JP2022058602A - 哺乳動物の変形性関節症及び関連する関節症状の治療に有用なhas2及びルブリシンを含む骨保護遺伝子を発現する組換えaavベクター - Google Patents
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Abstract
Description
(配列表に関する記載)本出願に付随する配列表はプリントアウトコピーに代わってテキスト形式で提供され、前記は参照により本明細書に含まれる。前記配列表を含むテキストファイルの名称はMER 16-291 SEQ Listing_ST25.txtである。テキストファイルは57.6KBであり、2016年1月13日に作成された。前記は、本明細書の出願と同時にEFS-Webにより電子的に提出されている。
(技術分野)
本発明は、組換えベクター、そのような組換えベクターを含む医薬組成物、及び動物の急性及び/又は慢性関節症状(変形性関節症を含む)の予防及び/又は治療のための方法に関する。特に、本発明は、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターであってヒアルロナンシンターゼ2(HAS2)及びルブリシン(PRG4)ファミリータンパク質に属する生物活性ポリペプチドを宿主で発現することができるベクターに関する。したがって、本発明は遺伝子操作分野に関し、滑膜細胞及び軟骨細胞におけるHAS2及びLUBの長期遺伝子発現によってヒト又は哺乳動物の関節の変形性関節症の治療に使用される、アデノ随伴ウイルス(AAV)をベースとする生物学的デリバリー及び発現系を提供する。
イヌでは、変形性関節症(OA)は爬行の最も一般的な原因の1つであり、1歳齢を過ぎたイヌの約20パーセントが罹患すると概算される。現在のところ、OAには治癒をもたらす利用可能な治療はなく、したがって医学的処置は軟骨の再生ではなく大部分は症状緩和に向けられている。通常、鎮痛処置はステロイド及び非ステロイド系抗炎症剤(NSAIDS)を含み、それらは数十年にわたってOAの治療で有効性を示してきた。しかしながら、これらの薬剤は関節の炎症を抑制できるが、それらの多くは軟骨で変性作用を有することが知られている(この作用はOA進行の根幹的過程をさらに悪化させる)。伝統的な鎮痛及び抗炎症療法に加えて、天然に存在する骨保護化合物の直接投与を用いてOA症状が緩和されてきたが、首尾の程度はさまざまであった。例えば、ヒアルロン酸(HA)が、罹患関節の粘弾性及び潤滑さの回復に広く用いられてきた。さらにまた、ポリ硫酸化グリコサミノグリカン(PSGAG)(関節内又は筋肉内経路で注射される)並びに経口投与グルコサミン及びコンドロイチン硫酸はいくらかの有効性を示している。
補助食品/薬剤のデリバリーに加えて、いくつかのグループが、粘弾性/粘性保護ポリペプチド、前記をコードする核酸、又は粘性保護タンパク質(例えば酵素)を生成する手段を宿主で発現することができるポリペプチド若しくは核酸をデリバリーすることによってOA症状を改善することを試みた。より大きな関心が寄せられるアプローチには、ルブリシンポリペプチド(Flannery, US 7,642,236 B2)、トリボネクチン(US 7,618,914 B2(Rhode Island General Hospital))、及びヒアルロナンシンターゼ(US 6,423,514(Millennium Pharmaceuticals))の使用が含まれる。
これらの試みのいくつかは“遺伝子治療”と特徴付けることができる(その基礎的概念はよく確立されている)(Evans CH, Robbins PD.Gene therapy for arthritis, In: Wolff JA (ed.).Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer.Birkhauser: Boston, 1994, pp 320-343)。最近、あるグループが、インターロイキン-1受容体アンタゴニスト(Il-1Ra)遺伝子のin vivoデリバリーによって変形性関節症を治療しようとした(US 2015/0031083 A1(Baylor College of Medicine);Frisbie, DD et al., Gene Therapy, 2002)。
したがって、本明細書で詳細に述べるように、本出願人らは、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターが、哺乳動物の関節へのただ1回の関節内注射によって治療物質をコードするcDNAをデリバリーし、当該物質の滑膜細胞及び軟骨細胞における局所的及び連続的in vivo生成を促進できることを提示することに初めて成功した。
出願人らはまた初めて、完全長のイヌルブリシンcDNA(配列番号:4)を単離し配列を決定した。
複数の特徴において、当該rAAVは、疾患修正特性、潤滑性特性、抗炎症特性及び痛み緩和特性を有する物質をコードするcDNAを含むことができる。
複数の特徴の実施態様では、rAAVベクターはヒアルロン酸シンターゼ-2(HAS2)又はその変種をコードする。いくつかの実施態様では、当該HAS2はヒトHAS2である。他の実施態様では、当該HAS2はイヌHAS2である。いくつかの実施態様では、HAS2はコドン最適化HAS2である。
グリコサミノグリカンヒアルロナン酸(HA)は非硫酸化グリコサミノグリカンであり、ベータ-1-3及びベータ-1-4グリコシド結合によって連結された反復グルクロン酸及びN-アセチルグルコサミン残基から成る。HAは複数の生物学的機能を提供し、それら機能には創傷治癒、細胞遊走、悪性形質転換及び組織のターンオーバーが含まれる。HAは、内皮細胞、線維芽細胞及び平滑筋細胞を含む多様な細胞タイプによって合成され、例えば結合組織、上皮組織及び神経組織のような組織で検出されている。関節間隙では、HAは、滑膜細胞(HAを滑液中に分泌する)とともに軟骨細胞によって生成される。滑液HAは、潤滑さ、組織の水分補給、構造的完全性、並びにマトリックスタンパク質及び生物的機構のための足場を提供するとともに、関節の恒常性において役割を果たしている。関節におけるHAの生物学的作用はその濃度及び分子量によって決定される。HAは、5,000Daから10,000,000Daの範囲で合成されうる。より小さい分子量のHA(<500kDa)は血管形成の受容体媒介活性化、悪性性及び炎症に密接に関係し、一方、より高分子量のHAは関節における潤滑さを提供する。
ルブリシン(PRG4)は、関節滑膜内層細胞及び軟骨の軟骨細胞によって生成される大きなムチン糖タンパク質であり、軟骨表面を保護する潤滑さを提供する(Flannery 1999;Schmidt 2001;Waller 2013)。HAと一緒にルブリシンはまた滑液中の重要な潤滑剤であり、衝撃吸収特性を提供する。マウスモデル及びヒトの希少遺伝性疾患におけるルブリシンの欠如は、変形性関節症(OA)に特徴的な軟骨変性を生じる(Rhee 2005;Ruan 2013)。ルブリシンの合成低下はまたヒトのOA患者及び多様な動物OAモデルで示されている(Elsaid, 2008)。組換えルブリシンによる関節内ルブリシン補充は軟骨病変を改善することが示された(Flannery, 2009)。
いくつかの実施態様では、rAAVベクターは、イヌのコドン最適化ヒアルロン酸シンターゼ-2(HAS2)をコードするAAV2又はAAV5キャプシド血清型であってもよい。
複数の特徴では、rAAVベクターは関節内デリバリーにより投与される。複数の実施態様では、rAAVただ1回の関節内デリバリーにより投与される。別の実施態様では、関節内投与に続いて、当該rAAV形質導入細胞に由来する同族治療物質のin vivo産生及び分泌は少なくとも約6カ月持続しうる。
いくつかの実施態様では、rAAVベクターは、遍在性プロモーター及びコドン最適化種適合性トランスジーンを含む発現カセットを含む(図1Aを参照されたい)。
別の特徴では、本開示は、rAAVベクターを用いて骨保護及び/又は骨再生遺伝子生成物を動物の関節においてin vivoで発現させる方法を提供する。
本明細書に引用する全ての参考文献(特許出願及び特許公開を含む)は、参照によりその全体が本明細書に含まれる。
以下の詳細な説明(例示として提供されるが、記載した具体的な実施態様にのみ本発明を限定する意図はない)は、本添付図面と一緒にすることで最良の理解が得られよう。前記添付図面は下記の通りである:
変形性関節症(OA)は、哺乳動物及びイヌの爬行のもっとも一般的な原因の1つであり、概算では1歳齢を超えるイヌの約20%が罹患する。OAは進行性で変性性の疾患であり、痛み、炎症及び関節可動性低下をもたらす。関節の潤滑さを改善し炎症及び痛みを減少させる新規で安全かつ効果的な治療法がOAの管理のために希求される。本明細書に開示するように、本出願人らは、関節での局所的かつ連続的な前記物質の生成を提供することを目標として、治療物質をコードする遺伝子をただ1回の関節内注射によってデリバリーするために組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを利用できることを見出した。rAAVベクターはAAV2及びAAV5キャプシド血清型を用いて作製され、イヌコドン最適化ヒアルロン酸(HA)シンターゼ-2(HAS2)をコードした。
22匹の健康な成犬(AAV2及びAAV5キャプシド血清型陰性)にrAAV2(1.5及び10x1011 vg/関節)、rAAV5(5x1011 vg/関節)又はPBS(コントロール)を関節内注射により投与した。有害な臨床的徴候はその後の28日間の試験の間には観察されなかった。組織病理学的分析ではrAAV5処理関節で最小限の滑膜炎症が示され、rAAV2処理グループでは有意な変化は示されなかった。ベクターゲノム(VG)が、全てのrAAV処理関節の滑膜及び大半の軟骨サンプルで検出された。rAAV5ベクターは、rAAV2と比較して両組織においてより高いVG検出及びmRNA発現をもたらした。予備的な分析で、被験関節の滑液におけるHAレベルの増加傾向もまた示された。要約すれば、我々の研究は、限られた数のイヌでただ1回の関節内注射で投与したときHAS2をコードするrAAV2及びrAAV5ベクターによりイヌ関節組織への遺伝子移転及び許容可能な安全性プロフィールを示した。
本発明のいくつかの実施態様では、rAAVはいったん動物に投与されて当該動物の細胞に取り込まれた場合、当該rAAVゲノムは染色体外エピソームとして存続するであろう。いくつかの実施態様では、本開示のrAAVは関節細胞に長期間、例えば約1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、7カ月、8カ月、9カ月、10カ月、11カ月、1年、2年、又は3年より長く(ただし前記に限定されない)存続できる。当該エピソームrAAVは発現し続けて治療物質の生成及び滑液中への分泌をもたらし、それによって関節へ直接的に当該物質の局所的及び連続的生成を提供するであろう。選択されたトランスジーン生成物は、関節の潤滑さを高め、痛み及び軟骨分解を軽減することによって関節の健康を促進することができる。
他の実施態様では、治療は繰り返される。いくつかの実施態様では、治療は最初の投与から2-3週間以内に繰り返され、他の実施態様では、第二の投与は最初の投与後3週間を超えて与えられる。いくつかの関連する実施態様では、第二の用量は同じ治療遺伝子を有するrAAVの投与を含み、当該rAAVは最初の治療と同じ血清型キャプシドを含む。他の関連する実施態様では、第二の用量は同じ治療遺伝子を有するrAAVの投与を含むが、当該rAAVは最初の投与と異なる血清型キャプシドを含む。いくつかの実施態様では、rAAVは血清型5のキャプシドを有する。関連する実施態様(反復投与が所望される)では、最初の用量は血清型5のキャプシドを有するrAAVの投与を含むことができ、第二の用量は血清型5のキャプシドを有するrAAVの投与を含むことができる。
