CN108697813B - 用于治疗哺乳动物内骨关节炎和相关关节病症的表达骨保护性基因、包括has2和润滑素的重组aav载体 - Google Patents

用于治疗哺乳动物内骨关节炎和相关关节病症的表达骨保护性基因、包括has2和润滑素的重组aav载体 Download PDF

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Abstract

本公开涉及重组病毒载体、包含此类重组载体的药物组合物以及预防和治疗哺乳动物的骨关节炎的方法。具体地，本公开提供了腺相关病毒(AAV)载体，其能够在宿主中表达骨保护性/软骨保护性生物活性蛋白，包括乙酰透明质酸合成酶2(HAS2)和润滑素(PRG4)。提供了产生这些AAV的方法，同样地提供了通过在滑膜和软骨细胞中长期基因表达骨保护性/软骨保护性蛋白(包括HAS2和PRG4)来治疗哺乳动物关节中的骨关节炎的方法。

Description

用于治疗哺乳动物内骨关节炎和相关关节病症的表达骨保护 性基因、包括HAS2和润滑素的重组AAV载体
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年1月13日提交的美国临时专利申请号62/278,243的优先权，所述临时专利申请通过引用整体并入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且通过引用并入本说明书。包含序列表的文本文件的名称是MER 16-291SEQ Listing_ST25.txt。文本文件为57.6KB；其创建于2016年1月13日；并且与说明书的提交同时地将其通过EFS-Web以电子方式提交。
发明领域
本发明涉及重组载体、包含此类重组载体的药物组合物，以及在哺乳动物中预防和/或治疗急性和/或慢性关节病况(包括骨关节炎)的方法。特别地，本发明涉及腺相关病毒(AAV)载体，其能够在宿主中表达属于透明质酸合酶2(HAS2)和润滑素(PRG4)蛋白家族的生物活性多肽。因此，本发明涉及基因工程领域，并提供基于腺相关病毒(AAV)的生物递送和表达系统，以用于通过在滑膜和软骨细胞中进行HAS2和LUB的长期基因表达来治疗人或哺乳动物关节中的骨关节炎。
发明概述
骨关节炎(OA)是一种在哺乳动物关节中发生并且构成严重的经济和医学问题的退行性关节病(Matthews,G.L.和Hunter,D.J.(2011).Expert Opin.Emerging Drugs 1-13.；Brooks PM.Curr Opin Rheumatol 2002；14:573-577)。软骨是一种坚韧的结缔组织，其在关节中覆盖骨的末端。其在坚硬的骨骼之间提供相对无摩擦的高度润滑的表面，并允许平稳运动。在OA发展期间，由于异常或过度磨损，软骨部分或完全丧失，这导致暴露的骨末端彼此摩擦，导致炎症、疼痛、肿胀或丧失活动性。目前，导致OA的初始软骨损失的详细原因尚不清楚，但发病率与年龄、肥胖和关节过度使用(诸如过度体育活动)之间存在很强的相关性。
在狗中，骨关节炎(OA)是跛足的最常见原因之一，并且据估计影响约20％的一岁以上的狗。目前没有治愈性治疗可用于OA，因此医学治疗一直以来主要针对缓解症状而不是重建软骨。镇痛治疗通常涉及类固醇和非类固醇抗炎药(NSAIDS)，其已在数十年中在OA的治疗方面显示出功效。然而，虽然这些药物可以抑制关节炎症，但已知它们中有许多对软骨具有恶化作用，这进一步恶化了OA发展的潜在过程。除了常规镇痛和抗炎疗法外，直接施用天然存在的骨保护性化合物已被用于缓解OA症状，取得了不同程度的成功。例如，透明质酸(HA)已被广泛用于恢复受累关节的粘弹性和润滑。此外，通过关节内或肌内途径注射的多硫酸化糖胺聚糖(PSGAG)以及口服施用的葡糖胺和硫酸软骨素已显示出一定的功效。
然而，前述药物必须经常施用，有时甚至彼此组合施用，以实现有意义的症状缓解。这些频繁的关节注射是费力/昂贵的，承受着感染的风险，并且对患者或动物造成很大的压力。虽然也开发了外科手术方法，但这些方法在狗和马中通常显示出低功效，从而通常仅在严重的晚期受试者中进行。
除了递送补充剂/药物以外，若干研究小组还已尝试通过递送粘弹性/粘性保护性多肽、编码其的核酸或能够在宿主中表达的多肽或核酸、用于产生粘性保护性蛋白(例如，酶)的装置(means)来改善OA症状。更令人关注的方法包括使用润滑素多肽(Flannery,US7,642,236B2)、tribonectins(属于Rhode Island General Hospital的US 7,618,914B2)和透明质酸合酶(属于Millennium Pharmaceuticals的US 6,423,514)。
这些努力中的一些可以被表征为“基因疗法”，其基本概念已被很好地建立(EvansCH,Robbins PD.Gene therapy for arthritis,In:Wolff JA(编辑).Gene Therapeutics:Methods and Applications of Direct Gene Transfer.Birkhauser:Boston,1994，第320-343页)。最近，一个研究小组试图通过体内递送白细胞介素-1受体拮抗剂(Il-1Ra)基因来治疗骨关节炎(属于BaylorCollege of Medicine的US 2015/0031083A1；以及参见Frisbie,DD等，Gene Therapy(2002))。
Arthrogen公司已使用AAV5在类风湿性关节炎(RA)的情形中表达人干扰素β(以减少炎性细胞因子)。与OA不同，炎症信号传导在RA的病理学中起重要作用，因此阻断该信号是关键的治疗方法。也就是说，寻求炎症与OA之间可能的联系的另一个研究小组在马OA的情形中使用重组AAV2来表达IL1受体拮抗剂(Goodrich等，Baylor College of Medicine)。
然而，这些方法中没有一种已被证明是普遍有效的，并且对于缓解OA患者的疼痛和痛苦仍然存在显著的未满足的需求。由此可见，对更加有效和持久的，同时从长远来看同样具有成本效益的治疗存在明确且尚未满足的医疗需求。
因此，如本文中详细描述的，本申请人首次成功证明重组腺相关病毒(rAAV)载体可通过单次关节内注射将编码治疗剂的cDNA递送至哺乳动物关节中，以促进在体内在滑膜细胞和软骨细胞中局部和连续地产生药剂。
本申请人还首次分离了全长犬润滑素cDNA(SEQ ID NO：4)并对其进行了测序。
本发明提供了在哺乳动物宿主中体内表达治疗有效量的骨保护性和/或骨再生基因产物的rAAV载体。
在一些方面，rAAV可含有编码具有疾病改善、润滑、抗炎和疼痛缓解特性的药剂的cDNA。
在一些方面，rAAV载体是衍生自AAV血清型的载体，所述AAV血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8和AAVrh.10。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8或AAVrh.10的ITR。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8或AAVrh.10的衣壳蛋白。在一些实施方案中，ITR和衣壳衍生自同一AAV血清型。在其他实施方案中，ITR和衣壳衍生自不同的AAV血清型。在一些实施方案中，rAAV载体可以是AAV2或AAV5衣壳血清型。在一些相关的实施方案中，rAAV2和rAAV5载体含有至少一个衍生自AAV2的ITR。
在一些实施方案中，rAAV载体编码透明质酸合酶-2(HAS2)或其变体。在一些实施方案中，HAS2是人HAS2。在其他实施方案中，HAS2是犬HAS2。在一些实施方案中，HAS2是密码子优化的HAS2。
糖胺聚糖透明质酸(HA)是非硫酸化的糖胺聚糖，其由通过β-1-3和β-1-4糖苷键连接的重复的葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺残基组成。其提供多种生物功能，包括伤口愈合、细胞迁移、恶性转化和组织周转。HA由各种细胞类型(包括内皮细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞)合成，并且已经在组织诸如结缔组织、上皮组织和神经组织中被检测到。在关节空间中，HA由滑膜细胞(其将HA分泌到滑液)和软骨细胞产生。滑液HA为基质蛋白和生物力学提供润滑、组织水合、结构完整性和支架，以及在关节稳态中起作用。HA在关节中的生物学效应由其浓度和分子量决定。其的合成范围为5000Da至10,000 000Da。较低分子量的HA(<500kDa)参与受体介导的血管生成、恶性肿瘤和炎症的激活，而较高分子量的HA在关节中提供润滑。
关节HA的大小和浓度受其合成和降解速率调节。HA的降解由透明质酸酶介导，所述透明质酸酶将HA切割成较小的片段，其排入淋巴系统以进行清除。已经描述了用于产生HA的三种酶，称为透明质酸合酶(HAS)1、2和3，其存在于滑膜细胞的质膜的内表面。其中，HAS2经显示负责高分子量HA的产生(Itano等，1999)。据报道，在人患者和动物OA模型中，骨关节炎关节中的高分子量HA水平降低(Plickert等，2013)。这可能是由于HA的合成减少和透明质酸酶对HA的降解增加。在HA合酶中，HAS2和3在人软骨中表达，并且在这些HAS中，HAS2表达在人OA中减少。由于HA降解酶即透明质酸酶2的水平升高，HA水平也降低(Yoshida等)。据报道，HAS2启动子响应于各种促炎和抗炎介质，这与报道的效应相互矛盾。这些介质包括TGFβ、主要表皮生长因子(primary epidermal growth factor)、TNFα和视黄酸(Guo,Kanter等，2007,Hyc等，2009)。预期患病关节中通过炎症介质产生的下调会降低HAS2表达，从而导致HA水平降低，并且可以差异地影响各种HAS同种型(David-Raoudi等，2009)。相反，已报道了机械刺激(Momberger等2005)或软骨组分诸如硫酸软骨素刺激HA产生(Momberger等，2005,David-Raoudi等，2009)。HA的产生导致细胞外周定位以及分泌到细胞外空间。目前尚不清楚什么调节分泌程度。然而，通常约80％的HA被分泌，而其余的则与产生性细胞保持缔合。这种细胞缔合的HA对基质蛋白的组装很重要；阻断HAS2合成将导致细胞缔合基质减少并且增加蛋白聚糖(即聚集蛋白聚糖)至培养基中的释放，进一步证实了HAS2在软骨细胞中作为合成HA的主要酶的主要作用(Nishida等，1999)。
在方面实施方案中，rAAV载体编码润滑素或其变体。在一些实施方案中，润滑素是人润滑素。在其他实施方案中，润滑素是犬润滑素。在一些实施方案中，润滑素是密码子优化的润滑素。
润滑素(Lubricin，PRG4)，其是由关节滑膜衬里细胞和软骨的软骨细胞产生的大的粘蛋白糖蛋白，并为软骨表面提供保护性润滑(Flannery 1999,Schmidt 2001,Waller2013)。润滑素与HA一起也是滑液中的重要润滑剂，提供减震性能。在小鼠模型和罕见的人遗传疾病中缺乏润滑素导致骨关节炎(OA)特征性的软骨退化(Rhee 2005,Ruan 2013)。在人OA患者和各种动物OA模型中也证实了润滑素的合成减少(Elsaid，2008)。已显示利用重组润滑素的关节内润滑素补充可改善软骨病变(Flannery 2009)。
在一些实施方案中，rAAV载体可以是编码犬密码子优化的透明质酸合酶-2(HAS2)的AAV2或AAV5衣壳血清型。
在一些方面，rAAV载体通过关节内递送施用。在一些实施方案中，rAAV通过单次关节内递送施用。在另一个实施方案中，在关节内施用后，来自rAAV转导的细胞的关联治疗剂(cognate therapeutic agent)的体内产生和分泌可持续至少约6个月。
在一些实施方案中，rAAV载体包含含有遍在启动子(ubiquitous promoter)以及密码子优化的和物种匹配的转基因的表达盒(参见例如图1A)。
在另一个方面，本公开提供了使用rAAV载体在动物的关节中体内表达骨保护性和/或骨再生基因产物的方法。
本文引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均通过引用整体并入。
附图简述
以举例的方式提供、但不旨在将本发明仅限于所述的特定实施例的以下详细描述，可以结合附图来最好地理解，其中：
图1A是显示质粒(上图)和rAAV病毒载体(下图)中的HAS表达盒的图。
图1B是显示用cHAS2表达质粒转染的细胞产生HA的图。将cHAS表达质粒转染到293细胞中，3天后收获条件培养基，并使用基于HA结合蛋白的检测系统定量培养基中的HA水平。缩写：CBAcHAS2，HAS2表达质粒。EGFP，EGFP表达质粒。未转染的阴性对照细胞。“Optimem”＝在无血清培养基中生长的细胞。“完全”＝在含血清培养基中生长的细胞。
图1C是用于对来自cHAS转染的293细胞(+或-透明质酸酶处理24小时)的条件培养基的组分进行分离的琼脂糖凝胶图像，证实了HA的表达。缩写：CM，条件培养基。MDa，分子量大小或标记。
图2A是显示来自使用三重转染方法将cHAS2小规模包装到rAAV2和AAV5载体中的rAAV载体生产的图。将EGFP表达盒包装到AAV2中显示为阳性对照，将在衣壳质粒不存在的情况下cHAS的包装作为阴性对照。rAAV产量显示为每个细胞的DNA抗性颗粒(DRP)的量。
图2B是显示来自通过三重转染进行的大规模载体生产的rAAV载体产量的图。显示了针对获得的多个载体批次获得的总滴度的实例。
图2C是显示体外AAV2/HAS2载体效力的图。通过各种MOI感染293细胞，并在3天后对条件培养基中的HA水平进行定量。
图2D是显示AAV5/HAS2载体在体外的效力的图。
图3A是显示在正常犬关节中关节内注射rAAV/HAS2载体后体重变化的图。
图3B是显示软骨评分的图。
图3C是显示滑膜评分的图。
图4A是显示用于犬滑膜rAAV载体定量的样品收集位置的图。
图4B是显示滑膜样品#3中载体基因组拷贝的定量的图。
图4C是显示滑液样品#1中的载体基因组拷贝的图。AAV2和AAV5的载体剂量显示为L＝低，M＝中等，H＝高(如图3A-C所示)。在rAAV载体递送后28天收集所有组织样品，并通过qPCR针对BGHpA分析所述样品。
图5A是显示在滑膜样品#3中载体衍生的cHAS表达的图。
图5B是显示滑液样品#1中的载体mRNA的图。
图5C是显示使用滑液样品#3分析的每只个体狗中的载体基因组和载体衍生的mRNA的图。AAV2和AAV5的载体剂量显示为L＝低，M＝中等，H＝高。在rAAV载体递送后28天收集所有组织样品，并通过qPCR针对BGHpA分析所述样品。
图6A是显示被收集来检测软骨中的rAAV载体和mRNA的股骨髁和胫骨坪样品的位置的图。
图6B是显示使用股骨髁样品#1分析的每只个体狗中的载体基因组和载体衍生的mRNA的图。另外，显示了对侧(未注射的右关节)的载体基因组拷贝(未被测试的样品#22除外)。
图6C是显示每个组中载体基因组(注射和未注射的关节)和mRNA拷贝的平均值的图。AAV2和AAV5的载体剂量显示为L＝低，M＝中等，H＝高(参见图3)。在rAAV载体递送后28天收集所有组织样品，并通过qPCR针对BGHpA分析所述样品。
图6D是显示每个组中胫骨坪软骨中的载体基因组(PBS或载体注射的关节)和mRNA拷贝的平均值的图。
图7A是显示从左后膝关节收集的组织中每个处理组中的滑膜(样品#3和#1)和软骨(股骨髁和胫骨坪)中的载体基因组的图。图7A和7B中显示的值表示组平均值±标准偏差(n＝5/组)。
图7B是显示各种组织中来自rAAV5/HAS2载体的载体基因组和mRNA的定量的图。
图8A是显示犬滑液中的HA水平的图。定量在第7天(基线)和第28天收集的SF样品中的HA水平。将每只动物中的HA水平针对基线水平进行标准化，表示为与载体施用前一周相比第28天的HA的百分比。
图8B是显示在第-7天(基线)和第28天的犬滑液中HA水平的图。箭头指示与基线(治疗前)相比在第28天具有更高HA水平的动物。
图9显示犬润滑素的完整氨基酸序列。加框区域指示外显子6(粘蛋白结构域)的位置。在缩短的犬润滑素(下文中称为“cLub1”或“cLub1co”)中缺失标以下划线的氨基酸(378至782)，并且KEPAPTT样重复(潜在的O-连接的糖基化位点)的位置以粗体显示。当序列名称以“co”结尾时，其表示cDNA序列已被“密码子优化”。类似地，“nonco”表示未经密码子优化。
图10是显示在实验中产生和使用的质粒的图。质粒含有缩短的(即工程化的内部缺失)、密码子优化的犬润滑素序列(cLub1co)、启动子(minCBA或CBA)和BGHpA位点。一些构建体含有N-或C-末端His-标签(C-末端)和从内含子序列中去除的ATG(潜在起始密码子)的修饰。前病毒AAV润滑素质粒在两个末端还含有侧翼ITR序列。
图11A是显示当将minCBAcLub1、CBA CLUB1和CBH cLub-nonco构建体转染到293细胞中时产生的mRNA拷贝/细胞的图。
图11B是显示当ΔATG/6His/N'、6His/N'、6His/C'、WT cLub和EGFP构建体被转染到293细胞中时产生的mRNA拷贝/细胞的图。
图12A是显示浓缩培养基(上述质粒)中分泌的润滑素的水平的抗-润滑素Western印迹。使用犬滑液作为阳性对照。
图12B是显示来自前病毒润滑素表达质粒的润滑素产生的Western印迹。分析两个克隆并将其与用minCBA-cLubco质粒获得的表达进行比较。将未转染的培养基和EGFP表达质粒转染的细胞作为阴性对照。
图13A是显示编码犬润滑素的AAV2载体的小规模载体生产中的载体产量的图。分析两个cLub克隆(-/+6xHis-标签)，并将其与EGFP和HAS2表达盒在前病毒(含ITR)质粒中的包装进行比较。阴性对照包括未转染的细胞和缺乏AAV2衣壳表达质粒的转染。
图13B是显示编码犬润滑素的AAV5载体的小规模载体生产中的载体产量的图。将EGFP和cLub表达盒的前病毒质粒与表达AAV5衣壳的质粒一起转染。
图14是显示rAAV5载体在体外的犬润滑素表达的抗-润滑素Western印迹。用不同量的rAAV5/minCBA-cLub1感染人293细胞72小时，然后浓缩条件培养基。来自AAV5/CBA-EGFP感染的细胞的培养基用作阴性对照。来自前病毒润滑素表达质粒转染的细胞的培养基用作阳性对照。
图15是呈现SEQ ID NO的概述的表。
图16是犬与人润滑素的比对。
图17是显示使用MMR模型的犬滑液中不同时间点的HA水平的图。在OA诱导前一周(前)、诱导后两周和测试物品施用之前(第0天)和测试物品递送后57天、112天和182天收集滑液。
图18A是显示载体施用后182天来自犬OA关节的滑膜样品中的rAAV5载体的检测和表达的图。
图18B是显示载体施用后182天犬OA关节的软骨(股骨髁)中的rAAV5载体的检测和表达的图。
图18C概述了犬MMR OA模型中第182天滑膜和软骨样品中的rAAV5载体基因组和cHAS2mRNA检测。
图19显示作为实例的从一个经PBS处理和两个经rAAV5/cHAS2处理的犬关节的内侧获得的软骨表面的番红-O染色切片。
发明详述
骨关节炎(OA)是哺乳动物和狗中跛足的最常见原因之一，并且据估计影响大约20％的>1岁的狗。OA是一种导致疼痛、炎症和关节活动性降低的进行性和退行性疾病。治疗OA需要改善关节润滑并且减少炎症和疼痛的新型安全有效的治疗方法。如本文所公开的，本申请人发现重组腺相关病毒(rAAV)载体可用于通过单次关节内注射递送编码治疗剂的基因，目的是在关节中提供局部和连续的药剂产生。用编码犬密码子优化的透明质酸(HA)合酶-2(HAS2)的AAV2和AAV5衣壳血清型产生rAAV载体。
