ES2324199T5

ES2324199T5 - Tribonectinas

Info

Publication number: ES2324199T5
Application number: ES00926303T
Authority: ES
Inventors: Gregory D. Jay
Original assignee: Rhode Island Hospital
Current assignee: Rhode Island Hospital
Priority date: 1999-04-23
Filing date: 2000-04-24
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2020-04-24
Also published as: US6743774B1; CA2367750A1; US7618941B2; JP2012070738A; CA2367750C; EP1173567A2; US8680057B2; US20140179611A1; AU781564B2; JP2016172760A; EP1173567B2; ATE425253T1; ES2324199T3; US20100204087A1; DE60041761D1; JP2016041769A; WO2000064930A2; WO2000064930A3; JP5909592B2; AU4485200A

Abstract

Una tribonectina que contiene una secuencia de aminoácidos que abarca por lo menos una, pero menos de 76 subunidades, en la que (a) cada subunidad consta por lo menos de 7 aminoácidos; (b) la secuencia de aminoácidos de dicha subunidad es idéntica por lo menos en un 50% con la SEQ ID NO: 3, en la que un aminoácido no idéntico es una sustitución conservadora de aminoácido; (c) dicha tribonectina consta por lo menos de un resto ß(1-3)Gal-GalNAc; y (d) por lo menos un 10% en peso de dicha tribonectina está formado por oligosacáridos unidos a través de O.

Description

Tribonectinas.

Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 09/298,970, depositada el 23 de abril de 1999, cuyo contenido completo se incorpora en la presente como referencia.

Antecedentes de la invención

La invención se refiere a la lubricación de articulaciones de mamíferos.

La osteoartritis (OA) es una de las formas más frecuentes de artropatías. Los factores que contribuyen al desarrollo de la OA incluyen un historial familiar de OA, daño previo de la articulación por lesión o cirugía y edad de la articulación, es decir, el "desgaste y deterioro" de las superficies que forman la articulación. La OA es muy frecuente en grupos de personas mayores, pero también puede afectar a los niños.

El tratamiento actual está destinado a aliviar el dolor y otros síntomas de la OA, por ejemplo, mediante la administración de fármacos analgésicos y anti-inflamatorios. Otras propuestas terapéuticas incluyen la viscosuplementación mediante la administración de ácido hialurónico y sus derivados al tejido articular para aumentar la viscosidad del líquido sinovial.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un nuevo tratamiento de la osteoartritis y otras enfermedades degenerativas de las articulaciones mediante la tribosuplementación. La tribosuplementación se realiza administrando directamente polipéptidos lubricantes a la articulación lesionada o artrítica. A diferencia de la viscosuplementación, la tribosuplementación no aumenta sustancialmente la viscosidad de la solución, por ejemplo, del líquido sinovial, a la que se añade. La viscosidad de una solución a la que se añade una tribonectina aumenta como máximo 10%, preferiblemente como máximo 5%, más preferiblemente como máximo 2%, más preferiblemente como máximo 1%. Lo más preferiblemente, la viscosidad de la solución a la que se añade una tribonectina permanece invariable o disminuye.

Por consiguiente, la invención proporciona una tribonectina. Una tribonectina es un lubricante artificial por capa límite, que contiene al menos una repetición de una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en al menos 50% a KEPAPTT (SEQ ID NO: 3). La invención proporciona una tribonectina que contiene al menos un resto lubricante unido por O, en donde dicho resto lubricante es un resto �(1-3)Gal-GalNAc. La secuencia de aminoácidos de la cadena principal de la proteína de una tribonectina de origen natural puede ser diferente en función del empalme alternativo de exones del gen del factor estimulante de megacariocitos (MSF) humano. Por ejemplo, la tribonectina contiene los aminoácidos 1 a 24 y 200 a 1404 de la SEQ ID NO: 1, pero carece de los aminoácidos 25-199 de la SEQ ID NO: 1. La tribonectina contiene los aminoácidos 1 a 156 y 200 a 1404 de la SEQ ID NO: 1, pero carece de los aminoácidos 157 a 199 de la SEQ ID NO: 1. La tribonectina contiene los aminoácidos 1 a 106 de la SEQ ID NO: 1 y 200 a 1404 de la SEQ ID NO: 1, pero carece de los aminoácidos 107 a 199 de la SEQ ID NO: 1. La tribonectina contiene los aminoácidos 1 a 25 de la SEQ ID NO: 1, 67 a 106 de la SEQ ID NO: 1 y 200 a 1404 de la SEQ ID NO: 1, pero carece de los aminoácidos 26 a 66 de la SEQ ID NO: 1. Las tribonectinas son polipéptidos de origen natural purificados o polipéptidos sintéticos o recombinantes. La secuencia de aminoácidos de la cadena principal de las tribonectinas sintéticas o recombinantes es idéntica en al menos 50% a la secuencia de aminoácidos de una tribonectina de origen natural y posee al menos 50% de la actividad lubricante de una tribonectina de origen natural.

Una tribonectina se formula para la administración a una articulación u otro tejido de mamífero, por ejemplo, tejido cardíaco, cuya lubricación se desea. Preferiblemente, la tribonectina es un polipéptido lubricante recombinante o sintetizado químicamente. Por ejemplo, una tribonectina incluye un polipéptido sustancialmente puro, cuya secuencia de aminoácidos incluye al menos repeticiones, pero menos de 76 repeticiones. Cada subunidad contiene al menos 7 aminoácidos (y típicamente 10 o menos aminoácidos). La secuencia de aminoácidos de cada subunidad es idéntica en al menos 50% a la SEQ ID NO: 3 y un aminoácido no idéntico de la secuencia de referencia es una sustitución conservadora de aminoácido. Por ejemplo, uno o los dos residuos de treonina están sustituidos por un residuo de serina. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de la subunidad es idéntica a la SEQ ID NO: 3. La tribonectina puede contener además una o más repeticiones de la secuencia de aminoácidos XXTTTX (SEQ ID NO: 4). Los polipéptidos u otros compuestos descritos en la presente memoria se dice que son "sustancialmente puros" si dentro de las preparaciones el compuesto de interés está presente en al menos 60% en peso (peso en seco). Preferiblemente, la preparación contiene al menos 75%, más preferiblemente al menos 90% y los más preferiblemente al menos 99%, en peso del compuesto de interés. La pureza puede medirse por cualquier método apropiado, por ejemplo, por cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis por HPLC.

Cuando se dice que un polipéptido o molécula de ácido nucleico concretos tienen una identidad porcentual específica a un polipéptido o molécula de ácido nucleico de referencia, de una longitud definida, la identidad porcentual se refiere al polipéptido o molécula de ácido nucleico de referencia. Por tanto, un péptido que es idéntico en 50% a un polipéptido de referencia que tiene una longitud de 100 aminoácidos puede ser un polipéptido de 50 aminoácidos que es completamente idéntico a una porción de una longitud de 50 aminoácidos del polipéptido de referencia. Puede ser también un polipéptido de 100 aminoácidos que es idéntico en 50% al polipéptido de referencia tomando en consideración toda su longitud.

Un polipéptido o molécula de ácido nucleico que es "sustancialmente idéntico" a un polipéptido o molécula de ácido nucleico de referencia dado es un polipéptido o molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia que es idéntica en al menos un 85%, preferiblemente en 90% y más preferiblemente en 95%, 98%, 99% o más a la secuencia del polipéptido o de la molécula de ácido nucleico de referencia. La "identidad" tiene un significado reconocido en la técnica y se calcula usando métodos publicados, bien conocidos, por ejemplo, Computational Molecular Biology, 1988, Lesk A.M., ed., Oxford University Press, New York; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, 1993, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, 1994, Griffin, A.M. and Griffin, E.G., ed., Humana Press, New Jersey; Sequence Analysis in Molecular Biology, 1987, Heinje, G., Academic Press, New York; y Sequence Analysis Primer, 1991, Gribskov, M. and Devereux, J.,ed., Stockton Press, New York. Existen, pues, muchos métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos y el término "identidad" es conocido por los expertos y tiene un significado definido con relación al método especificado determinado. La identidad de secuencias descrita en la presente memoria se mide con el programa informático Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI). Se emplea el módulo MegAlign del método Clustal V (Higgins et al., CABIOS 5 (2), 151-3, 1989). Los parámetros empleados son: penalización de hueco = 10, penalización de longitud de hueco = 10.

Alternativamente, los ácido nucleicos que difieren de una secuencia de referencia dada se hibridan con alta rigurosidad a una cadena de DNA que tiene la secuencia de referencia o uno de sus complementos. Las condiciones de alta rigurosidad son la hibridación a 42 grados C en formamida del 50%, un primer lavado a 65 grados C con 2 X SSC y un segundo lavado a 65 grados C con 0,2 X SSC.

Una tribonectina se caracteriza por reducir el coeficiente de fricción (or ejemplo, la

10 entre superficies de apoyo. P reducción de la fricción se mide in vitro detectando una reducción de la fricción en un aparato que emplea apoyos de látex:vidrio. La reducción de fricción se mide también in vivo, por ejemplo, midiendo la reducción del dolor del paciente. Las tribonectinas de la invención son composiciones lubricantes. Se analiza la función lubricante de los polipéptidos que tienen una identidad de al menos 50% (pero menos del 100%) de secuencias de aminoácidos a una secuencia de referencia, midiendo la reducción del 1 entre las superficies de apoyo.

Una tribonectina de la invención incluye un oligosacárido unido por O y comprende N-acetilgalactosamina y galactosa en la forma beta(1-3)Gal-GalNAC. Por ejemplo, los dominios repetitivos KEPAPTT (SEQ ID NO: 3) y XXTTTX (SEQ ID NO: 4) están glicosilados por beta(1-3)Gal-GalNAC (que algunas veces puede estar protegido con NeuAc en la forma de (1-3)Gal-GalNAC-NeuAc). El término "glicosilado" referido a un polipéptido significa que un resto de hidrato de carbono está presente en uno o más sitios de la molécula de polipéptido. 10%, preferiblemente al menos 20%, más preferiblemente al menos 30% y los más preferiblemente al menos 40% de la tribonectina de la invención está glicosilada. Puede estar glicosilada hasta 50% o más de la tribonectina. El porcentaje de glicosilación se determina en peso.

Un polipéptido de tribonectina contiene un fragmento sustancialmente puro de MSF. Por ejemplo, el peso molecular de una tribonectina sustancialmente pura que tiene una secuencia de aminoácidos de una tribonectina de origen natural está en el intervalo de 220-280 kDa. Preferiblemente, el peso molecular aparente de una tribonectina es menor que 230 kDa, más preferiblemente menor que 250 kDa y lo más preferiblemente menor que 280 kDa. Un fragmento de proteína o polipéptido se define como un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en parte, pero no totalmente, a la secuencia de aminoácidos de una proteína o polipéptido de origen natural, de los que se deriva, por ejemplo, MSF. La tribonectina puede contener un polipéptido, cuya secuencia de aminoácidos es idéntica en al menos 50% a la secuencia de los residuos 200-1140, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1; por ejemplo, contiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 200-1140, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1. En otro ejemplo, el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos 50% a la secuencia de los residuos 200-1167, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, una que tenga la secuencia de aminoácidos idéntica a los residuos 200-1167, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1. El polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos 50% a la secuencia de los residuos 200-1212, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de los residuos 200-1212, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1, o el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos 50% a la secuencia de los residuos 200-1263, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos idéntica a los residuos 200-1263, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la secuencia del polipéptido carece de la secuencia de aminoácidos de los residuos 1-24, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1 y/o de la secuencia de aminoácidos de los residuos 67-104, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1.

La invención se refiere también a una molécula aislada de ácido nucleico que codifica una tribonectina. Por ejemplo, el ácido nucleico incluye una secuencia que es idéntica en al menos 50% a los nucleótidos 631-3453, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 200-1140 de la SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, el ácido nucleico tiene una secuencia de nucleótidos idéntica a la de los nucleótidos 631-3453, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 2, o una de sus variantes degeneradas. Una molécula aislada de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico que está separada de las secuencias codificadoras o de las secuencias no codificadoras en 5' y 3', de la que es inmediatamente contigua en el genoma de origen natural de un organismo. Las moléculas aisladas de ácidos nucleicos incluyen las moléculas de ácidos nucleicos que no son de origen natural, por ejemplo, las moléculas de ácidos nucleicos creadas por técnicas de DNA recombinante. Por ejemplo, el ácido nucleico de la invención incluye los nucleótidos 631-3453, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 2, pero no los nucleótidos que están en una posición inmediatamente contigua a aquellas secuencias en la secuencia genómica de origen natural o en el cDNA de origen natural.

Está también dentro de la invención un método para lubricar una articulación de mamífero poniendo en contacto dicha articulación con MSF purificado o con una tribonectina. El mamífero es preferiblemente un ser humano, un caballo, un perro, un buey, un asno, un ratón, una rata, una cobaya, una vaca, una oveja, un cerdo, un conejo, un mono o un gato y la articulación es una articulación tal como rodilla, codo, hombro, cadera o cualquier otra articulación que pueda soportar peso. Las tribonectinas se administran por vía intra-articular. La lubricación terapéutica de la articulación se efectúa también por terapia génica, por ejemplo, poniendo en contacto la articulación o el líquido sinovial con un ácido nucleico que codifica una tribonectina. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se administran a una cavidad sinovial por una inyección intra-articular.

