JP2007502122A - 組換えルブリシン分子およびその使用 - Google Patents
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Abstract
組換えルブリシン分子およびその使用。新規の組換えルブリシン分子、ならびに、例えば、滑膜関節部、半月板、腱、腹膜、心膜および胸膜のための潤滑剤、抗付着剤および／または関節内助剤としてのそれらの使用を提供する。
Description
本発明は、新規の組換えルブリシン分子、ならびに、例えば、滑膜関節部、半月板、腱、腹膜、心膜および胸膜のための潤滑剤、抗癒着剤および／または関節内助剤としてのそれらの使用に関する。
滑膜関節部の最適な機能性は、関節で繋がっている組織間の極めて低い摩擦係数に依存する。通常、連続的な良好に潤滑された表面が関節軟骨上に維持される。しかし、骨関節炎（ＯＡ）の間、潤滑の減少は、軟骨マトリックスの分解および線維化に寄与し；次いで、これらは、関節部機能異常および疼痛に寄与する。潤滑の減少はまた、慢性関節リウマチ（ＲＡ）を含む他の形態の関節炎における関節機能異常および疼痛をもたらす。
他の組織（例えば、腱）についても、潤滑された表面は最適な機能性に寄与する。潤滑された表面を必要とすることに加えて、正常な腱の機能は、腱表面に対する細胞癒着の防止を必要とする。屈筋の損傷および修復では、例えば、腱癒着の形成は最も一般的な合併症である。
生来ルブリシン蛋白は、巨核球刺激因子（ＭＳＦ）前駆体蛋白に関連する。ＰＲＧ４（プロテオグリカン４）は、ＵＣＬ／ＨＧＮＣ／ＨＵＧＯ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅデータベースに受容されているＭＳＦの名称である。ＰＲＧ４蛋白（即ち、ＭＳＦ前駆体蛋白）については、特許文献１および特許文献２に記載されている（本明細書において引用されるすべての特許および特許出願は、出典明示によりその内容を本明細書の一部とする）。ＰＲＧ４遺伝子のエキソン６によってコードされるポリペプチドは重度にグルコシル化され、ＰＲＧ４関連蛋白が、例えば、関節軟骨の表面間で潤滑剤としての役割を果たすことを必要とするようである。
研究は、ＰＲＧ４糖蛋白が腱鞘を裏打ちする内膜の滑膜細胞によっても合成されることを示し；糖蛋白も腱細胞を起源とする可能性が高い（非特許文献１）。糖蛋白は、腱の線維軟骨性領域に優位に存在する。その滑液の機能に相補的な様式で、糖蛋白は、腱表面に対する細胞癒着を防止し、ならびに正常な腱機能中に潤滑を提供することによって、腱に対して重要な細胞保護的役割を果たし得る。
ＰＲＧ４（「ルブリシン」とも呼ばれる）遺伝子のエキソン６は、ＫＥＰＡＰＴＴ類似配列の約７６〜７８リピートおよびＸＸＴＴＴＸ様配列の６リピートをコードする。本発明に従う組換えルブリシン蛋白において比較可能な反復配列の数を変動することにより、関節部における潤滑を増強し、組織間の所望されない癒着を阻止するための改善されたバイオ治療の開発が可能である。
米国特許第６４３３１４２号明細書
米国公開特許第２００２０１３７８９４号明細書
Ｒｅｅｓら、２００２，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ２１：５９３−６０２
本発明は、新規の組換えルブリシン分子、ならびに潤滑剤、抗癒着剤および／または関節内助剤としてのそれらの使用に関する。
発現パラメータを最適化し、すべての約７６〜７８ＫＥＰＡＰＴＴ類似配列の機能的必要性を調べるために、Ｏ結合型オリゴ糖置換の程度を変動することにより、組換えルブリシン蛋白の合成を可能にするルブリシン発現構築物を設計した。このことは、エキソン１〜５、エキソン６の５’および３’フランキング領域、ならびにエキソン７〜１２よりなる「コア」ｃＤＮＡ構築物に組み入れることによって、達成される。複数のＫＥＰＡＰＴＴ様配列をコードする「合成ｃＤＮＡカセット」のリピート挿入は、異なるサイズの組換えルブリシン構築物の作製を容易にする。これらの研究の当初の焦点は、構築物ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：１（４つのＫＥＰＡＰＴＴ配列をコードする「合成ｃＤＮＡカセット１」（配列番号１）のＤＮＡを含有する）にあった。
本発明のルブリシンは、生来のヒトルブリシンのいくらかのイソ型と１次構造を共有する（米国特許第６７４３７７４号明細書、米国公開特許第２００４００７２７４１号明細書、および国際公開第００６４９３０号パンフレットを参照のこと）。特徴付けられたイソ型の間で、各イソ型は、イソ型の１次構造をコードするＰＲＧ４遺伝子のエキソンの組成が異なる。例えば、ＰＲＧ４遺伝子のエキソン１〜１２は、全長のイソ型を表すＶ０イソ型をコードする一方、エキソン１〜４および６〜１２は、エキソン５によってコードされる唯一のセグメントを欠くＶ１イソ型をコードする。エキソン１〜３および６〜１２は、エキソン４および５によってコードされるセグメントを欠くＶ２イソ型をコードする。最後に、エキソン１、３および６〜１２は、エキソン２、４および５によってコードされるセグメントを欠くＶ３イソ型をコードする。他のイソ型もおそらく存在し、いくつかの関連する変異蛋白が記載されている（米国公開特許第２００２００８６８２４号明細書を参照のこと）。
特に、本発明は、反復ＫＥＰＡＰＴＴ様配列を含んでなる組換えルブリシン蛋白を提供する。好適な実施態様では、本発明は、配列番号９、１３、１７、２１または２５を含んでなる単離された蛋白を提供する。本発明は、関連する実施態様において、配列番号７、１１、１５、１９または２３を含んでなる単離された蛋白を提供する。さらに関連する実施態様では、本発明は、組換えルブリシン蛋白をコードする核酸配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。好適な実施態様では、本発明は、蛋白をコードする核酸配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。さらに関連する実施態様では、本発明は、配列の全体の長さにわたって、配列番号６、１０、１４、１８または２２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する単離されたポリヌクレオチドを提供する。
関連する態様では、本発明はまた、配列番号２７の（Ｎ−２）リピート（ここで、Ｎは３〜２００の整数に等しい）に連結された配列番号２６を含んでなる単離された蛋白を提供する。さらに関連する実施態様では、本発明は、配列番号２６＋配列番号２８＋［配列番号２７の（Ｎ−２）リピート］＋配列番号２９（ここで、Ｎは３〜２００の整数に等しい）を含んでなる単離された蛋白を提供する。この段落において認められる本発明の関連する態様の実施態様では、より好ましくは、Ｎは５〜５０の整数に等しく、なおより好ましくは、Ｎは１０〜３０の整数に等しい。
本発明はまた、関連する実施態様で、医薬上許容されるキャリアにおいて治療有効量の組換えルブリシン蛋白を含んでなる組成物を提供する。いくつかの実施態様において、組成物は、ヒアルロナンまたはヒラン（ｈｙｌａｎ）をさらに含んでなる。
本発明は、組換えルブリシン蛋白組成物を入手すること；および前記組成物を被験体の組織に投与することを含んでなる、被験体を処置する方法をさらに提供する。本発明の本方法の関連する実施態様では、組織は、軟骨、滑膜、半月板、腱、腹膜、心膜、および胸膜よりなる群から選択される。本発明の本方法のさらに関連する実施態様では、方法は、麻酔薬を被験体に提供すること；抗炎症薬を被験体に提供すること；抗生物質を被験体に提供すること；被験体から液体を吸引すること；被験体の組織を洗浄すること；および被験体の組織を画像化することよりなる群から選択される工程をさらに含んでなる。他の関連する実施態様では、被験体は、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウマおよびヒトよりなる群から選択される。
他の実施態様では、本発明はまた、組換えルブリシン蛋白をコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを提供し、ここで、ポリヌクレオチドは発現制御配列に操作可能に連結される。関連する実施態様では、本発明は、発現ベクターで形質転換された細胞を液体培養培地において増殖させること；および培地から組換えルブリシン蛋白を回収することを含んでなる、組換えルブリシン蛋白を産生させる方法を提供する。蛋白を回収する工程は：膜を介して培地をろ過することによって、蛋白を濃縮すること；膜から保持された蛋白を回収すること；および０．１〜２．０Ｍの濃度の範囲でＬ−アルギニン塩酸塩を含有する緩衝生理食塩水に、回収された蛋白を溶解することをさらに含んでなる。
別の関連する実施態様では、本発明は、組換えルブリシン蛋白に特異的な単離された抗体を提供する。
本発明の特徴および利点は、以下のその好適な実施態様の説明、および特許請求の範囲から明らかになろう。
組換えルブリシン蛋白を作製するのに利用される塩基ＤＮＡ構築物は、ＰＲＧ４遺伝子のエキソン６の配列５’および３’の変動可能な整列を含むことができる。例えば、塩基ＤＮＡ構築物は、ソマトメジンＢ様ドメイン（エキソン２〜４）またはヘモペキシン様ドメイン（エキソン７〜９）をコードする配列の変動可能な整列を含むことができる。
エキソン６の３’側の多様なエキソン整列を有する塩基ＤＮＡ構築物の実施態様は、個々にエキソン７、８、９、１０、１１、もしくは１２のみ、またはエキソンの２つ組（７および８）、（７および９）、（７および１０）、（７および１１）、（７および１２）、（８および９）、（８および１０）、（８および１１）、（８および１２）、（９および１０）、（９および１１）、（９および１２）、（１０および１１）、（１０および１２）、もしくは（１１および１２）、またはエキソンの３つ組（７、８および９）、（７、８および１０）、（７、８、および１１）、（７、８、および１２）、（７、９および１０）、（７、９および１１）、（７、９および１２）、（７、１０および１１）、（７、１０および１２）、（７、１１および１２）、（８、９および１０）、（８、９および１１）、（８、９および１２）、（８、１０および１１）、（８、１０および１２）、（８、１１および１２）、（９、１０および１１）、（９、１０および１２）、（９、１１および１２）、もしくは（１０、１１および１２）、またはエキソンの４つ組（７、８、９および１０）、（７、８、９および１１）、（７、８、９および１２）、（７、８、１０および１１）、（７、８、１０および１２）、（７、８、１１および１２）、（７、９、１０および１１）、（７、９、１０および１２）、（７、９、１１および１２）、（７、１０、１１および１２）、（８、９、１０および１１）、（８、９、１０および１２）、（８、９、１１および１２）、（８、１０、１１および１２）、もしくは（９、１０、１１および１２）、またはエキソンの５つ組（７、８、９、１０および１１）、（７、８、９、１０および１２）、（７、８、９、１１および１２）、（７、８、１０、１１および１２）、（７、９、１０、１１および１２）、もしくは（８、９、１０、１１および１２）、またはエキソン６つ組（７、８、９、１０、１１および１２）を含む塩基ＤＮＡ構築物を含むことができる。
