MXPA06001658A - Moleculas de lubricina recombinantes y usos de las mismas. - Google Patents

Abstract

Se describen moleculas de lubricina recombinantes y usos de las mismas. Se proporcionan nuevas moleculas de lubricina recombinantes y sus usos como lubricantes, agentes antiadhesivos y/o suplementos intra-articulares para, por ejemplo, articulaciones sinoviales, meniscos, tendones, peritoneo, pericardio y pleura.

Description

MOLECULAS DE LUBRICINA RECOMBINANTES Y USOS DE LAS MISMAS Campo de la invención La invención se refiere a nuevas moléculas de lubricina recombinantes y a sus usos como lubricantes, agentes antiadhesivos y/o suplementos intra-articulares para, por ejemplo, articulaciones sinoviales, meniscos, tendones, peritoneo, pericardio y pleura. Antecedentes de la invención La funcionalidad óptima de las articulaciones sinoviales depende de coeficientes de fricción extremadamente bajos entre los tejidos articulantes. Normalmente, una superficie bien lubricada y contigua se mantiene sobre el cartílago articular. Durante la osteoartritis (OA) , sin embargo, una lubricación reducida contribuye a la degradación y fibrilación de la matriz de cartílago; esto a su vez contribuye a una disfunción y dolor de las articulaciones . La lubricación reducida lleva también a una disfunción y dolor de las articulaciones en otras formas de artritis, incluyendo artritis reumatoide (RA) . Para otros tejidos (por ejemplo, tendones) , una superficie lubricada contribuye también a una funcionalidad óptima. Además de requerir una superficie lubricada, la función normal de los tendones requiere de la prevención de la adherencia celular a la superficie del tendón. En la RBF. ; 169639 lesión y reparación de tendones flexores, por ejemplo, la formación de adhesiones entre tendones es la complicación más común. La proteína lubricina nativa está relacionada con la proteína precursora de factor estimulador de megacariocitos (MSF) . PRG4 (proteoglucana 4) es el nombre para MSF que ha sido aceptado para la base de datos de la Nomenclatura Genica Humana UCL/HGNC/HUGO . La proteína PRG4 (es decir , la proteína precursora de MSF) se describe en US6433142 y US20020137894 (todas las patentes y solicitudes de patente citadas en este documento se incorporan a manera de referencia en su totalidad) . El polipéptido codif icado por el exón 6 del gen PRG4 es fuertemente glicosilado y parece necesario para que una proteína relacionada con PRG4 sirva como un lubricante , por ej emplo , entre superficies de cartílago articular . Estudios indican que la glicoproteína PRG4 también es sintetizada por los sinoviocitos íntimos que recubren las cubiertas de los tendones; es altamente probable que la glicoproteína también se origine a partir de tenocitos (Rees et al . , 2002) . La glicoproteína está presente prominentemente en regiones fibrocartilaginosas del tendón. De una manera complementaria a su función de fluido sinovial , la glicoproteína podría j ugar un papel citoprotector importante para tendones al prevenir la adhesión celular a superficies del tendón, así como al proporcionar lubricación durante una función normal del tendón .

El exón 6 del gen PGR4 (también llamado "lubricina") codifica para aproximadamente 76-78 repeticiones de secuencias similares a KEPAPTT y 6 repeticiones de secuencias tipo XXTTTX. Al variar el número de secuencias de repetición comparables en proteínas lubricina recombinantes de acuerdo con la presente invención se permite el desarrollo de bioterapéuticos mejorados para incrementar la lubricación en articulaciones y para contrarrestar la indeseable adherencia entre tejidos. Breve descripción de la invención La presente invención se refiere a nuevas moléculas de lubricina recombinantes y a su uso como lubricantes, agentes antiadhesivos y/o suplementos intra-articulares . Para optimizar los parámetros de expresión e investigar la necesidad funcional de ' todas las aproximadamente 76-78 secuencias similares a KEPAPTT, se diseñaron construcciones de expresión de lubricina que hicieron posible la síntesis de proteínas lubricina recombinantes con grados variables de sustitución de oligosacáridos O-enlazados. Esto se logra al incorporar números variables de las secuencias tipo KEPAPTT en una construcción de ADNc de "núcleo" que comprende los exones 1 a 5, regiones de flanqueo 5' y 3' del exón 6, y los exones 7 a 12. La inserción iterativa de "casetes de ADNc sintéticos" que codifican para varias secuencias tipo KEPAPTT facilita la generación de construcciones de lubricina recombinantes de tamaños diferentes. El foco inicial de estos estudios fue la construcción PRG4-Lub:l (que contiene ADN de "casete-l de ADNc sintético" (SEQ ID NO: 1) la cual codifica para cuatro secuencias EPAPTT) . Las proteínas lubricina recombinantes de la presente invención comparten una estructura primaria con varias isoformas de lubricina humana nativa (véase US6743774, US20040072741 y WO0064930) . Entre las isoformas caracterizadas, cada isoforma difiere en la composición de los exones del gen P G4 que codifican para la estructura primaria de la isoforma. Por ejemplo, los exones 1 a 12 del gen PRG4 codifican para la isoforma V0 , la cual representa a isoforma de longitud completa, mientras que los exones 1 a 4 y 6 a 12 codifican para la isoforma VI, la cual carece sólo de un segmento codificado por el exón 5. Los exones 1 a 3 y 6 a 12 codifican para la isoforma V2 , la cual carece de segmentos codificados por los exones 4 y 5. Finalmente, los exones 1, 3 y 6 a 12 codifican para la isoforma V3 , la cual carece de segmentos codificados por los exones 2, 4 y 5. Probablemente existen otras isoformas, y algunas proteínas mutantes relacionadas han sido descritas (véase US20020086824) .