Además de funcionar como lubricante por capa límite en las articulaciones de los mamíferos, una tribonectina se usa como lubricante por capa límite entre tejidos blandos de mamíferos, tales como la piel u órganos internos, o entre tejidos de mamíferos y dispositivos médicos, por ejemplo un implante protésico. Por consiguiente, la invención abarca una composición biocompatible que contiene una tribonectina en forma adecuada para la inhibición de la formación de adhesión a tejidos. Por ejemplo, la tribonectina puede adoptar la forma de una película, una membrana, una espuma, un gel o una fibra. El término "película" tal como se emplea en la presente memoria significa una sustancia formada por compresión de una espuma o de un gel hasta formar una membrana delgada, por ejemplo, por vertido en un molde plano y secado al aire para formar una membrana delgada, o por compresión de un gel o fibras, o dejando o provocando que las fibras o el gel se deshidraten. El término "espuma" tal como se emplea en la presente memoria significa una sustancia que tiene estructura porosa formada, por ejemplo, por introducción de aire en una solución, suspensión, gel o fibra de tribonectina. El término "bioabsorbible" tal como se emplea en la presente memoria se refiere a la capacidad de un material compatible con tejidos para degradarse en el cuerpo después de la implantación, dando lugar a productos no tóxicos que se eliminan del cuerpo o se metabolizan. Una sustancia "biocompatible" tal como se emplea el término en la presente memoria es una sustancia que no tiene efectos tóxicos ni lesivos inaceptables en sentido médico, que pudieran afectar la función biológica. Las composiciones de tribonectina para impedir las adhesiones se formulan también en forma de composiciones idóneas para la extrusión, por ejemplo, para formar un molde sobre el que puede crecer el tejido sin adherirse a él.

Un método para inhibir la formación de adhesión entre una primera superficie y una segunda superficie de un mamífero se realiza colocando una tribonectina entre la primera y la segunda superficies para impedir la adhesión de dichas superficies de un mamífero. Por ejemplo, una superficie o las dos son un tejido de mamífero y una tribonectina colocada entre ellas impide la formación de adhesiones durante el proceso de curación. Alternativamente, la primera superficie o la segunda (o ambas) son un dispositivo artificial, por ejemplo, un implante ortopédico. Los tejidos a tratar incluyen los lesionados por incisión quirúrgica o por traumatismo.

También dentro de la invención se contempla un método de diagnóstico de la osteoartritis o de la predisposición a sufrirla, obteniendo una muestra biológica de un mamífero y midiendo la cantidad de un fragmento de MSF en dicha muestra biológica. El aumento de la cantidad comparado con un control, por ejemplo, un valor predeterminado asociado a un diagnóstico negativo o a una muestra biológica de un mamífero del que se sabe que no sufre osteoartritis, indica que el mamífero sufre osteoartritis o está predispuesto a desarrollar osteoartritis. Cualquier muestra biológica es adecuada para el ensayo en el método de diagnóstico; típicamente la muestra biológica es líquido sinovial, sangre, suero u orina. Preferiblemente, el fragmento de MSF contiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. Alternativamente, el fragmento de MSF contiene la secuencia de aminoácidos EPAPTT (SEQ ID NO: 5; un producto de escisión de tribonectina causada por tripsina) o la secuencia de aminoácidos PTTKEP (SEQ ID NO: 6; un producto de escisión de tribonectina causada por elastasa).

Otras características y ventajas de la invención resultarán manifiestas a partir de la descripción siguiente de sus realizaciones preferidas y de las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un diagrama de un alineamiento de las secuencias de aminoácidos del MSF y de una tribonectina humana. Los exones 7, 8 y 9 del MSF se muestran completos; el exón 6 se presenta en forma abreviada, porque es muy largo (940 aminoácidos). El exón 6 contiene un total de 76 repeticiones de la secuencia degenerada KEPAPPT (SEQ ID NO: 3), que actúan como sitios de O-glicosilación. Se presentan sobre fondo oscuro los residuos de lisina/arginina del C terminal de los fragmentos trípticos secuenciados. Se presentan sobre fondo oscuro y subrayado los aminoácidos 214-222 y 300-309 correspondientes a los cebadores delantero e inverso específicos del exón 6. Las coordenadas de la secuencia de aminoácidos se refieren a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

Las figuras 2A-B son diagramas de isoformas fenotípicas de expresión de la tribonectina por fibroblastos sinoviales humanos y condrocitos articulares, respectivamente. En la figura 2A se representan gráficamente exones de MSF expresados en isoformas de tribonectina. En la figura 2B se representa esquemáticamente la expresión de exones en condrocitos articulares comparadas con los fibroblastos sinoviales. Los exones 2, 4 y 5 se empalman de modo alternativo, dando como resultado la expresión de isoformas.

La figura 3 es un diagrama que representa los límites de empalme alternativo de las isoformas de tribonectina 5 V1, V2 y V3.

Descripción detallada

Se identificaron y aislaron un gran número de isoformas de tribonectina de origen natural. Por ejemplo, se purificó un polipéptido lubricante humano del líquido sinovial y se encontró que contenía los aminoácidos codificados por los exones 2 y 4-12 del gen del MSF (pero no los exones 1 o 3). El gen que codifica MSF de longitud completa de origen

10 natural contiene 12 exones y el producto génico del MSF de origen natural contiene 1404 aminoácidos con múltiples homologías de secuencia de polipéptido con la vitronectina, incluidas las regiones similares a hemopexina y similares a somatomedina. El exón 6 en posición central contiene 940 residuos. El exón 6 codifica el dominio de mucina O-glicosilado. Un polipéptido codificado por los nucleótidos 631-3453 de la SEQ ID NO: 2 proporciona una lubricación por capa límite del cartílago articular.

15 TABLA 1 Secuencia de aminoácidos del MSF

TABLA 2 cDNA del MSF

TABLA 3 Límites de los exones del MSF

Exón: Secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 Secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2

1: 1-24, ambos inclusive 34-105, ambos inclusive

2: 25-66, ambos inclusive 106-231, ambos inclusive

3: 67-104, ambos inclusive 232-345, ambos inclusive

4: 105-155, ambos inclusive 346-498, ambos inclusive

5: 156-199, ambos inclusive 499-630, ambos inclusive

6: 200- 1140, ambos inclusive 631-3453, ambos inclusive

7: 1141- 1167, ambos inclusive 3454-3534, ambos inclusive

8: 1168-1212, ambos inclusive 3535-3670, ambos inclusive

9: 1213- 1263, ambos inclusive 3671-3822, ambos inclusive

10: 1264- 1331, ambos inclusive 3823-4026, ambos inclusive

11: 1332- 1371, ambos inclusive 4027-4146, ambos inclusive

12: 1372-1404, ambos inclusive 4147-4245, ambos inclusive

El lubricante por capa límite aislado del líquido sinovial es una variante de empalme alternativo del MSF. Se ha

5 encontrado que esta variante de empalme alternativo es la composición presente en el líquido sinovial que confiere propiedades lubricantes a la articulación. El lubricante por capa límite aislado del líquido sinovial humano contiene los aminoácidos codificados por los exones 2 y 4-12 del gen del MSF, es decir, la variante de empalme alternativo carece de los aminoácidos codificados por los exones 1 y 3 del gen del MSF. Un polipéptido recombinante o producido químicamente que contenga al menos el exón 6 (pero no los exones 1 o 3) del MSF es útil para prevenir

10 y/o tratar una enfermedad osteoartrítica. Para lubricar las articulaciones de los mamíferos se administra también un polipéptido lubricante recombinante o producido químicamente que contiene al menos una repetición de la secuencia de aminoácidos KEPAPTT (SEQ ID NO: 3) bien sea idéntica o bien sea con una sustitución conservadora.

Producción y purificación de polipéptidos lubricantes recombinantes

15 Para producir polipéptidos recombinantes se transfecta en una célula el DNA que contiene el exón 6 del MSF (nucleótidos 631-3453 de la SEQ ID NO: 2) en un vector de expresión apropiado. El DNA puede contener además algunos o todos del exón 7 (nucleótidos 354-3534 de la SEQ ID NO: 2), exón 8 (nucleótidos 3535-3670 de la SEQ ID NO: 2) o exón 9 (nucleótidos 3671-3822 de la SEQ ID NO: 2) del gen del MSF. Los cebadores para los métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para generar un DNA que abarque varios exones del MSF se muestran

20 a continuación. Otras isoformas se expresan clonando ácidos nucleicos correspondientes a los exones del MSF que codifican las secuencias de aminoácidos que se pretenden expresar.

TABLA 4 Cebadores para la PCR

En la técnica de biología molecular son muy conocidos métodos para diseñar los cebadores delantero e inverso empleados para obtener los DNA que codifican los polipéptidos de tribonectina de longitudes variables y que incorporan varios exones del gen del MSF, por ejemplo, para obtener un polipéptido codificado por los exones 2, 412; los exones 6-9; y los exones 2, 4-9. Los expertos en la técnica de biología molecular conocen los métodos estándares para transfectar células con ácido nucleico aislado. Por ejemplo, se transfectan células procariotas o eucariotas en cultivo con el DNA de la invención unido operativamente a las secuencias de control de expresión apropiadas para lograr un alto nivel de expresión en la célula. Estas células son útiles para producir grandes cantidades del polipéptido lubricante, que se purifican por métodos estándares. Los polipéptidos lubricantes se emplean terapéuticamente para el tratamiento o la prevención de enfermedades artríticas. Los polipéptidos se usan también para generar anticuerpos contra glicoproteínas o glicopéptidos lubricantes de origen natural o producido por métodos recombinantes.

Por ejemplo, el producto génico recombinante se expresa en forma de proteína de fusión y se purifica empleando un sistema comercial de expresión y purificación, por ejemplo, el sistema de expresión pFLAG (IBI). Los sistemas de expresión que pueden emplearse para las finalidades de la invención incluyen, aunque sin limitación: microorganismos, tales como bacterias (por ejemplo, E. coli y B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de DNA recombinante de bacteriófago, DNA de plásmidos o DNA de cósmidos que contienen las moléculas de ácido nucleicos descritas en la presente memoria. Para la producción de polipéptidos glicosilados se emplean sistemas de expresión eucariotas. Se emplean levaduras (por ejemplo, Saccharomyces y Pichia) transformadas con vectores recombinantes de expresión en levaduras que contienen el ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de tribonectina. Son también útiles los sistemas de células de insectos infectadas con vectores recombinantes de expresión en virus (por ejemplo, baculovirus) que contienen las moléculas de ácidos nucleicos que codifican una tribonectina y sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, células COS, CEO, BEK, 293, VERO, HeLa, MDCK, W138 y NIH 3T3) que alojan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, el promotor de metalotioneina) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus y el promotor 7.5K del virus vaccinia). Además para aplicaciones clínicas, se inyectan los polipéptidos recombinantes a un conejo o roedor para producir anticuerpos del modo descrito más adelante.

El líquido sinovial de una articulación inflamada o lesionada contiene enzimas proteolíticas que degradan las proteínas o polipéptidos lubricantes. Por ejemplo, las células inmunitarias infiltradas, tales como los neutrófilos, secretan tripsina y/o elastasa. Incluso una lesión de menor importancia de una articulación o un estado inflamatorio puede dar como resultado una infiltración celular y la secreción de enzimas proteolíticas, que provocan una sinovitis traumática. La sinovitis durante un período de unos pocos días o semanas puede producir la pérdida de la capa citoprotectora de la articulación, que a su vez conduce a la pérdida de cartílago. Los apoyos cartilaginosos no lubricados pueden experimentar un desgaste prematuro que puede ser el inicio de la osteoartritis. Los individuos que presentan a nivel clínico una efusión traumática (por ejemplo, "agua en la rodilla") están predispuestos a desarrollar una osteoartritis; la elaboración de enzimas proteolíticas degrada y agota las composiciones lubricantes de origen natural del líquido sinovial. El agotamiento de las composiciones lubricantes naturales se observa en otras enfermedades inflamatorias de las articulaciones, tales como la artritis reumatoide. Reemplazando o suplementando el líquido sinovial de estas articulaciones lesionadas por las composiciones lubricantes de la invención se impide el desarrollo de la osteoartritis a largo plazo (por ejemplo, años, incluso décadas después) y se lubrica de inmediato la articulación, minimizando el daño a corto plazo.

Para lubricar articulaciones de mamíferos se emplean análogos, homólogos o miméticos de péptidos lubricantes que son menos susceptibles de degradación in vivo. Los análogos pueden diferir de los péptidos de origen natural en la secuencia de aminoácidos, o en modificaciones que no afectan a la secuencia, o en ambas cosas. Las modificaciones (que normalmente no alteran la secuencia primaria) incluyen la derivatización química in vivo o in vitro de los polipéptidos, por ejemplo, acetilación o carboxilación. Se incluyen también las modificaciones de glicosilación, por ejemplo, las realizadas modificando los modelos de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesado, o en las etapas posteriores del procesado, por ejemplo, exponiendo el polipéptido a enzimas que afecten a su glicosilación, por ejemplo, enzimas de glicosilación o desglicosilación en mamíferos.

Cuando la degradación proteolítica de los péptidos después de la inyección a un sujeto es un problema, la sustitución de un enlace peptídico particularmente sensible por un enlace peptídico mimético no escindible hace que el péptido resultante sea más estable y, por tanto, más útil como agente terapéutico. Para hacer que los péptidos terapéuticos sean menos susceptibles a la escisión por acción de las peptidasas, tales como tripsina o elastasa, los enlaces peptídicos de un péptido pueden ser reemplazados por un tipo alternativo de enlace covalente (un "péptido mimético"). La tripsina, elastasa y otras enzimas pueden obtenerse por infiltración de células inmunitarias durante la inflamación de la articulación. La tripsina escinde un enlace peptídico del lado carboxi de lisina y arginina; la elastasa escinde en el lado carboxi de alanina y glicina. La trombina, una serina-proteasa que está presente en las articulaciones hemorrágicas, escinde un enlace peptídico del lado carboxi de arginina. Las colagenasas son una familia de enzimas producidas por los fibroblastos y condrocitos cuando el metabolismo sinovial está alterado (por ejemplo, durante una lesión). Estas enzimas cortan en el lado carboxi de glicina y prolina. Uno o más enlaces peptídicos sensibles a las peptidasas, por ejemplo, los que aparecen en la secuencia repetitiva KEPAPTT (SEQ ID NO: 3), se alteran (por ejemplo, se reemplazan por un enlace no peptídico) convirtiendo el sitio en menos susceptible a la escisión, con lo cual se aumenta la semivida clínica de la formulación terapéutica.