对AAV2和AAV5衣壳呈血清反应阴性的22只成年健康犬通过关节内注射接受rAAV2(1、5和10x1011vg/关节)、rAAV5(5x1011vg/关节)或PBS(对照)。在28天的研究后未观察到不良临床体征。组织病理学分析显示用rAAV5处理的关节中的滑膜炎症最轻，并且rAAV2治疗组没有显著变化。在所有rAAV处理的关节的滑膜中和大多数软骨样品中检测到载体基因组(VG)。与两种组织中的rAAV2相比，rAAV5载体导致更高的VG检测和mRNA表达。初步分析还显示HA水平在经治疗的关节的滑液中升高的趋势。总之，我们的研究在有限数量的狗中证明了，当通过单次关节内注射施用时，用编码HAS2的rAAV2和rAAV5载体将基因转移至犬关节组织并获得可接受的安全性特征。
犬HA合酶2。在本发明的一个方面，本公开提供了包含AAV衣壳和单链DNA基因组的重组腺相关病毒(rAAV)载体。根据本公开的病毒衣壳可以使载体被摄取至关节细胞中，随后转运至细胞核中，导致治疗性基因的表达。在一些实施方案中，DNA基因组含有位于一个或多个表达盒的侧翼的一个或多个AAV反向末端重复序列(ITR)，用于在动物宿主体内表达治疗性基因。在本发明的一些实施方案中，病毒基因不存在于rAAV基因组中或不从其表达。
在本发明的一些实施方案中，一旦rAAV已被施用于动物并被动物细胞摄取，rAAV基因组将作为染色体外附加体持续存在。在一些实施方案中，本公开的rAAV可长期保持在关节细胞中；例如，但不限于超过约1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年或3年。附加体型rAAV将继续表达，导致治疗剂的产生和分泌至滑液中，从而直接在关节中局部且连续地产生药剂。所选择的转基因产品可通过增加关节润滑、减少疼痛和软骨降解等来促进关节健康。
在本发明的另一个方面，本公开提供了治疗有此需要的动物的方法，其包括向动物施用治疗有效量的根据本公开的rAAV的步骤。在一些实施方案中，该方法包括将所提出的产品直接施用于犬的受累关节中。在一些实施方案中，单次治疗足以影响动物病况的显著改善。
在其他实施方案中，重复治疗。在一些实施方案中，在第一次施用后2-3周内重复治疗，在其他实施方案中，在第一次施用后超过3周给予第二次施用。在一些相关的实施方案中，第二剂量包括具有相同治疗性基因的rAAV的施用，并且rAAV包含与第一治疗相同的血清型衣壳，在其他相关实施方案中，第二剂量包括具有相同治疗性基因的rAAV的施用，但该rAAV包含与第一剂量不同的血清型衣壳。在一些实施方案中，rAAV具有血清型5衣壳。在需要重复施用的相关实施方案中，第一剂量可包括具有血清型5衣壳的rAAV的施用，并且第二剂量可包括具有血清型5衣壳的rAAV的施用。
在一些方面，骨关节炎关节中HAS2蛋白的过表达升高了滑液中的HA水平，并通过增强HA的润滑、抗炎和疼痛缓解性质来改善关节健康。已显示HAS2的过表达导致由各种细胞类型体外在培养基中的HA水平升高。已使用CHO、293和COS细胞作为稳定转染子或瞬时转染证明了这一点。为了在体内在关节中提供HA的过表达，可通过使用编码HAS2表达盒的rAAV载体将HAS2cDNA递送至软骨和/或滑膜(HA合成的正常部位)。不希望受任何理论束缚，基因至细胞的转移将提供HAS2表达盒，用于持续表达HAS2和随后产生HA。由于治疗性载体将含有遍在启动子，因此与内源性HAS2启动子不同，其不会受到骨关节炎关节中存在的炎症介质的下调。当通过关节内注射施用载体时，其可导致各种细胞类型的转导，主要细胞类型是滑膜细胞。最后，已显示单独的HAS2蛋白足以合成HA，并且认为无其他相关蛋白或组分是体外产生HA所必需的(Yoshida等)。
犬润滑素。在一些方面，通过关节内递送编码润滑素的重组腺相关病毒(rAAV)载体作为犬骨关节炎(OA)的潜在治疗，增加了骨关节炎关节中的润滑素产量。润滑素是一种大的分泌糖蛋白，其可作为润滑剂起作用，保护关节内的软骨表面。本文所述的是全长犬润滑素的cDNA的发现和产生，所述cDNA用于设计犬润滑素(cLub1co)的缩短的且密码子优化的形式。然后将后者用于构建表达各种润滑素的质粒。在转染入HEK293细胞后，表征质粒的润滑素mRNA和蛋白质产生。数据显示每种构建体均产生润滑素mRNA和分泌的润滑素。用cLub1co表达盒产生rAAV载体并证明了rAAV/cLub1载体产生的可行性。用该构建体感染的HEK293细胞合成并分泌犬润滑素。
本文所述的方法和组合物还可用于骨关节炎的治疗性治疗。术语“疗法”或“治疗性治疗”，当它们涉及骨关节炎，以及当它们在本文和兽医学领域中使用时，涉及已患有骨关节炎或正从骨关节炎恢复(例如，处于恢复期)的受试者的治疗、或支持和/或加速治疗，或旨在减缓和/或逆转被诊断为患有骨关节炎或处于患骨关节炎的风险中的受试者的软骨损失的治疗。治疗的一个关键目标是降低向软骨和骨丢失的演变的风险。如本文中所用，如果合理地预期受试者患有与骨关节炎相关的进行性软骨丢失，则认为该受试者患有骨关节炎，或处于发生骨关节炎的风险中。特定受试者是否患有骨关节炎或处于发生骨关节炎的风险中可由相关兽医或医学领域中的普通技术人员来容易地确定。
本文所述的方法和组合物还可用于骨关节炎的预防性治疗。术语“防治”、“预防”、“防治性治疗”和“预防性治疗”，当它们涉及骨关节炎，以及当它们在本文中以及人和兽医学领域中所使用时，涉及健康受试者或患有不相关疾病但被认为处于发生骨关节炎的风险中的受试者的治疗。
本文描述了骨关节炎的疗法和预防性治疗(其利用包含能够在体内表达HAS或润滑素多肽的载体的药物组合物)和用于在关节中诱导透明质酸或润滑素浓度的持续增加以减少或消除软骨丢失的方法及组合物。
如本文中所用，如果施用该量的组合物足以引起患有骨关节炎的哺乳动物受试者中该疾病的临床体征或可测量的标志物的显著改善，则所述药物组合物被认为具有“治疗功效”或是“治疗有效的”。如本文中所用，如果施用该量的组合物足以预防受试者中骨关节炎的发展，则所述药物组合物被认为具有“预防功效”或是“有效的”。
本文还描述了能够在宿主中体内表达HAS或润滑素多肽或其变体或片段或组合的载体。在实施方案中，用于本发明的HAS或润滑素多肽与预期的目标物种在遗传上匹配(例如，编码犬HAS2的载体被递送至患有OA的犬科动物)。
通过举例说明的方式，本文所述的“变体”、“衍生物”等包括但不限于这样的HAS和润滑素变体、衍生物等，其由与本文公开的核苷酸序列不完全相同的核苷酸序列编码，但其中所述核苷酸序列中的变化不改变编码的氨基酸序列，或导致氨基酸残基的保守取代、一个或几个氨基酸的缺失或添加、不显著影响编码的多肽的性质(例如，变体或衍生物具有超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的野生型多肽的所需活性)的氨基酸类似物对氨基酸的取代等。保守氨基酸取代的实例包括甘氨酸/丙氨酸取代；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸取代；天冬酰胺/谷氨酰胺取代；天冬氨酸/谷氨酸取代；丝氨酸/苏氨酸/蛋氨酸取代；赖氨酸/精氨酸取代；和苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸取代。本文还描述了导致功能性HAS或润滑素衍生物的其他类型的取代、变化、添加、缺失和衍生物，并且本领域技术人员将容易知道如何制备、鉴定或选择此类变体或衍生物，和如何测试那些变体或衍生物的HAS或润滑系活性。本领域技术人员可优化本发明的HAS或润滑素多肽的表达；例如，但不限于去除隐蔽的剪接位点，通过在起始密码子之前引入Kozak共有序列来调整密码子用法，改变密码子用法或其组合以改善表达。
用于本发明的载体可包含编码包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的犬HAS2多肽的核酸序列。在一些实施方案中，犬HAS2多肽是与SEQ ID NO:2具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性或或同一性的犬HAS2变体。
用于本发明的载体可包含编码包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的犬润滑素多肽的核酸序列。在一些实施方案中，所述犬润滑素多肽是与SEQ ID NO:7具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性或同一性的犬润滑素变体。
序列同一性或同源性可通过在对齐以最大化重叠和同一性、同时使序列缺口最小化时比较序列来确定。具体地，可使用许多数学算法中的任何一种来确定序列同一性。用于比较两个序列的数学算法的一个非限制性实例是Karlin&Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990,87,2264-2268的算法(如在Karlin&Altschul,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993,90,5873-5877中改进的)。
用于比较序列的数学算法的另一个例子是Myers&Miller,CABIOS1988,4,11-17的算法。这种算法被并入ALIGN程序(2.0版)，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分为12、缺口罚分为4。用于鉴定局部序列相似性和比对的区域的另一种有用的算法是如Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988,85,2444-2448中描述的FASTA算法。
通常，氨基酸序列的比较可通过将具有已知结构的多肽的氨基酸序列与具有未知结构的多肽的氨基酸序列进行比对来实现。然后比较序列中的氨基酸，并将同源的氨基酸的组组合在一起。该方法检测多肽的保守区域并解释氨基酸插入和缺失。氨基酸序列之间的同源性可通过使用商购可得的算法来确定(也参见上文中同源性的描述)。除了本文另外提及的那些以外，还提及由国家生物技术信息中心提供的程序BLAST、gapped BLAST、BLASTN、BLASTP和PSI-BLAST。这些程序在本领域中被广泛地用于该目的，并且可以比对两个氨基酸序列的同源区域。
在套件中的所有搜索程序中，缺口比对程序对于数据库搜索本身是内在的。如果需要，可以关闭缺口。对于蛋白质，BLASTP中长度为1的缺口的默认罚分(Q)是Q＝9，BLASTN中Q＝10，但其可被改变为任何整数。对于蛋白质，BLASTP中延伸缺口的默认每残基罚分(R)为R＝2，对于BLASTN为R＝10，但其可被改变为任何整数。可使用Q和R的值的任何组合以对齐序列，以最大化重叠和同一性，同时使序列缺口最小化。默认氨基酸比较矩阵是BLOSUM62，但也可使用其他氨基酸比较矩阵诸如PAM。
术语“蛋白质”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用，是指具有任何长度的氨基酸残基的聚合物。
如本文中所用，术语“多核苷酸”用于指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，其含有脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。
如本文中所用，术语“载体”是指重组DNA或RNA质粒或病毒，其包含待被诸如体内递送至靶细胞的异源多核苷酸。异源多核苷酸可包含用于治疗目的的目标序列，并且可以任选地以表达盒的形式存在。如本文中所用，“载体”不需要能够在最终靶细胞或受试者中复制。
如本文中所用，术语“重组”意指半合成的或合成来源的多核苷酸，其在自然界中不存在或以在自然界中不存在的排列与另一多核苷酸连接。
如本文中所用，术语“异源的”意指来源于与同其比较的实体的其余部分在遗传上不同的实体。例如，可通过遗传工程技术将多核苷酸置于来源于不同来源的质粒或载体中，因此是异源多核苷酸。因此，从其天然编码序列中除去并且与除天然序列外的编码序列可操作地连接的启动子是异源启动子。
根据本发明使用的多核苷酸可以包含额外的序列，诸如同一转录单元内的其他编码序列、控制元件诸如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、多聚腺苷酸化位点、在相同或不同启动子控制下的其他转录单位、允许克隆、表达、同源重组和宿主细胞转化的序列，以及可能被需要来提供本发明实施方案的任何此类构建体。
在一个方面，本公开提供了治疗患有骨关节炎(OA)或处于发生骨关节炎的风险中的哺乳动物受试者的方法，其包括向所述哺乳动物受试者施用治疗有效量的腺相关病毒(AAV)，所述腺相关病毒含有编码骨保护性或骨再生性多肽并与启动子可操作地连接的核酸序列，其中所述多肽在哺乳动物受试者中体内表达，并且以有效减轻或预防OA症状的量表达。在一些实施方案中，施用是通过关节内途径。
在一些实施方案中，所述多肽可编码透明质酸合酶(HAS)，包括HAS2(HAS2)、润滑素、白细胞介素-1受体(IL-1R)拮抗剂、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、转化生长因子β1(TGFβ1)、骨形态发生蛋白7(BMP7)、葡萄糖胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶(GFAT)、白细胞介素10(IL-10)、血红素加氧酶-1HO-1、其生物活性截短或其组合。在一个实施方案中，哺乳动物受试者可以是人、犬科动物或猫科动物。在一个具体实施方案中，受试者是犬科动物。
在一些实施方案中，哺乳动物受试者患有慢性骨关节炎或处于发展慢性骨关节炎的风险中。
在其他实施方案中，多肽是犬HAS2或犬润滑素。在一些实施方案中，编码HAS2多肽的核酸序列具有与SEQ ID NO:3中所示的序列具有至少90％同一性的序列，或编码润滑素多肽的核酸序列具有与SEQ ID NO:6中所示的序列具有90％同一性的序列。
在一些实施方案中，HAS2多肽包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，HAS2多肽具有选自与SEQ ID NO:2中所示的序列具有至少90％同一性的多肽的氨基酸序列、在受试者中体内各自表现出HAS活性的其片段、变体和同系物。“HAS活性”意指生物活性透明质酸的产生。
在一些实施方案中，AAV载体从5'至3'包含以下元件：5'AAV ITR、填充片段、CBA、内含子(IN)、cHAS2密码子优化的cDNA、多聚腺苷酸化信号(pA)和3'AAV ITR。
在一些实施方案中，润滑素多肽包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。在其他实施方案中，润滑素多肽具有选自与SEQ ID NO:7中所示的序列具有至少90％同一性的多肽的氨基酸序列、在受试者中在体内各自表现出润滑素活性的其片段、变体和同系物。“润滑素活性”意指以与内源生产的润滑素基本相同的方式和基本上相同的程度提供润滑。这种润滑活性可以根据本领域已知的技术(参见，例如Swan,DA等Biochem J.1985Jan 1；225(1):195–201)来测量。
在一些实施方案中，启动子可以选自CMV IE启动子、RSV启动子、HSV-1TK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α-1抗胰蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、CBA启动子、β-肌动蛋白基因启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶(CK)基因启动子。
在其他实施方案中，AAV包含AAV2或AAV5衣壳。
在另一个方面，本公开提供了增加哺乳动物(例如，人或犬科动物)的软骨细胞和/或滑膜细胞中的透明质酸产生的方法。在一个实施方案中，该方法可包括以下步骤：向哺乳动物(例如，人或犬科动物)施用包含rAAV载体基因组的重组AAV(“rAAV”)，其中所述rAAV载体基因组包含编码HAS2的核酸，使HAS酶表达足够的时间，随后催化另外的透明质酸产生，从而升高哺乳动物中的透明质酸水平。
本公开还提供了增加哺乳动物(例如，人或犬科动物)的软骨细胞和/或滑膜细胞中的润滑素多肽产生的方法。在一个实施方案中，该方法可包括以下步骤：向哺乳动物(例如，人或犬科动物)施用包含rAAV载体基因组的rAAV，其中所述rAAV载体基因组包含编码润滑素的核酸，使润滑素表达足够的时间，从而升高犬科动物中的润滑素水平。
在一个实施方案中，在施用包含编码HAS2的核酸的rAAV后，HAS2以足以治疗或预防哺乳动物(例如，人或犬)的OA症状的量产生。
在另一个实施方案中，在施用包含编码润滑素的核酸的rAAV后，润滑素以足以治疗或预防哺乳动物(例如，人或犬)的OA症状的量产生。
在一个实施方案中，将HA水平恢复至健康哺乳动物(例如，人或犬)中存在的水平。本领域技术人员可参考各种参考文献以了解在健康动物中存在何种水平的HA(例如，Smith,GN等Arthritis Rheum.1998；41:976–985；Balazs E等Disorders of theKnee.Philadelphia:J B Lippincott；1982.第61–74页)。
在另一个实施方案中，将润滑素水平恢复至在健康哺乳动物(例如，人或犬)中存在的水平。
另一方面，本发明提供治疗患有OA或处于发生OA的风险中的犬的方法，其包括向所述犬施用治疗有效量的AAV载体，所述AAV载体含有与启动子可操作地连接的编码HAS2或润滑素多肽的核酸序列。在另一个实施方案中，本公开提供了治疗患有OA或处于发生OA风险中的人的方法，其包括向所述人施用治疗有效量的AAV载体，所述AAV载体含有与启动子可操作地连接的编码HAS2或润滑素多肽的核酸序列。
在一些实施方案中，编码HAS2多肽的核酸序列与SEQ ID NO:3中所示的核酸序列具有至少90％同一性，或编码润滑素多肽的核酸序列与SEQ ID NO:6所示的核酸序列具有至少90％同一性。
在一些实施方案中，AAV编码包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的HAS2多肽，或包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少90％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV编码包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的润滑素多肽，或包含与SEQ IDNO:7中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在任何实施方案中，启动子可选自CMV IE启动子、RSV启动子、HSV-1TK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α-1抗胰蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、β-肌动蛋白基因启动子、CBA启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶(CK)基因启动子。
