JP2003500022A - トリボネクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、トリボネクチンおよびトリボネクチンを直接損傷した関節または関節炎の関節に投与することにより行われる摩擦補強の方法を特徴付ける。本発明のトリボネクチンは、少なくとも１つのＯ結合型潤滑部分を含み、上記部分としては、β（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ部分が挙げられる。また、上記摩擦補強の方法とは、哺乳動物の関節を潤滑させる方法であって、この方法は、関節を、単離された巨核球刺激因子（ＭＳＦ）遺伝子産物と接触させる工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、米国特許出願番号第０９／２９８，９７０号（１９９９年４月２３
日出願）の一部継続であり、この出願の内容全体は本明細書中に参考として援用
される。

【０００２】 （発明の背景） 本発明は、哺乳動物関節の潤滑に関する。

【０００３】 変形性関節症（ＯＡ）は、関節疾患の最も一般的な形態の１つである。ＯＡの
発症に寄与する因子としては、ＯＡの家族歴、外傷または手術による関節に対す
る以前の損傷、および関節の年齢（すなわち、関節のアーティキュレイティング
（ａｒｔｉｃｕｌａｔｉｎｇ）表面の「摩耗および裂傷」）が挙げられる。ＯＡ
は、老人群において非常に一般的であるが、子供にも同様に発症し得る。

【０００４】 現在の処置は、ＯＡの痛みおよび他の症状を、例えば、鎮痛薬および抗炎症薬
物を投与することによって軽減することに指向される。他の治療アプローチは、
滑液の粘度を増加させるために、ヒアルロン酸およびその誘導体を投与すること
による粘度補充（ｖｉｓｃｏｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を含む。

【０００５】 （発明の要旨） 本発明は、摩擦補充（ｔｒｉｂｏｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）による変
形性関節症および他の変性関節疾患に対する新規な処置を特徴とする。摩擦補充
は、損傷した関節または関節炎の関節に潤滑ポリペプチドを直接投与することに
よって実行される。粘度補充とは異なり、摩擦補充は、それが添加される溶液（
例えば、滑液）の粘度を実質的に増加させない。トリボネクチン（ｔｒｉｂｏｎ
ｅｃｔｉｎ）が添加される溶液の粘度は、わずか１０％、好ましくはわずか５％
、より好ましくは、わずか２％、より好ましくは、わずか１％しか増加しない。
最も好ましくは、トリボネクチンが添加される溶液の粘度は、不変であるか、ま
たは減少する。

【０００６】 従って、本発明は、トリボネクチンを提供する。トリボネクチンは、ＫＥＰＡ
ＰＴＴ（配列番号３）と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列の少なくとも
１つの反復を含む人工の境界潤滑剤である。トリボネクチンは、少なくとも１つ
のＯ結合型潤滑部分を含む。好ましくは、その潤滑部分は、β（１−３）Ｇａｌ
−Ｇａｌ ＮＡｃ部分である。天然に存在するトリボネクチンのタンパク質骨格
のアミノ酸配列は、ヒト巨核球刺激因子（ＭＳＦ）遺伝子のエキソンの選択的ス
プライシングに依存して、異なり得る。例えば、トリボネクチンは、配列番号１
のアミノ酸１〜２４および２００〜１４０４を含むが、配列番号１のアミノ酸２
５〜１９９を欠損する。トリボネクチンは、配列番号１のアミノ酸１〜１５６お
よび２００〜１４０４を含むが、配列番号１のアミノ酸１５７〜１９９を欠損す
る。トリボネクチンは、配列番号１のアミノ酸１〜１０６および２００〜１４０
４を含むが、配列番号１のアミノ酸１０７〜１９９を欠損する。トリボネクチン
は、配列番号１のアミノ酸１〜２５、配列番号１の６７〜１０６および配列番号
１の２００〜１４０４を含むが、配列番号１のアミノ酸２６〜６６を欠損する。
トリボネクチンは、精製された天然に存在するポリペプチドもしくは合成的に作
製されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドである。合成もしくは組換えト
リボネクチンの骨格のアミノ酸配列は、天然に存在するトリボネクチンのアミノ
酸配列と少なくとも５０％同一であり、そして、天然に存在するトリボネクチン
の潤滑活性の少なくとも５０％を所有する。

【０００７】 トリボネクチンは、潤滑が所望される、哺乳動物関節または他の組織（例えば
、心臓組織）への投与のために処方される。好ましくは、トリボネクチンは、組
換えまたは化学的に合成された潤滑ポリペプチドである。例えば、トリボネクチ
ンは、実質的に純粋なポリペプチドを含み、そのアミノ酸配列は、少なくとも１
つの反復を含むが、７６未満の反復を含む。各サブユニットは、少なくとも７個
のアミノ酸（そして代表的には、１０個以下のアミノ酸）を含む。各サブユニッ
トのアミノ酸配列は、配列番号３と少なくとも５０％同一であり、そして参照配
列における非同一アミノ酸は、保存的アミノ酸置換である。例えば、１つもしく
は両方のスレオニン残基は、セリン残基に置換される。好ましくは、そのサブユ
ニットのアミノ酸配列は、配列番号３と同一である。トリボネクチンまた、アミ
ノ酸配列ＸＸＴＴＴＸ（配列番号４）の１つ以上の反復を含む。本明細書中に記
載されるポリペプチドまたは他の化合物が、それらが目的の化合物が少なくとも
重量で６０％（乾燥重量）である調製物内にある場合、「実質的に純粋」である
といわれる。好ましくは、その調製物は、目的の化合物重量で、少なくとも７５
％、より好ましくは、少なくとも９０％、および最も好ましくは、少なくとも９
９％である。純度は、任意の適切な標準的方法（例えば、カラムクロマトグラフ
ィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析）によって測定され
得る。

【０００８】 特定のポリペプチドまたは核酸分子が、限定された長さの参照ポリペプチドま
たは核酸分子と特定の同一性パーセントを有することが言われている場合、その
同一性パーセントは、参照ポリペプチドまたは核酸分子に関連している。従って
、１００アミノ酸長である参照ポリペプチドと５０％同一であるペプチドは、参
照ポリペプチドの５０アミノ酸長部分と完全に同一である５０アミノ酸ポリペプ
チドであり得る。それはまた、その全長にわたって参照ポリペプチドと５０％同
一である１００アミノ酸長ポリペプチドであり得る。

【０００９】 所定の参照ポリペプチドまたは核酸分子と「実質的に同一」であるポリペプチ
ドまたは核酸分子は、所定の参照ポリペプチド配列または核酸分子の配列に対し
て少なくとも８５％、好ましくは９０％およびより好ましくは９５％、９８％、
９９％以上の同一性を有する配列を有するポリペプチドまたは核酸分子である。
「同一性」は、当該分野で認められた意味を有し、そして公開された周知技術（
例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
１９８８，Ｌｅｓｋ Ａ．Ｍ．，編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉ
ｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，１９９３，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．
Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ
Ａｎａｙｌｕｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，１
９９４，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｉｎ，Ｅ．Ｇ．，編、Ｅｕｍ
ａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７，Ｈｅｉｎｊｅ，
Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ ２０ Ｙｏｒｋ；およびＳｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，１９９１，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，
Ｍ．およびＤｅｒｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ）を使用して算出される。２つのポリヌクレオチドまたはポリペ
プチド配列間の同一性を測定するための方法は、多数存在するが、用語「同一性
」は、当業者に周知であり、そして所定の特定の方法に関する限定された意味を
有する。本明細書中に記載される配列同一性は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｓｏｆｔ
ｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）
を使用して測定される。使用されるＭｅｇＡｌｉｇｎモジュールは、Ｃｌｕｓｔ
ａｌ Ｖ方法（Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ ５（２）：１５１
−３）である。使用されるパラメータは、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ １０、ｇａ
ｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ １０である。

【００１０】 あるいは、所定の参照配列と異なる核酸は、参照配列を有するＤＮＡ鎖または
その相補鎖と、高いストリンジェンシーにてハイブリダイズする。高いストリン
ジェンシー条件は、４２℃において５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーシ
ョンさせ、６５℃にて２×ＳＳＣで第１の洗浄を行い、そして６５℃にて０．２
×ＳＳＣで第２の洗浄を行うことである。

【００１１】 トリボネクチンは、支持表面間の摩擦計数（μ）を減少させるものとして特徴
付けられる。例えば、摩擦の減少は、インビトロでラテックス：ガラスベアリン
グを使用して、摩擦装置における摩擦の減少を検出ことによって測定される。摩
擦の減少はまた、インビボで、例えば患者の痛みの減少を測定することによって
、測定される。本発明のトリボネクチンは、潤滑組成物である。参照配列と少な
くとも５０％（しかし、１００％未満）のアミノ酸配列同一を有するポリペプチ
ドが、支持表面間のμの減少を測定することによって潤滑摩擦について試験され
る。

【００１２】 トリボネクチンは、Ｏ結合型オリゴサッカリド（例えば、β型（１−３）Ｇａ
ｌ−ＧａｌＮＡＣにおけるＮ−アセチルガラクトサミンおよびガラクトース）を
含む。例えば、ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）およびＸＸＴＴＴＸ（配列番号４
）反復ドメインは、β型（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡＣ（これは、時折、（１
−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡＣ−ＮｅｕＡｃの形態においてＮｅｕＡｃでキャップ
され得る）によってグリコシル化される。ポリペプチドに関する用語「グリコシ
ル化」は、炭水化物部分がポリペプチド分子の１つ以上の部位に存在することを
意味する。例えば、トリボネクチンの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも
２０％、より好ましくは少なくとも３０％、そして最も好ましくは少なくとも４
０％がグリコシル化される。５０％以上までのトリボネクチンが、グリコシル化
され得る。グリコシル化パーセントは、重量によって決定される。

【００１３】 トリボネクチンポリペプチドは、ＭＳＦの実質に純粋なフラグメントを含む。
例えば、天然に存在するトリボネクチンのアミノ酸配列を有する実質的に純粋な
トリボネクチンの分子量は、２２０〜２８０ｋＤａの範囲内にである。好ましく
は、トリボネクチンの見かけの分子量は、２３０ｋＤａ未満、より好ましくは２
５０ｋＤａ未満、そして最も好ましくは２８０ｋＤａ未満である。タンパク質ま
たはポリペプチドフラグメントは、天然に存在するタンパク質またはそれから誘
導されるポリペプチド（例えば、ＭＳＦ）のアミノ酸配列の一部（全てではない
）と同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドとして定義される。トリボネ
クチンは、ポリペプチドを含み得、そのアミノ酸配列は、配列番号１の残基２０
０〜１１４０（包括的）の配列と少なくとも５０％同一であり、例えば、それは
配列番号１の残基２００〜１１４０（包括的）のアミノ酸配列を含む。別の例に
おいて、このポリペプチドは、配列番号１の残基２００〜１１６７（包括的）の
配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含み、例えば、配列番号１の
残基２００〜１１６７（包括的）と同一であるアミノ酸配列を有する。このポリ
ペプチドは、配列番号１の残基２００〜１２１２（包括的）の配列と少なくとも
５０％同一であるアミノ酸配列（例えば、配列番号１の残基２００〜１２１２（
包括的）と同一であるアミノ酸配列）を含むか、またはこのポリペプチドは、配
列番号１の残基２００〜１２６３（包括的）の配列と少なくとも５０％同一であ
るアミノ酸配列（例えば、配列番号１の残基２００〜１２６３（包括的）と同一
であるアミノ酸配列）を含む。好ましくは、ポリペプチドの配列は、配列番号１
の残基１〜２４（包括的）のアミノ酸配列および／または配列番号１の残基６７
〜１０４（包括的）のアミノ酸配列を欠損する。

【００１４】 本発明はまた、トリボネクチンをコードする単離された核酸分子を特徴とする
。例えば、その核酸は、配列番号２のヌクレオチド６３１〜３４５３（包括的）
と少なくとも５０％同一である配列を含む。好ましくは、その核酸は、配列番号
１の残基２００〜１１４０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
例えば、その核酸は、配列番号２のヌクレオチド６３１〜３４５３（包括的）の
配列と同一であるヌクレオチド配列またはその縮重改変体を有する。単離された
核酸分子は、５’および３’コード配列または生物体の天然に存在するゲノムに
おいてすぐ隣に隣接するコード配列を伴う非コード配列から分離される核酸分子
である。単離された核酸分子は、天然に存在しない核酸分子（例えば、組換えＤ
ＮＡ技術によって作製された核酸分子）を含む。例えば、本発明の核酸は、配列
番号２のヌクレオチド６３１〜３４５３（包括的）を含むが、天然に存在するゲ
ノム配列において、それらの配列のすぐ隣に隣接するヌクレオチドまたは天然に
存在するｃＤＮＡを含まない。

【００１５】 また、関節を、精製されたＭＳＦまたはトリボネクチンと接触させることによ
って、哺乳動物関節を潤滑させる（ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ）方法は、本発明の
範囲内である。その哺乳動物は、好ましくは、ヒト、ウマ、イヌ、ウシ、ロバ、
マウス、ラット、モルモット、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、サル、またはネ
コであり、そして関節は、アーティキュレイティング（ａｒｔｉｃｕｌａｔｉｎ
ｇ）関節（例えば、膝、肘、肩関節、股関節部または任意の他の体重負荷関節）
である。トリボネクチンは、関節内に投与される。治療的関節潤滑はまた、遺伝
子治療（例えば、関節または滑液をトリボネクチンをコードする核酸と接触させ
ること）によって実施され得る。例えば、核酸は、関節内（ｉｎｔｒａ−ａｒｔ
ｉｃｕｌａｒ）注射によって滑液腔に投与される。

【００１６】 哺乳動物関節における境界潤滑剤として機能することに加えて、トリボネクチ
ンは、哺乳動物軟部組織間（例えば、皮膚もしくは内臓）または哺乳動物組織と
医療デバイス（例えば、人工器官移植片）との間に、境界潤滑剤として使用され
る。従って、本発明は、組織癒着形成を阻害するために適切な形態で、トリボネ
クチンを含む生物学的適合性組成物を包含する。例えば、トリボネクチンは、フ
ィルム、膜、泡沫、ゲルまたは繊維の形態である。本明細書中で使用される場合
、用語「フィルム」は、薄い膜に泡沫またはゲルを押しつけることによって、例
えば、鋳型に注ぎ込み、そして薄い膜に風乾することによってか、またはゲルも
しくは繊維を押しつけることによってか、あるいはゲルまたは繊維を脱水させる
か、もしくは脱水を引き起こすことによって形成される物質を意味する。本明細
書中で使用される場合、用語「泡沫」は、例えば、トリボネクチン溶液、懸濁物
、ゲルまたは繊維内に空気のように導入することによって形成される多孔性構造
を有する物質を意味する。本明細書中で使用される場合、用語「生物学的適合性
」とは、移植後の身体において、身体から除去されるか、または代謝される非毒
性産物に分解する組織適合性材料の能力をいう。本明細書中で用語として使用さ
れる場合、「生物学的適合性」物質は、生物学的機能に対して医学的に受容不可
能である毒性か、または傷害性の効果をもたない物質である。癒着を予防するた
めのトリボネクチン組成物がまた、例えば、組織が癒着を伴わずに増殖し得る型
わくを形成するように、押出し（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）のために適切な組成物と
して処方される。