Tales compuestos miméticos y los métodos de incorporarlos en los polipéptidos son muy conocidos en la técnica. De igual manera, el reemplazo de un residuo de L-aminoácido por un residuo de D-aminoácido es un método estándar de hacer el polipéptido menos sensible a la proteólisis. Son también útiles los grupos de bloqueo del extremo amino terminal, tales como los grupos t-butiloxicarbonilo, acetilo, teilo, succinilo, metoxisuccinilo, suberilo, adipilo, azelailo, dansilo, benciloxicarbonilo, fluorenilmetoxicarbonilo, metoxiazelailo, metoxiadipilo, metoxisuberilo y 2,4-dinitrofenilo.

Las formulaciones clínicas de las tribonectinas pueden contener también inhibidores de peptidasas, tales como la Nmetoxisuccinil-AlaAla-Pro-Val-clorometilcetona (un inhibidor de elastasa). Otros inhibidores de proteasas clínicamente aceptables (por ejemplo, los descritos en Berling et al., Int. J. Pancreatology 24, 9-17, 1998), tales como leupeptina, aprotinina, a1-antitripsina, a2-macroglobulina, el inhibidor de la a1-proteasa, antiquimotripsina (ACHY), el inhibidor de la secreción de proteasa en leucocitos (PSTI), se co-administran también con una tribonectina para reducir la escisión proteolítica y aumentar la semivida clínica. Puede co-administrarse también un cóctel de dos o más inhibidores de proteasas.

Las composiciones de polipéptidos de tribonectina o ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos se formulan en excipientes estándares fisiológicamente compatibles conocidos de la técnica, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato (PBS). Otras formulaciones y métodos para fabricar estas formulaciones son bien conocidas y pueden encontrarse por ejemplo, en el manual "Remington's Pharmaceutical Sciences". Las tribonectinas se formulan también con preparaciones de ácido hialurónico no reticulado o composiciones de viscosuplementación, tales como preparaciones de ácido hialurónico reticulado. Cuando se añade una tribonectina a una formulación de viscosuplemento, la interacción de la tribonectina con el ácido hialurónico reduce la viscosidad del viscosuplemento.

Los métodos de obtención de un glicopéptido y de determinación del porcentaje de glicosilación son conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describen en la patente de EE.UU. 5.767.254. La presencia de N-acetilgalactosamina es indicativa de la presencia de oligosacáridos unidos por O (o de oligosacáridos unidos por Ser/Thr), en los que GalNAc se encuentra normalmente en el enlace alfa O-glicosídico directamente unido al aminoácido. La presencia de oligosacárido unido por O se detecta también por unión a Jacalin-Sepharose, una lectina vegetal inmovilizada que se une a la secuencia del disacárido central Gal-beta-(1-3)-GalNAc unido a Ser/Thr en glicoproteínas, o la aglutinina de cacahuete, que se une al beta-(1-3)-Gal-GalNAc. Aplicando métodos estándares se distinguen los oligosacáridos unidos por O de los oligosacáridos unidos por N. Por ejemplo, los oligosacáridos que tienen un enlace O-glicosídico, pero no un enlace N-glicosídico, son susceptibles de liberarse del péptido por tratamiento con una base suave, en presencia de borohidruro sódico (NaOH 50 mM, NaBH4 1M, 16 horas a 45ºC) para causar la reacción de beta-eliminación.

Aplicaciones veterinarias

La osteoartritis canina es un trastorno clínico predominante, que se trata usando los métodos descritos en la presente memoria. Se estima que la osteoartritis afecta a uno de cada cinco perros adultos; se estima que 8 millones de perros sufren esta enfermedad degenerativa, potencialmente debilitante. Sin embargo, muchos dueños no se dan cuenta de los signos de dolor crónico de sus perros. Aunque cualquier perro puede desarrollar osteoartritis, los que corren un mayor riesgo son los perros de razas grandes, los perros geriátricos, los perros muy activos (por ejemplo, los animales empleados para el trabajo o para el deporte) y los que tienen anomalías articulares congénitas, por ejemplo la displasia de cadera o de codo.

Las enfermedades articulares degenerativas de equinos, tal como la osteoartritis, es una causa de cojera y de merma de actividad de los caballos. Al igual que en los seres humanos y otros mamíferos, las enfermedades degenerativas de las articulaciones que afectan a los caballos son trastornos progresivos de las articulaciones sinoviales, caracterizados por la degeneración del cartílago articular y la efusión de las articulaciones. El traumatismo agudo o crónico, la sobreutilización, la enfermedad del desarrollo, la inestabilidad de las articulaciones y la edad avanzada conducen a la sinovitis, al trastorno del metabolismo de los condrocitos y a la formación de fisuras en el cartílago articular. Las enzimas destructoras, tales como tripsina, elastasa, estromelisina e hialuronidasa se liberan dentro de la articulación, donde degradan el líquido sinovial y los componentes del cartílago, dando como resultado una menor viscosidad del líquido sinovial, lubricación defectuosa, disminución del metabolismo del cartílago y mayor desgaste, dando como resultado dolor y erosión del cartílago. Las propuestas terapéuticas actuales incluyen medicaciones para paliar el dolor y fármacos anti-inflamatorios. Las composiciones y métodos descritos en la presente memoria son útiles para recuperar las capacidades lubricantes de la articulación afectada.

Administración de polipéptidos terapéuticos

Se aplican los métodos estándares de administración de péptidos. Dichos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica. Para la administración intra-articular, se introduce la tribonectina en la cavidad sinovial en una concentración en el intervalo de 20-500 mg/ml en un volumen de aproximadamente 0,1-2 ml por inyección. Por ejemplo, se inyecta 1 ml de una tribonectina de una concentración de 250 mg/ml en la articulación de la rodilla empleando una aguja fina (por ejemplo, calibre 14-22, preferiblemente calibre 18-22). Las composiciones de la invención son también apropiadas para la administración parenteral, por ejemplo intravenosa, subcutánea, intramuscular e intraperitoneal.

Para impedir las adhesiones quirúrgicas, las tribonectinas descritas en la presente memoria se administran en forma de gel, espuma, fibra o tela no tejida. Una tribonectina formulada de este modo se coloca sobre o entre las interfases del tejido dañado o expuesto, con el fin de impedir la formación de adhesión entre las superficies yuxtapuestas. Para que sea eficaz, el gel o la película deben permanecer en el sitio e impedir que los tejidos entren en contacto durante un tiempo suficientemente largo para que cuando el gel finalmente se disperse y los tejidos entren en contacto, ya no tengan tendencia a adherirse. Se evalúa la capacidad de las tribonectinas formuladas para la inhibición o prevención de la formación de adhesiones (por ejemplo, en forma de membrana, tela no tejida, espuma o gel) para impedir las adhesiones pos-quirúrgicas en un modelo de abrasión cecal en ratas (Goldberg et al., en Gynecologic Surgery and Adhesion Prevention; Wiley-Liss, pp. 191-204, 1993). Las composiciones se colocan alrededor del intestino ciego de rata desgastado quirúrgicamente y se comparan con los controles no tratados (animales, cuyos intestinos ciegos estaban desgastados pero que no recibieron tratamiento). Una reducción de la cantidad de formación de adhesiones en el modelo de ratas en presencia de la formulación de tribonectina comparada con la cantidad en ausencia de tal formulación indica que la formulación es clínicamente eficaz para reducir la formación de adhesiones de tejidos.

Las tribonectinas se emplean también para revestir las extremidades y las articulaciones artificiales antes de su implantación en un mamífero. Por ejemplo, estos dispositivos se sumergen o bañan en una solución de una tribonectina, por ejemplo, como se ha descrito en las patentes de EE.UU. 5.709.020 o 5.702.456.

Los polipéptidos lubricantes tienen una longitud de al menos alrededor de 10 aminoácidos (que contienen al menos una repetición KEPAPTT (SEQ ID NO: 3) o al menos una XXTTTX (SEQ ID NO: 4)), normalmente de una longitud de alrededor de 20 aminoácidos contiguos, preferiblemente al menos 40 aminoácidos contiguos, más preferiblemente al menos 50 aminoácidos contiguos y lo más preferiblemente al menos alrededor de 60 a 80 aminoácidos contiguos. Por ejemplo, el polipéptido tiene una longitud de aproximadamente 500 aminoácidos y contiene 76 repeticiones KEPAPTT (SEQ ID NO: 3). El polipéptido tiene una longitud menor de 1404 residuos, por ejemplo, tiene la secuencia de aminoácidos del MSF de origen natural (SEQ ID NO: 1), pero carece de al menos 5, 10, 15, 20 o 24 aminoácidos del MSF de origen natural. Estos péptidos se generan por métodos conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen la escisión proteolítica de una proteína de MSF recombinante, la síntesis de novo o la ingeniería genética, por ejemplo, la clonación y la expresión de al menos los exones 6, 7, 8 y/o 9 del gen del MSF.

Los polipéptidos de tribonectina se purifican también por métodos bioquímicos. La enzima quimotripsina escinde en sitios que agrupan aminoácidos codificados por el exón 6 del gen del MSF. De este modo se obtiene un polipéptido que contiene aminoácidos codificados por el exón 6 del gen del MSF (pero no por cualesquiera otros exones del MSF) a partir de un producto génico de MSF de origen natural o producido por métodos recombinantes, mediante la digestión enzimática con quimotripsina. Después se somete el polipéptido a métodos estándares de purificación bioquímica para obtener un polipéptido sustancialmente puro, apropiado para la administración terapéutica, la evaluación de la actividad lubricante o la producción de anticuerpos.

Las composiciones terapéuticas se administran en un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, solución salina fisiológica). Los vehículos se seleccionan en función del modo o vía de administración y de la práctica farmacéutica estándar. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición terapéutica (por ejemplo, un polipéptido lubricante) es una cantidad que sea capaz de producir un resultado médicamente deseable en un animal tratado, por ejemplo, la lubricación por capa límite de una articulación de un mamífero. Un resultado médicamente deseable es la reducción del dolor (medida, por ejemplo, empleando una escala visual analógica del dolor, descrita por Peyron et al., J. Rheumatol. (supl. 39): 10-15, 1993) o una mayor capacidad de mover la articulación (medida, por ejemplo, empleando la podometría descrita por Belcher et al., J. Orthop. Trauma 11, 106-109, 1997). Otro método para medir la lubricación del líquido sinovial después del tratamiento consiste en reaspirar un pequeño volumen de líquido sinovial de la articulación afectada y analizar las propiedades lubricantes in vitro empleando un aparato de fricción que se describe más adelante en esta memoria.

Como es bien conocido en las técnicas médicas, la dosificación administrada a cualquier animal depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del animal, el área de la superficie corporal, la edad, el compuesto particular que se administra, el sexo, el tiempo y la vía de administración, el estado general de salud y otros fármacos que puedan administrarse simultáneamente. La administración es normalmente local a la articulación lesionada o inflamada. Alternativamente, los polipéptidos se administran mediante un implante de liberación retardada, colocado en la proximidad inmediata a la articulación, para que libere lentamente el fármaco en el sitio de la articulación lesionada o inflamada.

Terapia génica

La terapia génica se realiza administrando a un mamífero un ácido nucleico que codifica un polipéptido lubricante terapéutico, por ejemplo, DNA que codifica una o más repeticiones o la secuencia de aminoácidos KEPAPTT (SEQ ID NO: 3) o DNA que codifica un fragmento lubricante del MSF, empleando vectores estándares y/o sistemas de suministro de genes. Los sistemas apropiados de suministro de genes incluyen liposomas, sistemas de suministro mediados por receptores, DNA desnudo o vectores víricos, por ejemplo herpesvirus, retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados.

Además del sistema de suministro de genes recién descrito, la composición terapéutica puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un vehículo biológicamente compatible, tal como una solución salina fisiológica, idónea para la administración a un animal. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de ácido nucleico o polipéptido es una cantidad que es capaz de producir un resultado médicamente deseable en un animal tratado, por ejemplo, una reducción del dolor asociado al movimiento de la articulación o un aumento de la función lubricante del líquido sinovial.

Para la administración del compuesto puede utilizarse la vía parenteral, tal como intravenosa, subcutánea, intramuscular e intraperitoneal. Preferiblemente, las composiciones terapéuticas, tales como los ácidos nucleicos o los polipéptidos, se administran por vía intra-articular. La dosis destinada a cada paciente dependerá de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área de su superficie corporal, su edad, el compuesto concreto a administrar, el sexo, el tiempo y la vía de administración, el estado general de salud y tomando en consideración otros fármacos que se administren simultáneamente (por ejemplo, fármacos anti-inflamatorios, fármacos viscoterapéuticos). Una dosis preferida para la administración de ácidos nucleicos es de aproximadamente 106 a 1022 copias de la molécula de ácido nucleico.

El DNA se ha de introducir en las células diana del paciente por vectores estándares, por ejemplo, un vector que contenga el DNA que codifica una tribonectina unido operativamente a la secuencia de promotor. Los sistemas idóneos de suministro de genes pueden incluir liposomas, sistemas mediados por receptores, DNA desnudo y vectores víricos, tales como herpesvirus, retrovirus y adenovirus, entre otros.