さらに、エキソン６の５’側の多様なエキソン整列を有する塩基ＤＮＡ構築物の実施態様は、個々にエキソン１、２、３、４、もしくは５のみ、またはエキソンの２つ組（１および２）、（１および３）、（１および４）、（１および５）、（２および３）、（２および４）、（２および５）、（３および４）、（３および５）、もしくは（４および５）、またはエキソンの３つ組（１、２および３）、（１、２および４）、（１、２および５）、（１、３および４）、（１、３および５）、（１、４および５）、（２、３および４）、（２、３および５）、（２、４および５）、もしくは（３、４および５）、またはエキソンの４つ組（１、２、３および４）、（１、２、３および５）、（１、２、４および５）、（１、３、４および５）、もしくは（２、３、４および５）、またはエキソンの５つ組（１、２、３、４および５）を含む塩基ＤＮＡ構築物を含むことができる。
本発明はまた、塩基ＤＮＡ構築物によってコードされる蛋白を包含し、即ち、ここで、エキソン６配列によりコードされるポリペプチドの一部またはすべてが欠失し、合成ｃＤＮＡカセット由来の挿入物によってコードされるアミノ酸は付加されていない。
本発明はまた、本明細書において概略される特定の実施態様に相同であり、例えば、指定されたＤＮＡ配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するポリヌクレオチドを包含する。本発明は、高いストリンジェンシー条件下で指定されたＤＮＡ配列の相補体に対し機能的ドメインの長さにわたってハイブリダイズすることが可能な核酸配列を有するポリヌクレオチドをさらに含む。本発明はまた、これらの相同またはハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる蛋白を含む。
本発明のより明確な実施態様を描写するために、以下の定義が提供される。
定義。語句「反復ＫＥＰＡＰＴＴ様配列」は、（ａ）配列「ＡＰＴＴＰＫＥＰＡＰＴＴＴＫＳＡＰＴＴＰＫＥＰＡＰＴＴＴＫＥＰＡＰＴＴＰＫＥＰＡＰＴＴＴＫ」（配列番号２６；４５アミノ酸）に対し少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有し、かつ少なくとも１つのＯ結合型置換を有する；（ｂ）配列「ＫＥＰＡＰＴＴＴＫＥＰＡＰＴＴＴＫＳＡＰＴＴＰＫＥＰＡＰＴＴＰ」（配列番号２７；３１アミノ酸）に対し少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有し、かつ少なくとも１つのＯ結合型置換を有する；または（ｃ）配列「ＥＰＡＰＴＴＴＫＳＡＰＴＴＰＫＥＰＡＰＴＴＰ」（配列番号２８；２２アミノ酸）に対し少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有し、かつ少なくとも１つのＯ結合型置換を有するアミノ酸配列を意味する。反復ＫＥＰＡＰＴＴ様配列は、好ましくは、２、３、４もしくはそれ以上のＯ結合型置換を有することができる。
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定するための多くの方法が存在する一方、用語「同一性」は当業者に周知であり、所定の指定された方法に関連する規定の意味を有する。本明細書に記載の配列同一性は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／；Ｔａｔｕｓｏｖａ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ（１９９９）もまた参照のこと）を介して利用可能なＢＬＡＳＴ２ＳＥＱＵＥＮＣＥＳツールを使用して測定される。アミノ酸配列では、使用されるパラメータは、ｅｘｐｅｃｔ＝１０００；ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ＝２；ｆｉｌｔｅｒ＝ｏｆｆ；およびデフォルト値に設定された他のパラメータである。これらの同じパラメータは、ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ＝８を除いて、核酸配列について使用される。アミノ酸配列比較のためのデフォルト値は：Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ｏｐｅｎ ｇａｐ＝１１；ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ＝１ペナルティ；およびｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０である。核酸配列比較のためのデフォルト値は：ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ａ ｍａｔｃｈ＝１；ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ａ ｍｉｓｍａｔｃｈ＝２；ｓｔｒａｎｄ ｏｐｔｉｏｎ＝両鎖；ｏｐｅｎ ｇａｐ＝５；ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｇａｐ＝２ペナルティ；およびｇａｐ ｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０である。
組換えルブリシンのＯ結合型置換は、潤滑性オリゴ糖β−（１−３）−Ｇａｌ−ＧａｌＮａｃ、あるいは人工または天然に存在する炭水化物部分（例えば、ケラタン硫酸もしくはコンドロイチン硫酸）を含む他の部分による置換であってもよい。いくつかの実施態様では、Ｏ結合型置換は、組換えルブリシンが界面活性リン脂質（ＳＡＰＬ）または界面活性剤として作用する能力に寄与する部分を伴い得る（Ｈｉｌｌｓ，２００２）。グリコシル化または置換のパーセントは、重量（乾燥重量）によって決定される。
ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションに関して使用される場合、高いストリンジェンシー条件は、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨで７．４に調整されたｐＨ）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬ならびに１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡよりなる溶液における４２℃での結合またはハイブリダイゼーション、続いて、５００ヌクレオチド長のプローブが用いられる場合、０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含んでなる溶液における４２℃で洗浄するのに等価な条件を含んでなる。
本明細書に記載のポリペプチドまたは他の化合物は、それらが少なくとも５０重量％（乾燥重量）の目的の化合物である調製物内にある場合、「単離される」と呼ばれる。本明細書に記載のポリペプチドまたは他の化合物は、それらが少なくとも８０重量％（乾燥重量）の目的の化合物である調製物内にある場合、「実質的に純粋」と呼ばれる。本明細書に記載のポリペプチドまたは他の化合物は、それらが少なくとも９５重量％、好ましくは９９重量％（乾燥重量）の目的の化合物である調製物内にある場合、「相同」と呼ばれる。純度は、還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動および増強されたクマシーブルー染色、続いて、バンドの光学密度とレースによって測定される（即ち、蛋白の純度は光学的デンシトメトリーを介して測定される）。
「パイロジェンフリー」とは、エンドトキシンを含む発熱性混入物を含まないことを意味する。混入物の測定は、連邦食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって設定される適用可能な標準試験によって実施されるべきである。
本明細書において使用される用語「治療有効量」は、意義のある患者の利益、即ち、関連の医学的病態の処置、治癒、防止もしくは改善、またはそのような病態の処置、治癒、防止もしくは改善の割合の増加を示すのに十分である関連の薬学的組成物または方法の各活性成分の合計量を意味する。単独で投与される個々の有効成分に適用される場合、用語は該単独の成分を指す。組み合わせに適用される場合、用語は、組み合わせで、連続的にまたは同時に投与されるかどうかにかかわらず、治療効果を生じる有効成分の組み合わされた量を指す。
本発明の実施態様は、関節内助剤として使用してもよい。ルブリシンから誘導されない化合物による関節内補充が、関節部の治療として実践されている。例えば、高分子ヒアルロナン（ＨＡ）およびより高い分子量のヒラン（ｈｙｌａｎ）（例えば、ＷＹＥＴＨ（登録商標）ファーマシューティカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）より配布されているＳＹＮＶＩＳＣ（登録商標）粘弾性液体「ＨｙｌａｎＧ−Ｆ２０」）による「粘性補充」は、ＯＡ関連膝痛を処置するために臨床的に使用される。この粘性補充は、特に患者の荷重痛を減少することにおいて重要な臨床的価値を示す（Ｗｏｂｉｇら、１９９８）。
ＨｙｌａｎＧ−Ｆ２０は、雄鶏またはニワトリの鶏冠から得られるいくらかのＨＡ分子を架橋することによって作製される。ＨｙｌａｎＧ−Ｆ２０での粘性補充は、より低い分子量のＨＡによる粘性補充よりも痛みを軽減するのにより有意に有効であり得る（Ｗｏｂｉｇら、１９９９）。さらに、ＨｙｌａｎＧ−Ｆ２０での粘性補充による痛みを軽減することは、ＮＳＡＩＤに忍容性を示さない患者のためのＮＳＡＩＤの投与に特に好適であり得る（例えば、高リスクの胃腸合併症を伴う患者において；Ｅｓｐａｌｌａｒｇｕｅｓ ａｎｄ Ｐｏｎｓ，２００３）。ＨｙｌａｎＧ−Ｆ２０粘性補充は関節部の摩擦を改善しながら痛みの症状において短期間（即ち、処置後３〜６箇月まで）の減少を提供する安全かつ忍容性の高い治療法であるが、該治療法はＯＡ患者の膝置換の終局的必要性を顕著に抑制するとは言えない（Ｅｓｐａｌｌａｒｇｕｅｓ ａｎｄ Ｐｏｎｓ，２００３）。
実施例１：組換えルブリシンのクローニング
構築物。いくつかの実施態様では、組換えルブリシン分子の作製のための塩基ＤＮＡ構築物は、配列番号６のＭｅｔコドン（ＡＴＧ）〜ＢｓｓＨＩＩ制限部位（Ｇ＾ＣＧＣＧＣ）（即ち、塩基番号１〜１１２３）および配列番号６のＢｓｐＥＩ制限部位（Ｔ＾ＣＣＧＧＡ）〜終止コドン（ＴＡＡ）（即ち、塩基番号１２６９〜２９４６）よりなる。これらの配列、即ち、配列番号６の塩基番号１〜１１２３および１２６９〜２９４６は、生来の全長ルブリシン（即ち、ＰＲＧ４）のアミノ酸Ｍ１〜Ｓ３７３（エキソン１〜５およびエキソン６の約１７４フランキング５’コドンによりコードされる）ならびにＥ８４８〜Ｐ１４０４（エキソン６の約２９３フランキング３’コドンおよびエキソン７〜１４によりコードされる）をコードする。塩基ＤＮＡ構築物には存在しないエキソン６の部分は、生来のＰＲＧ４のアミノ酸Ａ３７４〜Ｐ８４７（エキソン６によりコードされる約９４０アミノ酸には存在しない４７４アミノ酸）をコードするＤＮＡ配列に対応する。この存在してないアミノ酸配列には、ＫＥＰＡＰＴＴ様配列が豊富に存在する。
