eur. J. Neurosci. 7:2119-2129) también han facilitado el recrecimiento y/o brote de los axones del CNS.

La presencia de ciertos componentes localizados o embebidos en mielina, que son inhibitorios de la regeneración de crecimiento de los axones después de la lesión, hace deseable retirar temporalmente la mielina y sus componentes inhibitorios para promover la reparación de la médula espinal adulta lesionada. La médula espinal adulta puede ser demielinada in vivo vía fármacos (por ejemplo, el bromuro de etidio); sin embargo, estos fármacos tienen efectos deletéreos no específicos en otros tipos de células del sistema nervioso central (por ejemplo, los astrocitos). Además, la progenie deficiente en mielina de ratones y ratas son fácilmente disponibles, pero son de limitado valor experimental debido a una duración acortada de la vida: la mayoría no sobrevive adicionalmente de un par de semanas después del nacimiento.

Existe, por consiguiente, una necesidad en métodos mejorados de fracturar la mielina in vivo para reforzar la regeneración del tejido nervioso. La presente invención proporciona métodos que se dirigen a esta necesidad.

Complemento

El sistema del complemento es el mediador humoral primario de reacciones antígeno-anticuerpo. Consiste por lo menos en 20 proteínas de suero, química e inmunológicamente distintas, capaces de actuar recíprocamente entre si, con el anticuerpo y con las membranas celulares (véase, por ejemplo, J. Klein. Inmunology The Science of Self-Nonse if Discrimination (New York:John Wiley & Sons. 1982) en pág. 310-346) Los actores principales en este sistema son 11 proteínas, denominadas como C1 hasta C9, B. y D, las que normalmente están presentes entre las proteínas del plasma. Estas proteínas normalmente son inactivas, pero ellas pueden activarse de dos maneras separadas: la vía clásica o la vía alternativa.

La vía clásica es activada por una reacción antígeno-anticuerpo: cuando un anticuerpo se enlaza con un antígeno, se activa un sitio reactivo específico en la porción constante del anticuerpo, el que a su vez se enlaza directamente con la molécula C1 del sistema del complemento. Esto pone en movimiento una cascada de reacciones consecutivas, empezando por la activación de la proenzima C1. Sólo se requieren unas pocas combinaciones antígeno-anticuerpo para activar muchas moléculas en esta primera fase del sistema del complemento. Las enzimas C1 activan luego consecutivamente cantidades crecientes de enzimas en las fases más tardías del sistema del complemento. Se forman productos finales múltiples, que provocan efectos importantes que ayudan a prevenir la lesión por un organismo invasor o toxina, incluyendo la opsonización y fagocitosis, lisis, aglutinación, neutralización de virus, quimiotaxis, activación de células y basófilos de mamas y efectos inflamatorios.

El sistema del complemento también puede activarse por una vía alternativa sin intermedio de una reacción antígeno-anticuerpo. Ciertas sustancias reaccionan con factores B y D del complemento, para el control de un producto de activación que activa el factor C3, desencadenando el remanente de la cascada del complemento; así, se forman esencialmente todos los mismos productos finales del sistema, como en la vía clásica, provocando los mismos efectos. Ya que la vía alternativa no involucra una reacción antígeno-anticuerpo, es una de las primeras líneas de defensa contra microorganismos invasores.

Ya que los componentes de la vía clásica y de la vía alternativa del sistema del complemento actúan localmente para activar C3, éste constituye el elemento pivote del sistema del complemento. C3 es una proteína 195 kD que comprende dos cadenas ponteadas de disulfuro de 105 y 75 kD. El complejo C4-C2 enzimáticamente activo, activado en la vía clásica por la unión de C1q a un complejo antígeno-anticuerpo, escinde C3 en dos fragmentos, C3a y C3b. El fragmento más grande, C3b, se enlaza covalentemente a la superficie de una célula objetivo, donde actúa como una proteasa para catalizar los pasos siguientes en la cascada del complemento. También es reconocida por las proteínas específicas del receptor en macrófagos y neutrófilos que aumentan la capacidad de estas células para fagocitar la célula objetivo. En particular, la membrana inmovilizada C3b activa una cascada adicional de reacciones que llevan al conjunto de membrana a atacar los complejos de los últimos componentes.

Se ha demostrado que la fijación del complemento, por los anticuerpos enlazantes de la superficie de la célula, compromete la homeostasis iónica de muchas células diferentes in vitro en minutos de activación (Mayer (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2954-2958; Morgan (1989) Biochem. J. 264:1-14).

Uso de complemento con anticuerpos específicos a la mielina

Después del enlace de un anticuerpo específico fijador del complemento de un antígeno de la superficie de mielina, el complemento de suero forma un complejo de ataque de la membrana a través de una cascada enzimática que produce una entrada rápida de calcio extracelular (Dyer y Benjamins (1990) J. Cell Biol. 111:625-633) y un rearreglo citoesquelético posterior (Dyer y Matthieu (1994) J. Neurochem. 62:777-787). In vivo, esto haría que los procesos de fractura de mielina un objetivo para fagocitosis por un posterior microglia, así como por cualquiera invasor macrófago.

La aplicación in vitro de complemento de suero con anticuerpos específicos a la mielina se ha demostrado que suprime la elaboración de mielina en cultivo purificado de oligodendrocitos (Dorfman et. al., (1979) Brain Res. 177:105-114; Dubios-Dalcq et. al. (1970) Pathol. Eur. 5:331-347; Dyer y Benjamins (1990) J. Cell Biol. 111:625-633; Fry et al., (1974) Science 183:540-542; Hruby et al., (1977) Science 195:173-175).

La fractura de mielina in vivo se ha demostrado en el nervio óptico del conejillos de indias usando un suero anti GaIC y complemento (Sergott et. al., (1984) J. Neurol. Sci. 64:297-303); la fractura de la mielina se observó entre 1 a 2 horas de tratamiento.

Modelo del polluelo

En el modelo avícola, el comienzo de la mielinación en la médula espinal embrionaria del polluelo en E 13 coincide con la transición desde un período permisivo a uno restrictivo para la reparación funcional de la médula espinal transeccionada. La primera aparición de oligodendrocitos de polluelos al décimo y undécimo día de desarrollo embrionario (E10-E11) precede la formación mitral de mielina en 2-3 días embrionarios y se caracteriza por la expresión de galactocerebrósido (GaIC), el esfingolípido mayor producido por los oligodendrocitos.

En la médula espinal de aves maduras, después de la transección de la médula espinal, la fractura inmunológica local de mielina de la médula espinal facilitó la regeneración por las neuronas tronco-cerebroespinales. (Keirsteadet. et. al. (1995) J. Neurosci. 15:6963-6974; Keirstead et al., (1997 Brain Res. Bull., 44; 727-734). La fractura inmunológica de mielina fue transitoria, producida por una infusión intraespinal de complemento de suero y un específico a la mielina, anticuerpo fijador del complemento específico de (por ejemplo Los GaIC anti cuerpos). Tal tratamiento produjo la regeneración de hasta 20% de los axones maduros tronco-cerebroespinales.

Se proporciona esta información de antecedentes con el propósito de hacer conocer la información que según la opinión del solicitante es de posible relevancia a la presente invención. No se intenta necesariamente ninguna admisión, ni debe interpretarse, que cualquiera de esta información precedente constituye la técnica anterior respecto a la presente invención. Las publicaciones referidas a lo largo de la presente memoria descriptiva están incorporadas como referencias en toda su integridad en esta solicitud.

El propósito de la presente invención es proporcionar medios para promover el recrecimiento, reparación y regeneración de neuronas del CNS de los mamíferos. En consecuencia, la invención brinda las composiciones y sus métodos de uso para promover el recrecimiento, la reparación y/o regeneración de neuronas del CNS de los mamíferos, como los seres humanos, en desórdenes crónicos y agudos.

Una realización de la presente invención proporciona una composición que comprende terapéuticamente las siguientes cantidades eficaces de:

(a)

Uno o más anticuerpos, o sus fragmentos, humanos o quiméricos, fijadores de complemento que específicamente enlazan a un epítope de mielina en humanos, y

(b)

una o más proteínas, o sus fragmentos, del complemento.

en la que el enlace de dichos anticuerpos a la mielina provoca la fractura transitoria y/o demielinación transitoria de neuronas en el humano. Los anticuerpos pueden ser monoclonales y/o policlonales. Pueden derivarse las proteínas, o sus fragmentos, del complemento de una especie diferente a la especie a la que se administra. En una realización preferente, las proteínas, o sus fragmentos, del complemento son humanas. El componente del complemento puede ser un componente físicamente distinto del componente del anticuerpo, o puede estar covalente o no covalentemente adosado directamente al componente del anticuerpo de forma tal, que ese enlace del anticuerpo a la superficie de la mielina active el ataque endógeno al sistema inmunológico. Pueden agregarse uno o más factores de crecimiento (en una secuencia apropiada) para facilitar el recrecimiento y la regeneración.

En una realización específica, el epitope de mielina es un epitope de la vaina de mielina, como el galactocerebrósido (GaIC), O4, la glicoproteína del oligodendrocito de la mielina (MOG, por las siglas de su expresión inglesa, Myelin Oligodendrocite Glycoprotein), o la glicoproteína asociada a la mielina (MAG, por las siglas de su expresión inglesa, Myelin Associated Glycoprotein), NOGO, NI22, NI-35/250, o arretina, o sus fragmentos. En una realización preferente, el epitoque de mielina es GaIC. Otra realización preferente es MOG.

En una realización preferente, las proteínas del complemento, o sus fragmentos, incluyen el componente C3 o su fragmento, variante, análogo o derivado químico. En una realización preferente, se usa el componente C3b.

En otra realización de la presente invención, la composición comprende adicionalmente neurotrofinas y factores de crecimiento, como NT-3, CNTF, FGF-1, BDNF, PDGF, GDNF, CT-1 o BNP.

La presente invención también se refiere al uso de estas composiciones para promover el recrecimiento, la reparación y/o regeneración de neuronas en un sujeto por fractura transitoria y/o demielinación transitoria de la mielina.

En una realización de la presente invención, las composiciones se usan en sujetos que requieren reparación y/o regeneración de las neuronas debido a una disfunción nerviosa. Esta disfunción nerviosa puede ser resultado de una lesión aguda o crónica del CNS. También puede ser resultado de una enfermedad degenerativa, como la enfermedad de Alzheimer o Parkinson.

En otra realización de la presente invención, las composiciones se usan en sujetos para generar un entorno dentro del CNS que sea relativamente permisivo al crecimiento de células trasplantadas.

Según una realización más preferente, dicha composición es una composición en dos partes, en la que las dos partes se entiende que son mezcladas entre sí antes de la administración, durante de la administración, o después de la administración a un humano en necesidad de tal tratamiento.

La presente invención también se refiere a un método para promover el recrecimiento, la reparación y regeneración de neuronas del CNS de mamíferos, en los que la lesión sido resultado de un desorden crónico o agudo. El método implica la entrega de un anticuerpo, o sus fragmentos, fijador del complemento que específicamente enlaza a un epitope de mielina y entrega una o más proteínas, o sus fragmentos, del complemento administradas juntas o separadamente para efectuar la fractura transitoria y/o demielinación transitoria de mielina en las zonas nerviosas que requieran regeneración.

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Diversos otros objetos y ventajas de la presente invención serán evidentes de la descripción detallada de la invención.

La invención se ilustra adicionalmente por las tablas y figuras adjuntas que muestran, respectivamente:

La Tabla 1 presenta los conteos de células nerviosas rubroespinales obtenidas de animales individuales de control y experimentales, con marcado retrógrado por Fluorogold del cordón lumbar de una rata adulta.

La Figura 1 presenta (A) Fotomicrografía de una sección transversal de la médula espinal de una rata adulta de una lesión de hemisección lateral izquierda a nivel de T10, coloreada con cresil violeta. Todas las lesiones fueron evaluadas y siempre se producían desuniendo el funículo a través del cual atraviesa el tracto rubroespinal. Los cuernos contralateral dorsal (dh) y ventral (vh) siempre quedaban ilesos; el canal central (c.c.) siempre se marcaba para una orientación. (B) Valoración de la difusión visible del Fluorogold en el control tratado y en la médula espinal hemiseccionada y fracturada vía inmunológica. La difusión del trazador retrógrado se midió en microscopio de luz visible a los tiempos indicados después de la inyección en la médula espinal lumbar (para detalles, véanse "métodos"). La demielinación inmunológica no afectó significativamente la difusión del trazador.

La Figura 2 muestra fotomicrografías electrónicas de secciones transversales a través del funículo dorsolateral, después de una infusión intraespinal continua de reactivos de acción inmunológica, durante 7 días. (A) Dentro de un segmento espinal (< 2 mm) del sitio de la infusión, eran visibles grandes regiones de axones desnudos demielinados. Se observó que algunos axones estaban asociados con células de monocitos (M, por ejemplo, macrófago infiltrados) y/o microglias endógenas, algunas de las cuales también contenían ovoides de mielina (flechas) o detritos de mielina. (B) En otras barras, podían también verse monocitos y nucleocitos polimorfos invasores (PMN, por las siglas de su expresión inglesa, Polymorpho Nucleocytes) en asociación íntima con axones demielinados. Se identificaron macrófagos y/o microglias en base a su retículo endoplásmico de alta densidad (flecha con cabezas) y procesos "como dedos". Algunos monocitos se han extendido debajo de componentes de las láminas basales, como el colágeno (Col) que los distingue de los astrocitos. Los núcleos multilóbulos son característicos de los PMN y facilitan su identificación. (C) Ejemplo de fractura de la mielina. Esto se observa a menudo a 4 - 8 mm (1-2 segmentos espinales) del sitio de la infusión inmunológica, en donde los axones todavía estaban asociados a la mielina. Son embargo, las láminas de mielina estaban fracturadas (deamielinadas). Persistieron algunas regiones de coherencia con la envoltura de mielina (flechas). (D) Ejemplo de la apariencia de axones dentro del funículo dorsolateral después de una infusión de control sólo del complemento de conejillos de indias. Ocurrió alguna lesión no específica de la vaina de mielina, sobre todo, dentro de un segmento espinal del sitio de infusión; sin embargo, la naturaleza compacta de la mielina permaneció intacta. La amplificación original fue x 4000 (A, B, D), x 10000 (C).