另一方面，本发明提供了预防处于发生OA的风险中的哺乳动物受试者中OA发生的方法，其包括向所述犬施用预防有效量的包含AAV载体基因组的rAAV，所述AAV载体基因组包含与启动子可操作地连接的编码HAS2或润滑素多肽的核酸序列。在一个实施方案中，编码HAS2多肽的核酸序列与SEQ ID NO:3中所示的核酸序列具有至少90％同一性，或编码润滑素多肽的核酸序列与SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列具有至少90％同一性。在另一个实施方案中，核酸编码包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的HAS2多肽，或核酸编码包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的润滑素多肽。在一个实施方案中，启动子可以选自CMVIE启动子、RSV启动子、HSV-1TK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α-1抗胰蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、β-肌动蛋白基因启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶基因启动子。在一些实施方案中，rAAV载体包含CBA-cHAS2co-BGH。在其他实施方案中，rAAV载体包含pITR/minCBA-HIb-cLub1co-BGH。
另一方面，本发明提供了重组质粒载体，其包含与启动子可操作地连接的编码犬HAS2或润滑素多肽的核酸序列。在一些实施方案中，编码HAS2多肽的核酸序列与SEQ IDNO:3中所示的核酸序列具有至少90％同一性，或编码润滑素多肽的核酸序列与SEQ ID NO:6中所示的核酸序列核酸具有至少90％同一性。在一些实施方案中，核酸编码包含SEQ IDNO:2中所示的氨基酸序列的HAS2多肽，或核酸编码包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的润滑素多肽。
在一个方面，本公开提供了药物组合物，其包含编码HAS或润滑素并在哺乳动物宿主中体内表达其的重组病毒载体和任选地一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。
在另一个方面，本公开提供了治疗患有骨关节炎或处于发生骨关节炎的风险中的哺乳动物受试者的方法，其包括向所述哺乳动物受试者关节内地施用治疗有效量的上述药物组合物。在一个实施方案中，受试者是人或犬。
在另一个方面，本公开提供了基于腺相关病毒(AAV)的生物递送和表达系统，以用于治疗或预防人或哺乳动物关节中的OA。在一些实施方案中，该方法通过在递送rAAV后在滑膜和/或软骨细胞中长期基因表达人或哺乳动物HAS2或润滑素来实现，所述rAAV包含编码人或哺乳动物HAS2或润滑素的核酸序列、左和右AAV反向末端重复序列(L ITR和R ITR)、AAV包装信号和任选地非病毒非编码填充核酸序列。在一些实施方案中，人或哺乳动物HAS2或润滑素基因在滑膜和/或软骨细胞内的表达受炎症诱导型启动子调节，该启动子位于编码人或哺乳动物HAS2或润滑素的核酸序列的阅读框架的上游，并且被升高的水平的免疫刺激物质特异性激活。
在一些实施方案中，炎症诱导型启动子选自以下启动子：NF-κB启动子、白细胞介素6(II-6)启动子、白细胞介素-1(II-1)启动子、肿瘤坏死因子(TNF)启动子、环加氧酶2(COX-2)启动子、补体因子3(C3)启动子、血清淀粉样蛋白A3(SAA3)启动子、巨噬细胞炎性蛋白-1a(MIP-1a)启动子及其杂合构建体。在一些实施方案中，rAAV载体基因组包含SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:6中所示的核酸序列，或其生物学有效变体。在一些实施方案中，AAV系统包含编码允许监测滑膜和软骨细胞中的载体基因组的标记基因的核酸。在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6中所示的核酸序列或其编码相同氨基酸的保守序列。在一些实施方案中，rAAV载体基因组包含编码SEQ ID NO:2中所示的HAS2多肽或SEQ IDNO:7中所示的润滑素多肽的核酸。rAAV载体基因组可包含与SEQ ID NO:3中所示的核酸序列具有至少80％或90％序列同一性的核酸分子。在其他实施方案中，rAAV载体基因组包含与SEQ ID NO:6中所示的核酸序列具有至少80％或90％序列同一性的核酸分子。
在AAV系统的一些实施方案中，该系统包含编码人或哺乳动物HAS2或润滑素的核酸序列、左和右AAV反向末端重复序列(L ITR和R ITR)、包装信号和任选地非病毒非编码填充核酸序列，以用于治疗或预防骨关节炎(OA)，其中所述人或哺乳动物HAS2或润滑素基因在滑膜和/或软骨细胞内的表达受炎症诱导型启动子调节，该启动子被升高的水平的免疫刺激物质特异性激活。
病毒颗粒和产生病毒颗粒的方法
本文还提供了包含编码HAS2或润滑素的核酸的病毒颗粒。病毒载体可用于递送编码HAS2或润滑素的核酸，以用于在特定位置(例如，关节)内的靶细胞中表达所述蛋白质。已知许多种病毒，并且出于将核酸递送至靶细胞中的目的已经研究了许多病毒。可将外源核酸插入载体，诸如腺相关病毒(AAV)。
在一些实施方案中，病毒颗粒是包含核酸的重组AAV颗粒，所述核酸含有一个或两个AAV ITR和侧翼连接有一个或两个ITR的编码本文所述的HAS2或润滑素的序列。核酸被包封在AAV颗粒中。AAV颗粒还包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，核酸以转录方向包含可操作地连接的组分，包括转录起始和终止序列的调控序列，和目标蛋白质编码序列(例如，编码融合蛋白的核酸)。这些组分在5'和3'末端上侧翼连接有功能性AAV ITR序列。“功能性AAVITR序列”意指ITR序列如所预期的用于拯救、复制和包装AAV病毒体。参见Davidson等，PNAS,2000,97(7)3428-32；Pass ini等，J.Virol.,2003,77(12):7034-40；和Pechan等，Gene Ther.,2009,16:10-16，所有这些文献都通过引用整体并入本文。为了实施本发明的某些方面，重组载体包含至少所有对衣壳化是必需的AAV序列和rAAV感染所需的物理结构。用于本发明的载体的AAV ITR不必具有野生型核苷酸序列(例如，如Kotin,Hum.GeneTher.,1994,5:793-801中所述的)，并且可通过核苷酸的插入、缺失或取代改变，或者AAVITR可源自几种AAV血清型中的任何一种。目前已知超过40种AAV血清型，并且新的血清型和现有血清型的变体不断地被鉴定。参见Gao等，PNAS,2002,99(18):11854-6；Gao等，PNAS,2003,100(10):6081-6；和Bossis等，J.Virol.,2003,77(12):6799-810。任何AAV血清型的使用都被认为在本发明的范围内。在一些实施方案中，rAAV载体是源自AAV血清型的载体，所述AAV血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8和AAVrh.10。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8或AAVrh.10的ITR。在其他实施方案中，rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8或AAVrh.10的衣壳蛋白。
不同的AAV血清型用于优化特定靶细胞的转导或靶向特定靶(例如，关节)内的特定细胞类型。rAAV颗粒可包含相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。例如，rAAV颗粒可包含AAV2衣壳蛋白和至少一种AAV2ITR，或其可包含AAV2衣壳蛋白和至少一个AAV5ITR。在另一个实例中，rAAV颗粒可包含AAV5衣壳蛋白和至少一个AAV2ITR。本文提供了用于产生rAAV颗粒的AAV血清型的任何组合，就如同每种组合已在本文中被明确地说明。
可以使用本领域已知的方法生产rAAV颗粒。参见，例如，美国专利第6,566,118号、第6,989,264号、第6,995,006号。在实施本发明时，用于产生rAAV颗粒的宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、微生物和酵母。宿主细胞也可以是其中AAV rep和cap基因稳定地维持在宿主细胞中的包装细胞或其中AAV载体基因组得以稳定地维持的生产细胞中。示例性包装和生产细胞源自293、A549或HeLa细胞。使用本领域已知的标准技术纯化和配制AAV载体。
在一些方面，提供了用于产生本文公开的任何rAAV颗粒的方法，其包括(a)在产生rAAV颗粒的条件下培养宿主细胞，其中宿主细胞包含(i)一种或多种AAV包装基因，其中每个所述AAV包装基因编码AAV复制或衣壳化蛋白；(ii)rAAV原-载体，其包含侧翼连接有至少一个AAV ITR的编码本文公开的任何融合蛋白的核酸，和(iii)AAV辅助功能；和(b)回收宿主细胞产生的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述至少一个AAV ITR选自AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AA6,AAV7,AAV8,AAV9,AAVrh.8和AAVrh.10ITR。在一些实施方案中，所述衣壳化蛋白选自AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AA6,AAV7,AAV8,AAV9,AAVrh.8和AAVrh.10衣壳蛋白。在进一步的实施方案中，纯化rAAV颗粒。如本文中所用，术语“纯化的”包括不含至少一些也可存在的另外组分(rAAV天然存在于其中或最初从其中制备)的rAAV颗粒的制剂。因此，例如，可使用从来源混合物(诸如培养物裂解物或生产培养上清液)中富集其的纯化技术制备分离的rAAV颗粒。富集可以以多种方式测量，诸如，例如通过溶液中存在的DNA酶抗性颗粒(DRP)的比例，或通过感染性，或者可以相对于存在于来源混合物中的第二潜在干扰物质诸如污染物(包括生产培养污染物或过程中的污染物，包括辅助病毒、培养基组分等)测量其。
本文还提供了包含rAAV颗粒的药物组合物，所述rAAV颗粒包含编码本发明的HAS2或润滑素的核酸和药学上可接受的载体。药物组合物可适用于本文所述的各种施用方式，包括例如全身性施用或局部施用。可以例如通过静脉内注射，通过导管(参见美国专利第5,328,470号)或通过立体定位注射(Chen等，1994,PNAS,91:3054-3057)全身性引入包含编码本文所述的HAS2或润滑素的核酸的rAAV的药物组合物。在一些实施方案中，包含本文所述的rAAV和药学上可接受的载体的药物组合物适于施用于人。此类药学上可接受的载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油等。盐水溶液和葡萄糖水溶液、聚乙二醇(PEG)和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。药物组合物还可包含另外的成分，例如防腐剂、缓冲剂、张力剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子型润湿剂或澄清剂、增粘剂等。可以以单一单位剂量或多剂量形式包装本文所述的药物组合物。通常将组合物配制成无菌和基本上等渗的溶液。
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实施例
实施例1 HAS2AAV载体构建体和评估
实施例1a概述
产生含有密码子优化的犬HAS2cDNA和遍在启动子的rAAV载体并将其包装到AAV2或AAV5衣壳中。通过三重转染法产生大规模载体批次，并通过CsCl梯度进行纯化。通过qPCR针对牛生长激素(BGH)polyA位点(pA)定量载体产量。对于AAV2/HAS2，总共产生4个批次(其中3个批次合并用于体内研究，2x1013DRP/总计)。对于AAV5/HAS2(5x1012DRP/总)产生两个批次来测试产量的一致性并获得足够量的病毒。
对AAV2和AAV5衣壳呈血清反应阴性的22只成年健康犬通过关节内注射接受rAAV2(1、5和10x1011vg/关节)、rAAV5(5x1011vg/关节)或PBS(对照)。在28天的研究后未观察到不良临床体征。组织病理学分析显示用rAAV5处理的关节中的滑膜炎症最轻，并且rAAV2治疗组没有显著变化。在所有rAAV处理的关节的滑膜中和大多数软骨样品中检测到载体基因组(VG)。在两种组织中与rAAV2相比，rAAV5载体导致更高的VG检测和mRNA表达。注意到经处理的关节的滑液中HA水平升高的趋势。总之，所公开的结果证明了编码HAS2的rAAV2和rAAV5载体当通过单次关节内注射向犬施用时将基因转移至犬关节组织并且获得可接受的安全特征。
实施例1b-方法
HA表达载体的克隆和产生。通过GeneArt/Invitrogen的算法对犬HAS2基因(GenBank XM 539153.3；SEQ ID NO:1)进行密码子优化以在犬中表达。合成侧翼连接有NheI-NsiI限制性内切酶位点的密码子优化的犬HAS2cDNA(1656bp；SEQ ID NO:3)。然后将该片段克隆到含有遍在鸡b-肌动蛋白启动子(CBA)、杂合内含子和牛生长激素(BGH)polyA(pA)的质粒中。使用maxi试剂盒(Qiagen)纯化所得的pCBA-HI-cHAS2-BGHpA质粒以用于表达分析。
cHAS2的体外表达和HA的产生。将含有cHAS2的质粒载体转染到293细胞中，3天后将条件培养基和细胞裂解物收集到250μl RIPA缓冲液加蛋白酶抑制剂中。旋转细胞裂解物以除去细胞碎片，并将30μl细胞裂解物加载到4-12％nu-page凝胶上，并在1x Mops缓冲液中运行。将蛋白质凝胶转移到硝酸纤维素膜上，并在4℃下用抗-HAS2(sc-34-068；SantaCruz Biotechnology)在PBS-T 0.1％tween-20中的5％牛奶中进行探测。使用驴抗-山羊二抗(以1:5000稀释度)作为二抗。β肌动蛋白检测用于显示细胞裂解物的相等加载。
体外培养物中HA水平和分子量的定量。通过将pCBA-HI-cHAS2-BGHpA转染到293细胞(在Optimem或完全培养基中)来评估表达HAS2的细胞的HA产量。使用HA测试试剂盒(Corgenix,Inc.)定量条件培养基的HA水平。该试剂盒含有源自聚集蛋白聚糖的HA结合蛋白。通过在琼脂糖凝胶上运行浓缩的条件培养基来评估HA的分子量。并行运行各种HA分子量标记物(Select-HA HiLadder,Hyalose,Austin,TX)。并行运行类似的凝胶，然后消化透明质酸酶，持续24小时。两种凝胶均用All-stain染色。
具有cHAS的rAAV载体的产生。将cHAS2表达盒克隆到含有AAV ITR的质粒中，以产生侧翼连接有AAV反向末端重复序列(前病毒质粒pDC627)的表达盒，以构建psITR/CBA-HI-cHAS2-BGHpA。将600bp的填充DNA(染色体16P1克隆96.4B)包含在表达盒的上游，以产生总共4500bp的病毒载体基因组。为了测试含有cHAS2表达盒的质粒的包装，将293个细胞以8x105个细胞/孔(6孔板)接种，第二天用psITR/CBA-HI-cHAS2-BGHpA或psp70/EGFP、pHLP-19cap2或p5repCMVcap5质粒和pAdHELP以一式两份进行转染(Promega CaPO4试剂盒)。3天后收集细胞，使用qPCR分析和针对BGHpA序列的引物/探针(SEQ ID NO:12-14)滴定裂解物的BGHpA拷贝。含有BGHpA的质粒用作标准。rAAV病毒产量表示为每个细胞的DNA酶抗性颗粒(DRP)的量。使用psitR/CBA-HI-cHAS2-BGH、pIM45BD rep-cap质粒(对于AAV2载体)和pHLP19-cap5(对于AAV5载体)和pAdHELP的三重转染进行大规模载体生产。通过CsCl纯化载体，并使用TaqMan分析和针对BGHpA序列的引物/探针(Applied Biosystems/LifeTechnologies)滴定所得的载体批次。
rAAV/cHAS2在体外在兔软骨细胞和滑膜细胞中的功效。使用兔细胞测试载体转导关节细胞类型诸如初级滑膜细胞和软骨细胞的能力。用1e5DRP/细胞感染细胞并将所述细胞培养3天。收集细胞裂解物以通过Western印迹检测HAS2蛋白，并如上所述定量培养基的HA水平。为了测试HA产生对疾病状态下的基质降解蛋白酶、炎性细胞因子和软骨结构蛋白产生的影响，首先用rAAV载体感染细胞，然后在24小时后用IL-1b进行刺激。24小时后，收集细胞和培养基以用于mRNA分析和HA产生。
正常犬关节中的rAAV/cHAS2评估。使用混合品种的狗(雄性和雌性，8-10kg)。将针对AAV2和/或AAV5衣壳的血清滴度<4或为4的犬用于该研究。通过关节内途径施用编码cHAS2的rAAV2和AAV5载体(AAV2：1、5和10x1011、AAV5,5x1011DRP/关节)。PBS用作阴性对照。注射前每天一次(持续7天)、注射后每天两次(持续7天)以及随后在研究期间每天一次观察动物的临床症状(疼痛、跛行、注射关节的肿胀和其他异常)。4周后处死动物。在施用后-7天、1天、14天和28天收集全血样品用于白细胞(WBC)计数。在第-7天、第14天和第28天收集滑液(SF)样品用于定量HA水平。收集滑膜组织、软骨和肝脏样品用于DNA和RNA分离。使用BGHpA引物/探针组(Applied Biosystems/Life Technologies)通过qPCR分析测定cHAS2载体基因组和mRNA拷贝。对于组织学分析，将膝盖的内侧(胫骨、股骨、滑膜)包埋在石蜡中并切片。切片用甲苯胺蓝染色，并由委员会认证的兽医病理学家进行检查。评估软骨的软骨损伤严重度和蛋白聚糖损失(评分：0-5)。针对炎症细胞的密度对滑膜病理学进行评分(评分：0-5)，因为未观察到滑膜增厚。
实施例1c-结果
HAS2表达盒的密码子优化和产生。哺乳动物HAS2是一种高度保守的蛋白质。例如，HAS2的人和犬氨基酸序列仅含有2个氨基酸差异(99.3％同一性)。类似地，犬与兔HAS2之间仅有3个氨基酸不同(99.5％)。在DNA水平上，犬与人HAS2合酶cDNA之间的相似性为93.9％。由于密码子优化可改善基因表达，因此由GeneArt/Invitrogen优化犬HAS2GenBank序列(XM539153.3)。这导致与原始GenBank序列具有78％相似性的核苷酸序列。优化的cDNA的GC含量从44.4％增加至59.0％。该cDNA用于产生具有CBA启动子的遍在表达质粒，以允许HAS2的组成型表达，与内源启动子不同(图1A)。CBA启动子受各种促炎和抗炎细胞因子的影响更小。
体外HAS2表达和HA产生。为了在体外测试HAS2蛋白的表达，用CBA-HI-cHAS2-BGHpA质粒载体的两个克隆(#1和2)转染293细胞，然后通过Western印迹分析细胞裂解物的HAS2蛋白(膜蛋白)。用该表达质粒转染的细胞显示出处于64kDa的条带，其是cHAS的预期大小(未显示)。我们接下来评估了293细胞中HAS2蛋白的过表达是否导致培养基中HA的检测增加，所述增加的检测表明HA的产生和跨细胞膜的分泌。与未转染的细胞和CBA-EGFP转染的细胞相比，来自用pCBA-cHAS2转染的细胞的培养基中的HA水平分别增加了6.5倍和9倍(图1B)。因此数据证实了cHAS2在细胞中的过表达导致细胞外区室中的HA水平升高。在琼脂糖凝胶上评估体外产生的HA的大小。数据显示从用HAS2表达盒转染的细胞获得的条件培养基中的高分子量HA。该材料的尺寸大于1.5兆道尔顿(MDa)(基于利用HA分子量标记物的估计)。在用透明质酸酶消化后，该物质消失，表明材料为HA(图1C)。