En particular, la presente invención proporciona una proteína lubricina recombinante que comprende secuencias tipo KEPAPTT repetitivas. En modalidades preferidas, la invención proporciona una proteína aislada que comprende SEQ ID NOS: 9, 13, 17, 21 6 25. La invención proporciona en modalidades relacionadas una proteína aislada que comprende SEQ ID NOS: 7, 11, 15, 19 ó 23. En modalidades relacionadas adicionales, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para proteína lubricina ecombinante. En modalidades preferidas, la invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína. En otras modalidades relacionadas adicionales, la invención proporciona un polinucleótido aislado que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% o 99% de identidad con SEQ ID NOS: 6, 10, 14, 18 ó 22 sobre la longitud completa de la secuencia. En aspectos relacionados, la presente invención proporciona también una proteína aislada que comprende SEQ ID NO: 26 unida a (N menos 2) repeticiones de SEQ ID NO: 27, en donde N es igual a un entero de 3 a 200. En otras modalidades relacionadas adicionales, la presente invención proporciona un proteína aislada que comprende SEQ ID NO: 26 más SEQ ID NO: 28 más [ (N menos 2) repeticiones de SEQ ID NO: 27] más SEQ ID NO: 29, en donde N es igual a un entero de 3 a 200. En modalidades de los aspectos relacionados con la invención indicadas en este párrafo, de manera muy preferible N es igual a un entero de 5 a 50, y aún más preferible N es igual a un entero de 10 a 30. Tabla 1 Identi icación de secuencias que tienen identificadores de secuencia SEQ ID NO: Identificación 1 Secuencia de nucleotidos de cásete de ADNc sintético-1: 155 bases 2 Traducción de SEQ ID NO: 1: 51aminoácidos 3 Secuencia de nucleótidos de cásete de ADNc sintético- 2 : 125 bases 4 Traducción de SEQ ID NO: 3: 41 aminoácidos 5 Vector pTmed2 que contiene construcción de ADNc PRG4- Lub:l recombinante: 8049 bases 6 construcción de ADNc PRG4-Lub:l recombinante: 2946 bases 7 Secuencia de aminoácidos de proteína PRG4-LUB: 1 completa: 981 aminoácidos 8 Inserto de ADN Lub: 1 de casete-1 de ADNc sintético.- 157 bases SEQ ID NO: Identificación 9 51 aminoácidos codificados por inserto de ADN Lub:l (4 secuencias KEPAPTT entre S373 a E425 en SEQ ID NO: 7) 10 construcción de ADNc PRG4-Lub:2 recombinante : 3024 bases 11 Secuencia de aminoácidos de proteína PRG4-LUB:2 completa: 1007 aminoácidos 12 Inserto de ADN Lub: 2 de casete-1 de ADNc sintético y- una secuencia de casete-2 de ADNc sintético: 235 bases 13 77 aminoácidos codificados por inserto de ADN Lub: 2 (6 secuencias KEPAPTT entre S373 y E451 en SEQ ID NO: 11) 14 construcción de ADNc PRG4-Lub:3 recombinante: 3117 bases 15 Secuencia de aminoácidos de proteína PRG4-LUB:3 completa: 1038 aminoácidos 16 Inserto de ADN Lub: 3 de cásete-1 de ADNc sintético y dos secuencias de casete-2 de ADNc sintético: 328 bases 17 108 aminoácidos codificados por inserto de ADN Lub: 3 (9 secuencias KEPAPTT entre S373 y E482 en SEQ ID NO: 15) 18 construcción de ADNc PRG4-Lub:4 recombinante: 3210 bases 19 Secuencia de aminoácidos de proteína PRG4-LUB:4 completa: 1069 aminoácidos SEQ ID NO: Identificación 20 Inserto de ADN Lub:4 de casete-1 de ADNc sintético y tres secuencias de casete-2 de ADNc sintético: 421 bases 21 139 aminoácidos codificados por inserto de ADN Lub:4 {12 secuencias EPAPTT entre S373 y ?513 en SEQ ID NO: 19) 22 construcción de ADNc PRG4-Lub:5 recombinante : 3303 bases 23 Secuencia de aminoácidos de proteína PRG4-LUB:5 completa: 1100 aminoácidos 24 Inserto de ADN Lub:5 de casete-1 de ADNc sintético y cuatro secuencias de casete-2 de ADNc sintético: 514 bases 25 170 aminoácidos codificados por inserto de ADN Lub:5 (15 secuencias KEPAPTT entre S373 y E544 en SEQ ID NO: 23) 25 construcción de ADNc PRG4-Lub:4 recombinante: 3210 bases 26 secuencia de aminoácidos "APTTPKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTTKEPAPTTPKEPAPTTTK" (45 aminoácidos) en protexna PRG4-LUB:N preferida SEQ ID NO: Identificación 27 secuencia de aminoácidos ttKEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (31 aminoácidos) repetida N-1 veces en proteína PRG4-LUB:N preferida 28 secuencia de aminoácidos VEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (22 aminoácidos) que une SEQ ID NO : 26 a (N-2) repeticiones de SEQ ID NO: 27 en proteína PRG4-LUB:N preferida, en donde N>3. 29 Secuencia de aminoácidos "KEPKPAPTTP" (10 aminoácidos) en proteína PRG4-LUB.-N preferida, en donde N>2 La invención proporciona también en modalidades relacionadas una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína lubricina recombinante en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, la composición comprende además hialuronano o hil no. La invención proporciona además un método para tratar un sujeto que comprende: obtener una composición de proteína lubricina recombinante y administrar la composición a un tejido del sujeto. En modalidades relacionadas de este método de la invención, el tejido se selecciona del grupo que consiste en cartílago, sinovio, menisco, tendón, peritoneo, pericardio y pleura. En modalidades relacionadas adicionales de este método de la invención, el método comprende además una etapa seleccionada del grupo que consiste en: proporcionar un anestésico al sujeto; proporcionar un fármaco anti-inflamatorio al sujeto; proporcionar un antibiótico al sujeto; aspirar fluido del sujeto; lavar te ido del sujeto y crear imágenes del tejido del sujeto. En otras modalidades relacionadas, el sujeto se selecciona del grupo que consiste en un ratón, una rata, un gato, un perro, un caballo y un humano . En otras modalidades la invención proporciona también un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica para una proteina lubricina recombinante, en donde el polinucleótido está ligado operablemente a una secuencia de control de presión. En modalidades relacionadas, la invención proporciona un método para producir proteína lubricina recombinante que comprende: cultivar células transformadas con el vector de expresión en medio de cultivo liquido y recoger proteína lubricina recombinante del medio. La etapa de recoger proteínas puede comprender además : concentrar la proteína al filtrar el medio a través de una membrana; recoger la proteína retenida de la membrana y solubilizar la proteína colectada en una solución salina de pH regulado que contenga clorhidrato de L-arginina que varíe en concentración de 0.1 a 2.0 M. En otra modalidad relacionada, la invención proporciona un anticuerpo aislado especifico para una proteína lubricina recombinante . Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción de las modalidades preferidas de la misma, y de las reivindicaciones . Descripción detallada de la invención La construcción de ADN base utilizada para generar las proteínas lubricina recombinantes puede incluir disposiciones variables de secuencias 5' y 3' del exón 6 del gen P G4. Por ejemplo, la construcción de ADN base puede incluir disposiciones variables de secuencias que codifiquen para dominios tipo somatomedina B (exones 2 a 4) o dominios tipo hemopexina (exones 7 a 9) . Las modalidades de la construcción de ADN base que tienen varias disposiciones de exones 3' del exón 6 pueden incluir construcciones de ADN base que incluyan sólo el exón 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 individualmente, o pares de exones (7 y 8), (7 y 9) , (7 y 10), (7 y 11), (7 y 12), (8 y 9) , (8 y 10), (8 y 11), (8 y 12), (9 y 10), (9 y 11), (9 y 12), (10 y 11), (10 y 12) o (11 y 12), o tripletes de exones (7, 8 y 9) , (7, 8 y 10), (7, 8 y 11), (7, 8 y 12) , (7, 9 y 10) , (7, 9 y 11), (7, 9 y 12), (7, 10 y 11), (7, 10 y 12) , (7, 11 y 12), (8, 9 y 10), (8, 9 y 11) , (8, 9 y 12) , (8, 10 y 11), (8, 10 y 12) , (8, 11 y 12), (9, 10 y 11), (9, 10 y 12), (9, 11 y 12) , o (10, 11 y 12) o cuadrupletes de exones (7, 8, 9 y 10) , (7, 8, 9 y 11) , (7, 8, 9 y 12), (7, 8, 10 y 11) , (7, 8, 10 y 12) , (7, 8, 11 y 12) , (7, 9, 10 y 11), (7, 9, 10 y 12), (7, 9, 11 y 12), (7, 10, 11 y 12), (8, 9, 10 y 11) , (8, 9, 10 y 12) , (8, 9, 11 y 12), (8, 10, 11 y 12) o (9, 10, 11 y 12) o quintetos de exones (7, 8, 9, 10 y 11), (7, 8, 9, 10 y 12) , (7, 8, 9, 11 y 12), (7, 8, 10, 11 y 12), (7, 9, 10, 11 y 12) o (8, 9, 10, 11 y 12) o sextetos de exones (7, 8, 9, 10, 11 y 12) . Además, las modalidades de la construcción de ADN base que tienen varias disposiciones de exones 5' del exón 6 pueden incluir construcciones de ADN base que incluyan sólo el exón 1, 2, 3, 4 ó 5 individualmente, o los pares de exones (1 y 2) , (1 y 3), (1 y 4) , (1 y 5) , (2 y 3) , (2 y 4) , (2 y 5) , 3 y 4) , (3 y 5) o (4 y 5) o tripletes de exones (1, 2 y 3), (1, 2 y 4), (1, 2 y 5), (1, 3 y 4), (1, 3 y 5), (1, 4 y 5), (2, 3 y 4), (2, 3 y 5) , (2, 4 y 5) o (3, 4 y 5) o cuadrupletes de exones (1, 2, 3 y 4) , (1, 2, 3 y 5) , (1, 2, 4 y 5), (1, 3, 4 y 5) , o (2, 3, 4 y 5) o quintetos de exones (1, 2, 3, 4 y 5) . La presente invención abarca también proteínas codificadas por construcciones de ADN base, es decir, en donde parte o todo el polipéptido codificado por una secuencia de 6 exones es suprimido y ningún aminoácido codificado por insertos a partir de casetes de ADMc sintéticos ha sido añadido. La presente invención abarca también polinucleótidos que son homólogos a las modalidades específicas descritas en la presente, por ejemplo, que tienen al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia con las secuencias de ADN especificadas. La invención incluye además polinucleótidos que tienen una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar sobre la longitud de un dominio funcional al complemento de las secuencias de ADN especificadas bajo condiciones de alta severidad. La invención incluye también proteínas codificadas por estos polinucleótidos homólogos o hibridadores . Para poder delinear más claramente las modalidades de la presente invención, se proporcionan las siguientes definiciones . Definiciones La frase "secuencia tipo KEPAPTT repetitiva" significa una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 o mayor identidad con: (a) la secuencia "APTTP EPAPTTT SAPTTP EPAPTTTKEPAPTTPKEPAPTTTK" (SEQ ID NO: 26; 45 aminoácidos) y que tiene al menos una sustitución . O-enlazada; (b) la secuencia "KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (SEQ ID NO: 27; 31 aminoácidos) y que tiene al menos una sustitución O-enlazada o (c) la secuencia EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (SEQ ID NO: 28; 22 aminoácidos) y que tiene al menos una sustitución 0-enlazada. Una secuencia tipo KEPAPTT repetitiva puede tener de preferencia dos, tres, cuatro o más sustituciones 0-enlazadas . Aunque existe un número de métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos , el término "identidad" se conoce bien por las personas capacitadas en la técnica y tiene un significado definitivo con respecto a un método específico dado. La identidad de secuencia descrita en la presente se mide usando la herramienta BLAST 2 SECUENCES disponible a través de NCBl (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/; véase también Tatusova y Madden (1999)). Para secuencias de aminoácidos, los parámetros usados son expectativa = 1000; tamaño de palabra = 2; filtro = apagado; y otros parámetros establecidos a valores por omisión. Estos mismos parámetros se usan para secuencias de ácido nucleico, excepto tamaño de palabra = 8. Los valores por omisión para comparaciones entre secuencias de aminoácidos son: Matriz = BLOSUM62 ; espacio abierto = 11; espacio de extensión = 1 penalidades y espacio x pérdida = 50. Los valores por omisión para comparaciones entre secuencias de ácido nucleico son: premio por una coincidencia = 1; penalidad por una no coincidencia = -2; opción de hebra = ambas hebras ; espacio abierto = 5 ; espacio de extensión = 2 penalidades y espacio x pérdida = 50. Una sustitución 0-enlazada de lubricina recombinante puede ser una sustitución con el oligosacárido lubricante ß- (1-3) -Gal-GalNac, o con otras porciones, incluyendo porciones de carbohidrato artificiales o que se originen naturalmente (tales como sulfato de gueratán o sulfato de condroitina) . En algunas modalidades, la sustitución O-enlazada puede ser con porciones que contribuyan a una capacidad de la lubrcina recombinante para actuar como un portador de fosfolxpidos tensioactivos (SAPL) o agentes tensioactivos (Hills, 2002) . El porcentaje de glicosilación o sustitución se determina en peso (peso seco) . Las condiciones de alta severidad, cuando se usan en referencia a la hibridación ADN:ADN, comprenden condiciones equivalentes a unión o hibridación a 42 °C en una solución que consiste en 5X SSPE (43.8 g/1 de NaCl, 6.9 g/1 de NaH2P0»H20' y 1.85 g/1 de EDTA, pH ajustado a 7.4 con NaOH) , 0.5% de SDS, 5X de reactivo de Denhardt y 100 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado seguidos por lavado en una solución que comprende 0. IX SSPE, 1.0% de SDS a 42°C cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleotidos de longitud.