【００１７】 哺乳動物における第一表面と第二表面との間の接着形成を阻害する方法は、哺
乳動物における表面の接着を防ぐのに十分な量で第一表面と第二表面との間にト
リボネクチンを配置することによって実行される。例えば、表面の一方または両
方が哺乳動物組織であり、そしてそれらの間に配置されたトリボネクチンが、治
癒プロセスの間の接着の形成を妨げる。あるいは、第一表面または第二表面（あ
るは、その両方）は、整形外科移植物のような人工的なデバイスである。処置さ
れるべき組織は、外科手術切開または外傷により損傷された組織を含む。

【００１８】 生物学的サンプルを哺乳動物から得て、生物学的サンプル中のＭＳＦフラグメ
ントの量を測定することによって、変形性関節症またはそれに対する素因を診断
するための方法もまた本発明の範囲内である。コントロール（例えば、変形性関
節症を有しないことが既知の哺乳動物由来の生物学的サンプルまたはネイティブ
の診断に関連する所定の値）と比較した量の増加は、哺乳動物が変形性関節症を
罹患するかまたは変形性関節症の発症にかかりやすくあることを示す。任意の生
物学的サンプルが、この診断方法で試験するのに適する；典型的には、生物学的
サンプルは、滑液、血液、血清または尿である。好ましくは、ＭＳＦフラグメン
トは、配列番号３のアミノ酸配列を含む。あるいは、ＭＳＦフラグメントは、Ｅ
ＰＡＰＴＴのアミノ酸配列（配列番号５；トリボネクチンのトリプシン切断の産
物）またはＰＴＴＫＥＰのアミノ酸配列（配列番号６；トリボネクチンのエラス
ターゼ切断の産物）を含む。

【００１９】 本発明の特徴および利点は、本発明の好ましい実施形態の以下の記載および特
許請求の範囲から明らかである。

【００２０】 （詳細な説明） 多くの天然トリボネクチンアイソフォームが同定され、単離された。例えば、
ヒト潤滑ポリペプチドは、滑液から精製され、ＭＳＦ遺伝子のエキソン２および
４〜１２（エキソン１または３でない）によってコードされるアミノ酸を含むこ
とが見出された。天然の全長ＭＳＦをコードする遺伝子は、１２エキソンを含み
、そして天然のＭＳＦ遺伝子産物は、ヘモペキシン様領域およびソマトメジン様
領域を含むビトロネクチンに対して複数のポリペプチド配列相同性を有する１４
０４アミノ酸を含む。中心に位置するエキソン６は、９４０残基を含む。エキソ
ン６は、Ｏ−グリコシル化ムチンドメインをコードする。配列番号２のヌクレオ
チド６３１〜３４５３によってコードされるポリペプチドは、関節軟骨細胞の境
界潤滑を提供する。

【００２１】

【表１】 滑液から単離される境界潤滑物は、オルタナティブスプライシングされたＭＳ
Ｆの改変体である。このオルタナティブスプライシングされた改変体は、関節に
潤滑能力を与える滑液に存在する組成物において見出された。ヒト滑液から単離
される境界潤滑物は、ＭＳＦ遺伝子のエキソン２、および４〜１２によってコー
ドされるアミノ酸を含む（すなわち、オルタナティブスプライシング改変体がＭ
ＳＦ遺伝子のエキソン１および３によってコードされるアミノ酸を欠く）。ＭＳ
Ｆの少なくともエキソン６を含む組換え的にまたは化学的に産生されたポリペプ
チド（エキソン１も３もない）は、変形性関節症疾患を妨げる、そして／または
処置するのに有用である。同一または保存的置換を有するのいずれかでアミノ酸
配列ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）の少なくとも１つの反復を含む組換え的また
は化学的に産生された潤滑ポリペプチドはまた、哺乳動物の関節を潤滑させるた
めに投与される。

【００２２】 （組換え潤滑ポリペプチドの産生および精製） 組換えポリペプチドを産生するために、適切な発現ベクター中のＭＳＦのエキ
ソン６（配列番号２のヌクレオチド６３１〜３４５３）を含むＤＮＡが細胞にト
ランスフェクトされる。ＤＮＡはまた、ＭＳＦ遺伝子のエキソン７（配列番号２
のヌクレオチド３５４〜３５３４）、エキソン８（配列番号２のヌクレオチド３
５３５〜３６７０）、またはエキソン９（配列番号２のヌクレオチド３６７１〜
３８２２）のいくつかまたはすべてを含み得る。ＭＳＦの種々のエキソンにわた
るＤＮＡを生成するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法のためのプライ
マーが、以下に示される。他のアイソフォームは、発現されることが求められる
アミノ酸配列をコードするＭＳＦのエキソンに対応する核酸をクローニングする
ことによって発現される。

【００２３】

【表２】 種々の長さのトリボネクチンポリペプチドをコードし、そして例えば、エキソン
２、４〜１２；エキソン６〜９；およびエキソン２、４〜９によってコードされ
るポリペプチドを作製するために、ＭＳＦ遺伝子の種々のエキソンを組み込むＤ
ＮＡを作製するために使用されるフォワードプライマーおよびリバースプライマ
ーを設計する方法は、分子生物学の分野で周知である。単離された核酸を用いて
細胞をトランスフェクトするための標準的な方法は、分子生物学の当業者に周知
である。例えば、培養物中の原核生物細胞または真核生物細胞は、細胞中で高レ
ベル発現に適切な発現制御配列に作動可能に連結される本発明のＤＮＡを用いて
トランスフェクトされる。このような細胞は、多量の潤滑ポリペプチドを産生す
るのに有用であり、これは、標準的な方法を使用して精製される。潤滑ポリペプ
チドは、関節炎疾患の処置または予防のために治療的に使用される。ポリペプチ
ドはまた、天然または組換え的に産生される潤滑糖タンパク質またはグリコペプ
チドに対する抗体を産生するために使用される。

【００２４】 例えば、組換え遺伝子産物は、融合タンパク質として発現され、市販の発現お
よび精製システム（例えば、ｐＦＬＡＧ発現システム（ＩＢＩ））を使用して精
製される。本発明の目的のために使用され得る発現システムには、本明細書中に
記載される核酸分子を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ
、またはコスミドＤＮＡの発現ベクターを用いて形質転換される細菌（例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物が挙げられるが、こ
れには限定されない。グリコシル化ポリペプチドの産生のために、真核生物発現
系が使用さ得る。トリボネクチンポリペプチドをコードする組換え核酸を含む組
換え酵母発現ベクターを用いて形質転換される酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｒｎｙｃｅｓおよびＰｉｃｈｉａ）が使用される。トリボネクチンをコードする
核酸分子を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用
いて感染される昆虫細胞系、および哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオ
ネインプロモーター）からまたは哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後
期プロモーターおよびワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）から誘導され
るプロモーターを含む組換え発現構築物を宿す哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ
、ＣＥＯ、ＢＥＫ、２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、および
ＮＩＨ３Ｔ３細胞）もまた有用である。臨床的用途に加えて、組換えポリペプチ
ドは、以下に記載されるような抗体を産生するためにウサギまたはゲッ歯動物に
注射される。

【００２５】 炎症を起こしたまたは損傷した関節の滑液は、潤滑タンパク質またはポリペプ
チドを分解するタンパク質分解酵素を含む。例えば、好中球のような浸潤免疫細
胞は、トリプシンおよび／またはエラスターゼを分泌する。関節に対する小さな
損傷または炎症状態は、細胞性浸潤および外傷性滑膜炎を生じるタンパク質分解
酵素分泌を生じ得る。数日または数週間の滑膜炎は、関節の細胞保護層の損失を
生じ得、これは、次いで、軟骨の損失に導く。潤滑されていない軟骨の支持面（
ｂｅａｒｉｎｇ）は、変形性関節症を開始し得る早発磨耗（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ
ｗｅａｒ）を経験し得る。外傷性滲出（例えば、「膝関節水腫」）で臨床的に
診察を受ける個人は、変形性関節症を発症しやすくあり；タンパク質分解酵素の
生成が滑液中の天然に存在する潤滑組成物を分解し、消耗する。天然の潤滑組成
物の消耗は、慢性関節リウマチのような他の炎症性関節疾患を生じる。本発明の
潤滑組成物を用いたこのような損傷関節の滑液の置換または補充は、長期（例え
ば、数年、数十年後さえ）の変形性関節症の発症を防ぎ、すぐに関節を潤滑し、
短期の損傷を最小化する インビボでの分解を受けにくい潤滑ペプチドのアナログ、ホモログまたは模倣
物を使用して、哺乳動物の関節を潤滑させる。アナログは、アミノ酸配列、配列
に影響を及ぼさない改変、またはその両方が、天然に存在するペプチドと異なり
得る。改変（通常は主要配列を改変しない）としては、ポリペプチドのインビボ
もしくはインビトロの化学的誘導体化（例えば、アセチル化もしくはカルボキシ
ル化）が挙げられる。グリコシル化の改変（例えば、その合成およびプロセシン
グの間に、またはさらなるプロセシング工程においてポリペプチドのグリコシル
化パターンを改変すること、例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素（例えば
、哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル化酵素）にポリペプチドを曝すこ
とにより作製される改変）もまた、挙げられる。

【００２６】 被験体に注射した後のペプチドのタンパク質分解が問題である場合に、特に感
受性のペプチド結合を非切断性のペプチド模倣結合と置換することは、得られる
ペプチドをより安定にし、従って治療剤としてより有用にする。治療ペプチドを
ペプチダーゼ（例えば、トリプシンまたはエラスターゼ（ｅｌａｓｔｉｓｅ））
により分解されにくくするために、ペプチドのペプチド結合を、別の型の共有結
合で置換し得る（「ペプチド模倣物」）。トリプシン、エラスターゼ、および他
の酵素は、関節炎症の間に免疫細胞が浸潤することにより合成され得る。トリプ
シンは、リジンおよびアルギニンのカルボキシ末端側でポリペプチド結合を切断
し；エラスターゼは、アラニン、グリシンのカルボキシ末端側で切断する。トロ
ンビン（出血性関節において存在するセリンプロテアーゼである）は、アルギニ
ンのカルボキシ末端側でペプチド結合を切断する。コラゲナーゼは、滑液代謝が
変化した場合に（例えば、傷害の間に）線維芽細胞および軟骨細胞により生成さ
れる酵素のファミリーである。これらの酵素は、グリシンおよびプロリンのカル
ボキシ末端側で切断する。１つ以上のペプチダーゼ感受性ペプチド結合（例えば
、ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）反復配列に現れる結合）を改変して（例えば、
非ペプチド結合と置換して）、部位を切断しにくくし、従って、治療処方物の臨
床的半減期を増大させる。

【００２７】 このような模倣物およびポリペプチドにこれらの模倣物を組み込む方法は、当
該分野で周知である。同様に、Ｌ−アミノ酸残基をＤ−アミノ酸で置換すること
は、ポリペプチドをタンパク質分解されにくくする標準的方法である。アミノ末
端ブロック基もまた有用である。このブロック基としては、以下が挙げられる：
ｔ−ブチルオキシカルボニル、アセチル、テニル（ｔｈｅｙｌ）、スクシニル、
メトキシスクシニル、スベリル（ｓｕｂｅｒｙｌ）、アジピル（ａｄｉｐｙｌ）
、アゼライル（ａｚｅｌａｙｌ）、ダンシル、ベンジルオキシカルボニル、フル
オレニルメトキシカルボニル、メトキシアゼレイル、メトキシアジピル、メトキ
シスベリル、および２，４−ジニトロフェニル。

【００２８】 トリボネクチン（ｔｒｉｂｏｎｅｃｔｉｎ）の臨床的処方物はまた、ペプチダ
ーゼインヒビターを含み得る。このペプチダーゼインヒビターとしては、以下が
挙げられる：Ｎ−メトキシスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌクロロ
メチルケトン（エラスターゼのインヒビター）。他の臨床的に受容可能なプロテ
アーゼインヒビター（例えば、Ｂｅｒｌｉｎｇら、１９９８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐａ
ｎｃｒｅａｔｏｌｏｇｙ ２４：９−１７）、例えば、ロイペプチン、アプロチ
ニン、α１−アンチトリプシン、α２−マクログロブリン、α１−プロテアーゼ
インヒビター、アンチキモトリプシン（ＡＣＨＹ）、分泌性白血球プロテアーゼ
インヒビター（ＰＳＴＩ）はまた、トリボネクチンとともに同時投与されて、プ
ロテアーゼ分解切断を減少し、かつ臨床的半減期を増大させる。２つ以上のプロ
テアーゼインヒビターのカクテル（ｃｏｃｋｔａｉｌ）もまた、同時投与され得
る。

【００２９】 トリボネクチンポリペプチドまたはこのポリペプチドをコードする核酸の組成
物は、当該分野で公知の標準的な生理学的に適合性の賦形剤中に処方される（例
えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））。他の処方物およびこのような処方
物を作製するための方法は周知であり、かつ「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に見いだされ得る。トリボネクチ
ンはまた、非架橋ヒアルロン酸調製物または粘性補充（ｖｉｓｃｏｓｕｐｐｌｅ
ｍｅｎｔａｔｉｏｎ）組成物とともに処方される（例えば、架橋ヒアルロン酸調
製物）。トリボネクチンを粘性補充処方物に添加する場合、トリボネクチンとヒ
アルロン酸との相互作用は、粘性補充物質の粘性を減少させる。

【００３０】 糖ペプチドを作製し、そしてグリコシル化％を決定する方法は、当該分野で公
知である（例えば、米国特許第５，７６７，２５４号に記載）。Ｎ−アセチルガ
ラクトサミンの存在は、Ｏ結合型オリゴサッカリド（すなわちＳｅｒ／Ｔｈｒ結
合型オリゴサッカリド）の存在を示す。Ｏ結合型オリゴサッカリドにおいて、Ｇ
ａｌＮＡｃは、アミノ酸に対して直のＯ−グリコシドα結合において共通して見
いだされる。Ｏ結合型オリゴサッカリドの存在はまた、Ｊａｃａｌｉｎ−セファ
ロース（糖タンパク質におけるＳｅｒ／Ｔｈｒに結合したコアのジサッカリド配
列Ｇａｌβ（１−３）ＧａｌＮＡｃに結合する固定化植物レクチン、すなわちβ
（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃに結合するピーナッツ凝集素）に結合すること
により検出される。Ｏ結合型オリゴサッカリドは、標準的な方法を用いて、Ｎ結
合型オリゴサッカリドとは区別される。例えば、Ｏグリコシド結合であって、Ｎ
結合型グリコシル結合でないオリゴサッカリドは、ホウ素化水素ナトリウムの存
在下（５０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＢＨ₄、４５℃で１６時間）で穏和な塩
基を用いた処理によりペプチドから遊離しやく、β脱離反応を引き起こす。