複数の特徴では、変形性関節症の関節におけるHAS2タンパク質の過剰発現が滑液中のHAレベルを上昇させ、HAの潤滑特性、抗炎症特性及び痛み緩和特性の増強によって関節の健康を増進する。HAS2の過剰発現は、多様な細胞タイプによる培養液中のHAレベルの上昇をin vitroでもたらすことが示された。前記は、CHO、293及びCOS細胞を用い安定的又は一過性トランスフェクションのどちらかとして示された。関節でHAのin vivo過剰発現を提供するために、HAS2発現カセットをコードするrAAVベクターを用いることによりHAS2 cDNAを軟骨及び/又は滑膜(正常なHA合成部位)にデリバリーすることができる。いずれの理論にも拘束されないが、細胞への遺伝子の導入は、HAS2の持続的発現及びその後のHA生成をHAS2発現カセットに提供するであろう。当該治療ベクターは遍在性プロモーターを含むであろうから、当該ベクターは、内因性HAS2プロモーターとは異なり変形性関節症関節に存在する炎症媒介物質によるダウンレギュレーションに支配されないであろう。ベクターが関節内注射によって投与されるとき、当該ベクターは多様な細胞タイプ(主要な細胞タイプは滑膜細胞である)の形質導入を生じることができる。ついに、HA合成のためにはHAS2だけで十分であることが示され、他の不随するタンパク質又は成分はin vitroでのHA産生に不要であると考えられる(Yoshida et al.)。
本明細書に記載した方法及び組成物はまた変形性関節症の治療的処置に用いることができる。“治療”又は“治療的処置”という用語は、それらが変形性関節症に関するとき、さらにそれらが本明細書で及び獣医学分野で用いられるときは、既に変形性関節症を罹患しているか又は変形性関節症から回復中の(例えば回復期にある)対象動物の治療、治療の支援及び/又は治療の加速、又は変形性関節症を有すると診断されたか又は変形性関節症のリスクがある対象動物の軟骨減少を遅らせる及び/又は軟骨減少を逆行させることを目指す治療に関する。治療の重要な目的は、軟骨及び骨減少への発生リスクを減少させることである。本明細書で用いられるように、対象動物が変形性関節症に関連する進行性軟骨減少を罹患すると合理的に予想される場合、対象動物は変形性関節症を罹患している、又は変形性関節症発症リスクがあると称される。個々の対象動物が変形性関節症を罹患しているか否か、又は変形性関節症発症のリスクがあるか否かは、対応する獣医学又は医学分野の習熟者によって容易に決定することができる。
本明細書に記載されるものは変形性関節症のための治療法及び予防的処置であり、前記は、HAS又はルブリシンポリペプチドをin vivoで発現することができるベクターを含む医薬組成物、並びにヒアルロン酸又はルブリシン濃度の持続的増加を関節で誘発して軟骨減少を軽減又は除去する方法及び組成物を利用する。
本明細書で用いられるように、ある量の医薬組成物の投与が、変形性関節症を罹患する対象哺乳動物で当該疾患の臨床的徴候又は測定可能マーカーの有意な改善を引き起こすために十分である場合、当該組成物は“治療有効性”を有する、又は“治療的に有効”であると言われる。本明細書で用いられるように、ある量の医薬組成物の投与が対象動物で変形性関節症の発症を予防するために十分である場合、当該組成物は、“予防的有効性”を有する、又は“有効”であると言われる。
本明細書に記載されるものはまた、HAS若しくはルブリシン、又は前記の変種、フラグメント若しくは組合せを宿主でin vivo発現できるベクターである。複数の実施態様で、本発明で使用されるHAS又はルブリシンポリペプチドは、目的の標的種に概ね適合する(例えば、イヌHAS2をコードするベクターがOAを罹患するイヌにデリバリーされる)。
本発明で使用されるベクターは、配列番号:7に示されるアミノ酸配列セットを含むイヌルブリシンポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、イヌルブリシンポリペプチドは、配列番号:7と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%相同性若しくは同一性を有するイヌルブリシン変種である。
配列同一性又は相同性は、オーバーラップ及び同一性を最大にするが配列ギャップを最少にするようにアラインメントしたときに配列を比較することによって決定できる。特に、配列同一性は多数の数学アルゴリズムのいずれかを用いて決定できる。2つの配列の比較に用いられる数学アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin & Altschulのアルゴリズム(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990, 87, 2264-2268)であり、前記アルゴリズムは、Karlin & Altschulによって改変されている(Karlin & Altschul, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993,90, 5873-5877)。
配列の比較に用いられる数学アルゴリズムの別の例は、Myers & Millerのアルゴリズムである(Myers & Miller, CABIOS 1988,4, 11-17)。そのようなアルゴリズムはALIGNプログラム(バージョン2.0)に取り込まれている(ALIGNプログラムはGCG配列アラインメントソフトウエアパッケージの部分である)。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用するときは、PAM120ウェイト残基表、ギャップ長ペナルティ、12及びギャップペナルティ、4を用いることができる。局所配列類似性及びアラインメントについて領域を識別するさらに別の有用なアルゴリズムは、Pearson & Lipmanが記載したFASTAアルゴリズムである(Pearson & Lipman, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988, 85, 2444-2448)。
これら一揃いの検索プログラムの全てで、ギャップ付加アラインメントルーチンはデータベースの検索そのものにとって必須である。ギャップ付加は所望の場合には停止することができる。長さが1のギャップのための初期設定ペナルティ(Q)は、タンパク質及びBLASTPについてはQ=1であり、BLASTNについてはQ=10であるが、任意の整数に変更してもよい。ギャップを伸長するための初期設定一残基ペナルティ(R)は、タンパク質及びBLASTPについてはR=2であり、BLASTNについてはR=10であるが、任意の整数に変更してもよい。Q及びRについての値を任意に組み合わせて、オーバーラップ及び同一性を最大にするが配列ギャップを最少にするように配列をアラインメントすることができる。初期設定アミノ酸比較マトリックスはBLOSUM62であるが、他のアミノ酸比較マトリックス(例えばPAM)も利用できる。
本明細書で用いられるように、“ポリヌクレオチド”という用語は、ヌクレオチドの任意の長さのポリマー形を指し、前記はデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む。
本明細書で用いられる“ベクター”という用語は、組換えDNA又はRNAプラスミド若しくはウイルスを指し、前記は、標的細胞に例えばin vivoでデリバリーされるべき異種ポリヌクレオチドを含む。異種ポリヌクレオチドは治療目的のために対象の配列を含むことができ、場合によって発現カセットの形態であってもよい。本明細書で用いられるように、“ベクター”は最終的な標的細胞又は対象動物で複製能力を有する必要はない。
本明細書で用いられる“組換え体”という用語は半合成又は合成起源のポリヌクレオチドを意味し、前記は天然に存在しないか又は天然には見出されない編成で別のポリヌクレオチドに連結される。
本明細書で用いられる“異種”という用語は、ある実体が比較される当該実体の残りの部分と遺伝的に別個である実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子操作によってあるポリヌクレオチドを異なる供給源に由来するプラスミド又はベクター内に配置することができ、したがって当該ポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである。その本来のコード配列から取り出され、当該本来の配列以外のコード配列に作動できるように連結されたプロモーターは、したがって異種プロモーターである。
本発明にしたがって使用されるポリヌクレオチドは、例えば同じ転写ユニット内の追加のコード配列、制御エレメント(例えばプロモーター)、リボソーム結合部位、転写終了因子、ポリアデニル化部位、同じ若しくは異なるプロモーターの制御下の追加の転写ユニット、宿主細胞のクローニング、発現、相同組換えを可能にする配列のような追加の配列、及び本発明の実施態様を提供するために所望することができる任意の構築物を含むことができる。
いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、ヒアルロン酸シンターゼ(HAS)(HAS2を含む)、ルブリシン、インターロイキン-1受容体(IL-1R)アンタゴニスト、インスリン様増殖因子1(IGF-1)、線維芽細胞増殖因子2(FGF-2)、形質転換増殖因子ベータ1(TGFβ1)、骨形成タンパク質7(BMP7)、グルコサミン-フルクトース-6-ホスフェートアミノトランスフェラーゼ(GFAT)、インターロイキン10(IL-10)、ヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)、前記の生物学的に活性な切端形、又は前記の組合せをコードすることができる。ある実施態様では、対象哺乳動物はヒト、イヌ又はネコでもよい。具体的な実施態様では、対象動物はイヌである。
いくつかの実施態様では、対象哺乳動物は慢性変形性関節症を罹患しているか、又はその発症リスクがある。
いくつかの実施態様では、HAS2ポリペプチドは配列番号:2に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、HAS2ポリペプチドは、配列番号:2に示される配列と少なくとも90%同一性を有するポリペプチド、そのフラグメント、変種及びホモローグ(前記は対象動物で各々in vivo HAS活性を示す)から選択されるアミノ酸配列を有する。“HAS活性”は生物学的に活性なヒアルロン酸の生成を意味する。
いくつかの実施態様では、AAVベクターは5’から3’に向けて以下のエレメントを含む:5’AAV ITR、スタッファー、CBA、イントロン(IN)、cHAS2コドン最適化cDNA、ポリアデニル化シグナル(pA)、及び3’AAV ITR。
いくつかの実施態様では、ルブリシンポリペプチドは配列番号:7に示されるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、ルブリシンポリペプチドは、配列番号:7に示される配列と少なくとも90%同一性を有するポリペプチド、そのフラグメント、変種及びホモローグ(前記は対象動物で各々in vivoルブリシン活性を示す)から選択されるアミノ酸配列を有する。“ルブリシン活性”は、内因的に産生されるルブリシンと実質的に同じ態様でかつ実質的に同じ程度で潤滑さを提供することを意味する。そのような潤滑性活性は当業界で公知の技術にしたがって測定できる(例えば以下を参照されたい:Swan, DA et al.Biochem J.1985 Jan 1; 225(1): 195-201)。
いくつかの実施態様では、プロモーターは、CMV IEプロモーター、RSVプロモーター、HSV-1 TKプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α-1アンチトリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼI遺伝子プロモーター、CBAプロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β-グロビン遺伝子プロモーター、γ-グロビン遺伝子プロモーター、α-フェトプロテイン遺伝子プロモーター、及び筋クレアチンキナーゼ(CK)遺伝子プロモーターから成る群から選択できる。
さらに他の実施態様では、AAVはAAV2又はAAV5キャプシドを含む。
本開示はまた、哺乳動物(例えばヒト又はイヌ動物)の軟骨細胞及び/又は滑膜細胞の両方でルブリシンポリペプチドの産生を増加させる方法を提供する。ある実施態様では、当該方法は、rAAVベクターゲノム(ルブリシンをコードする核酸を含む)を含むrAAVを哺乳動物(例えばヒト又はイヌ動物)に投与する工程、ルブリシンが発現されるために十分な時間を許容し、それによってイヌのルブリシンレベルを増加させる工程を含むことができる。