Los polipéptidos u otros compuestos descritos en la presente se dice que son "aislados" cuando están dentro de preparaciones que son al menos 50% en peso (peso seco) el compuesto de interés. Los polipéptidos u otros compuestos descritos en la presente se dice que son "sustancialmente puros" cuando están dentro de preparaciones que son al menos 80% en peso (peso seco) el compuesto de interés. Los polipéptidos u otros compuestos descritos en la presente se dice que son "homogéneos" cuando están dentro de preparaciones que son al menos 95%, y de preferencia 99% en peso (peso seco) el compuesto de interés. La pureza se mide al reducir en electroforesis con gel de poliacrilamida y tinción con azul de coomassie incrementada, seguida por rastros de densidad óptica de las bandas (es decir, la pureza de la proteína se mide a través de densitometrxa óptica) . "Libre de pirógenos" significa libre de contaminantes que causen fiebre, incluyendo endotoxinas. La medición de los contaminantes se lleva a cabo por las pruebas estándares aplicables establecidas por la Dirección de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos . Según se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad total de cada componente activo de la composición farmacéutica o método relevante que sea suficiente para mostrar un beneficio significativo en el paciente, es decir, tratamiento, curación, prevención o reducción de la condición médica relevante, o un incremento en la velocidad de tratamiento, curación, prevención o disminución de estas condiciones. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, el término se refiere a ese ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya sea administradas en combinación, en serie o simultáneamente. Las modalidades de la presente invención pueden usarse como suplementos intra-articulares. La suplementación intra-articular con compuestos no derivados de lubricina ha sido llevada a la práctica como una terapia de articulaciones. Por ejemplo, la "viscosuplementación" con hialuronano polimérico (HA) e hílanos de peso molécular más alto (tales como fluido elastoviscoso SYNVISCS "Hylan G-P 20" - distribuido por WYETH° Pharmaceuticals) se usa clínicamente para tratar dolor de rodilla asociado con OA. Esta viscosuplementación ha mostrado tener un valor terapéutico significativo, particularmente para reducir el dolor por soporte de peso en pacientes (Wobig et al., 1998) . Hylan G-F 20 se genera mediante el entrelazamiento de varias moléculas de HA obtenidas a partir de crestas de gallo o pollo. La viscosuplementación con Hylan G-F 20 puede ser significativamente más eficaz para aliviar el dolor que la viscosuplementación con HA de peso molecular más bajo (Wobig et al., 1999). Además, el alivio del dolor mediante la viscosuplementación con Hylan G-F 20 puede ser particularmente preferible a la administración de NSAIDs para aquellos pacientes que no toleren NSAIDs (por ejemplo, en pacientes con un alto riesgo de complicaciones gastrointestinales; Espallargues y Pons, 2003) . Aunque la viscosuplementación con Hylan G-F 20 es una terapia segura y bien tolerada que proporciona una reducción a corto plazo (es decir, hasta 3-6 meses postratamiento) en los síntomas de dolor mejorando al mismo tiempo la función de las articulaciones, la terapia podría no impedir significativamente la necesidad eventual de un reemplazo de rodilla en pacientes de ?? (Espaillargues y Pons, 2003) . Ej emplo 1 Clonación de lubricina recombinante Construcciones. En algunas modalidades, la construcción de ADN base para la generación de moléculas de lubricina recombinantes está compuesta del codón Met (ATG) a través del sitio de restricción BssHII (GACGCGC) de SEQ ID NO: 6 (es decir, nos. de base 1 a 1123) y el sitio de restricción BspEI (T^CCGGA) a través del codón de detención (TAA) de SEQ ID NO : 6 (es decir, nos. de base 1269 a 2946) . Estas secuencias, es decir, nos. de base 1 a 1123 y 1269 a 2946 de SEQ ID NO: 6, codifican para los aminoácidos MI a S373 (codificados por los exones 1 a 5 y aproximadamente 174 codones 5' de flanqueo del exón S) y E848 a P1404 (codificados por aproximadamente ¦ 293 codones 3' de flanqueo del exón 6 y exones 7 a 14) de la lubricina de longitud completa nativa (es decir, PRG4) . La porción del exón 6 ausente de la construcción de ADN base corresponde a una secuencia de ADN que codifica para los aminoácidos A374 a P847 de PRG4 nativo (474 aminoácidos ausentes de aproximadamente 940 aminoácidos codificados por el exón 6) . Esta secuencia de aminoácidos ausente es rica en secuencias tipo KEPAPTT. La secuencia de ADN del cásete-1 de ADNc sintético (SEQ ID NO: 1) se añade BssH.il/BspEI a la construcción base para hacer la construcción de ADNc PRG4-Lub:l recombinante (SEQ ID NO: 6) . SEQ ID NO: 6 está compuesta, del inserto de ADN Lub:l (SEQ ID NO: 8; que codifica para los 51 aminoácidos de SEQ ID NO: 9 con sus cuatro secuencias KEPAPTT) entre el ADN que codifica para los aminoácidos MI a S373 y ADN que codifica para E848 a P1404 de PRG4 nativo. En otras palabras, en lugar de A374 a P847 (474 aminoácidos) de PRG4 nativo, la lubricina recombinante PRG4-LUB:! incluye 51 aminoácidos que forman cuatro secuencias KEPAPTT perfectas y aproximadamente tres secuencias KEPAPTT imperfectas . La secuencia de ADN del casete-2 de ADNc sintético (SEQ ID NO: 3) se añade Bsu36l/BspEI a la construcción PRG4-Lub:l para hacer la construcción de ADNc PRG4-Lub:2 (SEQ ID NO: 10) . La construcción de ADNc PRG4-Lub:l tiene un sitio de restricción Bsu36I (CCATNAGG, es decir, CCATAAGG; nos. de base 1225 a 1231 de SEQ ID NO: 6) . Cuando el cásete-2 de ADNc sintético se añade a la construcción de ADNc PRG4-Lub:l, este sitio Bsu36I es destruido, pero el casete-2 sintético contiene otro sitio de restricción Bsu36I interno (CCATNAGG, es decir, CCATAAGG; nos. de base 92 a 98 de SEQ ID NO: 3). En consecuencia, una construcción PRG4-Lub:N+l puede acerse al añadir Bsu36I/BspEI del casete-2 de ADNc sintético a la construcción PRG4-Lub:N anterior en este sitio de restricción Bsu36I interno proporcionado por el casete-2 de ADNc sintético. Los casetes de ADNc se sintetizan como oligonucleótidos de una sola hebra y se hibridan juntos para producir un fragmento de ADN de doble hebra con extremos pegajosos. Esta es la razón por la cual los sitios BssHII, Bsu36I y BspEI terminales parecen incompletos. En el casete-1 de ADNc sintético (SEQ ID NO: 1), una secuencia limitada por los sitios de restricción BssHII (GACGCGC) y BspEI (TACCGGA) de flanqueo restantes incluye un sitio de restricción Bsu36I interno (CCATNAGG, es decir, CCATAAGG) ,-los sitios de restricción se subrayan abajo: CGCGCCCACAACTCCAAAAGAGCCCGCACCTACCACGACAAAGTCAGCTCCTACTACGCCC AAAGAGCCAGCGCCGACGACTACTAAAGAACCGGCACCCACCACGCCTAAGGAGCCAGCTC CTACTACAACGAAACCGGCACCAACCACTCCGG SEQ ID NO: 2, la cual es una traducción de SEQ ID NO: 1, incluye cuatro secuencias KEPAPTT que son coincidencias perfectas (resaltadas abajo) : 1 A P T T P K B P A T T K S P T T P OGCGCCCACAACTCCAAAAGAGCCCGCACCTACCACGACAAAGTCAGCTCCTACTACGCCC 21 K E P A P T T T K E P A P T T P K E P A AAAGAGCCAGCGCCGACGACTACTAAAGAACCGGCACGCÁCCACGCCTAAGGAGCCAGCT 1 p T ? T P A P T T P CCTACTACAACGAAACCGGCACCAACCAGTCCGG El casete-2 de ADNc sintético (SEQ ID NO: 3) tiene similarmente un sitio de restricción Bsu36I 5' -terminal restante (es decir, CC^TNAGG, evidenciado solamente por la secuencia TAA) , un sitio de restricción BspEI restante 3'-terminal (TACCGGA) y un sitio de restricción Bsu36I interno (CC^TNAGG) ; los sitios de restricción subrayan abajo: TAAAGAACCAGCCCCTACTACGACAAAGGAGCCTGCACCCACAACCACGAAGAGCGCACCC ACAACACCAAAGGAGCCGGCCGCTACGACTCCTAAGGAACCCAAACCGGCACCAACGACTC CGG SEQ ID NO: 4, la cual es una traducción de SEQ ID NO: 3, incluye tres secuencias KEPAPTT que son coincidencias perfectas (resaltadas abajo) : 1 E P A P T T T K E P A P T T T ? A P TAAAGAACCAGCCCCTACTACGACAAAGGAGCCTGCACCCACAACCACGAAGAGCGCACCC 21 I T P E P A P P E P P A P T T ACAACACCAAAGGAGCCGGCCCCTACGACTCCTAAGGAACCCAAACCGGCACCAACCACT 41 P CCGG La construcción de ADNc PRG4~Lub:l recombinante (SEQ ID NO: 6) en el vector pTmed2 (construcción más vector igual a SEQ ID NO: 5) es flanqueada por sitios de restricción Salí (G^TCGAC; nos. de base 1027 a 1032 de SEQ ID NO: 5) y Notl (GC^GGCCGC; nos. de base 3984 a 3991 de SEQ ID NO: 5). El sitio Salí incorpora una secuencia de inicio de traducción de Kozak modificada (CCCACC,- nos. de base 1032 a 1037 de SEQ ID. NO: 5) antes del codón de inicio de traducción ATG (nos. de base 1038 a 1040 de SEQ ID NO: 5) . Entre los sitios de restricción BssHII (G^CGCGC; nos. de base 2155 a 2160 de SEQ ID NO: 5) y BspEI (T^COGGA.; nos. de base 2306 a 2311 de SEQ ID NO: 5) se encuentra el sitio de clonación Bsu36I interno (CCAIN¾GG/ es decir, CC^TAGG; nos. de base 2262 a 2268 de SEQ ID NO: 5) . La construcción de ADNc PRG4-Lub:l (SEQ ID NO: 6) se traduce en la proteína PRG4-LUB:1 (SEQ ID NO: 7) . El inserto entre S373 y E425 (es decir, E848 de PRG4 nativo) de la proteína PRG4-LUB:1 completa (SEQ ID NO: 7) es los 51 aminoácidos de SEQ ID NO: 9. Éstos se traducen a partir del inserto de ADN Lub:l (SEQ ID NO: 8) e incluyen cuatro secuencias KEPAPTT perfectas . Entre el sitio de restricción BssHII (G^CGCGC; nos . de base 1118 a 1123 de SEQ ID NO: 6) y el sitio de restricción BspEI (T^CCGGA; nos. de base 1269 a 1274 de SEQ ID' NO: 6) se encuentra el sitio de clonación Bsu36J interno (CC TNAGG, es decir, CCATAAGG; nos. de base 1225 a 1231 de SEQ ID NO: 6) .

Al igual que en la construcción PRG4-Lub:l recombinante en el vector pTmed2 , la construcción de ADNc PRG4-Lub:2 recombinante (SEQ ID NO: ??') en el vector pTmed2 es flanqueada por los sitios de restricción Salí (G^TCGAC) y Notl (GC GGCCGC) ; el sitio Salí incorpora una secuencia de inicio de traducción de Kozak modificada ( CCCACC) antes del codón de inicio de traducción ATG (nos. de base 1 a 3 de SEQ ID NO: 10) . En forma similar, la construcción de ADNc PRG4-Lub:3 recombinante (SEQ ID NO: 14), la construcción de ADNc PRG4-Lub:4 recombinante (SEQ ID NO: 18) y' la construcción de ADNc PRG4-Lub:5 recombinante (SEQ ID NO: 22) en el vector pTmed2 son cada una flanqueadas por sitios de restricción Salí (GATCGAC) y NotJ (GCAGGCCGC) ; el sitio Salí incorpora una secuencia de inicio de traducción de Kozak modificada (CCCACC) antes del codón de inicio de traducción ATG (nos. de base 1 a 3 de SEQ ID NOS: 14, 18 y 22, respectivamente) . Dentro de la construcción de ADNc PRG4-Lub:2, el sitio de clonación Bsu36l interno (CCATNAGG, es decir, CC AAGG ; nos. de base 1318 a 1324 de SEQ ID NO: 10) se encuentra entre los sitios de restricción BssHII (GACGCGC; nos. de base 1118 a 1123) y BspEI (TACCGGA,- nos. de base 1347 a 1352) . La construcción •PRG4-Lub:2 (SEQ ID NO: 10) se traduce en la proteína PRG4-LUB:2 (SEQ ID NO: 11). El inserto entre S373 y E451 (es decir, E848 de PRG4 nativo) de la proteína PRG4-LUB:2 completa (SEQ ID NO: 11) es los 77 aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Éstos son traducidos a partir del inserto de ADN Lub:2 (SEQ ID NO: 12) . En lugar de A374 a P847 (474 aminoácidos) del PRG4 nativo, los 77 aminoácidos de la lubricina recombinante PRG4-LUB:2 forman seis secuencias KEPAPTT perfectas y aproximadamente cuatro secuencias KEPAPTT imperfectas. Dentro de la construcción de ADNc PRG4-Lub:3, el sitio de clonación us36I interno (CC TNAGG, es decir, CC^TAAGG; nos. de base 1411 a 1417 de SEQ ID NO: 14) se encuentra entre los sitios de restricción BssHII (G^CGCGC; nos. de base 1118 a 1123) y BspEI (T CCGGA; nos. de base 1440 a 1445) . La construcción PRG4-Lub:3 (SEQ ID NO: 14) se traduce en la proteína PRG4-LUB:3 (SEQ ID NO: 15) . El inserto entre S373 y E482 (es decir, E848 de PRG4 nativo) de la proteína PRG4-LUB.-3 completa (SEQ ID NO: 15) es los 108 aminoácidos de SEQ ID NO: 17. Éstos son traducidos a partir del inserto de ADN Lub:3 (SEQ ID NO: 16) . En lugar de A374 a P847 (474 aminoácidos) del PRG4 nativo, los 108 aminoácidos de la lubricina recombinante PRG4-LUB:3 forman nueve secuencias KEPAPTT perfectas y aproximadamente cinco secuencias KEPAPTT imperfectas .