【００３１】 （獣医学的適用） イヌ変形性関節症は、本明細書中で記載される方法を使用して処置される有力
な臨床的障害である。５匹の成体イヌに対して推定１匹が変形性関節症に罹って
おり；推定８００万匹のイヌがこの変性（潜在的に衰弱性疾患）に苦しんでいる
。しかし、多くの飼い主は、慢性的なイヌの疼痛の兆候を認識していない。どの
イヌも変形性関節症を発症し得るが、危険性が最も高いイヌは、多産（ｌａｒｇ
ｅ ｂｒｅｅｄ）の老齢化したイヌ、非常に活動的なイヌ（例えば、労働犬また
は競技用犬）、および臀部または肘形成異常のような遺伝した関節異常を有する
イヌである。

【００３２】 ウマ変形性関節疾患（例えば、変形性関節症）は、ウマの不具および作業の減
少の原因である。ヒトおよび他の動物でも同様に、ウマに罹る変性性関節疾患は
、関節性軟骨変性および関節滲出により特徴づけられる滑膜性の連結の進行性障
害である。急性または慢性の外傷、酷使、発達疾患、関節不安定性および老齢は
滑膜炎、軟骨代謝の欠陥、および関節軟骨における亀裂の形成を導く。トリプシ
ン、エラスターゼ、ストロメライシンおよびヒアルロニダーゼのような破壊酵素
は、関節に放出され、関節では、それらは滑液および軟骨成分を分解し、結果と
して滑液粘性の減少、貧弱な潤滑性、軟骨代謝の衰え、ならびに疼痛および軟骨
衰退を生じる摩擦の増大を生じる。現在の治療アプローチとしては、疼痛除去お
よび抗炎症薬物のための医薬が挙げられる。本明細書中に記載される組成物およ
び方法は、罹患した関節の潤滑能力を補充するために有用である。

【００３３】 （治療的ポリペプチドの適用） ペプチドの送達について標準的な方法が使用される。このような方法は、当業
者に周知である。関節内投与について、トリボネクチンは、１回の注射につき約
０．１〜２ｍｌの容量で２０〜５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で滑膜腔（ｓｙｎ
ｏｖｉａｌ ｃａｖｉｔｙ）に送達される。例えば、２５０μｇ／ｍｌの濃度の
１ｍｌのトリボネクチンは、細い（例えば、１４〜２２ゲージ、好ましくは、１
８〜２２ゲージ）針を用いて膝関節に注射される。本発明の組成物はまた、非経
口投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、および腹膜内）のために有用である。

【００３４】 手術癒着を予防するために、本明細書中に記載のトリボネクチンを、ゲル、泡
（ｆｏａｍ）、繊維、または織物（ｆａｂｒｉｃ）の形態で投与する。このよう
に処方されたトリボネクチンは、並んでいる表面の間での癒着形成を予防するた
めに、損傷したか、または曝された組織境界の上および組織境界の間に配置され
る。有効であるためには、ゲルまたはフィルムは、適所に留まっていなければな
らず、そしてゲルが最終的に分散し、そして組織が接触する場合に、もはや癒着
の傾向がないように、十分長期間にわたり、組織接触を妨げなければならない。
癒着形成を阻害または予防するために処方されたトリボネクチン（例えば、メン
ブレン、織物、泡沫、またはゲルの形態で）は、ラット盲腸接着モデル（Ｇｏｌ
ｄｂｅｒｇら、Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ ａｎｄ Ａｄｈｅｓ
ｉｏｎ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ、Ｗｉｌｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、１９１〜２０４頁、
１９９３）において手術後癒着の予防について評価される。組成物を、外科的に
磨り減らした（ａｂｒａｄｅｄ）ラット盲腸周辺に配置し、そして未処理コント
ロールと比較する（盲腸を磨り減らしたが、いずれの処置も受けなかった動物）
。トリボネクチン処方物の存在下でのラットモデルにおける癒着形成の量の減少
は、処方物非存在下での量と比較すると、この処方物が、組織癒着形成を減少す
るに臨床的に有効であることを示す。

【００３５】 トリボネクチンはまた、哺乳動物への移植の前に、人工四肢および関節をコー
ティングするために使用される。例えば、このようなデバイスは、トリボネクチ
ンの溶液に浸漬、すなわち槽に入れられる（例えば、米国特許第５，７０９，０
２０号および同第５，７０２，４５６号に記載）。

【００３６】 潤滑性ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸（少なくとも１つのＫＥＰ
ＡＰＴＴ（配列番号３）または少なくとも１つのＸＸＴＴＴＸ（配列番号４）反
復を含む）であり、通常、長さが約２０の連続するアミノ酸、好ましくは少なく
とも４０の連続するアミノ酸、より好ましくは、少なくとも５０の連続するアミ
ノ酸、および最も好ましくは、少なくとも約６０〜８０の連続するアミノ酸であ
る。例えば、このポリペプチドは、長さが約５００アミノ酸であり、そして７６
反復のＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）を含む。このポリペプチドは、長さが１４
０４残基未満であり、例えば、天然に存在するＭＳＦ（配列番号１）のアミノ酸
配列を有するが、少なくとも５、１０、１５、２０、または２４アミノ酸の天然
に存在するＭＳＦを欠如する。このようなペプチドは当業者に公知の方法により
作製され、このような方法としては、以下が挙げられる：組換えＭＳＦタンパク
質のタンパク質分解、デノボ合成、または遺伝子操作（例えば、ＭＳＦ遺伝子の
クローニングおよび少なくともエキソン６、７、８、および／または９の発現）
。

【００３７】 トリボネクチンポリペプチドはまた、生化学的に精製される。酵素、キモトリ
プシンは、ＭＳＦ遺伝子のエキソン６によりコードされるアミノ酸をひとまとめ
にした部位で切断する。従って、ＭＳＦ遺伝子のエキソン（しかし、他のどのＭ
ＳＦエキソンでもない）によりコードされるアミノ酸を含むポリペプチドは、キ
モトリプシンでの酵素消化により、天然に存在するか、または組換え生成された
ＭＳＦ遺伝子産物から調製される。次いで、このポリペプチドを標準的な生化学
的精製方法に供して、治療的投与、潤滑性活性の評価または抗体生成に適した実
質的に純粋なポリペプチドを得る。

【００３８】 治療組成物は、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、生理食塩水）中で投与
される。キャリアは、投与様式および経路ならびに標準的薬学的実施に基づいて
選択される。治療組成物（例えば、潤滑性ポリペプチド）の治療的に有効な量は
、処置した動物において医学的に所望される結果（例えば、哺乳動物関節の境界
の潤滑）を生じ得る量である。医学的に所望される結果は、疼痛の減少（例えば
、Ｐｅｙｒｏｎら、１９９３、Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．（補遺．３９）：１０
−１５に記載の可視的類似疼痛スケール（ｖｉｓｕａｌ ａｎａｌｏｇ ｐａｉ
ｎ ｓｃａｌｅ）を用いて測定される）または関節を動かす能力の増大（例えば
、Ｂｅｌｃｈｅｒら、１９９７、Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｔｒａｕｍａ １１：１０
６−１０９に記載のようにペドメトリ（ｐｅｄｏｍｅｔｒｙ）を用いて測定され
る）である。処置後に滑液の潤滑性を測定する別の方法は、罹患した関節から少
量の滑液を再吸引し、そして本明細書中に記載の摩擦装置を用いてインビトロで
潤滑特性を試験することである。

【００３９】 医学分野で周知のように、任意の１匹の動物についての投薬量は、多くの因子
に依存する。これらの因子としては、以下が挙げられる：動物のサイズ、体表面
積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全般的健康
状態、ならびに同時に投与される他の薬物。一般に、損傷した関節または炎症を
起こした関節に局所的に投与が行われる。あるいは、このポリペプチドは、損傷
した関節または炎症を起こした関節の部位でゆっくりと放出させるために、関節
のすぐ近くに配置された時限放出（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅｄ）インプラント
を介して投与される。

【００４０】 （遺伝子治療） 遺伝子治療は、治療的潤滑性ペプチドをコードする哺乳動物核酸（例えば、ア
ミノ酸配列ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）の１回以上の反復をコードするＤＮＡ
またはＭＳＦの潤滑性フラグメントをコードするＤＮＡ）を、標準的ベクターお
よび／または遺伝子送達系により投与することで行われる。適切な遺伝子送達系
としては、以下が挙げられる：リポソーム、レセプター媒介送達系、裸のＤＮＡ
、およびウイルスベクター（例えば、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデ
ノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）。

【００４１】 上記のように遺伝子送達系に加えて、治療組成物は、動物への投与に適切な薬
学的に受容可能なキャリア（例えば、生理食塩水のような生物学的に適合性のビ
ヒクル）を含み得る。治療的に有効な量の核酸またはポリペプチド組成物は、処
置される動物において医学的に所望される結果（例えば、関節の動きと関連した
疼痛の減少、滑液の潤滑機能の増大）を生じ得る量である。

【００４２】 非経口投与（例えば、静脈内、皮下、筋内、および腹腔内送達経路）は、化合
物を送達するために使用され得る。好ましくは、治療組成物（例えば、核酸また
はポリペプチド）は、関節内に送達される。任意の１患者のための用量は、多く
の因子（患者のサイズ、体表面面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投
与の時間および経路に依存し、一般的な健康、および同時に投与される他の薬剤
（例えば、抗炎症薬剤、粘性治療薬剤（ｖｉｓｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄ
ｒｕｇｓ））に依存する。核酸の投与の好ましい用量は、約１０６〜１０２２コ
ピーの核酸分子である。

【００４３】 ＤＮＡは、標準ベクター（例えば、プロモーター配列に作動可能に連結された
トリボネクチンをコードするＤＮＡを含むベクター）によって患者の標的細胞に
導入される。適切な遺伝子送達系としては、リポソーム、レセプター媒介送達系
、裸のＤＮＡ、およびウイルスベクター（特にヘルペスウイルス、レトロウイル
ス、およびアデノウイルス）が挙げられる。

【００４４】 ＤＮＡは、標準方法を使用するアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス送達
系を使用して局所的に投与され得る。例えば、ＤＮＡを関節内の滑液に送達する
方法およびＤＮＡを滑液由来の細胞（例えば、滑液の線維芽細胞または軟骨細胞
）に送達する方法は、米国特許第５，８５８，３５５号に記載される。組換えア
デノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの複製およびパッケージングに必要とされ
るシス作用配列のみが、ＡＡＶ末端反復である。４ｋｂまでのＤＮＡが、ウイル
ス複製にもパッケージングにも影響しないで末端反復の間に挿入される。組換え
ＡＡＶベクターをパッケージングするために、末端反復を含むプラスミドおよび
治療的ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびカプシドタン
パク質を発現するプラスミドと共に、細胞に同時トランスフェクトされる。次い
で、トランスフェクトされた細胞は、アデノ随伴ウイルスで感染され、そして所
望の配列を含む組換えＡＡＶウイルスは、トランスフェクション後、約４８〜７
２時間の細胞から単離される。次いで組換えウイルスは、公知の方法を使用して
遺伝子治療適用のために投与される。

【００４５】 エレクトロポレーションは、標的細胞（例えば、滑液の線維芽細胞または軟骨
細胞）に、エキソビボでＤＮＡを導入する別の方法である。エレクトロポレーシ
ョンされる細胞は、Ｈｅｐｅｓ緩衝液生理食塩水（ＥＢＳ）に、約１０⁷細胞／
ｍｌの濃度で置かれる。エレクトロポレーションされるＤＮＡは、約５〜２０μ
ｇ／ｍｌのＨＢＳの濃度で添加される。混合物はエレクトロポレーションデバイ
スに配置され、そして電場が標準プロトコール（例えば、約２５０と３００ボル
トの間の範囲で）に従って適用される。エキソビボでの滑膜細胞へのＤＮＡの導
入後、遺伝的に改変された自己滑膜細胞が、関節内注射によってドナーに移植さ
れる。約１０⁷細胞が、約１ｍｌの量で関節に関節内で注射される。

【００４６】 ＤＮＡが導入された滑膜細胞は、従来の方法（例えば、関節鏡を通じて）を使
用して得ら得る。関節鏡は、滑膜細胞を関節鏡検査で回収するために外科的な機
器への接近をアクセスを可能にする小さな刺創を介して膝に挿入された小さく、
窪んだ杆体である。いくつかの場合において、関節鏡的に切除された組織におけ
る滑膜細胞は、結合組織マトリックスの酵素学的消化によって無菌的に回収され
る。例えば、滑膜は、約１ｍｍの直径の小片にカットされ、そして順次、トリプ
シン（Ｇｅｙ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中０．２％
ｗ／ｖ）で、３７℃で３０分間、そしてコラゲナーゼ（Ｇｅｙ’ｓ Ｂａｌａｎ
ｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中０．２％ｗ／ｖ）で、３７℃で２時間、
消化される。遺伝的に改変された細胞の懸濁液は、レシピエント哺乳動物関節に
注射される。この型の関節内注射は慣習的であり、かつ、さらなる外科的処置を
用いないで医務室で行われる。必要な場合、繰り返しの注射が行われる。

【００４７】 あるいは、ＤＮＡ（裸またはウイルス内にパッケージングされた）は、適切な
薬学的キャリア内に処方され、そして関節内に注射される。遺伝子治療はまた、
変形性関節症を高度に発達させ易いと決定された個人（例えば、急性関節障害に
罹患した個人）において変形性関節症の発達を防ぐために予防的な手段として投
与され得る。治療的ポリペプチドをコードするＤＮＡの、関節への直接の関節内
注射は、ＤＮＡの発現を可能にするためのレシピエントの滑膜細胞のトランスフ
ェクションを生じる。