El DNA puede administrarse localmente empleando sistemas de suministro de adenovirus o virus adenoasociados, aplicando métodos estándares. Por ejemplo, en la patente de EE.UU. 5.858.355 se describen métodos de administración de DNA por vía intra-articular al líquido sinovial y los métodos de administración de DNA a células del líquido sinovial (por ejemplo, fibroblastos sinoviales o condrocitos). Las únicas secuencias de acción cis requeridas para la replicación y empaquetamiento de vectores de virus recombinantes adeno-asociados (AAV) son las repeticiones AAV-terminales. Hasta 4 kb de DNA se insertan entre las repeticiones terminales sin efectuar replicación ni empaquetamiento viral. Para empaquetar un vector AAV recombinante se co-transfecta un plásmido que contenga las repeticiones terminales y el DNA que codifica un polipéptido terapéutico en las células con un plásmido que expresa las proteínas de AAV-rep y de la cápsida. Las células transfectadas se infectan luego con virus adeno-asociados y se aísla el virus AAV recombinante que contenga las secuencias deseadas de dichas células, aproximadamente 48-72 horas después de la transfección. Después se administra el virus recombinante para las aplicaciones de terapia genética, aplicando métodos conocidos.

La electroporación es otro método para la introducción ex vivo de DNA en células diana, por ejemplo, fibroblastos sinoviales o condrocitos. Las células que han de ser sometidas a electroporación se colocan en una solución salina tamponada con Hepes (HBS), a una concentración de aproximadamente 107 células por ml. El DNA que se ha de someter a electroporación se añade a una concentración de aproximadamente 5-20 microgramos/ml de HBS. La mezcla se introduce en un dispositivo de electroporación y se aplica un campo eléctrico según los protocolos estándares, por ejemplo, dentro del intervalo entre aproximadamente 250 y 300 voltios. Una vez introducido ex vivo el DNA en las células sinoviales, se vuelven a trasplantar en el donante las células sinoviales autólogas modificadas genéticamente por una inyección intra-articular. Se inyectan a las articulaciones aproximadamente 107 células por vía intra-articular en un volumen de aproximadamente 1 ml.

Las células sinoviales en las que se introduce el DNA se obtienen aplicando métodos rutinarios, por ejemplo, mediante un artroscopio. El artroscopio es una varilla hueca, pequeña, insertada en la rodilla mediante una pequeña herida punzante, que permite el acceso del instrumento quirúrgico para extraer por artroscopia las células sinoviales. En algunos casos, las células sinoviales del tejido escindido por artroscopia se extraen asépticamente por digestión enzimática de la matriz de tejido conjuntivo. Por ejemplo, se corta la membrana sinovial en trozos de aproximadamente 1 mm de diámetro y se digiere sucesivamente con tripsina (0,28 p/v en solución salina equilibrada de Gey) a 37ºC durante 30 minutos y colagenasa (0,2% p/v en solución de sal equilibrada de Gey) a 37ºC durante 2 horas. Se inyecta una suspensión de las células modificadas genéticamente en la articulación del mamífero receptor. Las inyecciones intra-articulares de este tipo son acciones rutinarias que se efectúan en la consulta del médico sin necesidad de intervención quirúrgica adicional. Si fuera necesario se efectúan inyecciones repetidas.

Alternativamente, se formula el DNA (desnudo o empaquetado en un virus) en un vehículo farmacéutico idóneo y se inyecta por vía intra-articular. La terapia génica se aplica también como medida profiláctica para prevenir el desarrollo de la osteoartritis en los individuos, que se ha detectado que son muy propensos a desarrollar esta enfermedad, por ejemplo, los que han sufrido una lesión articular aguda. La inyección intra-articular directa de un DNA que codifica un polipéptido terapéutico en una articulación da como resultado la transfección de las células sinoviales del receptor para permitir la expresión del DNA.

Los fármacos que estimulan un promotor endógeno de tribonectina, por ejemplo, TGF-beta, pueden administrarse también del modo antes descrito para aumentar el nivel de expresión sinovial.

Producción de anticuerpos específicos de polipéptidos lubricantes sinoviales

Los anticuerpos específicos para polipéptidos lubricantes se obtienen por métodos muy conocidos en la técnica. Tales anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse, por ejemplo, por los métodos descritos en Ghose et al., Methods in Enzymology, vol. 93, 326-327, 1983. Por ejemplo, se emplea un polipéptido lubricante codificado por los nucleótidos 632-3453 de la SEQ ID NO: 2 como inmunógeno para estimular la producción de anticuerpos policlonales en los antisueros de un conejo. Pueden aplicarse métodos similares para generar antisueros en animales, tales como cabras, ovejas y roedores.

Los anticuerpos monoclonales se obtienen por procesos bien conocidos, descritos por Milstein y Kohler en Nature 256, 495-497, 1975, o modificados por Gerhard, Monoclonal Antibodies, Plenum Press, páginas 370-371, 1980. Se criban hibridomas para identificar los que producen anticuerpos que sean altamente específicos de un polipéptido lubricante sinovial. Preferiblemente, el anticuerpo tiene una afinidad de al menos aproximadamente 108 litros/mol y más preferiblemente una afinidad de al menos aproximadamente 109 litros/mol. Los anticuerpos monoclonales o policlonales proporcionan un medio para purificar rápidamente grandes cantidades de polipéptidos recombinantes lubricantes.

Además de los anticuerpos que se dirigen al núcleo peptídico de una tribonectina, es deseable también un anticuerpo dirigido a una porción de azúcar o a un complejo glicopéptido de una tribonectina. Para generar un anticuerpo para el núcleo peptídico se emplea un péptido que abarque los aminoácidos 200-350 de la SEQ ID NO:

1. Para generar tales anticuerpos se emplean también péptidos más cortos, por ejemplo, de una longitud de 8-15 aminoácidos, que sean idénticos a la porción de 8-15 aminoácidos de los aminoácidos 200-350 de la SEQ ID NO: 1. Otros péptidos para utilizar como inmunógenos para los anticuerpos específicos para el núcleo peptídico de una tribonectina, incluyen los que están en la región de los aminoácidos 24-66 de la SEQ ID NO: 1, los aminoácidos 105155 de la SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos 156-199 de la SEQ ID NO: 1. Para generar anticuerpos que se unan a un polipéptido de tribonectina glicosilada (pero no sobre la forma desglicosilada o no glicosilada), el inmunógeno es preferiblemente un glicopéptido, cuya secuencia de aminoácidos abarca una porción altamente glicosilada de una tribonectina, por ejemplo, un péptido con una secuencia de aminoácidos de los residuos 200-1140 de la SEQ ID NO:

1. También se emplean como inmunógenos glicopéptidos más cortos, por ejemplo, de una longitud de 8-15 aminoácidos, de la misma región altamente glicosilada. Los métodos para generar los anticuerpos contra biomoléculas altamente glicosiladas son conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe por Schneerson et al., J. Exp. Med. 152: 361-376, 1980.

Métodos de diagnóstico

La osteoartritis es una enfermedad que se desarrolla lentamente y es difícil de diagnosticar hasta que alcanza sus últimos estadios, cuando el dolor articular suele compeler al individuo a recurrir al tratamiento médico. El diagnóstico temprano de la osteoartritis o la predisposición a desarrollar esta enfermedad permite una intervención temprana para prevenir o reducir el desarrollo de la osteoartritis avanzada. La invención proporciona métodos para la detección precoz de esta enfermedad o la predisposición a desarrollarla mediante el análisis de líquidos corporales, tales como suero u orina, para determinar la presencia de fragmentos de tribonectinas de origen natural o la presencia de fragmentos del MSF. La detección y cuantificación de estos péptidos en líquidos biológicos es muy conocida en la técnica. Por ejemplo, se realiza un ensayo ELISA sándwich estándar empleando dos anticuerpos diferentes (por ejemplo, un primer anticuerpo que se une a la porción de oligosacárido del glicopéptido y un segundo anticuerpo que se une al núcleo peptídico del glicopéptido) dirigidos contra una tribonectina de origen natural. Alternativamente, se emplea la secuenciación estándar de proteínas por cromatografía de líquidos y espectroscopía de masas, del modo descrito más adelante, para detectar los fragmentos del MSF en muestras biológicas. Un valor de control es un valor predeterminado, asociado con un diagnóstico negativo; alternativamente, una muestra de control es una muestra biológica de un mamífero del que se sabe que no padece osteoartritis. Un aumento en la cantidad, comparada con 30 veces el valor o muestra de control indica que el animal sufre osteoartritis o está predispuesto a desarrollar osteoartritis.

Caracterización de una tribonectina de líquido sinovial humano

Se recogieron partes alícuotas de líquido sinovial de pacientes sometidos a artroscopia de diagnóstico y reemplazo total de la rodilla y se ensayaron en el aparato de fricción. En ambos casos se aspiró el líquido sinovial antes de iniciar cualquier procedimiento quirúrgico y se centrifugó inmediatamente a 10.000 x g a 4ºC durante 2 h para eliminar los residuos celulares. Se desecharon las muestras que estaban contaminadas con sangre. Las partes alícuotas de capacidad lubricante normal se reunieron y se conservaron a -20ºC.

Purificación y aislamiento de una tribonectina

Se filtró líquido sinovial humano (200 ml) por unidades de filtración estériles de 0,22 micrómetros (Nalgene) a 4ºC durante dos días. Se rascó de las membranas de filtración el material retenido y se puso en suspensión de nuevo en un tampón de NaAc 50 mM, pH 5,5, hasta un volumen original del líquido sinovial que contenía inhibidores proteolíticos: fluoruro de fenilmetil-sulfonilo (PMSF) 1 mM, ácido paracloromercúrico-benzoico (PCMB) 1 mM y etilenodiamino-tetraacetato (EDTA) 10 mM. La digestión del ácido hialurónico se realizó a 37ºC con hialuronidasa de estreptomices en 1 U/ml de líquido sinovial resuspendido. El material digerido se cargó en una columna de DEAE (Whatman International, Maidstone, UK), con un volumen sedimentado de 300 ml, equilibrada con tampón NaAc 50 mM y se lavó con 1,5 litros del mismo tampón. El material con actividad lubricante se eluyó de la matriz de DEAE con NaCl 1M. Se recogió 1 litro de líquido de lavado y se concentró mediante una celdilla de flujo Amicon de 500 ml con una membrana XM-100 (límite de exclusión de peso molecular: 100 kDa). La muestra concentrada se dializó contra un tampón de fosfato 25 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 0,15 M y CaCl2 0,5 mM

El material concentrado unido a DEAE se cargó en una columna de afinidad de aglutinina de cacahuete (PNA)agarosa, con un tamaño de lecho sedimentado de 25 ml, equilibrada a temperatura ambiente con tampón de fosfato 25 mM y NaCl 0,15 M, pH 7,4. La proteína no unida se eluyó con el mismo tampón hasta que la absorbancia a 230 y 280 nm descendió hasta la línea base. El material con actividad lubricante se eluyó al máximo en presencia de un gradiente escalonado de a-lactosa a una concentración de 0,07 M en Tris 25 mM y NaCl 0,15 M, a pH 7,4. Este material se cargó en una columna de Actigel ALD-agarosa (Sterogene Bioseparations, Arcadia, CA) acoplado a través de los grupos amino al anticuerpo monoclonal de múridos contra la fibronectina humana (Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA) para eliminar la fibronectina como contaminante. Se analizó la pureza del material eluido por SDS-PAGE (acrilamida al 5-15%) teñido con azul Coomassie y por HPLC.

Los patrones de electroforesis de proteína fueron de GibcoBRL (Grand Island, NY) y el patrón de escalera de DNA fue de FMC Bioproducts (Rockland, ME).

Cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC)

Una columna Bondpak C18 de 3,9 x 150 mm (Waters, Milford, MA) se eluyó en fase inversa con metanol al 45% (v/v) (Sigma) y acetonitrilo al 5% (v/v) (Aldrich) de calidad HPLC, a 1 ml/min a 35ºC. El eluato se analizó en un detector de matriz de fotodiodos PDA 996 (Waters) y se analizaron las fracciones de los picos para determinar el material con gráficos de pureza calculados con el programa informático Millenium 32 (Waters).

Aparato de fricción

Se empleó un aparato de fricción estándar (por ejemplo, un aparato descrito por Jay et al., Conn. Tiss. Res. 28: 7188, 1992, o Jay et al., J. Biomed. Mater. Res. 40: 414-418, 1998) para medir la actividad lubricante. Se hace oscilar látex natural contra un anillo de vidrio pulido, con una superficie de contacto constante de 1,59 cm2. El sistema de apoyo se cargó axialmente dentro de un sistema de articulaciones cardán, libre para girar alrededor de dos ejes horizontales perpendiculares. Se eligieron el látex y el vidrio como materiales de apoyo porque presentaban una superficie plana con poca altura de asperezas, del orden de 0,05 mm. El látex, al igual que el cartílago es adaptable. Dentro del sistema de cardanes, estas superficies poseen una co-planaridad casi perfecta. Por tanto, no se generaron cuñas de líquido y solamente estaba presente una capa fina de líquido en el límite. La velocidad de arrastre (es decir, la velocidad de deslizamiento) fue 0,37 mm/s, con una presión de contacto constante de 0,35 x 106 N/m2.

El aparato de fricción registró desplazamientos del sistema de cardanes alrededor del eje vertical de carga a través de un transductor de tensión por desplazamiento lineal, cuyo voltaje de salida era directamente proporcional a la magnitud del par de fricción. La amplitud entre picos de esta señal se relacionó con evio con

1 por un calibrado pr pares de fricción conocidos.