Dentro de la construcción de ADNc PRG4-Lub : 4, el sitio de clonación Bsu36I interno (CCATNAGG, es decir, CC TAAGG nos. de base 1504 a 1510 de SEQ ID NO: 18) se encuentra entre los sitios de restricción BssHII (GACGCGC ; nos. de base 1118 a 1123) y BspEI (T CCGGA; nos. de base 1533 a 1538) . La construcción PRG4 -Lub:4 (SEQ ID NO: 18) se traduce en la proteína PRG4-LUB:4 (SEQ ID NO: 19) . El inserto entre S373 y E513 (es decir, E848 de PRGE4 nativo) de la proteína PRG4 -LUB:4 completa SEQ ID NO: 19) es los 139 aminoácidos de SEQ ID NO: 21. Éstos se traducen a partir del inserto de ADN de Lub : 4 (SEQ ID NO: 20) . En lugar de A374 a P847 (474 aminoácidos) del PRG4 nativo, los 139 aminoácidos de la lubricina recombinante PRG4 -LUB : 4 ' forman doce secuencias EPAPTT perfectas y aproximadamente seis secuencias KEPAPTT imperfectas. Dentro de la construcción de ADNc PRG4-Lub:5, el sitio de Bsu36I internó (CCATNAGG , es decir, CCATAAGG; nos. de base 1597 a 1603 de SEQ ID NO: 22) se encuentra entre los sitios de restricción BssHII (GACGCGC; nos. de base 1118 a 1123) y BspEI ( ACCGGA nos. de base 1626 a 1631) . La construcción PRG4-Lub : 5 (SEQ ID NO: 22) se traduce en la proteína PRG4-LUB:5 (SEQ ID NO: 23) . El inserto entre S373 y E544 (es decir, E848 de PRGE4 nativo) de la proteína PRG4 -LUB : 5 completa SEQ ID NO : 23) es los 170 aminoácidos de SEQ ID NO: 25. Éstos se traducen a partir del inserto de ADN de Lub ·.5 (SEQ ID NO: 24) . En lugar de A374 a P847 (474 aminoácidos) del PRG4 nativo, los 170 aminoácidos de la lubricina recombinante PRG4-LUB : 5 forman quince secuencias KEPAPTT perfectas y aproximadamente siete secuencias KEPAPTT imperfectas. En forma importante, el proceso de insertar el casete-2 de ADNc sintético se puede iterar indefinidamente. Cada iteración da como resultado la adición de tres secuencias KEPAPTT perfectas. Al igual que las lubricinas recombinantes PRG4-LUB:2 a PRG4-LUB:5 se construyen de esta manera a través del uso de secuencias de inserto, se construyen lubricinas recombinantes PRG4-LUB:6 a PRG4-LUB:N. La tabla 2 proporciona un resumen de las secuencias de inserto BssHII/BspEI. Tabla 2 Secuencias de inserto BssHII/BspEI INSERTO SEQ Secuencias (sitios de restricción subrayados en insertos de ADN; LUB ID NO: las secuencias KEPAPTT están resaltadas en los insertos de proteína) L b:l 8 GCGCGCCCACAa.CTCCAAAAGA.GCCCGCACCTACCACGACAa¾GTCAGCTCCT ACTACGCCCAAAGAGCCAGCGCCGACGACTACTAAAGAACCGGGACCCACCAC GCCTAAGGAGCCAGCTCCTACTACAACGAAACCGGCACCAACCACTCCGGA LUB:1 9 AETTPKEPASÍTTKSAPTTPKEPAPTITKEPAPITPKEPAPTIT PAPTTP INSERTO SEQ Secuencias (sitios de restricción subrayados en insertos de ÁDN; LUB ID NO: las secuencias EPAPTT están resaltadas en los insertos de proteína) r Lub:2 12 GCGCGCCCACAACTCCA2VS-RGAGCCCGCACCa?aCCACGaCAAAGTCAGCTCCT ACTACGCCCAAAGAGCCAGCGCCGACGACTACTAAAGAACCGGCACCCACCAC GCCTAAAGAACCAGCCCCTACTACGACAAAGGAGCCTGCACCCACAACCACGA AGAGCGCACCCACAACACCAAAGGAGCCGGCCCCTACGACTCCTAAGGAACCC AAACCGGCACCAACCACTCCGGA LUB:2 13 SAPTTPKEPAPTTPKEPKPAPTTP Lub:3 16 GCGCGCCCACAACTCCAAAAGAGCCCGCACCTACCACGACAAAGTCAGCTCCT ACTACGCCCAAAGAGCCAGCGCCGACGACTACTAAAGAACCGGCACCCACCAC GCCTAAAGAACCAGCCCCTACTACGACAAAGGAGCCTGCACCCACAACCACGA AGAGCGCACCCACAACACCAAAGGAGCCGGCCCCTACGACTCCTAAAGAACCA GCCCCTACTACGACAAAGGAGCCTGCACCCACAACCACGAAGAGCGCACCCAC AACACCAAAGGAGCCGGCCCCTACGACTCCTAAGGAACCCAAACCGGCACCAA CCACICCGGA LUB:3 17 SAPTTPKBPAPIIPKEPAPTTTKEPAPTIT SAPTTPKEPAPTTPKEPKPAPT TP Lub:4 20 GCGCGCCCACAACTCCAAAAGAGCCCGCACCTACCACGACAAAGTCAGCTCCT . ACTACGCCCAAAGAGCCAGCGCCGACGACTACTAAAGAACCGGCACCCACCAC GCCTAAAGAACCAGCCCCTACTACGACAAAGGAGCCTGCACCCACAACCACGA AGAGCGCACCCACAACACCA&AGGAGCCGGCCCCTACGACTCCTAAAGAACCA GCCCCTACTACGACAAAGGAGCCTGCACCCACAACCACGAAGAGCGCACCCAC AACACCAAAGGAGCCGGCCCCTACGACTCCTAAAGAACCAGCCCCTACTACGA CAAAGGAGCCTGCACCCACAACCACGAAGAGCGCACCCACAACACCAAAGGAG CCGGCCCCTACGACTCCTAAGGAACCCAAACCGGCACCAACCACTCCGGA LUB:4 21 APTTPKEPAPEITKSAPTTPKE-?APT-JTKEI?AP^ SAPTTPKI3PAPia;PKBPAPI3?TKSPA-?3.ITKSAPTTP --P&EITP BPA-?Xt-'T KEPAPTTTKSAPTTEKEPAPTIP SPKPAPTTP Lub:5 24 GCGCGCCCACAACTCCAAAAGAGCCCGCACCTACCACGACAAAGTCAGCTCCT AGTACGCCCAAAGAGCCAGCGCCGACGACTACTAAAGAACCGGCACCCACCAC GCCTAAAGAACCAGCCCCTACTACGACAAAGGAGCCTGCACCCACAACCACGA . AGAGCGCACCCACAACACCAAAGGAGCCGGCCCCTACGACTCCTAAAGAACCA GCCCCTACTACGACAAAGGAGCCTGCACCCACAACCACGAAGAGCGCACCCAC AACACCAAAGGAGCCGGCCCCTACGACTCCTAAAGAACCAGCCCCTACTACGA CAAAGGAGCCTGCACCCACAACCACGAAGAGCGCACCCACAACACCAAAGGAG CCGGCCCCTACGACTCCTAAAGAACCAGCCCCTACTACGACAAAGGAGCCTGC ACCCACAACCACGAAGAGCGCACCCACAACACCAAAGGAGCCGGCCCCTACGA CTCCTAAGGAACCCAAACCGGCACCAACCACTCCGGA LUB:5 25 APTTPKEPAPT!TT SAPTTPKEPAPTTTKSPAPiCTPKEPAPITTKEPAPIITK SAPTTPKEEAPTSPKEPAPTTTKEPAPTTT SAPTTPKEPAPTTPiíEPAPTTT KEPAPITT SA TTPKBPAPTIP EPA TITIÍEPAPTrTKSAPTTPKEPAPI- PKEPKPAPTTP Aunque se ha ejemplificado la construcción de ADN base con PRG4 de longitud completa que contiene todos los 12 exones (menos una porción central del exón 6) , las variantes de empalme de PGR4 también pueden emplearse, dependiendo de las diferentes actividades y longitud deseadas. Además, diferentes enzimas de restricción pueden . emplearse en una estrategia análoga, siempre y cuando su ubicación se localice convenientemente dentro de la secuencia de ácido nucleico que codifique para la proteína PRG4. En otras modalidades, la construcción de ADN base carece de la secuencia de exón 6 nativa, pero incluye una o más secuencias del exón 1 al exón 5 o del exón 7 al exón 12 del gen PRG4 nativo. En otras modalidades, la construcción de ADN base es idéntica a las secuencias de MSF recombinante descritas en US6433142 o US20020137894 excepto que parte o todas las secuencias del exón 6 están ausentes . La invención proporciona construcciones de ADNc que codifican para lubricinas recombinantes que son clonadas en sitios de restricción Salí (GATCGAC; nos. de base 1027 a 1032 de SEQ ID NO: 5) y Notl (GC GGCCGC; nos. de base 3984 a 3991 de SEQ ID NO: 5) en el vector de expresión eucariótico pTmed2 como una modalidad preferida (por ejemplo, la construcción de ADNc PRG4-Lub:l recombinante en el vector de expresión pTmed2 se localiza en SEQ ID NO: 5 en los nos. de base 1038 a 3983) . El sitio SalJ incorpora la primera base de una secuencia de inicio de traduceion de Koz k modificada (CCCACC; no. de base 1032 de SEQ ID NO: 5) antes del codón de inicio de metionina (ATG; nos. de base 1038 a 1040 de SEQ ID NO: 5) . Otras modalidades de la invención incluyen otras combinaciones de sitios de restricción y otros vectores de expresión. En una modalidad preferida, el proceso iterativo hace uso del casete-1 de ADNc sintético (SEQ ID NO: 1) en el vector de expresión pTmed2, el cual es flanqueado por los sitios de restricción para BssHII (GACGCGC) y BspEI (T^CCGGA) , y el casete-1 de ADNc sintético, el cual incluye un sitio de restricción Bsu36I interno (CC^TNAGG, es decir, CC^TAAGG; nos. de base 107 a 113 de SEQ ID NO: 1) . Para la generación iterativa de construcciones de lubricina recombinantes que contienen secuencias tipo KEPAPTT en esta modalidad preferida, el casete-2 de ADNc sintético (SEQ ID NO: 3) se inserta entre los sitios Bsu36I y BspEI de la construcción recombinante. El casete-2 de ADNc sintético (SEQ ID NO: 3) es flanqueado por un sitio Bsu36I restante modificado (TAAAG) y un sitio BspEI restante (ACTCCGG) ·. Incluye también un sitio Bsu36I interno (CCATNAGG, es decir, CC^TAAGG; nos. de base 92 a 98 de SEQ ID NO : 3) . Despviés de la clonación del casete-2 de ADNc sintético en los sitios Bsu36I y BspEI de una construcción de lubricina recombinante, el sitio de clonación Bsu.361 de la construcción original se destruye dejando un sitio de clonación Bsu36I único en la nueva construcción.