La Figura 3 presenta demostraciones de la regeneración de neuronas rubroespinales después de la hemisección torácica lateral izquierda y del siguiente tratamiento de supresión inmunológica de la mielina. Los cuadros A y B son fotomicrografías de neuronas rubroespinales del mismo animal tratado experimentalmente (14 días de infusión del complemento de suero con anti GaIC); A es del núcleo rojo ileso, mientras que B es el del la mielina lesionada; sin embargo, las láminas de la mielina fueron fracturadas (núcleo Rojo deslaminado. El de los cuadros C y D también son del mismo animal tratado de control (14 días de infusión sólo del complemento de suero): C es del núcleo Rojo ileso y D es del núcleo Rojo lesionado. La inyección de Fluorogold dentro del cordón lumbar rostral, 28 días después de la lesión producía el marcado retrógrado de las neuronas rubroespinales ilesas (A y C), así como las neuronas rubroespinales que se habían regenerado del núcleo Rojo lesionado (B y D). Las neuronas rubroespinales axotomizadas (E) y (F) fueron marcadas en forma retrógrada en el momento de la lesión con la primera marca RDA (las cabezas de las flechas están rellenas) y posteriormente a los 28 días después con la segunda marca FG (las cabezas de la flecha están abiertas). Las células con doble marcado (RDA + FG) son indicadas por un asterisco y representan esas neuronas rubroespinales que se habían regenerado después del tratamiento de supresión inmunológica de la mielina. La barra de la escala = 100 \mum.

La Figura 4 muestra una valoración cuantitativa relativa de la regeneración de neuronas rubroespinales después de la lesión torácica y del tratamiento inmunológico. La regeneración se evaluó contando las células marcadas con FG en secciones de tejido alternadas: aquellas que tenían una morfología nerviosa multipolar y que también estaban marcadas con FG se consideraron positivas. El porcentaje de regeneración fue calculado por comparación de los conteos celulares de las marcadas en forma retrógrada del núcleo Rojo lesionado con los del núcleo Rojo ileso del control, dentro del mismo animal. Para cada animal fue evaluado el grado de lesión. La barra rellena representa la destrucción de la mielina; barra enrejada: los grupos tratados con el control, agrupados. Los datos muestran la \pm d.s.

La Figura 5 muestra los efectos de la retirada de una sola proteína del complemento sobre la demielinación inmunológica. (A) Control de la médula espinal ilesa. Las fotomicrografías electrónicas de las secciones transversales a través de los funículos dorsolaterales indican la ultrastructura de vainas de mielina adultas. (B) Infusión durante 7 días con el anticuerpo específico a la mielina y el suero dl complemento humano dan como resultado una supresión profunda de la mielina. (C) Retirada del componente C3 del complemento da cómo resultado una falta de retirada de la mielina, indicando el papel fundamental de esta proteína tanto (i) en la opsonización, como (ii) en la propagación de la cascada al complejo de ataque a la membrana lítica (MAC, por las siglas de su expresión inglesa, Membrane Attack Complex), el complejo último de la vía lítica. Se cree que es un requisito fundamental y esencial para un anticuerpo específico de la mielina, enlazante de la superficie celular, para activar la vía clásica del complemento para una demielinación transitoria eficaz.

La Figura 6 muestra una valoración cuantitativa relativa de la regeneración de neuronas vestibuloespinales laterales después de una lesión torácica y un tratamiento inmunológico retardado. El tratamiento de demielinación inmunológica, como se indica, fue retardado hasta 1 ó 2 meses después de la lesión. La regeneración se evaluó contando las células marcadas FG en secciones de tejido alternadas: aquellas que tenían una morfología nerviosa multipolar y que también estaban marcadas con FG se consideraron positivas El porcentaje de regeneración fue calculado por comparación de los conteos celulares de las marcadas en forma retrógrada del núcleo vestíbuloespinal lateral lesionado con los del núcleo vestíbuloespinal lateral ileso del control, dentro del mismo animal. Para cada animal fue evaluado el grado de lesión. La barra rellena representa la destrucción de la mielina; barra enrejada: los grupos tratados con el control, agrupados. Los datos muestran la \pm d.s.

La Figura 7 presenta: A) Dibujo de una vista dorsal del sistema nervioso central de una rata, indicando los orígenes relativos y curso del tracto rubroespinal (RN) y del tracto vestibular lateral (LVe). También está ilustrada (línea llena) la lesión de hemisección torácica izquierda lateral, (línea \simT10), el sitio de infusión inmunológica, (\sim T11, enrejado vertical), y el sitio de inyección de Fluorogold \sim L1, enrejado diagonal). B) Fotomicrografía compuesta de secciones parasagitales a través del torácico inferior y la médula espinal lumbar rostral (T9-L1, el rostral está hacia arriba). Un poco de difusión de Fluorogold puede estar emanando claramente del sitio de inyección como un intenso "halo blanco", sin embargo, la mancha rápidamente disminuye con la distancia del sitio de inyección y no fue visible ninguna en rostral T11 desde el sitio de infusión inmunológica (es decir, ninguna difusión hacia o sobre la lesión a T10, así que ninguna evidencia para cualquier positivo "falso" de marcado retrógrado de las proyecciones tronco-cerebroespinales). C) Fotomicrografía de una sección transversal de la médula espinal al nivel de T10 de la lesión de hemisección lateral izquierda, coloreada con cresil violeta. Todas las lesiones fueron evaluadas y siempre producían como resultado la afección de los funículos a través de los que atravesaran el tracto rubroespinal y el vestibuloespinal lateral. Los cuernos contralateral dorsal (dh) y ventral (vh) siempre quedaban ilesos; el canal central (c.c) se marca para orientación. D y E) Fluorescencia no específica asociada a las células de la sangre dentro de la lesión y el sitio de implantación de la cánula que indica el grado de lesión asociado respectivamente a la lesión e implantación de la cánula. La fluorescencia del marcado específico por Fluorogold nunca se observó a nivel de la implantación de la cánula o la lesión de hemisección.

La Figura 8 muestra la regeneración de neuronas vestíbuloespinales laterales después de la hemisección torácica lateral izquierda y el siguiente tratamiento de supresión inmunológica de la mielina. Los cuadros A y B son fotomicrografías de neuronas vestibuloespinales laterales del mismo animal tratado experimentalmente (14 días de infusión del complemento de suero con el anti GaIC); A es del núcleo vestibular lateral lesionado, B es del núcleo vestibular lateral ileso y los cuadros C y D también son del mismo animal de control tratado (14 días de infusión sólo del complemento de suero); donde C es el núcleo del vestibuloespinal lateral lesionado y D es el núcleo vestibuloespinal lateral ileso. La inyección de Fluorogold dentro del cordón lumbar rostral 28 días después de producida la lesión producía el marcado retrógrado de las neuronas vestibuloespinal laterales ilesas (B y D), así como esas neuronas vestibuloespinales laterales que se habían regenerado del núcleo vestibuloespinal lateral lesionado (A y C), por favor, véanse "resultados" para detalles adicionales. El cuadro E es un dibujo de una sección transversal a través del cerebro medio, que indica la situación del núcleo vestibular lateral (LVe), SpVe = núcleo vestibular espinal, MVe = núcleo medio vestibular, 4V = 4º ventrículo, FN = tracto del nervio facial. 7 = 7º núcleo craneal (facial), PFI = paraflóculo. La barra de la escala = 100 \mum

La Figura 9 muestra la valoración relativa cuantitativa de la regeneración de las neuronas rubroespinales y vestibuloespinales laterales después de la lesión torácica y el tratamiento inmunológico. La regeneración se evaluó contando las células marcadas por FG en secciones de tejido alternadas: aquellas que tenían una morfología nerviosa multipolar y que también estaban marcadas con FG se consideraron positivas. El porcentaje de regeneración se calculó por comparación del núcleo lesionado respecto al núcleo contralateral (no dañado) dentro del mismo animal. Para cada animal se evaluó el grado de lesión. Las barras rellenas, experimentales; las barras abiertas, los grupos de control, agrupados.

La Figura 10 muestra una valoración cuantitativa de la regeneración de axones tronco-cerebroespinales descendientes después de la hemisección lateral crónica y el tratamiento inmunológico retardado. Los porcentajes de neuronas del núcleo rojo de marcado retrógrado (rojo) y lateral vestibular (verde) respecto al contralateral ileso, después del control del tratamiento (PBS, Ab, GpC) (barras abiertas) o fractura / demielinación inmunológica (barras rellenas). Expresado como el porcentaje de células marcadas en el núcleo lesionado vs. el contralateral ileso.

A lo largo de la presente solicitud y de las reivindicaciones se usan los siguientes términos y abreviaciones:

La expresión "anticuerpos o sus fragmentos" incluye formas recombinantes, quiméricas y de afinidad modificadas, hechas por técnicas de biología molecular, bien conocidas en la técnica.

El término "CNS" se refiere al sistema nervioso central.

La expresión "proteína del complemento o sus fragmentos" (C) se refiere a cualquiera de las 13 proteínas de suero, enteras o cualquiera de más de 20 intermedios y complejos del sistema del complemento, el mediador humoral primario de reacciones antígeno-anticuerpo, e incluye variantes, análogos y sus derivados químicos.

El término "composición" se usa para indicar más de un componente. Pueden mezclarse conjuntamente los elementos de la composición, sin embargo, no es necesario que ellos se combinen en la misma solución. En una realización alternativa, ellos no necesitan ser empaquetados, guardados o incluso mezclados conjuntamente. Los elementos (del tipo de anticuerpos y del tipo de complementos) pueden administrarse secuencialmente al sitio de lesión del nervio, o al mismo tiempo. La necesidad en una secuencia temporal terapéuticamente eficaz se entiende por un experto en la técnica. El concepto por lo menos de un anticuerpo fijador del complemento o sus fragmentos, más por lo menos una proteína del complemento o sus fragmentos activos, se iguala con el concepto de composición. Estos elementos se administran al sitio de la lesión para formar un complejo con un epitope apropiado, presente en la mielina para que sea temporalmente demielinada. Así, los primeros dos tipos de elementos (de los cuales puede haber más de un miembro de cada tipo de elemento, por ejemplo, dos o más anticuerpos o proteínas del componente o sus fragmentos) se administra al sitio designado para la demielinación transitoria y formar un complejo in situ, in vivo, con el(los) epítope(s) de la mielina.

El término "demielinación" se refiere a la delaminación o fractura de mielina en el tejido de las neuronas. Demielinación consiste en la retirada de la vaina de mielina, como la que rodea las neuronas o las neuronas de proyección (por ejemplo, los axones). Este proceso puede ser químico o inmunológico en ambos estados, el experimental y el patológico. Esta invención efectúa la demielinación transitoria para promover la reparación y el recrecimiento.

El término "fractura" se refiere a la delaminación o fractura de la estructura tridimensional de mielina.

El término "disfunción", cuando se usa para describir el uso terapéutico de la invención, abarca cualquier tipo de trauma del sistema nervioso y la pérdida resultante de la función. Tal trauma puede surgir de una lesión o enfermedad física.

El término "Fab" (por las siglas de su expresión inglesa, Fragment Antibody) significa un fragmento de anticuerpo que se obtiene escindiendo un anticuerpo en la región de articulación, lo que da como producto dos fragmentos Fab, cada uno teniendo los dominios de cadena pesada y ligera del anticuerpo, junto con una región Fc.

El término "Fc" (por las siglas de su expresión inglesa, Fragment Constant) significa la región constante del anticuerpo, la cual puede activar el complemento.

El término "fragmentos Fv " (por las siglas de su expresión inglesa, Fragment Variable) significa un heterodímero de los dominios variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo. Estos dominios variables pueden unirse por un vinculador de péptido o por un enlace disulfuro diseñado.

Los factores de crecimiento son moléculas de polipéptido extracelular de señalización que estimulan una célula para que crezca o prolifere. Ejemplos son el factor de crecimiento epidérmico (EGF, por las siglas de su expresión inglesa, Epidermal Growth Factor) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF, por las siglas de su expresión inglesa, Platelet-Derived Growth Factor). Muchos factores de crecimiento tienen otras acciones además de la inducción del crecimiento o de la proliferación celular. Los factores de crecimiento pueden ser divididos en clases de especificidad estrecha y amplia. Los factores de especificidad amplia, como PDGF y EGF afectan a cualquier clase de células. En los extremos opuestos se encuentran los factores de especificidad estrecha. En la proliferación de los animales intactos la mayor parte de los tipos celulares dependen de una combinación específica de factores de crecimiento, en lugar de un solo factor de crecimiento. Así, un número justamente pequeño de familias de factores de crecimiento puede servir, en combinaciones diferentes, para regular la proliferación cada uno selectivamente de muchos tipos de células en un animal superior.

El factor de crecimiento de fibroblasto (FGF, por las siglas de su expresión inglesa, Fibroblast Growth Factor) es cualquiera de un grupo de proteínas, normalmente intracelulares que tienen una importante función angiogénica y de refuerzo de la sanación y reparación del tejido. La sobreactividad de estos factores ha sido asociada con la neoplasia.

Los factores neurotróficos son una familia de sustancias que promueven el crecimiento y regeneración de las neuronas. Mientras que los factores de crecimiento en todas las partes del cuerpo promueven y apoyan la división celular, las neuronas no se pueden dividir; pero ellas se pueden regenerar después de las lesiones y los factores neurotróficos promueven esta regeneración. Ellos también promueven el crecimiento de los axones y las dendritas, las ramas nerviosas que forman las conexiones con otras neuronas.

"GaIC" (por las siglas de su expresión inglesa, Galactocerebroside) se refiere al galactocerebrósido.

"MAG" (por las siglas de su expresión inglesa, Myelin-Associated Glycoprotein) se refiere a la glicoproteína asociada a la mielina.

"MBP" (por las siglas de su expresión inglesa, Myelin Basic Protein) se refiere a la proteína básica de la mielina.

"MOG" (por las siglas de su expresión inglesa, Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein) se refiere a la glicoproteína del oligodendrocito de la mielina.

El término "tejido neurológico" se refiere típicamente a las neuronas y otras células situadas dentro de la región del sistema nervioso, como es la médula espinal del CNS.