具有HAS2表达盒的rAAV载体的产生。随后将cHAS2co表达盒克隆到具有AAV ITR的质粒中。所得病毒基因组的示意图显示于图1A中。在小规模包装实验中测试了用AAV2和AAV5衣壳和HAS2cDNA产生rAAV载体的能力(图2A)，随后进行更大规模的载体产生。可以使用标准三重转染方法产生AAV2和AAV5载体(图2B)。通过感染293细胞并分析培养基中HA水平的产生来测试该材料的效力。AAV2和AAV5载体均导致培养基中HA的剂量反应性增加(图2C，D)。
正常犬关节中rAAV/HAS2载体评估。通过关节内施用将具有cHAS2的rAAV2和AAV5载体递送到正常狗的关节中，并评估动物28天。在研究期间未观察到不利的临床体征、体重变化(图3A)、跛行或死亡。一些动物在第-7天具有升高的白细胞(WBC)计数，这可能是由于运输应激造成的。一般而言，第1天、第14天和第28天的WBC计数在正常限度范围内。来自注射PBS、AAV的(左)和对侧的(未注射的)的膝盖的组织学评价显示出非常少的蛋白聚糖损失和软骨退化(评分范围0-0.5；最大分值5)(图3B)。这些微小的变化是典型的与年龄相关的自发变化。对于PBS-和AAV2-处理的关节和对侧关节观察到轻微的滑膜变化(图3C)。在用AAV5载体处理的雄性和雌性的所有左膝中均观察到最小限度至轻度滑膜炎(通常延伸至关节囊和内侧副韧带)(在对侧关节中未观察到滑膜炎)。因此，整体上治疗耐受良好，几乎未观察到不利影响。
分析从滑膜和软骨收集的组织样品以检测病毒基因组(图4A、6A)。最接近注射部位收集的滑液样品，样品#3，显示在所有AAV处理的关节中存在载体基因组(图4B)。AAV2处理的关节含有大约0.01至2个载体基因组(VG)/细胞。有趣的是，尽管低剂量组与高剂量组之间存在10倍的差异，但对于AAV2观察到的剂量反应轻微。用AAV5载体处理的关节显示更高和更一致的检测，范围为1至12个拷贝/细胞。在一些对侧(未注射的)关节中，检测到低水平的VG，其在低AAV2处理组中更明显，在较高AAV2剂量和AAV5组中更加零星发生(未显示)。
分析从注射部位进一步收集的滑膜样品(样品#1)以评估关节中的AAV扩散(图4C)。用AAV2低剂量注射的关节显示出更一致的VG检测。这些水平与滑膜样品#3中测量的水平相当。在AAV5治疗组中，所有滑膜#1样品具有始终可检测的VG(在3倍内)。然而，它们低于在滑膜#3中检测到的VG水平，因此证明了位置依赖性转导。
通过定量载体来源的mRNA分析来自载体基因组的表达。对于滑膜样品#3，在AAV2处理的低、中和高组的2/5、4/5和4/5中检测到表达，而所有AAV5处理的关节具有可检测的mRNA拷贝(图5A)。还在滑膜#1中检测到AAV5载体的载体表达，尽管水平较低，类似于在该位置处VG的检测减少(图5B)。mRNA的检测与VG检测有很好的相关性；将滑膜样品#3中每个单独注射的关节中的mRNA和VG DNA作为实例显示(图5C)。
犬软骨中的载体基因组检测。分析从股骨髁和胫骨坪收集的软骨样品以检测病毒基因组(VG；图6A)。将在每个单个注射的关节中检测到的载体DNA和mRNA以及股骨髁中的组平均值作为实例显示(图6B、C)。数据显示AAV5载体以一致的方式存在于软骨中，并显示相当水平的载体来源的转录物。相当剂量的AAV2载体(培养基)产生与AAV5载体相似的VG水平，但显示出低至约1/100的mRNA水平。另外，AAV2VG拷贝似乎与载体剂量具有反向相关性。注射rAAV5的关节在从胫骨坪收集的软骨样品中还显示载体检测和表达，而在rAAV2处理的关节中未检测到所述载体及其表达(图6D)。所有载体均导致对侧(未注射的)关节中载体DNA检测的最小量。
滑膜和软骨结果概括于图7A中。对于滑膜基因转移，与AAV2载体相比，AAV5载体在两个滑膜样品位置中均导致高约10倍的载体DNA拷贝。通过AAV5引起的向软骨的基因转移为向滑膜的基因转移的1/20至1/10，而在滑膜和软骨中均观察到相似水平的AAV2载体基因组。图7B中概述了rAAV5载体来源的基因组和mRNA检测，在所有检查的组织样品中显示了一致的通过rAAV5/HAS2载体的基因转移和表达。本申请人认为这个结果非常出乎意料。
滑液中的HA水平分析。为了确定在rAAV载体施用后是否可以检测到滑液中HA水平的任何变化，定量第-7天(基线)和第28天收集的样品中的滑膜HA水平。由于在动物中检测到高水平的变化，因此将每只动物的HA水平针对每只动物的基线水平进行标准化。数据显示，与经PBS处理的动物相比，AAV2/高和AAV5/中剂量平均升高滑液中的HA水平(图8A和8B)。
实施例1d-结论
为了在体内在关节中提供HA的过表达，本申请人产生了具有两种衣壳血清型的rAAV载体。AAV衣壳血清型的选择是重要的，因为靶物种中任何预先存在的中和抗体可中和治疗性载体并因此阻断rAAV载体的基因转移。本文公开的结果显示，所分析的大多数狗具有低水平的针对AAV2和AAV5衣壳的中和抗体。因此，本申请人在关节内注射后直接在靶组织(即犬膝关节)中测试AAV2和AAV5衣壳定位。由于预期HA表达对滑膜细胞和软骨细胞都有益，因此分别定量犬滑膜和软骨样品中的载体基因组拷贝。数据显示，AAV2在体内对犬滑膜和软骨组织提供了非常不一致的基因转移，并且几乎没有剂量-反应效应，其原因尚不清楚。在兔OA关节中进行的类似实验用可比较的载体剂量证明了非常一致的rAAV2载体基因组检测(Kyostio-Moore 2015)。与AAV2载体相反，在两种组织类型(n＝5/组)中均以一致的方式检测到AAV5载体基因组。
重要的是，软骨样品中AAV5的检测是令人惊讶和出乎意料的，因为据报道软骨由于广泛的细胞外基质而在体内条件下难以转导，并且目前没有关于在关节内递送后在大型动物的软骨中检测到AAV5的其他报道。另外，现在公开的犬研究在犬滑膜组织中产生了不可预测的高水平的rAAV5载体，与软骨中的rAAV5载体水平相比，滑膜中的rAAV5载体水平也高出约2个对数，表明AAV5偏好犬滑膜衬里。这种偏好表达模式同样在本公开之前无法预测。
除了检测高水平的载体以外，还通过mRNA分析在犬滑膜和软骨组织中确认了重组HAS2表达，表明CBA启动子在两种组织类型中都是有功能的。另外，在软骨样品中检测到AAV5的转录物证实了软骨细胞被载体转导而非被隔离在软骨的细胞外基质中的病毒转导。对于AAV2，在滑膜衬里中也观察到相当水平的载体基因组和转录物。然而，来自AAV2载体的mRNA表达令人惊讶地为软骨样品中相应载体基因组的检测的约1/100，表明一些载体保留在软骨细胞外，可能保留在细胞外基质中。只有在本申请人进行了重要的非常规实验后才能理解这些关键差异。
尽管只向每只动物中的一个关节施用载体，但偶尔在对侧未注射的关节中检测到载体基因组。这主要在从AAV2处理的关节获得的滑液样品中观察到。然而，在对侧关节中观察到载体基因组的动物在这些关节中均不具有任何可检测的HAS2转录物。
总之，本文公开的数据表明AAV5衣壳通过关节内递送至犬关节提供良好的基因转移。这基于受试者中低的预先存在的对AAV5的体液免疫力和在关节内注射后转导关节组织的能力。至关节内的注射不仅可以提供向滑膜衬里的基因转移，还可以提供向软骨的软骨细胞的基因转移。两种组织类型都将受益于由所公开的基因递送组合物和方法提供的增加的HA合成：滑膜，受益于增强的在滑液中提供润滑的能力；软骨，通过用作支架用于增强基质附着从而改善软骨健康。这些结果表明，通过AAV介导的HAS2基因向疾病部位的转移产生的HA过表达将减轻OA病理学和疼痛。
实施例2-润滑素AAV载体的构建和评估
实施例2a-概述
最近，已证明重组润滑素蛋白的关节内注射减少了大鼠OA模型中的软骨退化(Flannery 2006)。然而，施用于关节内的重组润滑素在滑液中具有非常短的半衰期，其中大部分蛋白质在72小时内被清除(Vugmeyster 2011)。因此，需要重复的关节内注射，这是费力的、有压力的和昂贵的。与HAS2相反(参见实施例1)，润滑素由大的cDNA编码并且在其粘蛋白样结构域中含有多个DNA重复，使得其难以相应地装入rAAV载体和高水平表达。为了避免该问题，本申请人产生了缩短的犬润滑素cDNA来优化小的表达盒以增加润滑素产生。重要的是，在本公开之前，全长犬润滑素序列和本文公开的缩短形式都是未知的。
简言之，本申请人产生了全长犬润滑素的cDNA，其随后被用于设计犬润滑素的缩短和密码子优化的形式(cLub1co)。然后将后者用于构建表达各种润滑素的质粒。在转染入HEK293细胞后，表征质粒的润滑素mRNA和蛋白质产生。数据显示每种构建体均产生润滑素mRNA和分泌的润滑素。最后，本申请人用cLub1表达盒产生rAAV载体并证明了rAAV/cLub1载体产生的可行性。用该构建体感染的HEK293细胞合成并分泌犬润滑素。
实施例2b-方法
犬润滑素的克隆。由于GenBank(不完整序列：GenBank号ABD38836.1)中不存在犬全长润滑素cDNA，因此从定制合成的犬软骨cDNA文库中获得完整的犬cDNA。为实现该目的，使用qPCR和各种引物产生重叠片段。然后将全长cDNA(SEQ ID NO:4)用于设计犬润滑素(cLub1)的缩短形式，其类似于公开的较短版本的人润滑素(Flannery 2009)。该较短的犬润滑素在编码氨基酸378至782的序列中含有缺失。对缩短的润滑素序列进行密码子优化(cLub1co)并合成其(GeneArt/Invitrogen)。将cLubco片段(KpnI平端化至PmeI)克隆入含有CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子和缩短的杂合内含子(HIb)(min CBA)和牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化(pA)位点的质粒的Mfe(平端化的)–PmeI位点。将连接反应物转化至大肠杆菌(E.coli)稳定II细胞中并在30℃下生长以使DNA重排最小化。通过限制性内切酶分析来分析所得的克隆，并通过DNA测序分析克隆连接。产生另外的构建体，其含有6x组氨酸(6xHis)密码子和存在于内含子序列中的两个“ATG”序列中的修饰。表达质粒用于体外分析润滑素表达。
犬润滑素的表达分析。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将润滑素表达质粒转染到HEK293细胞中，并使细胞生长72小时。为了分析润滑素mRNA表达，收集细胞并使用对BGH pA特异的引物/探针通过实时(RT)qPCR测定来测量转录物水平(7500实时PCR系统；Applied Biosystems,Foster City,CA)。为了分析蛋白质产量，收集培养基并浓缩约20至30倍(100k MWCO过滤器，Millipore)。将样品分别在MOPS或Tris-乙酸盐缓冲液中的4-12％Bis-Tris凝胶或3-8％Tris-乙酸盐(NuPAGE；Thermo Fisher Scientific)SDS-PAGE凝胶(还原的)上运行。使用小鼠抗-润滑素抗体(9G3，Millipore)(Ai2015)和山羊抗小鼠-HRP作为二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)通过Western印迹检测润滑素。
AAV/cLub1co的产生。将cLub1表达盒克隆入含有AAV反向末端重复序列(ITR)的质粒中，以产生侧翼连接有AAV ITR(前病毒质粒pDC627)的表达盒，以构建psITR/minCBA-HI-cLub1co-BGHpA。为了测试含有cLub1表达盒的质粒的包装，将293细胞以8x105个细胞/孔(6孔板)接种，第二天用psITR/minCBA-HI-cLub1co-BGHpA或psp70/EGFP、pHLP-19cap2(AAV2)或p5repCMVcap5(AAV5)质粒和pAdHELP(Promega CaPO4试剂盒)转染，以将载体包装到AAV2或AAV5衣壳中。3天后收集细胞，使用对BGH pA序列特异的引物/探针(AppliedBiosystems/Life Technologies)和连续稀释的含有BGH pA的线性化质粒DNA的标准曲线，通过qPCR测定(7500实时PCR系统)定量裂解物的载体产量。rAAV病毒产量表示为每个细胞的DNA酶抗性颗粒(DRP)的量(Clark 1999)。
使用pSITR/minCBA-HI-cLub1co-BGH、pHLP19-cap5(对于AAV5载体)和pAdHELP的三重转染进行研究规模载体生产。通过CsCl梯度纯化载体，并如上所述(University ofMassachusetts Medical School,Worcester,MA)对产量进行定量。
实施例2c-结果
短的犬润滑素的产生。由于GenBank中存在的犬润滑素序列缺失了大部分外显子6(编码857个氨基酸)，因此产生全长犬润滑素cDNA(4017bp，不包括终止密码子；SEQ ID NO：4)，其编码具有总共1339个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO:5；图9)，其略微小于1404个氨基酸的人序列。在氨基酸水平，犬润滑素序列与人润滑素(SEQ ID NO:11；图16)具有79％同一性。
由于包装限制，全长犬润滑素太大而不能被装入rAAV载体中，因此产生了缩短形式的犬润滑素。通过缺失编码粘蛋白样结构域中的氨基酸378至782的序列产生这种较短形式的犬润滑素“Lub1”，并产生编码983个氨基酸(SEQ ID NO:7)的2949bp长的cDNA(SEQ IDNO:6)。尽管缺失了大部分粘蛋白样结构域，但仍保留了约10个KEPAPTT样肽重复序列。重要的是，这些都与经典的人重复序列不相同，但即使它们是相同的，技术人员也无法预测缩短的犬Lub11的递送在治疗OA方面是否有效。这些重复被认为对润滑性质很重要，因为它们是潜在的O-连接的寡糖附接位点。该较短的润滑素(Lub1co；SEQ ID NO:6)的密码子优化使GC含量从44％增加至60％，并且与原始犬DNA序列具有74％的核苷酸相似性。然后将该较短的犬cDNA用于产生具有minCBA启动子、cLub1co和BGHpA的质粒表达盒(图10)。还制备了具有6xHis-标签和内含子区域中推定的ATG核苷酸序列中的修饰(以最小化错误的翻译起始位点)的表达质粒。
犬润滑素表达分析。通过证明转染的293细胞中mRNA水平升高，体外证实了来自最小CBA启动子(minCBA-cLub1co)质粒的cLub1co的表达(图11A)。具有较短内含子的minCBA-cLub1co构建体的活性低至使用全长CBA-HI构建体(CBA-cLub1co)的约1/3。用含有全长润滑素和非密码子优化的构建体(CBH-cLubr)的质粒观察到非常少的转录。还对具有各种修饰的表达盒进行转录物分析(图10、11B)。来自minCBA-Lub1co的表达与EGFP和具有C末端6xHis-标签的构建体的表达相当。缺失存在于杂合内含子中的推定的两个ATG密码子似乎使表达水平升高约2倍。在Lub1co转染的细胞中观察到的另外的形态变化也表明Lub1表达，因为这些变化在未转染的细胞或EGFP-质粒转染的细胞中不存在(未显示)。
使用润滑素抗体通过Western印迹分析测试来自各种表达质粒的犬Lub1蛋白的产生，并在浓缩的培养基中显示了250-380kDa的蛋白质(图12A)。基于1339个氨基酸的预期大小约为160kDa，但信号的较大和扩散模式可能归因于糖基化。在未转染的细胞或EGFP质粒转染的细胞中几乎观察不到检测。另外，ΔATG修饰似乎增加了润滑素的检测，类似于对于来自该构建体的升高的转录物水平所观察到的。还从前病毒AAV质粒确认了蛋白质表达，显示了相当的蛋白质检测(图12B)。总之，这些结果证明了具有犬润滑素表达盒的质粒表达并分泌糖基化的润滑素蛋白。
具有犬润滑素表达盒的rAAV载体的产生。在证实了来自质粒载体的犬润滑素表达后，我们接下来测试表达盒是否可在小规模包装实验中被包装到AAV2和AAV5衣壳血清型中(图13A、B)。数据显示AAV2和AAV5衣壳对犬润滑素的包装效率相当，如对于EGFP表达载体所观察到的。包含6xHis-标签不改变rAAV载体产量。对于具有犬HAS2表达盒的AAV2载体，测量到低至约1/5的包装水平。然后进行AAV5/minCBA-cLub1的研究规模生产以评估按比例放大的载体生产。载体产量与以EGFP作为转基因的标准AAV2和AAV5载体的载体产量相当(数据未显示)。然后在体外在HEK293细胞中测试rAAV5载体的润滑素产生和分泌。通过Western印迹分析条件培养基证明了犬润滑素的剂量依赖性检测(图14)。总之，数据表明缩短形式的犬润滑素可用于产生rAAV载体，并且用该载体感染的细胞可介导润滑素合成和分泌到培养基中。
实施例2d-结论
如上所示，作为转基因的润滑素对rAAV产生提出了许多挑战。首先，具有必需表达元件的润滑素cDNA的大小超过rAAV包装能力，因此需要较短的cDNA形式。有趣的是，与粘蛋白样结构域中的人润滑素氨基酸序列相比，犬序列中不存在完美的KEPAPTT重复序列(图16)。为了产生重组rAAV载体，任何重复的DNA序列都可能带来挑战，因为重复序列可通过在病毒产生过程中引起DNA缺失和重排而降低病毒基因组的稳定性和完整性。然而，所公开的(并且令人惊讶的)结果表明，考虑到与标准EGFP报道载体相比获得了相当的载体产量，含有和表达新型犬润滑素序列的rAAV病毒的产生是可行的。此外，用所公开的载体感染的细胞均产生并分泌犬润滑素。因此，这是证明用于润滑素基因递送的单一rAAV载体策略的第一份报告。
实施例3-在内侧半月板韧带释放(MMR)模型中进行的AAV-HAS2的体内功效研究
本研究的目的是使用犬OA后膝关节模型的总体观察和组织学评估HA合酶-2基因疗法的功效。将12只为特定目的而饲养的首次接触实验的雄性杂种狗(猎狐犬表型，≈20-23kg)麻醉，并通过关节镜(d-14)完成右后膝关节的内侧半月板韧带释放(MMR)。
在第0天(n＝6只狗/组)关节内施用磷酸盐缓冲盐水(PBS对照)或5x1011个携带犬透明质酸合酶2(cHAS-2)的重组AAV5的DNA酶抗性颗粒[drp]。
在第0天和第182天从所有狗收集血浆用于关节炎症生物标志物水平分析。在第0天、第56天、第112天和第182天从所有PBC对照和cHAS-2处理组收集右侧和左侧滑液用于HA水平分析。
在第182天对狗实施安乐死，并测量由半月板韧带释放诱导的软骨缺损(通过印度墨水染色指示的)，并根据由国际骨关节炎研究学会(OARSI)标准技术收集关节组织用于组织病理学。
使用利用GraphPad Prism 6统计软件的Kruskal-Wallis分析总体和组织学数据。
测量滑液中的总HA水平，在总HA水平上未显示出任何处理相关的差异(图17)。
在第182天从处理的关节收集滑膜和软骨样品并分析病毒基因组的检测(图18A)。在滑膜(图18A)和大部分软骨(图18B)样品中的每个单独的rAAV5/cHAS-2注射关节中检测到载体来源的DNA和mRNA。数据概述于图18C中，显示了两种组织样品中载体基因组和mRNA的组平均值。
没有证据表明局部或全身毒性与HA合酶-2基因疗法的关节内施用相关。与PBS处理相比，cHAS-2处理组中的软骨结构得到一致保持。在6只rAAV5/cHAS2处理的狗的4只中，内侧股骨髁和内侧胫骨坪关节表面上的损伤的尺寸和深度减小更明显。