En esta modalidad preferida, la secuencia de aminoácidos "APTTPKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTTKEPAPTTPKEPAPTTTK" (SEQ ID NO: 26; 45 aminoácidos) permanece como parte de cada proteína P G4-LUB:N (en donde N = un entero de 1 o más) . Además, la secuencia de aminoácidos "KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (SEQ ID NO: 27; 31 aminoácidos) es codificada por el inserto de ADN que se vuelve parte de cada construcción de ADNc PRG4-Lub:N+l a través de la adición del casete-2 de ADNc sintético Bsu36I/BspEI a una construcción de ADNc PRG4-Lub:N. Para la proteina PRG4-LUB:N en donde N es un entero de más de o igual a 3, la secuencia de aminoácidos "EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (SEQ ID NO: 28; 22 aminoácidos) une SEQ ID NO: 26 a (N menos 2) repeticiones de SEQ ID NO: 27 en modalidades preferidas. Más aún, la secuencia de aminoácidos "KEPKPAPTTP" (SEQ ID NO: 29; 10 aminoácidos) sigue inmediatamente la última repetición de inserto de SEQ ID NO: 27 en modalidades preferidas de la proteína PRG4-LUB-.N en donde N es un entero de más de o igual a 2. Debido a que forman por lo menos dos secuencias KEPAPTT, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 son cada una designadas en la presente como una "secuencia tipo KEPAPTT repetitiva" (el término N de SEQ ID 28 se enlaza a un residuo K por lo que SEQ ID NO: 28 forma dos secuencias KEPAPTT en las proteínas PRG4-LUB:N) .

En consecuencia, para la proteína lubricina recorabinante PRG4~LUB:N (en donde N es igual a un entero de 1 o más) , la proteína PRG4-LUB:N comprende SEQ ID NO: 26 en una modalidad preferida. Además, para la proteína lubricina recombinante PRG4-LUB:N (en donde N es igual a un entero de 2 o más) , la proteína PRG4-LUB:N comprende también SEQ ID NO : 27 en una modalidad preferida. SEQ ID NO: 27 se repite (N menos 1) veces dentro de cada proteína PRG4-LUB:N en estas modalidades preferidas. En PRG4-LUB-.2, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27 se traslapan (es decir, comparten una secuencia KEPAPTT) . En otras modalidades preferidas en donde N es un entero de más de o igual a 3 (por ejemplo, cuando N es igual a un entero de 3 a 200, o en las modalidades que más se prefieren cuando N es un entero de 5 a 50, o en las modalidades que se prefieren todavía más cuando N es igual a un entero de 10 a 30) , la proteína de lubricina recombinante comprende los 22 aminoácidos de SEQ ID NO: 28 que unen a los 45 aminoácidos orientados hacia la N-terminal de SEQ ID NO: 26 (N menos 2) repeticiones de los 31 aminoácidos de SEQ ID NO: 27, en donde los 10 aminoácidos de SEQ ID NO: 29 son C-terminales a los últimos 31 aminoácidos de la repetición de SEQ ID NO: 27.

Tabla 3 Frecuencias de secuencia en las proteínas PRG4-LUB preferidas Las proteínas PRG4-LUB:N tienen en general (3 veces N) repeticiones de la secuencia KEPAPTT en modalidades preferidas en donde N es igual al número de secuencias tipo KEPAPTT repetitivas. La lubricina recombinante PRG4-LUB:5 (que tiene 3 x N = 3 x 5 = 15 copias de la secuencia KEPAPTT en modalidades preferidas) es la lubricina recombinante PRG4-LUB:N más grande cuya secuencia se detalla en la presente. Para la lubricina recombinante de la presente invención, sin embargo, el valor N puede ser de más de 5, tal como 7, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200 o más. En particular, las proteínas PRG4-LUB:1, PRG4-LUB: 2, PRG4-LUB:3, PRG4-LUB:4 y PRG4-LUB:5 se detallan en la presente con 4, 6, 9, 12 y 15 secuencias KEPAPTT perfectas, respectivamente. Sin embargo, es posible agregar números cada vez más altos de secuencias KEPAPTT al continuar el procedimiento de insertos de Lub:N iterativo descrito en la presente. Los presentes inventores han proporcionado una descripción detallada para lubricinas recombinantes PRG4-LUB :N con números relativamente bajos de secuencias KEPAPTT o tipo KEPAPTT en comparación con la proteína PRG4/lubricina nativa debido a que proteínas más pequeñas son más fáciles de sintetizar y manipular. También puede ser deseable incrementar el número de secuencias tipo KEPAPTT sobre aquél observado en la proteína PRG4 nativa. Esto se puede lograr ya sea al continuar el procedimiento de inserto de Lub :N iterativo descrito en la presente de tal manera que haya más de 78 secuencias tipo KEPAPTT en la proteína PRG4-LUB:N de lubricina recombinante , o al empezar con un ADNc de PRG4 intacto, en lugar de una versión de exón 6 suprimido o de exón 6 reducido del ADNc de PRG4. Así, cualquier secuencia tipo KEPAPTT añadida está en exceso del número encontrado en la proteína PRG4 nativa. Los procedimientos de inserto usados para la generación de proteínas de lubricina recombinantes más grandes a partir de un ADNc de PGR4 intacto, así como procedimientos de inserto que usan- una versión de exón 6 suprimido o exón 6 disminuido de ADNc de PRG4 , se abarcan dentro de la invención.

Ejemplo 2 Expresión y purificación de la proteína LOB7 La construcción de ANDc PRG4-Lub: 1 (SEQ ID NO: 5; que contiene la secuencia del casete-1 de ADNc sintético) fue expresada en una línea de células CHO DU X preadaptiva y transfectada de manera estable, purificada a partir de medios acondicionados y solubilizada en PBS que contenía 500 mM de clorhidrato de L-arginina como sigue. La construcción de ADNc PRG4-Lub:l se expresó en una línea de células CHO KU X establemente transfectada y el medio acondicionado fue recogido. Un volumen de dos litros de este medio acondicionado se concentró por filtro bajo gas nitrógeno comprimido (2.81 kg/cma) usando una unidad de filtración AMICONs M2000™ equipada ya sea con un límite de peso molecular nominal (NMWL) de 10 kDa, una membrana de disco de 30 kDa NMWL o 100 kDa NMWL PALL FILTRON® OMEGA™. El medio se concentró hasta aproximadamente un volumen de 100 mi, el cual fue aspirado de la membrana de disco. La membrana de disco se removió después de la unidad de filtración AMIC0N@ M2000™. El retenido "mucinoso", el cual se había acumulado en la superficie de la membrana de disco, se cosechó usando un raspador de células y se transfirió a tubos microcentrífugos . Las muestras en los tubos microcentrífugos se centrifugaron a aproximadamente 12,000 x g durante 10 minutos, y se removió el sobrenadante acuoso.

Las pellas "enriquecidas con lubricina" restantes se disolvieron en solución salina de pH regulado con fosfato (PBS) que contenía 500 mM de clorhidrato de L-arginina. La concentración de clorhidrato de L-arginina puede variar de 100 mM a 2.0 M. Usando el procedimiento anterior, las glicoproteínas PRG4-LUB:2 a PRG4-LUB:5 (y las proteínas PRG4-LUB :N en donde N = un entero no negativo de 6 o más, así como otras glicoproteínas que contenían secuencias tipo KEPAPTT) se cosechan directamente de las membranas de disco, es decir, sin purificación del concentrado que permanece sobre las membranas de disco. Es decir, estas glicoproteínas de lubricina recombinantes se aislan directamente de las membranas de disco de unidades de filtración de 10 kDa NMWL, 30 kDa NMWL o 100 kDa NMWL PALL FILTRON® OMEGA™. En algunos casos, estas glicoproteínas también pueden ser purificadas a partir del concentrado que permanezca sobre las membranas de disco a través de técnicas cromatográficas o técnicas electroforáticas o ambas. Las proteínas y glicoproteínas de lubricina recombinantes también pueden ser purificadas usando cromatografía y otras técnicas conocidas en la técnica (tales como, por ejemplo, descritas en US6433142 para proteínas MSF? véase también: Deutscher, 1990 y Scopes, 1994) .

Ejemplo 3 Inmunohistoquímica La fuente de células de lubricina en articulaciones normales y osteoartríticas se investigó más usando técnicas inmunohistoquímicas . Además, la presencia de lubricina sobre otras superficies tisulares, incluyendo pleura, pericardio, peritoneo y meninges, se examinó de acuerdo con los siguientes métodos. Cartílago y sinovio osteoartríticos fueron obtenidos mediante consentimiento informado de pacientes que se estaban sometiendo a cirugía de reemplazo de rodilla. Otros tejidos examinados fueron sinovio humano normal y sinovio, cartílago, pleura, pericardio, peritoneo, meninges, cerebro, tendón y ligamentos de primate no humano (NHP) normal, y menisco, cartílago, sinovio, ligamento y tendones de canino normales y osteoartríticos. Los tejidos fueron fijados en paraforraaldehído al 4% inmediatamente después de la cosecha o después de 24 horas de incubación en medio sin y con monensina suplemental (5 µ?) . Para los estudios inmunohistoquímicos los tejidos se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 24 horas y se obtuvieron secciones de parafina de 6-8 mieras. Un subconjunto de tejidos se congeló en un compuesto de congelamiento de tomografía de coherencia óptica (OCT) y se cortaron a intervalos de 5 a 10 mieras seguidos por la fijación en acetona.