"PNS" (por las siglas de su expresión inglesa, Peripheral Nervous System) se refiere al sistema nervioso periférico.

El término "anticuerpos recombinantes o sus fragmentos" incluye colectivamente las formas quiméricas o recombinantes de los anticuerpos o de sus fragmentos, en las que el dominio Fc se sustituye por un dominio Fc de otras especies o isotipos, las formas de afinidad modificada de los anticuerpos o de sus fragmentos en las que los sitios enlazantes están alterados, las formas de avidez modificada de los anticuerpos o sus fragmentos en las que las regiones de articulaciones están alteradas, sus fragmentos inmunoreactivos y sus combinaciones.

El término "regeneración de tejido nervioso" incluye el recrecimiento de neuronas que da como resultado la reforma de las conexiones nerviosas, anatómica y/o funcionalmente.

La presente invención reside en el descubrimiento inesperado que una combinación de ambos, de un anticuerpo, que enlaza a un epitope en una célula de la neuroglia productora de mielina, y de un complemento, puede usarse para la fractura y demielinación de la vaina de mielina de forma tal que mejoran la reparación y regeneración del tejido nervioso de los mamíferos. La composición de esta invención es valiosa como agente terapéutico, en los casos en los que hay una lesión o enfermedad del sistema nervioso de los mamíferos de forma tal que hay necesidad de facilitar la plasticidad nerviosa y el recrecimiento de las conexiones nerviosas. Según la invención, el tejido nervioso se expone a la composición que fractura la mielina, siguiendo lo más pronto posible a la lesión, trauma o enfermedad. La naturaleza del protocolo para efectuar la demielinación transitoria se puede determinar según Kierstead y Blakemore. 1997. J. Neuropath. Expt. Neurol. 56 1191-1201; Kierstead et al., 1998, Glia, 22 161-170.

La presente invención provee medios de promover la regeneración del tejido nervioso en un sujeto mamífero, como un humano, con una disfunción del sistema nervioso, poniendo en contacto el tejido nervioso con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un anticuerpo fijador del complemento, que se enlaza a la mielina, y el complemento. También pueden usarse las composiciones de la presente invención en el campo de la medicina veterinaria.

Las composiciones de la presente invención comprenden uno o más anticuerpos o sus fragmentos, que enlazan a la mielina, y una o más proteínas de suero del complemento o sus fragmentos.

Anticuerpos

Los anticuerpos usados en esta invención pueden ser específicamente cualquier anticuerpo o sus fragmentos que enlacen a la mielina, y en la que dichos anticuerpos activan el sistema del complemento. Los anticuerpos preferentes de la presente invención enlazan específicamente un epitope de vaina de mielina, galactocerebrósido (GaIC), 04, glicoproteína de oligodendrocito de la mielina (MOG), o glicoproteína asociada a la mielina (MAG). Otros epítopes preferentes son NOGO (anteriormente NI 35/250) y N1220 y arretina.

Generación de anticuerpos

Los anticuerpos de la presente invención, o sus fragmentos, puede ser:

a) Que ocurran naturalmente.

b) Anticuerpos obtenidos de estados de enfermedades como las células B de los pacientes de esclerosis múltiple; b) producidos por una tecnología recombinante de ADN.

c) Producidos por fragmentación bioquímica o enzimática de moléculas mayores.

d) Producidos por métodos que son el resultado de una combinación de a) a c);

e) Producidos por cualquier otro medio para la producción de anticuerpos.

Los anticuerpos humanos pueden ser generados por varias técnicas conocidas a los expertos en la técnica, incluyendo el uso de células de insectos y de plantas transgénicas como el tabaco o semillas de maíz (Cramer. C L . CropTech Development Corp; Reno. J., NeoRx-IVC's IV Annual Conference: Sept 9-12, S F. U.S.A.).

Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser producidos por técnicas tradicionales, como la vía monoclonal o policlonal, aunque se prefieren los anticuerpos monoclonales. En general, los anticuerpos pueden ser obtenidos inyectando el inmunogen deseado en una amplia variedad de vertebrados o invertebrados de acuerdo con técnicas convencionales. Aunque se prefieran roedores, particularmente los ratones, pueden emplearse otras especies, como los miembros de las familias bovina, ovina, caballar, porcina, avícola. La inmunización de estos animales puede realizarse prontamente y pueden obtenerse sus linfocitos, particularmente los esplenocitos, para las fusiones.

Los protocolos de inmunización son bien conocidos y pueden variar considerablemente permaneciendo todavía eficaces (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed.) (Academic Press, 1986). Pueden usarse proteínas aisladas, péptidos sintéticos, y proteínas de fusión bacteriana que contienen fragmentos antigénicos de la molécula de mielina, como los inmunogenes. Preferentemente se enriquecerán los inmunogenes de péptidos o proteínas recombinantes para proteínas o fragmentos que contengan epítopes para los que se desee n células productoras de anticuerpos B o sus esplenocitos.

Una vez se han purificado las proteínas o sus péptidos a la magnitud deseada, ellas pueden suspenderse o pueden diluirse en un portador fisiológico apropiado para inmunización, o se pueden acoplar a un cantidad inmunogénica coadyuvante de preparaciones antigénicas enriquecidas en mielina, o sus porciones antigénicas, se inyectan generalmente en concentraciones en el intervalo de 1 ug a 100 mg/kg del anfitrión. La administración puede ser por inyección intramuscular, peritoneal, hipodérmica o intravenosa. La administración puede ser una pluralidad de veces, normalmente a intervalos de una a cuatro semanas.

Los animales inmunizados se supervisan para la producción de anticuerpos para los antígenos deseados, luego los bazos son retirados y los linfocitos B esplénicos son aislados y fundidos con una línea celular de mieloma, o transformados. Los linfocitos B también pueden aislarse de la sangre. La transformación o fusión puede llevarse a cabo por las maneras convencionales. La técnica de fusión se describe en un número adicional de patentes, como las patentes de los EE.UU. Nº 4.172.124; 4.350.683; 4.363.799; 4.381.292; y 4.423.147. La forma de inmortalización no es crítica, pero el método más común es la fusión con un compañero de fusión de mieloma. Otras técnicas de inmortalización incluyen la transformación EBV, transformación con ADN expuesto, como los oncogenes o retrovirus, o cualquier otro método que provea el mantenimiento estable de la línea celular y la producción de anticuerpos monoclonales. El proceso general para obtener los anticuerpos monoclonales ya ha sido descrito (Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497). Los anticuerpos humanos monoclonales pueden ser obtenidos por fusión de células del bazo con un compañero humano de fusión apropiado, como WI-L2, descrito en la solicitud de patente europea Nº 82.301103.6. Se ha enseñado una técnica detallada para producir anticuerpos monoclonales ratón X-ratón (Oi & Herzenberg (1980) en Mishell and Shiigi (ed.) Selected Methods in Cellular Immunology 351-372). Los hibridomas resultantes se protegen para aislar copias individuales, cada una de los cuales secretan una sola especie del anticuerpo al antígeno.

Las líneas celulares inmortalizadas pueden duplicarse y pueden protegerse de acuerdo con técnicas convencionales, y los anticuerpos descubiertos en los sobrenadantes celulares son capaces de enlazarse con la mielina. Las líneas celulares inmortalizadas apropiadas pueden crecerse luego in vitro o pueden inyectarse en la cavidad peritoneal de un anfitrión apropiado para la producción de fluido de ascitos. Las líneas celulares del hibridoma inmortalizado pueden producirse fácilmente de una variedad de fuentes. Alternativamente, estas líneas celulares pueden fundirse con otras células B neoplásticas, en las que tal otra células B pueden servir como destinatarias para el genómico ADN codificante del anticuerpo.

El anticuerpo monoclonal secretado por las líneas celulares transformadas o híbridas puede ser cualquiera de las clases o subclases de las inmunoglobulinas, como IgM, IgD, IgA, IgG_{1-4}, o IgE. Como IgG es el isotipo más común, utilizado en los ensayos de diagnóstico, se le prefiere a menudo.

Para obviar la posible antigenicidad en un anfitrión humano de un anticuerpo monoclonal derivado de un animal que no sea el humano, pueden construirse anticuerpos quiméricos. Por ejemplo, el fragmento enlazante de antígeno de una molécula de inmunoglobulina (región variable) puede conectarse por vínculo del péptido por lo menos a una parte de otra proteína no reconocida como extraño por los humanos, como la porción constante de una molécula de inmunoglobulina humana. Esto puede ser logrado fundiendo los exones de la región animal variable con exones humanos de las regiones constante kappa o gamma. Se conocen varias técnicas por el experto en la técnica, como aquellas descritas en los documentos PCT 86/01533, EP 171496, y EP 173494.

Como un método alternativo de producción de anticuerpos, la patente de los EE.UU. Nº 5.627.052 describe métodos de producción de proteínas que reproducen las características enlazantes y la función deseada de anticuerpos particulares. Un ejemplo de aplicación de este método incluye el aislamiento y caracterización de una célula de linfocito B humano, produciendo un anticuerpo específico anti mielina, por ejemplo del bloqueo de un paciente con esclerosis múltiple.

Ingeniería de anticuerpo

Los anticuerpos pueden usarse intactos, o como fragmentos, como Fv, Fab, y F(ab')2 con tal de que haya una región Fc presente para enlazar el complemento. Tales fragmentos de anticuerpo proporcionan mejores características de difusión in vivo que el anticuerpo entero, debido a su menor tamaño. Los medios para diseñar los anticuerpos por métodos de ADN recombinante y de modificación química son considerados muy conocidos en la técnica.

Los anticuerpos pueden fragmentarse para obtener los fragmentos altamente inmunoreactivos F(ab )2, F(ab) y Fab usando la pepsina de la enzima por métodos bien conocidos en la técnica (véase Colcher et al., (1983) Cancer Res. 43:736-742).

Debido al desarrollo de técnicas moleculares de clonación, ahora es posible producir fragmentos de anticuerpo monoclonal humano rápidamente paneando el despliegue de bibliotecas de fagos respecto a especificidades antigénicas predefinidas. Para técnicas ejemplares véase: Pistillo et al., Human Immunology, 57(1): 19-26, 1997 Sep 15.

Los anticuerpos o sus fragmentos son también obtenidos en formas recombinantes por técnicas de biología molecular bien conocidas en la técnica (véanse Rice et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7862-7865. Kurokawa et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:3077-3085; Oi et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:825-829; Boss et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:3791-3806; Boulianne et al., (1984) Nature (London) 312:643-646; Cabily et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277; Kenten et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2955-2959; Liu et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5369-5373; Monison et al., (1984) Proc. NatL Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger et al., (1984) Nature (London) 312:604-608; Potter et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7161-7165; Neuberger et al., (1985) Nature (London) 314:268-270; Jones et al., (1986) Nature (London) 321:522-525; Oi et al., (1986) Bio Techniques 4: 214-221; Sahagan et al., (1986) J. Immunol. 137:1066-1074; Sun et al., (1986) Hybridoma 5 (Supp. 1):S17-S20; & Sun et al., (1987). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218).

Más específicamente, los anticuerpos y sus fragmentos pueden alterarse a una forma quimérica sustituyendo por fragmentos de anticuerpo de otra especie, por ejemplo, sustituyendo regiones constantes humanas (dominios Fc) por regiones constantes del ratón por técnicas recombinante de ADN conocidas en la técnica, como son las descritas en las referencias citadas anteriormente. Estos dominios Fc pueden ser de varios isotipos humano, es decir, IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}, o IgM.

Además, pueden alterarse los anticuerpos y sus fragmentos a una forma de afinidad modificada, una forma de avidez modificada, o ambas, alterando los sitios enlazantes o alterando la región de articulación, usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica, como las descritas en las referencias citadas anteriormente.

Las formas recombinantes de anticuerpos también pueden fragmentarse para producir fragmentos inmunoreactivos F(ab)_{2}, F (ab'), y Fab de la misma manera, como ya se ha descrito anteriormente.

Los fragmentos de anticuerpos también pueden incluir fragmentos Fv, los módulos funcionales de anticuerpos más pequeños exigidos para mantener el enlace y especificidad del anticuerpo entero. Los fragmentos de Fv son heterodímeros compuestos de un dominio de cadena pesada variable y un dominio de cadena ligera variable. La digestión proteolítica de anticuerpos puede dar como resultado el fragmento aislado Fv, pero el método preferente de obtener los Fv es por la tecnología recombinante (véase Esquerra y Pluckthun (1988) Science 240, 1038-1041)

Los Fv puede ser dominios V_{II} y V_{I}, asociados no covalentemente, aunque éstos tienden a disociar entre si. Los Fv estables pueden producirse obteniendo moléculas recombinantes, en las que los dominios V_{ii} y V_{i} son conectados por un vinculador de péptido para que el sitio combinador del antígeno se regenere en una sola proteína. Estas moléculas recombinantes son denominadas de una sola cadena Fv (scFv). Los medios para preparar scFv son conocidos en la técnica (Véase: Raag and Whitlow (1995) FASEB 9:73; Bird et al., (1988) Science 242:423-426-1 Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Alternativamente, los dos dominios variables pueden unirse y pueden estabilizarse por un enlace disulfuro diseñado; éstos son denominados Fv disulfuros (dsFvs) (Reiter and Pastan (1996) Clin. Cancer Res. 2:245-252).

El dominio Fc de un anticuerpo se requiere para la activación de un complemento. Los fragmentos Fv, a los que les falta el dominio Fc, no pueden activar el complemento. Para que los fragmento Fv puedan ser útiles en la presente invención, ellos tendrían que ser diseñados con un nuevo activador de la cascada del complemento. Como ejemplo, el fragmento Fv podría diseñarse para incluir el dominio C_{H}2 de un anticuerpo IgG. Como ejemplo alternativo, una molécula totalmente sintética puede enlazarse al fragmento Fv para activar el complemento, o un activador de complemento familiar a los expertos en la técnica puede enlazarse al fragmento Fv.

El anticuerpo también puede modificarse por la adición de moléculas tales como polietilenglicol (tal como está descrito en la patente de los EE.UU. Nº 5.766.897) para prolongar su vida media biológica, su potencia o la difusión in situ de la molécula (patente de los EE.UU Nº 5.747.446, Chinol et al., 98 Brit. J. Cancer, 78:189-197; Francis et al., 98, Intl J. Hematol. 68:1-18).

