KR20210082478A

KR20210082478A - 연골 질환의 치료약

Info

Publication number: KR20210082478A
Application number: KR1020217015301A
Authority: KR
Inventors: 가츠토 다마이; 다카시 심보; 에이지 사사키; 다카히로 츠시마; 다케히코 야마자키
Original assignee: 고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸; 가부시키가이샤 스템림
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2021-07-05
Also published as: EP3865179A4; CA3117107A1; MX2021004758A; BR112021007732A2; CN113423466A; US20210386823A1; SG11202104015YA; IL282377A; AU2019367943A1; JP7448126B2; JPWO2020085506A1; WO2020085506A1; EP3865179A1

Abstract

본 발명자들은 연골 질환의 치료에 유효한 물질을 탐색한 결과, 특정 아미노산 서열을 갖는 HMGB1 단편 펩티드가 관절 연골 결손증의 동물 모델에 있어서 유리 연골을 포함하는 정상적인 연골 조직을 재생하는 효과를 나타내는 것을 발견하였다. 이 지견에 기초하여, 본원은 당해 특정 HMGB1 단편 펩티드를 함유하는, 연골 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 조성물을 제공한다.

Description

연골 질환의 치료약

본원은 고이동성 그룹 박스 1(High mobility group box 1; HMGB1) 단백질의 단편 펩티드를 포함하는, 연골 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 조성물에 관한 것이다. 본원은 2018년 10월 25일에 출원된 일본 특허 출원 제2018-200866호에 대하여 우선권을 주장하는 것이며, 해당 일본 특허 출원의 전체 내용을 참조에 의해 본 명세서에 일체화시킨다.

연골 조직, 예를 들어 관절 연골은 수복능이 낮아, 한번 손상되어 버리면 자연 재생되는 것은 거의 불가능하다. 예를 들어 외상성 관절 연골 결손증의 치료법은 진통제의 내복이나 히알루론산의 관절내 주사 등의 대증요법이 중심이며, 현재 시점에서 외상성 관절 연골 결손증에 대한 근치적 요법은 확립되어 있지 않다. 또한, 외상성 관절 연골 결손증에 대한 자가 골연골 기둥 이식 등의 외과적 치료 방법도 존재하지만, 환자의 정상 조직을 채취할 필요가 있기 때문에 큰 결손에는 대응할 수 없는 등의 문제가 있다. 따라서, 보다 효과적이며 또한 침습성이 낮은 연골 질환 치료약의 개발이 요망되고 있다.

WO2012/147470 WO2014/065347 WO2014/065348 WO2018/139562 WO2018/186480

본원은 연골 질환의 치료에 유효한 신규 의약을 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본원은 이하를 제공한다.

[1]

이하의 (a) 내지 (c) 중 어느 것에 기재된 물질(이하, 물질 A라고 칭함)을 함유하는, 연골 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 조성물:

(a) 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HMGB1 단편 펩티드;

(b) 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 하나 혹은 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및

(c) 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열과 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.

[2]

연골 질환이 외상성 연골 결손증, 변형성 관절증 또는 이단성 골연골염인, [1]에 기재된 의약 조성물.

[3]

물질 A를 함유하는, 연골 질환의 환자에 있어서 유리 연골을 재생하기 위한 의약 조성물.

[4]

연골 질환이 외상성 연골 결손증, 변형성 관절증 또는 이단성 골연골염인, [3]에 기재된 의약 조성물.

[A1]

물질 A의 유효량을 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 연골 질환을 예방 및/또는 치료하는 방법.

[A2]

연골 질환이 외상성 연골 결손증, 변형성 관절증 또는 이단성 골연골염인, [A1]에 기재된 방법.

[A3]

물질 A의 유효량을 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 연골 질환의 환자에 있어서 유리 연골을 재생하는 방법.

[A4]

연골 질환이 외상성 연골 결손증, 변형성 관절증 또는 이단성 골연골염인, [A3]에 기재된 방법.

[B1]

연골 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 물질 A.

[B2]

연골 질환이 외상성 연골 결손증, 변형성 관절증 또는 이단성 골연골염인, [B1]에 기재된 물질 A.

[B3]

연골 질환의 환자에 있어서 유리 연골의 재생에 사용하기 위한 물질 A.