Se limpiaron a fondo las superficies de ensayo antes de utilizarlas. Se lavó una pieza de 3,8 x 3,8 cm de látex, fijada sobre un vástago de acero inoxidable, con una corriente de agua desionizada destilada (DDW) durante 2 min. Después se colocó en un baño poco profundo de solución salina fisiológica (PS) con NaCl al 0,9%. El portaobjetos de vidrio se lavó por burbujeo 7 veces con una solución de detergente al 1% (v/v) (Flow Laboratories, McLean, VA) en DDW durante 10 minutos y se dejó impregnar en la misma solución a 100ºC. También se realizó 7 veces un lavado por burbujeo de 5 minutos con la solución caliente y un posterior enjuagado durante 2-4 minutos en una corriente de DDW.

Se midió el valor de 1 a 35ºC, pero antes se realizó una medición en la línea base del 1 c on la PS. La lubricación se manifestó por una reducción del 1 con respecto al 1 de la PS. Los valores de delta negativos indican lubricaci

ón, mientras que los valores positivos indican fricción. La adición de 200 μl de PS y después 200 μl del lubricante de ensayo se realizaron colocando las superficies de apoyo en una proximidad suficiente para que la solución humectara las dos superficies. Después de 5 minutos de equilibrado, se dejó descansar el apoyo revestido con látex sobre el vidrio, de modo que oscilara. Los voltajes entre picos se registraron automáticamente después de 1, 3 y 5 minutos. Luego se separaron las superficies durante 2 minutos y se volvieron a poner en contacto para otra sesión de 5 minutos. Los valores 1 de 3 y de 5 minutos de las dos

últimas sesiones de 5 minutos se estabilizaron típicamente y se registraron.

La fibronectina de suero humano se adquirió a Sigma Chemical (F0895, St. Louis, MO) y se dializó frente a una PS antes de ser utilizada en el aparato de fricción.

Los lubricantes por capa límite ejercen su efecto cambiando las características físico-químicas de la superficie. Las superficies de apoyo tienen que generar una repulsión muta para ser lubricadas en el modo de capa límite. Los ejemplos típicos de lubricantes por capa límite a temperatura ambiente son grafito, teflón y sulfuro de molibdeno. Estas composiciones reducen la fricción entre las superficies de apoyo y por ello se emplean como controles positivos en el ensayo para medir las propiedades lubricantes de las tribonectinas. Las tribonectinas son lubricantes por capa límite que pueden tener un carácter anfipático revistiendo superficies hidrófobas no biológicas, tales como látex. El componente oligosacárido de una tribonectina se entrelaza con el entorno acuoso circundante. Cuando se eliminan los azúcares último y penúltimo de una tribonectina de origen natural purificada a partir de líquido sinovial, se elimina la capacidad lubricante.

El artrotripsómetro de látex:vidrio ofrece una vía directa para analizar repetidamente los factores lubricantes biológicos purificados con reproducibilidad. El látex natural y el vidrio pulido son superficies de apoyo con poca variación, o quizás ninguna, en las características físico-químicas de un ensayo a otro. En cambio, un cartílago resecado apoyado sobre vidrio pulido o cartílago experimentará una deformación, que no puede controlarse con precisión. El valor 1 observado en un apoyo de cartílago-cartílago lubricado por líquido sinovial estaba entre 0,005 y 0,024. Los valores de 1 del sistema látex:vidrio fueron considerablemente más elevados y estaban por ejemplo en 0,04 o menos. Las diferencias de los 1 entre los materiales de apoyo se atribuyen al contenido de agua del 80% (p/p) del cartílago.

Secuenciación de proteínas por cromatografía de líquidos y espectrometría de masas (LCMS)

El análisis por LCMS estándar se realizó con materiales digeridos trípticos del material lubricante purificado descrito anteriormente. Se analizaron bandas escindidas de geles de SDS-PAGE de 2 mm de espesor y gradiente 5-20% (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA) que contenían el material lubricante. Se desglicosiló el material por NaNasa III y O-glicosidasa DS (Glyko, Novato; CA). Se efectuó la desglicosilación con las enzimas anteriores de actividades de 0,17 U/ml y 0,10 U/ml, respectivamente, durante 18 horas en presencia de 0,5 mg/ml de una tribonectina purificada de líquido sinovial. En todos los casos, las rebanadas de gel se cortaron por el centro de la banda y tenían un volumen de 16 mm3. Todas las superficies de contacto se limpiaron cuidadosamente con acetonitrilo al 50% (v/v). Los datos de secuencia se introdujeron en el algoritmo de búsqueda BLAST GENBANK® y se identificaron las coincidencias.

Aislamiento y cultivo de fibroblastos sinoviales humanos

Se obtuvo membrana sinovial humana de aspecto normal de un varón blanco de 30 años, sometido a artroscopia. 1 hora después de la cirugía se lavó tres veces el explante de tejido sinovial con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, exenta de calcio y de magnesio (GIBCO). Se introdujeron piezas de 2 mm3 de volumen en

5 medio Dulbecco modificado por Eagle (GIBCO), suplementado con 100 U de penicilina y 100 μg de estreptomicina por ml (GIBCO), que contenía 4 mg/ml de clostridio-peptidasa A (Worthington Biochemical CLS, 125-200 U/mg) esterilizada a través de un filtro de 0,22 μm (Nalgene). Los fragmentos de tejido se cortaron con tijeras adicionalmente en una cápsula Petri de plástico de 100 mm (Falcon) y se incubaron en 20 ml de medio a 37ºC durante 4 horas en una atmósfera húmeda que contenía 5% de dióxido de carbono y 95% de aire.

10 Se mezcló bien el material digerido varias veces por aspiración S y expulsión desde una pipeta Pasteur. Se añadieron un volumen igual de tripsina al 0,05% y EDTA al 0,02% en solución salina A modificada de Puck (GIBCO) y se continuó la incubación durante una hora más en las mismas condiciones. Se centrifugó la suspensión a 400 x g a 23ºC durante 10 minutos y se lavó tres veces con 40 ml de solución salina tamponada con fosfato, exenta de calcio y de magnesio, cada vez. Se puso en suspensión el sedimento en medio modificado de Eagle (20 ml)

15 suplementado con suero fetal bovino al 10% (Flow Laboratories), 100 U de penicilina y 100 mg de estreptomicina por ml. Se cultivaron en placa dos mililitros de esta mezcla final por cápsula de Petri de plástico de 60 mm (Falcon). Se cultivaron los fibroblastos sinoviales hasta confluencia y se recolectaron las células. Se cultivaron también fibroblastos de piel humana (American Type Culture Collection (ATCC), denominación: CCD-10995K; ATCC, Mannassas, VA) que sirvieron de control y se recolectaron del modo descrito anteriormente.

20 Extracción de RNA y análisis por RT-PCR

El RNA de fibroblastos sinoviales y cutáneos se purificó en mini-columnas y reactivos RNeasy (Qiagen, Crawley, Ltd., UK). Se eliminó el DNA genómico contaminante por DNAshredder y DNasa (libre de RNasa) (Qiagen). Se sintetizó el cDNA de la primera cadena por transcripción inversa y amplificación por PCR empleando los siguientes cebadores oligonucleotídicos. Cebador delantero del Exón 6 de MSF: 5'-CCAAACCACCAGTTGTAGATGAAGC-3' 25 (SEQ ID NO: 15) y cebador inverso del exón 6 de MSF: 5'-GCGGAAGTAGTCTTCTCTTTTCCATCAG-3' (SEQ ID NO: 16). Estos cebadores corresponden a los números de las posiciones de nucleótidos 674-698 y 953-926, respectivamente, del gen del MSF humano (SEQ ID NO: 2; GENBANK®; número de acceso: U70136). Las condiciones de los ciclos térmicos fueron: 42ºC durante 12 minutos, 95ºC durante 10 minutos, después 43 ciclos entre 94ºC x 20 segundos y 55-65ºC x 30-90 segundos. Se realizó una extensión final a 72ºC durante 7 minutos

30 (Perkin Elmer Biosystems).

Una variante alternativa de empalme del MSF es una tribonectina

Se purificó un polipéptido lubricante de líquido sinovial humano aplicando métodos bioquímicos estándares seguido por cromatografía de afinidad con aglutinina de cacahuete. La fracción final, la única que poseía capacidad lubricante, contenía un producto de peso molecular aparente de 280 kDa. No se observaron componentes de un 35 peso molecular aparente superior a 280 kDa. El análisis por LCMS realizado en fragmentos trípticos de la banda escindida de 280 kDa indicó la presencia de dos proteínas diferentes que, en el algoritmo de búsqueda BLAST, coincidían con el precursor de la fibronectina y con el MSF (GENBANKTM, nº de acceso: U70136). Las secuencias de MSF se identificaron tanto en polipéptidos lubricantes naturales como en desglicosilados. Por consiguiente, el esquema de purificación se terminó con una columna anti-fibronectina que dio como resultado la eliminación de la 40 fibronectina como impureza (ensayos realizados por HPLC analítica en columna C18 y análisis con gráfico de pureza). Además, las bandas más bajas de peso molecular aparente de 70 y 160 kDA determinados por SDS-PAGE estaban ausentes en la preparación de tribonectina purificada que eluía de la columna de anti-fibronectina. Se analizó la tribonectina purificada en el aparato de fricción y se encontró que presentaba una actividad lubricante por capa límite similar a la del líquido sinovial completo (Tabla 5). En cambio, la tribonectina de suero purificada produjo

45 fricción, lo cual indicaba que la capacidad lubricante del líquido sinovial estaba mediada por la tribonectina purificada.

TABLA 5: Coeficientes de fricción para una tribonectina purificada de líquido sinovial humano y para una fibronectina (Valor medio ± desviación típica; N = 3)

LUBRICANTE*: (PS**)

Tribonectina: 0,047 ± 0,006 0,131 ± 0,007 -0,084 ± 0,004

HSF†: 0,040 ± 0,005 0,135 ± 0,009 -0,095 ± 0,011

Fibronectina: 0,181 0,136 + 0,045 ± 0,005

*Analizado a una concentración de 250 μg/ml en PS ** Solución salina fisiológica † Líquido sinovial humano post-mortem

50 Además, con el análisis LCMS de fragmentos trípticos se identificaron porciones de los exones 6 a 9 del MSF, ambos inclusive. La tribonectina purificada reaccionó con la aglutinina de cacahuete, lo cual indicaba la presencia de oligosacáridos beta(1-3)Gal-GalNAC en virtud de su purificación. Se observó un aumento de la movilidad electroforética después de la digestión con la NaNasa III y la O-glicosidasa DS, lo cual indicó que la tribonectina purificada estaba muy glicosilada por los oligosácaridos unidos por O. El peso molecular aparente de la tribonectina desglicosilada purificada de líquido sinovial fue 120 kDa.

El análisis por RT-PCR se completó empleando cebadores específicos para las secuencias de nucleótidos que codifican el extremo N-terminal del exón 6 del MSF. Las RT-PCR que empleaban RNA de fibroblasto sinovial humano generaron un producto de 280 pb, la distancia prevista entre los cebadores diseñados. Los experimentos similares sin transcriptasa inversa no generaron este producto, lo cual indicaba que el RNA estaba libre de DNA genómico. El RNA purificado de fibroblastos cutáneos no produjo ningún producto empleando los mismos cebadores.

En primer lugar se aisló el MSF de monocitos humanos; se encontró que un fragmento de MSF de 25 kDa estimulaba el desarrollo de megacariocitos. La proteína precursora de MSF tiene un tamaño de 1404 residuos y se construyó con 12 exones. Parece que el exón 6 codifica una mucina situada en posición central, que tiene una longitud de 940 residuos. El exón 6 es homólogo a la vitronectina, los exones 2 y 3 parecen homólogos a las regiones similares a la somatomedina B y los exones 8 y 9 son similares a las regiones de vitronectina similares a la hemopexina. La hemopexina es una proteína eliminadora del grupo hemo del suero que interacciona con el hialuronato.

Una tribonectina purificada del líquido sinovial y una proteína de zona superficial (SZP) purificada de cartílago articular comparten identidad de secuencias con el MSF, pero difieren en sus pesos moleculares aparentes y secuencias de aminoácidos.

Ejemplo 1: Expresión del gen de MSF por fibroblastos sinoviales humanos

Se encontró que una tribonectina de origen natural era expresada por fibroblastos sinoviales humanos de un gen que codifica el MSF. Algunos, pero no todos, los exones del gen del MSF están representados en el producto génico de la tribonectina. Por ejemplo, la tribonectina contiene secuencias codificadas por los exones 6-9 del gen del MSF, pero carece de las secuencias codificadas por al menos un exón del gen de MSF de origen natural.

La expresión del gen de MSF se evaluó del modo siguiente. Se digirieron con tripsina rebanadas de gel de una banda de pesos moleculares aparentes de 240 kDA de la tribonectina purificada a partir de líquidos sinoviales humanos reunidos, con capacidad lubricante normal. La secuenciación N-terminal de los fragmentos trípticos se realizó por cromatografía de líquidos y espectrometría de masas y los resultados se compararon con secuencias conocidas del GenBankTM. Se empleó la digestión de la tribonectina purificada con O-glicosidasa DS y NaNasa III para indicar el peso molecular de la proteína del núcleo. Se analizó la capacidad lubricante con un aparato de fricción estándar que hace oscilar látex natural contra un anillo de vidrio pulido.