Marcado de anticuerpos o fragmentos

Los anticuerpos de esta invención, o sus fragmentos, pueden ser usados sin modificación o modificados de una variedad de maneras, por ejemplo, por un marcado. Se considera que marcado significa unión, covalente o no covalente. Un marcado que directa o indirectamente mantiene medios de detección del anticuerpo para habilitar la supervisión del progreso del tratamiento terapéutico que usa la composición.

Un marcado puede comprender cualquier material que posea una propiedad química o la física detectable. Se conoce una variedad amplia de marcados, que incluye radionucleidos, enzimas, sustratos de enzimas, cofactores de enzima, inhibidores de enzimas, ligandos (particularmente háptenes), sustancias fluorescentes, cromóforos, sustancias luminescentes y partículas magnéticas. Estos marcados son detectables en base a sus propias propiedades físicas (p. ej., sustancias fluorescentes, cromóforos y radioisótopos), o a sus propiedades reactivas u enlazantes (p. ej., enzimas, sustratos, cofactores e inhibidores). Estos materiales se conocen bien por los expertos en la técnica. La patente de los EE.UU 4.671.958 enseña métodos que pueden usarse para el marcado de los anticuerpos, o la pegadura del complemento a los anticuerpos.

Complemento

La porción del complemento en la composición puede comprender una o más proteínas del complemento, fragmentos, variantes, análogos y/o derivados químicos.

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Un fragmento de una proteína del complemento se refiere a cualquier subconjunto de la molécula C. Por ejemplo, los fragmentos de C3 incluyen C3b, iC3b, C3a, C3c. C3dg y C3d.

Una "variante" de una proteína del complemento, o sus fragmentos, se refiere a una molécula que sea esencialmente similar a la proteína entera o a un fragmento suyo, la cual posea actividad biológica que sea esencialmente similar a la actividad biológica de la proteína del complemento o de sus fragmentos. Se dice que una molécula es esencialmente "similar" a otra molécula, si ambas moléculas tienen estructuras esencialmente similares o si ambas moléculas poseen una actividad biológica similar.

Las variantes de C3b, por ejemplo, incluyen dímeros de C3b, y oligómeros superiores. Cuando la activación de C ocurre en la superficie celular, los ciclos múltiples de reacciones de la enzima producen la deposición en la superficie de C3b en forma multimérica. Dímeros u oligómeros superiores de C3b de hecho tienen superior afinidad por la célula que la que tienen los monómeros C3b.

Las variantes de proteína del complemento, o sus fragmentos, son producidas por medios químicos o recombinantes bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, tales variantes incluyen supresiones, inserciones o sustituciones, de residuos de aminoácidos dentro de la secuencia del aminoácido. Por ejemplo, por lo menos, un residuo de aminoácido puede retirarse y un residuo diferente puede insertarse en su lugar. Los cambios sustanciales en las propiedades funcionales o inmunológicas son hechos seleccionando sustituciones que son menos conservadoras, es decir, eso difiere más significativamente en su efecto de mantener: (a) la estructura del espinazo del péptido en el área de sustitución, por ejemplo, como la de una hoja o una estructura helicoidal, (b) la carga o hidrofobocidad de la molécula en el sitio designado, o (c) la masa de la cadena lateral. Las sustituciones que en general se espera que induzcan los mayores cambios son aquellas en las que (a) la glicina y/o la prolina se sustituye por otro aminoácido, se anula o se inserta; (b) un residuo hidrófilo, por ejemplo, seril-ortreonilo, se sustituye por (o con) un residuo hidrófobo, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenil-alanilo, valilo, o alanilo; (c) un residuo de cisteína se sustituye por (o con) cualquier otro residuo; (d) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histidilo, se sustituyen por (o con) un residuo que tiene una carga electronegativa, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (e) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenil-alanina, es sustituido por (o con) uno que no tenga tal cadena lateral, por ejemplo, glicina.

La mayoría de las supresiones, inserciones y sustituciones no se espera que puedan producir cambios radicales en las características de la molécula de la proteína, sin embargo, cuando es difícil de predecir por adelantado el efecto exacto de la sustitución, supresión o inserción un experto en la técnica apreciará que el efecto se evaluará por ensayos rutinarios de prueba y error. Por ejemplo, un cambio en el carácter inmunológico de la molécula de la proteína, como es el enlazarla a un anticuerpo dado, es medido por un inmunoensayo, como sería un inmunoensayo de tipo competitivo.

Un "análogo" de una proteína del complemento o de su fragmento se refiere a una molécula no natural esencialmente similar a la proteína entera o a un fragmento suyo.

Un "derivado" químico de una proteína del complemento o de su fragmento contiene restos químicos adicionales que normalmente no son parte de la proteína o de fragmento. Las modificaciones covalentes de los péptidos son incluidas dentro del alcance de esta invención. Pueden introducirse tales modificaciones en la molécula haciendo residuos señalados de aminoácido del péptido con agentes orgánicos de derivación que son capaces de reaccionar con residuos de las cadenas laterales o terminales seleccionadas, como es muy conocido en la técnica (T E. Creighton Proteins: Structure and Molecule Properties (San Francisco W H Freeman, 1983) pág. 70-86 ).

La porción del complemento de la composición puede ser un componente físicamente distinto del componente del anticuerpo. Alternativamente, las proteínas del complemento, o sus fragmentos, puede ser covalente o no covalentemente adosada directamente al componente del anticuerpo, de forma tal que ese enlace del anticuerpo a la superficie de la mielina activa el ataque del sistema inmunológico endógeno.

Los componentes del complemento pueden ser fragmentos que han sido purificados, así como aquellos que han sido enriquecidos en las proteínas que comprenden el sistema del complemento. Tales preparaciones deben tener en cuenta la inestabilidad relativa del complemento y deben proporcionar una combinación suficiente de factores, como para permitir la activación completa de la cascada del complemento para permitir que ocurra la demielinación transitoria.

La porción del complemento de la composición puede comprender una o más proteínas del complemento, fragmentos, variantes, análogos y/o derivados químicos. Debe notarse, sin embargo, que el componente C3 del complemento juega un papel fundamental en la opsonización o en la propagación de la cascada hacia el MAC lítico. En una realización preferente, el componente C3 o su fragmento, variante, análogo o derivado químico debe ser incluido en la porción del complemento de la composición. En situaciones señaladas para demielinación, el componente C3 debe estar ciertamente presente para obtener resultados óptimos. En situaciones señaladas para regeneración, éste ciertamente se requiere.

La porción del complemento de la composición puede derivarse del propio suero de un sujeto, del suero de un donante o del suero agrupado de varios donantes, como aquellos que están disponibles comercialmente y que se producen según normas consecuentes y aceptadas.

Los componentes del complemento pueden derivarse de especies diferentes a aquella especie a la que se administra debido al hecho de que las composiciones se presentan directamente al tejido nervioso (por ejemplo, interiormente por un catéter).

Otros factores

La composición puede opcionalmente incluir otras sustancias químicas o fármacos como factores de crecimiento y neurotrofinas. Se sabe que los efectos beneficiosos de bloquear los inhibidores asociados a la mielina del CNS en la regeneración de los axones pueden ser aumentados por la aplicación concomitante de neurotrofinas, como NT-3 (Bregman et al., (1995) Nature 378:498-501; Schnell et al., (1994) Nature 367:170-173). También puede usarse el FGF-1 (Chang et al., 1996, supra).

En una realización preferente, la composición comprende un anticuerpo monoclonal específico GalC y un complemento de suero humano.

En otra realización preferente, la composición comprende un anticuerpo monoclonal MOG específico y un complemento de suero humano.

Usos

Las composiciones de la presente invención pueden usarse para promover el recrecimiento, reparación y/o regeneración de neuronas en el CNS de un sujeto, estimulando la fractura inmunológica transitoria de la mielina o la demielinación transitoria de los axones. Preferentemente, el proceso de demielinación transitoria de la presente invención ocurre en el CNS, más preferentemente en la médula espinal.

El sujeto puede ser cualquier mamífero. En una realización preferente, el sujeto es humano.

Las composiciones de la presente invención pueden usarse para promover el recrecimiento, reparación y/o regeneración de neuronas disfuncionales en el CNS que se ha dañado como resultado de una lesión, como sería una lesión de la médula espinal. El método puede usarse inmediatamente a continuación de una lesión, o en una lesión crónica.

Las composiciones de la presente invención también pueden usarse para promover el recrecimiento, reparación y/o regeneración de neuronas disfuncionales en el CNS que se ha dañado como resultado de una enfermedad, como son las enfermedades degenerativas incluyendo las enfermedades de Alzheimer y de Parkinson.

También pueden usarse las composiciones de la presente invención para generar un entorno dentro del CNS de los mamíferos que sea relativamente permisivo al crecimiento de células trasplantadas. Por ejemplo, si se trasplantan células PNS en un sitio del CNS que se ha dañado, los axones podrían crecer en el tejido trasplantado pero serían incapaces de crecer hacia fuera de este tejido en el CNS, debido a los efectos inhibitorios de la mielina. Las composiciones de la presente invención pueden usarse para fracturar la mielina en el CNS y permitir que los axones se extiendan hacia esta área.

Preparaciones y su administración

Los métodos de uso de las composiciones de la presente invención comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición tal al sujeto. Como está usado en la presente solicitud, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de composición suficiente para eficaz y temporalmente fracturar y/o demielinar el CNS para que sea aumentada la reparación y regeneración del tejido nervioso, y de las conexiones nerviosas. Generalmente, la composición terapéutica se administra en un intervalo desde aproximadamente 0,03 mg de anticuerpo hasta aproximadamente 0,6 mg de anticuerpo en una solución al 20% hasta 30% del complemento por kg de peso corporal. Preferentemente, el intervalo es desde 0,05 mg de anticuerpo hasta 0,4 mg de anticuerpo en una solución al 20% hasta 30% del complemento por kg de peso corporal. Lo más preferente, el intervalo es desde 0,1 mg de anticuerpo hasta 0,3 mg de anticuerpo en una solución al 20% hasta 30% del complemento por kg de peso corporal. La relación exacta del anticuerpo al complemento variará, dependiendo de las circunstancias, sin embargo, ya que la cantidad de complemento activada es directamente proporcional al número de moléculas del anticuerpo enlazadas, es posible administrar una concentración relativamente alta de anticuerpo en exceso de concentraciones relativas del complemento. Además, la concentración particular de anticuerpo administrada variará con la disfunción particular y su severidad, así como con factores tales como la edad, sexo y la historia médica del paciente. Los expertos en la técnica clínica conocerán tales factores y cómo, en consecuencia, compensar los intervalos de la dosificación de la composición.

La mayoría de las lesiones de la médula espinal es el resultado de lesiones a la columna vertebral que rodea la médula espinal. Estas lesiones incluyen fracturas, dislocaciones o ambas. Muchas de la lesiones a la médula espinal son debidas a fenómenos secundarios que ocurren dentro de horas que siguen a la lesión. A estas alturas, la lesión resultante puede ser reversible; en consecuencia, es un factor indiscutible para la función recuperable del CNS la cantidad de tiempo que ocurra entre la lesión y la aplicación de la terapia. Lo más preferentemente, cuando la disfunción del sistema nervioso sea un resultado de lesión, es que la administración de la composición al sujeto sea lo más cercana en tiempo a la lesión como sea posible.

Una composición según el método de la invención puede administrarse a un sujeto vía parental por inyección o por infusión gradual en el transcurso del tiempo. Por ejemplo, la composición puede administrarse vía catéter o puede inyectarse directamente en la médula espinal.

Las preparaciones para la administración parenteral se contienen en un portador farmacéuticamente aceptable que sea compatible tanto con los componentes de la composición, como con el paciente. Tales portadores incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones, estériles, acuosas o no acuosas. Los ejemplos de solventes no acuosos incluyen propilenglicol, polietilenglicol, aceites metabolizables como aceite de oliva o escualano, y ésteres orgánicos inyectables como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones de alcohol / agua, y emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y búferes. Los vehículos para administración parenteral incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringe, dextrosa y cloruro de sodio, aceites lactados de Ringe o aceites fijos. Los preservantes y otros aditivos pueden también estar presentes como, por ejemplo, microbicidas, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes, y análogos. Un portador preferente es el fluido cerebroespinal artificial.

Equipo

Los materiales para uso en la realización de la invención están idealmente preparados para su preparación en un equipo. Tal equipo puede comprender medios portadores compartimentados para recibir en un espacio cerrado uno o más medios y recipientes, como viales, tubos y sus análogos, cada uno de los medios recipientes comprendiendo cada uno de los elementos por separado para ser usados según el método. Por ejemplo, uno de los medios recipientes puede comprender un anticuerpo específico GaIC. Alternativamente, el anticuerpo y el complemento pueden estar presentes en el mismo recipiente. Los constituyentes pueden estar presentes en forma líquida o liofilizada, como se desee. Las agujas y/o otros equipos que facilitan el suministro del complemento y anticuerpo al sitio de lesión pueden incluir:

a) Tubería silástica, de polietileno, Tygon (como la de Norton Performance Plastics).

b) Bombas subcutáneas, (como el sistema de bombas Medtronic, conocido para la administración intratecal (intrarraquídea) de baclofeno).

c) Aguja espinal para la administración intraespinal (intrarraquídea) directa, o para la administración intratecal durante un corto plazo.

Un ejemplo de un método que usa tal equipo puede describirse como: una aguja Tuohy 14º se inserta en el espacio lumbar subaracnoideo. Un catéter 5-F es puesto coaxialmente con la punta en L10 y es penetrado hacia el costado (o hacia una situación apropiada). Este tipo de instrucción se entendería por un experto en la técnica. La tubería se pone vía intratecal y se conecta a la bomba. La bomba, conteniendo un volumen finito de los reactivos, se pone bajo la piel, aquella se puede rellenaren la oficina del médico, vía una aguja insertada en un sello de la bomba. O como una alternativa se puede usar dicha bomba en variante de infusión.