Los análisis inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes utilizaron un anticuerpo de lubricina anti-humano de conejo policlonal purificado (Ab 06A10) generado mediante inmunización con una forma truncada de lubricina recombinante y purificación sobre una columna de proteína' A. Se usó el anticuerpo CD16 (NEOMARKERS3, Preraont CA) para identificar macrofagos (receptor III de Fcy) . Se usó el anticuerpo CD106/VCAM-1 (NEOMARKERS®) para marcar fibroblastos dentro de secciones de criostato. Para las secciones de control, una concentración equivalente de RIgG (VECTOR LABS™, CA) , MIgGi (DAKO®) y IgG2a (DAKO®) se usó consecutivamente. Se usó el Sistema de Tecnología de Dextrano (ENVISION+™; DARO®) para visualizar la unión de anticuerpos y las secciones fueron contrateñidas con alum-hematoxilina de Mayer. Se llevó a cabo la inmunofluorescencia usando los anticuerpos primarios anteriores y sondeando con anticuerpos secundarios (Alexa Dyes - MOLECULAR PROBES™, Oregon) colorante Alexa anti-conejo de cabra a 546 nm y colorante Alexa anti-ratón de cabra a 488 nm. La unión fluorescente del anticuerpo se detectó con un microscopio fluorescente NI ON°. La lubricina se detectó a lo largo de las superficies de cartílago y sinovio articular humano normal y osteoartrítico . Una gruesa capa de lubricina recubrió completamente la superficie osteoartrítica fibrilada. La inraunofluorescencia con CD106 mostró una fuerte tinción de la membrana celular de los fibroblastos íntimos del sinovio; la proteina lubricina también fue visualizada como tiñendo dentro de células sinoviales. La doble inmunotinción para CD106+lubricina, mostró claramente la co-localización dentro de los fibroblastos Intimos del sinovio. La tinción con CD16 de los macrófagos sinoviales demostró la presencia de estas células a lo largo de las capas del sinovio, pero no hubo co-localización con lubricina. La tinción de NHP y tejidos articulares caninos (normales y OA) con el anticuerpo de lubricina mostró que la lubricina recubría la capa superficial del sinovio, cartílago, menisco y tendones. El cartílago NHP también mostró una fuerte inmunorreactividad no sólo en las células de la zona superficial sino también en las células de la zona transicional sin la adición de monesina para incrementar los depósitos intracelulares de la glicoproteína . Las células que recubrían el peritoneo, pericardio y pleura también exhibieron expresión de lubricina, aunque no se observó inmunorreactividad alguna en las meninges o cerebro. En resumen, sinovio, tendón, menisco y cartílago tanto normal como osteoartrítico fueron recubiertos por una capa sustancial de lubricina. La glicoproteína está claramente presente sobre tejidos dentro de articulaciones OA. La tinción inmunofluorescente doble de sinovio OA humano demostró que los sinoviocitos de fibroblasto íntimos eran responsables de la síntesis de lubricina. La localización de la proteína de lubricina fuera del tejido de articulaciones no se ha descrito previamente. Una capa superficial de lubricina se demostró claramente sobre pleura pulmonar, pericardio y peritoneo. La lubricina tiene la reputación de tener una función lubricante dentro de la articulación sinovial, pero puede jugar varios papeles incluyendo, pero no limitados a, funciones de lubricación y anti-adherencia en otros tejidos. La suplementación de estos otros tejidos con lubricina es una bioterapia abarcada dentro de esta invención. Ejemplo 4 Lubricina recombinante como un lubricante mecánico La lubricina recombinante se podría usar como un lubricante generalmente, por ejemplo, con sellos y cojinetes y similares. Por ejemplo, US3973781 titulado "Sello autolubricante" , US4491331 titulada "Sello superficial mecánico ranurado" , US4560174 titulada "Sello de varios rebordes" y US4973068 titulada "Sellos y cojinetes dinámicos de aspereza de superficie diferencial" , describen cada uno sellos de diseños variables. La lubricina recombinante se podría usar como un lubricante con estos sellos . En particular, la lubricina recombinante podría usarse como un lubricante para dispositivos médicos, prótesis e implantes, particularmente cuando se requiera un lubricante biocompatible . Además, las aplicaciones no tienen que ser médicas, . sino que pueden incluir aplicaciones en contextos ambientalmente sensibles en los que pueda ser deseable un lubricante biocompatible. Ej emplo 5 Composiciones de lubricina recombinante Una lubricina recombinante de la presente invención puede usarse en una composición farmacéutica cuando se le combine con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede contener también (además de protelna y vehículo) diluyentes, rellenos, sales, reguladores de pH, estabilizadores, solubilizadores y otros materiales bien conocidos en la técnica. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos. Las características del vehículo dependerán de la ruta de administración. La composición farmacéutica de la invención también puede contener citocinas, linfocinas u otros factores hematopoyéticos tales como M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL4, IL-5, IL-S, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, TNF1, TNF2 , G-CSF, Meg-CSF, trombopoyetina, factor de células madre y eritropoyetina . La composición farmacéutica puede contener además otros agentes que incrementen la actividad de la protelna o complementen su actividad o uso en tratamiento. Estos factores y/o agentes adicionales pueden incluirse en la composición farmacéutica para producir un efecto sinergístico con la proteína de la invención, o para minimizar los efectos secundarios. De manera inversa, la proteína de la presente invención puede incluirse en formulaciones de la citocina, linfocina, otro factor hematopoyético, factor trombolítico o anti-trombotico, o agente anti-inflamatorio particular, para reducir al mínimo los efectos secundarios . Se prefiere particularmente el uso de la proteína lubricina recombinante para suplementación intra-articular en combinación con el hialuronano (HA.) polimérico descrito arriba e hílanos de peso molecular más alto. Otras combinaciones preferidas para usarse en suplementación intra-articular incluyen el uso de la proteína lubricina recombinante con anestésicos (por ejemplo, lidocaína) , esferoides (por ejemplo, hexacetónido de triamcinolona) o radioisótopos (por ejemplo, itrio) . Otras combinaciones preferidas para usarse en suplementación intra-articular pueden incluir preparaciones celulares autólogas o heterólogas (por ejemplo, de condrocitos, sinoviocitos o células madre cultivados, ya sea derivados autólogamente o heterólogamente) . Una lubricina recombinante de la presente invención puede ser activa en multímeros (por ejemplo, heterodímeros u homodímeros) o complejos con ella misma u otras proteínas. Como resultado, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender una proteína de la invención en esta forma multimérica o acomplejada. Una composición farmacéutica de la invención puede estar en forma de un complejo de las proteínas lubricina recombinantes de la presente invención junto con antígenos de proteina o péptido. El antlgeno de proteína y/o péptido suministrará una señal estimuladora tanto a linfocitos B como T. Los linfocitos B responderán al antígeno a través de su receptor de inmunoglobulina de superficie. Los linfocitos T responderán al antígeno a través del receptor de células T (TCR) después de la presentación del antígeno por proteínas MHC. MHC y las proteínas estructuralmente emparentadas incluyendo aquellas codificadas por genes MHC clase I y clase II sobre células hospederas servirán para presentar los antígenos péptidos a linfocitos T. Los componentes del antígeno también pueden ser suministrados como complejos MHC-péptido purificados solos o con moléculas co-estimuladoras que puedan señalizar directamente células T. Como alternativa, los anticuerpos capaces de unirse a inmunoglobulinas de superficie y otras moléculas sobre células B así como anticuerpos capaces de unirse al TCR y otras moléculas sobre células T pueden combinarse con la composición farmacéutica de la invención.