Dos especies de proteínas identificadas previamente estaban presentes en la fracción lubricante final del líquido sinovial humano. Se identificaron tanto los fragmentos trípticos del precursor de fibronectina (FN) como del factor estimulador de megacariocitos (MSF). Se observó una coincidencia del 100% (intervalo de valores E 0,31-0,047) con secuencias de MSF específicas de los exones 6 a 9. El MSF tiene un tamaño de 1104 aminoácidos con dominios funcionales múltiples similares a la vitronectina. Esta tribonectina redujo el coeficiente de fricción (10 de 0,142 a 0,036, mientras que la fibronectina de suero purificada generó unntero e

1 de 0,136 a 0,181. Los cebadores dela inverso para la RT-PCR correspondientes a las posiciones de aminoácidos 214-222 y 300-309 de la SEQ ID NO: 1 se emplearon para sondar el mRNA purificado de fibroblastos sinoviales humanos cultivados in vitro. Se observó un producto génico de 280 pb que era concordante con la secuencia de aminoácidos prevista. Los datos descritos en la presente memoria indican que una tribonectina de origen natural es secretada por los fibroblastos sinoviales mediante la expresión del gen del MSF.

Los métodos descritos a continuación se emplearon para caracterizar un componente lubricante del líquido sinovial.

Recogida de líquido sinovial humano

Se recogieron partes alícuotas de líquido sinovial de pacientes sometidos a una artroscopia de diagnóstico o a una sustitución completa de la rodilla y se analizaron en el aparato de fricción. En ambos casos, se aspiró el líquido sinovial antes de iniciar cualquier intervención quirúrgica e inmediatamente después se centrifugó a 10.000 x g a 4ºC durante 2 horas para eliminar los residuos celulares. Se descartaron las muestras que estaban sumamente contaminadas con sangre. Se reunieron las partes alícuotas con capacidad lubricante normal y se conservaron a 20ºC.

Purificación y aislamiento de tribonectina humana

Se filtraron 200 ml de líquido sinovial humano por unidades filtrantes estériles de 0,221m (Nalgene0 a 4ºC durante dos días. Se rascó el material retenido en las membranas filtrantes y se puso de nuevo en suspensión con tampón NaAc 50 mM, pH 5,5, hasta el volumen original del líquido sinovial. El tampón de la re-suspensión contenía los inhibidores proteolíticos: PMSF 1 mM, PCMB 1 mM y EDTA 10 mM. Se realizó la digestión del ácido hialurónico a 37ºC con hialuronidasa de estreptomices a una concentración de 1 U/ml de líquido sinovial re-suspendido. Se cargó el material digerido en una columna de DEAE (Whatman International, Maidstone, UK) de volumen sedimentado de 300 ml, equilibrada con tampón NaAc 50 mM y se lavó con 1,5 litros del mismo tampón. Se eluyó el material deseado de la matriz de DEAE con NaCl 1M. Se recogió 1 litro de líquido de lavado y se concentró en una celdilla de flujo Amicon de 500 ml con una membrana XM-100 (límite de exclusión de peso molecular = 100 kDa). Se dializó la muestra concentrada frente a un tampón fosfato 25 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 0,15 M y CaCl2 0,5 mM.

El material concentrado unido a DEAE, se cargó en una columna de afinidad de aglutinina de cacahuete (PNA)agarosa con un volumen de lecho sedimentado de 25 ml, equilibrada a temperatura ambiente con tampón fosfato 25 mM y NaCl 0,15 M, pH 7,4. La proteína no unida se eluyó con el mismo tampón hasta que la absorbancia a 230 y 280 nm disminuyó hasta la línea base. Se eluyó el máximo del material deseado en presencia de un gradiente escalonado de a-lactosa a una concentración de 0,07 M en Tris 25 mM y NaCl 0,15 M, a pH 7,4. La tribonectina prepurificada se cargó en la columna de Actigel ALD-agarosa (Sterogene Bioseparations, Arcadia, CA) acoplada a través de los grupos amino a un anticuerpo monoclonal de múridos contra la fibronectina humana (Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA). Se analizó el material eluido en SDS-PAGE al 5-15%, teñido con azul Coomassie y por HPLC.

Cromatografía de líquidos a alta presión

Se eluyó una columna 1Bondapa k C18 de 3,9 x 150 mm (Waters, Milford, MA) en fase inversa con metanol al 45% (v/v) (Sigma) y acetonitrilo al 5% (v/v) (Aldrich) de calidad HPLC, a 1 ml/min a 35ºC. Se analizó el eluato por un detector PDA 996 de matriz de fotodiodos (Waters) y se determinó la pureza de los picos de la gráfica con el programa informático Millenium 32 (Waters).

Aparato de fricción

Se empleó un aparato de fricción estándar para medir la actividad lubricante tal como se ha descrito antes.

Se midió el valor de 1 a 35ºC y esta medición fue precedida por una medición en la línea base del

1 con PS. La lubricación se manifestó por una reducción de

1 con respecto al 1 de la PS. Los valores L1 negativos indican lubricación, mientras que los valores positivos indican fricción. Se efectuó la adición de 200 μl de PS y después 200 μl del lubricante de ensayo, a continuación se pusieron en contacto las superficies de apoyo hasta una proximidad suficiente, de modo que la solución humectara las dos superficies. Pasados 5 minutos de equilibrado, se dejó descansar el apoyo revestido de látex sobre el vidrio mientras estaba oscilando. Después de 1, 3 y 5 minutos se registraron automáticamente los voltajes entre picos. Entonces se separaron las superficies durante 2 minutos y se volvieron a poner en contacto para otra sesión de 5 minutos. Se estabilizaron los valores de 1 de 3 y de 5 minutos de las dos últimas sesiones de 5 minutos y se registraron.

LCMS

La LCMS de los materiales digeridos trípticos se efectuó del modo antes descrito. Se escindieron bandas de 2 mm de espesor de geles SDS-PAGE de un gradiente 5-20% (Bio-rad Laboratories, Hercules, CA) para otros análisis. Se efectuó la desglicosilación empleando la NaNasa III y la O-glicosidasa DS (Glyko, Novato, CA) (en concentraciones de 0,17 U/ml y 0,10 U/ml, respectivamente), durante 6 horas, en presencia de 0,5 mg/ml de proteína. En todos los casos se cortaron rebanadas de gel por el centro de la banda y tenían un volumen de 16 mm3. Todas las superficies de contacto se limpiaron cuidadosamente con acetonitrilo al 50% (v/v). Los datos de las secuencias se introdujeron en el algoritmo de búsqueda BLAST GenBankTM y se identificaron las coincidencias.

Extracción de RNA y análisis por RT-PCR

Se purificó el RNA de fibroblastos sinoviales y cutáneos en mini-columnas y reactivos RNeasy (Qiagen, Crawley, Ltd., UK). Se eliminó el DNA genómico contaminante por DNAshredder y DNasa (libre de RNasa) (Qiagen). Se sintetizó el cDNA de la primera cadena por transcripción inversa y amplificación por PCR empleando los siguientes cebadores oligonucleotídicos (las posiciones relativas en los cebadores específicos del MSF se representan en la figura 1): cebador delantero del exón 6 de MSF: 5'-CCAAACCACCAGTTGTAGATGAAGC-3' (SEQ ID NO: 15) y cebador inverso del exón 6 de MSF: 5'-GCGGAAGTAGTCTTCTCTTTTCCATCAG-3' (SEQ ID NO: 16). Estos cebadores corresponden a los números de posiciones de nucleótidos 674-698 y 953-926, respectivamente, de GENBANK®; número de acceso: U70136 (MSF humano). Las condiciones de los ciclos térmicos fueron: 42ºC durante 12 minutos, 95ºC durante 10 minutos, después 43 ciclos entre 94ºC x 20 segundos y 55-65ºC x 30-90 segundos. La extensión final se realizó a 72ºC durante 7 minutos (Perkin Elmer Biosystems).

Reactivos diversos

Se adquirió fibronectina de suero humano a Sigma Chemical (F0895, St. Louis, MO) y se dializó frente a PS antes de utilizarla en el aparato de fricción. Los patrones de electroforesis de proteínas fueron de GibcoBRL (Grand Island, NY) y el patrón de escalera de DNA fue de FMC Bioproducts (Rockland, ME).

Se purificó una tribonectina de líquido sinovial humano. La fracción final, la única que poseía capacidad lubricante, contenía principalmente un producto de peso molecular aparente de 280 kDa. Esta fracción contenía además una cantidad secundaria de componentes de bajo peso molecular, que se eliminaron en la etapa final de purificación basada en anticuerpos. No se observaron componentes de un peso molecular superior a 280 kDa. El análisis por 5 LCMS realizado en fragmentos trípticos de la banda escindida de 280 kDa indicó la presencia de dos proteínas diferentes que, en el algoritmo de búsqueda BLAST, coincidían con el precursor de fibronectina y con el MSF (GENBANKTM, nº de acceso: U70136). Las secuencias de MSF se identificaron tanto en la tribonectina natural como en la desglicosilada. Por consiguiente, el esquema de purificación se terminó en una columna anti-fibronectina que produjo la casi eliminación de la fibronectina como impureza sobre la base de análisis realizados por HPLC analítica

10 en columna C18 y análisis por gráfico de pureza. Además, las bandas secundarias de peso molecular bajo de 70 y 160 kDA por SDS-PAGE estuvieron ausentes en la preparación purificada que eluye de la columna de antifibronectina. Se analizó la tribonectina purificada en el aparato de fricción y se encontró que tenía una actividad lubricante por capa límite similar a la del líquido sinovial completo (Tabla 6).

TABLA 6: Coeficientes de fricción para una tribonectina humana y fibronectina

LUBRICANTE†: (PS*)

Tribonectina: 0,035 0,142 -0,106

Fibronectina: 0,181 0,136 +0,045

* Solución salina fisiológica † Analizado a una concentración de 250 μg/ml en PS

En cambio, la fibronectina de suero purificada generó fricción, lo cual indicó que la capacidad lubricante del líquido sinovial estaba mediada por tribonectina.

El análisis por LCMS de fragmentos trípticos identificó correctamente porciones de los exones 6 a 9 del MSF, ambos inclusive. Se encontraron fragmentos codificados por las secuencias de ácido nucleico al comienzo y al final del

20 exón 6. La tribonectina reaccionó con la PNA, lo cual indicó la presencia de oligosacáridos �(1 -3)Gal-GalNAc en virtud de su purificación. Hubo además un aumento muy significativo de la movilidad electroforética después de la digestión con la NaNasa III y la O-glicosidasa DS, lo cual indicó que la tribonectina purificada está altamente glicosilada por los oligosácaridos unidos por O. El peso molecular aparente de la tribonectina desglicosilada fue 120 kDa.

25 El análisis por RT-PCR se completó empleando cebadores específicos de las secuencias de nucleótidos que codifican el extremo N-terminal del exón 6 del MSF. Las RT-PCR que emplearon RNA de fibroblastos sinoviales humanos generaron un producto de 280 pb, la distancia prevista entre los cebadores diseñados. Los experimentos similares sin transcriptasa inversa no generaron este producto, lo cual indicó que el RNA estaba libre de DNA genómico. El RNA purificado de fibroblastos cutáneos no produjo ningún producto empleando los mismos

30 cebadores.

Los datos descritos en la presente memoria indican que los exones del gen de MSF se empalman alternativamente para que expresen los polipéptidos lubricantes en las articulaciones sinoviales. Los fibroblastos sinoviales son una de las fuentes de tales tribonectinas en las articulaciones. Una tribonectina aislada de origen natural descrita en la presente memoria (Masa molecular relativa (Mr) � 280 kDa) y la SZP (Mr � 345 kDa) son moléculas diferentes 35 porque sus pesos moleculares aparentes difieren en 65 kDa. Es posible que el MSF sea un precursor de ambas moléculas en virtud de una expresión diferente de los exones del MSF por dos líneas celulares independientes, que pueblan la cavidad sinovial. La secuenciación repetitiva por LCMS de materiales digeridos trípticos no identificó ninguno de los exones que abarcan desde el exón 6 al exón 9 del MSF. Se encontró que una tribonectina de origen natural purificada a partir de ternera bovina tenía el mismo peso molecular que la tribonectina purificada de fuentes

40 humanas.

Los lubricantes por capa límite ejercen su efecto cambiando las características físico-químicas de una superficie. Las superficies de apoyo tienen que generar una repulsión mutua para lubricarse en el modo de capa límite. Los ejemplos típicos de lubricantes por capa límite a temperatura ambiente son grafito, teflón y sulfuro de molibdeno. Las tribonectinas parecen tener un carácter anfipático revistiendo superficies hidrófobas no biológicas, tales como látex. 45 Las glicosilaciones amplias son importantes para interconectar con el entorno acuoso circundante. Cuando se eliminan los azúcares último y penúltimo se elimina la capacidad lubricante. La posibilidad del hialuronato de unirse a SZP o a una tribonectina por la proteína expresada por el exón 9 sugiere un mecanismo, según el cual el hialuronato desempeña un papel en el líquido sinovial. Un polímero de hialuronato puede servir para unir muchas moléculas de SZP o de tribonectina en una relación de lado a lado en tándem, distribuyéndose de este modo los

50 esfuerzos de cizallamiento y estabilizando las moléculas lubricantes.

La estructura primaria del precursor del MSF (productos génicos de empalme alternativo, tales como las tribonectinas) es diferente de la de MG2, estaterina y glicoproteína rica en prolina, que se encuentran en la saliva y lubrican los apoyos dentales. Solamente se analizó la MG2 en el presente apoyo de látex:vidrio y se encontró que lubricaba tan eficazmente como una tribonectina. Ambas glicoproteínas comparten el mismo resto �(1 -3)Gal-GalNAc unido por O. Estos datos indican que el resto �(1-3)Gal-GalNAc unido por O es importante para la actividad de lubricación por capa límite.