Ventajas respecto a los métodos actuales

Las composiciones y los usos de la presente invención tienen varios ventajas respecto a los métodos actualmente disponible para la regeneración del crecimiento de las neuronas del CNS.

Las terapias de Intervencionistas, incluso los antagonistas opiáceos, la hormona para la liberación de tirotropina, enfriamiento local de la médula, infusión de dextrana, bloqueo adrenérgico, corticoesteroides y oxígeno hiperbárico, se han dirigido a la reducción de la inflamación secundaria después de una lesión traumática de la médula espinal para prevenir la extensión del daño a las neuronas ilesas. Al contrario de la presente invención, sin embargo, estas terapias no promueven la regeneración de las neuronas dañadas.

Los trasplantes de nervios periféricos y el injerto de células donantes en el CNS son útiles en tanto que los axones pueden crecer en ellos; sin embargo, los axones no pueden crecer fuera de ellos en el CNS circundante debido a la mielina inhibitoria presente. Por el contrario, la presente invención fractura la mielina inhibitoria para permitir el recrecimiento de neuronas en el CNS.

La presente invención se describe con adicional detalle en los siguientes ejemplos no limitantes. Será entendido que los ejemplos descritos a continuación no significan limitar el alcance de la presente invención. Se espera que numerosas variantes serán obvias a la persona expertas en la técnica a la que pertenece la presente invención. Las reivindicaciones añadidas, propiamente traducidas, forman la única limitación en el alcance de la presente invención.

Ejemplo I Regeneración de axones tronco-cerebroespinales

El siguiente ejemplo ilustra que la supresión transitoria del desarrollo de la mielinación o la fractura de mielina madura por infusión intraespinal local de proteínas del complemento de suero, junto con un anticuerpo fijador del complemento, específico a la mielina, facilita la regeneración de los axones tronco-cerebroespinales después de la transección espinal en un sujeto mamífero.

Materiales y métodos Transección espinal quirúrgica y fractura inmunológica transitoria de la mielina

Se anestesiaron con "Ketamine" / "Xylazine" (60 mg/kg / 7,5 mg/kg. respectivamente) ratas hembras adultas (Sprague-Dawley), de diez a doce semanas de edad y de aproximadamente 200 g de peso. Después de una laminectomía dorsolateral limitada a T10, se realizó una lesión de hemisección lateral izquierda de la médula espinal con micro tijeras. La magnitud de la lesión se confirmó luego pasando tres veces un escalpelo afilado a través del sitio de la lesión (Fig. 1a). Inmediatamente después de la lesión, se implantó una cánula intraespinal en T11 (n = 22 en total) y se conectó a una bomba osmótica Alzet (14d) para a continuación suministrar continuamente una infusión intraespinal (@ 0,5 \muI/hr) de complemento de suero (GIBCO BRL, #19195-015,33% v/v) junto con un anticuerpo IgG fijador del complemento al galactocerebrósido (sea nuestro propio anticuerpo policlonal o de Chemicon Intl. S.A., # AB 142, 25% v/v). Se sostuvieron en su lugar las cánulas por medio de acrílico dental aplicado al hueso vertebral. Luego, se suturaron las capas de músculos sobre el acrílico dental, y se cerraron el tejido superficial y la piel. La magnitud de la lesión de hemisección siempre fue confirmada histológicamente al final del tratamiento en la 5ª semana del período de tratamiento y recuperación.

Todos los animales de control recibieron una lesión de hemisección idéntica y luego fueron infundidos intraespinalmente por medio de una bomba osmótica, durante el mismo lapso de tiempo, sea sólo con cualquier vehículo (búfer de fosfato salino 0,1 M, PBS, n = 5), sólo con el anticuerpo (25% v/v, n = 2), o exclusivamente con el complemento de suero (33% v/v, n = 6). Todos los protocolos de los procedimientos quirúrgicos y posteriores cuidados de los animales estuvieron de acuerdo con las pautas del "Comité para el Cuidado de Animales" del Canadá y de la Universidad de la "Columbia Británica".

Microscopía electrónica

El tejido para el análisis ultraestructural se obtuvo de ratas hembras adultas Sprague-Dawley de 10-12 semanas de edad sacrificadas 7 días después de la infusión del complemento de suero junto con un anticuerpo IgG fijador del complemento a GaIC (véase lo anterior para más detalles) vía una bomba osmótica. Se anestesiaron los animales letalmente con "Ketamine" / "Xylazine" (120 mg/kg / 15 mg/kg, respectivamente), luego se realizó la perfusión intracardial con 200 ml de 0,1 M PBS (pH 7,4), seguido por 100 ml de glutaraldehído al 4% en 0,1 M PBS, (pH 7,3) y a continuación se sometió a fijación posterior durante una noche en el mismo fijador. El sitio de infusión y el cordón circundante se cortaron en bloques transversales de 1 mm y fueron procesados para conservar la secuencia rostral caudal. Se lavaron los bloques en búfer 0,1 M de cacodilato de sodio (24 horas), se sometió a fijación posterior en OsO4 al 2%, deshidratado a través con alcoholes ascendentes, y fueron embebidos en resina de Spurr según los protocolos normales. Los bloques de tejidos de los animales experimentales y los no tratados del control se procesaron en paralelo. Fueron cortadas secciones delgadas (1 \mum) de cada bloque, entintado con Azul de Toluidina alcalino, y se examinaron bajo un microscopio de luz visible. Para el examen en el microscopio electrónico, los bloques se recortaron y luego las secciones fueron cortadas a 80-100 nm, montadas en rejilla de cobre, entintadas con acetato de uranilo y citrato de plomo, y se visualizaron en un microscopio electrónico Ziess EM 10C (a 80 kV).

Marcado retrógrado de las neuronas

Si se inyecta trazador retrógrado (una sola marca) en el cordón lumbar rostral (en posición caudal a 1 centímetro en el sitio de la lesión), se debe incorporar y debe transportar hacia atrás a los cuerpos celulares de origen por ambos axones, intactos, así como neuronas regeneradas de proyección. Por consiguiente, es esencial que el trazador retrógrado marque fiable y extensivamente la mayoría, si no todas, las neuronas descendientes de las proyecciones espinales. Un parámetro igualmente importante es que el trazador debe inyectarse en un control llevado y de manera reproducible en posición caudal lo suficientemente distante de la lesión espinal para prevenir cualquier difusión directa del trazador a nivel de la lesión de hemisección. El marcador retrógrado que mejor satisface todas estas condiciones es Fluorogold (Sahibzada, et al., (1987) Brain Res. 415.242-256). Las dextran-aminas fluorescentes, como RDA, exigen una lesión creciente de axones para facilitar la captación por los axones (Heimer and Zaborszky Neuroanatomical Tract-tracing Methods 2: Recent Progress (New York: Plenum, 1989)), y por consiguiente son satisfactoriamente buenas para su uso en estudios de marcado doble por trazado retrógrado.

Estudios de marcado simple

Veintiocho días después de la lesión de hemisección y, por consiguiente, 14 días después de la realización de la infusión intraespinal de reactivos inmunológicos, cada rata adulta se anestesió con "Ketamine" / "Xylazine" (60 mg/kg y 7,5 mg/kg, respectivamente). Se inyectó Fluorogold (FG, 100-150 nl de volumen total, 5% p/v en dH_{2}O estéril, Fluorochrome Inc., Englewood, CO, EE.UU.) (50-75 nl) bilateralmente en el medio de tejido espinal al nivel de L1, aproximadamente en posición caudal 1 centímetro al sitio de la lesión.

También fue evaluado el efecto específico del protocolo de demielinación sobre la magnitud de la difusión de FG. Las ratas (n = 8) se trataron experimentalmente como se ha descrito anteriormente; sin embargo, los animales se mataron a las 12, 24, 72 y 120 horas después de la inyección de FG en el cordón a nivel de L1. Ocho otras ratas sirvieron como controles, en las que la bomba sólo contuvo el vehículo, y se procesaron en paralelo con los animales experimentalmente tratados. Se analizó la magnitud de la difusión de FG de las secciones obtenidas en un criostato (25 \mum de espesor) de cada sitio de inyección (Fig. 1 B). No había ninguna diferencia significativa en la magnitud de la difusión visible de FG, como fue descubierto a nivel del microscopio de luz visible, entre los animales experimentalmente tratados y el control tratado. En todos los casos, el intervalo de difusión de FG fue 4-6 mm (1-1,5 segmentos espinales) del sitio de inyección o por lo menos 1,5 segmento espinal caudal respecto al sitio de la lesión.

Estudios de marcado doble

En el momento de la lesión, el sitio de hemisección se agitó con espuma de gel empapada con 12% (p/v en dH_{2}O estéril) dextran-amina conjugada con Rodamina (RDA, 10,000 PM FluoroRuby, Molecular Probes) durante 30 minutos. Luego se retiró la espuma de gel, y fueron completados los procedimientos quirúrgicos restantes (como se ha esbozado anteriormente). Después de 28 días de supervivencia, todos los animales se anestesiaron con "Ketamine" / "Xylazine" (60 mg/kg y 7,5 mg/kg, respectivamente). Se inyectó FG (100-150 nl volumen total, 5% p/v en dH_{2}O estéril) (50-75 nl) bilateralmente en el parénquima espinal al nivel de L 1 del cordón (n = 6).

Análisis de la regeneración de axones

Siete días con posterioridad a la inyección del trazador FG en el cordón lumbar, los animales se anestesiaron letalmente con "Ketamine" / "Xylazine" (120 mg/kg y 15 mg/kg, respectivamente) y luego se realizó la perfusión intracardial con 200 ml de PBS 0,1M (pH 7,4) seguido por 100 ml de para-formaldehído al 4% en PBS 0,1 M, (pH 7,3). Luego se retiró el cordón cerebral y espinal y se fijó posteriormente de noche con el mismo fijador. A continuación, se aclaró cada cordón cerebral y espinal del fijador y se conservó en conservación criogénica poniendo el tejido en una serie de soluciones de sacarosa (15%, seguido por 21%). Se cortaron en un criostato las secciones de corona o parasagital, cortadas a un espesor de 25 \mum. Se examinaron las secciones de los tejidos tronco-cerebroespinales y de la médula espinal en un microscopio Zeiss Axioskop con una bombilla de mercurio de 100 W (longitudes de onda de excitación / emisión: FG, 365 / 420 nm; RDA, 546 / 590 nm).

El núcleo tronco-cerebroespinal usado para evaluar experimentalmente las capacidades de regeneración de los axones de los animales tratados fue el Núcleo Rojo (RN [por las siglas de su expresión inglesa. Red Nucleous], su origen es contralateral a la hemisección). Los axones de las proyecciones espinales de cada RN cruzan al lado opuesto del cerebro medio y descienden a lo largo de la médula espinal dentro del funículo contralateral dorsolateral. Esta vía de proyección espinal contralateral se conoce que es un tracto completamente lateralizado, con posible excepción de 2-5% de los axones, que puedan proyectarse al cordón vía una ruta ipsilateral (Brown (1974) J. Comp. Neurol. 154: 169-188; Huisman et al., (1981) Brain Res. 209:217-286; Shieh et al., (1983) J. Comp. Neurol. 214:79-86; Waldron and Gwyn (1969) J. Comp. Neurol. 137:143-154).

Usando un protocolo a un solo ciego, el número de neuronas marcadas retrógradas dentro del Núcleo Rojo (RN) se contó en cada otra sección del tejido a lo largo del núcleo, para evitar contar la misma neurona dos veces. Sólo aquellas células que exhibían una morfología de núcleo y neuronas (es decir, multipolar en apariencia), y que se marcaron específicamente con FG (es decir, que no eran visibles usando otros filtros fluorescentes, véase lo anterior) extendiéndose en procesos proximales, se consideraron neuronas de proyecciones espinales marcadas positivamente. El porcentaje de neuronas regeneradas se determinó luego en comparación con el número de neuronas marcadas dentro del núcleo contralateral de control (ileso), dentro del mismo animal.

Resultados Magnitud de la demielinación de la médula espinal y fractura de la mielina después del tratamiento inmunológico

La infusión intraespinal directa de complemento heterólogo de suero al 33% (conejillos de indias) junto con anticuerpos policlonales GaIC (25%) en PBS durante 7 días (@ 0,5 \mul/hr) producía la demielinación adicional a 2 mm hacia fuera de la cánula de infusión (distancia rostrocaudal total de 4 mm o aproximadamente 1 segmento espinal (Fig. 2A). Esta zona de demielinación se limitó por cada lado por 8 mm adicionales o 2 segmentos de médula espinal, caracterizados por mielina fracturada (es decir, mielina que está extensivamente deslaminada, teniendo una apariencia desenredada, Fig., 2C). Como se ha demostrado en estudios anteriores (Keirstead et al., (1995) J. Neurosci. 15:6963-6974; Keirstead et al., (1992) Proc. NatL Acad. Sci. (USA) 89: 11664-11668; Keirstead et al., (1997) Brain. Res. Bull. 44:727-734), las infusiones de control de sólo el complemento heterólogo de suero, de sólo el anticuerpo específico a la mielina, o sólo PBS producían lesiones no específicas sólo limitadas centradas inmediatamente alrededor del sitio de la cánula. No había ninguna zona circundante de demielinación o fractura de la mielina (Fig. 2D).

La demielinación inmunológica y fractura de mielina dentro de la médula espinal de la rata adulta tratada experimentalmente es un proceso activo que se extiende a lo largo del perfil transversal entero del cordón. La fractura inmunológica de la mielina comienza en 1 día y está asociada a una invasión de macrófagos o microglia del residente y células polimorfonucleadas (por ejemplo, leucocitos tales como neutrófilos, eosinófilos y basófilos). Muchos macrófagos / microglia contienen fragmentos de mielina y completan su actividad fagocítica dentro de los 7 días (Fig. 2B). Este modelo de demielinación y fractura de la mielina puede mantenerse mientras el complemento de suero y el anticuerpo específico a la mielina sean infundidos. La evidencia reciente sugiere que después de que se termina la infusión inmunológica, empieza la remielinación dentro de 2 semanas (Keirstead and Blakemore (1997) Glia (en prensa); Dyer, Bourque and Steeves (observaciones sin publicar)); la nueva mielina se origina de progenitores oligodendrocitos que se diferencian, aunque células invasoras de Schwann y los "oligodendrocitos maduros supervivientes" también pueden contribuir a la remielinación.