構築物。いくつかの実施態様では、組換えルブリシン分子の作製のための塩基ＤＮＡ構築物は、配列番号６のＭｅｔコドン（ＡＴＧ）〜ＢｓｓＨＩＩ制限部位（Ｇ＾ＣＧＣＧＣ）（即ち、塩基番号１〜１１２３）および配列番号６のＢｓｐＥＩ制限部位（Ｔ＾ＣＣＧＧＡ）〜終止コドン（ＴＡＡ）（即ち、塩基番号１２６９〜２９４６）よりなる。これらの配列、即ち、配列番号６の塩基番号１〜１１２３および１２６９〜２９４６は、生来の全長ルブリシン（即ち、ＰＲＧ４）のアミノ酸Ｍ１〜Ｓ３７３（エキソン１〜５およびエキソン６の約１７４フランキング５’コドンによりコードされる）ならびにＥ８４８〜Ｐ１４０４（エキソン６の約２９３フランキング３’コドンおよびエキソン７〜１４によりコードされる）をコードする。塩基ＤＮＡ構築物には存在しないエキソン６の部分は、生来のＰＲＧ４のアミノ酸Ａ３７４〜Ｐ８４７（エキソン６によりコードされる約９４０アミノ酸には存在しない４７４アミノ酸）をコードするＤＮＡ配列に対応する。この存在してないアミノ酸配列には、ＫＥＰＡＰＴＴ様配列が豊富に存在する。
合成ｃＤＮＡカセット１のＤＮＡ配列（配列番号１）は、塩基構築物にＢｓｓＨＩＩ／ＢｓｐＥＩで付加され、組換えＰＲＧ４−Ｌｕｂ：１ｃＤＮＡ構築物（配列番号６）が作製される。配列番号６は、生来のＰＲＧ４のアミノ酸Ｍ１〜Ｓ３７３をコードするＤＮＡとＥ８４８〜Ｐ１４０４をコードするＤＮＡとの間のＬｕｂ：１ＤＮＡ挿入物（配列番号８；その４ＫＥＰＡＰＴＴ配列を伴う配列番号９の５１アミノ酸をコードする）よりなる。言い換えれば、生来のＰＲＧ４のＡ３７４〜Ｐ８４７（４７４アミノ酸）の代わりに、組換えルブリシンＰＲＧ４−ＬＵＢ：１は、４つの完全なＫＥＰＡＰＴＴ配列および約３つの不完全なＫＥＰＡＰＴＴ配列を形成する５１アミノ酸を含む。
合成ｃＤＮＡカセット２のＤＮＡ配列（配列番号３）は、ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：１構築物にＢｓｕ３６Ｉ／ＢｓｐＥＩで付加され、ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：２ｃＤＮＡ構築物（配列番号１０）が作製される。ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：１ｃＤＮＡ構築物は、１つのＢｓｕ３６Ｉ制限部位（ＣＣ＾ＴＮＡＧＧ、即ち、ＣＣ＾ＴＡＡＧＧ；配列番号６の塩基番号１２２５〜１２３１）を有する。合成ｃＤＮＡカセット２がＰＲＧ４−Ｌｕｂ：１ｃＤＮＡ構築物に付加される場合、このＢｓｕ３６Ｉ部位は破壊されるが、合成カセット２は別の内部Ｂｓｕ３６Ｉ制限部位（ＣＣ＾ＴＮＡＧＧ、即ち、ＣＣ＾ＴＡＡＧＧ；配列番号３の塩基番号９２〜９８）を含有する。従って、ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：Ｎ＋１構築物は、合成ｃＤＮＡカセット２を、合成ｃＤＮＡカセット２により提供されるこの内部Ｂｓｕ３６Ｉ制限部位において先のＰＲＧ４−Ｌｕｂ：Ｎ構築物にＢｓｕ３６Ｉ／ＢｓｐＥＩで付加することによって作製することができる。
ｃＤＮＡカセットを一本鎖オリゴヌクレオチドとして合成し、共にハイブリダイズさせて、粘着末端を伴う二本鎖ＤＮＡフラグメントを生成する。これが、末端のＢｓｓＨＩＩ、Ｂｓｕ３６Ｉ、およびＢｓｐＥＩ部位が不完全であると思われる理由である。合成ｃＤＮＡカセット１（配列番号１）では、残存するフランキングＢｓｓＨＩＩ（Ｇ＾ＣＧＣＧＣ）およびＢｓｐＥＩ（Ｔ＾ＣＣＧＧＡ）制限部位が結合する配列は、内部Ｂｓｕ３６Ｉ制限部位（ＣＣ＾ＴＮＡＧＧ、即ち、ＣＣ＾ＴＡＡＧＧ）を含み；制限部位に下線を付して以下に示す：
ＣＧＣＧＣＣＣＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＡＡＧＡＧＣＣＣＧＣＡＣＣＴＡＣＣＡＣＧＡＣＡＡＡＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＣＡＡＡＧＡＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＡＣＴＡＣＴＡＡＡＧＡＡＣＣＧＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＴＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＣＣＧＧ
ＣＧＣＧＣＣＣＡＣＡＡＣＴＣＣＡＡＡＡＧＡＧＣＣＣＧＣＡＣＣＴＡＣＣＡＣＧＡＣＡＡＡＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＡＣＴＡＣＧＣＣＣＡＡＡＧＡＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＡＣＧＡＣＴＡＣＴＡＡＡＧＡＡＣＣＧＧＣＡＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＴＡＡＧＧＡＧＣＣＡＧＣＴＣＣＴＡＣＴＡＣＡＡＣＧＡＡＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＣＣＧＧ
配列番号１の翻訳である配列番号２は、完全一致である４つのＫＥＰＡＰＴＴ配列を含む（以下に強調した）：
合成ｃＤＮＡカセット２（配列番号３）も同様に、残存する５’末端Ｂｓｕ３６Ｉ制限部位（即ち、ＣＣ＾ＴＮＡＧＧ、ＴＡＡ配列によってのみ照明される）、３’末端の残存するＢｓｐＥＩ制限部位（Ｔ＾ＣＣＧＧＡ）、および内部Ｂｓｕ３６Ｉ制限部位（ＣＣ＾ＴＮＡＧＧ）を有し；制限部位に下線を付して以下に示す：
ＴＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＴＡＣＧＡＣＡＡＡＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＡＧＡＧＣＧＣＡＣＣＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＧＡＧＣＣＧＧＣＣＣＣＴＡＣＧＡＣＴＣＣＴＡＡＧＧＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＣＣＧＧ
ＴＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＴＡＣＧＡＣＡＡＡＧＧＡＧＣＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＡＧＡＧＣＧＣＡＣＣＣＡＣＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＧＡＧＣＣＧＧＣＣＣＣＴＡＣＧＡＣＴＣＣＴＡＡＧＧＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＣＡＣＴＣＣＧＧ
配列番号３の翻訳である配列番号４は、完全一致である３つのＫＥＰＡＰＴＴ配列を含む（以下に強調した）：
ｐＴｍｅｄ２ベクターにおける組換えＰＲＧ４−Ｌｕｂ：１ｃＤＮＡ構築物（配列番号６）（構築物＋ベクターは配列番号５に等しい）は、ＳａｌＩ（Ｇ＾ＴＣＧＡＣ；配列番号５の塩基番号１０２７〜１０３２）およびＮｏｔＩ（ＧＣ＾ＧＧＣＣＧＣ；配列番号５の塩基番号３９８４〜３９９１）制限部位によって隣接される。ＳａｌＩ部位は、翻訳開始コドンＡＴＧ（配列番号５の塩基番号１０３８〜１０４０）の前に、改変されたＫｏｚａｋ翻訳開始配列（ＣＣＣＡＣＣ；配列番号５の塩基番号１０３２〜１０３７）を組み入れる。ＢｓｓＨＩＩ（Ｇ＾ＣＧＣＧＣ；配列番号５の塩基番号２１５５〜２１６０）とＢｓｐＥＩ（Ｔ＾ＣＣＧＧＡ；配列番号５の塩基番号２３０６〜２３１１）制限部位との間には、内部Ｂｓｕ３６Ｉクローニング部位（ＣＣ＾ＴＮＡＧＧ、即ち、ＣＣ＾ＴＡＡＧＧ；配列番号５の塩基番号２２６２〜２２６８）が見出される。
ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：１ｃＤＮＡ構築物（配列番号６）は、ＰＲＧ４−ＬＵＢ：１蛋白（配列番号７）に翻訳される。ＰＲＧ４−ＬＵＢ：１蛋白全体（配列番号７）のＳ３７３とＥ４２５（即ち、生来のＰＲＧ４のＥ８４８）との間の挿入物は、配列番号９の５１アミノ酸である。これらは、Ｌｕｂ：１ＤＮＡ挿入物（配列番号８）から翻訳され、４つの完全なＫＥＰＡＰＴＴ配列を含む。ＢｓｓＨＩＩ制限部位（Ｇ＾ＣＧＣＧＣ；配列番号６の塩基番号１１１８〜１１２３）とＢｓｐＥＩ制限部位（Ｔ＾ＣＣＧＧＡ；配列番号６の塩基番号１２６９〜１２７４）制限部位との間には、内部Ｂｓｕ３６Ｉクローニング部位（ＣＣ＾ＴＮＡＧＧ、即ち、ＣＣ＾ＴＡＡＧＧ；配列番号６の塩基番号１２２５〜１２３１）が見出される。
ｐＴｍｅｄ２ベクターにおける組換えＰＲＧ４−Ｌｕｂ：１構築物に関して、ｐＴｍｅｄ２ベクターにおける組換えＰＲＧ４−Ｌｕｂ：２ｃＤＮＡ構築物（配列番号１０）は、ＳａｌＩ（Ｇ＾ＴＣＧＡＣ）およびＮｏｔＩ（ＧＣ＾ＧＧＣＣＧＣ）制限部位によって隣接され；ＳａｌＩ部位は、翻訳開始コドンＡＴＧ（配列番号１０の塩基番号１〜３）の前に改変されたＫｏｚａｋ翻訳開始配列（ＣＣＣＡＣＣ）を組み入れる。同様に、ｐＴｍｅｄ２ベクターにおける組換えＰＲＧ４−Ｌｕｂ：３ｃＤＮＡ構築物（配列番号１４）、組換えＰＲＧ４−Ｌｕｂ：４ｃＤＮＡ構築物（配列番号１８）、および組換えＰＲＧ４−Ｌｕｂ：５ｃＤＮＡ構築物（配列番号２２）は、それぞれ、ＳａｌＩ（Ｇ＾ＴＣＧＡＣ）およびＮｏｔＩ（ＧＣ＾ＧＧＣＣＧＣ）制限部位により隣接され；ＳａｌＩ部位は、翻訳開始コドンＡＴＧ（それぞれ、配列番号１４、１８、および２２の塩基番号１〜３）の前に改変されたＫｏｚａｋ翻訳開始配列（ＣＣＣＡＣＣ）を組み入れる。
ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：２ｃＤＮＡ構築物内では、内部Ｂｓｕ３６Ｉクローニング部位（ＣＣ＾ＴＮＡＧＧ、即ち、ＣＣ＾ＴＡＡＧＧ；配列番号１０の塩基番号１３１８〜１３２４）が、ＢｓｓＨＩＩ（Ｇ＾ＣＧＣＧＣ；塩基番号１１１８〜１１２３）とＢｓｐＥＩ（Ｔ＾ＣＣＧＧＡ；塩基番号１３４７〜１３５２）制限部位との間に見出される。ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：２構築物（配列番号１０）は、ＰＲＧ４−ＬＵＢ：２蛋白（配列番号１１）に翻訳される。ＰＲＧ４−ＬＵＢ：２蛋白全体（配列番号１１）のＳ３７３とＥ４５１（即ち、生来のＰＲＧ４のＥ８４８）との間の挿入物は、配列番号１３の７７アミノ酸である。これらは、Ｌｕｂ：２ＤＮＡ挿入物（配列番号１２）から翻訳される。生来のＰＲＧ４のＡ３７４〜Ｐ８４７（４７４アミノ酸）の代わりに、組換えルブリシンＰＲＧ４−ＬＵＢ：２の７７アミノ酸は、６つの完全なＫＥＰＡＰＴＴ配列および約４つの不完全なＫＥＰＡＰＴＴ配列を形成する。
ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：３ｃＤＮＡ構築物内では、内部Ｂｓｕ３６Ｉクローニング部位（ＣＣ＾ＴＮＡＧＧ、即ち、ＣＣ＾ＴＡＡＧＧ；配列番号１４の塩基番号１４１１〜１４１７）が、ＢｓｓＨＩＩ（Ｇ＾ＣＧＣＧＣ；塩基番号１１１８〜１１２３）とＢｓｐＥＩ（Ｔ＾ＣＣＧＧＡ；塩基番号１４４０〜１４４５）制限部位との間に見出される。ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：３構築物（配列番号１４）は、ＰＲＧ４−ＬＵＢ：３蛋白（配列番号１５）に翻訳される。ＰＲＧ４−ＬＵＢ：３蛋白全体（配列番号１５）のＳ３７３とＥ４８２（即ち、生来のＰＲＧ４のＥ８４８）との間の挿入物は、配列番号１７の１０８アミノ酸である。これらは、Ｌｕｂ：３ＤＮＡ挿入物（配列番号１６）から翻訳される。生来のＰＲＧ４のＡ３７４〜Ｐ８４７（４７４アミノ酸）の代わりに、組換えルブリシンＰＲＧ４−ＬＵＢ：３の１０８アミノ酸は、９つの完全なＫＥＰＡＰＴＴ配列および約５つの不完全なＫＥＰＡＰＴＴ配列を形成する。
ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：４ｃＤＮＡ構築物内では、内部Ｂｓｕ３６Ｉクローニング部位（ＣＣ＾ＴＮＡＧＧ、即ち、ＣＣ＾ＴＡＡＧＧ；配列番号１８の塩基番号１５０４〜１５１０）が、ＢｓｓＨＩＩ（Ｇ＾ＣＧＣＧＣ；塩基番号１１１８〜１１２３）とＢｓｐＥＩ（Ｔ＾ＣＣＧＧＡ；塩基番号１５３３〜１５３８）制限部位との間に見出される。ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：４構築物（配列番号１８）は、ＰＲＧ４−ＬＵＢ：４蛋白（配列番号１９）に翻訳される。ＰＲＧ４−ＬＵＢ：４蛋白全体（配列番号１９）のＳ３７３とＥ５１３（即ち、生来のＰＲＧ４のＥ８４８）との間の挿入物は、配列番号２１の１３９アミノ酸である。これらは、Ｌｕｂ：４ＤＮＡ挿入物（配列番号２０）から翻訳される。生来のＰＲＧ４のＡ３７４〜Ｐ８４７（４７４アミノ酸）の代わりに、組換えルブリシンＰＲＧ４−ＬＵＢ：４の１３９アミノ酸は、１２つの完全なＫＥＰＡＰＴＴ配列および約６つの不完全なＫＥＰＡＰＴＴ配列を形成する。
ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：５ｃＤＮＡ構築物内では、内部Ｂｓｕ３６Ｉクローニング部位（ＣＣ＾ＴＮＡＧＧ、即ち、ＣＣ＾ＴＡＡＧＧ；配列番号２２の塩基番号１５９７〜１６０３）が、ＢｓｓＨＩＩ（Ｇ＾ＣＧＣＧＣ；塩基番号１１１８〜１１２３）とＢｓｐＥＩ（Ｔ＾ＣＣＧＧＡ；塩基番号１６２６〜１６３１）制限部位との間に見出される。ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：５構築物（配列番号２２）は、ＰＲＧ４−ＬＵＢ：５蛋白（配列番号２３）に翻訳される。ＰＲＧ４−ＬＵＢ：５蛋白全体（配列番号２３）のＳ３７３とＥ５４４（即ち、生来のＰＲＧ４のＥ８４８）との間の挿入物は、配列番号２５の１７０アミノ酸である。これらは、Ｌｕｂ：５ＤＮＡ挿入物（配列番号２４）から翻訳される。生来のＰＲＧ４のＡ３７４〜Ｐ８４７（４７４アミノ酸）の代わりに、組換えルブリシンＰＲＧ４−ＬＵＢ：５の１７０アミノ酸は、１５つの完全なＫＥＰＡＰＴＴ配列および約７つの不完全なＫＥＰＡＰＴＴ配列を形成する。
重要なことに、合成ｃＤＮＡカセット２を挿入するプロセスは、不確定に反復され得る。それぞれの反復により、３つの完全なＫＥＰＡＰＴＴ配列の付加が生じる。挿入配列の使用を介するこの様式で組換えルブリシンＰＲＧ４−ＬＵＢ：２〜ＰＲＧ４−ＬＵＢ：５が構築されるように、組換えルブリシンＰＲＧ４−ＬＵＢ：６〜ＰＲＧ４−ＬＵＢ：Ｎが構築される。表２は、ＢｓｓＨＩＩ／ＢｓｐＥ１挿入配列の概要を提供する。
本発明者らは、すべての１２エキソン（エキソン６の中央部分を欠く）を含有する全長ＰＲＧ４により塩基ＤＮＡ構築物を例示してきたが、所望される多様な活性および長さに依存して、ＰＲＧ４のスプライス変異体を用いてもよい。さらに、異なる制限酵素を類似のストラテジーにおいて用いてもよいが、但し、それらの局在は、ＰＲＧ４蛋白をコードする核酸配列内に適宜局在する。他の実施態様では、塩基ＤＮＡ構築物は生来のエキソン６配列を欠くが、生来のＰＲＧ４遺伝子のエキソン１〜エキソン５配列またはエキソン７〜エキソン１２配列の１つもしくはそれ以上を含む。他の実施態様では、塩基ＤＮＡ構築物は、エキソン６の配列の一部もしくはすべてが存在しないことを除いて、米国特許第６４３３１４２号明細書または米国公開特許第２００２０１３７８９４号明細書に記載の組換えＭＳＦ配列に同一である。
本発明は、好適な実施態様として、真核生物の発現ベクターｐＴｍｅｄ２のＳａｌＩ（Ｇ＾ＴＣＧＡＣ；配列番号５の塩基番号１０２７〜１０３２）およびＮｏｔＩ（ＧＣ＾ＧＧＣＣＧＣ；配列番号５の塩基番号３９８４〜３９９１）制限部位にクローニングされる組換えルブリシンをコードするｃＤＮＡ構築物（例えば、ｐＴｍｅｄ２発現ベクターにおける組換えＰＲＧ４−Ｌｕｂ：１ｃＤＮＡ構築物は配列番号５において塩基番号１０３８〜３９８３に局在する）を提供する。ＳａｌＩ部位は、メチオニン開始コドン（ＡＴＧ；配列番号５の塩基番号１０３８〜１０４０）の前に、改変されたＫｏｚａｋ翻訳開始配列の最初の塩基（ＣＣＣＡＣＣ；配列番号５の塩基番号１０３２）を組み入れる。本発明の他の実施態様は、他の制限部位の組み合わせおよび他の発現ベクターを含む。
好適な実施態様では、反復（ｉｎｔｅｒａｔｉｖｅ）プロセスは、ＢｓｓＨＩＩ（Ｇ＾ＣＧＣＧＣ）およびＢｓｐＥＩ（Ｔ＾ＣＣＧＧＡ）のための制限部位により隣接される発現ベクターｐＴｍｅｄ２における合成ｃＤＮＡカセット１（配列番号１）、および内部Ｂｓｕ３６Ｉ制限部位（ＣＣ＾ＴＮＡＧＧ、即ち、ＣＣ＾ＴＡＡＧＧ；配列番号１の塩基番号１０７〜１１３）を含む合成ｃＤＮＡカセット１を利用する。この好適な実施態様においてＫＥＰＡＰＴＴ様配列を含有する組換えルブリシン構築物の反復作製のために、組換え構築物のＢｓｕ３６ＩおよびＢｓｐＥＩ部位の間に合成ｃＤＮＡカセット２（配列番号３）が挿入される。合成ｃＤＮＡカセット２（配列番号３）は、改変された残存するＢｓｕ３６Ｉ部位（ＴＡＡＡＧ）および残存するＢｓｐＥＩ（ＡＣＴＣＣＧＧ）部位により隣接される。それはまた、内部Ｂｓｕ３６Ｉ部位（ＣＣ＾ＴＮＡＧＧ、即ち、ＣＣ＾ＴＡＡＧＧ；配列番号３の塩基番号９２〜９８）を含む。合成ｃＤＮＡカセット２を組換えルブリシン構築物のＢｓｕ３６ＩおよびＢｓｐＥＩ部位にクローニングするときに、本来の構築物のＢｓｕ３６Ｉクローニング部位は破壊され、新たな構築物において１つの独特なＢｓｕ３６Ｉクローニング部位が残る。
この好適な実施態様では、アミノ酸配列「ＡＰＴＴＰＫＥＰＡＰＴＴＴＫＳＡＰＴＴＰＫＥＰＡＰＴＴＴＫＥＰＡＰＴＴＰＫＥＰＡＰＴＴＴＫ」（配列番号２６；４５アミノ酸）は、各ＰＲＧ４−ＬＵＢ：Ｎ蛋白（ここで、Ｎ＝１もしくはそれ以上の整数）の部分を保持する。さらに、アミノ酸配列「ＫＥＰＡＰＴＴＴＫＥＰＡＰＴＴＴＫＳＡＰＴＴＰＫＥＰＡＰＴＴＰ」（配列番号２７；３１アミノ酸）は、合成ｃＤＮＡカセット２のＰＲＧ４−Ｌｕｂ：ＮｃＤＮＡ構築物へのＢｓｕ３６Ｉ／ＢｓｐＥＩでの付加を介して各ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：Ｎ＋１ｃＤＮＡ構築物の部分となるＤＮＡ挿入物によってコードされる。ＰＲＧ４−ＬＵＢ：Ｎ蛋白（ここで、Ｎは３を超えるかまたは等しい整数である）については、好適な実施態様において、アミノ酸配列「ＥＰＡＰＴＴＴＫＳＡＰＴＴＰＫＥＰＡＰＴＴＰ」（配列番号２８；２２アミノ酸）は、配列番号２６を配列番号２７の（Ｎ−２）リピートに接続する。さらに、ＰＲＧ４−ＬＵＢ：Ｎ蛋白（ここで、Ｎは２を超えるかまたは等しい整数である）の好適な実施態様では、アミノ酸配列「ＫＥＰＫＰＡＰＴＴＰ」（配列番号２９；１０アミノ酸）は、配列番号２７の最後の挿入リピートのすぐ後に続く。
それらは少なくとも２つのＫＥＰＡＰＴＴ配列を形成するため、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８は、本明細書において、「反復ＫＥＰＡＰＴＴ様配列」と称される（配列番号２８がＰＲＧ４−ＬＵＢ：Ｎ蛋白において２つのＫＥＰＡＰＴＴ配列を形成するように、配列番号２８のＮ末端はＫ残基に連結する）。
従って、組換えルブリシン蛋白ＰＲＧ４−ＬＵＢ：Ｎ（ここで、Ｎは１もしくはそれ以上の整数に等しい）について、ＰＲＧ４−ＬＵＢ：Ｎ蛋白は、好適な実施態様において、配列番号２６を含んでなる。さらに、組換えルブリシン蛋白ＰＲＧ４−ＬＵＢ：Ｎ（ここで、Ｎは２もしくはそれ以上の整数に等しい）について、ＰＲＧ４−ＬＵＢ：Ｎ蛋白は、好適な実施態様において、配列番号２７を含んでなる。配列番号２７は、これらの好適な実施態様において、各ＰＲＧ４−ＬＵＢ：Ｎ蛋白内で（Ｎ−１）回反復される。ＰＲＧ４−ＬＵＢ：２において、配列番号２６および配列番号２７は重複する（即ち、それらはＫＥＰＡＰＴＴ配列を共有する）。
Ｎは３を超えるかまたは等しい整数である他の好適な実施態様では（例えば、ここで、Ｎは３〜２００の整数に等しい、あるいはより好適な実施態様では、Ｎは５〜５０の整数に等しい、あるいはさらにより好適な実施態様では、Ｎは１０〜３０の整数に等しい）、組換えルブリシン蛋白は、配列番号２６のＮ末端に配向された４５アミノ酸を配列番号２７の３１アミノ酸の（Ｎ−２）リピートに接続する配列番号２８の２２アミノ酸を含んでなり、ここで、配列番号２９の１０アミノ酸は配列番号２７の最後の３１アミノ酸リピートに対するＣ末端である。
ＰＲＧ４−ＬＵＢ：Ｎ蛋白は、一般に、好適な実施態様において、ＫＥＰＡＰＴＴ配列の（Ｎの３倍）リピートを有し、ここで、Ｎは反復ＫＥＰＡＰＴＴ様配列の数に等しい。組換えルブリシンＰＲＧ４−ＬＵＢ：５（好適な実施態様において３×Ｎ＝３×５＝１５コピーのＫＥＰＡＰＴＴ配列を有する）は、最も大きな組換えルブリシンＰＲＧ４−ＬＵＢ：Ｎであり、その配列を本明細書において詳述する。しかし、本発明の組換えルブリシンについて、数値Ｎは、５を超えてもよく、例えば、７、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００もしくはそれ以上である。
特に、蛋白ＰＲＧ４−ＬＵＢ：１、ＰＲＧ４−ＬＵＢ：２、ＰＲＧ４−ＬＵＢ：３、ＰＲＧ４−ＬＵＢ：４、およびＰＲＧ４−ＬＵＢ：５は、それぞれ４、６、９、１２および１５の完全なＫＥＰＡＰＴＴ配列と共に本明細書において詳述する。しかし、本明細書において記載の反復Ｌｕｂ：Ｎ挿入手順を継続することによって、増加数のＫＥＰＡＰＴＴ配列を追加することが可能である。小さな蛋白ほど合成および操作が容易であるため、本発明者らは、生来のＰＲＧ４／ルブリシン蛋白と比較して相対的に低い数のＫＥＰＡＰＴＴまたはＫＥＰＡＰＴＴ様配列を伴うＰＲＧ４−ＬＵＢ：Ｎ組換えルブリシンに関する詳細な説明を提供している。