[B4]

연골 질환이 외상성 연골 결손증, 변형성 관절증 또는 이단성 골연골염인, [B3]에 기재된 물질 A.

[C1]

연골 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, 물질 A의 사용.

[C2]

연골 질환이 외상성 연골 결손증, 변형성 관절증 또는 이단성 골연골염인, [C1]에 기재된 사용.

[C3]

연골 질환의 환자에 있어서 유리 연골을 재생하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 물질 A의 사용.

[C4]

연골 질환이 외상성 연골 결손증, 변형성 관절증 또는 이단성 골연골염인, [C3]에 기재된 사용.

도 1은 수술 후 2, 4, 8 및 12주에 있어서의 슬관절의 연골 결손 부위 및 그 주변의 현미경 관찰 결과를 나타내는 사진이다(「Vehicle」이 대조군, 「1-44」가 HMGB1 펩티드(1-44) 투여군을 각각 나타냄).
도 2는 수술 후 2, 4, 8 및 12주에 있어서의 슬관절 연골 결손 부위의 웨인 스코어링 시스템(Wayne scoring system)에 의한 육안 소견의 스코어를 나타내는 그래프이다(「Vehicle」이 대조군, 「1-44」가 HMGB1 펩티드(1-44) 투여군을 각각 나타냄). 종축은 스코어, 횡축은 연골 결손 작성 후의 주수를 나타낸다. * p<0.05(양측(Two-tailed) 독립표본(unpaired) t-검정(test)),

p<0.05(사후(post-hoc) 터키 검정(Tukey's test)과 함께 이원(Two-way) ANOVA).
도 3은 수술 후 2, 4, 8 및 12주에 있어서의 슬관절 연골 조직 절편의 사프라닌 O 염색의 결과를 나타내는 사진이다(「Vehicle」이 대조군, 「1-44」가 HMGB1 펩티드(1-44) 투여군을 각각 나타냄).
도 4는 수술 후 2, 4, 8 및 12주에 있어서의 슬관절 연골 조직의 와키타니(Wakitani) 스코어를 나타내는 그래프이다(「Vehicle」이 대조군, 「1-44」가 HMGB1 펩티드(1-44) 투여군을 각각 나타냄). 종축은 스코어, 횡축은 연골 결손 작성 후의 주수를 나타낸다. * p<0.05(양측 독립표본 t-검정,

p<0.05(사후 터키 검정과 함께 이원 ANOVA).
도 5는 수술 후 12주에 있어서의 슬관절 연골 조직 절편의 사프라닌 O 염색의 결과를 개체별로 나타내는 사진이다(「Vehicle」이 대조군, 「1-44」가 HMGB1 펩티드(1-44) 투여군을 각각 나타냄).
도 6은 수술 후 12주에 있어서의 슬관절 연골 조직의 와키타니 스코어를 항목별로 나타내는 그래프이다(「Vehicle」이 대조군, 「1-44」가 HMGB1 펩티드(1-44) 투여군을 각각 나타냄). 종축은 스코어, 횡축은 와키타니 스코어를 구성하는 각 항목을 나타낸다. * p<0.05(양측 독립표본 t-검정).
도 7은 연골 결손 모델 마우스의 수술 후 12주에 있어서의 슬관절 연골 조직 절편의 염색 결과를 나타내는 사진이다. 좌측이 사프라닌 O 염색, 우측이 II형 콜라겐의 면역 염색이다.
도 8은 정상 마우스의 슬관절 연골 조직 절편의 염색 결과를 나타내는 사진이다. 좌측이 사프라닌 O 염색, 우측이 II형 콜라겐의 면역 염색이다.

본원은 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HMGB1 단편 펩티드를 함유하는, 연골 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 조성물을 제공한다.

연골 질환이란, 연골 조직의 이상을 수반하는 질환을 말한다. 연골 조직의 이상으로서는 연골의 손상, 마모, 결손, 변성 등을 들 수 있다.