Elección del trazador retrógrado y su distancia de difusión desde el sitio inyección

En este estudio, la mayor evidencia anatómica de la regeneración de los axones, dentro de la médula espinal hemiseccionada y con la mielina suprimida vía inmunológica en ratas adultas, depende de una comparación entre el número de neuronas de marcado retrógrado dentro de un par homólogo de núcleos tronco-cerebroespinales. Para que estas comparaciones sean válidas, los núcleos espinales tronco-cerebroespinales del candidato deben tener neuronas de proyección muy unilaterales que en todos los niveles se confinen a un lado de la médula espinal. Una hemisección torácica izquierda (Fig. 1A) cortó las neuronas magnocelulares que se proyectan contralateral desde el núcleo rojo derecho (RN), pero dejó las neuronas de proyección izquierda del RN izquierdo intactas (cuando éstas se proyectan a través del funículo dorso lateral derecho intacto del cordón torácico).

En todos los casos, el marcador Fluorogold (100-150 nl) se inyectó bilateralmente dentro del cordón lumbar rostral (1 centímetro o 3 segmentos espinales en posición caudal al sitio de la lesión de hemisección). Nosotros evaluamos el transcurso del tiempo y grado de difusión en dirección rostrocaudal de Fluorogold dentro de la médula espinal lumbar y torácica de los animales normalmente mielinados (control) y las ratas experimentalmente tratadas (es decir, bajo condiciones de demielinación y fractura de mielina). Secciones de 25 \mum seleccionadas al azar de las médulas espinales experimentales y de control del tratamiento (extendiéndose de L2 a T8) se examinaron en un microscopio de fluorescencia usando los valores de intensidad más altos que brinda la lámpara de mercurio de 100 W. El tejido espinal se examinó para determinar la magnitud de la difusión del Fluorogold a los intervalos de supervivencia variables después de la inyección, incluyendo: 12 h. (n = 4), 24 h. (n = 4), 3 d (n = 4) y 5 d (n = 4). La distancia de difusión rostral máxima observada fue 4-6 mm (o 1 - 1,5 segmentos espinales) y ocurrió dentro de un espacio de tiempo de 24h. El grado de difusión del Fluorogold dentro del cordón lumbar no cambió durante los siguientes valores examinados de tiempo (Fig. 1 B).

En resumen, ningún animal (experimental o de control) mostró evidencia alguna de marcado por el Fluorogold dentro de la médula espinal al nivel de la lesión de hemisección (T10); así, por este criterio, ningún animal tuvo que ser excluido de este estudio. La evidencia disponible indica que el marcado retrógrado se restringió al marcado de las neuronas tronco-cerebroespinales, intactas y regeneradas, que tienen neuronas de proyección de axones en posición caudal al sitio T10 de la lesión.

Evidencia de regeneración de axones tronco-cerebroespinales por el marcado retrógrado de las neuronas

Se sometieron a una hemisección, lateral izquierdo-lateral de la médula espinal de T10, 28 animales (12 experimentales (9 por marcado retrógrado simple, 3 por marcado doble) y 16 control (13 por simple marcado retrógrado, 3 por doble marcado)). Inmediatamente después de la hemisección, se insertó una cánula de infusión (conectada a una bomba osmótica 14d) directamente en la médula espinal 4-5 mm (1 segmento espinal) en posición caudal al sitio de la lesión. La bomba osmótica contuvo una de las 3 soluciones diferentes de control o tratamiento experimental (es decir, el vehículo de PBS sólo, complemento de suero, un anticuerpo antigalactocerebrósido sólo, o exclusivamente complemento de suero con los anticuerpos de anti GaIC, respectivamente). Luego, se les permitió a los animales recuperarse durante 28 días antes que se les inyectase Fluorogold en rostral lumbar a 1 centímetro (es decir, 3 segmentos espinales) en posición caudal al sitio de la lesión. Después de una supervivencia de 7 días adicionales, se sacrificó cada animal, y se retiraron el cerebro y médula espinal para el examen y análisis (véase, materiales y métodos para el criterio usado en la determinación de una neurona marcada).

Se evaluó la magnitud de la lesión de hemisección en cada animal. En todos, menos uno experimental y un animal tratado con el control, fue hemiseccionada la médula espinal torácica izquierda (Fig. 1). Lo más importante, se cortó la región del tracto rubroespinal (funículo dorsolateral). La sustancia blanca del tracto lateral derecho siempre permanecía intacta e ilesa; normalmente, la sustancia gris del lado contralateral también estaba ilesa.

Al comparar "el conteo a ciegas" del número de neuronas marcadas dentro de cada RN (Fig. 3A-B, Tabla 1), los datos indicaron que 31,8% \pm 13,38% (n = 9, intervalo 10-50%) de las neuronas magnocelulares lesionadas del RN se había regenerado una distancia suficiente en el cordón lumbar en dirección caudal como para incorporar y transportar retrógradamente el Fluorogold (Fig. 4). Por el contrario, los animales tratados con el control, que recibieron el vehículo de PBS sólo, el anticuerpo de GaIC sólo o exclusivamente el complemento de suero, no exhibieron una cantidad importante de RN marcado: 1,49% \pm 0,84%, (Fig. 3C-D; Fig. 4, n = 13, intervalo 0-3, Tabla 1). El marcado de algunas neuronas dentro del núcleo lesionado de RN derecho puede representar el pequeño número del RN que no se proyecta al lado opuesto del cerebro medio y desciende dentro del ipsilateral (ileso) del cordón (Shieh et al., (1983) J. Comp. Neurol. 214:79-86). No se observó ningún marcado retrógrado de células dentro de la región parvocelular del RN. Esto se esperó predominantemente ya que esta región del RN sólo se proyecta hasta la región cervical del cordón.

También fue valorado cualitativamente el tracto rubroespinal lesionado por doble marcado retrógrado y con supresión de la mielina (Fig. 3E y F). Se observaron números grandes de neuronas RDA positivas (primer marcado) del RN magnocelular después del marcado directo del sitio de la lesión, durante el momento de lesión por hemisección de la médula espinal torácica. Después de la supresión intraespinal de mielina y la siguiente inyección de Fluorogold, en posición caudal al sitio de la lesión, se observó un pequeño solapo de la población de neuronas FG positivas (es decir, algunas neuronas se marcaron tanto con RDA, como con FG). También estuvieron presentes, en cada tronco cerebro-espinal analizado, células marcadas exclusivamente por el primero o por el segundo trazador. El bajo número de neuronas tronco-cerebroespinales con doble marcado pueden en parte ser debido al fallo de los axones cortados para incorporar RDA antes del sellado del extremo cortado, es decir, se les debe dañar recientemente (Heimer and Zaborszky Neuroanatomical tract-tracing methods 2: Recent Progress (New York: Plenum, 1989)). También la población de neuronas rubroespinales que no cruzan el tronco cerebro-espinal también se contarán como las células FG positivas en el "núcleo lesionado". Debido al número pequeño de animales que se evaluaron, nosotros no intentamos cuantificar estos resultados. No obstante, ellos probablemente representan una estimación por lo bajo de la regeneración de axones facilitada por la demielinación y fractura inmunológica de la mielina, pero definitivamente no una sobre estimación del grado de regeneración del tronco cerebro-espinal después de la supresión de la mielina.

En comparación con la técnica anterior que usaba la transección espinal (Keirstead et al., (1995) J. Neurosci. 15:6963-6974; Keirstead et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:11664-11668), la presente invención se demuestra empleando para este estudio la hemisección para que cada animal pudiera servir como su propio control interior (es decir, la regeneración de axones de las neuronas tronco-cerebroespinales lesionadas podría compararse prontamente con sus homólogas del contralateral ileso). Además, la presente invención se esforzó por minimizar el grado de formación de quiste de cavidad que a menudo ocurre con las lesiones espinales más grandes, así como la cantidad de malestar de los animales durante los períodos de recuperación relativamente largos requeridos para este estudio.

Los exámenes de cualquier diferencia funcional o conductual durante el período de recuperación de 5 semanas después del tratamiento experimental no indicó ninguna diferencia notable entre los patrones locomotores de los animales lesionados y los animales ilesos del control (es decir todos los animales caminaron y todos los animales fueron comparables con respecto a sus funciones reflejo básicas). Estas observaciones fueron ciertas sin tener en cuenta el tratamiento de infundir vía intraespinal después de una lesión de hemisección (por ejemplo, PBS sólo, anticuerpo de GaIC sólo, complemento de suero exclusivamente, o complemento de suero más el anticuerpo de GaIC).

Estos resultados indican que la supresión inmunológica de mielina (demielinación y fractura) facilita la regeneración anatómica de axones tronco-cerebroespinales dentro de la médula espinal lesionada de la rata adulta.

Ejemplo II Efectos de la retirada de una sola proteína del complemento en la demielinación inmunológica Materiales y métodos

Transección espinal quirúrgica y fractura inmunológica transitoria de la mielina: a diez ratas de hembras adultas de 12 semana de edad (Sprague-Dawley), de aproximadamente 200 g de peso, se les anestesió con "Ketamine" / "Xylazine" (60 mg/kg y 7,5 mg/kg, respectivamente). Se realizó una laminectomía dorsolateral limitada a T10 y se conectó a una bomba osmótica Alzet (14 d) para administrar a continuación una infusión intraespinal continua (@ 0,5 \muI/hr) de complemento de suero con C3 retirado (Sigma S8788, 33% v/v) junto con un anticuerpo IgG fijador del complemento al galactocerebrósido (tanto nuestro propio anticuerpo policlonal o Chemicon Intl. S.A.., # AB 142, 25% v/v). Se sostuvieron las cánulas en el lugar por medio de acrílico dental aplicado al hueso vertebral. Luego, se suturaron las capas del músculo encima del acrílico dental, y fueron cerrados el tejido superficial y piel.

Todos los animales del control fueron infundidos vía intraespinal con una bomba osmótica, para el mismo lapso de tiempo, con el complemento de suero humano entero (Sigma S1764, 33% v/v) junto con un anticuerpo fijador del complemento IgG al galactocerebrósido (anticuerpo policlonal propio o Chemicon Intl. S.A.., # AB142, 25% v/v). Todos los protocolos de los procedimientos quirúrgicos y posteriores cuidados de los animales estuvieron de acuerdo con las pautas del "Comité para el Cuidado de Animales" del Canadá y de la Universidad de la "Columbia Británica".

La microscopía electrónica se realizó como fue descrito en el Ejemplo 1.

Resultados

Como se puede ver en la Figura 5, la retirada del componente C3 del complemento da como resultado la ausencia de retirada de mielina. Esto indica que esta proteína tiene un papel fundamental sea (i) en la opsonización, o (ii) en la propagación de la cascada al complejo de ataque de la membrana lítica (MAC), el último complejo de la vía lítica.

Ejemplo III Regeneración de neuronas lesionadas crónicamente Materiales y métodos

11 animales (6 experimentales y 5 del control) se sometieron a una hemisección lateral izquierda de la médula espinal en T10 como sigue: diez ratas de hembras adultas de 12 semana de edad (Sprague-Dawley), de aproximadamente 200 g de peso, fueron anestesiada con "Ketamine" / "Xylazine" (60 mg/kg y 7,5 mg/kg, respectivamente). Después de una laminectomía dorsolateral limitada a T10, se realizó con microtijeras una lesión de la médula espinal hemisección del lado izquierdo. La magnitud de la lesión luego se confirmó pasando tres veces un escalpelo afilado a través del sitio de la lesión.

Un mes (a 5 animales) o 2 meses (a 6 animales) después de la hemisección, se insertó una cánula de infusión (conectada a una bomba osmótica 14d) directamente en la médula espinal 4 - 5 mm (1 segmento espinal) en posición caudal al sitio de la lesión. Se sostuvieron las cánulas en el lugar por medio de acrílico dental aplicado al hueso vertebral. Luego, se suturaron las capas del músculo encima del acrílico dental, y fueron cerrados el tejido superficial y la piel. La bomba osmótica administró una infusión intraespinal continua (0,5 \muI/hr) de complemento de suero de conejillos de indias (33% v/v) junto con un anticuerpo fijador del complemento de IgG al galactocerebrósido (nuestro propio anticuerpo policlonal o de Chemicon Intl. S.A.., # AB142, 0,25 mg/ml).

Todos los animales del control recibieron una lesión de hemisección idéntica y luego fueron infundidos vía intraespinal con una bomba osmótica durante el mismo lapso de tiempo exclusivamente con el complemento de suero de conejillos de indias entero (33% v/v).

Luego, se les permitió a los animales recuperarse durante 28 días antes de que se inyectara Fluorogold en el rostral lumbar a 1 centímetro (es decir 3 segmentos espinales) en posición caudal al sitio de la lesión, como fue descrito en el Ejemplo 1. Después de una supervivencia adicional de 7 días, se sacrificó cada animal, y se retiraron el cerebro y la médula espinal para el examen y análisis tal como fue descrito en el Ejemplo 1.

La magnitud de la lesión de hemisección fue confirmada histológicamente tanto al final del tratamiento en la 5ª semana y como en el período de recuperación. Todos los protocolos de los procedimientos quirúrgicos y posteriores cuidados de los animales estuvieron de acuerdo con las pautas del "Comité para el Cuidado de Animales" del Canadá y de la Universidad de la "Columbia Británica".

Resultados

Se evaluó la magnitud de la lesión de hemisección en cada animal. En todos los animales se cortó la región del tracto vestibuloespinal. La sustancia blanca del tracto del lado derecho siempre permanecía intacta e ilesa, mientras que la sustancia gris del lado contralateral normalmente permanecía ilesa.