また、生来のＰＲＧ４蛋白において認められる数よりもＫＥＰＡＰＴＴ様配列の数を増加することを所望してもよい。このことは、組換えルブリシンＰＲＧ４−ＬＵＢ：Ｎ蛋白において７８を超えるＫＥＰＡＰＴＴ様配列が存在するように本明細書に記載の反復Ｌｕｂ：Ｎ挿入手順を継続するか、またはＰＲＧ４ ｃＤＮＡのエキソン６欠失もしくはエキソン６減少バージョンではなく、無傷なＰＲＧ４ ｃＤＮＡから開始することによって、達成することができる。従って、添加される任意のＫＥＰＡＰＴＴ様配列は、生来のＰＲＧ４蛋白において見出される数よりも多い。無傷なＰＲＧ４ｃＤＮＡからのより大きな組換えルブリシン蛋白の作製に使用される挿入手順、ならびにＰＲＧ４ｃＤＮＡのエキソン６欠失またはエキソン６減少バージョンを使用する挿入手順も本発明に包含される。
実施例２：「ＬＵＢ」蛋白の発現および精製
ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：１ｃＤＮＡ構築物（配列番号６；合成ｃＤＮＡカセット１配列を含有する）を、以下のように、安定にトランスフェクトされた前適応ＣＨＯ ＤＵＫＸ細胞系統において発現させ、順化培地から精製し、５００ｍＭ Ｌ−アルギニン塩酸塩を含有するＰＢＳに溶解した。
ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：１ｃＤＮＡ構築物（配列番号６；合成ｃＤＮＡカセット１配列を含有する）を、以下のように、安定にトランスフェクトされた前適応ＣＨＯ ＤＵＫＸ細胞系統において発現させ、順化培地から精製し、５００ｍＭ Ｌ−アルギニン塩酸塩を含有するＰＢＳに溶解した。
ＰＲＧ４−Ｌｕｂ：１ｃＤＮＡ構築物を、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ ＤＵＫＸ細胞系統において発現させ、順化培地を回収した。この順化培地の２リットルの容積を、圧縮窒素ガス（４０ｐｓｉ）下、１０ｋＤａの見かけの分子量限界（ＮＭＷＬ）、３０ｋＤａ ＮＭＷＬまたは１００ｋＤａ ＮＭＷＬ ＰＡＬＬ ＦＩＬＴＲＯＮ（登録商標）ＯＭＥＧＡＴＭディスク膜のいずれかを具備するＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｍ２０００ＴＭろ過ユニットを使用して、フィルター濃縮した。培地を約１００ｍｌの容積に濃縮し、ディスク膜から吸引した。次いで、ディスク膜をＡＭＩＣＯＮ（登録商標）Ｍ２０００ＴＭろ過ユニットから取り出した。ディスク膜の表面に蓄積した「粘液性」保持物をセルスクレーバーを使用して回収し、マイクロ遠心チューブに移した。マイクロ遠心チューブ内のサンプルを１２，０００×ｇで１０分間、遠心分離し、水性上清を取り出した。残留する「ルブリシン富化」ペレットを、５００ｍＭ Ｌ−アルギニン塩酸塩を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。Ｌ−アルギニン塩酸塩濃度は、１００ｍＭ〜２．０Ｍの範囲であり得る。
上記の手順を使用して、ＰＲＧ４−ＬＵＢ：２〜ＰＲＧ４−ＬＵＢ：５糖蛋白（およびＰＲＧ４−ＬＵＢ：Ｎ蛋白、ここで、Ｎ＝６もしくはそれ以上の負でない整数、ならびにＫＥＰＡＰＴＴ様配列を含有する他の糖蛋白）を、ディスク膜から直接回収し、即ち、上記のディスク膜に残留する濃縮物の精製を伴わない。即ち、これらの組換えルブリシン糖蛋白は、１０ｋＤａ ＮＭＷＬ、３０ｋＤａ ＮＭＷＬ、または１００ｋＤａ ＮＭＷＬ ＰＡＬＬ ＦＩＬＴＲＯＮ（登録商標）ＯＭＥＧＡＴＭろ過ユニットのディスク膜から直接単離される。場合によって、これらの糖蛋白はまた、クロマトグラフィー技術もしくは電気泳動技術または両方を介して、上記のディスク膜に残留する濃縮物から精製してもよい。組換えルブリシン蛋白ならびに糖蛋白はまた、クロマトグラフィーおよび他の当該分野において公知の技術（例えば、ＭＳＦ蛋白についての米国特許第６４３３１４２号明細書に記載の通り；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，１９９０；およびＳｃｏｐｅｓ，１９９４も参照のこと）を使用して精製してもよい。
実施例３：免疫組織化学
正常および骨関節炎関節部におけるルブリシンの細胞供給源について、免疫組織化学技術を使用して調べた。さらに、胸膜、心膜、腹膜、および髄膜を含む他の組織表面上のルブリシンの存在を、以下の方法に従って調べた。
正常および骨関節炎関節部におけるルブリシンの細胞供給源について、免疫組織化学技術を使用して調べた。さらに、胸膜、心膜、腹膜、および髄膜を含む他の組織表面上のルブリシンの存在を、以下の方法に従って調べた。
骨関節炎の軟骨および滑膜は、膝置換術を経験した患者のインフォームドコンセントによって得た。調べた他の組織は、正常なヒト滑膜ならびに正常非ヒト霊長類（ＮＨＰ）滑膜、軟骨、胸膜、心膜、腹膜、髄膜、脳、腱、および靭帯、ならびにイヌ正常ならびに骨関節炎半月板、軟骨、滑膜、靭帯、および腱であった。組織は、回収直後または補足のモネンシン（５μＭ）を伴うおよび伴わない培地における２４時間のインキュベーション後に４％パラホルムアルデヒドに固定化した。免疫組織化学的研究のために、組織を、２４時間、４％パラホルムアルデヒドにおいて固定化し、６〜８ミクロンのパラフィン切片を得た。化合物を凍結する光干渉断層撮影（ＯＣＴ）において組織のサブセットを凍結し、５〜１０ミクロン間隔で切断し、続いて、アセトン固定に供した。
免疫組織化学および免疫蛍光分析は、組換えルブリシンの短縮された形態による免疫および蛋白Ａカラム上での精製によって作製される精製されたポリクローナルウサギ抗ヒトルブリシン抗体（Ａｂ ０６Ａ１０）を利用した。ＣＤ１６抗体（ＮＥＯＭＡＲＫＥＲＳ（登録商標）、Ｆｒｅｍｏｎｔカリフォルニア州）を使用して、マクロファージ（Ｆｃｙ受容体ＩＩＩ）を同定した。ＣＤ１０６／ＶＣＡＭ−１抗体（ＮＥＯＭＡＲＫＥＲＳ（登録商標））を使用して、クライオスタット切片内の線維芽細胞を標識した。コントロール切片のために、等価濃度のＲＩｇＧ（ベクターＬＡＢＳＴＭ、カリフォルニア州）、ＭＩｇＧ１（ＤＡＫＯ（登録商標））、およびＭＩｇＧ２ａ（ＤＡＫＯ（登録商標））を一貫して使用した。Ｄｅｘｔｒａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋ＴＭ；ＤＡＫＯ（登録商標））を使用して、結合している抗体を可視化し、メイヤー（Ｍａｙｅｒ）のミョウバン−ヘマトキシリンによって対比染色した。上記の１次抗体を使用して免疫蛍光を実施し、２次抗体（Ａｌｅｘａ Ｄｙｅｓ−ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＢＥＳＴＭ、Ｏｒｅｇｏｎ）５４６ｎｍでのヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ色素および４８８ｎｍでのヤギ抗マウスＡｌｅｘａ色素で探索した。抗体の蛍光結合を、ＮＩＫＯＮ（登録商標）蛍光顕微鏡によって検出した。
ルブリシンを、正常ならびに骨関節炎ヒト関節軟骨および滑膜の表面に沿って検出した。ルブリシンの厚い層は、線維化した骨関節炎表面を完全に被覆していた。ＣＤ１０６免疫蛍光は滑膜の内膜線維芽細胞の強度の細胞膜染色を示し；ルブリシン蛋白もまた、滑膜細胞内の染色として可視化した。ＣＤ１０６＋ルブリシンに対する二重免疫染色は、明らかに、滑膜の内膜線維芽細胞内の同時局在を示した。滑液マクロファージのＣＤ１６染色は、滑膜の層全体のこれらの細胞の存在を実証したが、ルブリシンとの同時局在は認められなかった。
ＮＨＰおよびイヌ関節組織（正常ならびにＯＡ）のルブリシン抗体に夜染色により、滑膜、軟骨、半月板、および腱の表面層を被覆するルブリシンが示された。ＮＨＰ軟骨はまた、糖蛋白の細胞内貯蔵を増加するためのモネンシンの添加を伴わずに、表層細胞だけではなく、移行細胞においても強力な免疫活性を示した。腹膜、心膜、および胸膜を裏打ちする細胞もまた、ルブリシン発現を示したが、髄膜または脳では免疫活性は観察されなかった。
要約すると、正常ならびに骨関節炎の両方の滑膜、腱、半月板および軟骨は、ルブリシンの実質的な層によって被覆されていた。糖蛋白は、ＯＡ関節部内の組織上に明確に存在する。ヒトＯＡ滑膜の二重免疫蛍光染色は、内膜線維芽細胞様滑膜細胞（ｉｎｔｉｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）はルブリシンの合成を担うことを実証した。
関節部組織以外のルブリシン蛋白の局在については、これまで記載されていなかった。ルブリシンの表層は、肺胸膜、心膜、および腹膜上で明確に実証された。ルブリシンは滑膜関節部内で潤滑機能を有すると評価されているが、他の組織における潤滑および抗癒着機能を含むがこれらに限定されない複数の役割を有し得る。ルブリシンによるこれらの他の組織の補充は、本発明に包含される生物学的治療である。
実施例４：機械的潤滑剤としての組換えルブリシン
組換えルブリシンは、一般に、例えば、シール部およびベアリング部などを伴う潤滑剤として使用し得る。例えば、米国特許第３９７３７８１号明細書（発明の名称「Ｓｅｌｆ−ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ ｓｅａｌ」）、同第４４９１３３１号明細書（発明の名称「Ｇｒｏｏｖｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆａｃｅ ｓｅａｌ」）、同第４５６０１７４号明細書（発明の名称「Ｍｕｌｔｉ ｌｉｐ ｓｅａｌ」）、および同第４９７３０６８号明細書（発明の名称「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ ｄｙｎａｍｉｃ ｓｅａｌｓ ａｎｄ ｂｅａｒｉｎｇｓ」）は、それぞれ、様々なデザインのシール部について説明している。組換えルブリシンは、これらのシール部を伴う潤滑剤として使用し得る。
組換えルブリシンは、一般に、例えば、シール部およびベアリング部などを伴う潤滑剤として使用し得る。例えば、米国特許第３９７３７８１号明細書（発明の名称「Ｓｅｌｆ−ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ ｓｅａｌ」）、同第４４９１３３１号明細書（発明の名称「Ｇｒｏｏｖｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆａｃｅ ｓｅａｌ」）、同第４５６０１７４号明細書（発明の名称「Ｍｕｌｔｉ ｌｉｐ ｓｅａｌ」）、および同第４９７３０６８号明細書（発明の名称「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｏｕｇｈｎｅｓｓ ｄｙｎａｍｉｃ ｓｅａｌｓ ａｎｄ ｂｅａｒｉｎｇｓ」）は、それぞれ、様々なデザインのシール部について説明している。組換えルブリシンは、これらのシール部を伴う潤滑剤として使用し得る。
特に、組換えルブリシンは、特に、生体適合性潤滑剤が要求される医療デバイス、補綴、およびインプラントのための潤滑剤として使用し得る。さらに、アプリケーションは医療用である必要はないが、生体適合性潤滑剤が所望され得る環境の影響を受けやすい状況でのアプリケーションを含み得る。