【００４８】 内因性トリボネクチンプロモーターを刺激する薬剤（例えば、ＴＧＦ−β）は
また、滑液の発現のレベルを増加するために上記のように投与され得る。

【００４９】 （滑液潤滑ポリペプチドに特異的な抗体の産生） 潤滑ポリペプチドに特異的な抗体は、当該分野で周知の技術によって得られる
。このような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。例えば
、ポリクローナル抗体は、Ｇｈｏｓｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，第９３巻，３２６−３２７，１９８３に記載される方法によって得ら
れ得る。例えば、配列番号２のヌクレオチド６３２−３４５３によってコードさ
れる潤滑ポリペプチドは、ウサギの抗血清においてポリクローナル抗体の産生を
刺激するための免疫源として使用される。類似の方法が、動物（例えば、ヤギ、
ヒツジおよびげっ歯類）において抗血清を惹起するために使用され得る。

【００５０】 モノクローナル抗体は、ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＫｏｈｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ
、２５６：４９５−４９７，１９７５に記載されるか、またはＧｅｒｈａｒｄ，
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１
９８０，第３７０−３７１頁によって変更された周知のプロセスによって得られ
る。ハイブリドーマは、抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにスクリ
ーニングされる。この抗体は、滑液潤滑ポリペプチドに高度に特異的である。好
ましくは、抗体は、少なくとも約１０⁸リットル／モルの親和性、そしてより好
ましくは、少なくとも約１０⁹リットル／モルの親和性を有する。ポリクローナ
ル抗体のモノクローナルは、大量の組換え潤滑ポリペプチドを急速に精製する手
段を提供する。

【００５１】 トリボネクチンのペプチドコアを配向する抗体に加えて、トリボネクチンの糖
部分または糖ペプチド複合体を配向する抗体が好ましい。ペプチドコアに対する
抗体を産生するために、配列番号１のアミノ酸２００〜３５０に渡るペプチドが
使用される。配列番号１のアミノ酸２００〜３５０の８〜１５アミノ酸部分に同
一である、より短いペプチド（例えば、８〜１５アミノ酸長）はまた、このよう
な抗体を産生するために使用され得る。トリボネクチンのペプチドコアに特異的
な抗体についての免疫源として使用される他のペプチドとしては、配列番号１の
アミノ酸２４〜６６、配列番号１のアミノ酸１０５〜１５５、配列番号１のアミ
ノ酸１５６〜１９９の領域におけるペプチドが挙げられる。グリコシル化された
トリボネクチンポリペプチドに結合する抗体を産生するために（しかしグリコシ
ル化形態でも非グリコシル化形態でもない）、免疫源は好ましくは、糖ペプチド
、トリボネクチンの高度にグリコシル化された部分に渡るアミノ酸配列（例えば
、配列番号１の残基２００〜１１４０のアミノ酸配列を有するペプチド）である
。その同じ高度にグリコシル化された領域内の、より短い糖ペプチド（例えば、
８〜１５のアミノ酸長）はまた、免疫源として使用される。高度にグリコシル化
された生体分子に対する抗体を産生する方法は、当該分野で公知である（例えば
、Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、１９８０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：３６１−
３７６に記載される）。

【００５２】 （診断の方法） 変形性関節症は、ゆっくりと発達し、かつ関節痛がしばしば個人に医学処置を
求めさせる、その後期段階まで診断が困難な疾患である。変形性関節症の初期診
断、またはこの疾患を発達する素因の診断は、初期の介入が、進行した変形性関
節症の発達を防ぐか、または減少すること可能にする。本発明は、この疾患また
はそれを発達させる素因の初期の検出方法を提供する。この方法は、体液（例え
ば、血清または尿）を天然に生じるトリボネクチンのフラグメントの存在または
ＭＳＦのフラグメントの存在について試験することによる。生物学的液体中のこ
のようなペプチドの検出および定量化は、当該分野で周知である。例えば、標準
サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイは、天然に生じるトリボネクチンに対する２つ
の異なる抗体（例えば、糖ペプチドのオリゴサッカリド部分に結合する第１抗体
および糖ペプチドのペプチドコアに結合する第２抗体）を使用して行われる。あ
るいは、以下に記載される液体クロマトグラフィーおよび質量分析による標準タ
ンパク質配列決定は、生物学的サンプル内のＭＳＦフラグメントを検出するため
に使用される。コントロール値は、ネガティブな診断に関連して予め決定された
値である；あるいは、コントロールサンプルは、変形性関節症がないことが既知
の哺乳動物由来の生物学的サンプルである。３０のコントロール値またはサンプ
ルに比較された量の増加は、その哺乳動物が変形性関節症に罹患することを示す
か、または、進行中の変形性関節症の素因であることを示す。

【００５３】 （ヒト滑液由来のトリボネクチンの特徴付け） 診断的関節鏡検査および膝全体の交換を受けている患者由来の滑液のアリコー
トを収集し、そして摩擦装置でアッセイした。両方の場合において、滑液は、任
意の外科的な手順の開始前に吸引され、そして直ぐに１０，０００×ｇで、４℃
で２時間遠心分離し、細胞性細片は除去された。血液で汚染されたサンプルは廃
棄した。正常な潤滑能力を有するアリコートをプールし、そして−２０℃で保存
した。

【００５４】 （トリボネクチンの精製および単離） ヒト滑液（２００ｍｌ）を０．２２マイクロ滅菌フィルターユニット（Ｎａｌ
ｇｅｎｅ）を通じて、４℃で２日間フィルター濾過した。保持されたもの（ｒｅ
ｔｅｎｔａｔｅ）をフィルター膜から廃棄し、そして５０ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液
、ｐＨ５．５で、タンパク質分解インヒビター：１ｍＭフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ パラクロロ水銀安息香酸（ＰＣＭＢ）、
および１０ｍＭエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）を含んで元々の
滑液量まで再懸濁した。ヒアルロン酸の消化を、３７℃でストレプトミセスヒア
ルロニダーゼで、１Ｕ／ｍｌの再懸濁された滑液で行った。消化物を３００ｍｌ
の容量で設置かれたＤＥＡＥカラム（Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，ＵＫ）にロードし、ＮａＡｃ緩衝液、５０ｍＭで平
衡化し、そして１．５Ｌの同じ緩衝で洗浄した。潤滑作用を有する物質を１Ｍ
ＮａＣｌを用いてＤＥＡＥ膜から溶出した。１Ｌの洗浄液を収集し、そしてＸＭ
−１００膜（分子量カットオフ １００ｋＤａ）を備えた５００ｍｌのＡｍｉｃ
ｏｎフローセルを介して濃縮した。濃縮されたサンプルを０．１５Ｍ ＮａＣｌ
および０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む２５ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．４に対
して透析した。

【００５５】 ＤＥＡＥ結合濃縮物を、室温で２５ｍＭリン酸塩および０．１５ ＮａＣｌ緩
衝液、ｐＨ７．４で平衡化された、２５ｍｌの総容積で設置されたピーナッツ凝
集素（ＰＮＡ）アガロース親和性カラムにロードした。２３０ｎｍおよび２８０
ｎｍの吸収がバックグラウンドまで減少するまで、非結合タンパク質を同じ緩衝
液で溶出した。潤滑活性を有する物質を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓおよび０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中の０．０７Ｍの濃度の段階的な（ｓｔｅｐ−ｗｉｓｅ
）勾配で最大限に溶出した。この物質を、汚染物質としてフィブロネクチンを除
去するためにアミン基を介して、ヒトフィブロネクチンに対する（Ｚｙｍｅｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）マ
ウスモノクローナル抗体に結合されたＡｃｔｉｇｅｌ ＡＬＤアガロース（Ｓｔ
ｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｒｃａｄｉａ，ＣＡ）にロ
ードした。溶出された物質を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅで染色されたＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ（５〜１５％アクリルアミド）上で、およびＨＰＬＣによって純度
についてアッセイした。

【００５６】 タンパク質電気泳動標準は、ＧｉｂｃｏＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，
ＮＹ）から、そしてＤＮＡラダー標準は、ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｒ
ｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）からである。

【００５７】 （高圧液体クロマトグラフィー） Ｂｏｎｄｐａｋ Ｃ１８ ３．９×１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌ
ｆｏｒｄ，ＭＡ）を、４５％（ｖ／ｖ）メタノール（Ｓｉｇｍａ）および５％（
ｖ／ｖ）アセトニトリル（Ａｌｄｒｉｃｋ）ＨＰＬＣグレードを用いて、１ｍｌ
／分で、３５℃で逆相で溶出した。溶出物を、フォトダイオードアレイ検出機Ｐ
ＤＡ ９９６（Ｗａｔｅｒｓ）によってアッセイし、そしてピーク画分内の物質
を、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ソフトウエア（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して計算され
る純度プロットによって分析した。

【００５８】 （摩擦装置） 標準摩擦装置（例えば、Ｊａｙら、１９９２、Ｃｏｎｎ．Ｔｉｓｓ．Ｒｅｓ．
２８：７１−８８、またはＪａｙら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｓｔｅ
ｒ．Ｒｅｓ．４０：４１４−４１８に記載される装置）を使用して、潤滑活性を
測定した。天然のラテックスを、１．５９ｃｍ²の定常接触面積を有する研磨さ
れたガラスのリングに対して振動した。支持システムを、２つの垂直水平軸の周
りを自由に回転するためにジンバルシステム内の軸の方向にロードした。支持物
質としてのラテックスおよびガラスが選択された。なぜなら、それらは、０．０
５ｍｍのオーダーの小さな隆起の高さを有する平らな表面を提供するからである
。軟骨のようなラテックスが準拠している。ジンバルシステム内のこれらの表面
は、ほとんど完全なｃｏ−ｐｌａｎａｒｉｔｙを有する。従って、液体ウェッジ
は、産生されず、そして境界液体の薄い層のみが存在した。同調する速度（すな
わち、スライディングスピード）は、０．３５×１０⁶Ｎ／ｒｍ²の定常接触圧力
で０．３７ｍｍ／ｓｅｃであった。

【００５９】 この摩擦装置は、直線変位電圧変換器を通じて垂直の負荷軸の周りのジンバル
システムの変位を記録した。この変換器の出力電圧は、その摩擦トルクの程度に
正比例した。この信号のピークごとの増幅は、公知の摩擦トルクを有する以前の
較正と関連した。

【００６０】 試験表面を、使用前に徹底的に洗浄した。ステンレス鋼スタッドに係合された
３．８×３．８ｃｍのラテックス片を流れる蒸留脱イオン水（ＤＤＷ）で２分間
洗浄した。次いで、これを０．９％のＮａＣｌ生理食塩水（ＰＳ）の浅いバスに
入れた。このガラススライドを、ＤＤＷ中１％（ｖ／ｖ）の７×界面活性剤（Ｆ
ｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭｃＬｅａｎ，ＶＡ）溶液で１０分間擦り
、次いで、その同じ溶液中１００℃に浸させた。５分間の擦りもまた、熱い７×
溶液で行い、続いて、２〜４分間流れるＤＤＷにもとで洗浄した。

【００６１】 μを３５℃で測定し、そしてＰＳを用いてそのμの基底腺測定をその前にした
。潤滑を、ＰＳのμに対するμの減少によって示した。負のδ値は、潤滑を示し
、他方で正の値は、摩擦を示す。２００μｌのＰＳおよび後の２００μｌの試験
潤滑剤の添加に続き、ベアリング表面をその溶液が両方の面を湿潤させるに充分
密接させる。５分間の平衡化の後、ラテックスコーティングしたベアリングをそ
れが振動するときにガラス上に静止させた。ピークごとの電圧を１、３および５
分後に自動記録させた。この時点で、その表面を２分間分離し、次いでさらに５
分間のせっしょにわたって元に戻して一緒にした。最後の２回の５分間のセッシ
ョンの３および５分のμ値は、代表的に安定しており、そしてこれを記録した。

【００６２】 ヒト血清フィブロネクチンをＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｆ０８９５，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、そして摩擦装置における使用前にＰＳに対
して透析した。

【００６３】 境界潤滑剤は、表面の物理化学的特性を変更することによってその効果を奏す
る。ベアリング表面は、境界モードにおいて潤滑となるように共同の反発力を生
成しなければならない。境界潤滑剤の代表的な室温例は、グラファイト、テフロ
ン（登録商標）、および亜硫酸モリブデンである。そのような組成物は、ベアリ
ング表面の間の摩擦を減少させ、そして従ってトリボネクチンの潤滑特性を測定
するためのアッセイにおいて正のコントロールとして使用される。トリボネクチ
ンは、ラテックスのような日生物学的疎水性表面をコーティングすることによっ
て両親媒性の特性を有し得る境界潤滑剤である。トリボネクチンのオリゴサッカ
リド成分は、周囲の水性環境とネットワーク形成する。最後および最後から二番
目の糖は、滑液から精製された天然に存在するトリボネクチンから除去され、潤
滑能力が除去される。

【００６４】 ラテックス：ガラスアースロトリプソメーター（ａｒｔｈｒｏｔｒｉｐｓｏｍ
ｅｔｅｒ）は、再現性良く反復して、精製された生物学的潤滑因子を試験するた
めの迅速な方法を提供する。天然ラテックスおよび研磨ガラスは、試験ごとの物
理化学的特性の変化はないかまたはあっても殆どないベアリング表面を有する。
対照的に、研磨ガラスまたは軟骨自身のいずれかに対して並置された切断された
軟骨は、正確に制御され得ない変位を生じる。滑液によって潤滑される軟骨−軟
骨ベアリングにおいて観察されるμは、０．００５と０．０２４との間であった
。ラテックス：ガラス系におけるμの値は、認知可能により高く、そして代表的
には０．０４以下であった。ベアリング材料間のμの変動は、軟骨の８０％（ｗ
／ｗ）水含量に起因する。

【００６５】 （液体クロマトグラフィーおよび質量分析（ＬＣＭＳ）によるタンパク質配列
決定） 標準的なＬＣＭＳを、上記精製された潤滑材料のトリプシン消化で行った。潤
滑材料を含む２ｍｍ厚の５〜２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−ｒａｄ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から切り出されたバン
ドを分析した。この材料は、ＮａＮａｓｅＩＩＩおよびＯ−グリコシダーゼＤＳ
（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ；ＣＡ）によって脱グリコシル化した。脱グリコシ
ル化は、それぞれ０．１８Ｕ／ｍｌおよび０．１０Ｕ／ｍｌの活性の上記酵素を
用いて１８時間、０．５ｍｇ／ｍｌの滑液から精製されたトリボネクチンの存在
下で行った。すべての場合において、ゲルスライスを、バンドの中央を通じて切
断し、そして１６ｍｍ³のサイズであった。すべての接触表面は、慎重に５０％
（ｖ／ｖ）のアセトニトリルで洗浄した。配列データを、ＢＬＡＳＴ ＧＥＮＢ
ＡＮＫ（登録商標）検索アルゴリズムに入力し、そしてマッチを同定した。