在图19中，基于Cook等(2001)的组织病理学评分显示在每个内侧股骨髁和内侧胫骨软骨图像(2x)的左下角中。狗994731/PBS向下广泛侵蚀至中间区域，其中两个软骨表面都有相当多的蛋白聚糖损失。未观察到软骨保护作用。用rAAV5/cHAS2处理的狗993107在股骨软骨的浅表区域具有浅的病变，但总体而言，软骨的其余部分保持良好并且几无蛋白聚糖损失。胫骨坪病变深入至中间区域，具有中度蛋白聚糖消耗。在股骨髁中观察到软骨保护作用，因为下面的软骨相对正常。用rAAV5/cHAS2处理的狗992879在股骨软骨中具有一定的蛋白聚糖损失，但整体形态得以保持。胫骨坪具有明确的局灶性侵蚀，但大部分软骨得以保持。因此，存在一些软骨保护的证据，因为病变较小且不太严重。
值得注意的是，在软骨样品中没有可检测的载体的rAAV5处理动物之一也具有最大的胫骨坪病变区域(狗993107，图19)。相反，在滑膜和软骨中均检测到载体但在软骨中缺乏mRNA检测的rAAV5处理动物之一(狗992879)具有最佳的软骨结构。
因此，rAAV5-HAS2载体的存在与最佳软骨结构相关，并且其缺失与最大的胫骨坪病变区域相关。因此，尽管载体/mRNA检测存在差异，但表达HAS2的rAAV5载体似乎已引发所需的临床结果。
综上所述，结果证实了至犬OA关节的滑膜和软骨中的一致的rAAV5介导的基因转移，并证明了持续至少6个月的持续的载体来源表达。组织学分析表明在大部分cHAS-2处理的关节中软骨病理学减轻并且疾病进展延迟，而在滑液中对于总HA水平几乎未观察到差异。后者可表明HA在软骨和滑膜组织中的局部表达具有一些疾病改善特性而不提高总滑液HA水平。或者，通过测量总HA水平无法检测的合成的HA的分子量变化也可能有助于rAAV5/cHAS-2的有益作用。
参考资料
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Cook et al.The OARSI histopathology initiative-recommendations forhistological assessments of osteoarthritis in the dog.OsteoarthritisCartilage,2010；18suppl 3:S66-79.
在以下编号的段落中进一步描述本发明：
1.一种治疗患有骨关节炎(OA)的哺乳动物受试者的方法，其包括向所述哺乳动物受试者关节内施用治疗有效量的重组腺相关病毒(rAAV)，所述重组腺相关病毒包含与启动子可操作地连接的编码骨保护性或骨再生多肽的核酸，其中所述多肽在哺乳动物受试者中以有效减轻OA症状的量体内表达。
2.段落1的方法，其中所述多肽是透明质酸合酶(HAS)、润滑素、白细胞介素-1受体(IL-1R)拮抗剂、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、转化生长因子β1(TGFβ1)、骨形态发生蛋白7(BMP7)、葡萄糖胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶(GFAT)、白细胞介素10(IL-10)、血红素加氧酶-1HO-1、其生物活性截短或其组合。
3.段落1或2的方法，其中所述多肽是HAS2多肽。
4.段落1-3中任一段的方法，其中所述哺乳动物受试者是人、犬或猫。
5.段落1-4中任一段的方法，其中所述哺乳动物受试者是犬。
6.段落5的方法，其中所述多肽是犬HAS2。
7.段落5或6的方法，其中所述HAS2多肽包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或在所述受试者中体内表现出体内HAS2活性的其片段、变体或其同系物。
8.段落5-7中任一段的方法，其中所述HAS2多肽包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
9.段落5-8中任一段的方法，其中所述编码HAS2多肽的核酸具有与SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。
10.段落5-9中任一段的方法，其中所述rAAV包含rAAV载体基因组，其从5'至3'包含以下元件：5'AAV反向末端重复序列(ITR)、填充核酸、启动子、内含子(IN)、cHAS2密码子优化的cDNA、多聚腺苷酸化信号(pA)和3'AAV ITR。
11.段落10的方法，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。
12.段落1或2的方法，其中所述多肽是润滑素多肽。
13.段落12的方法，其中所述润滑素多肽包含与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或在所述受试中体内表现出润滑素活性的其片段、变体或同系物。
14.段落13的方法，其中所述润滑素多肽包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。
15.段落13或14的方法，其中所述编码润滑素多肽的核酸具有与SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。
16.段落13-14中任一段的方法，其中所述rAAV包含由质粒pITR/minCBA-HI-cLub1co-BGH编码的rAAV载体基因组。
17.段落1-9或12-16中任一段的方法，其中所述启动子选自CMV IE启动子、RSV启动子、HSV-1TK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α-1抗胰蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、β-肌动蛋白基因启动子、CBA启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶(CK)基因启动子。
18.段落1的方法，其中所述AAV包含AAV2或AAV5衣壳。
19.一种增加犬的软骨细胞和/或滑膜细胞中透明质酸产生的方法，其包括向所述犬施用rAAV的步骤，其中所述rAAV包含含有与启动子可操作地连接的编码HAS2酶的核酸的rAAV载体基因组，并且其中在施用后所述HAS2酶被表达并催化另外的透明质酸的产生，从而升高透明质酸(HA)在犬中的水平。
20.段落19的方法，其中以足够的量产生所述HAS2以治疗犬的OA症状。
21.段落20的方法，其中将所述HA水平恢复至在健康犬中发现的水平。
22.一种治疗患有OA的犬的方法，其包括向所述犬施用治疗有效量的rAAV，其中所述rAAV包含含有与启动子可操作地连接的编码HAS2的核酸的AAV载体基因组。
23.一种治疗患有OA的人的方法，其包括向所述人施用治疗有效量的rAAV，其中所述rAAV包含含有与启动子可操作连接的编码HAS2的核酸的AAV载体。
24.段落19-23中任一项的方法，其中所述编码HAS2的核酸与SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列具有至少90％同一性，或编码具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的HAS2。
25.段落19-23中任一项的方法，其中所述HAS2具有SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
26.一种增加犬的软骨细胞和/或滑膜细胞中的润滑素产生的方法，其包括向犬施用rAAV的步骤，其中所述rAAV包含含有与启动子可操作地连接的编码润滑素的核酸的rAAV载体，并且其中在施用后表达所述润滑素，从而升高所述犬中的润滑素水平。
27.段落26的方法，其中以足够的量产生所述润滑素以治疗犬的OA症状。
28.段落26的方法，其中将所述润滑素水平恢复至健康犬中发现的水平。
29.一种治疗患有OA的犬的方法，其包括向所述犬施用治疗有效量的rAAV，其中所述rAAV包含有与启动子可操作地连接的编码润滑素的核酸的rAAV载体基因组。
30.一种治疗患有OA的人的方法，其包括向所述人施用治疗有效量的rAAV，其中所述rAAV包含含有与启动子可操作地连接的编码润滑素的核酸的AAV载体基因组。
31.段落26-30中任一项的方法，其中所述编码润滑素多肽的核酸与SEQ ID NO:6中所示的序列具有至少90％同一性，或者所述核酸编码具有与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的润滑素。
32.段落26-30中任一项的方法，其中所述润滑素具有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。
33.段落19-32中任一项的方法，其中所述启动子选自CMV IE启动子、RSV启动子、HSV-1TK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α-1抗胰蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、CBA启动子、β-肌动蛋白基因启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶基因启动子。
34.段落19-25中任一项的方法，其中所述rAAV包含由质粒Ps-AAV-ITR/CBA-cHAS2co-BGH编码的rAAV载体基因组。
35.段落26-32中任一段的方法，其中所述rAAV包含由质粒Ps-AAV-ITR/minCBA-HI-cLub1co-BGH编码的rAAV载体基因组。
36.一种预防处于其风险中的哺乳动物受试者中的OA发展的方法，其包括向所述犬施用治疗有效量的rAAV，其中所述rAAV包含含有与启动子可操作地连接的编码HAS2的核酸的rAAV载体基因组。
37.段落36的方法，其中所述编码HAS2多肽的核酸与SEQ ID NO:2中所示的序列具有至少90％同一性，或编码具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的HAS2。
38.段落36或37的方法，其中所述HAS2多肽包含SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列。
39.一种预防处于其风险中的哺乳动物受试者的OA发展的方法，其包括向所述犬施用治疗有效量的rAAV，其中所述rAAV包含含有与启动子有效连接的编码润滑素的核酸的rAAV载体基因组。
40.段落39的方法，其中所述编码润滑素的核酸与SEQ ID NO:6中所示的序列具有至少90％同一性，或者所述核酸编码具有与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的润滑素。
41.段落40的方法，其中所述润滑素多肽具有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。
42.段落36-38中任一项的方法，其中所述启动子选自CMV IE启动子、RSV启动子、HSV-1TK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α-1抗胰蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、CBA启动子、β-肌动蛋白基因启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶基因启动子。
43.段落26的方法，其中rAAV包含由质粒Ps-AAV-ITR/CBA-cHAS2co-BGH编码的rAAV载体基因组。
44.段落26的方法，其中所述rAAV包含由质粒Ps-AAV-ITR/minCBA-HI-cLub1co-BGH编码的rAAV载体基因组。
45.段落19-44中任一段的方法，其中关节内施用所述rAAV。
46.一种重组质粒载体，其包含与启动子可操作地连接的编码犬HAS2多肽的核酸序列。
47.段落46的重组质粒，其中编码HAS2多肽的核酸序列与SEQ ID NO:3中所示的序列具有至少90％同一性，或者所述核酸编码包含与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基序列的HAS2多肽。
48.段落46或47的重组质粒，其中所述HAS2多肽包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
49.段落46-49中任一段的重组质粒，其包含pCBA-HI-cHAS2-BGHpA。
50.一种包含与启动子可操作连接的编码缩短的犬润滑素的核酸序列的重组质粒载体。
51.段落50的重组质粒，其中所述编码润滑素的核酸序列与SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列具有至少90％同一性，或者所述核酸编码包含与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的润滑素。
52.段落50或51的重组质粒，其中所述润滑素多肽具有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。
53.段落46-49或50-52中任一段的重组质粒，其中所述启动子选自CMV IE启动子、RSV启动子、HSV-1TK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α-1抗胰蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、CBA启动子、β-肌动蛋白基因启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶基因启动子。
54.一种包含SEQ ID NO:8中所示的核苷酸序列的重组AAV5病毒载体。
55.一种包含段落53的rAAV载体的rAAV。
56.一种药物组合物，其包含段落55的rAAV，和至少一种药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。
57.一种治疗患有骨关节炎的哺乳动物受试者的方法，其包括向所述哺乳动物受试者关节内施用治疗有效量的段落56的药物组合物。
58.段落57的方法，其中所述哺乳动物受试者是人或犬科动物。
59.一种基于腺相关病毒(AAV)的生物递送和表达系统，其用于通过在滑膜和/或软骨细胞中长期基因表达HAS2或润滑素来治疗哺乳动物关节中的OA，其包括rAAV，其中所述rAAV包含rAAV载体，其包含编码HAS2或润滑素的核酸序列、左和右AAV反向末端重复序列(L ITR和R ITR)，并且其中HAS2或润滑素基因在滑膜和/或软骨细胞内的表达受启动子调控，所述启动子位于编码HAS2或润滑素的核酸序列的阅读框架的上游，并且被升高水平的免疫刺激物质特异性激活。
60.段落59的AAV系统，其中所述HAS2是哺乳动物HAS2。
61.段落59或60的AAV系统，其中所述HAS2是人HAS2。
62.段落59-61中任一段的AAV系统，其中所述启动子是炎症诱导型启动子。
63.段落62的AAV系统，其中所述诱导型启动子选自：NF-κB启动子、白细胞介素6(IL-6)启动子、白细胞介素-1(IL-1)启动子、肿瘤坏死因子(TNF)启动子、环加氧酶2(COX-2)启动子、补体因子3(C3)启动子、血清淀粉样蛋白A3(SAA3)启动子、巨噬细胞炎症蛋白-1a(MIP-1a)启动子及其杂合构建体。
64.根据段落59-63中任一段的AAV系统，其中所述rAAV载体基因组包含编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的HAS2、包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的润滑素或其功能变体的核酸。
65.段落59-64中任一段的AAV系统，其中所述rAAV载体基因组包含允许监测滑膜和/或软骨细胞中的载体基因组的标记基因。
66.段落59-65中任一段的AAV系统，其中所述rAAV载体基因组包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6中所示的核酸序列具有至少80％或90％序列同一性的核酸。
67.段落59-66中任一段的AAV系统，其中所述rAAV载体基因组包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6中所示的核酸序列。
68.段落59-67中任一段的AAV系统，其用于治疗或预防骨关节炎(OA)。
69.一种药物组合物，其包含段落59-68中任一段的AAV系统。
70.一种包含rAAV载体的rAAV，其中所述rAAV载体包含与启动子可操作地连接的编码犬HAS2多肽的核酸序列。
71.段落70的rAAV，其中所述编码HAS2多肽的核酸序列与SEQ ID NO:3中所示的序列具有至少90％的同一性，或者所述核酸编码包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的HAS2多肽。
72.段落70或71的rAAV，其中所述HAS2多肽包含SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列。
73.一种包含rAAV载体的rAAV，其中所述rAAV载体包含与启动子可操作连接的编码缩短的犬润滑素的核酸序列。
74.段落73的rAAV，其中所述编码润滑素的核酸序列与SEQ ID NO:6中所示的核苷酸序列具有至少90％同一性，或者所述核酸编码包含与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的润滑素。
75.段落73或74的rAAV，其中所述润滑素多肽具有SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列。
76.段落50-53中任一段的rAAV，其中所述rAAV载体包含SEQ ID NO:8中所示的核苷酸序列。
77.段落71-72或74-76中任一项的rAAV，其中所述启动子选自CMV IE启动子、RSV启动子、HSV-1TK启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、磷酸甘油酸激酶基因启动子、金属硫蛋白基因启动子、α-1抗胰蛋白酶基因启动子、白蛋白基因启动子、胶原酶基因启动子、弹性蛋白酶I基因启动子、CBA启动子、β-肌动蛋白基因启动子、β-珠蛋白基因启动子、γ-珠蛋白基因启动子、甲胎蛋白基因启动子和肌肉肌酸激酶基因启动子。
78.段落71-77中任一段的rAAV，其中所述rAAV包含AAV2衣壳或AAV5衣壳。
79.一种药物组合物，其包含段落71-78中任一项的rAAV，和至少一种药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂或媒介物。
80.一种治疗患有骨关节炎的哺乳动物受试者的方法，其包括向所述哺乳动物受试者关节内给予治疗有效量的段落79的药物组合物。
81.段落80的方法，其中所述哺乳动物受试者是人或犬科动物。
82.一种具有SEQ ID NO:4中所示的序列的分离的核酸。
83.一种具有SEQ ID NO:5中所示的序列的分离的多肽。
现在将根据以下一组非限制性权利要求来详述本发明。
序列表
<110> Merial, Inc.