Al comparar el "conteo a ciegas" del número de neuronas marcadas dentro de cada LVe (la Fig. 6), se ve que los datos indican que de los animales lesionado crónicamente en el 1 mes, un 31,5% \pm 5% (n = 3) de las neuronas lesionadas en vestibuloespinal lateral tenía regenerada una distancia suficiente en el cordón lumbar en posición caudal para incorporar y transportar en forma retrógrada el Fluorogold. Por el contrario, los animales del control, tratados que recibieron exclusivamente el complemento de suero, no exhibieron una cantidad importante del LVe marcados: 3,6% \pm 2,7%, (n = 2). De los animales para los que se que retardó el tratamiento durante 2 meses antes de comenzar, un 26,8% \pm 13% (n = 3) de las neuronas lesionadas en vestibuloespinal lateral habían regenerado una distancia suficiente en el cordón lumbar en dirección caudal para incorporar y transportar en forma retrógrada el Fluorogold. Por el contrario, los animales del control, tratados que recibieron exclusivamente el complemento de suero, no exhibieron una cantidad importante del LVe marcado: 5,4% \pm 1,8%, (n = 2). Estos resultados indican que las composiciones de la presente invención son útiles para promover el recrecimiento, la reparación y regeneración de las neuronas lesionadas en forma crónica en el CNS de los mamíferos.

Ejemplo IV Transección espinal quirúrgica y fractura inmunológica transitoria de la mielina

Diez ratas de hembras adultas de 12 semana de edad (Sprague-Dawley), de aproximadamente 200 g de peso, fueron anestesiada con "Ketamine" / "Xylazine" (60 mg/kg, 7,5 mg/kg respectivamente). Después de una laminectomía limitada a T10, se realizó con microtijeras una lesión de la médula espinal, una hemisección del lado izquierdo, La magnitud de la lesión luego se confirmó pasando un escalpelo afilado a través del sitio de la lesión (Fig. 7). Inmediatamente después de la lesión, se implantó intraespinal una cánula en T11 (n = 22 total) y conectó a una bomba osmótica Alzet (14 días) para administrar intraespinal a continuación una infusión continua (0,5 \mul/hr) de complemento de suero (GIBCOBRL, # 19195-015,33% v/v) junto a un anticuerpo fijador del complemento IgG al galactocerebrósido (nuestro propio anticuerpo policlonal o de la firma Chemicon Intl. Ltd., #AB 142,25% v/v). Se sostuvieron las cánulas en el lugar por medio de acrílico dental aplicado al hueso vertebral. Se suturaron, luego, las capas del músculo encima del acrílico dental y se cerraron el tejido superficial y piel. La magnitud de la lesión de hemisección siempre fue confirmada histológicamente al final del tratamiento de la 5ª semana y del período de recuperación.

Todos los animales del control recibieron una lesión de hemisección idéntica y luego fueron infundidos intraespinal vía una bomba osmótica, para el mismo lapso de tiempo, sea con el vehículo sólo (0,1 M de búfer salino de fosfato, PBS, n = 5), anticuerpo sólo (25% v/v, n = 2), o exclusivamente complemento de suero (33% v/v, n = 6). Todos los protocolos de los procedimientos quirúrgicos y posteriores cuidados de los animales estuvieron de acuerdo con las pautas del "Comité para el Cuidado de Animales" del Canadá y de la Universidad de la "Columbia Británica".

Microscopía electrónica

El tejido para el análisis ultrastructural se obtuvo de ratas hembras adultas Sprague-Dawley de 10-12 semana de edad, sacrificada a los 7 días después de la infusión del complemento de suero junto con un anticuerpo fijador del complemento IgG a GaIC (véase lo anterior para todos los detalles) vía una bomba osmótica. Se anestesiaron los animales letalmente con "Ketamine" / "Xylazine" (120 mg/kg, 15 mg/kg, respectivamente), luego fueron perfusionadas intracardial con 200 ml de PBS 0,1 M (pH 7,4) seguido por 100 ml de glutaraldehído al 4% en PB 0,1 M, (pH 7,3) y a continuación se fijó posteriormente de noche en el mismo fijador. El sitio de infusión y el cordón circundante fueron cortados en bloques transversales de 1 mm y se procesaron para conservar la secuencia rostralcaudal. Se lavaron los bloques en búfer de cacodilato de sodio 0,1 M (24 horas), se fijaron posteriormente con OsO_{4} al 2%, se deshidrataron con alcoholes en flujo ascendente y se embebieron en resina de Spurrs, según los protocolos normales. Los bloques experimentales de tejidos y de los animales no tratados del control se procesaron en paralelo. Se cortaron secciones delgadas (1 \mum) de cada bloque, se colorearon con azul de toluidina alcalino y se examinaron en un microscopio de luz visible. Para el examen por microscopía electrónica se recortaron los bloques y se cortaron las secciones a un grosor de 80-100 nm, se montaron en barras de cobre, se colorearon con acetato de uranilo y citrato de plomo y se observaron en un microscopio electrónico Ziess EM 10C (a 80kV).

Marcado retrógrado de las neuronas Estudios de marcado simple

Veintiocho días después de la lesión de hemisección y por consiguiente 14 días después de la realización de la infusión intraespinal de los reactivos inmunológicos, cada rata adulta se anestesió con "Ketamine" / "Xylazine" (60 mg/kg, 7,5 mg / kg respectivamente). Se inyectó bilateralmente (volumen 50-75 nl) de Fluorogold (FG, volumen total 100-150 nl, 5% p/v en dH_{2}O estéril; Fluorochrome Inc., Englewood, CO, EE.UU.) en el medio de tejido espinal al nivel L 1, aproximadamente 1 centímetro en posición caudal al sitio de la lesión (Fig. 7).

Estudios de marcado doble

En el momento de la lesión, se recubrió el sitio de hemisección con espuma de gel empapada en dextran-amina al 12% (p/v en dH_{2}O estéril) conjugada con Rodamina (RDA, 10,000 PM FluoroRuby, Molecular Probes) durante 30 minutos. La espuma de gel se retiró luego y fueron completados los procedimientos quirúrgicos restantes (como se ha indicado anteriormente). Después de 28 días de supervivencia, todos los animales se anestesiaron con "Ketamine" / "Xylazine" (60 mg/kg, 7,5 mg/kg respectivamente) y FG (volumen total de 100-150 nl, 5% p/v en dH_{2}O estéril) se inyectaron (50-75 nl) bilateralmente en el parénquima espinal al nivel L1 del cordón (n = 6).

Análisis de la regeneración

A los siete días siguientes a la inyección del trazador FG en el cordón lumbar, los animales se anestesiaron letalmente con "Ketamine" / "Xylazine" (120 mg/kg, 15 mg/kg, respectivamente) y luego se perfusionaron intracardial con 200 ml de PBS 0,1 M (pH 7,4) seguido por 100 ml de para-formaldehído al 4% en PBS 0,1 M, (pH 7,3). Luego se retiraron el cerebro y la médula espinal y posteriormente se fijaron durante la noche en el mismo fijador. A continuación, cada cerebro y médula espinal se aclararon del fijador y se conservaron en conservación criogénica poniendo el tejido en una serie de soluciones de sacarosa (15% seguidos por 21%). En un criostato se cortaron secciones coronales o parasagitales con un espesor de 25 \mum. Se examinaron las secciones de tejido tronco-cerebroespinal y de la médula espinal en un microscopio Zeiss Axioskop con una bombilla de mercurio de 100 W (las longitudes de onda de excitación / emisión fueron: FG, 365 / 420 nm; RDA, 546 / 590 nm; fluoresceína, 490 / 515 nm).

Los dos núcleos tronco-cerebroespinales evaluados para constatar las capacidades regeneradoras de los axones en los animales experimentalmente tratados fueron el Núcleo Rojo (RN) (su origen es contralateral a la hemisección) y el Núcleo Lateral Vestibular (LVe) (su origen es ipsilateral a la hemisección). Los axones de las proyecciones espinales de cada RN cruzan al lado opuesto del cerebro medio y descienden a lo largo de la médula espinal dentro del funículo contralateral dorsolateral. Esta vía de proyección espinal contralateral se conoce por ser un tracto completamente lateralizado con la posible excepción de 2 - 5% de los axones que se pueden proyectar ipsilateral hacia la ruta cordviana (Waldron and Gwyn 1969; Brown, 1974; Huisman et al., 1981; Shieh et al., 1983). El tracto del LVe se proyecta dorsolateral desde el pontículo del metencéfalo, manteniendo un curso ipsilateral exclusivo a lo largo del tronco cerebro-espinal y ventrolateral de la sustancia blanca de la médula espinal (Zemlan et al.,1979; Shamboul, 1980).

Usando un protocolo ciego simple, el número de neuronas marcadas retrógradas dentro del Núcleo Rojo (RN) (contralateral a la hemisección) y el Núcleo Lateral Vestibular (LVe) (ipsilateral a la hemisección) se contaron en cada otra sección de tejidos (a lo largo de estos núcleos tronco-cerebroespinales) para evitar contar la misma neurona dos veces. Sólo esas células que exhiben un núcleo, una morfología de neuronas (es decir multipolar en apariencia) y marcadas específicamente con FG (p. ej., que no son visibles usando otros filtros fluorescentes; véase lo anterior) que se extendía en los procesos proximales, se consideraron como neuronas positivamente marcadas que se proyectaban espinal. Luego se determinó el porcentaje de neuronas que se regeneran para cada proyección tronco-cerebroespinal, en comparación con el número de neuronas marcadas dentro del núcleo contralateral (ileso) del control, dentro del mismo animal.

Magnitud de la demielinación y fractura de mielina de la médula espinal después del tratamiento inmunológico

La infusión intraespinal directa durante 7 días (@ 0,5g \mul/hr) de complemento heterólogo de suero al 33% (conejillos de indias) junto con los anticuerpos policlonales a GaIC (25%) en PBS producía la demielinación adicional a 2 mm alejado de la cánula de infusión (distancia rostrocaudal total de 4 mm o aproximadamente 1 segmento espinal (Fig. 2A). Esta zona de demielinación se limitó adicionalmente por cada lado por 8 mm o 2 segmentos adicionales de médula espinal caracterizados por mielina fracturada (es decir, mielina que está extensivamente delaminada, que tenía una apariencia sin revelar. Fig. 2B). Como fue mostrado en estudios anteriores (Keirstead et al., 1992, 1995), las infusiones del control de sólo complemento heterólogo de suero, sólo anticuerpo específico a la mielina, o sólo PBS producían una lesión no específica sólo limitada en forma centrada inmediatamente alrededor del sitio de la cánula. No había ninguna zona circundante de demielinación o fractura de mielina (Fig. 2C).

Demielinación y fractura inmunológica de la mielina dentro de la médula espinal de las ratas adultas, tratadas experimentalmente fue un proceso activo que se extendía a lo largo del perfil transversal entero del cordón. La fractura inmunológica de la mielina comenzó dentro de 1 día y fue asociada con una invasión de macrófagos o microglia residente y células polimorfonucleadas (por ejemplo, leucocitos como neutrófilos, eosinófilos y basófilos). Muchos macrófagos / microglia contuvieron fragmentos de mielina y completaron su actividad fagocítica dentro de los 7 días (Fig. 2D). Este modelo de demielinación y fractura de la mielina podría mantenerse mientras que se infundiera el complemento de suero y el anticuerpo específico a la mielina. La evidencia reciente sugiere que después de que la infusión inmunológica se termina, la remielinación empieza a las 2 semanas (Keirstead y Blakemore, 1997; Dye. Bourque y Steeves, observaciones sin publicar) y la nuevo mielina se origina a partir de progenitores oligodendrocitos sin diferenciar a, aunque también pueden contribuir a la remielinación células invasoras de Schwann y oligodendrocitos maduros "sobrevivientes".

Elección de trazador retrógrado y su distancia de difusión del sitio inyección

En este estudio, la mayor evidencia anatómica sobre la regeneración de los axones dentro la médula espinal, hemiseccionada y suprimida la mielina vía inmunológica de ratas adultas depende de una comparación entre el número de neuronas marcadas retrógrado dentro de un par homólogo de núcleos tronco-cerebroespinales. Para que estas comparaciones sean válidas, los núcleos de los ejes cerebroespinales del candidato deben tener neuronas de proyección muy unilaterales que se confinen a un lado de la médula espinal a todos los niveles. Como se ha resumido en la Fig. 7A, por una hemisección torácica izquierda se cortaron las neuronas magnocelulares de proyección contralateral del núcleo rojo derecho (RN), pero se dejaba ilesas las proyecciones de las neuronas del RN izquierdo (ya que éstas se proyectan a través del funículo dorsolateral derecho intacto del cordón torácico). Igualmente, por una hemisección torácica izquierda se cortó las neuronas que se proyectan ipsilateral del núcleo vestibulospinal lateral izquierdo (LVe), pero se dejó los axones del núcleo LVe derecho ileso (ya que éstos también se proyectan a través del lado derecho intacto del cordón torácico vía la sustancia blanca ventrolateral).

Si se inyecta trazador retrógrado (un marcado simple) en el cordón lumbar rostral (1 centímetro en posición caudal al sitio de la lesión), debe incorporarse y debe transportarse atrás hacia los cuerpos celulares de origen por ambos axones intactos, así como las neuronas de proyección regeneradas. Por consiguiente, es esencial que el trazador retrógrado marque fiablemente y extensivamente la mayoría, si no todas, las neuronas espinales descendientes de proyección. Un parámetro igualmente importante es que el trazador debe inyectarse en una manera controlada y reproducible a una distancia suficiente en posición caudal a la lesión espinal para prevenir cualquier difusión directa del trazador al nivel de la lesión de hemisección. El marcador retrógrado que mejor satisfizo todas estas condiciones fue el Fluorogold (Sahibzada, et. al., 1987). Las dextranaminas fluorescentes, como RDA, exigen a una lesión reciente de axones para facilitar la captación por los axones (Heimer y Zaborszky, 1989), y resultó, por consiguiente, mejor adecuado para su uso en los estudios del trazado retrógrado por marcado doble (véase más adelante su descripción).