【００６６】 （ヒト滑膜線維芽細胞の単離および培養） 正常な外観を有するヒト滑膜を、関節鏡検査を受けた３０歳の白人男性から得
た。術後１時間以内に、滑膜組織移植片を３回Ｄｕｌｂｅｃｃｏのカルシウムお
よびマグネシウムなしのリン酸緩衝化生理食塩水（ＧＩＢＣＯ）で洗浄した。２
ｍｍ³のサイズの片を、１ｍｌあたり１００Ｕのペニシリンおよび１００μｇの
ストレプトマイシンを補充し、４ｍｇ／ｍｌのＣｌｏｓｔｒｉｏｐｅｐｔｉｄａ
ｓｅ Ａ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ＣＬＳ，１２５
−２００ Ｕ／ｍｇ）を含み、０．２２ｍｍフィルター（Ｎａｌｇｅ）を通して
滅菌されたＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＧＩＢＣＯ）中に入れた、こ
の組織断片を、さらに、１００ｍｍのプラスチックペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ）で
分割し、そして５％二酸化炭素および９５％空気の湿潤雰囲気下で３７℃で２０
ｍｌの培地中で４時間インキュベートした。

【００６７】 消化物を、パスツールピペットへの吸引Ｓおよびそこからの排除によって多数
回充分に混合した。改変されたＰｕｃｋ Ｓａｌｉｎｅ Ａ（ＧＩＢＣＯ）中の
等容量の０．０５％トリプシンおよび０．０２％のＥＤＴＡを添加し、そしてイ
ンキュベーションを、さらに１時間、同じ条件下で続けた。懸濁物を、４００×
ｇで２３℃で１０分間遠心分離し、そして３回４０ｍｌのカルシウムおよびマグ
ネシウムを含まないリン酸緩衝化生理食塩水で各々洗浄した。このペレットを、
１０％仔ウシ血清（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１００Ｕのペニシ
リンおよび１００ｍｇのストレプトマイシン（１ｍｌあたり）を補充した改変Ｅ
ａｇｌｅ培地（２０ｍｌ）中に懸濁した。２ｍｌのこの最終混合物を、６０ｍｍ
プラスチックペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ）１つあたりにプレートした。滑膜線維芽
細胞を、コンフルエンスにまで増殖させ、そして細胞を採集した。ヒト皮膚線維
芽細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（ＡＴＣＣ）Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ ＣＣＤ−１０９９５Ｋ；ＡＴＣＣ，Ｍａ
ｎｎａｓｓａｓ，ＶＡ）をコントロールとして使用し、これもまた、上記手順を
用いて増殖および採取した。

【００６８】 （ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ分析） 滑膜線維芽細胞および皮膚線維芽細胞からのＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニカラ
ムおよび試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｒａｗｌｅｙ，Ｌｔｄ．，ＵＫ）によって精製
した。夾雑するゲノムＤＮＡを、ＤＮＡシュレッダーおよびＤＮａｓｅ（ＲＮａ
ｓｅなし）（Ｑｉａｇｅｎ）により除去した。第一の鎖のｃＤＮＡを、逆転写お
よび以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ増幅により合成した。
ＭＳＦ−エキソン６順向きプライマー５’−ＣＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＧＴ
ＡＧＡＴＧＡＡＧＣ−３’（配列番号１５）ａｎｄ ＭＳＦ−エキソン ６逆向
きプライマー５’−ＧＣＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＡ
Ｇ−３’（配列番号１６）。これらのプライマーは、ヒトＭＳＦ遺伝子（配列番
号２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７０１３６）のヌクレオチド番号６７４−６９
８および９５３−９２６にそれぞれ対応する。サーマルサイクル条件を、１２分
間４２℃、９５℃で１０分、続いて４３サイクルの９４℃×２０秒および５５〜
６５℃×３０〜９０秒であった。７分間の最終の伸長は７２℃であった（Ｐｅｒ
ｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。

【００６９】 （トリボネクチンの代替のＭＳＦのスプライス改変体） 潤滑ポリペプチドをヒト滑液から標準的な生化学的方法に続いてピーナツ凝集
素を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。最終の画分で
あって、唯一潤滑能を有したものは、見かけ上の分子量が２８０ｋＤａの産物を
含んでいた。２８０ｋＤａを超える分子量の成分は、観察されなかった。２８０
ｋＤａの切断バンドからのトリプシンフラグメントにおいて行われたＬＣＭＳは
、２つの異なるタンパク質の存在を示した。このタンパク質は、ＢＬＡＳＴ検索
アルゴリズムでフィブロネクチン前駆体およびＭＳＦ（ＧｅｎＢａｎｋ（ＴＭ）
登録番号Ｕ７０１３６）と適合した。 ＭＳＦの配列は、ネイティブおよび脱グ
ルコシル化の潤滑ポリペプチドの両方から同定された。従って、精製スキームを
、抗フィブロネクチンカラムで終結させ、これは、不純物としてフィブロネクチ
ンの除去を生じた（Ｃ１８分析ＨＰＬＣおよび純度プロット分析によってアッセ
イされるところ）。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上７０ｋＤａおよび１６０ｋＤａ
におけるより低分子量のバンドは、抗フィブロネクチンカラムから溶出する精製
したトリボネクチン調製物からなくなっていた。摩擦装置においてアッセイされ
た精製したトリボネクチンは、全体の滑液のものに類似する境界潤滑活性をしめ
すことが分かった（表５）。対照的に、精製した血清フィブロネクチンは、摩擦
を上昇させ、このことは、滑液潤滑能が精製されたトリボネクチンによって媒介
されたことを示す。

【００７０】

【表３】 ^*ＰＳに中２５０μｇ／ｍｌの濃度で試験した。^** 生理学的生理食塩水。 †死後のヒト滑液 さらに、トリプシン処理フラグメントのＬＣＭＳにより、エキソン６〜９（両
端服務）の部分が同定された。精製されたトリボネクチンは、ピーナツ凝集素と
反応した。このことは、その精製によるβ（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃオリ
ゴサッカリドの存在を示す。電気泳動の移動度における増加が、ＮａＮａｓｅＩ
ＩＩおよびＯ−グリコシダーゼＤＳでの消化後に観察された。このことは、この
精製されたトリボネクチンが高度にＯ結合型オリゴサッカリドを介してグリコシ
ル化されていることを示す。滑液から精製された脱グリコシル化したトリボネク
チンの見かけ上の分子量は１２０ｋＤａであった。

【００７１】 ＲＴ−ＰＣＲ分析を、ＭＳＦのＮ末端およびエキソン６をコードするヌクレオ
チド配列に特異的なプライマーを用いて完了させた。ヒト滑膜線維芽細胞ＲＮＡ
を用いたＲＴ−ＰＣＲは、２８０ｂｐ産物を生じ、これは設計されたプライマー
の間の距離であった。逆転写酵素なしの類似の実験では、この産物は生じなかっ
た。このことは、そのＲＮＡがゲノムＤＮＡを含まないことを示す。皮膚線維芽
細胞からの精製されたＲＮＡは、この同じプライマーを用いても何ら産物を生じ
なかった。

【００７２】 ＭＳＦは、ヒト単球からまず単離された；ＭＳＦの２５ｋＤａフラグメントは
、巨核球の発生を刺激することが見出された。ＭＳＦ前駆体タンパク質は、１４
０４残基のサイズであり、そして１２のエキソンから構成される。エキソン６は
、９４０残基の長さである中心に位置するムチンをコードするようである。エキ
ソン６は、ビトロネクチンに対して相補性を有し、エキソン２および３は、ソマ
トスタチンＢ様領域に対して相補的であるようであり、そしてエキソン８、９は
、ビトロネクチンにおけるヘモペキシン様領域に類似する。ヘモペキシンは、ヒ
アルロネートと相互作用する血清ヘムスカベンジタンパク質である。

【００７３】 滑液から精製されたトリボネクチンおよび関節軟骨から精製された関節軟骨の
表面帯タンパク質（ＳＺＰ）は、ＭＳＦとの配列同一性を共有するが、それらの
見かけ上の分子量およびアミノ酸配列において異なる。

【００７４】 （実施例１：ヒト滑膜線維芽細胞によるＭＳＦ遺伝子発現） 天然に存在するトリボネクチンは、ＭＳＦをコードする遺伝子からのヒト滑膜
線維芽細胞によって発現されることを見出した。すべてではないがいくつかのＭ
ＳＦ遺伝子のエキソンは、トリボネクチン遺伝子産物において表現される。例え
ば、トリボネクチンは、ＭＳＦ遺伝子のエキソン６−９によってコードされる配
列を含むが、天然に存在するＭＳＦ遺伝子の少なくとも１つのエキソンによって
コードされる配列を欠如する。

【００７５】 ＭＳＦ遺伝子発現を以下のように評価した。正常の潤滑能力を有する、プール
されたヒト滑液精製されたトリボネクチンの２４０ｋＤａの見かけ上の分子量バ
ンドからのゲルスライスをトリプシンで消化した。トリプシン処理したフラグメ
ントのＮ末端配列決定を、液体クロマトグラフィー質量分析によって行い、そし
て結果を、ＧｅｎＢａｎｋ^TMにおける公知配列と比較した。Ｏ−グリコシダーゼ
ＤＳおよびＮａＮａｓｅＩＩＩを有する精製されたトリボネクチンの消化を用い
て、コアタンパク質の分子量を示した。潤滑能力を、研磨ガラスのリングに対し
て、天然のラテックスを振動させる標準的な摩擦装置を用いてアッセイした。

【００７６】 ２つの以前に同定されたタンパク質種は、ヒト滑液の最後の潤滑画分に存在し
た。フィブロネクチン前駆体（ＦＮ）および巨核球刺激因子（ＭＳＦ）のトリプ
シン処理フラグメントを、両方とも同定した。１００％マッチ（Ｅ値は０．３１
〜０．０４７の範囲である）が、エキソン６〜９について特異的なＭＳＦ配列を
用いて観察された。ＭＳＦは、ビトロネクチンに類似する多重機能ドメインを有
するサイズが１１０４アミノ酸である。このトリボネクチンは、摩擦係数（ｎ）
を、０．１４２から０．０３６へと減少させたが、他方、精製された血清フィブ
ロネクチンは、ｎを０．１３６から０．１８１へと上昇させた。配列番号１のア
ミノ酸位２１４−２２２および３００−３０９に対応する順向きおよび逆向きの
ＲＴ−ＰＣＲプライマーを用いて、インビトロで増殖させたヒトの滑膜線維芽細
胞から精製されたｍＲＮＡを検査した。２８０ｂｐ遺伝子産物が予測されたアミ
ノ酸配列と一致していることが観察された。本明細書において記載されるデータ
は、天然に存在するトリボネクチンが、ＭＳＦ遺伝子の発現を介して、滑膜繊維
が細胞から分泌されることを示す。

【００７７】 以下に記載される方法を使用して、滑液における潤滑成分を特徴付けた。

【００７８】 （ヒト滑液収集物） 診断関節鏡検査を受ける患者からの滑液および綜合膝置換物のアリコートを集
め、そしてその摩擦装置においてアッセイした。両方の場合において、滑液を、
任意の手術手順の開始の前に吸引し、そして直ぐに２時間４℃で１０，０００×
ｇで遠心分離して、細胞砕片を除去した。血液を肉眼で見て夾雑するサンプルを
捨てた。正常な潤滑能力を有するアリコートをプールし、そして−２０℃で格納
した。

【００７９】 （ヒトトリボネクチンの精製および単離） ヒト滑液２００ｍｌを、０．２２ｎｍの滅菌フィルターユニット（Ｎａｌｇｅ
ｎｅ）を通して４℃で２日にわたって濾過した。保持物をフィルターメンブレン
から掻き取り、そして５０ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液、ｐＨ５．５を用いて再懸濁し
てもとの滑液容量とした。その再懸濁緩衝液は、タンパク質加水分解インヒビタ
ー：１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＰＣＭＢおよび１０ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ。
ヒアルロン酸の消化を、１Ｕ／ｍｌの再懸濁した滑液のストレプトマイセスヒア
ルロニダーゼによって３７℃で行った。消化物を、３００ｍｌの設置した容量の
ＤＥＡＥカラム（Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｍａｉｄｓｔ
ｏｎｅ、ＵＫ）上にのせ、ＮａＡｃ緩衝液、５０ｍＭに平衡化し、そして１．５
Ｌの同じ緩衝液で洗浄した。所望の材料をＤＥＡＥマトリクスから、１Ｍ Ｎａ
Ｃｌを用いて溶出した。１Ｌの洗浄物を収集し、そしてＸＭ−１００メンブレン
（ｍｗカットオフ＝１００ｋＤａ）を有する５００ｍｌのＡｍｉｃｏｎフローセ
ルを介して濃縮した。濃縮したサンプルを２５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４（
０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含む）に対して透析した
。

【００８０】 このＤＥＡＥ結合濃縮物を、２５ｍｌの設置ベッド容量を有するピーナツ凝集
素（ＰＮＡ）アガロースアフィニティーカラムにのせ、室温で２５ｍＭホスフェ
ートおよび０．１５ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４と平衡化した。結合していない
タンパク質を、同じ緩衝液で、２３０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度がバック
グラウンドにまで下がるまで溶出した。所望の材料をａ−ラクトースの段階勾配
の存在下で２５ｍＭ Ｔｒｉｓおよび０．１５Ｍ ＮａＣｌ濃度でｐＨ７．４に
て最大に溶出された。予備精製されたトリボネクチンを、アミン結合を介してヒ
トフィブロネクチンに対するマウスモノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）．）に結合
されたＡｃｔｉｇｅｌ ＡＬＤ アガロース（Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｅ
ｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｒｃａｄｉａ，ＣＡ）にのせた。溶出された材料をクー
マシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ ５−１５％およびＨＰＬＣによって
アッセイした。

【００８１】 （高圧液体クロマトグラフィー） μＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ １８ ３．９×１５０ ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ
，Ｍｉｌｏｒｄ，ＭＡ）を、４５％（ｖ／ｖ）メタノール（Ｓｉｇｍａ）および
５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ）ＨＰＬＣ等級を用いた逆相中
で１分間／分で３５℃で溶出した。溶離物を、光ダイオードアレイ検出器ＰＤＡ
９９６（Ｗａｔｅｒｓ）によりアッセイし、そしてＭｉｌｌｅｎｉｕｍ３２ソフ
トウェア（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて算出した精製プロットによってピークを分析
した。

【００８２】 （摩擦装置） 標準的な摩擦装置を用いて、上記のように潤滑活性を測定した。

【００８３】 μを、３５℃で測定した。その前に、μの基底線測定をＰＳを用いて行った。
潤滑を、ＰＳのμに対する減少によって表した。負のΔμの値は、潤滑を示すが
、他方、正の値は摩擦を表す。２００μｌのＰＳの添加および後の２００μｌの
試験潤滑剤の添加に続いて、その溶液が両方の表面を湿らせるように十分ベアリ
ング表面を近接させた。平衡化のための５分の後、ラテックスコーティングされ
たベアリングを、それが振動しているときにガラス上にとどまらせた。ピークご
との電圧を、１、３および５分後に自動的に記録させた。この時点で、その表面
を２分間分離し、次いで別の５分間のセッションのために戻して一緒にした。最
後の５分間のセッションの３分および５分のμ値は代表的に安定化し、そしてこ
れを記録した。