Genzyme
Dias Figueiredo, Monica
RM Kyostio-Moore, Sirkka
Berthelette, Patricia
<120> 用于治疗哺乳动物的骨关节炎和相关关节病症的表达骨保护性基因，
包括HAS2和润滑素的重组AAV载体
<130> MER 16-291
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1656
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 犬透明质酸合酶2(cHAS2) - GenBank XM 539153.3
<400> 1
atgcattgtg agaggtttct atgcatcctg agaataattg gaaccacact ttttggagtg 60
tctctcctcc ttggaatcac agctgcttac attgttggct accaatttat ccaaacagat 120
aattactact tctcttttgg actgtatggt gcctttttag catcacacct catcatccaa 180
agcctgtttg cctttttgga gcatcgaaaa atgaagaaat ccctagaaac acccatcaaa 240
ttgaacaaga ctgttgctct ttgcatcgct gcctatcaag aagatccaga ctacttacga 300
aaatgtttgc aatctgtgaa gaggctaacc taccctggga ttaaagttgt catggtcata 360
gatgggaact cggaagatga cctttatatg atggacatct ttagcgaagt catgggcagg 420
gacaaatcag ccacttatat ctggaagaac aacttccacg agaaaggtcc tggtgagacg 480
gatgagtcac ataaagaaag ctcgcaacat gtcacccagt tggtcttgtc caacaaaagt 540
atttgcatca tgcaaaaatg gggtggaaaa agagaagtca tgtacacggc cttcagagca 600
ctgggacgaa gtgtggatta tgtacaggtt tgtgattcag acaccatgct tgaccctgcc 660
tcatctgtgg agatggtgaa agttttagaa gaagacccca tggttggagg tgtcggggga 720
gatgtccaga ttttaaacaa gtatgattcc tggatctcct tcctcagcag tgtgagatac 780
tggatggctt ttaacataga aagggcctgc cagtcttatt ttgggtgtgt ccagtgcatt 840
agtggacctc tgggaatgta cagaaactcc ttgctgcatg aatttgtgga agactggtac 900
aatcaggaat ttatgggcag ccaatgtagt tttggggacg accggcatct aacgaaccga 960
gtgctgagtc tgggctatgc aacaaaatac acagctcgat ccaagtgcct tacggagacg 1020
cctatagagt atctcagatg gttaaaccag cagacccgct ggagcaagtc ctacttccga 1080
gagtggctgt acaatgcgat gtggttccat aaacatcact tgtggatgac ctatgaggcc 1140
gttatcactg gattcttccc tttctttctc attgccacag tgatccagct cttctacagg 1200
ggtaaaattt ggaacatcct cctcttcttg ttaactgtcc agttagtagg tctcataaaa 1260
tcctcctttg ccagctgcct tagaggaaat attgtcatgg tcttcatgtc cctctactca 1320
gtgctataca tgtcaagttt acttcctgcc aaaatgtttg ccattgccac gataaacaaa 1380
gctgggtggg gcacatctgg aaggaaaacc attgtcgtta atttcatagg actcattcca 1440
gtatcggttt ggtttacaat cctcctgggt ggtgtgattt tcaccattta taaggaatct 1500
aaaaagccat tctcagaatc caagcagaca gttctcattg ttggaacgtt gctctatgca 1560
tgctattggg tcatgctttt gacgctgtat gtggttctca tcaataagtg tggcaggagg 1620
aagaagggac aacagtatga catggtgctc gatgta 1656
<210> 2
<211> 552
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> cHAS2多肽
<400> 2
Met His Cys Glu Arg Phe Leu Cys Ile Leu Arg Ile Ile Gly Thr Thr
1 5 10 15
Leu Phe Gly Val Ser Leu Leu Leu Gly Ile Thr Ala Ala Tyr Ile Val
20 25 30
Gly Tyr Gln Phe Ile Gln Thr Asp Asn Tyr Tyr Phe Ser Phe Gly Leu
35 40 45
Tyr Gly Ala Phe Leu Ala Ser His Leu Ile Ile Gln Ser Leu Phe Ala
50 55 60
Phe Leu Glu His Arg Lys Met Lys Lys Ser Leu Glu Thr Pro Ile Lys
65 70 75 80
Leu Asn Lys Thr Val Ala Leu Cys Ile Ala Ala Tyr Gln Glu Asp Pro
85 90 95
Asp Tyr Leu Arg Lys Cys Leu Gln Ser Val Lys Arg Leu Thr Tyr Pro
100 105 110
Gly Ile Lys Val Val Met Val Ile Asp Gly Asn Ser Glu Asp Asp Leu
115 120 125
Tyr Met Met Asp Ile Phe Ser Glu Val Met Gly Arg Asp Lys Ser Ala
130 135 140
Thr Tyr Ile Trp Lys Asn Asn Phe His Glu Lys Gly Pro Gly Glu Thr
145 150 155 160
Asp Glu Ser His Lys Glu Ser Ser Gln His Val Thr Gln Leu Val Leu
165 170 175
Ser Asn Lys Ser Ile Cys Ile Met Gln Lys Trp Gly Gly Lys Arg Glu
180 185 190
Val Met Tyr Thr Ala Phe Arg Ala Leu Gly Arg Ser Val Asp Tyr Val
195 200 205
Gln Val Cys Asp Ser Asp Thr Met Leu Asp Pro Ala Ser Ser Val Glu
210 215 220
Met Val Lys Val Leu Glu Glu Asp Pro Met Val Gly Gly Val Gly Gly
225 230 235 240
Asp Val Gln Ile Leu Asn Lys Tyr Asp Ser Trp Ile Ser Phe Leu Ser
245 250 255
Ser Val Arg Tyr Trp Met Ala Phe Asn Ile Glu Arg Ala Cys Gln Ser
260 265 270
Tyr Phe Gly Cys Val Gln Cys Ile Ser Gly Pro Leu Gly Met Tyr Arg
275 280 285
Asn Ser Leu Leu His Glu Phe Val Glu Asp Trp Tyr Asn Gln Glu Phe
290 295 300
Met Gly Ser Gln Cys Ser Phe Gly Asp Asp Arg His Leu Thr Asn Arg
305 310 315 320
Val Leu Ser Leu Gly Tyr Ala Thr Lys Tyr Thr Ala Arg Ser Lys Cys
325 330 335
Leu Thr Glu Thr Pro Ile Glu Tyr Leu Arg Trp Leu Asn Gln Gln Thr
340 345 350
Arg Trp Ser Lys Ser Tyr Phe Arg Glu Trp Leu Tyr Asn Ala Met Trp
355 360 365
Phe His Lys His His Leu Trp Met Thr Tyr Glu Ala Val Ile Thr Gly
370 375 380
Phe Phe Pro Phe Phe Leu Ile Ala Thr Val Ile Gln Leu Phe Tyr Arg
385 390 395 400
Gly Lys Ile Trp Asn Ile Leu Leu Phe Leu Leu Thr Val Gln Leu Val
405 410 415
Gly Leu Ile Lys Ser Ser Phe Ala Ser Cys Leu Arg Gly Asn Ile Val
420 425 430
Met Val Phe Met Ser Leu Tyr Ser Val Leu Tyr Met Ser Ser Leu Leu
435 440 445
Pro Ala Lys Met Phe Ala Ile Ala Thr Ile Asn Lys Ala Gly Trp Gly
450 455 460
Thr Ser Gly Arg Lys Thr Ile Val Val Asn Phe Ile Gly Leu Ile Pro
465 470 475 480
Val Ser Val Trp Phe Thr Ile Leu Leu Gly Gly Val Ile Phe Thr Ile
485 490 495
Tyr Lys Glu Ser Lys Lys Pro Phe Ser Glu Ser Lys Gln Thr Val Leu
500 505 510
Ile Val Gly Thr Leu Leu Tyr Ala Cys Tyr Trp Val Met Leu Leu Thr
515 520 525
Leu Tyr Val Val Leu Ile Asn Lys Cys Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gln
530 535 540
Gln Tyr Asp Met Val Leu Asp Val
545 550
<210> 3
<211> 1656
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的cHAS2
<400> 3
atgcactgcg agcggtttct gtgcatcctg aggatcatcg gcaccaccct gttcggcgtg 60
tccctgctgc tgggcatcac cgccgcctac atcgtgggct accagttcat ccagaccgac 120
aactactact tcagcttcgg cctgtacggc gccttcctgg ccagccacct gatcatccag 180
agcctgttcg ccttcctcga gcaccggaag atgaagaagt ccctggaaac ccccatcaag 240
ctgaacaaga ccgtggccct gtgtatcgct gcctaccagg aagatcccga ctacctgcgg 300
aagtgcctgc agagcgtgaa gaggctgacc taccccggca tcaaggtggt catggtcatc 360
gacggcaaca gcgaggacga cctgtacatg atggacatct tcagcgaagt gatgggcagg 420
gacaagagcg ccacctacat ctggaagaac aacttccacg agaagggccc tggcgaaacc 480
gacgagagcc acaaagaaag cagccagcac gtgacccagc tggtgctgag caacaagagc 540
atctgcatca tgcagaagtg gggcggcaag agggaagtga tgtacaccgc cttcagagcc 600
ctgggcagaa gcgtggacta cgtccaagtg tgcgacagcg acaccatgct ggaccccgcc 660
agcagcgtgg aaatggtcaa ggtgctggaa gaggacccca tggtcggagg cgtgggcggc 720
gacgtgcaga tcctgaacaa atacgacagc tggatcagct tcctgagcag cgtgcggtac 780
tggatggcct tcaacatcga gagggcctgc cagagctact tcggctgcgt gcagtgcatc 840
agcggccctc tgggcatgta ccggaacagc ctgctgcacg agttcgtcga ggactggtac 900
aaccaggaat tcatgggcag ccagtgcagc ttcggcgacg acaggcacct gaccaacagg 960
gtgctgagcc tgggctacgc caccaagtac accgccaggt ccaagtgcct gaccgagaca 1020
cccatcgagt acctgcggtg gctgaaccag cagaccaggt ggtccaagtc ctacttcaga 1080
gagtggctgt acaacgccat gtggttccac aagcaccacc tgtggatgac ctacgaggcc 1140
gtgatcaccg gattcttccc tttcttcctg atcgccaccg tgattcagct gttctacagg 1200
ggcaagatct ggaatatcct gctgttcctg ctgaccgtcc agctcgtggg cctgatcaag 1260
agcagcttcg ccagctgcct gaggggcaac atcgtgatgg tgttcatgag cctgtacagc 1320
gtgctgtaca tgtcctccct gctgcccgcc aagatgttcg ccattgccac catcaacaag 1380
gccggctggg gcacaagcgg cagaaagacc atcgtggtca acttcatcgg cctgatcccc 1440
gtgtccgtgt ggttcaccat cctgctgggc ggcgtgatct tcaccatcta caaagagagc 1500
aagaagccct tcagcgagag caagcagacc gtgctgatcg tgggaaccct gctgtacgcc 1560
tgctactggg tcatgctgct gaccctgtac gtggtgctga ttaacaagtg cggcaggcgg 1620
aagaagggcc agcagtacga catggtgctg gacgtg 1656
<210> 4
<211> 4020
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 犬全长润滑素
<400> 4
atgcagtgga aaatacttcc catatacttg ctgctcctct ctgttttctt gattcagcaa 60
gtttcttctc aagatttacc aagctgtgca gggagatgtg gggaagggta ttctagagat 120
gccatctgca actgtgatta taactgtcaa cactacatgg agtgctgccc tgatttcaag 180
aaagcctgca ctgtggagct ttcctgtaaa ggtcgctgct tcgagtcctt tgcacgaggg 240
agggagtgtg actgtgactc agactgtaag aagtatggca agtgctgtcc cgattatgag 300
gatttttgtg gaagagtgca taatcccaca tcacctccat cttcaaagac tgcacctcca 360
tctccaggag catctcaaac catcaaatca acagccaaac gttcacccaa agcaccaaat 420
aagaagaaga ctaagaaagt tatagaatca gaggaaataa cagaagaaca ttctgtttct 480
gaaaaccaag agtcttcttc ctcctcttcc tcttcctctt caactattcg gaaaatcaag 540
tcttccaaaa attcagcagc taataaagaa ttaaagaaga aacccaaagt aaaagataac 600
aagaaggaaa gaactcctaa aaagaaacct ccgccagaac caccagttgt agatgaagct 660
ggaagtggac tggacaatgg tgacatcaag ctcaccccaa ctcctgacat tcctaccacc 720
caacgcaata aggttaccac atctcccaag tttacaacag gcaaaccaat aaatcctaaa 780
cctagtcttc cacctaatac tgatacatcc aaagagacct cttcaacacc taataaggag 840
acaacagtga aaagtaaaga gactttagca aacaaagaga cttcaagtaa agcaaaagag 900
aagattactt cagccaaaga gacacgaagt gcagagaaaa cacctgctaa agattttgta 960
cccacaacca aagctcctgt taaatctaca cccaaagctg aaagtacaac caaatctcct 1020
gctcccacca ccaccaagga gcccactcct accaccacca agaagcctgc acccactacc 1080
cccaagaaac ctgctcccac tactcccaag gagcctgtac ccactaccac caaggggcca 1140
cccaccacgc ccaagaaacc tgaacccacc actcccaagg atcctgctcc caccaccacc 1200
aaggagccca ctcccaccac ccccaagaag cctgctccca ctactcccaa ggagcctgta 1260
cccattacca ccaaggagcc tgaacccacc acccccaaga agcctgaacc caccactccc 1320
aaggagcctg ctcccaccac tcccaaggag cctgtaccca ctaccaccaa ggagcctgaa 1380
cccaccactc ccaaggagcc tgcacccacc acccccaagg agcctgctcc cactactccc 1440
aaggagcctg tacctactac caccaaggag ccacccacca cccccaagaa gcctgaaccc 1500
accactccca aggagcctgc tcccaccact cccaaggagc ctgtacccac taccaccaag 1560
gagcctgaac ccaccactcc caaggagctt gcacccacca cccccaagga gcctgctccc 1620
actactccca aggagcctgt acctactacc accaaggagc cacccaccac ccccaagaag 1680
cctgaaccca ccactcccaa ggagcctgca cccaccaccc ccaaggagcc tgctcccact 1740
actcccaagg agccacctac cacccccaag aagcctgaac ccaccactcc caaagaggct 1800
gctcccacca ccaagaaacc agctgccacc actcccaagg agcctgcacc cactatcact 1860
aaggagcctg caccaactac tcccaacaag cctgaaccca ccactcccaa agagcctgtg 1920
cccacaaccc ccaaggagcc tgaacccact ccccctaagg aacctgctcc taccaccacc 1980
aaggaccctg cacctaccag tcccaaggaa cctactccca ccgcccccaa ggagcctgta 2040
cctactgccc ccaaggagcc tgaacccatg gcccccaaga agcctgtacc cactgccccc 2100
aagcagccta cacccaccac ccccaaggag ccttcaccca ctgtccccaa ggagcctgaa 2160
cctatggccc ccaaggagcc tgtacccaca gctcccaaga aacctgcacc caccgccccc 2220
aaggaccctg cacccaccgc ccccaaggag cctgaaccca ctgcccccaa taaggaatct 2280
gcacccacca catccaagga acaggttccc atcaccacca aggagcccac acccaaactc 2340
ccgaaggagc ctgctccagc ctctcttgag acgcctgctc caaccacctc agacgccttt 2400
actacaacta cgactatgga gcctcccact actcccaaga accctgctga gtcaactcct 2460
aagtttcctg cagaacccac accaaagcct cttgaaaaca gtcccaaaga accagttgta 2520
cctataacca aggctcctga agtgaccaaa cctgaaatga ctacaacagc taaagataaa 2580
acaacagaaa aagacataat acctgaaatt acaactgctg tacctaagat tacaacccag 2640
gagacagcaa ctccaacaga agaaacgacc actgagtcca aaacaagtac aaccacacaa 2700
gtaacatcta ccacatcatc caaaaacact cctaaagcaa caactctcgc acccaaagta 2760
atgactgcaa cacaaaagac aactacaact gaagagacta tgaataaacc tgaagaaacc 2820
acagctgtgc caaaggatac agctacgagt actaaagtct caactcctag accccgaaag 2880
ccaaccaaag caccaaagaa gcccacttct accaaaaagc caaacacaat acctaaaaga 2940
aaaaaaccaa agactacacc aactccccca aagatgacta catcgacaat gcccaaatta 3000
caccctacct cttcagtgga agccatgctc caaactacca ccagccccaa ccaaagacct 3060
aactcagaaa tagttgaagt aaatccaaat gaagatacag atgctgctgg aaaaaaacct 3120
cacatgttcc ccaggccccc tgtgttaact cctatattta tcccagggac tgatatctta 3180
gtgagaggat ccaatcaaga cattgccatc aatcccatgc tttcagatga gactaattta 3240
tgcaacggta agccagtaga tggactgact actttgcgca atggaaccat ggtcgcattt 3300
cgaggtcatt atttctggat gctgagtcca tccaatccac catctccacc tcgtaaaatt 3360
actgaagttt ggggtattcc ctcccccatt gatactgttt ttactaggtg caactgtgaa 3420
ggaaaaactt tcttctttaa gggttcccag tactggcgtt tcaccaatga tataaaagat 3480
gcagggtatc ccaaacaaat tgtaaaagga tttggaggac taaatggaag aatagtggca 3540
gctctctcaa tagctaaata caaggacaga cctgaatctg tgtatttttt caagagaggt 3600
ggcagcgttc agcagtacac ttataaacag gaacccatca aaaagtgcac tggaagaagg 3660
cccgctatca attacccagt gtatggagaa acaacacagg ttagaagacg tcgctttgaa 3720
cgcgccatag gaccttctca aacacacacc atcagaattc actattcacc catcagagtc 3780
tcttatcaag ataaaggttt cctccataat gaagtcaaaa tgagttcaca gtggagagga 3840
tttccaaatg tggttacttc agctatagca ctgcccaaca tcagaaaacc tgatggctat 3900
gattactacg ccttttctag gaatcaatac tataacattg atgtacccag cagaacagca 3960
agagttgtta ctactcgttt tgggaggacc ttatccaata tctggtacaa ctgtccttag 4020
<210> 5
<211> 1339
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 全长润滑素多肽 - SEQ ID NO: 4的翻译
<400> 5
Met Gln Trp Lys Ile Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Pro Ser Cys Ala Gly Arg
20 25 30
Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Ile Cys Asn Cys Asp Tyr Asn
35 40 45
Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Lys Ala Cys Thr
50 55 60
Val Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Ala Arg Gly
65 70 75 80
Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ser Asp Cys Lys Lys Tyr Gly Lys Cys Cys
85 90 95
Pro Asp Tyr Glu Asp Phe Cys Gly Arg Val His Asn Pro Thr Ser Pro
100 105 110
Pro Ser Ser Lys Thr Ala Pro Pro Ser Pro Gly Ala Ser Gln Thr Ile
115 120 125
Lys Ser Thr Ala Lys Arg Ser Pro Lys Ala Pro Asn Lys Lys Lys Thr
130 135 140
Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val Ser
145 150 155 160
Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile
165 170 175
Arg Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Lys Glu Leu Lys
180 185 190
Lys Lys Pro Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Glu Arg Thr Pro Lys Lys
195 200 205
Lys Pro Pro Pro Glu Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser Gly Leu
210 215 220
Asp Asn Gly Asp Ile Lys Leu Thr Pro Thr Pro Asp Ile Pro Thr Thr
225 230 235 240
Gln Arg Asn Lys Val Thr Thr Ser Pro Lys Phe Thr Thr Gly Lys Pro
245 250 255
Ile Asn Pro Lys Pro Ser Leu Pro Pro Asn Thr Asp Thr Ser Lys Glu
260 265 270
Thr Ser Ser Thr Pro Asn Lys Glu Thr Thr Val Lys Ser Lys Glu Thr
275 280 285
Leu Ala Asn Lys Glu Thr Ser Ser Lys Ala Lys Glu Lys Ile Thr Ser
290 295 300
Ala Lys Glu Thr Arg Ser Ala Glu Lys Thr Pro Ala Lys Asp Phe Val
305 310 315 320
Pro Thr Thr Lys Ala Pro Val Lys Ser Thr Pro Lys Ala Glu Ser Thr
325 330 335
Thr Lys Ser Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr
340 345 350
Thr Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr
355 360 365
Pro Lys Glu Pro Val Pro Thr Thr Thr Lys Gly Pro Pro Thr Thr Pro
370 375 380
Lys Lys Pro Glu Pro Thr Thr Pro Lys Asp Pro Ala Pro Thr Thr Thr
385 390 395 400
Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro
405 410 415
Lys Glu Pro Val Pro Ile Thr Thr Lys Glu Pro Glu Pro Thr Thr Pro