Los experimentos de digestión enzimática indican que la lubricación por capa límite con el líquido sinovial es altamente sensible a la tripsina. Estos experimentos demostraron que la eliminación de la capacidad lubricante por las fosfolipasas (contaminadas con cantidades muy pequeñas de proteasas similares a tripsina) podría ser eliminada por la co-incubación con los inhibidores de proteasas, leupeptina y aprotinina. La lisina y la arginina comprenden 13,5% y 1,3%, respectivamente, del producto del exón 6, en el que se basa la observación de la sensibilidad a la tripsina, incluso cuando es esta misma región de la tribonectina la que está ampliamente glicosilada y, por ello, podría impedir la proteólisis. Es probable que incluso los estados inflamatorios secundarios, que producen tripsina o elastasa, tengan efectos nocivos sobre la capacidad lubricante de las tribonectinas de origen natural. Los apoyos cartilaginosos no lubricados pueden experimentar un desgaste prematuro que pueden iniciar la osteoartritis. Estos estados patológicos se tratan con polipéptidos lubricantes, es decir, las tribonectinas descritas en la presente memoria.

Ejemplo 2: Homología de una tribonectina y SZP: Productos de la expresión del gen del MSF en fibroblastos sinoviales humanos y condrocitos articulares localizados en el cromosoma 1q25

Se evaluó la expresión de tribonectinas en fibroblastos sinoviales humanos primarios y en cartílago articular primario. Se purificó el RNA de fibroblastos sinoviales y condrocitos articulares humanos cultivados in vitro a partir de explantes de tejido obtenidos de sujetos que no padecían enfermedad articular degenerativa. Se usó RT-PCR con múltiples pares de cebadores complementarios, que abarcaban el exón 6 central del gen MSF que expresa mucina y exones individuales, tanto de los lados N-terminal como C-terminal, del exón 6. Parece que los exones 2, 4 y 5 se expresan variablemente en fibroblastos sinoviales y condrocitos articulares. Un polipéptido lubricante, una tribonectina, expresado por varios exones del gen del MSF, es expresado tanto en condrocitos como en fibroblastos sinoviales in vitro. Tanto la tribonectina como la proteína de zona superficial (SZP), un proteoglicano relacionado, comparten una estructura primaria similar (pero no idéntica). Las tribonectinas y la SZP difieren también en las modificaciones post-traduccionales con oligosacáridos unidos por O; las tribonectinas contienen oligosacáridos unidos por O, mientras que dichas modificaciones post-traduccionales no se detectaron en la SZP. Los oligosacáridos son predominantes en las tribonectinas; en la SZP se han encontrado cantidades limitadas de condroitina y de sulfato de queratina. Puesto que la mayoría de los exones del MSF participan en la expresión de la tribonectina, persiste una fuerte homología a la vitronectina. El cribado de la genoteca BAC genómica humana con un par de cebadores de cDNA, complementario con el exón 6, identificó dos clones. Ambos clones eran complementarios del cromosoma 1q25 por hibridación in situ. Este locus estuvo implicado en el síndrome de camptodactilia-artropatía-pericarditis (CAP) por cartografía génica. La CAP, una amplia artropatía articular, está asociada con una lubricación ineficaz por capa límite, causada por el líquido sinovial. Por consiguiente, las tribonectinas descritas en la presente memoria son útiles para prevenir y/o tratar la CAP.

Los datos descritos más adelante sugieren las preguntas siguientes: 1) ¿cuáles de los 12 exones del MSF son expresados por los fibroblastos sinoviales y presumiblemente dan como resultado la secreción de tribonectina en la cavidad sinovial?; 2) ¿cómo difiere esto de la expresión del MSF en los condrocitos articulares que da como resultado la secreción de la SZP en la superficie del cartílago?; 3) ¿comparten las tribonectinas y la SZP la misma estructura primaria?; 4) ¿están modificadas las tribonectinas después de la traducción con sulfato de condroitina? esta es una característica de la SZP, y 5) ¿ posee un producto aislado del exón 6 capacidad lubricante por capa límite?.

Se recogió líquido sinovial humano y se procesó del modo antes descrito y se purificaron y aislaron las tribonectinas de tejido humano aplicando los métodos antes descritos. Se midió la actividad lubricante empleando un aparato de fricción estándar.

Inmunodetección del sulfato de condroitina-6

Se empleó el anticuerpo monoclonal M621C (ICN, Aurora, OH) para detectar la presencia de sulfato de condroitina-6 en la tribonectina purificada. Se aplicaron las técnicas estándares de transferencia de mancha y Western.

Digestión de una tribonectina con quimotripsina

Se incubó a 37ºC durante 1 hora 0,1 BTEE U/ml de quimotripsina tratada con TLCK de líquido sinovial humano. Inmediatamente después de la digestión se analizó la actividad lubricante en el aparato de fricción. Se efectuaron digestiones adicionales del mismo modo, pero también en presencia de 10 μg/ml de leupeptina y 5 μg/ml de aprotinina, en el caso de que el tratamiento con TLCK comercial inactivara incompletamente la tripsina contaminante.

Aislamiento y cultivo de condrocitos articulares humanos

Además de aislar los fibroblastos sinoviales humanos del modo antes descrito, se aislaron condrocitos humanos. Se obtuvieron cartílagos de cóndilos femorales y de mesetas tibiales de articulaciones de rodilla humana durante la autopsia de donantes sin historial conocido de enfermedad articular o de donantes sanos de órganos procedentes de bancos de tejidos. Se cortaron rebanadas de cartílago en piezas de 2-3 mm3, se lavaron con DMEM (Whittaker MAB Bioproducts, Walkerville, MD) y se trataron durante 15 minutos con tripsina al 10% (v/v) en un baño de agua a 37ºC. Se transfirieron los tejidos a DMEM, FBS al 5%, penicilina-estreptomicina-fungizona y 2 mg/ml de colagenasa de C. perfringens de tipo IV (Sigma) y se digirieron en un agitador giratorio durante una noche. Las células se lavaron 3 veces con DMEM y se cultivaron en DMEM que contenía FBS al 5%.

Cultivo de monocitos humanos

Se adquirieron monocitos humanos CRL-9855 en suspensión a American Type Culture Collection (Mannassas, V). Las células se concentraron por centrifugación y después se volvieron a poner en suspensión en un matraz T75 hasta una concentración entre 0,2 y 1,0 x 106/ml con medio de Dulbecco modificado por Iscove suplementado con suero fetal bovino al 10%, que no se había inactivado por calor (Flow Laboratories), timidina 0,03 mM, hipoxantina 0,1 mM y 2-mercaptoetanol 0,05 mM. A medida que se multiplicaron los monocitos, el cultivo se expandió para mantener el intervalo de concentración anterior.

Extracción de RNA y análisis por RT-PCR

Los RNA de condrocitos y de monocitos sinoviales y articulares humanos se purificaron en mini-columnas y reactivos RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). El DNA genómico contaminante se eliminó con DNAshredder y DNasa (libre de RNasa) (Qiagen). La síntesis del DNA complementario se efectuó incubando a 25ºC durante 10 minutos para extender los cebadores hexámeros por transcriptasa inversa y síntesis del cDNA a 42ºC durante 12 minutos y activación del Ampli Taq/desnaturalización del complejo RNA-cDNA a 95ºC durante 10 minutos. Las condiciones de los ciclos térmicos fueron las siguientes: 43 ciclos de 94ºC, 20 segundos para la desnaturalización y 62ºC, 60 segundos, y una extensión final a 72ºC durante 7 minutos (Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA). Se analizaron los productos de la RT-PCR mediante electroforesis en gel de agarosa NuSieve GTG al 3% (FMC, Rockland, ME) teñido con bromuro de etidio. Se escindieron las bandas que no correspondían a los tamaños de los productos esperados por RT-PCR y se extrajeron de la agarosa (Qiagen).

Cribado de la genoteca de clones BAC

Se cribó una genoteca BAC de E. coli que contenía el genoma humano (Research Genetics Inc., Huntsville, AL) con un par de cebadores de cDNA complementario al exón 6 del MSF por PCR. Cebador delantero: 5'-CCAAACCACCAGTTGTAGATGAAGC-3' (SEQ ID NO: 15) y cebador inverso: 5'-GCGGAAGTAGTCTTCTCTTTTCCATCAG-3' (SEQ ID NO: 16) complementarios del par de bases de los números de posición 674-698 y 953-926 de la SEQ ID NO: 2. Los clones candidatos de E. coli se cultivaron en agar-agar con caldo de Luria (LB) que contenía 12,5 mg/ml de cloranfenicol a 37ºC durante 16 horas. Se purificó una construcción grande de DNA libre de DNA genómico por intercambio aniónico y digestión con exonucleasa (Qiagen Largeconstruct kit, Qiagen, Valencia, CA).

Hibridación in situ del DNA de clones de BAC y cromosomas

Se prepararon los cromosomas en metafase a partir de cultivos de linfocitos de corta duración de individuos normales de acuerdo con protocolos establecidos. Se marcaron dos microgramos de DNA de BAC de clones positivos empleando un kit de marcado BioNick (Life Technologies, MD) empleando biotina-14-dATP en una reacción de traslado de muesca de acuerdo con un protocolo suministrado por el fabricante. Después del traslado de muesca se purificaron los productos de reacción en una columna G-50. Se co-precipitaron con etanol 100 ng de DNA marcado y 20 1g de DNA de cot1. Se recuperó el DNA por centrifugación y se disolvió en 20 1l de solución de hibridación (Hybrisol vii, Oncor). La hibridación con sonda, lavado, microscopía y cartografía de las sondas se realizaron de acuerdo con métodos estándares.

Digestión de tribonectinas con quimotripsina y valoración de la capacidad lubricante

Se purificó una tribonectina del líquido sinovial humano reunido que tenía una capacidad lubricante normal, definida como L1 < -0,06 y poseía un peso molecular aparente de 280 kDa. El final de la purificación se efectuó con una etapa anti-fibronectina para eliminar las bandas contaminantes. En esta etapa se redujo también el ángulo de pureza a <6°. Una tribonectina de una concentracion de 250 Ig/ml lubricó el apoyo de látex:vidrio con la misma eficacia que un líquido sinovial post-mortem de un sujeto sin enfermedad articular degenerativa (Tabla 7).

TABLA 7. Coeficientes de fricción de una tribonectina humana y fibronectina

Lubricante: μ μ (PS‡ ) �I N

Tribonectina†: 0,047 ± 0,006 0,131 ± 0,007 -0,084 ± 0,004 3

HSF*: 0,040 ± 0,005 0,135 ± 0,009 -0,095 ± 0,011 3

Quimotripsina§: 0,130 ± 0,041 0,107 ± 0,024 -0,02 ± 0,035 3

Valor medio ± desviación típica † Analizada a una concentración de 250 μg/ml en PS ‡ Solución salina fisiológica * Líquido sinovial humano post-mortem § HSF digerido con quimotripsina tratada con TCLK en presencia de leupectina y aprotinina

Se realizaron digestiones enzimáticas con quimotripsina tratada con TLCK para determinar si el producto proteínico del exón 6 aislado posee capacidad lubricante, dado que este dominio no contiene aminoácidos aromáticos. El 5 producto digerido resultante aumentó la 1 a 0,130 desde el valor de control de la soluci

ón salina, 1 = 0,107. Las digestiones similares en presencia de leupeptina/aprotinina continuaron sin mostrar capacidad lubricante (L1 = +0,02).

Inmunodetección de sulfato de condroitina-6

Se empleó el anticuerpo monoclonal M621C para sondar las tribonectinas transferidas a nitrocelulosa. No se

10 observó reacción que correspondiera a la banda de 280 kDa en el análisis por SDS-PAGE original. Esto indica que las tribonectinas no contienen el sulfato de condroitina-6.

Análisis por RT-PCR de RNA de fibroblastos sinoviales y condrocitos articulares

La RT-PCR del mRNA de condrocitos y fibroblastos sinoviales se efectuó empleando los cebadores que se indican en la Tabla 8. Para ambas líneas celulares se observaron los productos de la RT-PCR del tamaño previsto y otros

15 de tamaño inferior al previsto. Se observó que el par de cebadores que abarcaba desde el extremo C-terminal del exón 6 hasta el extremo N-terminal del exón 12 tenía 769 pb, su longitud prevista para ambas líneas celulares. Similarmente, el par de cebadores que abarca la misma posición del exón 6 hasta el exón 11 produjeron un producto esperado de RT-PCR de 654 pb. El par de cebadores de los exones 5 y 6 produjo el producto de RT-PCR esperado, de 278 pb, para ambas líneas celulares.

20 TABLA 8: Pares de cebadores empleados para las RT-PCR con RNA de fibroblastos sinoviales y de condrocitos articulares humanos

TABLA 9: Pares de cebadores empleados para las RT-PCR con RNA de monocitos humanos

El par de cebadores que abarca desde el exón 1 hasta el exón 6 no consiguió generar singularmente el producto del tamaño previsto de 756 pb. En su lugar, se observaron tres bandas de menor tamaño (350, 450 y 490 pb) para ambas líneas celulares. El par de cebadores que abarca desde el exón 2 hasta el extremo N-terminal del exón 6 generó un producto de un tamaño de aproximadamente 420 pb para ambas líneas celulares y cuya longitud fue 272 pb más corta (692 pb - 420 pb) del tamaño previsto. El producto previsto de la RT-PCR de 692 pb apenas se observó en los condrocitos y aún menos en los fibroblastos sinoviales. El producto de 420 pb del par de cebadores de los exones 2 a 6 se escindió y secuenció, lo que reveló la ausencia del exón 5 y de la mayor parte del exón 4, excepto los dos primeros aminoácidos del extremo N-terminal, Ala105 y Leu106, de la SEQ ID NO: 1. Secuenciando los productos de la RT-PCR de longitud 490 y 450 pb, generados con el par de cebadores de los exones 1 a 6, se identificaron las mismas deleciones. Secuenciando el producto de menor tamaño, de 350 pb, generado por el par de cebadores de los exones 1 a 6, se pusieron de manifiesto las mismas deleciones además del exón 2, excepto el Q25 del extremo N-terminal. El par de cebadores de los exones 4 y 6 generó el producto de RT-PCR esperado de 449 pb para ambas líneas celulares y un producto más pequeño de 340 pb. La secuenciación de este producto de 340 pb puso de manifiesto una deleción del exón 5, excepto para el E156 del extremo N-terminal.