Una composición farmacéutica de la invención puede estar en forma de un liposima en el cual la proteína de la presente invención se combine, además de otros vehículos farmacéuticamente aceptables, con agentes anfif ticos tales como lípidos que existan en forma agregada tales como micelas, monocapas ínsolubles, cristales líquidos o capas laminares en solución acuosa. Los lípidos adecuados para la formulación liposómica incluyen, sin limitación, monoglicéridos, díglicéridos , sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos , saponina, ácidos biliares y similares. La preparación de estas preparaciones liposómicas está dentro del nivel de capacidad en la técnica, como se describe, por ejemplo, en US4235871, US4501728, US4837028 y US4737323. En la práctica el método de tratamiento o uso de la presente invención, una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de la presente invención se administra a un sujeto (por ejemplo, un mamífero) que tiene una condición que será tratada. La proteína de la presente invención se puede administrar de acuerdo con el método de la invención ya sea sola o en combinación con otras terapias tales como tratamientos que empleen citocinas, linfocinas, otros factores hematopoyéticos o suplementos a base de células . Cuando se co-administra con una o más citocinas, linfocinas, otros factores hematopoyéticos o suplementos a base de células, la proteína de la presente invención puede administrarse ya sea simultáneamente con las citocinas, linfocinas, otros factores hematopoyéticos, factores trombolíticos o antitrombóticos o suplementos a base de células, o secuencialmente . Si se administra secuencialmente, el médico que atienda decidirá sobre la secuencia adecuada de administración de la proteína de la presente invención en combinación con citocinas, linfocinas, otros factores hematopoyéticos, factores trombolíticos o antitrombóticos, o suplementos a base de células. · La administración de la proteína de la presente invención usada en la composición farmacéutica o para llevar a la práctica el método de la presente invención se puede llevar a cabo en una variedad de formas convencionales, tales como inyección cutánea, subcutánea, intraperitoneal , parenteral o intravenosa, o, en algunos casos, ingestión oral, inhalación, aplicación tópica. Se prefiere generalmente la administración a un paciente mediante inyección en el tejido de la articulación (Schumacher, 2003) . Cuando una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de la presente invención se administra oralmente, la proteína de la presente invención estará en forma de una tableta, cápsula, polvo, solución o elixir. Cuando se administra en forma de tableta, la composición farmacéutica de la invención puede contener además un vehículo sólido tal como una gelatina o un adyuvante. La tableta, cápsula y polvo contiene alrededor de 5 a 95% de proteina de la presente invención, y de preferencia alrededor de 25 a 90% de la proteína de la presente invención. Cuando se administra en forma líquida, puede añadirse un vehículo líquido tal como agua, petróleo, aceites de origen animal o de origen vegetal tales como aceite de cacahuate, aceite mineral, aceite de soya o aceite de ajonjolí, o aceites sintéticos. , La forma líquida de la composición farmacéutica puede contener además una solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos, o glicoles tales como etilenglicol , propilenglicol o polietilenglicol . Cuando se administra en forma líquida, la composición farmacéutica contiene alrededor de 0.5 a 90% en peso de la proteína de la presente invención, y de preferencia alrededor de 1 a 50% de la proteína de la presente invención. Cuando una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de la presente invención se administra mediante inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, la proteína de la presente invención estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable y libre de pirógenos . La preparación de estas soluciones de proteínas parenteralmente aceptables, en lo que se refiere a pH, isotonícidad, estabilidad y similares, está dentro de la capacidad de la técnica. Una composición farmacéutica preferida para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea debe contener, además de la proteína de la presente invención, un vehículo isotónico tal como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa e inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer lactada u otro vehículo conocido en la técnica. La composición farmacéutica de la presente invención también puede contener estabilizadores, conservadores, reguladores de pH, antioxidantes y otros aditivos conocidos por los capacitados en la técnica. Por ejemplo, la inyección en asociación con, o en combinación con, lidocaína u otro anestésico local, esteroides o adronocorticoides, HA y/o hílanos, o radioisótopos son todas abarcadas dentro de la presente invención. La cantidad de proteína de la presente invención en la composición farmacéutica de la presente invención dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que se esté tratando, y de la naturaleza de tratamientos anteriores a los que haya sido sometido el paciente. Finalmente, el médico a cargo decidirá la cantidad de proteína de la presente invención con la cual tratar cada paciente individual. Inicialmente, el médico a cargo administrará dosis bajas de la proteína de la presente invención y observará la respuesta del paciente. Dosis más grandes de la proteína de la presente invención pueden administrarse hasta que se obtenga el efecto terapéutico óptimo para el paciente, y en ese punto la dosis ya no se incrementa más. Se contempla que las diferentes composiciones farmacéuticas usadas para llevar a la práctica el método de la presente invención deben contener alrededor de 0.01 µg a aproximadamente 100 mg (de preferencia alrededor de 0.1 /zg a aproximadamente 10 mg, muy preferiblemente alrededor de 0.1 µ<3 a aproximadamente 1 mg) de la proteína de la presente invención por kg de peso corporal dependiendo del método de administración y del curso terapéutico exacto implementado. Si se administra intravenosamente, la duración de la terapia intravenosa usando una composición farmacéutica que comprenda la lubricina recombinante de la presente invención variará, dependiendo de la severidad de la condición y de la enfermedad que se esté tratando y de la respuesta idiosincrásica potencial de cada paciente individual. Se contempla que la duración de cada aplicación de la proteína de la presente invención puede estar en la escala de 12 a 24 horas de administración intravenosa continua. Finalmente, el médico a cargo decidirá acerca de la duración adecuada de la terapia intravenosa usando la composición farmacéutica de la presente invención. Para composiciones de la presente invención que sean útiles para terapia de huesos, cartílagos, tendones o ligamentos, el método terapéutico incluye administrar la composición tópicamente, sistemáticamente o localmente como un implante o dispositivo. Cuando se administra, la composición terapéutica para usarse en esta invención está, por supuesto, en una forma libre de pirógenos y fisiológicamente aceptable. Además, la composición deseablemente puede ser encapsulada o inyectada en una forma viscosa para su suministro al sitio del daño en hueso, cartílago o tejido. La administración tópica puede ser adecuada en algunos contextos de curación de heridas y reparación de tejidos. Los agentes terapéuticamente útiles que también pueden incluirse opcionalmente en la composición descrita arriba, pueden como alternativa o además, administrarse simultánea o secuencialmente con la composición que comprenda la proteina lubricina recombinante de la invención en los métodos de la invención. De preferencia, la composición incluiría una matriz capaz de suministrar la composición que contenga proteína al sitio de daño en hueso y/o cartílago, posiblemente capaz de proporcionar una estructura para el desarrollo de hueso y cartílago, y óptimamente capaz de ser resorbida en el cuerpo. Estas matrices se pueden formar a partir de materiales actualmente en uso para otras aplicaciones médicas implantadas. Si se usa una matriz, la elección del material de la matriz se basa en la biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, apariencia cosmética y propiedades interfaciales. La aplicación particular de las composiciones definirá la formulación adecuada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser sulfato de calcio, fosfato tricálcico, hidroxiapatita, ácido poliláctico, ácido poliglicólico y polianhídridos biodegradables y definidos químicamente. Otros materiales potenciales son biodegradables y biológicamente bien definidos, tales como colágeno óseo o dérmico. Las matrices adicionales comprenden proteínas puras o componentes de matriz extracelular. Otras matrices potenciales son no biodegradables y químicamente definidas, tales como hidroxiapatita sinterizada, biocristal, aluminatos u otras cerámicas. Las matrices pueden comprender combinaciones de cualquiera de los tipos de materiales mencionados arriba, tales como ácido polilático e hidroxiapatita o colágeno y fosfato tricálcico. La biocerámica puede alterarse en composición, tal como en calcio-aluminato-fosfato y procesarse para alterar el tamaño de poro, tamaño de partícula, forma de la partícula y biodegradabilidad. En composiciones adicionales, las proteínas de la invención pueden combinarse con otros agentes benéficos para el tratamiento del defecto o herida en hueso y/o cartílago o tejido en cuestión. Esos agentes incluyen varios factores de crecimiento tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factores de crecimiento por transformación (TGF-a y TGF-ß) y factor de crecimiento tipo insulina (TGF) .

Las composiciones terapéuticas también son actualmente valiosas para aplicaciones veterinarias. Particularmente los animales domésticos tales como gatos y perros, animales de laboratorio tales como ratones y ratas, así como caballos, además de humanos, son sujetos o pacientes particularmente deseados para este tratamiento con las proteínas de lubricina recombinantes de la presente invención. El régimen de dosificación de una composición farmacéutica que contenga proteínas que se usará en la regeneración de tejidos será determinado por el médico a cargo considerando varios factores que modifiquen la acción de las proteínas, por ejemplo, cantidad de peso de tejido que se desee formar, el sitio del daño, la condición del tejido dañado, el tamaño de una herida, el tipo de tejido dañado (por ejemplo, cartílago o tendón) , la edad, sexo y dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos. La dosis puede variar con el tipo de matriz usada en la reconstitución y con la inclusión de otras proteínas en la composición f rmacéutica. Por ejemplo, la adición de otros factores de crecimiento conocidos, tales como IGF I (factor de crecimiento tipo insulina I) o, a la composición final, también puede efectuar la dosis. El progreso puede monitorearse mediante la evaluación periódica del crecimiento y/o reparación del tejido y/o hueso, por ejemplo, rayos X, determinaciones historaorfométricas y marcado con tetraciclina . Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden usar para terapia génica. Estos polinucleótidos pueden introducirse ya sea in vivo o ex vivo en células para su expresión en un sujeto (por ejemplo, un mamífero) . Los polinucleótidos de la invención también se pueden administrar mediante otros métodos de introducción conocidos para la introducción del ácido nucleico en una célula u organismo (incluyendo, sin limitación, en forma de vectores virales o ADN desnudo) . Las células también pueden cultivarse ex vivo en presencia de ácidos nucleicos o proteínas de la presente invención para de esta manera proliferar o para producir un efecto o actividad deseado en estas células. Las células tratadas después se pueden introducir in vivo para propósitos terapéuticos . E emplo 6 Anticuerpos anti-lubricina La proteína lubricina recombinante de la invención también se puede usar para inmunizar animales y obtener anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionen específicamente con la proteína o, en algunas modalidades, sus contrapartes nativas . Estos anticuerpos pueden obtenerse usando ya sea proteína lubricina recombinante completa o fragmentos de la misma como un inmunógeno. Los inmunógenos péptidos pueden contener además un residuo de cisteína en el término carboxilo, y se conjugan a hapteno tal como hemocianina de lapa en forma de cerradura (KLH) . Los métodos para sintetizar estos péptidos se conocen en la técnica (por ejemplo, como en Merrifield, 1963 y rstenansky et al., 1987) . Los anticuerpos monoclonales que se unen a la proteina lubricina recombinante de la invención pueden ser agentes de diagnóstico útiles para la inmunodetección de proteínas relacionadas. La neutralización de los anticuerpos monoclonales que se unen a estas proteínas relacionadas también puede ser un procedimiento terapéutico útil para ambas condiciones asociadas con lubricina o, en algunos casos, en el tratamiento de algunas formas de cáncer en las que pueda estar implicada una expresión anormal de lubricina (por ejemplo, en sinoviomas) . Además de los anticuerpos que están dirigidos al núcleo del polipéptido de una protexna lubricina recombinante, un anticuerpo dirigido a una porción de azúcar o a un complejo de gliproteína de proteína lubricina recombinante es deseable . Para poder generar anticuerpos que se unan a lubricina recombinante glicosilada (pero no a una forma desglicosilada) , el inmunógeno es de preferencia un glicopéptido, cuya secuencia de aminoácidos abarca una porción altamente glicosilada de la lubricina recombinante, por ejemplo, una secuencia tipo ?????G repetitiva. Los glicopéptidos más cortos, por ejemplo, de 8-15 aminoácidos de longitud, dentro de la misma región altamente glicosilada también se usan como inmunógenos. Los métodos para generar anticuerpos para biomoléculas altamente glicosiladas se conocen en la técnica (por ejemplo, como se describe por Schneerson et al., 1980) . Ejemplo 7 Suministro de lubricina recombinante Se usan los métodos estándares para el suministro de lubricina recombinante. Para administración intra-articular, la lubricina recombinante se suministra a la cavidad sinovial a una concentración en la escala de 20-500 ¿g/ml en un volumen de aproximadamente 0.1-2 mi por inyección. Por ejemplo, 1 mi de una lubricina recombinante a una concentración de 200-300 µg/tnl se inyecta en una articulación de rodilla usando una aguja fina (por - ejemplo, calibre 14-30, de preferencia calibre 18-26) . Las composiciones de la invención también son útiles para administración parenteral, tal como administración intravenosa, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal y, en modalidades preferidas, sobre las superficies de la pared peritoneal, pericardio o pleura. La colocación adecuada de la aguja es crítica para la eficacia de la lubricina recombinante que se suministre mediante inyección en terapias de articulaciones (Schumacher, 2003) . Una colocación adecuada de la aguja puede facilitarse a través del uso de tecnología de ultrasonido. Las inyecciones exitosas son más comunes después de la aspiración exitosa . del fluido. Un enfoque supralateral al interior del saco suprapatelar ha sido sugerido para proporcionar el acceso más confiable al espacio de la articulación de la rodilla. Además de suministrar lubricina recombinante mediante inyección intra-articular, los ácidos nucleicos que codifiquen para lubricina recombinante (por ejemplo, en aplicaciones de terapia génica) pueden administrarse a una cavidad sinovial mediante la inyección intra-articular. Para la prevención de adhesiones quirúrgicas, las lubricinas recombinantes descritas en la presente se administran en forma de gel, espuma, fibra o tela. Una lubricina recombinante formulada de esta manera se coloca sobre y entre tejido dañado o expuesto y en las interf ses para prevenir la formación de adherencias entre las superficies que se empalman. Para ser efectivo, el gel o película deben permanecer en su lugar y evitar el contacto del tejido durante un tiempo lo suficientemente largo como para que cuando el gel finalmente se disperse y los tejidos entren en contacto, ya no tengan una tendencia a adherirse. La lubricina recombinante formulada para la inhibición o prevención de la formación de adherencia (por ejemplo, en forma de una membrana, tela, espuma o gel) se evalúa para la prevención de . adherencias posquirúrgicas en un modelo de abrasión cecal de rata (Goldberg et al., 1993). Las composiciones se colocan alrededor de ciegos de rata quirúrgicamente expuestos, y se les compara con controles no tratados (animales cuyos ciegos fueron expuestos pero no recibieron ningún tratamiento) . Una reducción en la cantidad de la formación de adherencia en el modelo de rata en presencia de la formulación de lubricina recombinante comparada con la cantidad en ausencia de la formulación ' indica que la formulación es clínicamente efectiva para reducir la formación de adherencia tisular. En contextos en los que la adherencia tisular se desee (por ejemplo, cuando se desee la curación de fisuras en cartílago) , sin embargo, se puede evitar mejor el uso de la lubricina recombinante. El proporcionar lubricación a superficies de cartílago deteriora la integración entre cartílagos (Schaefer et al., 2004) . Las lubricinas recombinantes se usan también para recubrir extremidades y articulaciones artificiales antes de su implante en un mamífero. Por ejemplo, estos dispositivos pueden ser sumergidos o bañados en una solución de lubricina recombinante, por ejemplo, siguiendo métodos descritos en US5709020 o US5702456. Sin embargo, se debe tener cuidado en el uso in vivo de la lubricina recombinante al proporcionar una lubricación cerca de una prótesis. Una sobre-regulación marcada en la expresión del gen PRG4 (es decir, la expresión del gen MSF) se ha reportado que está asociada con el aflojamiento de la prótesis; la lubricina podría alterar la interacción hermética entre el hueso y prótesis y de esta manera contribuir al aflojamiento de la prótesis (Morawietz et al . , 2003) . Ejemplo 8 Modelo de OA Para evaluar la eficacia de la administración intra-articular de preparaciones de lubricina, se prepara un modelo de murino con osteoartritis/erosión de cartílago. Para la inducción quirúrgica de la osteoartritis, los ratones son anestesiados con 250 mg/kg de tribrornómetano1 intraperitoneal (SIGMA° Chemical) , y las rodillas se preparan para cirugía aséptica. Se practica una incisión longitudinal media al ligamento rotuliano, la cápsula de la articulación se abre y el ligamento meniscotibial (que fija el menisco medio a la planicie tibial) se identifica. En un subconjunto de animales, no se lleva a cabo manipulación adicional, y este grupo es considerado operado en falso. En el grupo experimental el ligamento meniscotibial medio es transeccionado dando como resultado la desestabilización del menisco medio (DMM) . En ambos animales falsos como DMM, la cápsula de la articulación y la capa subcutánea se cierran por sutura por separado y la piel se cierra mediante la aplicación del adhesivo tisular NEXABAND® S/C (Abbott, North Chicago, IL) . Se administra buprenorfina (BUPRENEX®; Reckitt & Colman, Kingston-upon-Hull, Reino Unido) antes y después de la operación. Las preparaciones de lubricina recombinantes se administran mediante inyección intra-articular usando una aguja calibre 30. Inyecciones de 5-10 microlitros por articulación de rodilla se administran una semana después de la cirugía. Las inyecciones adicionales se administran opcionalmente sobre una base semanal . Los animales se sacrifican con dióxido de carbono 4 semanas después de la operación y 8 semanas después de la operación. Para evaluar la progresión y severidad de la osteoartritis , las articulaciones de rodilla intactas se colocan en paraformaldehído al 4% durante 24 horas, luego se descalcifican en EDTA/polivinilpirrolidona durante cinco días . Las articulaciones son incrustadas en parafina y secciones frontales de 6 tm se obtienen a través de la articulación completa. Portaobjetos se tiñen con verde Safranin O-fast y se gradúan a intervalos de 70 µ?? a través de la articulación usando una modificación de un sistema de puntuación semicuantitativa (Chambers et al., 2001) en el cual "0" = cartílago normal, "0.5" = pérdida de Safranin O sin cambios estructurlaes ; "1" = superficie articular áspera y fibrilaciones pequeñas; "2" = fibrilación hasta la capa inmediatamente debajo de la capa superficial y cierta pérdida de láminas de superficie; "3" = leve (<20%) ; "5" = moderada (20-80%) y "6" = severa (>80%) pérdida de cartílago no calcificado. Las puntuaciones de " (erosión en el hueso) no son una característica de este modelo. Todos los cuadrantes de la articulación (planicie tibial media, cóndilo femoral medio, planicie tibial lateral y cóndilo femoral lateral) se califican por separado. Un mínimo de 12 niveles se califican por observadores ciegos para cada articulación de rodilla. Las puntuaciones se expresan como la puntuación histológica máxima encontrada en cada articulación o las puntuaciones histológicas sumadas. La puntuación sumada representa las puntuaciones aditivas para cada cuadrante de la articulación en cada corte histológico a través de la articulación. Este método de análisis hace posible la evaluación de la severidad de lesiones así como el área superficial del cartílago afectada con lesiones tipo OA (Glasson et al., 2004). Referencias (1) Chambers et al., 2001, Artritis Rheum. 44; 1455-65; (2) Deutscher, 1990, Methods in Enzymology, vol . 182: Guide to Protein Purification, Academic Press,- (3) Espallargues y Pons, 2003, Int'l J. Tech.