ある実施態様では、HAS2は、HAS2をコードする核酸を含むrAAVの投与後に十分な量で生成され、哺乳動物(例えばヒト又はイヌ)のOAの症状を治療又は予防する。
別の実施態様では、ルブリシンは、ルブリシンをコードする核酸を含むrAAVの投与後に十分な量で生成され、哺乳動物(例えばヒト又はイヌ)のOAの症状を治療又は予防する。
ある実施態様では、HAレベルは、健康な哺乳動物(例えばヒト又はイヌ)で見いだされるレベルに回復する。当業者は多様な参考文献を調べてどのようなHAレベルが健康な動物で見いだされるかを知ることができる(例えば、Smith, GN et al.Arthritis Rheum.1998;41:976-985;Balazs E et al.Disorders of the Knee.Philadelphia: J B Lippincott; 1982.pp.61-74)。
別の実施態様では、ルブリシンレベルは、健康な哺乳動物(例えばヒト又はイヌ)で見いだされるレベルに回復する。
いくつかの実施態様では、HAS2ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号:3に示される核酸配列と少なくとも90%同一性を有するか、又はルブリシンポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号:6に示される核酸配列と少なくとも90%同一性を有する。
いくつかの実施態様では、AAVは、配列番号:2に示されるアミノ酸配列を含むHAS2ポリペプチドをコードするか、又は配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、AAVは、配列番号:7に示されるアミノ酸配列を含むルブリシンポリペプチドをコードするか、又は配列番号:7に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む。
任意の実施態様で、プロモーターは、CMV IEプロモーター、RSVプロモーター、HSV-1 TKプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α-1アンチトリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼI遺伝子プロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、CBAプロモーター、β-グロビン遺伝子プロモーター、γ-グロビン遺伝子プロモーター、α-フェトプロテイン遺伝子プロモーター、及び筋クレアチンキナーゼ遺伝子プロモーターから選択できる。
ある特徴では、本開示は医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、哺乳動物宿主でHAS又はルブリシンをin vivoでコード及び発現する組換えウイルスベクター、及び場合によって1つ以上の医薬的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを含む。
別の実施態様では、本開示は、変形性関節症を罹患しているか又は発症するリスクがある対象哺乳動物を治療する方法を提供し、前記方法は、上記に詳述した医薬組成物の治療的に有効な量を前記対象哺乳動物に関節内投与する工程を含む。ある実施態様では、対象動物はヒト又はイヌである。
別の特徴では、本開示は、ヒト又は哺乳動物の関節のOAの治療又は予防で使用される、アデノ随伴ウイルス(AAV)をベースとする生物学的デリバリー及び発現系を提供する。いくつかの実施態様では、当該方法は、滑膜細胞及び/又は軟骨細胞におけるヒト又は哺乳動物のHAS2又はルブリシンの長期遺伝子発現とそれに続くrAAVのデリバリーによって達成され、前記rAAVは、ヒト又は哺乳動物のHAS2又はルブリシンをコードする核酸配列、左右のAAV逆方向末端リピート(L ITR及びR ITR)、AAVパッケージングシグナル、及び場合によって非ウイルス性非コード性スタッファー核酸配列を含む。いくつかの実施態様では、滑膜細胞及び/又は軟骨細胞内でのヒト又は哺乳動物のHAS2又はルブリシン遺伝子の発現は炎症誘導性プロモーターによって調節される。前記プロモーターは、ヒト又は哺乳動物のHAS2又はルブリシンをコードする核酸配列のリーディングフレームの上流に配置され、免疫刺激物質のレベルが増加することによって特異的に活性化される。
AAV系のいくつかの実施態様では、当該系は、ヒト又は哺乳動物のHAS2又はルブリシンをコードする核酸配列、左右のAAV逆方向末端リピート(L ITR及びR ITR)、パッケージングシグナル、及び場合によって非ウイルス性非コード性スタッファー核酸配列を含み、変形性関節症(OA)の治療又は予防のために、滑膜細胞及び/又は軟骨細胞内でのヒト又は哺乳動物のHAS2又はルブリシン遺伝子の発現は、炎症誘導性プロモーターによって調節され免疫刺激物質のレベルの増加によって特異的に活性化される。
いくつかの実施態様では、ウイルス粒子は、1つ若しくは2つのAAV ITRを含む核酸及び1つ若しくは2つのITRによってフランキングされる本明細書に記載のHAS2又はルブリシンをコードする配列を含む組換えAAV粒子である。核酸はAAV粒子内で被包化される。AAV粒子はまたキャプシドタンパク質を含む。いくつかの実施態様では、核酸は、作動できるように転写の方向で連結された成分、制御配列(転写開始及び終了配列を含む)、及び対象のタンパク質コード配列(例えば融合タンパク質をコードする核酸)を含む。これらの成分は、機能的なAAV ITR配列によって5’及び3’末端でフランキングされる。“機能的AAV ITR”とは、ITRがAAVビリオンのレスキュー、複製及びパッケージングのために意図されるように機能することを意味する(以下を参照されたい:Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32;Passini et al., J.Virol., 2003, 77(12):7034-40;及びPechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16(前記はいずれも参照によりその全体が本明細書に含まれる))。本発明のいくつかの特徴を実施するためには、組換えベクターは、少なくとも被包化及びrAAVによる感染のための物理的構造に必須のAAVの配列の全てを含む。本発明のベクターで使用されるAAV ITRは、野生型のヌクレオチド配列(例えばKotinが記載したもの(Kotin, Hum.Gene Ther., 1994, 5:793-801))を有する必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって改変させてもよく、又はいくつかのAAV血清型のいずれかから誘導してもよい。これまでに40を超えるAAV血清型が知られ、新規な血清型及び既存の血清型の変種が同定され続けている。例えば以下を参照されたい:Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6;Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6;及びBossis et al., J.Virol., 2003, 77(12):6799-810。いずれのAAV血清型の使用も本発明の範囲内と考えられる。いくつかの実施態様では、rAAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、及びAAVrh.10(ただしこれらに限定されない)を含むAAV血清型に由来するベクターである。いくつかの実施態様では、AAVの核酸は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、又はAAVrh.10のITRを含む。さらに別の実施態様では、rAAV粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8、又はAAVrh.10のキャプシドタンパク質を含む。
rAAV粒子は当業界で公知の方法を用いて生成することができる。例えば米国特許6,566,118号、6,989,264号、6,995,006号を参照されたい。本発明の実施で、rAAV粒子を生成する宿主細胞には哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物及び酵母が含まれる。宿主細胞はまたパッケージング細胞であることができ、前記細胞では、AAV rep及びcap遺伝子は宿主細胞又はプロデューサー細胞(AAVベクターゲノムが安定的に維持される)で安定的に維持されうる。例示的なパッケージング及びプロデューサー細胞は293、A549又はHeLa細胞に由来する。AAVベクターは、当業界で公知の標準的技術を用いて精製され処方される。
さらにまた本明細書で提供されるものは、本発明のHAS2又はルブリシンをコードする核酸を含むrAAV粒子及び医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物である。当該医薬組成物は、本明細書に記載する多様な投与態様(例えば全身投与又は局所投与を含む)に適切でありうる。本明細書に記載するHAS2又はルブリシンをコードする核酸を含むrAAVの医薬組成物は、全身的に、例えば静脈内注射によって、カテーテルによって(米国特許5,328,470号参照)、又は定位注射によって(Chen et al., 1994, PNAS, 91: 3054-3057)導入できる。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のrAAV及び医薬的に許容できる担体を含む組成物はヒトへの投与に適切である。そのような医薬的に許容できる担体は無菌的液体、例えば水及び油(石油、動物、植物又は合成起源の油を含む)、例えば落花生油、大豆油、鉱物油などでありうる。食塩水溶液及びデキストロース水、ポリエチレングリコール(PEG)並びにグリセロール溶液もまた液性担体として、特に注射可能溶液のために利用することができる。医薬組成物はさらに追加の成分、例えば保存料、緩衝剤、等張化剤、抗酸化剤及び安定化剤、非イオン性湿潤化剤又は清澄剤、増粘剤などを含むことができる。本明細書に記載の医薬組成物は、単一ユニット投薬形又はマルチユニット投薬形で梱包することができる。組成物は一般的に無菌的で実質的に等張な溶液として処方される。
本明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、全ての目的のために参照によりその全体が本明細書に含まれる。
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実施例1a-概要
コドン最適化イヌHAS2 cDNA及び遍在性プロモーターを含むrAAVベクターを作製し、AAV2又はAAV5キャプシドにパッケージングした。大規模ベクターロットを三重トランスフェクション法によって作製し、CsClグラディエントによって精製した。ベクター収量をウシ成長ホルモン(BGH)ポリA部位(pA)に対するqPCRによって定量した。AAV2/HAS2については合計4ロットを作製した(そのうちの3ロットをin vivo試験のためにプールした、2x1013 DRP/総量)。AAV5/HAS2については2ロット(5x1012 DRP/総量)を作製し、生産収量の一貫性を試験し十分な量のウイルスを得た。
22匹の健康な成犬(AAV2及びAAV5キャプシド血清型陰性)に、rAAV2(1、5及び10x1011 vg/関節)、rAAV5(5x1011 vg/関節)、又はPBS(コントロール)を関節内注射により投与した。組織病理学的分析で、rAAV5処置関節で最小限の滑膜炎症が示され、rAAV2処置グループでは有意な変化は示されなかった。ベクターゲノム(VG)は、全てのrAAV処置関節の滑膜で、さらに軟骨サンプルの大半で検出された。rAAV5ベクターは、rAAV2と比較して両組織でより高いVG検出及びmRNA発現をもたらした。処置関節の滑液中のHAレベルの増加傾向が観察された。要約すれば、開示の結果は、イヌへの単回関節内注射による投与時におけるイヌ関節組織への遺伝子の移転及び許容可能な安全性プロフィールを明らかにした。