Se observó un empalme alternativo que era responsable de la generación de 4 isoformas fenotípicas diferentes del MSF tanto de los fibroblastos sinoviales como de los condrocitos (Figuras 2A y 2B).

El fenotipo V0 está formado por los 12 exones, el V1 carece del exón 5, el V2 carece del exón 5 y de la mayor parte del 4 y el V3 carece del exón 5 y de la mayor parte del 4 y del 2. Otra isoforma adicional es un polipéptido que está formado por aminoácidos codificados por los exones 1 y 6-12 del MSF (que carece del exón 5); esta es probablemente la tribonectina de origen natural de tamaño más pequeño. Cada isoforma contiene el dominio lubricante del exón 6. El dominio codificado por el exón 1 desempeña un papel mediando en la unión de la tribonectina a superficies hidrófobas, como el cartílago.

Análisis por RT-PCR del RNA de monocitos

Los análisis por RT-PCR con RNA de monocitos purificados empleando pares de cebadores (Tabla 9) complementarios del exón 6 del MSF no generaron ningún producto. Un par de cebadores, que se extiende de los exones 1 a 3, generó un producto de PCR de 250 pb, su tamaño previsto. Otro par de cebadores que abarca de los exones 1 a 4 generó un producto de PCR que tenía un tamaño de aproximadamente 130 pb más pequeño que el previsto de 312 pb. Otro par de cebadores adicional, que abarca de los exones 2 a 5, no generó ningún producto por PCR, lo cual indicó que el exón 5 no se expresó. Estos datos parecen demostrar que los monocitos expresan los exones 1 a 3, 1 a 4 aunque de modo variable y no expresan el exón 6. La secuencia del cebador delantero del exón 1 es común a todos los anteriores trabajos de RT-PCR con monocitos, fibroblastos sinoviales y condrocitos.

Hibridación in situ del DNA de clones de BAC y cromosomas

El cribado de la genoteca de clones de BAC del genoma humano con el par de cebadores de cDNA del exón 6 anterior del MSF dio lugar a 2 clones candidatos. Los clones de BAC 330 y 285 se hibridaron al cromosoma 1 en la región q25 (bandas DAPI). Para confirmar la localización en el cromosoma 1, se hibridaron los cromosomas en metafase con sondas de BAC junto con la sonda centrómera específica del cromosoma 1 (VYSIS). Tanto las sondas centrómeras como las sondas de BAC se hibridaron al cromosoma 1. La posterior generación de bandas G de los mismos portaobjetos confirmaron la localización q25.

Se empalmaron alternativamente fibroblastos sinoviales cultivados in vitro con los exones 2, 4 ó 5 del MSF o con una de sus combinaciones. En el caso del exón 4, la expresión se detuvo después de los dos primeros codones del exón (Ala105 y Leu106). Existen también las isoformas sin exón 5, excepto para el residuo E156 y una sin exón 2, excepto para Q25. Se formaron tres productos por RT-PCR con el par de cebadores de los exones 1 a 6, que parecen corresponder a los fenotipos V1 - 3. Sin embargo, se observó el producto esperado por la RT-PCR, de 692 pb, para el par de cebadores de los exones 2-6, lo cual indicó que también existe una isoforma V0, que contiene cada uno de estos exones. Parecería que 4 ó 5 isoformas fenotípicas diferentes de tribonectinas son expresadas por los fibroblastos sinoviales. Los condrocitos comparten esta expresión fenotípica. Un resumen de los sitios de empalme alternativo para ambas líneas celulares se ilustra en la Figura 3. La intensidad relativamente mayor de los productos de los pares de cebadores de los exones 2-6 (692 pb) y de los exones 4-6 (449 pb) para los condrocitos sugiere que estas células podrían seleccionar potencialmente un isotipo de peso molecular aparente más elevado.

El exón 6 del MSF está posicionado entre una región de unión análoga de sulfato de heparina (exón 4 del MSF) y las repeticiones similares a hemopexina (exones 8, 9 del MSF). La separación de estos dominios favorece una mayor interacción con el glicosaminoglicano, que diferiría de la vitronectina, en la que estos dominios se piensa que compiten por unirse al glicosaminoglicano debido a su proximidad. Tal vez la capacidad de unirse al glicosaminoglicano por uno o por ambos extremos del dominio lubricante sirve para estabilizar la actividad lubricante en un cartílago cubierto con esplendinas en láminas. Alternativamente, existe una interacción entre una tribonectina y el colágeno de tipo II, sirviendo dicha interacción para unir la tribonectina directamente al cartílago.

Los lubricantes por capa límite, tales como las tribonectinas, se unen a las superficies de apoyo y generan una repulsión mutua con el fin de lubricar en modo de capa límite. Este atributo bifuncional aparece como un comportamiento anfipático revistiendo superficies hidrófobas no biológicas, tal como látex. Las glicosilaciones amplias interconectan con el entorno acuoso circundante. Cuando se eliminan los azúcares último y penúltimo, desaparece la capacidad lubricante. La expresión del exón 6 del MSF es necesaria para la actividad lubricante; una actividad lubricante óptima requiere probablemente la expresión de un dominio expresado por al menos un exón adicional del MSF, por ejemplo, el exón 1. El experimento de digestión por quimotripsina se realizó para intentar escindir el producto del exón 6 y analizar la capacidad lubricante del material digerido, suponiendo que los productos liberados por el exón no interferirán con la capacidad lubricante. El material digerido no lubricó bien, a pesar de la replicación en presencia de leupeptina y aprotinina, lo cual sugiere que pueden requerirse otros productos de exones. Puede ser necesario, por ejemplo, el exón 3, que tiene un número de residuos de cisteína que son importantes en la agregación de polímeros de mucina. La capacidad de una tribonectina para revestir una superficie depende probablemente de la hidrofobicidad y de la capacidad de agregación de los polímeros individuales de tribonectina.

Los estudios inmunohistoquímicos no han conseguido detectar el sulfato de condroitina-6, lo cual indica que no está presente o que está impedido estéricamente por las glicosilaciones unidas por O, adyacentes a D220EASG224, donde estaría unido el sulfato de condroitina. La presencia de sulfato de condroitina y de queratina en la SZP se confirmó por marcaje con 35S y liberación después de la digestión con queratinasa y condroitina-liasa ABC. Sin embargo, no se observó un cambio significativo en el peso molecular aparente de la SZP después de esta digestión, lo cual indicó que solamente era probable un pequeño grado de sustitución. Es posible que el glicosaminoglicano esté conjugado con una tribonectina.

Las tribonectinas y la SZP son moléculas similares que comparten los exones 1, 3 y 6 a 12 del MSF y los exones de empalme alternativo 2 a 5. A pesar de su estructura primaria similar, se detectaron diferencias en las modificaciones post-traduccionales entre las dos proteínas. La presencia del resto lubricante �(1 -3)Gal-GalNAc unido por O no se detectó en el caso de la SZP, pero sí en las tribonectinas descritas en la presente memoria. La diferencia de pesos moleculares entre tribonectinas y SZP se confirmó por análisis de transferencia Western con anticuerpos desarrollados contra la SZP, que se purificó de condrocitos de zonas superficiales.

Síndrome de camptodactilia-artropatía-pericarditis (CAP)

Experimentos de hibridación in situ indicaron que las secuencias de DNA que codifican las tribonectinas residen en el cromosoma 1q25, puesto que ambas sondas de clones de BAC se han localizado independientemente en la misma localización. Una búsqueda booleana de la herencia mendeliana en el hombre por Internet (OMIM) reveló una enfermedad artrítica que ha sido cartografiada genéticamente en el mismo locus. El síndrome de camptodactiliaartropatía-pericarditis (CAP) se caracteriza por el inicio juvenil de la artropatía no inflamatoria de articulaciones grandes y contracturas de flexión no traumática congénitas de una o más articulaciones interfalángicas (camptodactilia). El aspecto histopatológico de los tejidos sinoviales y teno-sinoviales de pacientes que padecen esta enfermedad heredada autosómicamente es el de la hiperplasia sinoviocítica de tipo B y de la fibrosis en estadio terminal. El síndrome CAP es un resultado directo de la lubricación ineficaz que da como resultado un desgaste prematuro de la articulación. Algunos pacientes con CAP también desarrollan pericarditis. Las tribonectinas aisladas, de origen natural o sintético, son útiles para tratar el CAP y para lubricar los tejidos del pericardio. El CAP se diagnostica detectando una mutación en el gen del MSF.

Otras realizaciones se definen en las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una tribonectina que reduce el coeficiente de fricción entre superficies de apoyo, que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos una, pero menos de 76, subunidades, en donde:

(a)

cada subunidad comprende al menos 7 aminoácidos;

(b)

la secuencia de aminoácidos de dicha al menos una subunidad es la SEQ ID NO: 3; y

(c)

en donde al menos 10% en peso de dicha tribonectina está glicosilada por �(1-3)Gal-GalNAc unido por O; para uso en un método para lubricar tejido en un mamífero.
2.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende además una o más repeticiones de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4.
3.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende los aminoácidos 1-24 y 200-1404 de la SEQ ID NO: 1, en donde dicha tribonectina carece de los aminoácidos 25-199 de la SEQ ID NO: 1.
4.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende los aminoácidos 1-156 y 200-1404 de la SEQ ID NO: 1, en donde dicha tribonectina carece de los aminoácidos 157-199 de la SEQ ID NO: 1.
5.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende los aminoácidos 1-106 de la SEQ ID NO: 1 y 200-1404 de la SEQ ID NO: 1, en donde dicha tribonectina carece de los aminoácidos 107-199 de la SEQ ID NO: 1.
6.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende los aminoácidos 1-25 de la SEQ ID NO: 1, 67-106 de la SEQ ID NO: 1 y 200-1404 de la SEQ ID NO: 1, en donde dicha tribonectina carece de los aminoácidos 26-66 de la SEQ ID NO: 1.
7.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina se caracteriza porque reduce el coeficiente de fricción entre las superficies de apoyo in vitro.
8.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina se caracteriza porque reduce el coeficiente de fricción entre las superficies de apoyo in vivo.
9.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina no aumenta sustancialmente la viscosidad de una solución a la que se añade.
10.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde al menos 20% de dicha tribonectina está glicosilado por dicho resto oligosacárido unido por O.
11.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde al menos 40% de dicha tribonectina está glicosilado por dicho resto oligosacárido unido por O.
12.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde el peso molecular de dicha tribonectina está en el intervalo de 220-280 kDa.
13.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende un fragmento de factor estimulante de megacariocitos.
14.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 200-1140, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1.
15.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 200-1167, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1.
16.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 200-1212, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1.
17.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 200-1263, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1.
18.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina carece de la secuencia de aminoácidos de los residuos 1-24, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1.
19.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina carece de la secuencia de aminoácidos de los residuos 67-104, ambos inclusive, de la SEQ ID NO: 1.
20.

El uso de la tribonectina definida en la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para lubricar una articulación de un mamífero.
21.

El uso de la reivindicación 20, en donde dicha articulación es una articulación de un ser humano.
22.

El uso de la reivindicación 20, en donde dicha articulación es una articulación de un perro.
23.

El uso de la reivindicación 20, en donde dicha articulación es una articulación de un caballo.
24.

El uso de la reivindicación 20, en donde dicho medicamento se administra por vía intra-articular.
25.

El uso de una tribonectina definida en la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar el síndrome de camptodactilia-artropatía-pericarditis en un mamífero.
26.

Una composición biocompatible que comprende la tribonectina definida en la reivindicación 1, en donde dicha composición comprende además ácido hialurónico reticulado o no reticulado.
27.

Una composición biocompatible que comprende la tribonectina definida en la reivindicación 1, en donde dicha composición está en una forma adecuada para la inhibición de la formación de adhesión a tejidos y está en forma de una membrana, una espuma, un gel o una fibra.
28.

El uso de una tribonectina definida en la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para inhibir la formación de adhesión entre una primera superficie y una segunda superficie de un mamífero.
29.

El uso de la reivindicación 28, en donde dicha primera superficie y dicha segunda superficie son, ambas, tejidos lesionados de dicho mamífero.
30.

El uso de la reivindicación 28, en donde dicha primera superficie o dicha segunda superficie es un dispositivo artificial.
31.

El uso de la reivindicación 30, en donde dicho dispositivo artificial es un implante ortopédico.
32.

El uso de la reivindicación 28, en donde dicho medicamento está en forma de una membrana, una espuma, un gel o una fibra.
33.

El uso de la reivindicación 28, en donde dicha lesión se debe a una incisión quirúrgica.
34.

El uso de la reivindicación 28, en donde dicha lesión se debe a un traumatismo.
35.

El uso de la reivindicación 28, en donde dicha primera superficie o dicha segunda superficie es el tejido pericárdico.
36.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende además un grupo protector NeuAc.
37.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende un polipéptido recombinante.
38.

La tribonectina de la reivindicación 1, en donde dicha tribonectina comprende un polipéptido sintetizado químicamente