420 425 430
Lys Lys Pro Glu Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro
435 440 445
Lys Glu Pro Val Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Glu Pro Thr Thr Pro
450 455 460
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro
465 470 475 480
Lys Glu Pro Val Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys
485 490 495
Lys Pro Glu Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys
500 505 510
Glu Pro Val Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Glu Pro Thr Thr Pro Lys
515 520 525
Glu Leu Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys
530 535 540
Glu Pro Val Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Lys
545 550 555 560
Pro Glu Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu
565 570 575
Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro
580 585 590
Glu Pro Thr Thr Pro Lys Glu Ala Ala Pro Thr Thr Lys Lys Pro Ala
595 600 605
Ala Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Ile Thr Lys Glu Pro Ala
610 615 620
Pro Thr Thr Pro Asn Lys Pro Glu Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Val
625 630 635 640
Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Glu Pro Thr Pro Pro Lys Glu Pro Ala
645 650 655
Pro Thr Thr Thr Lys Asp Pro Ala Pro Thr Ser Pro Lys Glu Pro Thr
660 665 670
Pro Thr Ala Pro Lys Glu Pro Val Pro Thr Ala Pro Lys Glu Pro Glu
675 680 685
Pro Met Ala Pro Lys Lys Pro Val Pro Thr Ala Pro Lys Gln Pro Thr
690 695 700
Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ser Pro Thr Val Pro Lys Glu Pro Glu
705 710 715 720
Pro Met Ala Pro Lys Glu Pro Val Pro Thr Ala Pro Lys Lys Pro Ala
725 730 735
Pro Thr Ala Pro Lys Asp Pro Ala Pro Thr Ala Pro Lys Glu Pro Glu
740 745 750
Pro Thr Ala Pro Asn Lys Glu Ser Ala Pro Thr Thr Ser Lys Glu Gln
755 760 765
Val Pro Ile Thr Thr Lys Glu Pro Thr Pro Lys Leu Pro Lys Glu Pro
770 775 780
Ala Pro Ala Ser Leu Glu Thr Pro Ala Pro Thr Thr Ser Asp Ala Phe
785 790 795 800
Thr Thr Thr Thr Thr Met Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Asn Pro Ala
805 810 815
Glu Ser Thr Pro Lys Phe Pro Ala Glu Pro Thr Pro Lys Pro Leu Glu
820 825 830
Asn Ser Pro Lys Glu Pro Val Val Pro Ile Thr Lys Ala Pro Glu Val
835 840 845
Thr Lys Pro Glu Met Thr Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Lys
850 855 860
Asp Ile Ile Pro Glu Ile Thr Thr Ala Val Pro Lys Ile Thr Thr Gln
865 870 875 880
Glu Thr Ala Thr Pro Thr Glu Glu Thr Thr Thr Glu Ser Lys Thr Ser
885 890 895
Thr Thr Thr Gln Val Thr Ser Thr Thr Ser Ser Lys Asn Thr Pro Lys
900 905 910
Ala Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Met Thr Ala Thr Gln Lys Thr Thr
915 920 925
Thr Thr Glu Glu Thr Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Thr Ala Val Pro
930 935 940
Lys Asp Thr Ala Thr Ser Thr Lys Val Ser Thr Pro Arg Pro Arg Lys
945 950 955 960
Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Asn Thr
965 970 975
Ile Pro Lys Arg Lys Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Pro Lys Met
980 985 990
Thr Thr Ser Thr Met Pro Lys Leu His Pro Thr Ser Ser Val Glu Ala
995 1000 1005
Met Leu Gln Thr Thr Thr Ser Pro Asn Gln Arg Pro Asn Ser Glu
1010 1015 1020
Ile Val Glu Val Asn Pro Asn Glu Asp Thr Asp Ala Ala Gly Lys
1025 1030 1035
Lys Pro His Met Phe Pro Arg Pro Pro Val Leu Thr Pro Ile Phe
1040 1045 1050
Ile Pro Gly Thr Asp Ile Leu Val Arg Gly Ser Asn Gln Asp Ile
1055 1060 1065
Ala Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr Asn Leu Cys Asn Gly
1070 1075 1080
Lys Pro Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg Asn Gly Thr Met Val
1085 1090 1095
Ala Phe Arg Gly His Tyr Phe Trp Met Leu Ser Pro Ser Asn Pro
1100 1105 1110
Pro Ser Pro Pro Arg Lys Ile Thr Glu Val Trp Gly Ile Pro Ser
1115 1120 1125
Pro Ile Asp Thr Val Phe Thr Arg Cys Asn Cys Glu Gly Lys Thr
1130 1135 1140
Phe Phe Phe Lys Gly Ser Gln Tyr Trp Arg Phe Thr Asn Asp Ile
1145 1150 1155
Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Gln Ile Val Lys Gly Phe Gly Gly
1160 1165 1170
Leu Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala Leu Ser Ile Ala Lys Tyr Lys
1175 1180 1185
Asp Arg Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys Arg Gly Gly Ser Val
1190 1195 1200
Gln Gln Tyr Thr Tyr Lys Gln Glu Pro Ile Lys Lys Cys Thr Gly
1205 1210 1215
Arg Arg Pro Ala Ile Asn Tyr Pro Val Tyr Gly Glu Thr Thr Gln
1220 1225 1230
Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile Gly Pro Ser Gln Thr
1235 1240 1245
His Thr Ile Arg Ile His Tyr Ser Pro Ile Arg Val Ser Tyr Gln
1250 1255 1260
Asp Lys Gly Phe Leu His Asn Glu Val Lys Met Ser Ser Gln Trp
1265 1270 1275
Arg Gly Phe Pro Asn Val Val Thr Ser Ala Ile Ala Leu Pro Asn
1280 1285 1290
Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr Ala Phe Ser Arg Asn
1295 1300 1305
Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg Thr Ala Arg Val Val
1310 1315 1320
Thr Thr Arg Phe Gly Arg Thr Leu Ser Asn Ile Trp Tyr Asn Cys
1325 1330 1335
Pro
<210> 6
<211> 2949
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的截短的cLub
<400> 6
atgcagtgga agatcctgcc tatctacctg ctcctgctga gcgtgttcct gatccagcaa 60
gtgtccagcc aggacctgcc cagctgcgcc ggaagatgcg gcgagggcta cagcagggac 120
gccatctgca actgcgacta caactgccag cactacatgg aatgctgccc cgacttcaag 180
aaggcctgca ccgtcgagct gagctgcaag ggccggtgct tcgagagctt cgccaggggc 240
agagagtgcg actgcgacag cgactgcaag aaatacggca agtgctgccc tgactacgag 300
gacttctgcg gcagggtgca caaccccacc agccccccta gcagcaagac cgcccctcca 360
tctcctggcg ccagccagac catcaagagc accgccaaga ggtcccccaa ggcccccaac 420
aagaaaaaga ccaagaaagt gatcgagagc gaggaaatca ccgaggaaca cagcgtgtcc 480
gagaatcaag agagcagcag cagctccagc tccagcagca gcaccatccg gaagatcaag 540
agcagcaaga acagcgccgc caacaaagag ctgaagaaga agcccaaagt caaggacaac 600
aagaaagagc ggacccccaa gaagaaaccc cccccagagc cccctgtggt ggatgaggcc 660
ggcagcggcc tggacaacgg cgacatcaag ctgaccccca cccccgacat ccccaccacc 720
cagaggaaca aagtgaccac ctcccccaag ttcaccaccg gcaagcccat caaccccaag 780
cccagcctgc cccccaacac cgacaccagc aaagaaacca gcagcacccc taacaaagag 840
acaaccgtca agagcaaaga gacactggct aacaaagaaa cctccagcaa ggccaaagag 900
aagatcacca gcgccaaaga gactcggagc gccgagaaaa cccccgccaa ggacttcgtg 960
cccaccacca aggcccctgt gaagtccacc cctaaggccg agtctaccac caagagccct 1020
gcccccacca ccaccaaaga gccaacccct acaaccacca agaaacccgc tcctaccaca 1080
cccaagaagc cagccccaac tacccctaaa gaacccgtgc ctaccaccac aaagggccct 1140
cccacaaccc ctaagaaacc tgagcccacc acccccaagg accccgctcc cacaacaaca 1200
aaagagccca cccccactac acccaaaaag cctgctccta caactcccaa agagcccgtc 1260
ccaaccacaa ccgagccagc ccctgccagc ctggaaaccc ctgcccctac taccagcgac 1320
gcgttcacca ccacaaccac catggaaccc cccaccactc ctaagaatcc cgccgagagc 1380
acccccaagt ttcccgccga gcctacccct aagcccctgg aaaacagccc caaagaacct 1440
gtggtgccta tcaccaaagc ccccgaagtg accaagcccg agatgaccac cacagccaag 1500
gacaagacca ccgagaagga catcatccct gagatcacca ccgccgtgcc caaaatcacc 1560
acccaagaga cagccacccc caccgaggaa accaccaccg agagcaagac cagcaccacc 1620
acacaagtga cctccaccac aagctccaag aacaccccca aagccaccac cctggccccc 1680
aaagtgatga ccgccaccca gaaaaccact accaccgaag agactatgaa caagcccgaa 1740
gagacaacag ccgtgcctaa ggacaccgcc acctccacca aggtgtccac ccccagaccc 1800
cggaagccca ccaaggctcc aaagaagccc acctctacca agaagcctaa caccatcccc 1860
aagaggaaga aacccaagac cacccctacc ccccccaaga tgacaaccag caccatgccc 1920
aagctgcacc ccacctccag cgtggaagcc atgctgcaga ccaccacctc tcccaaccag 1980
aggcccaaca gcgagatcgt ggaagtgaac cccaacgagg acaccgacgc cgctggcaag 2040
aaaccccaca tgttccccag gcctcccgtg ctgaccccta tcttcatccc cggcaccgac 2100
atcctcgtgc ggggcagcaa ccaggatatc gccatcaacc ctatgctgag cgacgagaca 2160
aacctgtgca acggcaagcc cgtggacggc ctgaccaccc tgagaaacgg caccatggtg 2220
gccttcaggg gccactactt ctggatgctg agccccagca accctcccag ccctcctcgg 2280
aagatcaccg aagtgtgggg catccccagc cccatcgaca ccgtgttcac caggtgcaat 2340
tgcgagggca agacattctt cttcaagggc tcccaatact ggcggttcac caacgacatc 2400
aaggacgccg gctaccccaa gcagatcgtg aagggcttcg gcggcctgaa cggcaggatc 2460
gtggccgccc tgtctatcgc caagtacaag gacaggcccg agagcgtgta cttcttcaag 2520
aggggcggca gcgtgcagca gtacacctac aagcaagagc ccatcaagaa gtgcaccggc 2580
agaaggcccg ccatcaacta ccccgtgtac ggcgaaacca cccaagtgcg gaggcggaga 2640
ttcgagaggg ccatcggccc tagccagacc cacaccatca ggatccacta cagccccatc 2700
agggtgtcct accaggacaa gggcttcctg cacaacgaag tgaagatgag cagccagtgg 2760
cggggcttcc ccaacgtcgt gaccagcgcc attgccctgc ccaacatccg gaagcccgac 2820
ggctacgact actacgcctt cagccggaac cagtactaca acatcgacgt gcccagcagg 2880
accgccaggg tggtcaccac cagattcggc aggaccctga gcaacatctg gtacaactgc 2940
ccctgatga 2949
<210> 7
<211> 981
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的密码子优化的cLUB多肽 - SEQ ID NO: 6的翻译
<400> 7
Met Gln Trp Lys Ile Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Pro Ser Cys Ala Gly Arg
20 25 30
Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Ile Cys Asn Cys Asp Tyr Asn
35 40 45
Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Lys Ala Cys Thr
50 55 60
Val Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Ala Arg Gly
65 70 75 80
Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ser Asp Cys Lys Lys Tyr Gly Lys Cys Cys
85 90 95
Pro Asp Tyr Glu Asp Phe Cys Gly Arg Val His Asn Pro Thr Ser Pro
100 105 110
Pro Ser Ser Lys Thr Ala Pro Pro Ser Pro Gly Ala Ser Gln Thr Ile
115 120 125
Lys Ser Thr Ala Lys Arg Ser Pro Lys Ala Pro Asn Lys Lys Lys Thr
130 135 140
Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val Ser
145 150 155 160
Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile
165 170 175
Arg Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Lys Glu Leu Lys
180 185 190
Lys Lys Pro Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Glu Arg Thr Pro Lys Lys
195 200 205
Lys Pro Pro Pro Glu Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser Gly Leu
210 215 220
Asp Asn Gly Asp Ile Lys Leu Thr Pro Thr Pro Asp Ile Pro Thr Thr
225 230 235 240
Gln Arg Asn Lys Val Thr Thr Ser Pro Lys Phe Thr Thr Gly Lys Pro
245 250 255
Ile Asn Pro Lys Pro Ser Leu Pro Pro Asn Thr Asp Thr Ser Lys Glu
260 265 270
Thr Ser Ser Thr Pro Asn Lys Glu Thr Thr Val Lys Ser Lys Glu Thr
275 280 285
Leu Ala Asn Lys Glu Thr Ser Ser Lys Ala Lys Glu Lys Ile Thr Ser
290 295 300
Ala Lys Glu Thr Arg Ser Ala Glu Lys Thr Pro Ala Lys Asp Phe Val
305 310 315 320
Pro Thr Thr Lys Ala Pro Val Lys Ser Thr Pro Lys Ala Glu Ser Thr
325 330 335
Thr Lys Ser Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr
340 345 350
Thr Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr
355 360 365
Pro Lys Glu Pro Val Pro Thr Thr Thr Lys Gly Pro Pro Thr Thr Pro
370 375 380
Lys Lys Pro Glu Pro Thr Thr Pro Lys Asp Pro Ala Pro Thr Thr Thr
385 390 395 400
Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro
405 410 415
Lys Glu Pro Val Pro Thr Thr Thr Glu Pro Ala Pro Ala Ser Leu Glu
420 425 430
Thr Pro Ala Pro Thr Thr Ser Asp Ala Phe Thr Thr Thr Thr Thr Met
435 440 445
Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Asn Pro Ala Glu Ser Thr Pro Lys Phe
450 455 460
Pro Ala Glu Pro Thr Pro Lys Pro Leu Glu Asn Ser Pro Lys Glu Pro
465 470 475 480
Val Val Pro Ile Thr Lys Ala Pro Glu Val Thr Lys Pro Glu Met Thr
485 490 495
Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Lys Asp Ile Ile Pro Glu Ile
500 505 510
Thr Thr Ala Val Pro Lys Ile Thr Thr Gln Glu Thr Ala Thr Pro Thr
515 520 525
Glu Glu Thr Thr Thr Glu Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr Gln Val Thr
530 535 540
Ser Thr Thr Ser Ser Lys Asn Thr Pro Lys Ala Thr Thr Leu Ala Pro
545 550 555 560
Lys Val Met Thr Ala Thr Gln Lys Thr Thr Thr Thr Glu Glu Thr Met
565 570 575
Asn Lys Pro Glu Glu Thr Thr Ala Val Pro Lys Asp Thr Ala Thr Ser
580 585 590
Thr Lys Val Ser Thr Pro Arg Pro Arg Lys Pro Thr Lys Ala Pro Lys
595 600 605
Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Asn Thr Ile Pro Lys Arg Lys Lys
610 615 620
Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Pro Lys Met Thr Thr Ser Thr Met Pro
625 630 635 640
Lys Leu His Pro Thr Ser Ser Val Glu Ala Met Leu Gln Thr Thr Thr
645 650 655
Ser Pro Asn Gln Arg Pro Asn Ser Glu Ile Val Glu Val Asn Pro Asn
660 665 670
Glu Asp Thr Asp Ala Ala Gly Lys Lys Pro His Met Phe Pro Arg Pro
675 680 685
Pro Val Leu Thr Pro Ile Phe Ile Pro Gly Thr Asp Ile Leu Val Arg
690 695 700
Gly Ser Asn Gln Asp Ile Ala Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr
705 710 715 720
Asn Leu Cys Asn Gly Lys Pro Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg Asn
725 730 735
Gly Thr Met Val Ala Phe Arg Gly His Tyr Phe Trp Met Leu Ser Pro
740 745 750
Ser Asn Pro Pro Ser Pro Pro Arg Lys Ile Thr Glu Val Trp Gly Ile
755 760 765
Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val Phe Thr Arg Cys Asn Cys Glu Gly Lys
770 775 780
Thr Phe Phe Phe Lys Gly Ser Gln Tyr Trp Arg Phe Thr Asn Asp Ile
785 790 795 800
Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Gln Ile Val Lys Gly Phe Gly Gly Leu
805 810 815
Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala Leu Ser Ile Ala Lys Tyr Lys Asp Arg
820 825 830
Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys Arg Gly Gly Ser Val Gln Gln Tyr
835 840 845
Thr Tyr Lys Gln Glu Pro Ile Lys Lys Cys Thr Gly Arg Arg Pro Ala
850 855 860
Ile Asn Tyr Pro Val Tyr Gly Glu Thr Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg
865 870 875 880
Phe Glu Arg Ala Ile Gly Pro Ser Gln Thr His Thr Ile Arg Ile His
885 890 895
Tyr Ser Pro Ile Arg Val Ser Tyr Gln Asp Lys Gly Phe Leu His Asn
900 905 910
Glu Val Lys Met Ser Ser Gln Trp Arg Gly Phe Pro Asn Val Val Thr
915 920 925
Ser Ala Ile Ala Leu Pro Asn Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr
930 935 940
Tyr Ala Phe Ser Arg Asn Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg
945 950 955 960
Thr Ala Arg Val Val Thr Thr Arg Phe Gly Arg Thr Leu Ser Asn Ile
965 970 975
Trp Tyr Asn Cys Pro
980
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGH-正向引物
<400> 8
tctagttgcc agccatctgt tgt 23
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGH-反向引物
<400> 9
tgggagtggc accttcca 18
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BGH 探针
<400> 10
tcccccgtgc cttccttgac c 21
<210> 11
<211> 1404
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人PRG4转录物变体A氨基酸序列
<400> 11
Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val
1 5 10 15
Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly
20 25 30
Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr
35 40 45
Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys
50 55 60
Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg
65 70 75 80
Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys
85 90 95
Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser
100 105 110
Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr
115 120 125
Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys
130 135 140
Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val
145 150 155 160
Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser
165 170 175
Ser Thr Ile Arg Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg
180 185 190
Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr
195 200 205
Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser
210 215 220
Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr
225 230 235 240
Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys
245 250 255
Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys
260 265 270
Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu
275 280 285
Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr
290 295 300
Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp
305 310 315 320
Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu
325 330 335
Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro
340 345 350
Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro
355 360 365
Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr
370 375 380
Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr
385 390 395 400
Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr
405 410 415
Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro
420 425 430
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro
435 440 445
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr Pro
450 455 460
Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys
465 470 475 480
Glu Pro Ala Pro Thr Ala Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys
485 490 495
Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys
500 505 510
Glu Pro Ser Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys
515 520 525
Ser Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser
530 535 540
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ser Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro
545 550 555 560
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro
565 570 575
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro
580 585 590
Ala Pro Thr Thr Thr Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro
595 600 605
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Leu
610 615 620
Thr Pro Thr Thr Pro Glu Lys Leu Ala Pro Thr Thr Pro Glu Lys Pro
625 630 635 640
Ala Pro Thr Thr Pro Glu Glu Leu Ala Pro Thr Thr Pro Glu Glu Pro
645 650 655
Thr Pro Thr Thr Pro Glu Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Ala Ala
660 665 670
Ala Pro Asn Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro
675 680 685
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr
690 695 700
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr Thr Leu Lys Glu Pro
705 710 715 720
Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Lys Glu Leu Ala Pro Thr
725 730 735
Thr Thr Lys Glu Pro Thr Ser Thr Thr Ser Asp Lys Pro Ala Pro Thr
740 745 750
Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr
755 760 765
Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr
770 775 780
Thr Leu Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Lys
785 790 795 800
Glu Leu Ala Pro Thr Thr Thr Lys Gly Pro Thr Ser Thr Thr Ser Asp
805 810 815
Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys
820 825 830
Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Glu
835 840 845
Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser Glu Val Ser Thr Pro Thr Thr Thr Lys
850 855 860
Glu Pro Thr Thr Ile His Lys Ser Pro Asp Glu Ser Thr Pro Glu Leu
865 870 875 880
Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys Ala Leu Glu Asn Ser Pro Lys Glu Pro
885 890 895
Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr Pro Ala Ala Thr Lys Pro Glu Met Thr
900 905 910
Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Arg Asp Leu Arg Thr Thr Pro
915 920 925
Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro Lys Met Thr Lys Glu Thr Ala Thr Thr
930 935 940
Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser Lys Ile Thr Ala Thr Thr Thr Gln Val
945 950 955 960
Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp Thr Thr Pro Phe Lys Ile Thr Thr Leu
965 970 975
Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Thr Thr Thr Lys Lys Thr Ile
980 985 990
Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Lys
995 1000 1005
Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys Ala Thr Thr Pro Lys Pro Gln Lys
1010 1015 1020
Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Lys
1025 1030 1035
Thr Met Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Arg
1040 1045 1050
Lys Met Thr Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn Pro Thr Ser Arg Ile
1055 1060 1065
Ala Glu Ala Met Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro Asn Gln Thr Pro
1070 1075 1080
Asn Ser Lys Leu Val Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu Asp Ala Gly
1085 1090 1095
Gly Ala Glu Gly Glu Thr Pro His Met Leu Leu Arg Pro His Val
1100 1105 1110
Phe Met Pro Glu Val Thr Pro Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg Val
1115 1120 1125
Pro Asn Gln Gly Ile Ile Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr
1130 1135 1140
Asn Ile Cys Asn Gly Lys Pro Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg
1145 1150 1155
Asn Gly Thr Leu Val Ala Phe Arg Gly His Tyr Phe Trp Met Leu
1160 1165 1170
Ser Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro Ala Arg Arg Ile Thr Glu Val
1175 1180 1185
Trp Gly Ile Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val Phe Thr Arg Cys Asn
1190 1195 1200
Cys Glu Gly Lys Thr Phe Phe Phe Lys Asp Ser Gln Tyr Trp Arg
1205 1210 1215
Phe Thr Asn Asp Ile Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Phe
1220 1225 1230
Lys Gly Phe Gly Gly Leu Thr Gly Gln Ile Val Ala Ala Leu Ser
1235 1240 1245
Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys
1250 1255 1260
Arg Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr Ile Tyr Lys Gln Glu Pro Val
1265 1270 1275
Gln Lys Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala Leu Asn Tyr Pro Val Tyr
1280 1285 1290
Gly Glu Thr Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile
1295 1300 1305
Gly Pro Ser Gln Thr His Thr Ile Arg Ile Gln Tyr Ser Pro Ala
1310 1315 1320
Arg Leu Ala Tyr Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn Glu Val Lys
1325 1330 1335
Val Ser Ile Leu Trp Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr Ser Ala
1340 1345 1350
Ile Ser Leu Pro Asn Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr
1355 1360 1365
Ala Phe Ser Lys Asp Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg
1370 1375 1380
Thr Ala Arg Ala Ile Thr Thr Arg Ser Gly Gln Thr Leu Ser Lys
1385 1390 1395
Val Trp Tyr Asn Cys Pro
1400
<210> 12
<211> 5050
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人PRG4 转录物变体A核酸序列
<400> 12
aaactcatct atcctttacg gcaagggtac ctacggtacc tgaaaacaac gatggcatgg 60
aaaacacttc ccatttacct gttgttgctg ctgtctgttt tcgtgattca gcaagtttca 120
tctcaagatt tatcaagctg tgcagggaga tgtggggaag ggtattctag agatgccacc 180
tgcaactgtg attataactg tcaacactac atggagtgct gccctgattt caagagagtc 240
tgcactgcgg agctttcctg taaaggccgc tgctttgagt ccttcgagag agggagggag 300
tgtgactgcg acgcccaatg taagaagtat gacaagtgct gtcccgatta tgagagtttc 360
tgtgcagaag tgcataatcc cacatcacca ccatcttcaa agaaagcacc tccaccttca 420
ggagcatctc aaaccatcaa atcaacaacc aaacgttcac ccaaaccacc aaacaagaag 480
aagactaaga aagttataga atcagaggaa ataacagaag aacattctgt ttctgaaaat 540
caagagtcct cctcctcctc ctcctcttcc tcttcttctt caacaattcg gaaaatcaag 600
tcttccaaaa attcagctgc taatagagaa ttacagaaga aactcaaagt aaaagataac 660
aagaagaaca gaactaaaaa gaaacctacc cccaaaccac cagttgtaga tgaagctgga 720
agtggattgg acaatggtga cttcaaggtc acaactcctg acacgtctac cacccaacac 780
aataaagtca gcacatctcc caagatcaca acagcaaaac caataaatcc cagacccagt 840
cttccaccta attctgatac atctaaagag acgtctttga cagtgaataa agagacaaca 900
gttgaaacta aagaaactac tacaacaaat aaacagactt caactgatgg aaaagagaag 960
actacttccg ctaaagagac acaaagtata gagaaaacat ctgctaaaga tttagcaccc 1020
acatctaaag tgctggctaa acctacaccc aaagctgaaa ctacaaccaa aggccctgct 1080
ctcaccactc ccaaggagcc cacgcccacc actcccaagg agcctgcatc taccacaccc 1140
aaagagccca cacctaccac catcaagtct gcacccacca cccccaagga gcctgcaccc 1200
accaccacca agtctgcacc caccactccc aaggagcctg cacccaccac caccaaggag 1260
cctgcaccca ccactcccaa ggagcctgca cccaccacca ccaaggagcc tgcacccacc 1320
accaccaagt ctgcacccac cactcccaag gagcctgcac ccaccacccc caagaagcct 1380
gccccaacta cccccaagga gcctgcaccc accactccca aggagcctac acccaccact 1440
cccaaggagc ctgcacccac caccaaggag cctgcaccca ccactcccaa agagcctgca 1500
cccactgccc ccaagaagcc tgccccaact acccccaagg agcctgcacc caccactccc 1560
aaggagcctg cacccaccac caccaaggag ccttcaccca ccactcccaa ggagcctgca 1620
cccaccacca ccaagtctgc acccaccact accaaggagc ctgcacccac cactaccaag 1680
tctgcaccca ccactcccaa ggagccttca cccaccacca ccaaggagcc tgcacccacc 1740
actcccaagg agcctgcacc caccaccccc aagaagcctg ccccaactac ccccaaggag 1800
cctgcaccca ccactcccaa ggaacctgca cccaccacca ccaagaagcc tgcacccacc 1860
actcccaaag agcctgcccc aactaccccc aaggagactg cacccaccac ccccaagaag 1920
ctcacgccca ccacccccga gaagctcgca cccaccaccc ctgagaagcc cgcacccacc 1980
acccctgagg agctcgcacc caccacccct gaggagccca cacccaccac ccctgaggag 2040
cctgctccca ccactcccaa ggcagcggct cccaacaccc ctaaggagcc tgctccaact 2100
acccctaagg agcctgctcc aactacccct aaggagcctg ctccaactac ccctaaggag 2160
actgctccaa ctacccctaa agggactgct ccaactaccc tcaaggaacc tgcacccact 2220
actcccaaga agcctgcccc caaggagctt gcacccacca ccaccaagga gcccacatcc 2280
accacctctg acaagcccgc tccaactacc cctaagggga ctgctccaac tacccctaag 2340
gagcctgctc caactacccc taaggagcct gctccaacta cccctaaggg gactgctcca 2400
actaccctca aggaacctgc acccactact cccaagaagc ctgcccccaa ggagcttgca 2460
cccaccacca ccaaggggcc cacatccacc acctctgaca agcctgctcc aactacacct 2520
aaggagactg ctccaactac ccccaaggag cctgcaccca ctacccccaa gaagcctgct 2580
ccaactactc ctgagacacc tcctccaacc acttcagagg tctctactcc aactaccacc 2640
aaggagccta ccactatcca caaaagccct gatgaatcaa ctcctgagct ttctgcagaa 2700
cccacaccaa aagctcttga aaacagtccc aaggaacctg gtgtacctac aactaagact 2760
cctgcagcga ctaaacctga aatgactaca acagctaaag acaagacaac agaaagagac 2820
ttacgtacta cacctgaaac tacaactgct gcacctaaga tgacaaaaga gacagcaact 2880
acaacagaaa aaactaccga atccaaaata acagctacaa ccacacaagt aacatctacc 2940
acaactcaag ataccacacc attcaaaatt actactctta aaacaactac tcttgcaccc 3000
aaagtaacta caacaaaaaa gacaattact accactgaga ttatgaacaa acctgaagaa 3060
acagctaaac caaaagacag agctactaat tctaaagcga caactcctaa acctcaaaag 3120
ccaaccaaag cacccaaaaa acccacttct accaaaaagc caaaaacaat gcctagagtg 3180
agaaaaccaa agacgacacc aactccccgc aagatgacat caacaatgcc agaattgaac 3240
cctacctcaa gaatagcaga agccatgctc caaaccacca ccagacctaa ccaaactcca 3300
aactccaaac tagttgaagt aaatccaaag agtgaagatg caggtggtgc tgaaggagaa 3360
acacctcata tgcttctcag gccccatgtg ttcatgcctg aagttactcc cgacatggat 3420
tacttaccga gagtacccaa tcaaggcatt atcatcaatc ccatgctttc cgatgagacc 3480
aatatatgca atggtaagcc agtagatgga ctgactactt tgcgcaatgg gacattagtt 3540
gcattccgag gtcattattt ctggatgcta agtccattca gtccaccatc tccagctcgc 3600
agaattactg aagtttgggg tattccttcc cccattgata ctgtttttac taggtgcaac 3660
tgtgaaggaa aaactttctt ctttaaggat tctcagtact ggcgttttac caatgatata 3720
aaagatgcag ggtaccccaa accaattttc aaaggatttg gaggactaac tggacaaata 3780
gtggcagcgc tttcaacagc taaatataag aactggcctg aatctgtgta ttttttcaag 3840
agaggtggca gcattcagca gtatatttat aaacaggaac ctgtacagaa gtgccctgga 3900
agaaggcctg ctctaaatta tccagtgtat ggagaaacga cacaggttag gagacgtcgc 3960
tttgaacgtg ctataggacc ttctcaaaca cacaccatca gaattcaata ttcacctgcc 4020
agactggctt atcaagacaa aggtgtcctt cataatgaag ttaaagtgag tatactgtgg 4080
agaggacttc caaatgtggt tacctcagct atatcactgc ccaacatcag aaaacctgac 4140
ggctatgatt actatgcctt ttctaaagat caatactata acattgatgt gcctagtaga 4200
acagcaagag caattactac tcgttctggg cagaccttat ccaaagtctg gtacaactgt 4260
ccttagactg atgagcaaag gaggagtcaa ctaatgaaga aatgaataat aaattttgac 4320
actgaaaaac attttattaa taaagaatat tgacatgagt ataccagttt atatataaaa 4380
atgtttttaa acttgacaat cattacacta aaacagattt gataatctta ttcacagttg 4440
ttattgttta cagaccattt aattaatatt tcctctgttt attcctcctc tccctcccat 4500
tgcatggctc acacctgtaa aagaaaaaag aatcaaattg aatatatctt ttaagaattc 4560
aaaactagtg tattcactta ccctagttca ttataaaaaa tatctaggca ttgtggatat 4620
aaaactgttg ggtattctac aacttcaatg gaaattatta caagcagatt aatccctctt 4680
tttgtgacac aagtacaatc taaaagttat attggaaaac atggaaatat taaaatttta 4740
cacttttact agctaaaaca taatcacaaa gctttatcgt gttgtataaa aaaattaaca 4800
atataatggc aataggtaga gatacaacaa atgaatataa cactataaca cttcatattt 4860
tccaaatctt aatttggatt taaggaagaa atcaataaat ataaaatata agcacatatt 4920
tattatatat ctaaggtata caaatctgtc tacatgaagt ttacagattg gtaaatatca 4980
cctgctcaac atgtaattat ttaataaaac tttggaacat taaaaaaata aattggaggc 5040
ttaaggatta 5050

Claims (7)

1.一种重组腺相关病毒在制备用于治疗患有骨关节炎的哺乳动物受试者的药物中的用途，其包括向所述哺乳动物受试者关节内施用治疗有效量的所述重组腺相关病毒，其中所述重组腺相关病毒包含与启动子可操作地连接的编码透明质酸合酶2多肽的核酸，其中所述透明质酸合酶2多肽在所述哺乳动物受试者中以有效减轻骨关节炎症状的量体内表达。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述透明质酸合酶2多肽由SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述编码透明质酸合酶2多肽的核酸由SEQ IDNO:3中所示的核苷酸序列组成；以及
其中所述重组腺相关病毒包含重组腺相关病毒载体基因组，其从5’至3’包含以下元件：5’AAV反向末端重复序列、填充核酸、启动子、内含子、犬透明质酸合酶2密码子优化的cDNA、多聚腺苷酸化信号和3’AAV反向末端重复序列。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述重组腺相关病毒载体包含表达盒，所述表达盒从5’至3’包含以下元件：鸡β-肌动蛋白启动子、杂合内含子、编码犬透明质酸合酶2多肽的核酸序列和牛生长激素polyA位点。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述重组腺相关病毒关节内注射到哺乳动物关节中导致编码犬透明质酸合酶2多肽的核酸序列基因转移到软骨和滑膜。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述重组腺相关病毒关节内注射到哺乳动物关节中导致体内在滑膜细胞和软骨细胞中产生透明质酸。
7.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述重组腺相关病毒包含AAV5衣壳。
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