HA発現ベクターのクローニングと作製:イヌHAS2遺伝子(GenBank XM 539153.3(配列番号:1))を、イヌでの発現のためにGeneArt/Invitrogenのアルゴリズムによってコドン最適化を実施した。このコドン最適化イヌHAS2 cDNA(1656bp(配列番号:3))をフランキングするNheI-NsiI制限酵素部位を用いて合成した。続いてこのフラグメントを、遍在性ニワトリb-アクチンプロモーター(CBA)、ハイブリッドイントロン及びウシ成長ホルモン(BGH)ポリA(pA)を含むプラスミドにクローン化した。得られたpCBA-HI-cHAS2-BGHpAプラスミドをマキシキット(maxi kit, Qiagen)を用いて発現分析のために精製した。
cHAS2のin vitro発現とHA産生:cHAS2を含むプラスミドベクターを293細胞にトランスフェクトし、3日後に条件付け培養液及び細胞溶解物をRIPA緩衝液+プロテアーゼ阻害剤の250μL中に集めた。細胞溶解物を回転して細胞屑を除去し、30μLの細胞溶解物を4-12%のnu-PAGEゲルにローディングして1xのMops緩衝液中で泳動した。このタンパク質ゲルをニトロセルロース膜に移し、5%乳及び0.1% Tween-20のPBS-T中で抗HAS2をプローブとして4℃で一晩調べた。ロバの抗ヤギ二次抗体(1:5000希釈)を二次抗体として用いた。ベータアクチン検出を用いて細胞溶解物が等量ローディングされていることを示した。
in vitro培養物におけるHAレベルと分子量の定量:pCBA-HI-cHAS2-BGHpAを293細胞にトランスフェクトすることによって、HAS2発現細胞によるHA産生を評価した(Optimen培地又はcomplete培地による)。HA試験キット(Corgenix, Inc.)を用いて条件付け培養液のHAレベルを定量した。前記キットは、アグレカンに由来するHA-結合タンパク質を含んでいる。HAの分子量はアガロースゲル上で濃縮した条件付け培養液を泳動することによって評価した。多様なHAサイズマーカーを並行して泳動した(Select-HA HiLadder, Hyalose, Austin, TX)。同様なゲルを並行して泳動し、続いてヒアルロニダーゼで24時間消化した。両方のゲルをオール-ステイン(All-stain)で染色した。
cHASを有するrAAVベクターの作製:cHAS2発現カセットをAAV ITR含有プラスミドにクローン化し、AAV逆方向末端リピートによってフランキングされた発現カセットを作製し(プレウイルスプラスミドpDC627)、psITR/CBA-HI-cHAS2-BGHpAを構築した。600bpのスタッファーDNA(染色体16 P1クローン96.4B)を発現カセットの上流に加え、合計で4500bpのウイルスベクターゲノムを作製した。cHAS2発現カセット含有プラスミドのパッケージングを試験するために、293細胞を8x105細胞/ウェルで播種し(6ウェルのプレート)、次の日にpsITR/CBA-HI-cHAS2-BGHpA又はpsp70/EGFP、pHLP-19cap2又はp5repCMVcap5プラスミド及びpAdHELPをデュープリケートでトランスフェクトした(CaPO4キット(Promega))。3日後に細胞を収集し、qPCR及びBGHpA配列(配列番号:12-14)のプライマー/プローブを用いてBGHpAコピーについて溶解物の力価を測定した。BGHpAを含むプラスミドを標準物質として用いた。rAAVウイルス収量は細胞当たりのDNase耐性粒子(DRP)の量として表した。大規模ベクター生成は、psITR/CBA-HI-cHAS2-BGH、AAV2ベクターのためにpIM45BD rep-capプラスミド、及びAAV5ベクターのためにpHLP19-cap5並びにpAdHELPの三重トランスフェクションを用いて実施した。CsClによってベクターを精製し、TaqMan分析及びBGHpA配列のプライマー/プローブを用いて得られたベクターロットの力価を測定した(Applied Biosystems/Life Technologies)。
ウサギ軟骨細胞及び滑膜細胞におけるrAAV/cHAS2のin vitro有効性:当該ベクターが関節細胞タイプ(例えば初代滑膜細胞及び軟骨細胞)を形質導入する能力をウサギの細胞で試験した。細胞を1e5 DRP/細胞で感染させ、3日間培養した。細胞溶解物を収集してウェスタンブロットによってHAS2タンパク質を検出し、さらにHAレベルを上記に記載したように定量した。症状下でのマトリックス分解プロテアーゼの産生、炎症性サイトカイン及び軟骨構造タンパク質生成におけるHAの影響を試験するために、細胞を最初にrAAVベクターに感染させ、続いて24時間後にIL-1b刺激を実施した。24時間後に、細胞及び培養液の両方をmRNA分析及びHA産生のために収集した。
正常イヌ関節でのrAAV/cHAS2の評価:雑種犬(雄及び雌、8-10kgkgkg)を用いた。AAV2及び/又はAAV5キャプシドについて4以下の血清力価を有するイヌを試験に用いた。関節内ルートでcHAS2をコードするrAAV及びrAAV5ベクターを投与した(AAV2:1、5及び10x1011 DRP/関節、AAV5:5x1011 DRP/関節)。陰性コントロールとしてPBSを用いた。注射前7日間は1日に1回、注射後7日間は1日に2回、さらにその後の試験期間中は1日に1回、臨床的徴候について動物を観察した(痛み、爬行、注射関節の腫脹及び他の異常)。4週間後に動物を犠牲にした。白血球(WBC)計測のために、ベクター投与後-7、1、14及び28日に全血サンプルを収集した。HAレベルの定量のために、滑液(SF)サンプルを-7、1、14及び28日目に収集した。DNA及びRNAの単離のために、滑膜組織、軟骨及び肝臓サンプルを収集した。cHAS2ベクターゲノム及びmRNAコピーは、BGHpAプライマー/プローブセット(Applied Biosystems/Life Technologies)を用いqPCR分析によって決定した。切片はトルイジンブルーで染色され、資格認定獣医病理士が精査した。軟骨病巣の重篤度及びプロテオグリカン減少(スコア0-5)について軟骨を評価した。滑膜の肥厚は観察されなかったので、滑膜病変スコアは炎症細胞の密度で決定した(スコア0-5)。
HAS2発現カセットのコドン最適化と作製:哺乳動物のHAS2は高度に保存されたタンパク質である。例えば、HAS2のヒト及びイヌアミノ酸配列は2つのアミノ酸が相違するだけである(99.3%同一性)。同様に、イヌ及びウサギのHAS2間では3アミノ酸が相違するだけである(99.5%)。DNAレベルでは、イヌとヒトHAS2シンターゼcDNAとの間の類似性は93.9%である。コドン最適化により遺伝子発現を改善できるので、イヌHAS2のGenBank配列(XM 539153.3)をGeneArt/Invitrogenによって最適化した。これによって本来のGenBank配列と78%類似性を有するヌクレオチド配列が得られた。最適化cDNAのGC含有量は44.4%から59.0%に増加した。このcDNAを用いて、CBAプロモーターを有する遍在性発現プラスミドを作製し、内因性プロモーターとは異なるHAS2の構成的発現を可能にした(図1A)。CBAプロモーターは多様な前炎症性及び抗炎症性サイトカインによる影響が少ない。
in vitroにおけるHAS2発現とHA産生:HAS2タンパク質のin vitro発現を試験するために、CBA-HI-cHAS2-BGHpAプラスミドベクターの2つのクローン(#1及び#2)を293細胞にトランスフェクトし、続いて細胞溶解物をウェスタンブロットによってHAS2タンパク質(膜タンパク質)について分析した。発現プラスミドをトランスフェクトされた細胞は、cHASの予想サイズである64kDaのバンドを示した(データは提示していない)。次に我々は、293細胞におけるHAS2タンパク質の過剰発現が培養液中のHA検出増加をもたらすか否かを判定した(HAの産生及び細胞膜を通過するHAの分泌の両方を示す)。pCBA-cHAS2をトランスフェクトした細胞の培地中のHAレベルは、非トランスフェクト細胞及びCBA-EGFPトランスフェクト細胞と比較してそれぞれ6.5倍及び9倍増加した(図1B)。したがって、当該データによって、細胞中の過剰発現は細胞外区画のHAレベルの増加をもたらすことが確認された。in vitroで産生されたHAのサイズはアガロースゲルで判定された。当該データは、HAS2発現カセットをトランスフェクトされた細胞から得られた条件付け培養液中の高分子量のHAの存在を示した。この物質のサイズは、1.5メガダルトン(MDa)より大きかった(HA分子量マーカーによる概算に基づく)。この物質はヒアルロニダーゼ消化後に消失し、物質がHAであることを示した(図1C)。
HAS2発現カセットを有するrAAVベクターの作製:cHAS2共発現カセットを続いてAAV ITRを有するプラスミドにクローン化した。得られたウイルスゲノムの模式図は図1Aに示されている。AAV2及びAAV5キャプシド並びにHAS2 cDNAを有するrAAVベクターを生じる能力を小規模パッケージング実験で試験し(図2A)、続いて大規模ベクター生成を実施した。標準的な三重トランスフェクション法を用いて、AAV2及びAAV5ベクターの両方を作製できた(図2B)。この材料の能力を、293細胞の感染及び培養液中の産生HAレベルの分析によって試験した。AAV2及びAAV5ベクターの両方が培養液中のHAの用量応答増加をもたらした(図2C、D)。
正常なイヌの関節におけるrAAV/HAS2ベクターの評価:cHAS2を有するrAAV2及びrAAV5ベクターを正常なイヌの関節に関節内投与によってデリバリーし、動物を28日間評価した。有害な臨床的徴候、体重変化(図3A)、爬行又は死亡はいずれも試験中に観察されなかった。-7日目に幾匹かの動物で白血球(WBC)数が増加し、輸送のストレスによる可能性がある。1、14及び28日目のWBC数は概ね正常限界内であった。PBS-、AAV-注射側(左)及び反対側(非注射)の膝の組織学的評価では、非常にわずかのプロテオグリカンの減少及び軟骨変性(スコア範囲0-0.5(最大スコアは5))が示された。これらの最小限の変化は典型的な齢相応の自然発生的変化であった。最小限の滑膜変化がPBS-及びAAV2-処置関節並びに反対側関節で観察された(図3C)。最小限から軽度の滑膜炎(概して関節包及び内側副靱帯に広がる)が、AAV5ベクターで処置された雄及び雌の全ての左膝で認められた(反対側の関節では滑膜炎は観察されなかった)。したがって、全体としてこの処置は観察される有害作用がほとんどなく十分に寛容された。
ウイルスゲノムの検出のために滑膜及び軟骨から収集した組織サンプルを分析した(図4A、6A)。注射部位のもっとも近くから収集した滑膜サンプル(サンプル#3)は、AAV処置関節の全てでベクターゲノムの存在を示した(図4B)。AAV2処置関節は、おおざっぱに0.01から2ベクターゲノム(VG)/細胞を含んでいた。興味深いことに、低用量グループと高用量グループ間の10倍の相違にもかかわらず、軽微な用量応答がAAV2で観察された。AAV5ベクターで処置された関節はより高くより一貫した検出を示し、1から12コピー/細胞の範囲であった。いくつかの反対側(非注射)関節で低レベルのVGが検出され、これは、低AAV2処置グループでより明確であり、高AAV2用量グループ及びAAV5グループではより散発的であった(データは提示していない)。
注射部位よりさらに上方で収集した滑膜サンプル(サンプル#1)を分析して、関節内に拡散したAAVを評価した(図4C)。低用量AAV2を注射した関節は、より一貫したVG検出を示した。これらのレベルは滑膜サンプル#3で測定されたレベルと類似する。AAV5処置グループでは、全ての滑膜#1サンプルは一貫して検出できるVGを有する(3倍内)。しかしながら、これらは滑膜#3で検出されるVGレベルより低く、したがって位置依存性形質導入が明らかになった。