実施例５：組換えルブリシン組成物
本発明の組換えルブリシンは、医薬上許容されるキャリアと組み合わされる場合、薬学的組成物において使用することができる。そのような組成物はまた、（蛋白およびキャリアに加えて）希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定化剤、溶解剤、ならびに当該分野において周知の他の材料を含有してもよい。用語「医薬上許容される」とは、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない非毒性材料を意味する。キャリアの特徴は投与経路に依存する。本発明の薬学的組成物はまた、サイトカイン、リンフォカイン、または他の造血因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＥＧ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポエチンを含有する。薬学的組成物は、蛋白の活性を増強するかまたは処置におけるその活性もしくは使用を補完する他の薬剤をさらに含有し得る。そのようなさらなる因子および／または薬剤は、本発明の蛋白との相乗効果を生じるか、または副作用を最小限にする薬学的組成物に含まれ得る。逆に言えば、本発明の蛋白は、特定のサイトカイン、リンフォカイン、他の造血因子、血栓溶解もしくは抗血栓因子、または抗炎症剤の処方に含まれ、副作用を最小限にし得る。
本発明の組換えルブリシンは、医薬上許容されるキャリアと組み合わされる場合、薬学的組成物において使用することができる。そのような組成物はまた、（蛋白およびキャリアに加えて）希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定化剤、溶解剤、ならびに当該分野において周知の他の材料を含有してもよい。用語「医薬上許容される」とは、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない非毒性材料を意味する。キャリアの特徴は投与経路に依存する。本発明の薬学的組成物はまた、サイトカイン、リンフォカイン、または他の造血因子、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、ＭＥＧ−ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポエチンを含有する。薬学的組成物は、蛋白の活性を増強するかまたは処置におけるその活性もしくは使用を補完する他の薬剤をさらに含有し得る。そのようなさらなる因子および／または薬剤は、本発明の蛋白との相乗効果を生じるか、または副作用を最小限にする薬学的組成物に含まれ得る。逆に言えば、本発明の蛋白は、特定のサイトカイン、リンフォカイン、他の造血因子、血栓溶解もしくは抗血栓因子、または抗炎症剤の処方に含まれ、副作用を最小限にし得る。
先に記載の高分子ヒアルロナン（ＨＡ）およびより高い分子量のヒラン（ｈｙｌａｎ）との組み合わせでの関節内補助のための組換えルブリシン蛋白のための使用は、特に好適である。関節内補助における使用のための他の好適な組み合わせは、組換えルブリシン蛋白の麻酔薬（例えば、リドカイン）、ステロイド（例えば、トリアムシノロンヘキサアセトニド）、または放射性同位元素（例えば、イットリウム）との使用を含む。関節内補助における使用のための他の好適な組み合わせは、（例えば、自己もしくは異種のいずれから誘導されるかにかかわらず培養された軟骨細胞、滑膜細胞、もしくは幹細胞の）自己または異種細胞調製物を含むことができる。
本発明の組換えルブリシンは、多量体（例えば、へテロ二量体もしくはホモ二量体）あるいはそれ自体または他の蛋白との複合体において活性であり得る。結果として、本発明の薬学的組成物は、そのような多量体または複合化された形態で本発明の蛋白を含んでなり得る。
本発明の薬学的組成物は、本発明の組換えルブリシン蛋白と蛋白またはペプチド抗原との複合体の形態であり得る。蛋白および／またはペプチド抗原は、ＢおよびＴリンパ球の両方に刺激信号を送達する。Ｂリンパ球は、それらの表面免疫グロブリン受容体を介して、抗原に応答する。Ｔリンパ球は、ＭＨＣ蛋白による抗原の提示後、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して抗原に応答する。宿主細胞上のＭＨＣならびにクラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ遺伝子によってコードされるそれらを含む関連蛋白は、Ｔリンパ球にペプチド抗原を提示する役割を果たす。抗原成分は、単独かまたはＴ細胞に直接シグナル伝達することができる同時刺激分子を伴う精製されたＭＨＣペプチド複合体として供給され得る。あるいは、Ｂ細胞上の表面免疫グロブリンおよび他の分子に結合することか可能な抗体、ならびにＴ細胞上のＴＣＲおよび他の分子に結合することが可能な抗体は、本発明の薬学的組成物と組み合わせることができる。
本発明の薬学的組成物は、本発明の蛋白を、他の医薬上許容されるキャリアに加えて、両親媒性薬剤、例えば、ミセル、不溶解性一重膜、液晶、または水溶液中のラメラ層として凝集された形態で存在する脂質と組み合わせたリポソームの形態であってもよい。リポソーム処方に適切な脂質として、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなリポソーム処方の調製は当該分野の技術レベルの範囲内であり、例えば、米国特許第４２３５８７１号明細書、同第４５０１７２８号明細書、同第４８３７０２８号明細書、および同第４７３７３２３号明細書に開示されている。
本発明の処置または使用の方法を実施する際、本発明の治療有効量の蛋白が、処置すべき病態を有する被験体（例えば、哺乳動物）に投与される。本発明の蛋白は、単独か、または他の両方、例えば、サイトカイン、リンフォカイン、他の造血因子、もしくは細胞に基づく補助を用いる処置との組み合わせで、本発明の方法に従って投与することができる。１つもしくはそれ以上のサイトカイン、リンフォカイン、他の造血因子、または細胞に基づく補助と共に同時投与する場合、本発明の蛋白は、サイトカイン、リンフォカイン、他の造血因子、血栓溶解もしくは抗血栓因子、または細胞に基づく補助と共に同時に、あるいは連続的に投与することができる。連続投与する場合、担当医は、サイトカイン、リンフォカイン、他の造血因子、血栓溶解もしくは抗血栓因子、または細胞に基づく補助と組み合わされた本発明の蛋白を投与する適切な順序を決定する。
薬学的組成物において使用されるまたは本発明の方法を実践するための本発明の蛋白の投与は、従来の様々な方法、例えば、皮膚、皮下、腹腔内、非経口もしくは静脈内注入、または場合によって、経口摂取、吸入、局部適用で行うことができる。関節部組織への注入による患者への投与が、一般に好適である（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，２００３）。
本発明の治療有効量の蛋白を経口的に投与する場合、本発明の蛋白は、錠剤、カプセル、散剤、溶液またはエリキシルの形態である。錠剤の剤形で投与する場合、本発明の薬学的組成物は、ゼラチンまたはアジュバントのような固体キャリアをさらに含有してもよい。錠剤、カプセル、および散剤は、約５〜９５％の本発明の蛋白、好ましくは、約２５〜９０％の本発明の蛋白を含有する。液体の剤形で投与する場合、液体キャリア、例えば、水、石油、動物または植物起源の油、例えば、ピーナツ油、鉱油、ダイズ油、もしくはゴマ油、あるいは合成油を添加してもよい。薬学的組成物の液体の剤形は、生理食塩水、デキストロースまたは他の糖溶液、あるいはグリコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールをさらに含んでもよい。液体の剤形で投与する場合、薬学的組成物は、約０．５〜９０重量％の本発明の蛋白、好ましくは、約１〜５０％の本発明の蛋白を含有する。
本発明の治療有効量の蛋白を、静脈内、皮膚または皮下注入によって投与する場合、本発明の蛋白は、パイロジェンフリーの非経口的に許容可能な水溶液の形態である。そのような非経口的に許容可能な蛋白溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを十分顧慮して、当該分野の技術の範囲内にある。静脈内、皮膚、または皮下注入のための好適な薬学的組成物は、本発明の蛋白に加えて、等張性ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸リンゲル注射液、または当該分野において公知の他のビヒクルを含有すべきである。本発明の薬学的組成物はまた、安定化剤、保存剤、緩衝液、抗酸化剤、または当業者に公知の他の添加物を含有してもよい。例えば、リドカインもしくは他の局所麻酔薬、ステロイドもしくは副腎性コルチコイド、ＨＡおよび／またはヒラン（ｈｙｌａｎ）、または放射性同位元素に関連する、あるいは組み合わされた注射液は、すべて、本発明に包含される。
本発明の薬学的組成物における本発明の蛋白の量は、処置する病態の性質および重症度、および患者が経験した以前の処置の性質に依存する。究極的には、担当医が、それぞれの個々の患者を処置する本発明の蛋白の量を決定する。はじめに、担当医は、低い用量の本発明の蛋白を投与し、患者の応答を観察する。患者に対し最適な治療効果が観察され、そのポイントで用量がさらに増加されなくなるまで、より大きな用量の本発明の蛋白を投与することができる。本発明の方法を実践するために使用される多様な薬学的組成物は、投与方法および履行される正確な治療経過に依存して、１ｋｇの体重あたり約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ（好ましくは、約０．１μｇ〜約１０ｍｇ、より好ましくは、約０．１μｇ〜約１ｍｇ）の本発明の蛋白を含有すべきであることが考慮される。
静脈内投与する場合、本発明の組換えルブリシンを含んでなる薬学的組成物を使用する静脈内治療の期間は、治療する疾患の重症度ならびにそれぞれの個々の患者の病態および潜在的な特異的応答に依存して変動する。本発明の蛋白のそれぞれの適用期間は、１２〜２４時間の連続静脈内投与の範囲であり得ることが考慮される。究極的には、担当医が、本発明の薬学的組成物を使用する静脈内治療の適切な期間を決定する。
骨、軟骨、腱または靭帯治療に有用である本発明の組成物について、治療方法は、組成物を、インプラントまたはデバイスとして、局部的、全身、もしくは局所的に投与することを含む。投与する場合、本発明における使用のための治療組成物は、もちろん、パイロジェンフリーの生理学的に許容可能な形態である。さらに、組成物は、骨、軟骨もしくは組織損傷の部位への送達のための粘性形態でのカプセル化または注入が所望され得る。局部投与は、いくつかの創傷治癒および組織修復状況において適切であり得る。場合により、上記の組成物にも含まれ得る治療上有用な薬剤は、代替的に、またはさらに、本発明の方法において本発明のルブリシンを含んでなる組成物と共に同時にもしくは連続的に投与することができる。好ましくは、組成物は、蛋白含有組成物を骨および／または軟骨損傷の部位に送達することが可能な、おそらく、骨および軟骨を発達させるための構造を提供することが可能な、および最適には、身体に再吸収させることが可能なマトリックスを含む。そのようなマトリックスは、他のインプラントされた医療アプリケーションに現在使用されている材料より形成される。