【００８４】 （ＬＣＭＳ） トリプシン処理消化物のＬＣＭＳを、上記のように行った。バンドを、２ｍｍ
厚の５−２０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）からさらなる分析のために切り出した。脱
グルコシル化をＮａＮａｓｅ ＩＩＩおよびＯ−グルコシダーゼＤＳ（Ｇｌｙｋ
ｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）（それぞれ０．１７ Ｕ／ｍｌおよび０．１０ Ｕ／
ｍｌの濃度で、０．５ｍｇ／ｍｌタンパク質の存在下で６時間）を用いて行った
。全ての場合において、ゲルスライスを、バンドの中心を通り、１６ｍｍ³のサ
イズとなるように切り出した。すべての接触表面を、注意深く５０％（ｖ／ｖ）
アセトニトリルで洗った。配列データをＢＬＡＳＴ ＧｅｎＢａｎｋ^TM検索アル
ゴリズムに入力し、そしてマッチを同定した。

【００８５】 （ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ分析） 滑膜線維芽細胞および皮膚線維芽細胞からのＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニカラ
ムおよび試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｒａｗｌｅｙ，Ｌｔｄ．，ＵＫ）によって精製
した。夾雑するゲノムＤＮＡは、ＤＮＡシュレッダーおよびＤＮａｓｅ（ＲＮａ
ｓｅなし）（Ｑｉａｇｅｎ）．によって除去される。第一の鎖ｃＤＮＡを、以下
のオリゴヌクレオチドプライマー（ＭＳＦ特異的プライマーの相対位置は図１に
示される）を用いて逆転写およびＰＣＲ増幅によって合成した：ＭＳＦ−エキソ
ン ６順向きプライマー５’−ＣＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡ
ＡＧＣ−３’（配列番号１５）およびＭＳＦ−エキソン６逆向きプライマー５’
−ＧＣＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＡＧ−３’（配列番
号１６）。これらのプライマーは、ＧＥＮＢＡＮＫ^TM登録番号Ｕ７０１３６（ヒ
トＭＳＦ）においてそれぞれ塩基対番号位置６７４−６９８および９５３−９２
６に対応する。サーマルサイクリング条件は、１２分で４２℃、９５℃で１０分
に続いて４３サイクルの９４℃×２０秒および５５〜６５℃×３０〜９０秒であ
った。７分間の最終の伸長を、７２℃であった（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。

【００８６】 （種々の試薬） ヒト血清フィブロネクチンを、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｆ０８９５，
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、そしてＰＳに対して透析し、その後、摩
擦装置において使用した。タンパク質電気泳動の標準物を、ＧｉｂｃｏＢＲＬ（
Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から購入し、そしてＤＮＡラダー標準物を、
ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）から購入した。

【００８７】 ヒト滑液からのトリボネクチンを精製した。唯一潤滑能力を有した最終画分は
、主に、２８０ｋＤａの見かけ上の分子量を有する産物を含んだ。この画分はま
た、マイナーな分子量成分を含んでおり、これは、最終の抗体ベースの精製工程
で除去された。２８０ｋＤａを超える分子量を有する成分は、観察されなかった
。２８０ｋＤａから切り出されたバンドからのトリプシン処理フラグメントにお
いて実施されたＬＣＭＳは、２つの異なるタンパク質の存在を示し、これは、フ
ィブロネクチン前駆体およびＭＳＦに対するＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムに適合
した（ＧＥＮＢＡＮＫ^TM登録番号Ｕ７０１３６）。ＭＳＦの配列は、ネイティブ
および脱グルコシル化トリボネクチンの両方から同定された。従って、精製スキ
ームを、抗フィブロネクチンカラムによって終結させ、そしてＣ１８分析ＨＰＬ
Ｃおよび精製プロット分析において不純物としてフィブロネクチンのおおよその
除去を達成した。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける７０ｋＤａおよび１６０ｋ
Ｄａにおけるマイナーな低分子量バンドは、抗フィブロネクチンカラムから溶出
された精製調製物から除かれていた。摩擦装置においてアッセイされた精製され
たトリボネクチンは、滑液の全体のものに類似する境界潤滑活性を示すことが見
出された（表６）。

【００８８】

【表４】 ^*生理食塩水 †ＰＳにおいて２５０μｇ／ｍｌの濃度で試験した。

【００８９】 対照的に、精製された血清フィブロネクチンは、摩擦を上昇させた。このここ
とは、滑液潤滑能力がトリボネクチンによって媒介されることを示した。

【００９０】 トリプシン処理フラグメントのＬＣＭＳは、ＭＳＦのエキソン６〜９（両端含
む）の部分を正確に同定した。エキソン６の初めおよび終わりで核酸配列によっ
てコードされたフラグメントが見出された。トリボネクチンは、ＰＮＡと反応し
た。このことは、その精製による、（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃオリゴサッ
カリドの存在を示すさらに、ＮａＮａｓｅ ＩＩＩおよびＯ−グルコシダーゼＤ
Ｓでの消化後に電気泳動移動度における非常に有意な増加が存在した。このこと
は、トリボネクチンがＯ結合型オリゴサッカリドを介してグリコシル化されるこ
とを示す。脱グルコシル化トリボネクチンの見かけ上の分子量は１２０ｋＤａで
あった。

【００９１】 ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＭＳＦのエキソン６のＮ末端をコードするヌクレオチド
配列について特異的なプライマーを用いて完了させた。ヒト滑膜線維芽細胞ＲＮ
Ａを用いたＲＴ−ＰＣＲは、２８０ｂｐの産物を生成した。これは、設計された
プライマーの間の推定距離である。逆転写酵素のない類似の実験は、この産物を
生成しなかった。このことは、このＲＮＡは、ゲノムＤＮＡを含まないことを示
した。皮膚線維芽細胞から精製されたＲＮＡは、同じプライマーを用いて何も産
物を生成しなかった。

【００９２】 本明細書において記載されたデータは、ＭＳＦ遺伝子のエキソンが選択スプラ
イシングされて、滑膜関節において潤滑ポリペプチドを発現することを示す。滑
膜線維芽細胞は、関節におけるそのようなトリボネクチンの供給源のひとつであ
る。本明細書においてきさいされた単離された天然に存在するトリボネクチン（
Ｍｒ−２８０ｋＤａ）およびＳＺＰ（Ｍｒ−３４５ｋＤａ）は異なる分子である
。なぜなら、６５ｋＤａだけ見かけ上の分子量が異なるからである。ＭＳＦは、
滑膜腔に集中する２つの独立した細胞株によってＭＳＦエキソンの異なる発現に
よって両方の分子についての前駆体であることが可能である。トリプシン処理さ
れた消化物の反復ＬＣＭＳ配列決定は、ＭＳＦにおけるエキソン６から９に囲ま
れたエキソンのいずれも同定しなかった。仔ウシから精製された天然に存在する
トリボネクチンは、ヒト供給源から精製されたトリボネクチンと同じ分子量を有
することが見出された。

【００９３】 境界潤滑剤は、表面の物理化学的特性を変更することによってこれらの効果を
奏する。ベアリング表面は、境界モードで潤滑されるために、相互反発を生成し
なければならない。通常の室温（環境）の例は、グラファイト、テフロン（登録
商標）および硫化モリブデンである。トリボネクチンは、ラテックスのような非
生物学的疎水性表面をコーティングすることによって両親媒性特性を有するよう
である。広汎なグリコシル化は、周囲の水性環境でネットワークにとって重要で
ある。最後および最後から二番目の糖が除去されるとき、潤滑能力が消失した。
エキソン９によって発現されるタンパク質を介すＳＺＰまたはトリボネクチンに
対するヒアルロネートの結合は、滑液における役割をヒアルロネートが果たす機
構を支持する。ヒアルロネートポリマーは、多くのＳＺＰまたはトリボネクチン
の分子を、タンデムで側方に結合するように機能し得る。従って、せん断ストレ
スを分配し、そして潤滑分子を安定化させる。

【００９４】 ＭＳＦ前駆体（トリボネクチンのような選択スプライシング遺伝子産物）の主
な構造は、ＭＧ２、スタテリン（ｓｔａｔｈｅｒｉｎｅ）およびプロリンリッチ
糖タンパク質のもの（これは、唾液および潤滑歯科ベアリングにおいて見出され
る）とは異なる。ＭＧ２のみがこのラテックス：ガラスベアリングにおいて試験
され、そしてトリボネクチンと同程度に有効に潤滑させることが見出された。糖
タンパク質の両方は、同じＯ結合型（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｚ部分を共有
する。これらのデータは、Ｏ結合型（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ部分は境界
潤滑活性にとって重要であることを示す。

【００９５】 酵素消化実験は、滑液によって提供される境界潤滑は、トリプシンにとって非
常に感受性であることを示す。これらの実験は、ホスホリパーゼによる潤滑能力
の除去（極少量のトリプシン様プロテアーゼが夾雑する）がプロテアーゼインヒ
ビターのロイペプチンおよびアプロチニンとともに同時インキュベーションする
ことによって除去され得る。リジンおよびアルギニンは、徹底的にグリコシル化
され、そして従ってタンパク質分解を妨害し得るトリボネクチンの同じ領域であ
るとはいえトリプシン感受性の観察を支持するエキソン６産物のそれぞれ１３．
５％および１．３％を含む。トリプシンまたはエラスターゼを詳述するさらにマ
イナーな炎症状態は、天然に存在するトリボネクチンの潤滑能力に対して有害効
果を有するようである。非潤滑性軟骨ベアリングは、変形性関節症を開始し得る
未熟な摩損量を経験し得る。そのような条件は、本明細書に記載される潤滑ポリ
ペプチド、すなわちトリボネクチンを用いて処理される。

【００９６】 （実施例２：染色体１ｑ２５に局在されるヒト滑膜線維芽細胞および関節軟骨
細胞によるトリボネクチンおよびＳＺＰ：ＭＳＦ産物の遺伝子発現の相同性） トリボネクチンの発現を初代ヒト滑膜線維芽細胞および初代関節軟骨において
評価した。ＲＮＡを、変性関節疾患のない被検体から得られた組織移植片からイ
ンビトロで増殖したヒト滑膜線維芽細胞および関節軟骨細胞から精製した。ＲＴ
−ＰＣＲをＭＳＦ遺伝子のエキソン６ならびにエキソン６のＮ末端およびＣ末端
の両方における個々のエキソンを発現する中心のムチンにわたる多重相補的プラ
イマー対とともに用いた。エキソン２、４および５は、滑膜線維芽細胞および関
節軟骨細胞によって変動して発現されるようである。ＭＳＦ遺伝子の種々のエキ
ソンから発現される、潤滑ポリペプチドであるトリボネクチンは、軟骨細胞およ
び滑膜線維芽細胞の両方をインビトロで発現する。トリボネクチンおよび関連プ
ロテオグリカンである表面帯タンパク質（ＳＺＰ）の両方は、類似の（ではある
が同一ではない）一時構造を共有する。トリボネクチンおよびＳＺＰはまた、Ｏ
結合型オリゴサッカリドと翻訳後改変において異なり：トリボネクチンは、Ｏ結
合型オリゴサッカリドを含むが、他方、そのような翻訳後改変は、ＳＺＰには検
出されなかった。オリゴサッカリドは、トリボネクチンにおいて優勢である；制
限された量のコンドロイチンおよびケラチン硫酸がＳＺＰにおいて見出された。
ほとんどのＭＳＦエキソンがトリボネクチンの発現に関与していることから、ビ
トロネクチンに対する強力な相同性が持続する。ヒトゲノムＢＡＣライブラリー
のエキソン６について相補的なｃＤＮＡプライマー対を使用したスクリーニング
は、２つのクローンを同定した。両方のクローンは、染色体１ｑ２５について、
インサイチュハイブリダイゼーションによって相補的であった。この位置は、屈
指（ｃａｍｐｔｏｄａｃｔｙｌ）−関節症−心膜炎症候群（ＣＡＰ）に、遺伝子
マッピングによって相関付けられた。大きな関節の関節症であるＣＡＰは、滑膜
によって提供される無効な境界潤滑と関連している。従って、本明細書において
記載されるトリボネクチンは、ＣＡＰを予防および／または処置するに有用であ
る。

【００９７】 以下に記載されるデータは、以下の課題を検討する：１）１２のＭＳＦのエキ
ソンのうちどれが、滑膜線維芽細胞によって発現され、そしておそらく、滑膜の
腔へのトリボネクチン分泌を生じるか。２）どのようにこれが、軟骨の表面にＳ
ＺＰ分泌を生じる関節軟骨細胞によるＭＳＦの発現とは異なるか、３）トリボネ
クチンおよびＳＺＰが同じ一次構造を共有するかどうか、４）トリボネクチンは
、ＳＺＰの特徴であるコンドロイチン硫酸で翻訳後かいへんされるかどうか、な
らびに５）単離されたエキソン６産物が境界潤滑能力をゆうするかどうか。

【００９８】 ヒト滑液を上記のように処理した。収集し、そしてトリボネクチンを上記の方
法を用いてヒト組織から精製および単離した。潤滑活性を標準的な摩擦装置を用
いて測定した。

【００９９】 （コンドロイチン−６−硫酸の免疫検出） モノクローナル抗体Ｍ６２１Ｃ（ＩＣＮ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）を用いてコン
ドロイチン−６−硫酸の存在を検出した。標準的なドットブロット技術およびウ
ェスタンブロット技術を用いた。

【０１００】 （キモトリプシンでのトリボネクチンの消化） ヒト滑液のＴＬＣＫ処理したキモトリプシン０．１ＢＴＥＥ Ｕ／ｍｌを、３
７℃で１時間インキュエートした。消化後すぐに潤滑活性を、摩擦装置において
アッセイした。さらなる消化を、市販のＴＬＣＫ処置がトリプシンを夾雑して不
完全に不活化した場合において、同じ方法で、ただし１０μｇのロイペプチンお
よび５μｇ／ｍｌのアプロチニンの存在下で行なった。