Assess. Health Care 19:41-56; (4) Plannery et al . , 1999, Biochem. Biophys . Res. Comm. 254: 535-41; (5) Glasson et al., 2004, Arthritis Rheum. 50:2547-58 ; (6) Goldberg et al . , 1993, eri: Gynecologic Surgery and Adhesión Prevention, Willey-Liss, págs . 191-204; (7) Hills, 2002, J. Rheumatology 29:200-01; (8) Ikegawa et al . , 2000, Cytogenet . Cell Genet. 90:291-297; (9) Jay et al . , 2001, J. Orthopaedic Research 19: 677-87; (10) Jay et al., 2002, Glycoconjugate Journal 18 :807-15; (11) Krstenansky et al., 1987, FEBS Lett. 211:10- 16; (12) Marcelino et al., 1999, Nature Genetics 23:319-322; (13) Merberg et al., 1993, Biology of Vitronectins and their Receptors, Pressner et al. (eds.): Elsevier Science Publishers, págs. 45-53; (14) Merrifield, 1963, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54; (15) Morav/ietz et al., 2003, Virchows Arch. 443:57-66; (16) Rees et al., 2002, Matrix Biology 21 : 593-602 ; (17) Schneerson et al . , 1980, J". Exp. Med. 152: 361-76; (18) Scopes, 1994, Protein Purification: Principies and Practíce (3a edición) , Springer Verlag; (19) Schaefer et al., 2004, Bioxheology 41 : 503-508 ; (20) Schumacher, 2003, Arthritis & Bheumatism 49 :413-20; (21) Tatusova y Madden, 1999, FEMS Microbiol Lett. 174:247-50; (22) Wobig et al., 1998, Clin. Ther. 20:410-23 y (23) Wobig et al., 1999, Clin. Ther. 21:1549-62. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una proteína aislada caracterizada porque comprende SEQ ID NOS: 9, 13, 17, 21 ó 25. 2. Una proteína aislada caracterizada porque comprende SEQ ID NO: 26 enlazada a N-2 repeticiones de SEQ ID NO: 27, en donde N es igual a un entero de 3 a 200. 3. La proteína de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque N es igual a un entero de 5 a 50. . La proteína de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque N es igual a un entero de 10 a 30. 5. Una proteína aislada caracterizada porque comprende SEQ ID NO: 26 más SEQ ID NO: 28 más [N-2 repeticiones de SEQ ID NO: 27] más SEQ ID NO: 29, en donde N es igual a un entero de 10 a 30. 6. Un polinucleótído aislado caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de conformidad con la reivindicación 1. 7. Un polinucleótído aislado caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de conformidad con la reivindicación 2. 8. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de conformidad con la reivindicación 3. 9. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de conformidad con la reivindicación 4. 10. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de conformidad con la reivindicación 5. 11. Una proteína aislada caracterizada porque comprende SEQ ID MOs : 7, 11, 15, 19 ó 23. 12. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de conformidad con la reivindicación 11. 13. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque comprende SEQ ID NOS: 8, 12, 16, 20 ó 24. 1 . El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque comprende SEQ ID NOS: 6, 10, 14, 18 ó 22. 15. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende un polinucleótido que tiene al menos 80% de identidad con SEQ ID NOS: 6, 10, 14, 18 ó 22 sobre la longitud completa de la secuencia. 16. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porgue comprende un polinucleótido que tiene al menos 90% de identidad. 17. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende un polinucleótido que tiene al menos 95% de identidad. 18. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque comprende un polinucleótido que tiene al menos 99% de identidad. 19. La proteína de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque es O-enlazada con ß- (1-3) -Gal-GalNac. 20. Una composición caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de conformidad con la reivindicación 19 en un vehículo farmacéuticamente aceptable. 21. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque comprende además hialuronanno o hilano. 22. Uso de* la composición de conformidad con la reivindicación 20, para elaborar un medicamento para tratar a un sujeto al cual se le aplica el medicamento en un tejido del sujeto. 23. El uso de conformidad con la reivindicación 22, en donde el tejido se selecciona del grupo que consiste en cartílago, sinovio, menisco, tendón, peritoneo, pericardio y pleura . 24. El uso de conformidad con la reivindicación 23, en donde el tejido es cartílago. 25. El uso de conformidad con la reivindicación 22, que comprende además una etapa seleccionada del grupo que consiste en: proporcionar un anestésico al sujeto; proporcionar un fármaco anti-inflamatorio al sujeto; proporcionar un antibiótico al sujeto; aspirar fluido del sujeto; lavar tejido del sujeto y formar imágenes del tejido del sujeto. 26. El uso de conformidad con la reivindicación 22, en donde el sujeto se selecciona del grupo que consiste en un ratón, una rata, un gato, un perro, un caballo y un humano. 27. El uso de conformidad con la reivindicación 26, en donde el sujeto es un humano. 28. Un vector de expresión caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con las reivindicaciones 6 ó 7 enlazado operablemente a una secuencia de control de expresión. 29. Un método para producir una proteína recombinante, caracterizado porque comprende: cultivar células transformadas con el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 28 en medio de cultivo líquido y recoger la proteína recombinante del medio. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque recoger la proteína comprende: concentrar la proteína al filtrar el medio a través de una membrana; recoger la proteína retenida de la membrana y solubilizar la proteína colectada en una solución salina de pH regulado que contenga clorhidrato de L-arginina que varía en concentración de 0.1 a 2.0 M. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la concentración de clorhidrato de L-arginina es de 0.5 M. 32. Un anticuerpo aislado caracterizado porque es específico para la proteína de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2.