マトリックスを使用する場合、マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、表面の外観および界接面の特性に基づく。組成物の特定のアプリケーションは、適切な処方を規定する。組成物の潜在的マトリックスは、生分解性であり、化学的に規定された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ハイドロキシアパタイト、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリ酸無水物であり得る。他の潜在的マトリックスは、生分解性であり、骨または皮膚コラーゲンのように、生物学的に良好に規定される。さらに、マトリックスは、純粋な蛋白または細胞外マトリックス成分よりなる。他の潜在的マトリックスは、非生物分解性であり、焼結ハイドロキシアパタイト（ｈｙｄｒｏｘａｐａｔｉｔｅ）、バイオグラス、アルミネート、または他のセラミックスのように、化学的に規定される。マトリックスは、例えば、ポリ乳酸およびハイドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムのような上記のタイプの材料のいずれかの組み合わせよりなり得る。バイオセラミックスは、カルシウム−アルミネート−リン酸のような組成を変更してもよく、ポアサイズ、粒子サイズ、粒子の形状、および生分解性を変更するためにプロセシングに供される。
さらなる組成物では、本発明の蛋白は、骨および／または軟骨欠損、創傷、または問題の組織の処置に有益な他の薬剤と組み合わせることができる。これらの薬剤は、多様な増殖因子、例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、およびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）を含む。
治療用組成物はまた、獣医アプリケーションに現在、貴重である。特に、ネコおよびイヌのような家畜、マウスおよびラットのような研究用動物、ならびにウマは、ヒトに加えて、本発明の組換えルブリシン蛋白によるそのような処置のための特に所望される被験体または患者である。
組織再生において使用すべき蛋白含有薬学的組成物の用量レジメンは、蛋白の作用を改変する多様な因子、例えば、形成すべき組織重量の量、損傷の部位、損傷した組織の状態、創傷のサイズ、損傷した組織のタイプ（例えば、軟骨または腱）、患者の年齢、性別、および食事、任意の感染賞の重症度、投与回数ならびに他の臨床的要因を考慮する担当医によって決定される。用量は、再構成において使用されるマトリックスのタイプおよび薬学的組成物における他の蛋白の封入によって変動し得る。例えば、ＩＧＦ Ｉ（インスリン様増殖因子Ｉ）のような他の既知の増殖因子を最終組成物に添加することもまた、用量に影響を及ぼし得る。組織／骨成長および／または修復の定期的な評価、例えば、Ｘ線、組織形態決定およびテトラサイクリンラベリングによって、進行をモニターすることができる。
本発明のポリヌクレオチドはまた、遺伝子治療のためにも使用することができる。そのようなポリヌクレオチドは、被験体（例えば、哺乳動物）における発現のために、インビボまたはエクスビボのいずれかで、細胞に導入することができる。本発明のポリヌクレオチドはまた、核酸の細胞またはオルガネラ（ウイルスベクターもしくは裸のＤＮＡの形態を含むがこれらに限定されない）への導入のための他の既知の方法によっても投与することができる。
細胞はまた、そのような細胞において所望される効果もしくは活性を増殖または生成するために、本発明の核酸あるいは蛋白の存在下、エクスビボで培養することもできる。次いで、処置した細胞を、インビボで治療目的のために導入することができる。
実施例６：抗ルブリシン抗体
また、本発明の組換えルブリシン蛋白を使用して動物を免疫し、蛋白またはいくつかの実施態様においてその生来の対応物に特異的に反応するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を得ることもできる。そのような抗体は、完全な組換えルブリシン蛋白または免疫原としてのそのフラグメントのいずれかを使用することができる。ペプチド免疫原は、カルボキシル末端にシステイン残基をさらに含有してもよく、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）のようなハプテンにコンジュゲートされる。そのようなペプチドを合成するための方法は、当該分野において既知である（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３；およびＫｒｓｔｅｎａｎｓｋｙら、１９８７におけるように）。本発明のルブリシンに結合するモノクローナル抗体は、関連する蛋白の免疫検出のための有用な診断薬剤であり得る。これらの関連する蛋白に結合するモノクローナル抗体もまた、ルブリシンに関連する病態または、いくつかの場合、いくつかの形態の癌（ここで、ルブリシンの異常発現は（例えば、骨膜腫）に関与する）の処置の両方について有用な治療であり得る。
また、本発明の組換えルブリシン蛋白を使用して動物を免疫し、蛋白またはいくつかの実施態様においてその生来の対応物に特異的に反応するポリクローナルおよびモノクローナル抗体を得ることもできる。そのような抗体は、完全な組換えルブリシン蛋白または免疫原としてのそのフラグメントのいずれかを使用することができる。ペプチド免疫原は、カルボキシル末端にシステイン残基をさらに含有してもよく、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）のようなハプテンにコンジュゲートされる。そのようなペプチドを合成するための方法は、当該分野において既知である（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３；およびＫｒｓｔｅｎａｎｓｋｙら、１９８７におけるように）。本発明のルブリシンに結合するモノクローナル抗体は、関連する蛋白の免疫検出のための有用な診断薬剤であり得る。これらの関連する蛋白に結合するモノクローナル抗体もまた、ルブリシンに関連する病態または、いくつかの場合、いくつかの形態の癌（ここで、ルブリシンの異常発現は（例えば、骨膜腫）に関与する）の処置の両方について有用な治療であり得る。
組換えルブリシン蛋白のポリペプチドコアに対する抗体に加えて、組換えルブリシン蛋白の糖部分または糖蛋白複合体に対する抗体が所望される。グリコシル化組換えルブリシン（しかし、脱クリコシル型ではない）に結合する抗体を作成するために、免疫原は、好ましくは、アミノ酸配列が組換えルブリシンの高度にグリコシル化された部分に及ぶ糖ペプチド、例えば、反復ＫＥＰＡＰＴＴ様配列である。より短い糖ペプチド、同じ高度にグリコシル化された溶域内の例えば、８〜１５アミノ酸長もまた、免疫原として使用される。高度にグルコシル化された生体分子に対する抗体を作製する方法は、当該分野において既知である（例えば、Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、１９８０において記載のように）。
実施例７：組換えルブリシンの送達
組換えルブリシンの送達のための標準的な方法を使用する。関節内投与のために、組換えルブリシンを、２０〜５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、１回注入あたり約０．１〜２ｍｌの容積で、滑膜腔に送達する。例えば、２００〜３００μｇ／ｍｌの濃度の１ｍｌの組換えルブリシンは、細い（例えば、４〜３０ゲージ、好ましくは、１８〜２６ゲージ）針を使用して、膝関節部に注入される。本発明の組成物はまた、非経口投与、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、または腹腔内投与に、および好適な実施態様では、腹腔、心膜、もしくは胸膜の表面上にも有用である。
組換えルブリシンの送達のための標準的な方法を使用する。関節内投与のために、組換えルブリシンを、２０〜５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度、１回注入あたり約０．１〜２ｍｌの容積で、滑膜腔に送達する。例えば、２００〜３００μｇ／ｍｌの濃度の１ｍｌの組換えルブリシンは、細い（例えば、４〜３０ゲージ、好ましくは、１８〜２６ゲージ）針を使用して、膝関節部に注入される。本発明の組成物はまた、非経口投与、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、または腹腔内投与に、および好適な実施態様では、腹腔、心膜、もしくは胸膜の表面上にも有用である。
適切な針の配置は、関節部治療における注入によって送達される組換えルブリシン蛋白の有効性は極めて重要である（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，２００３）。適切な針の配置は、超音波技術の使用を介して容易にされ得る。首尾よい注入は、液体の首尾よい吸引が得られた後が最も一般的である。膝蓋上包への上側アプローチが、膝関節部空間への最も信頼できるアクセスを提供することが示唆されている。関節内注入によって組換えルブリシンを投与することに加えて、（例えば、遺伝子治療アプリケーションにおける）組換えルブリシンをコードする核酸を、関節内注入によって、滑膜腔に投与することができる。
手術癒着の防止のためは、本明細書に記載の組換えルブリシンは、ゲル状、泡状、線維状または布状の形態で投与される。そのような様式で処方される組換えルブリシンは、対置している表面間での癒着形成を防止するために、損傷または暴露された組織界接面上および間に配置される。効果的であるためには、ゲルが最終的に分散し、組織が接触する場合にそれらがもはや癒着する傾向を有さないような十分に長い時間、ゲルまたはフィルムを所定の位置に保持し、組織の接触を防止する。癒着形成の阻害または防止のために処方された組換えルブリシンは、（例えば、膜状、布状、泡状、またはゲル状の形態で）ラット盲腸癒着モデルにおける手術後癒着の防止について評価される（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、１９９３）。組成物は、外科的に磨耗されたラット盲嚢の周りに配置され、非処置コントロール（盲嚢が磨耗されたが、何ら処置を受けなかった動物）と比較される。処方物の非存在下の量と比較した、組換えルブリシン処方物の存在下におけるラットモデルの癒着形成の量の減少は、処方物が、組織癒着形成を減少するのに、臨床的に有効であることを示す。しかし、組織の癒着が所望される（例えば、軟骨裂傷の治癒が所望される）状況では、組換えルブリシンの使用が最も良好に回避され得る。軟骨表面に潤滑を提供することは、軟骨軟骨同化を減少する（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２００４）。