【０１０１】 （ヒト関節軟骨細胞の単離および培養） ヒト滑膜線維芽細胞を上記のように単離することに加えて、ヒト軟骨細胞を単
離した。ヒトの膝関節の大腿部の関節丘および頚骨平坦部（ｐｌａｔｅａｕ）か
ら軟骨を解剖によりドナー（関節疾患の既知の履歴のない）または組織銀行から
の健常器官ドナーから入手した。軟骨スライスを、２−３ｍｍ³の片に切断し、
ＤＭＥＭ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ ＭＡＢ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗａｌｋｅ
ｒｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で洗浄し、そしてトリプシン１０％（ｖ／ｖ）で３７℃で
水浴中で１５分間処理した。この組織をＤＭＥＭ、５％ＦＢＳ，ペニシリン−ス
トレプトマイシン−フンジゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）および２ｍｇ／ｍｌＣ．
ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓコラゲナーゼＩＶ型（Ｓｉｇｍａ）へと移し、そしてこ
れを旋回シェーカー上で一晩消化した。この細胞を３回ＤＭＥＭで洗浄し、そし
て５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。

【０１０２】 （ヒト単球の培養） 懸濁物中のヒト単球ＣＲＬ−９８５５をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。
細胞を、遠心分離により濃縮し、そして次いでＴ７５フラスコに再懸濁して、熱
非働化していない１０％仔ウシ血清（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、
０．０３ｍＭチミジン、０．１ｍＭヒポキサンチンおよび０．０５ｍＭ２−メル
イカプトエタノールを補充したＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地を用いて
０．２×１０⁶／ｍｌと１．０×１０⁶／ｍｌとの間に濃縮した。単球が増幅する
につれ、その培養物は、上記の濃度範囲を維持するように拡張した。

【０１０３】 （ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲ分析） ヒト滑膜および関節の軟骨細胞および単球からのＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニ
カラムおよび試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって精製した
。夾雑するゲノムＤＮＡを、ＤＮＡシュレッダーおよびＤＮａｓｅ（Ｒｎａｓｅ
なし）（Ｑｉａｇｅｎ）により除去した。相補的なＤＮＡ合成を、逆転写酵素に
よるヘキサマープライマーの伸長のために２５℃で１０分間、および４２℃で１
２分間のｃＤＮＡの合成および９５℃で１０分間のＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体のＡ
ｍｐｌｉＴａｑ／変性の活性化のためインキュベートすることによって行なった
。サーマルサイクリング条件は、４３サイクルの９４℃、２０秒（変性のため）
および６２℃、６０秒および７２℃で７分間の最終の伸長であった（Ｐｅｒｋｉ
ｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ産物を、臭化エチジウムにより染色した、３％ ＮｕＳｉｅｖｅ Ｇ
ＴＧ アガロース（ＦＭＣ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）ゲル電気泳動により分析
した。推定されるＲＴ−ＰＣＲ産物サイズに対応しないバンドを、切り出し、そ
してアガロースから抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。

【０１０４】 （ＢＡＣクローンライブラリースクリーニング） ヒトゲノムを含むＥ．ｃｏｌｉ ＢＡＣライブラリーを、ＭＳＦエキソン６に
対して相補的なｃＤＮＡプライマー対を用いてＰＣＲによりスクリーニングした
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ
）：配列番号２の６７４−６９８および９５３−９２６の塩基対位置番号に対し
て相補的な順向き５’−ＣＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＧＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣ
−３’（配列番号１５）および逆向きプライマー５’−ＧＣＧＧＡＡＧＴＡＧＴ
ＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＡＧ−３’（配列番号１６）。候補となるＥ．
ｃｏｌｉクローンを、１２．５ｍｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天
中で３７℃で１６時間増殖した。ゲノムＤＮＡのない大きな構築物ＤＮＡを、ア
ニオン交換およびエキソヌクレアーゼ消化によって精製した（Ｑｉａｇｅｎ Ｌ
ａｒｇｅ−ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｋｉｔ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）。

【０１０５】 （ＢＡＣクローンＤＮＡおよび染色体のインサイチュハイブリダイゼーション
） 中期染色体を、樹立されたプロトコルに従って正常な個体からの短期リンパ球
培養物から調製した。陽性のクローンからの２μｇのＢＡＣ ＤＮＡを、製造者
により供給されたプロトコルに従ってニック翻訳反応においてＢｉｏＮｉｃｋ標
識キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＭＤ）を用い、ビオチン１４
−ｄＡＴＰを用いて標識した。ニック翻訳後、反応産物を、Ｇ５０カラムにおい
て精製した。１００ｎｇの標識されたＤＮＡおよび２０μｇのｃｏｔ１ ＤＮＡ
をエタノールを用いて共沈した。そのＤＮＡを遠心分離により回収し、そして２
０μｌのハイブリダイゼーション溶液（Ｈｙｂｒｉｓｏｌ ｖｉｉ，Ｏｎｃｏｒ
）中に溶解した。プローブハイブリダイゼーション、洗浄、顕微鏡およびプロー
ブのマッピングを標準的な手順に従って行なった。

【０１０６】 （キモトリプシンでのトリボネクチンの消化および潤滑活性についてのアッセ
イ） トリボネクチンを、プールされたヒト滑液から、Δμ＜−０．０６であると規
定される正常な潤滑活性を有する精製し、そして２８０ｋＤａの見かけ上の分子
量を有した。抗フィブロネクチン工程を用いて精製を終結させることを行なって
、夾雑バンドを除去した。この工程はまた、＜６°へと純度角度を減少させた。
２５０μｇ／ｍｌの濃度でのトリボネクチンはラテックス：ガラスベアリングを
変性関節疾患なしに被検体からの死後滑液と同様に有効に潤滑にさせた（表７）
。

【０１０７】

【表５】 平均±ＳＤ †ＰＳ中で２５０μｇ／ｍｌの濃度で試験した ‡生理食塩水^* 死後ヒト滑液 §ロイペプチンおよびアプロチニンの存在下でＴＬＣＫ処置されたキモトリプシ
ンで消化したＨＳＦ ＴＬＣＫ処理されたキモトリプシンでの酵素消化を行なって、その単離された
エキソン５タンパク質産物が潤滑活性を有するかどうかを判定した。なぜなら、
このドメインは、芳香族アミノ酸を有していないからである。得られた消化物は
、μを、生理食塩水コントロールの値μ＝０．１０７から０．１３０へと上昇さ
せた。ロイペプチン／アプロチニンの存在下での類似の消化は、潤滑活性を実証
しないままであった（Δμ＝＋０．０２）。

【０１０８】 （コンドロイチン−６−硫酸の免疫検出） モノクローナル抗体Ｍ６２１ Ｃ を用いてニトロセルロースに移されたトリ
ボネクチンを検査した。もとのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける２８０ｋＤａバンドに
対応する反応は観察されなかった。これは、トリボネクチンがコンドロイチン−
６−硫酸を含まないことを示す。

【０１０９】 （滑膜線維芽細胞および関節軟骨細胞のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析） 軟骨細胞および滑膜線維芽細胞のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを表８において例示
されるプライマーを用いて行なった。推定されるよりも少ない他のものに加えて
推定されるサイズのＲＴ−ＰＣＲ産物が、両方の細胞株について観察された。エ
キソン６のＣ末端からエキソン１２のＮ末端までにわたるプライマー対が７６９
ｂｐであることが観察された。これは、両方の細胞株について推定される長さで
ある。同様に、エキソン６からエキソン１１までの同じ位置にわたるプライマー
対は、６５４ｂｐの推定されるＲＴ−ＰＣＲ産物を生産した。エキソン５および
６のプライマー対は、両方の細胞株について２７８ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ推定産物
を生成した。

【０１１０】

【表６】 塩基対位置番号は、ＧＥＮＢＡＮＫ^TMにおいて登録番号Ｕ ７０１３６に対応
する

【０１１１】

【表７】 塩基対位置番号は、ＧＥＮＢＡＮＫ^TMにおいて登録番号Ｕ ７０１３６に対応
する。

【０１１２】 エキソン１からエキソン６までにわたるプライマー対は、７５６ｂｐの推定産
物サイズを単一に生成しなかった。３つのより小さなサイズの（３５０、４５０
および４９０ｂｐ）のバンドの代わりに、両方の細胞株について観察された。エ
キソン２からエキソン６Ｎ末端にわたるプライマー対は、両方の細胞株について
ほぼ４２０ｂｐのサイズの産物を生成し、そしてこれはその推定サイズより短い
２７２ｂｐ（６９２ｂｐ−４２０ｂｐ）であった。推定されたＲＴ−ＰＣＲ ６
９２ｂｐ産物は、軟骨細胞についてわずかに観察され、滑膜線維芽細胞について
はそれほどではなかった。エキソン２から６のプライマー対４２０ｂｐ産物を切
り出し、そして配列決定し、これは、エキソン５およびエキソン４のほとんど（
最初の２つのＮ末端アミノ酸である配列番号１のＡｌａ¹⁰⁵およびＬｅｕ¹⁰⁶を除
く）がないことを明らかにした。エキソン１〜６のプライマー対からの４９０お
よび４５０のＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定によって、同じ欠失が同定された。エ
キソン１から６プライマー対からのより小さな３５０ｂｐの産物の配列決定によ
って、Ｎ末端Ｑ²⁵をのぞいてエキソン２に加えてこれらと同じ欠失を明らかにし
た。エキソン４および６のプライマー対は、両方の細胞株について４４９ｂｐの
推定されたＲＴ−ＰＣＲ産物およびより小さな３４０ｂｐの産物を生成した。こ
の３４０ｂｐ産物の配列決定は、Ｎ末端のＥ¹⁵⁶を除きエキソン５の欠失が明ら
かにした。

【０１１３】 選択スプライシングは、滑膜線維芽細胞および軟骨細胞の両方からの４つの異
なる表現型のＭＳＦアイソフォームを生成することを担うことが見出された（図
２Ａおよび２Ｂ）。

【０１１４】 表現型Ｖ０はすべての１２のエキソンからなり、Ｖ１はエキソン５を欠失し、
Ｖ２は、エキソン５およびエキソン４のほとんどを欠失し、そしてＶ３は、エキ
ソン５およびエキソン４および２のほとんどを欠失する。さらに別のアイソフォ
ームは、ＭＳＦエキソン１および６−１２（エキソン５を欠失する）によってコ
ードされるアミノ酸からなるポリペプチドである。これは、おそらく、最も小さ
な天然に存在するトリボネクチンである。各アイソフォームは、潤滑性ドメイン
エキソン６を含む。エキソン１によってコードされるドメインは、トリボネクチ
ンの疎水性表面様軟骨に結合することを媒介することにおいて役割を果たす。

【０１１５】 （単球ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析） ＭＳＦエキソン６に相補的なプライマー対（表９）を使用して、生成された単
球ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲは、任意の産物を生成しなかった、エキソン１〜
３にわたるプリマー対が、２５０ｂｐ（その予測される大きさ）のＰＣＲ産物を
産生した。エキソン１〜４にわたる別のプライマー対は、３１２ｂｐの予測され
た大きさより小さいおよそ１３０ｂｐであるＰＣＲ産物を産生した。エキソン２
〜５にわたるさらに別のプライマー対は、任意のＰＣＲ産物を生成せず、エキソ
ン５は発現されないことを示した。これらのデータは、単球がエキソン１〜３、
１〜４を不定に発現し、そしてエキソン６を発現しないことを示したようである
。エキソン１における正方向プライマー配列は、単球、滑膜（ｓｙｎｏｖｉａｌ
）線維芽細胞および軟骨細胞を含む上記のＲＴ−ＰＣＲ実験の全てに共通した。

【０１１６】 （ＢＡＣクローンＤＮＡおよび染色体のインサイチュハイブリダイゼーション
） 上記のＭＳＦエキソン６ｃＤＮＡプライマー対を用いたヒトゲノムＢＡＣクロ
ーンライブラリーのスクリーニングが、２つの候補クローンを生じた。ＢＡＣク
ローン３３０および２８５が、ｑ２５領域（ＤＡＰＩバンド）の染色体１にハイ
ブリダイズした。染色体１に対する局在を確認するために、中期染色体を、染色
体１特異的動原体プローブ（ＶＹＳＩＳ）と共に、ＢＡＣプローブにハイブリダ
イズした。動原体ならびにＢＡＣプローブの両方が、染色体１にハイブリダイズ
した。同じスライドの引き続くＧバンドが、ｑ２５の局在を確認した。

【０１１７】 インビトロで増殖した滑膜線維芽細胞は、ＭＳＦエキソン２，４または５、あ
るいはそれらの組み合わせのいずれかを代替でスプライスした（ｓｐｌｉｃｅ
ｏｕｔ）。エキソン４の場合、発現は、そのエキソンの最初の２つのコドン（Ａ
ｌａ¹⁰⁵およびＬｅｕ¹⁰⁶）後で停止した。残基Ｅ¹⁵⁶を除く、エキソン５のない
同位体およびＱ²⁵を除くエキソン２のない同位体もまた存在する。３つのＲＴ−
ＰＣＲ産物が、表現型Ｖ１〜３に対応するようなエキソン１〜６プライマー対と
共に存在した。しかし、エキソン２〜６プライマー対に対する期待されたＲＴ−
ＰＣＲ６９２ｂｐ産物を観察し、これらのエキソンの各々を含む同位体Ｖ０もま
た存在することを示した。トリボネクチンの４または５の異なる表現型同位体は
、滑膜線維芽細胞により発現されるようである。軟骨細胞は、この表現型の発現
を共有する。両方の細胞株に対する代替のスプライス部位の概要を、図３におい
て例示する。軟骨細胞について、６９２ｂｐエキソン２〜６プライマー産物およ
び４４９ｂｐエキソン４〜６プライマー産物の比較的大きい強度は、これらの細
胞がより高い分子量同位体を潜在的に選択し得ることを示唆する。

【０１１８】 ＭＳＦにおけるエキソン６は、アナログヘパリン硫酸結合領域（ＭＳＦエキソ
ン４）とヘモペキシン様リピート（ＭＳＦエキソン８、９）との間に位置する。
これらのドメインの分離は、ドメインの近接に起因してこれらのドメインがグリ
コサミノグリカン結合と競合することが考えられるビトロネクチンとは異なるグ
リコサミノグリカンとのより大きい相互作用を与える。おそらく、潤滑ドメイン
のいずれかの末端または両方の末端におけるグリコサミノグリカンに結合する能
力は薄層スプレンディン（ｌａｍｉｎａ ｓｐｌｅｎｄｉｎ）に覆われた軟骨に
おいて潤滑活性を安定にするのに機能する。あるいは、相互作用は、トリボネク
チンとコラーゲンＩＩ型との間に存在し、この相互作用は、軟骨に直接トリボネ
クチンを結合するのに機能する。