ベクターゲノムからの発現をベクター由来mRNAの定量によって分析した。滑膜サンプル#3については、発現はAAV2処置低、中及び高用量グループの2/5、4/5及び4/5で検出されたが、全てのAAV5処置関節は検出可能なmRNAコピーを有した(図5A)。ベクター発現はまたAAV5ベクターについて滑膜#1で検出されたが、そのレベルはこの場所における低いVG検出と同様に低かった(図5B)。mRNAの検出はVG検出と良好な相関関係を示した。滑膜サンプル#3の個々の注射関節のそれぞれのmRNA及びVG DNAが例として示されている(図5C)。
滑膜及び軟骨の結果は図7Aに要約されている。滑膜における遺伝子導入については、AAV5ベクターは、AAV2ベクターと比較して、両方の滑膜サンプルの位置でほぼ10倍高いベクターコピーを生じた。軟骨への遺伝子導入は、AAV5による滑膜への遺伝子導入よりも10から20倍低いが、一方、AAV2ベクターゲノムは滑膜及び軟骨の両方で同様なレベルで観察された。rAAV5ベクター由来ゲノム及びmRNAの検出は図7Bに要約され、試験した全ての組織サンプルにおけるrAAV5/HAS2ベクターによる一貫した遺伝子導入及び発現を示している。本出願人らはこの結果は大いに予想に反すると考える。
滑液のHAレベルの分析:滑液における一切のHAレベルの変化はrAAVベクター投与後に検出されうるものか否かを決定するために、滑膜のHAレベルを-7日目(基準線)及び28日目に収集したサンプルで定量した。動物間で高レベルの変動が検出されたので、各動物のHAレベルを各動物の基準線レベルで正規化した。データは、PBS処置動物と比較してAAV2/高用量及びAAV5/中用量は両方とも平均して滑液中のHAレベルを増加させることを示した(図8A及び8B)。
関節におけるHAのin vivo過剰発現を提供するために、本出願人らは2つのキャプシド血清型を用いてrAAVベクターを作製した。AAVキャプシド血清型の選択は重要である。なぜならば、標的種に既に存在するいずれの中和抗体も当該治療ベクターを中和することができ、したがってrAAVベクターによる遺伝子導入を阻止し得るからである。本明細書に開示した結果は、分析したイヌの大半がAAV2及びAAV5キャプシドの両方に対し低レベルの中和抗体を有していたことを示した。したがって、本出願人らは、AAV2及びAAV5キャプシドの局在化を関節内注射後に標的組織(すなわちイヌの膝関節)で直接試験した。HA発現は滑膜細胞及び軟骨細胞の両方にとって有益であると期待されるので、ベクターゲノムコピーをそれぞれイヌ滑膜サンプル及び軟骨サンプルで定量した。データは、AAV2は極めて一貫しないイヌ滑膜組織及び軟骨組織へのin vivo遺伝子導入を提供することを示し、さらに用量応答作用をほとんど示さなかったがその理由は明らかではない。OAのウサギ関節で実施された同様な実験は、類似するベクター用量を用いて非常に一貫したrAAV2ベクターゲノム検出を示した(Kyostio-Moore, 2015)。AAV2ベクターとは対照的に、AAV5ベクターゲノムは両組織タイプにおいて一貫した態様で検出された(n=5/グループ)。
重要なことには、軟骨サンプルでのAAV5の検出は驚くべきでかつ予想に反する。なぜならば、軟骨はin vivo条件では広範囲の細胞外マトリックスのために形質導入が困難であると報告され、これまでのところ関節内デリバリー後の多くの動物の軟骨におけるAAV5の検出に関する他の報告は存在しないからである。加えて、本開示のイヌの試験はイヌ滑膜組織で意表を突く高レベルのrAAV5ベクターを産生し、これはまた軟骨のそれと比較して滑膜で約2log高く、AVV5のイヌ滑膜内層に対する優先性を示している。この優先的な発現パターンも同様に本開示の前には予想されえなかった。
高レベルのベクター検出に加えて、mRNA分析によって組換えHAS2発現がイヌの滑膜組織及び軟骨組織で確認され、CBAプロモーターは両組織タイプで機能を有することが示された。さらにまた、軟骨サンプルでのAAV5による転写物の検出は、軟骨細胞が、軟骨の細胞外マトリックス中に隠れているウイルスではなく当該ベクターによって形質導入されることを確認させた。AAV2については、類似レベルのベクターゲノム及び転写物がまた滑膜内層で観察された。しかしながら、AAV2ベクターのmRNA発現は、軟骨サンプルでの対応するベクターゲノムの検出よりも驚くべきことにほぼ100倍低く、ベクターのいくらかは軟骨細胞の外部に存続すること、もしかすると細胞外マトリックスに保持されている可能性を示唆する。これらの重大な違いは、本出願人らが重要な非日常的実験を実施した後でのみ理解されうるであろう。
ベクターは、各動物で1つの関節にのみ投与されたが、ベクターゲノムはときに反対側の非注射関節で検出された。これはほとんどがAAV2処置関節から得られた滑膜サンプルで観察された。しかしながら、反対側の関節でベクターゲノムが観察された動物はいずれもこれらの関節で検出可能なHAS2転写物を全く持たなかった。
要約すれば、本明細書に開示したデータは、AAV5キャプシドはイヌ関節への関節内デリバリーにより良好な遺伝子導入を提供することを示す。これは、対象動物でAAV5に対する既存の液性免疫が低いこと、及び関節内注射後に関節組織に形質導入する能力による。関節内への注射は、滑膜内層だけでなく軟骨の軟骨細胞にも遺伝子導入を提供することができる。両方の組織タイプが、本開示の遺伝子デリバリー組成物及び方法によって与えられるHA合成の増加から利益を得るであろう。すなわち、滑膜は滑液で潤滑さを提供する能力の増強によって、さらに軟骨はマトリックスの結合が増強されしたがって軟骨の健康が改善された足場として機能することによって利益を得るであろう。これらの結果は、病気の部位へのAAV媒介HAS2遺伝子導入によるHAの過剰発現はOAの病状及び痛みを減少させることを示す。
実施例2a-概要
組換えルブリシンの関節内注射がラットOAモデルで軟骨変性を減少させることが最近示された(Flannery, 2006)。しかしながら、関節に投与されたルブリシンは滑液中で非常に短い半減期を有し、大半のタンパク質が72時間以内に除去される(Vugmeyster, 2011)。したがって、関節内反復注射が必要とされ、それは時間と労力を要し、ストレスをもたらしさらに高価である。HAS2(実施例1参照)と対比して、ルブリシンは、大きなcDNAによってコードされ、さらに複数のDNAリピートをそのムチン様ドメインに含み、そのことはそれぞれrAAVベクターへの適合及び高レベルの発現を困難にする。この問題を回避するために、本出願人らは、短縮イヌルブリシンcDNAを作製し小さな発現カセットを最適化してルブリシン生成を増強させた。重要なことに、本開示の前には完全長のイヌルブリシン配列も本明細書開示の短縮形も知られてなかった。
略記すれば、本出願人らは完全長イヌルブリシンのcDNAを作製し、続いて前記を用いて短縮コドン最適化イヌルブリシンバージョン(cLub1co)を設計した。続いて後者を用いて多様なルブリシン発現プラスミドを構築した。これらのプラスミドをHEK293細胞のトランスフェクション後にルブリシンmRNA及びタンパク質生成について特徴を調べた。各構築物からルブリシンmRNA及び分泌ルブリシンの両方が生成されることがデータで示された。最後に、本出願人らはcLub1発現カセットを有するrAAVベクターを作製し、rAAV/cLub1ベクター生成の実行可能性を提示した。この構築物を感染させたHEK293細胞はイヌルブリシンを合成し分泌した。
イヌルブリシンのクローニング:GenBankにはイヌ完全長ルブリシンcDNAは存在しないので(不完全配列:GenBank no.ABD38836.1)、完全なイヌcDNAを注文合成イヌ軟骨cDNAライブラリーから入手した。前記を達成するために、多様なプライマーによるqPCRを用いてオーバーラップフラグメントを作製した。続いて完全長cDNA(配列番号:4)を用いてイヌルブリシンの短縮形(cLub1)を設計した(前記はヒトルブリシンの短い公表バージョン(Flannery, 2009)に類似する)。この短いイヌルブリシンはアミノ酸378から782をコードする配列の欠失を含んでいた。この短縮ルブリシン配列をコドン最適化し(cLub1co)、さらに合成した(GeneArt/Invitrogen)。cLubcoフラグメント(平滑化KpnIからPmeIまで)をプラスミドのMfe(平滑化)-PmeI部位にクローン化した。前記プラスミドは、CMVエンハンサー、ニワトリβ-アクチンプロモーター及び短縮ハイブリッドイントロン(Hib)(minCBA)、並びにウシ成長ホルモン(BGH)ポリアデニル化部位を含んでいた。連結反応物で大腸菌(E. coli)Stable II細胞を形質転換し、DNAの再編成を最小限にするために30℃で増殖させた。得られたクローンを制限酵素分析によって分析し、クローニング接合部をDNA配列決定によって分析した。追加の構築物を作製した。前記追加の構築物は6xヒスチジン(6xHis)及びイントロン配列に存在する2つの“ATG”配列の改変を含んでいた。発現プラスミドを用いてin vitroのルブリシン発現を分析した。
イヌルブリシンの発現分析:リポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いてHEK293細胞にルブリシン発現プラスミドをトランスフェクトし、細胞を72時間増殖させた。ルブリシンmRNA発現を分析するために、細胞を収集し転写物レベルをリアルタイム(RT)qPCRアッセイによって測定した。アッセイにはBGA pA特異的プライマー/プローブを用いた(7500 Real-Time PCR System; Applied Biosystems, Foster City, CA)。タンパク質生成分析のために、培養液を収集しほぼ20から30倍濃縮した(100k MWCO filter, Millipore)。サンプルを4-12% Bis-Trisゲル又は3-8% Tris-酢酸(NuPAGE; Thermo Fisher Scientific)SDS-PAGEゲル(還元)でそれぞれMOPS又はTris-酢酸緩衝液により泳動した。ルブリシンは、マウス抗ルブリシン抗体(9G3, Millipore)(Ai, 2015)及び二次抗体としてヤギ抗マウス-HRP(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)を用いてウェスタンブロットによって検出した。
AAV/cLub1coの作製:cLub1発現カセットをAAV逆方向末端リピート(ITR)含有プラスミドでクローン化してAAV ITRによってフランキングされた発現カセット(プレウイルスプラスミドpDC627)を作製し、psITR/minCBA-HI-cLub1co-BGHpAを構築した。cLub1発現カセット含有プラスミドのパッケージングを試験するために、293細胞を8x105細胞/ウェルで播種し(6ウェルプレート)、次の日にpsITR/minCBA-HI-cLub1co-BGHpA、又はpsp70/EGFP、pHLP-19cap2(AAV2)若しくはp5repCMVcap5(AAV5)プラスミド及びpAdHELP(Promega CaPO4 kit)をトランスフェクトして、AAV2又はAAV5キャプシドにベクターをパッケージングさせた。3日後に細胞を収集し、ベクター収量について溶解物をqPCRアッセイ(7500 Real-Time PCR System)によって定量した。BGH pA配列特異的プライマー/プローブ(Applied Biosystems/Life Technologies)及び連続希釈した線状化プラスミドDNA(BGH pAを含む)の標準曲線を用いた。rAAVウイルス収量は細胞当たりのDNase耐性粒子(DRP)の量として表した(Clark, 1999)。
psITR/minCBA-HI-cLub1co-BGH、pHLP19-cap5(AAV5ベクターのため)及びpAdHELPの三重トランスフェクションを用い、実験規模のベクター生成を実施した。CsClグラディエントによってベクターを精製し、上記のように収量を定量した(University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)。
短いイヌルブリシンの作製:GenBankに存在するイヌルブリシン配列はエクソン6(857アミノ酸をコードする)の大きな部分を欠失しているので、完全長のイヌルブリシンcDNA(4017bp(終止コドンを含まない)、配列番号:4)を作製した。完全長のイヌルブリシンcDNAは合計1339アミノ酸を含むタンパク質(配列番号:5、図9)をコードする(1404アミノ酸のヒト配列よりもわずかに小さい)。アミノ酸レベルでは、このイヌルブリシンはヒトルブリシン(配列番号:11、図16)の配列と79%同一性を有する。