組換えルブリシンはまた、動物への移植前に、人工肢および関節部を被覆するのに使用される。例えば、そのようなデバイスは、例えば、米国特許第５７０９０２０号明細書または同第５７０２４５６号明細書に記載の方法に従って、組換えルブリシンの溶液に浸漬されるかまたは浴され得る。しかし、補綴付近に潤滑を提供する際の組換えルブリシンのインビボ使用では、注意しなければならない。ＰＲＧ４遺伝子発現（即ち、ＭＳＦ遺伝子発現）の顕著なアップレギュレーションについては、補綴のぐらつきに関連することが報告されており；ルブリシンは、骨と補綴との間の緊密な相互作用を妨害し、従って、補綴のぐらつきに寄与し得る（Ｍｏｒａｗｉｅｔｚら、２００３）。
実施例８：ＯＡモデル
ルブリシン調製物の関節内投与の有効性を評価するために、骨関節炎／軟骨侵食のマウスモデルを調製する。骨関節炎の外科的導入のために、マウスを２５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内トロブロモエタノール（シグマ（ＳＩＧＭＡ）（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で麻酔し、無菌的手術のために、膝を調製する。膝蓋靭帯の中心軸に対する縦切開を行い、関節包を開放し、半月脛骨靭帯（ｍｅｎｉｓｃｏｔｉｂｉａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ）（内側半月板を脛骨プラトーに固定している）を同定する。一部分の動物では、さらなる操作を実施せず、このグループをシャムオペとみなす。実験群では、内側半月脛骨靭帯（ｍｅｎｉｓｃｏｔｉｂｉａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ）を横切断し、内側半月板の不安定化（ＤＭＭ）を得る。シャムおよびＤＭＭの両方の動物において、関節包および皮下層を個別に縫合して閉じ、皮膚を、ＮＥＸＡＢＡＮＤ（登録商標）Ｓ／Ｃ組織接着剤（Ａｂｂｏｔｔ、Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ、イリノイ州）の塗布によって閉じる。Ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ（ＢＵＰＲＥＮＥＸ（登録商標）；Ｒｅｃｋｉｔｔ＆Ｃｏｌｅｍａｎ、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ−ｕｐｏｎ−Ｈｕｌｌ、英国）を、術前後に投与する。
ルブリシン調製物の関節内投与の有効性を評価するために、骨関節炎／軟骨侵食のマウスモデルを調製する。骨関節炎の外科的導入のために、マウスを２５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内トロブロモエタノール（シグマ（ＳＩＧＭＡ）（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で麻酔し、無菌的手術のために、膝を調製する。膝蓋靭帯の中心軸に対する縦切開を行い、関節包を開放し、半月脛骨靭帯（ｍｅｎｉｓｃｏｔｉｂｉａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ）（内側半月板を脛骨プラトーに固定している）を同定する。一部分の動物では、さらなる操作を実施せず、このグループをシャムオペとみなす。実験群では、内側半月脛骨靭帯（ｍｅｎｉｓｃｏｔｉｂｉａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ）を横切断し、内側半月板の不安定化（ＤＭＭ）を得る。シャムおよびＤＭＭの両方の動物において、関節包および皮下層を個別に縫合して閉じ、皮膚を、ＮＥＸＡＢＡＮＤ（登録商標）Ｓ／Ｃ組織接着剤（Ａｂｂｏｔｔ、Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｃａｇｏ、イリノイ州）の塗布によって閉じる。Ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎｅ（ＢＵＰＲＥＮＥＸ（登録商標）；Ｒｅｃｋｉｔｔ＆Ｃｏｌｅｍａｎ、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ−ｕｐｏｎ−Ｈｕｌｌ、英国）を、術前後に投与する。
組換えルブリシン調製物を、３０ゲージ針を使用する関節内注入によって投与する。膝関節あたり５〜１０マイクロリットルの注入を、手術の１週間後に投与する。場合により、１週間ごとにさらなる注入を投与する。術後４週間および術後８週間に、動物を二酸化炭素で屠殺する。
骨関節炎の進行および重症度を評価するために、無傷な膝関節を４％パラホルムアルデヒドに２４時間配置し、次いで、ＥＤＴＡ／ポリビニルピロリドンにおいて５日間、カルシウムを除去する。関節部をパラフィン中に包埋し、関節部全体を通して６μｍの前額断を得る。スライドをＳａｆｒａｎｉｎ Ｏ−ｆａｓｔ ｇｒｅｅｎで染色し、判定量評価システム（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、２００１）の改変型（「０」＝正常軟骨；「０．５」＝構造的変化を伴わないＳａｆｒａｎｉｎ Ｏの消失；「１」＝粗関節面および小さな線維化；「２」＝浅層部のすぐ下の層にまで及んだ線維化およびいくつかの表面薄層の消失；「３」＝軽度（＜２０％）；「５」＝中等度（２０〜８０％）；ならびに「６」＝重度（＞８０％）非石灰化軟骨の消失）を使用して、関節部全体を通して７０μｍ間隔で等級付けする。「４」（骨への侵食）の評価はこのモデルの特徴ではない。関節部のすべての四分円（内側脛骨プラトー、大腿骨内側顆、外側脛骨プラトー、および大腿骨外側顆）を個別に評価する。各膝関節部に対し、最低でも１２レベルをブラインドされた観察者によって評価する。スコアを、各関節部において見出される最大組織学的評価または合計した組織学的スコアとして表す。合計したスコアは、関節部を通した各組織学的切片上の各四分円についての相加的スコアを示す。この解析方法は、病巣の重症度ならびにＯＡ様病巣を患う軟骨の表面積の評価を可能にする（Ｇｌａｓｓｏｎら、２００４）。
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Claims (32)
- 配列番号９、１３、１７、２１または２５を含む、単離された蛋白。
- 配列番号２７のＮ−２リピート（ここで、Ｎは３〜２００の整数に等しい）に連結された配列番号２６を含む、単離された蛋白。
- Ｎは５〜５０の整数に等しい、請求項２記載の蛋白。
- Ｎは１０〜３０の整数に等しい、請求項２記載の蛋白。
- 配列番号２６＋配列番号２８＋［配列番号２７のＮ−２リピート］＋配列番号２９（ここで、Ｎは１０〜３０の整数に等しい）を含む、単離された蛋白。
- 請求項１に記載の蛋白をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項２に記載の蛋白をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項３に記載の蛋白をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項４に記載の蛋白をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項５に記載の蛋白をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号７、１１、１５、１９または２３を含む、単離された蛋白。
- 請求項１１に記載の蛋白をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号８、１２、１６、２０または２４を含む、請求項６記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号６、１０、１４、１８または２２を含む、請求項１２記載のポリヌクレオチド。
- 配列の全体の長さにわたって配列番号６、１０、１４、１８または２２に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１５記載のポリヌクレオチド。
- 少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１５記載のポリヌクレオチド。
- 少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１５記載のポリヌクレオチド。
- β−（１−３）−Ｇａｌ−ＧａｌＮａｃによるＯ−結合型である、請求項１または２記載の蛋白。
- 医薬上許容されるキャリアにおいて請求項１９に記載の治療有効量の蛋白を含む組成物。
- ヒアルロナンまたはヒラン（ｈｙｌａｎ）をさらに含む、請求項２０記載の組成物。
- 請求項２０に記載の組成物を得；および
該組成物を対象の組織に投与する
ことを含む、対象を処置する方法。 - 組織が、軟骨、滑膜、半月板、腱、腹膜、心膜、および胸膜よりなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
- 組織は軟骨である、請求項２３記載の方法。
- 麻酔薬を対象に提供すること；抗炎症薬を対象に提供すること；抗生物質を対象に提供すること；対象から液体を吸引すること；対象の組織を洗浄すること；および対象の組織を画像化することからなる群より選択される工程をさらに含む、請求項２２記載の方法。
- 対象が、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウマおよびヒトよりなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項２６記載の方法。
- 発現制御配列に操作可能に連結された請求項６または７に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
- 請求項２８に記載の発現ベクターで形質転換された細胞を液体培地において増殖させること；および
その培地から組換え蛋白を回収すること、
を含む、組換え蛋白の産生方法。 - 蛋白を回収することが：
膜を介して培地をろ過することによって、蛋白を濃縮し；
膜から保持された蛋白を回収し；および
０．１〜２．０Ｍの濃度の範囲でＬ−アルギニン塩酸塩を含有する緩衝生理食塩水に、回収された蛋白を溶解する
ことを含む、請求項２９に記載の方法。 - Ｌ−アルギニン塩酸塩濃度が０．５Ｍである、請求項３０記載の方法。
- 請求項１または２に記載の蛋白に特異的な単離された抗体。
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