【０１１９】 トリボネクチンのような境界潤滑剤は、支持表面に結合し、そして境界モード
（ｍｏｄｅ）で潤滑させるために、相互反発を生成する。この二機能性の寄与は
、ラテックスのような非生物学的疎水性表面により、両親媒性の挙動により現れ
る。広範なグリコシル化は、周囲の水性環境とネットワークを作る。最後の（ｕ
ｌｔｉｍａｔｅ）糖および最後から二番目の（ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ）糖を除
く場合、潤滑能力は、排除される。ＭＳＦエキソン６の発現を、潤滑活性のため
に必要とし；最適な潤滑活性は、少なくとも１つのさらなるＭＳＦエキソン（例
えば、エキソン１）により発現されるドメインの発現をおそらく必要とする。行
われたキモトリプシン消化実験は、エキソン６産物を削除し、そして他の放出さ
れたエキソン産物が、潤滑能力を妨げないと仮定して、潤滑のためのこの消化（
ｄｉｇｅｓｔａｔｅ）を試験するために意図された。この消化（ｄｉｇｅｓｔａ
ｔｅ）は、ロイペプチンおよびアプロチニンの存在下での複製にも関わらず、ｗ
ｅ；；を潤滑にせず、他のエキソン産物が必要とされ得ることを示唆した。例え
ば、エキソン３が必要とされ得、エキソン３は、ムチンポリマーの凝集に重要で
ある、多数のシステイン残基を有する。表面をコートするトリボネクチンの量は
、凝集するのに、疎水性および個々のトリボネクチンポリマーの能力におそらく
依存する。

【０１２０】 免疫組織化学的研究は、コンドロイチン−６−硫酸を検出できず、存在しな
いか、またはコンドロイチン硫酸を結合するＤ²²⁰ＥＡＳＧ²²⁴に隣接するＯ結合
型グリコシル化により立体的に妨げられることを示唆した。ＳＺＰにおけるコン
ドロイチン硫酸およびケラタン硫酸の存在を、³⁵Ｓ標識ならびにケラタナーゼお
よびコンドロイチンリアーゼＡＢＣを用いた消化後の放出により確認した。しか
し、ＳＺＰ分子量における顕著な変化を、この消化後には観察せず、少量の置換
のみをおそらく観察することを示唆した。グリコサミノグリカンのいずれかを、
トリボネクチンに結合体化することが可能である。

【０１２１】 トリボネクチンおよびＳＺＰは、ＭＳＦエキソン１、３および６〜１２、なら
びに代替のスプライスされたエキソン２〜５を共有する類似の分子である。類似
の初期構造に関わらず、２つのタンパク質との間の翻訳後改変における相違を検
出した。Ｏ結合型潤滑部分β（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃの存在を、本明細
書中で記載されるトリボネクチンについてと同様に、ＳＺＰに対して検出しなか
った。トリボネクチンとＳＺＰとの間の分子量における相違を、ＳＺＰに対して
開発された抗体（表在性帯域の（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ ｚｏｎｅ）軟骨細胞
から生成した）を用いたウェスタンブロッティングにより支持した。

【０１２２】 （屈指−関節症−心膜炎症候群（ＣＡＰ）） インサイチュハイブリダイゼーション実験で、両方のＢＡＣクローンプローブ
が、同じ位置に独立して局在することから、トリボネクチンをコードするＤＮＡ
配列が、染色体１ｑ２５に存在することを示した。Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌ
ｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）のブールサーチで
、同じ座に遺伝的にマップされた１つの関節炎疾患を明らかにした。屈指−関節
症−心膜炎症候群（ＣＡＰ）は、一つ以上の指間関節（ｉｎｔｅｒ−ｐｈａｌａ
ｎｇｅａｌ ｊｏｉｎｔ）（屈指）の若年性発症大関節非炎症性関節症（ｊｕｖ
ｅｎｉｌｅ ｏｎｓｅｔ ｌａｒｇｅ ｊｏｉｎｔ ｎｏｎ−ｉｎｆｌａｍｍａ
ｔｏｒｙ ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）および先天的非外傷性屈曲拘縮により特徴
付けられる。この常染色体上に受け継がれた疾患を有する患者由来の滑膜および
腱滑膜組織の組織病理学的様子は、Ｂ型滑膜細胞過形成（Ｂ−ｔｙｐｅ ｓｙｎ
ｏｖｉｏｃｙｔｅ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）および終期（ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ
）線維症の組織病理学的様子である。ＣＡＰ症候群は、早発性関節摩耗（ｐｒｅ
ｍａｔｕｒｅ ｊｏｉｎｔ ｗｅａｒ）を生じる、効果のない潤滑の直接の結果
である。ＣＡＰを患う数人の患者はまた、心膜炎を発症する。単離された天然に
存在するまたは合成性トリボネクチンは、ＣＡＰを処置するため、および心膜組
織を潤滑させるために有用である。ＣＡＰを、ＭＳＦ遺伝子における変異体を検
出することにより診断する。

【０１２３】 他の実施形態は、上記の請求の範囲内にある。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＭＳＦおよびヒトトリボネクチンのアミノ酸配列の配列の整列の図で
ある。ＭＳＦエキソン７、８、および９を、それらの全体で示す；エキソン６は
、その長さ（９４０アミノ酸）のため省略する。エキソン６は、Ｏ−グリコシル
化の部位として機能する縮重配列ＫＥＰＡＰＰＴ（配列番号３）の合計７６反復
を含む。配列決定されたトリプシンフラグメントのＣ末端リジン／アルギニン残
基に影をつけている。エキソン６−特異的フォワードプライマーおよびエキソン
６−特異的リバースプライマーに対応するアミノ酸２１４〜２２２および３００
〜３０９に影がつけられ、そして下線が引かれる。アミノ酸配列座標（ｃｏｏｒ
ｄｉｎａｔｅ）は、配列番号１のアミノ酸を示す。

【図２】 図２Ａ、２Ｂは、それぞれヒト滑膜線維芽細胞および関節軟骨細胞によるトリ
ボネクチン発現の表現型アイソフォームの図である。図２Ａは、ＭＳＦエキソン
がトリボネクチンアイソフォームで発現されたことを図で示す。図２Ｂは、滑膜
線維芽細胞エキソン２、４、および５と比較した関節軟骨細胞におけるエキソン
発現が、オルタナティブスプライシングされ、アイソフォーム発現を生じること
を図で示す。

【図３】 図３は、トリボネクチンアイソフォームＶ１、Ｖ２、およびＶ３の境界のオル
タナティブスプライシングを示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０１ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA01 GA30 HA20 4C081 AB05 AB11 AB17 AC03 BA17 BB04 BB05 CD111 CD27 DA02 DA04 DA11 DA12 DA15 4C084 AA02 AA06 AA07 BA02 BA08 BA22 BA23 BA34 CA18 DC50 NA14 ZA961 ZC511 4H045 AA30 BA53 CA40 EA20 EA34 HA07

Claims (54)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも１つのＯ結合型潤滑部分を含むトリボネクチン。
2. 【請求項２】 前記部分がβ（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ部分である、
   請求項１に記載のトリボネクチン。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のトリボネクチンであって、該トリボネクチ
   ンは、配列番号１のアミノ酸１〜２４および２００〜１４０４を含み、配列番号
   １のアミノ酸２５〜１９９を欠失する、トリボネクチン。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のトリボネクチンであって、該トリボネクチ
   ンは、配列番号１のアミノ酸１〜１５６および２００〜１４０４を含み、配列番
   号１のアミノ酸１５７〜１９９を欠失する、トリボネクチン。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のトリボネクチンであって、該トリボネクチ
   ンは、配列番号１のアミノ酸１〜１０６および２００〜１４０４を含み、配列番
   号１のアミノ酸１０７〜１９９を欠失する、トリボネクチン。
6. 【請求項６】 請求項１に記載のトリボネクチンであって、該トリボネクチ
   ンが、配列番号１のアミノ酸１〜２５、６７〜１０６および２００〜１４０４を
   含み、配列番号１のアミノ酸２６〜６６を欠失する、トリボネクチン。
7. 【請求項７】 ポリペプチドを含むトリボネクチンであって、該ポリペプチ
   ドのアミノ酸配列は、少なくとも１つのサブユニットを含むが７６個より少なく
   、ここで、 （ａ）各サブユニットが少なくとも７個のアミノ酸を含み；そして （ｂ）該サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号３に対して少なくとも５０
   ％同一であり、ここで非同一アミノ酸が保存的アミノ酸置換である、 トリボネクチン。
8. 【請求項８】 前記サブユニットのアミノ酸配列が、配列番号３である、請
   求項７に記載のトリボネクチン。
9. 【請求項９】 配列番号４のアミノ酸配列の１つ以上の繰り返しをさらに含
   む、請求項７に記載のトリボネクチン。
10. 【請求項１０】 支持表面との間の摩擦係数を低減するとして特徴付けられ
    る、請求項１に記載のトリボネクチン。
11. 【請求項１１】 インビトロで支持表面との間の摩擦係数を低減するとして
    特徴付けられる、請求項１に記載のトリボネクチン。
12. 【請求項１２】 インビボで支持表面との間の摩擦係数を低減するとして特
    徴付けられる、請求項１に記載のトリボネクチン。
13. 【請求項１３】 前記トリボネクチンが添加される溶液の粘度を実質的に増
    大しない、請求項１に記載のトリボネクチン。
14. 【請求項１４】 Ｏ結合型オリゴ糖を含む、請求項７に記載のトリボネクチ
    ン。
15. 【請求項１５】 前記オリゴ糖が、Ｎ−アセチルガラクトサミン−ガラクト
    ースである、請求項１４に記載のトリボネクチン。
16. 【請求項１６】 前記トリボネクチンの少なくとも１０％がグリコシル化さ
    れる、請求項１に記載のトリボネクチン。
17. 【請求項１７】 前記トリボネクチンの少なくとも４０％がグリコシル化さ
    れる、請求項１に記載のトリボネクチン。
18. 【請求項１８】 前記トリボネクチンの分子量が、２００〜２８０ｋＤａの
    範囲である、請求項１に記載のトリボネクチン。
19. 【請求項１９】 前記ポリペプチドが、巨核球刺激因子のフラグメントを含
    む、請求項１に記載のトリボネクチン。
20. 【請求項２０】 前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜
    １１４０の配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に
    記載のトリボネクチン。
21. 【請求項２１】 前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜
    １１４０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のトリボネクチン。
22. 【請求項２２】 前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜
    １１６７の配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に
    記載のトリボネクチン。
23. 【請求項２３】 前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜
    １１６７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のトリボネクチン。
24. 【請求項２４】 前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜
    １２１２の配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に
    記載のトリボネクチン。
25. 【請求項２５】 前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜
    １２１２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のトリボネクチン。
26. 【請求項２６】 前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜
    １２６３の配列と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に
    記載のトリボネクチン。
27. 【請求項２７】 前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基２００〜
    １２６３のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のトリボネクチン。
28. 【請求項２８】 前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基１〜２４
    のアミノ酸配列を欠失する、請求項１に記載のトリボネクチン。
29. 【請求項２９】 前記ポリペプチドが、配列番号１に含まれる残基６７〜１
    ０４のアミノ酸配列を欠失する、請求項１に記載のトリボネクチン。
30. 【請求項３０】 トリボネクチンをコードする、単離された核酸分子。
31. 【請求項３１】 前記核酸が、配列番号２に含まれるヌクレオチド６３１〜
    ３４５３の配列を含む、請求項３０に記載の核酸。
32. 【請求項３２】 哺乳動物の関節を潤滑させる方法であって、該方法は、該
    関節を、単離されたＭＳＦ遺伝子産物と接触させる工程を包含する、方法。
33. 【請求項３３】 哺乳動物の関節を潤滑させる方法であって、該方法は、該
    関節を、請求項１に記載のトリボネクチンと接触させる工程を包含する、方法。
34. 【請求項３４】 ヒトのアーティキュレイティング関節である、請求項３３
    に記載の方法。
35. 【請求項３５】 イヌのアーティキュレイティング関節である、請求項３３
    に記載の方法。
36. 【請求項３６】 ウマのアーティキュレイティング関節である、請求項３３
    に記載の方法。
37. 【請求項３７】 前記トリボネクチンが、関節内に投与される、請求項３３
    に記載の方法。
38. 【請求項３８】 哺乳動物の関節を潤滑させる方法であって、該方法は、該
    関節を請求項３０に記載の核酸と接触させる工程を包含する、方法。
39. 【請求項３９】 哺乳動物における、屈指−関節症−心膜炎症候群を予防す
    るかまたは処置する方法であって、該方法は、該哺乳動物にトリボネクチンを投
    与する工程を包含する、方法。
40. 【請求項４０】 トリボネクチンを含む生物学的適合性組成物であって、該
    組成物は、組織接着形成の阻害に適切な形態である、組成物。
41. 【請求項４１】 前記トリボネクチンが、膜、泡沫、ゲル、または繊維であ
    る、請求項４０に記載の組成物。
42. 【請求項４２】 哺乳動物において第１表面と第２表面との間の接着形成を
    阻害する方法であって、該方法は、該哺乳動物における該表面の接着を阻害する
    のに十分な量で該第１表面および該第２表面との間にトリボネクチンを配置する
    工程を包含する、方法。
43. 【請求項４３】 前記第１表面および前記第２表面が、共に前記哺乳動物の
    損傷した組織である、請求項４２に記載の方法。
44. 【請求項４４】 前記第１表面または前記第２表面が、人工デバイスである
    、請求項４２に記載の方法。
45. 【請求項４５】 前記人工デバイスが整形外科用移植片である、請求項４４
    に記載の方法。
46. 【請求項４６】 前記トリボネクチンが、膜、泡沫、ゲル、または繊維の形
    態である、請求項４２に記載の方法。
47. 【請求項４７】 前記損傷が外科的切開に起因する、請求項４２に記載の方
    法。
48. 【請求項４８】 前記損傷が外傷に起因する、請求項４２に記載の方法。
49. 【請求項４９】 前記第１表面または前記第２表面が心膜組織である、請求
    項４２に記載の方法。
50. 【請求項５０】 哺乳動物において、変形性関節症またはそれに対する素因
    を診断する方法であって、該方法は、該哺乳動物に由来する生物学的サンプルに
    おいて、巨核球刺激因子（ＭＳＦ）またはそのフラグメント量を測定する工程を
    包含し、ここでコントロールと比較された該量における増大は、該哺乳動物が変
    形性関節症を罹患するか、または変形性関節症を発症しやすいかを示す、方法。
51. 【請求項５１】 前記生物学的サンプルが滑液、血液、血清、尿である、請
    求項５０に記載の方法。
52. 【請求項５２】 前記ＭＳＦフラグメントが、配列番号３のアミノ酸配列を
    含む、請求項５０に記載の方法。
53. 【請求項５３】 前記ＭＳＦフラグメントが、配列番号５のアミノ酸配列を
    含む、請求項５０に記載の方法。
54. 【請求項５４】 前記ＭＳＦフラグメントが、配列番号６のアミノ酸配列を
    含む、請求項５０に記載の方法。