完全長イヌルブリシンは大きすぎ、パッケージ限界のためにrAAVベクターに適合しないので、イヌルブリシン短縮化バージョンを作製した。この短いイヌルブリシンバージョン(“Lub1”)は、ムチン様ドメインのアミノ酸378から782をコードする配列を欠失させることによって作製され、983アミノ酸(配列番号:7)をコードする2949bpの長さのcDNA(配列番号:6)が得られた。ムチン様ドメインの大きな欠失にもかかわらず、ほぼ10のKEPAPTT様ペプチドリピートが残存した。重要なことに、これらのいずれも規準的ヒトリピート配列と同一ではないが、(たとえそれらが同一であったとしても)当業者はこの短縮イヌLub1のデリバリーがOAの治療に有効であろうとは予想しえなかったであろう。これらのリピートは、それらが潜在的O-結合オリゴ糖結合部位であるので潤滑特性のために重要であると考えられる。この短いルブリシンのコドン最適化(Lub1co、配列番号:6)は、GC含有量を44%から60%に増加させ、本来のイヌDNA配列と74%のヌクレオチド類似性を有した。続いて、この短いイヌcDNAを用いて、minCBAプロモーター、cLub1co及びBGHpAを有するプラスミド発現カセットを作製した(図10)。6xHis-タグ及びイントロン領域内の推定ATGヌクレオチド配列の改変(偽翻訳開始部位を最小限にする)を有する発現プラスミドもまた作製した。
イヌルブリシンの発現分析:最小CBAプロモーター(minCBA-cLub1co)プラスミドのcLub1coの発現は、トランスフェクト293細胞におけるmRNAレベルの増加を示すことによってin vitroで確認された(図11A)。短いイントロンを有するminCBA-cLub1co構築物の活性は完全長CBA-HI構築物(CBA-cLub1co)を用いたときよりも約3倍低かった。完全長ルブリシンを含むプラスミド及び非コドン最適化構築物(CBH-cLubr)では転写はほとんど観察されなかった。多様な改変を有する発現カセットについて、転写物の分析もまた実施した(図10、11B)。minCBA-Lub1coの発現は、EGFP及びC-末端6xHis-タグ含有構築物に匹敵した。ハイブリッドイントロンに存在する2つの推定ATGコドンの欠失は発現レベルを約2倍強化させたようであった。Lubicoトランスフェクト細胞で観察された別の形態学的変化もまたLub1発現を示唆した。なぜならば、それら変化は非トランスフェクト細胞又はEGFPプラスミドトランスフェクト細胞には存在しなかったからである(データは提示していない)。
多様な発現プラスミドに由来するイヌLub1タンパク質の生成をルブリシンに対する抗体でウェスタンブロットによって試験し、濃縮培養液で250-380kDaのタンパク質が示された(図12A)。1339アミノ酸に基づいて予想されるサイズはほぼ160kDaであるが、より大きく、また広がったパターンシグナルはおそらくグリコシル化に起因する。非トランスフェクト細胞又はEGFPプラスミドトランスフェクト細胞では検出はほとんど観察されなかった。加えて、ΔATG改変は、この構築物に由来する転写物レベルの上昇についての観察と同様にルブリシン検出を増加させたようであった。タンパク質発現もまたプレウイルスAAVプラスミドから確認され、匹敵しうるタンパク質の検出が示された(図12B)。要約すれば、これらの結果は、イヌルブリシン発現カセットを含むプラスミドはグリコシル化ルブリシンタンパク質を発現し分泌することを明示した。
イヌルブリシン発現カセットを含むrAAVベクターの作製:プラスミドベクターのイヌルブリシン発現を確認したので、次に我々は、発現カセットがAAV2及びAAV5キャプシド血清型にパッケージされうるか否かを小規模パッケージ実験で試験した(図13A、B)。データは、EGFP発現ベクターで観察されたものと同様なイヌルブリシンのパッケージ有効性をAAV2及びAAV5キャプシドの両方で示した。6xHis-タグを加えてもrAAVベクター収量に変化はなかった。イヌHAS2発現カセットを含むAAV2ベクターで約5倍低いレベルのパッケージングが測定された。続いて、実験規模のAAV5/minCBA-cLub1の生成を実施して、スケールアップベクター生成を評価した。ベクター収量は、トランスジーンとしてEGFPを含む標準AAV2及びAAV5ベクター収量に匹敵した(データは提示していない)。続いて、AAV5ベクターをHEK293細胞でルブリシン産生及び分泌についてin vitroで試験した。ウェスタンブロットによる条件付け培養液の分析は、イヌルブリシンの用量依存検出を示した(図14)。要約すれば、イヌルブリシンの短縮バージョンを用いてrAAVベクターを作製できること、及びこのベクターを感染させた細胞はルブリシン合成及び培地への分泌を媒介できることがデータで示された。
上記に示したように、トランスジーンとしてのルブリシンはrAAV作製のために多くの問題を提示する。第一に、必要な発現エレメントを含むルブリシンcDNAのサイズはrAAVのパッケージング能力を超え、したがってより短いcDNAが要求された。興味深いことに、ムチン様ドメインのヒトルブリシンアミノ酸配列と比較して、完全なKEPAPTTリピートはイヌ配列には存在しない(図16)。組換えrAAVベクターの作製の場合、いずれのDNA配列の繰返しも難題をもたらしうる。なぜならば、リピート配列は、ウイルス生成中にDNA欠失及び再編成を引き起こすことによってウイルスゲノムの安定性及び完全性を低下させうるからである。しかしながら、標準EGFPレポーターベクターと比較したとき匹敵しうるベクター収量が得られたことを考慮すれば、開示の(かつ驚くべき)結果は、新規なイヌルブリシン配列を含みこれを発現するrAAVウイルスの作製は実現可能であることを示した。したがって、これは、ルブリシン遺伝子デリバリーのための単一rAAVベクター戦略を明らかにした最初の報告である。
この試験の目的は、イヌOA後膝関節モデルで肉眼観察及び組織学を用いHAシンターゼ2遺伝子療法の有効性を評価することであった。12匹の無傷の研究用繁殖雑種犬の雄(フォックスハウンド表現型、約20-23kg)を麻酔し、関節鏡を用いて右後膝関節の内側半月靱帯遊離(MMR)を実施した(-14日目)。
リン酸緩衝生理食塩水(PBSコントロール)又はイヌヒアルロン酸シンターゼ2(cHAS-2)保有組換えAAV5のDNase耐性粒子(DRP)(5x1011)を0日目に関節内投与した(n=6匹/グループ)。
関節炎症のバイオマーカーのために、血漿を0日目及び182日目に全てのイヌから収集した。HAレベルの分析のために、右及び左滑液0、56、112及び182日目に全てのPBSコントロール及びcHAS-2処置グループから収集した。
182日目にイヌを安楽死させ、後膝関節靱帯遊離によって誘発された軟骨欠損(墨汁染色によって表示)を測定し、国際OA研究協会(OA Research Society International(OARSI))の標準技術による組織病理学検査のために関節組織を収集した。
肉眼的及び組織学的データは、GraphPad Prism 6統計ソフトを用いKruskal-Wallisで分析した。
滑液中の総HAレベルを測定したが、総HAレベルにおける処置関連の相違は全く示されなかった(図17)。
滑膜及び軟骨サンプルを182日目に処置関節から収集し、ウイルスゲノムの検出のために分析した(図18A)。個々のrAAV5/cHAS-2注射関節のそれぞれの滑膜サンプル(図18A)及び大半の軟骨サンプル(図18B)で、ベクター由来DNA及びmRNAが検出された。データは図18Cに要約されており、両組織サンプルにおける平均ベクターゲノム及びmRNAが示されている。
HAシンターゼ-2遺伝子療法の関節内投与と密接に関係する局所及び全身毒性の証拠はなかった。PBS処置と比較してcHAS-2処置では一貫した軟骨構造保全が存在した。内側大腿顆及び内側脛骨プラトー関節表面の両方における病巣のサイズ及び深さの減少は、6匹のrAAV5/cHAS2処置犬のうち4匹の大腿顆においてより明白であった。
図19では、内側大腿顆及び内側脛骨軟骨画像(2x)のそれぞれの左下角にCookら(Cook et al., 2001)に基づく組織病理学スコアが示されている。イヌ994731/PBSは中央帯に向けて広範囲に広がるびらんを有し、両軟骨表面でかなりのプロテオグリカンの消失を示した。軟骨保護効果は観察されなかった。イヌ993107(rAAV5/cHAS2処置)は、大腿軟骨の表層帯に浅い病巣を有したが、全体として、軟骨の残余部の良好な保護が存在し、プロテオグリカンの消失はほとんどなかった。脛骨プラトー病巣は中央帯に向かってより深く、軽度のプロテオグリカンの欠失があった。下層の軟骨は比較的正常であるので、大腿顆で軟骨保護作用は存在した。rAAV5/cHAS2で処置されたイヌ992879は大腿軟骨でいくらかのプロテオグリカン消失を示したが、全体的な形態は保存された。脛骨プラトーは輪郭が明瞭な巣状びらんを有したが、軟骨の大半は保存された。したがって、病巣は小さく重篤度も軽度であったので、ある程度の軟骨保護作用は証明された。
特に、軟骨サンプルでベクターが検出できないrAAV5処置動物の1匹はまたもっとも大きな脛骨プラトー病巣領域を有した(イヌ993107、図19)。逆に、滑膜及び軟骨の両方でベクターが検出された(ただし軟骨でmRNAは検出されなかった)rAAV5処置動物の1匹(イヌ992879)は最良の軟骨構造を有していた。
したがって、rAAV5-HAS2ベクターの存在は最良の軟骨構造と密接に関係し、当該ベクターが存在しないことと最大の脛骨プラトー病巣領域とは密接に関係する。したがって、ベクター/mRNA検出のばらつきにもかかわらず、HAS2を発現するrAAV5ベクターは所望の臨床結果を引き起こしたと思われる。
総合すれば、これらの結果により、イヌOA関節の滑膜及び軟骨への一貫したrAA5媒介遺伝子導入が明らかにされ、少なくとも6カ月間の持続的なベクター由来発現が確認された。組織学的分析は、cHAS-2処置関節の大半で軟骨病変の減少及び疾患進行を遅らせることを示したが、一方、滑液の総HAレベルでは相違はほとんど観察されなかった。後者は、軟骨及び滑膜の局所的HA発現は、総滑液HAレベルを上昇させることなく何らかの病気改変特性を有することを示しているのかもしれない。或いはまた、総HAレベル測定では検出できない、合成されたHAにおける分子量の変化もrAAV5/cHAS-2による有益な作用に貢献した可能性がある。
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1.変形性関節症(OA)を罹患する対象哺乳動物を治療する方法であって、前記対象哺乳動物に治療的に有効な量の組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を関節内に投与する工程を含み、当該組換えアデノ随伴ウイルスがプロモーターに作動できるように連結された骨保護性若しくは骨再生性ポリペプチドをコードする核酸を含み、当該ポリペプチドが当該対象哺乳動物でOAの症状を緩和するために有効な量でin vivo発現される、前記方法。
2.ポリペプチドが、ヒアルロン酸シンターゼ(HAS)、ルブリシン、インターロイキン-1受容体(IL-1R)アンタゴニスト、インスリン様増殖因子1(IGF-1)、線維芽細胞増殖因子2(FGF-2)、形質転換増殖因子ベータ1(TGFβ1)、骨形成タンパク質7(BMP7)、グルコサミン-フルクトース-6-ホスフェートアミノトランスフェラーゼ(GFAT)、インターロイキン10(IL-10)、ヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)、前記の生物学的に活性な切端形、又は前記の組合せである、項目1に記載の方法。
3.ポリペプチドがHAS2ポリペプチドである、項目1又は2に記載の方法。
4.対象哺乳動物がヒト、イヌ又はネコである、項目1-3のいずれかの項目に記載の方法。
5.対象哺乳動物がイヌである、項目1-4のいずれかの項目に記載の方法。
6.ポリペプチドがイヌHAS2である、項目5に記載の方法。