En todos los casos, se inyectó el marcador Fluorogold (100-150 nl) bilateralmente dentro del cordón lumbar rostral (1 centímetro o 2-3 segmentos espinales en posición caudal al sitio de la lesión de hemisección, Fig. 7). Nosotros evaluamos el transcurso del tiempo y grado de difusión en dirección rostrocaudal del Fluorogold dentro de la médula espinal lumbar y torácica de los animales normalmente mielinados (el control) y las ratas experimentalmente tratadas (es decir, en condiciones de demielinación y de fractura de la mielina). Se examinaron secciones de 25 \mum tomadas al azar de médulas espinales (extendiéndose desde L 2 a T 8), tratadas experimentalmente y del control, en un microscopio fluorescente usando la intensidad más alta correspondiente a la lámpara de mercurio de 100 W. El tejido espinal se examinó para determinar la magnitud de la difusión del Fluorgold a diferentes intervalos de supervivencia después de la inyección, incluyendo: 12 h (n = 6), 24 h. (n = 6), 3d (n = 6), 5d (n = 6) y 7d (n = 22). La distancia máxima de difusión rostral observada fue 4 - 6 mm (o 1 - 1,5 segmentos espinales) y ocurrió dentro de un espacio de tiempo de 24 h. El grado de difusión de Fluorogold dentro del cordón lumbar no cambió durante los siguientes tiempos examinados (Fig. 7).

Evidencia de la regeneración de axones tronco-cerebroespinales por marcado retrógrado de las neuronas

En resumen, se sometieron 28 animales; 12 experimentales (9 marcado simple retrógrado, 3 doble marcado) y 16 de control (13 marcado retrógrado simple, 3 doble marcado) a una hemisección lateral izquierda de la médula espinal en T10. Inmediatamente después de la hemisección, se insertó una cánula de infusión (conectada a una bomba osmótica 14 d) directamente en la médula espinal a 4-5 mm (1 segmento espinal) en posición caudal al sitio de la lesión. La bomba osmótica contuvo una de 3 soluciones de diferentes controles o del tratamiento experimental (es decir, sólo del vehículo de PBS, exclusivamente complemento de suero, sólo anticuerpo de anti galactocerebrósido, o complemento de suero con los anticuerpos de anti GaIC, respectivamente). A los animales luego se les permitió recuperarse durante 28 días antes que se inyectase el Fluorogold en el lumbar rostral a 1 centímetro (es decir, por lo menos 2 segmentos espinales) caudal al sitio de la lesión. Después de una supervivencia adicional de 7 días, se sacrificó cada animal y se retiraron el cerebro y la médula espinal para su examen y análisis (véase anteriormente para el criterio que determinaba si una neurona fue marcada).

Se evaluó para cada animal la magnitud de la lesión de hemisección. En todos, excepto un animal tratado experimental y uno de control, la médula espinal torácica izquierda estaba hemiseccionada (Fig. 7). Lo más importante, se habían cortado las regiones del tracto rubroespinal (funículo dorsolateral) y del tracto vestibulospinal lateral (funículo ventrolateral). La sustancia blanca del lado derecho de los tractos siempre permanecía intacta e ilesa y normalmente la sustancia gris del lado ileso también estaba ilesa.

Como se ha discutido anteriormente, los 2 pares de núcleos de los ejes cerebroespinales examinados para la evidencia de marcado retrógrado (después de la hemisección de la médula espinal y la supresión inmunológica de la mielina) fueron el RN y el LVe. Estos núcleos tronco-cerebroespinales fueron escogidos por sus modelos de proyecciones unilaterales dentro del cordón torácico y lumbar, permitiendo hacer comparaciones entre el marcado retrógrado dentro de un núcleo lesionado y el homólogo contralateral ileso. Comparando los conteos "a ciegas" del número de neuronas marcadas dentro de cada RN (Fig. 3A-B), los datos indicaron que 31,8% \pm 4,7% (n = 8, 10 - 50%) de las neuronas magnocelulares lesionadas del RN se habían regenerado a una distancia suficiente en el cordón lumbar en dirección caudal para incorporar y transportar retrógrado el Fluorogold (Fig. 9). Por el contrario, los animales tratados con el control, sea recibiendo sólo el vehículo de PBS, sólo el anticuerpo GaIC, o exclusivamente el complemento de suero no exhibieron una cantidad importante de RN marcados; 1,49 % \pm 0,23%, (Fig. 3C-D; Fig. 9, n = 13, intervalo 0 - 3). El marcado de algunas neuronas dentro del núcleo RN derecho lesionado puede representar el número pequeño de RN que no proyectan al lado opuesto del cerebro medio y descienden dentro del cordón ipsilateral (ileso) (Shieh et. al., 1983). No se observó ningún marcado retrógrado de células dentro de la región parvocelular del RN.

También fue observado el marcado retrógrado de neuronas regeneradas del LVe, pero sólo después de la demielinación experimental y fractura de mielina de la médula espinal (Fig. 8). En 8 animales experimentales, el porcentaje promedio de neuronas regeneradas marcadas del LVe, en comparación con el núcleo de control contralateral ileso, fue 41,8% \pm 3,1% (n = 8, intervalo 33 - 49%). En los animales de control tratados (véase lo anterior) el por ciento de LVe marcados fue 2,24% \pm 0,55% (Fig. 5, n = 13, intervalo 0 - 6).

El marcado retrógrado doble del tracto rubroespinal lesionado y con supresión de la mielina también fue cualitativamente valorado (Fig. 9E y 9F). Se observaron valores grandes de RDA positivos (primer marcado) de las neuronas magnocelulares de RN después del marcado directo del sitio de lesión en el momento de la lesión de hemisección a la médula espinal torácica. Después de la supresión intraespinal de mielina e inyección siguiente de Fluorogold en posición caudal al sitio de la lesión (véase lo anterior para los detalles) fue observada una pequeña superposición de la población de neuronas FG positivas (es decir, algunas neuronas se marcaron con RDA y FG). También estaban presentes las células marcadas exclusivamente por el primero o por el segundo trazador en cada tronco cerebro-espinal analizado.

Los exámenes de cualquier diferencia funcional o conductual, durante el período de recuperación de 5 semanas después del tratamiento experimental, no indicó ninguna diferencia notable en el modelo locomotor entre los animales lesionados y los animales ilesos del control (es decir, todos los animales caminaron y todos los animales fueron comparables con respecto a sus funciones reflejo básicas). Estos ocurrió respecto al tratamiento infundido intraespinal después de una lesión de hemisección (por ejemplo, PBS sólo, anticuerpo de GaIC sólo, exclusivamente complemento de suero, o complemento de suero más el anticuerpo de GaIC). Así, fueron muy difíciles de observar o cuantificar diferencias sutiles y la totalidad de los modelos de motor fueron esencialmente los mismos.

En comparación con la técnica anterior que usaba la transección espinal (Keirstead et al., 1992, 1995), la presente invención usa un modelo de hemisección, se demuestra para que cada animal pudiera servir como su propio control interior (es decir, la regeneración de los axones del lesionado podría compararse con las neuronas tronco-cerebroespinales fácilmente con su homologo contralateral ileso). Además, la presente invención se esforzó para minimizar el grado de la formación de cavidad de quiste, la que a menudo ocurre con las lesiones espinales más grandes, así como la cantidad de malestar de los animales durante los períodos de recuperación relativamente largos requeridos.

La presente invención también ilustra que la demielinación producida por la infusión intraespinal de complemento de suero y un anticuerpo específico a la mielina (por ejemplo, GaIC) produjo una demielinación rápida y activa a 1-2 segmentos del cordón con fractura de la mielina que se extiende aún 2 segmentos adicionales, a cualquier lado del sitio de infusión. Se observaron microglia residentes y/o macrófagos invasores para contener los detritos de la mielina. La supresión inmunológica de mielina de la médula espinal que rodea la hemisección torácica facilitó una significante regeneración de axones unilateralmente por 2 vías tronco-cerebroespinales, los tractos rubroespinal y vestibuloespinal lateral (RN y LVe, respectivamente). Los animales tratados del control (la lesión de hemisección más la infusión intraespinal local de PBS sólo, anticuerpo de GaIC sólo o exclusivamente complemento de suero) mostró un pequeño o ningún marcado retrógrado dentro de los tractos RN o LVe lesionado.

TABLA 1

1

Claims (37)

1. Una composición que comprende las siguientes cantidades terapéuticamente eficaces de:

(a)

uno o más anticuerpos, humanos o quiméricos, fijadores del complemento o sus fragmentos, que enlazan a un epitope de mielina en humanos; y

(b)

una o más proteínas del complemento o sus fragmentos;

en la que el enlace de dichos anticuerpos a la mielina provoca la fractura transitoria y/o demielinación transitoria de neuronas en los humanos.

2. La composición de la Reivindicación 1, la que es una composición de dos partes, en la que los dos componentes (a) y (b) se destinan a ser mezclados entre sí sea antes de su administración, en el momento de su administración, o después de su administración a un humano en necesidad de tal tratamiento.

3. La composición de la Reivindicación 1, en la que dicha una o más proteínas del complemento se derivan del propio suero del humano.

4. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3, en la que los anticuerpos son monoclonales y/o policlonales.

5. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en la que la composición comprende adicionalmente uno o más factores de crecimiento y/o células para trasplante.

6. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en la que se marcan uno o más de los anticuerpos.

7. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, en la que los fragmentos de anticuerpos son fragmentos inmunoreactivos seleccionados entre el grupo que consiste en fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')2.

8. La composición de la Reivindicación 7, en la que las regiones variables del fragmento de Fv están vinculadas por enlaces disulfuros o por un vinculador de péptidos.

9. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en la que el epitope de mielina es un epitope de vaina de mielina seleccionado de la lista que incluye galactocerebrósido e (GaIC), O4, glicoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG), glicoproteína asociada a mielina (MAG), NOGO, NI220, NI-35/250, y arretina.

10. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9, en la que las proteínas del complemento o sus fragmentos incluyen el componente C3 o un fragmento, variante, análogo o derivado químico de éste.

11. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 10, en la que las proteínas del complemento o sus fragmentos se derivan de una especie no humana.

12. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11, en la que dicha una o más proteínas del complemento o sus fragmentos son un componente físicamente distinto de dicho uno o más anticuerpos o sus fragmentos.

13. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11, en la que dicha una o más proteínas del complemento o sus fragmentos son covalente o no covalentemente pegadas directamente a dicho uno o más anticuerpos o sus fragmentos.

14. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13, comprendiendo adicionalmente uno o más de los siguientes: factores de crecimiento, factores neurotróficos y/o células para trasplante.

15. La composición de la Reivindicación 14, en la que la neurotrofina es NT-3 o FGF-1.

16. La composición de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 14 que es una composición farmacéutica y adicionalmente comprende, opcionalmente, un portador fisiológicamente aceptable.

17. El uso de un anticuerpo, humano o quimérico fijador del complemento, o uno de sus fragmentos, que se enlaza a un epitope de mielina en los humanos y es conveniente para uso en combinación con una o más proteínas del complemento, o sus fragmentos, en la fabricación de un medicamento para promover la reparación y/o regeneración de las neuronas en un humano, en la que el enlace de dicho anticuerpo a la mielina provoca en presencia de dicha una o a más proteínas del complemento la fractura transitoria de la mielina y / o demielinación transitoria de las neuronas.

18. El uso según la reivindicación 17, en el que dicho medicamento también es para generar un entorno dentro del CNS que sea permisivo al crecimiento de células trasplantadas.

19. El uso según las Reivindicaciones 17 o 18, en el que dicha una o más proteínas del complemento o sus fragmentos se derivan del propio suero del humano.

20. El uso según cualquiera de las Reivindicaciones 17 a 19, en el que dicho medicamento comprende células para trasplante.

21. El uso según cualquiera de las Reivindicaciones 17 a 20, en el que dicho medicamento comprende uno o más factores de crecimiento.

22. El uso según cualquiera de las Reivindicaciones 17 a 21, en el que se requiere la reparación y/o regeneración de neuronas debido a una disfunción de las neuronas.

23. El uso según la reivindicación 22, en el que la disfunción de las neuronas es provocada por lesión o trauma al CNS, o es provocada por enfermedad.

24. El uso según la reivindicación 23, en el que la lesión es una lesión de la médula espinal.

25. El uso según la reivindicación 23, en el que la enfermedad es seleccionada entre el grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.

26. El uso según cualquiera de las Reivindicaciones 17 a 25, en el que el humano está padeciendo una enfermedad crónica.

27. Un equipo para su uso de cualquiera de las Reivindicaciones 17 a 26, que comprende:

(a)

uno o más anticuerpos, humanos o quiméricos fijadores del complemento, o sus fragmentos, que enlazan un epítope de mielina en humanos, con los que el enlace de dichos anticuerpos a la mielina provoca la fractura de la mielina y/o la demielinación en los humanos;

(b)

una o más proteínas del complemento o sus fragmentos; y opcionalmente

(c)

uno o más factores de crecimiento y/o,

(d)

células para trasplante.

28. Un anticuerpo, humano o quimérico fijador del complemento, o uno de sus fragmentos, que se enlaza a un epítope de mielina en humanos, para uso en combinación con una o más proteínas del complemento, o sus fragmentos, para promover la reparación y / o regeneración de las neuronas en un humano, con el que el enlace de dicho anticuerpo a la mielina provoca la fractura transitoria de ésta y/o la demielinación transitoria de las neuronas.

29. El anticuerpo o sus fragmentos según la reivindicación 28, con el que dicho uso es también generar un entorno dentro del CNS que sea permisivo al crecimiento de células trasplantadas.

30. El anticuerpo, o sus fragmentos, según la reivindicación 28 o 29, en el que dicha una o más proteínas del complemento, o sus fragmentos, se derivan del propio suero del humano.

31. El anticuerpo o sus fragmentos según cualquiera de las Reivindicaciones 28 a 30 para uso en combinación con células usadas para trasplante.

32. El anticuerpo o sus fragmentos según cualquiera de las Reivindicaciones 28 a 31 para uso en combinación con uno o más factores de crecimiento.

33. El anticuerpo, o sus fragmentos, según cualquiera de las Reivindicaciones 28 a 32, con el que la reparación nerviosa y/o regeneración se requieren debido a una disfunción nerviosa.

34. El anticuerpo, o sus fragmentos según la reivindicación 33, con el que la disfunción nerviosa se provoca por lesión o trauma al CNS o se provoca por una enfermedad.

35. El anticuerpo o sus fragmentos, con el que la lesión es una lesión de la médula espinal según la reivindicación 34.

36. El anticuerpo, o sus fragmentos según la reivindicación 34, con el que la enfermedad es seleccionada entre el grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.

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37. El anticuerpo o sus fragmentos según cualquiera de las Reivindicaciones 28 a 36, con el que el humano está padeciendo de una enfermedad crónica.