7.HAS2ポリペプチドが、配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列、又はHAS2 in vivo活性を当該対象動物で示す前記のフラグメント、変種若しくはホモローグを含む、項目5又は6に記載の方法。
8.HAS2ポリペプチドが配列番号:2に示されるアミノ酸配列を含む、項目5-7のいずれかの項目に記載の方法。
9.HAS2ポリペプチドをコードする核酸が、配列番号:3に示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%同一性を有するヌクレオチド配列を有する、項目5-8のいずれかの項目に記載の方法。
10.rAAVが、5’から3’に向けて以下のエレメント:5’AAV逆方向末端リピート(ITR)、スタッファー核酸、プロモーター、イントロン(IN)、cHAS2コドン最適化cDNA、ポリアデニル化シグナル(pA)、及び3’AAV ITRを含むrAAVベクターゲノムを含む、項目5-9のいずれかの項目に記載の方法。
11.プロモーターがニワトリベータ-アクチン(CBA)プロモーターである、項目10に記載の方法。
12.ポリペプチドがルブリシンポリペプチドである、項目1又は2に記載の方法。
13.ルブリシンポリペプチドが、配列番号:7に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列、又はin vivoのルブリシン活性を当該対象動物で示す前記のフラグメント、変種若しくはホモローグを含む、項目12に記載の方法。
14.ルブリシンポリペプチドが、配列番号:7に示されるアミノ酸配列を含む、項目13に記載の方法。
15.ルブリシンポリペプチドをコードする核酸が、配列番号:6に示されるヌクレオチドと少なくとも90%同一性を有するヌクレオチド配列を有する、項目13又は14に記載の方法。
16.rAAVが、プラスミドpITR/minCBA-HI-cLub1co-BGHによってコードされるrAAVベクターゲノムを含む、項目13-14のいずれかの項目に記載の方法。
17.プロモーターが、CMV IEプロモーター、RSVプロモーター、HSV-1 TKプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α-1アンチトリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼI遺伝子プロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、CBAプロモーター、β-グロビン遺伝子プロモーター、γ-グロビン遺伝子プロモーター、α-フェトプロテイン遺伝子プロモーター、及び筋クレアチンキナーゼ(CK)遺伝子プロモーターから成る群から選択される、項目1-9又は12-16のいずれかに記載の方法。
18.AAVがAAV2又はAAV5キャプシドを含む、項目1に記載の方法。
19.イヌの軟骨細胞及び/又は滑膜細胞でヒアルロン酸の生成を増加させる方法であって、イヌにrAAVを投与する工程を含み、ここで、当該rAAVが、プロモーターに作動できるように連結されたHAS2酵素をコードする核酸を含むrAAVベクターゲノムを含み、投与の後で、当該HAS2酵素が発現されて追加のヒアルロン酸の生成を触媒し、それによって当該イヌでヒアルロン酸(HA)のレベルを増加させる、前記方法。
20.HAS2がイヌのOAの症状を治療するために十分な量で生成される、項目19に記載の方法。
21.HAレベルが健康なイヌで見いだされるレベルに回復される、項目20に記載の方法。
22.OAに罹患するイヌを治療する方法であって、イヌに治療的に有効な量のrAAVを投与する工程を含み、ここで、当該rAAVが、プロモーターに作動できるように連結されたHAS2をコードする核酸を含むAAVベクターゲノムを含む、前記方法。
23.OAに罹患するヒトを治療する方法であって、ヒトに治療的に有効な量のrAAVを投与する工程を含み、ここで、当該rAAVが、プロモーターに作動できるように連結されたHAS2をコードする核酸を含むAAVベクターを含む、前記方法。
24.HAS2をコードする核酸が、配列番号:3に示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%同一性を有するか、又は配列番号:2のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するHAS2をコードする、項目19-23のいずれかの項目に記載の方法。
25.HAS2が配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有する、項目19-23のいずれかの項目に記載の方法。
26.イヌの軟骨細胞及び/又は滑膜細胞でルブリシンの生成を増加させる方法であって、イヌにrAAVを投与する工程を含み、ここで、当該rAAVがプロモーターに作動できるように連結されたルブリシンをコードする核酸を含むrAAVベクターゲノムを含み、投与の後で当該ルブリシンが発現され、それによって当該イヌでルブリシンのレベルを増加させる、前記方法。
27.ルブリシンが、イヌのOAの症状を治療するために十分な量で生成される、項目26に記載の方法。
28.ルブリシンレベルが健康なイヌで見いだされるレベルに回復される、項目26に記載の方法。
29.OAに罹患するイヌを治療する方法であって、イヌに治療的に有効な量のrAAVを投与する工程を含み、ここで、当該rAAVが、プロモーターに作動できるように連結されたルブリシンをコードする核酸を含むrAAVベクターゲノムを含む、前記方法。
30.OAに罹患するヒトを治療する方法であって、ヒトに治療的に有効な量のrAAVを投与する工程を含み、ここで、当該rAAVが、プロモーターに作動できるように連結されたルブリシンをコードする核酸を含むAAVベクターゲノムを含む、前記方法。
31.ルブリシンポリペプチドをコードする核酸が配列番号:6に示される配列と少なくとも90%同一性を有するか、又は当該核酸が配列番号:7に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するルブリシンをコードする、項目26-30のいずれかの項目に記載の方法。
32.ルブリシンが配列番号:7に示されるアミノ酸配列を有する、項目26-30のいずれかの項目に記載の方法。
33.プロモーターが、CMV IEプロモーター、RSVプロモーター、HSV-1 TKプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α-1アンチトリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼI遺伝子プロモーター、CBAプロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β-グロビン遺伝子プロモーター、γ-グロビン遺伝子プロモーター、α-フェトプロテイン遺伝子プロモーター、及び筋クレアチンキナーゼ遺伝子プロモーターから成る群から選択される、項目19-32のいずれかに記載の方法。
34.rAAVが、プラスミドPs-AAV-ITR/CBA-cHAS2co-BGHによってコードされるrAAVベクターゲノムを含む、項目19-25のいずれかの項目に記載の方法。
35.rAAVが、プラスミドPs-AAV-ITR/minCBA-HI-cLub1co-BGHによってコードされるrAAVベクターゲノムを含む、項目26-32のいずれかの項目に記載の方法。
36.OAの発症をそのリスクがある対象哺乳動物で予防する方法であって、治療的に有効な量のrAAVをイヌに投与する工程を含み、ここで、当該rAAVがプロモーターに作動できるように連結されたHAS2をコードする核酸を含むrAAVベクターゲノムを含む、前記方法。
37.HAS2ポリペプチドをコードする核酸が、配列番号:2に示される配列と少なくとも90%同一性を有するか、又は配列番号:2のアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するHAS2をコードする、項目36に記載の方法。
38.HAS2ポリペプチドが配列番号:3に示されるアミノ酸配列を含む、項目36又は37に記載の方法。
39.OAの発症をそのリスクがある対象哺乳動物で予防する方法であって、治療的に有効な量のrAAVをイヌに投与する工程を含み、ここで、当該rAAVがプロモーターに作動できるように連結されたルブリシンをコードする核酸を含むrAAVベクターゲノムを含む、前記方法。
40.ルブリシンをコードする核酸が、配列番号:6に示される配列と少なくとも90%同一性を有するか、又は当該核酸が、配列番号:7に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有するルブリシンをコードする、項目39に記載の方法。
41.ルブリシンポリペプチドが配列番号:7に示されるアミノ酸配列を有する、項目40に記載の方法。
42.プロモーターが、CMV IEプロモーター、RSVプロモーター、HSV-1 TKプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α-1アンチトリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼI遺伝子プロモーター、CBAプロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β-グロビン遺伝子プロモーター、γ-グロビン遺伝子プロモーター、α-フェトプロテイン遺伝子プロモーター、及び筋クレアチンキナーゼ遺伝子プロモーターから成る群から選択される、項目36-38のいずれかに記載の方法。
43.rAAVが、プラスミドPs-AAV-ITR/CBA-cHAS2co-BGHによってコードされるrAAVベクターゲノムを含む、項目26に記載の方法。
44.rAAVが、プラスミドPs-AAV-ITR/minCBA-HI-cLub1co-BGHによってコードされるrAAVベクターゲノムを含む、項目26に記載の方法。
45.rAAVが関節内に投与される、項目19-44のいずれかの項目に記載の方法。
46.プロモーターに作動できるように連結されたイヌHAS2ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、組換えプラスミドベクター。
47.HAS2ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号:3に示される配列と少なくとも90%同一性を有するか、又は当該核酸が、配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むHAS2ポリペプチドをコードする、項目46に記載の組換えプラスミド。
48.HAS2ポリペプチドが配列番号:2に示されるアミノ酸配列を含む、項目46又は47に記載の組換えプラスミド。
49.pCBA-HI-cHAS2-BGHpAを含む、項目46-49のいずれかの項目に記載の組換えプラスミド。
50.プロモーターに作動できるように連結された短縮イヌルブリシンをコードする核酸配列を含む、組換えプラスミドベクター。
51.ルブリシンをコードする核酸配列が、配列番号:6に示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%同一性を有するか、又は当該核酸が、配列番号:7に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むルブリシンをコードする、項目50に記載の組換えプラスミド。
52.ルブリシンポリペプチドが配列番号:7に示されるアミノ酸配列を有する、項目50又は51に記載の組換えプラスミド。
53.プロモーターが、CMV IEプロモーター、RSVプロモーター、HSV-1 TKプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α-1アンチトリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼI遺伝子プロモーター、CBAプロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β-グロビン遺伝子プロモーター、γ-グロビン遺伝子プロモーター、α-フェトプロテイン遺伝子プロモーター、及び筋クレアチンキナーゼ遺伝子プロモーターから成る群から選択される、項目46-49又は50-52のいずれかの項目に記載の組換えプラスミド。
54.配列番号:8に示されるヌクレオチド配列を含む、組換えAAV5ウイルスベクター。
55.項目53に記載のrAAVベクターを含む、rAAV。
56.項目55に記載のrAAV、及び少なくとも1つの医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤又はベヒクルを含む、医薬組成物。
57.変形性関節症に罹患する対象哺乳動物を治療する方法であって、項目56に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を対象哺乳動物に関節内投与する工程を含む、前記方法。
58.当該対象哺乳動物がヒト又はイヌである、項目57に記載の方法。
59.滑膜細胞及び/又は軟骨細胞におけるHAS2又はルブリシンの長期遺伝子発現によって哺乳動物の関節のOAの治療で使用される、アデノ随伴ウイルス(AAV)を土台とする生物学的デリバリー及び発現系であって、前記系がrAAVを含み、ここで当該rAAVが、HAS2又はルブリシンをコードする核酸配列、左右のAAV逆方向末端リピート(L ITR及びR ITR)を含むrAAVベクターを含み、滑膜細胞及び/又は軟骨細胞内のHAS2又はルブリシン遺伝子の発現がプロモーターによって調節され、当該プロモーターがHAS2又はルブリシンをコードする核酸配列のリーディングフレームの上流に配置され、さらに前記プロモーターが免疫刺激物質のレベル増加によって特異的に活性化される、前記系。
60.HAS2が哺乳動物HAS2である、項目59に記載のAAV系。
61.HAS2がヒトHAS2である、項目59又は60に記載のAAV系。
62.プロモーターが炎症誘導性プロモーターである、項目59-61のいずれかの項目に記載のAAV系。
63.炎症誘導性プロモーターが、NF-KBプロモーター、インターロイキン6(IL-6)プロモーター、インターロイキン-1(IL-1)プロモーター、腫瘍壊死因子(TNF)プロモーター、シクロオキシゲナーゼ2(COX-2)プロモーター、補体因子3(C3)プロモーター、血清アミロイドA3(SAA3)プロモーター、マクロファージ炎症タンパク質-1a(MIP-1a)プロモーター及び前記のハイブリッド構築物から選択される、項目62に記載のAAV系。
64.rAAVベクターゲノムが、配列番号:2のアミノ酸配列を含むHAS2、配列番号:7のアミノ酸配列を含むルブリシン、又は前記の機能的変種をコードする核酸を含む、項目59-63のいずれかの項目に記載のAAV系。
65.rAAVベクターゲノムが、滑膜細胞及び/又は軟骨細胞内で当該ベクターゲノムをモニターすることを可能にするマーカー遺伝子を含む、項目59-64のいずれかの項目に記載のAAV系。
66.rAAVベクターゲノムが、配列番号:3又は配列番号:6に示される核酸配列と少なくとも80%又は90%配列同一性を有する核酸を含む、項目59-65のいずれかの項目に記載のAAV系。
67.rAAVベクターゲノムが配列番号:3又は配列番号:6に示される核酸配列を含む、項目59-66のいずれかの項目に記載のAAV系。
68.変形性関節症の治療又は予防のための、項目59-67のいずれかの項目に記載のAAV系。
69.項目59-68のいずれかの項目に記載のAAV系を含む、医薬組成物。
70.rAAVベクターを含むrAAVであって、プロモーターに作動できるように連結されたイヌHAS2ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、前記rAAV。
71.HAS2ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号:3に示される配列と少なくとも90%同一性を有するか、又は当該核酸が、配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むHAS2ポリペプチドをコードする、項目70に記載のrAAV。
72.HAS2ポリペプチドが配列番号:2に示されるアミノ酸配列を含む、項目70又は71に記載のrAAV。
73.プロモーターに作動できるように連結されたイヌルブリシンをコードする核酸配列を含むrAAVベクターを含むrAAV。
74.ルブリシンをコードする核酸配列が、配列番号:6に示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%同一性を有するか、又は当該核酸が、配列番号:7に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むルブリシンをコードする、項目73に記載のrAAV。
75.ルブリシンポリペプチドが配列番号:7に示されるアミノ酸配列を有する、項目73又は74に記載のrAAV。
76.rAAVベクターが配列番号:8に示されるヌクレオチド配列を含む、項目50-53のいずれかの項目に記載のAAV。
77.プロモーターが、CMV IEプロモーター、RSVプロモーター、HSV-1 TKプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α-1アンチトリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼI遺伝子プロモーター、CBAプロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β-グロビン遺伝子プロモーター、γ-グロビン遺伝子プロモーター、α-フェトプロテイン遺伝子プロモーター、及び筋クレアチンキナーゼ遺伝子プロモーターから成る群から選択される、項目71-72又は74-76のいずれかの項目に記載のrAAV。
78.AAV2キャプシド又はAAV5キャプシドを含む、項目71-77のいずれかの項目に記載のrAAV。
79.項目71-78のいずれかの項目に記載のrAAV、及び少なくとも1つの医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤又はベヒクルを含む、医薬組成物。
80.変形性関節症に罹患する対象哺乳動物を治療する方法であって、項目79に記載の医薬組成物の治療的に有効な量を対象哺乳動物に関節内投与する工程を含む、前記方法。
81.対象哺乳動物がヒト又はイヌである、項目80に記載の方法。
82.配列番号:4に示される配列を有する単離核酸。
83.配列番号:5に示される配列を有する単離ポリペプチド。
本発明は今や下記の非限定的特許請求の範囲にしたがって表されるであろう。
Claims (15)
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターを含むrAAVであって、当該rAAVベクターがプロモーターに作動できるように連結されたイヌHAS2ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、前記rAAV。
- HAS2ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号:3に示される配列と少なくとも90%同一性を有するか、若しくはHAS2ポリペプチドをコードする核酸が配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むHAS2ポリペプチドをコードするか、又はHAS2ポリペプチドが配列番号:2に示されるアミノ酸配列を含む、及び/又は組換えプラスミドがpCBA-HI-cHAS2-BGHpAを含む、請求項1に記載のrAAV。
- rAAVベクターを含むrAAVであって、当該rAAVベクターが、プロモーターに作動できるように連結された、短縮イヌルブリシンをコードする核酸配列を含む、前記rAAV。
- ルブリシンをコードする核酸配列が配列番号:6に示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%同一性を有するか、又は当該核酸が配列番号:7に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を含むルブリシンをコードする、請求項3に記載のrAAV。
- ルブリシンポリペプチドが配列番号:7に示されるアミノ酸配列を有する、請求項3又は4に記載のrAAV。
- rAAVベクターが配列番号:8に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項3から5のいずれかの項に記載のrAAV。
- プロモーターが、CMV IEプロモーター、RSVプロモーター、HSV-1 TKプロモーター、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子プロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、α-1アンチトリプシン遺伝子プロモーター、アルブミン遺伝子プロモーター、コラゲナーゼ遺伝子プロモーター、エラスターゼI遺伝子プロモーター、CBAプロモーター、β-アクチン遺伝子プロモーター、β-グロビン遺伝子プロモーター、γ-グロビン遺伝子プロモーター、α-フェトプロテイン遺伝子プロモーター、及び筋クレアチンキナーゼ遺伝子プロモーターから成る群から選択される、請求項1から6のいずれかの項に記載のrAAV。
- rAAVがAAV2キャプシド又はAAV5キャプシドを含む、請求項1から7のいずれかの項に記載のrAAV。
- rAAVがAAV5キャプシドを含む、請求項8に記載のrAAV。
- 請求項1から9のいずれかの項に記載のrAAV及び場合によって少なくとも1つの医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを含む、医薬組成物。
- 変形性関節症(OA)に罹患する対象哺乳動物を治療する方法であって、対象哺乳動物に治療的に有効な量の組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)を関節内に投与する工程を含み、前記組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)が、プロモーターに作動できるように連結された、骨保護性又は骨再生性ポリペプチドをコードする核酸を含み、当該ポリペプチドが当該対象哺乳動物でOAの症状を緩和するために有効な量でin vivo発現され、ここで、当該ポリペプチドが、ヒアルロン酸シンターゼ(HAS)、ルブリシン、インターロイキン-1受容体(IL-1R)アンタゴニスト、インスリン様増殖因子1(IGF-1)、線維芽細胞増殖因子2(FGF-2)、形質転換増殖因子ベータ1(TGFβ1)、骨形成タンパク質7(BMP7)、グルコサミン-フルクトース-6-ホスフェートアミノトランスフェラーゼ(GFAT)、インターロイキン10(IL-10)、ヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)、それらの生物学的に活性な短縮形、又はそれらの組合せである、前記方法。
- ポリペプチドがHAS2ポリペプチドである、請求項11に記載の方法。
- HAS2ポリペプチドが、配列番号:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一性を有するアミノ酸配列を含む、又はin vivo HAS2活性を当該対象動物で示すそのフラグメント、変種若しくはホモローグを含む、請求項11又は12に記載の方法。
- HAS2ポリペプチドが配列番号:2に示されるアミノ酸配列を含む、請求項11から13のいずれかの項に記載の方法。
- HAS2ポリペプチドをコードする核酸が、配列番号:3に示されるヌクレオチド配列と少なくとも90%同一性を有するヌクレオチド配列を有し、さらにrAAVが、5’から3’に向けて以下のエレメント:5’AAV逆方向末端リピート(ITR)、スタッファー核酸、プロモーター、イントロン(IN)、cHAS2コドン最適化cDNA、ポリアデニル化シグナル(pA)、及び3’AAV ITRを含むrAAVベクターゲノムを含む、請求項11から14のいずれかの項に記載の方法。
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