본원에 있어서의 연골 질환으로서는 외상성 연골 결손증, 변형성 관절증, 이단성 골연골염, 반월판 손상, 외상성 관절증, 염증성 관절증(예를 들어 관절 류머티즘), 감염성 관절증(예를 들어 화농성 관절염) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 변형성 관절증에는, 원인이 명확하지 않은 원발성 변형성 관절증과, 원인이 명확한 속발성 변형성 관절증이 있다. 속발성 변형성 관절증으로서는 인대 손상, 연골 손상, 반월판 손상 등이 원인이 되어 생기는 변형성 관절증을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

하나의 바람직한 양태에 있어서, 본원의 HMGB1 단편 펩티드를 사용하여 치료되는 연골 질환은 외상성 연골 결손증, 변형성 관절증 또는 이단성 골연골염이다. 다른 바람직한 양태에 있어서, 본원의 HMGB1 단편 펩티드를 사용하여 치료되는 연골 질환은 외상성 연골 결손증 또는 변형성 관절증이다. 또 다른 양태에 있어서, 본원의 HMGB1 단편 펩티드를 사용하여 치료되는 연골 질환은 외상성 연골 결손증이다. 다른 양태에 있어서, 본원의 HMGB1 단편 펩티드를 사용하여 치료되는 연골 질환은 변형성 관절증이다.

본원의 HMGB1 단편 펩티드를 사용하여 치료되는 연골의 종류(부위)로서는, 예를 들어 관절의 연골을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 관절로서는 사지관절(견관절, 주관절, 손관절, 고관절, 슬관절, 다리관절), 악관절, 추간관절 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

하나의 양태에 있어서, 본원의 HMGB1 단편 펩티드를 사용하여 치료되는 연골 질환은 사지관절의 연골 질환이다. 다른 양태에 있어서, 본원의 HMGB1 단편 펩티드를 사용하여 치료되는 연골 질환은 주관절 또는 슬관절의 연골 질환이다. 또 다른 양태에 있어서, 본원의 HMGB1 단편 펩티드를 사용하여 치료되는 연골 질환은 슬관절의 연골 질환이다.

본원의 HMGB1 단편 펩티드를 사용하여 치료되는 연골 질환의 또 다른 예로서는, 관절의 외상성 연골 결손증, 주관절의 외상성 연골 결손증, 슬관절의 외상성 연골 결손증, 변형성 주관절증, 변형성 슬관절증, 관절의 이단성 골연골염, 주관절의 이단성 골연골염, 슬관절의 이단성 골연골염을 들 수 있다. 하나의 양태에 있어서, 본원의 HMGB1 단편 펩티드를 사용하여 치료되는 연골 질환은 슬관절의 외상성 연골 결손증이다. 다른 양태에 있어서, 본원의 HMGB1 단편 펩티드를 사용하여 치료되는 연골 질환은 변형성 슬관절증이다.

본원에 있어서, 「의약 조성물」이라는 용어는 「의약」, 「약제」 또는 「약학적 조성물」과 호환적으로 사용된다.

또한 본원은 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HMGB1 단편 펩티드를 함유하는, 연골 질환의 환자에 있어서 유리 연골을 재생하기 위한 의약 조성물을 제공한다. 하나의 양태에 있어서, 본원의 의약 조성물은 외상성 연골 결손증, 변형성 관절증 또는 이단성 골연골염의 환자에 있어서 유리 연골을 재생하기 위해 사용되는 것이다.

본원에 있어서, 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HMGB1 단편 펩티드란, HMGB1 단백질의 일부를 포함하는 펩티드이며, 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 의미한다. 이러한 펩티드는, 해당 펩티드를 코딩하는 DNA를 적당한 발현계에 도입하여 유전자 재조합체(recombinant)로서 얻을 수 있거나, 또는 인공적으로 합성할 수도 있다.

본원에 있어서 HMGB1 단백질로서는, 서열 번호: 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 및 서열 번호: 3에 기재된 염기 서열을 포함하는 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본원에 있어서의 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HMGB1 단편 펩티드로서는, 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HMGB1 단편 펩티드를 예시할 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.

본원의 의약 조성물에 있어서는, 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HMGB1 단편 펩티드 대신에, 또는 이것과 함께, 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1개 이상의 아미노산 잔기가 개변(치환, 결실, 삽입 혹은 부가)된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이며, 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HMGB1 단편 펩티드와 기능적으로 동등한 펩티드를 사용할 수도 있다. 이러한 펩티드의 예로서는 이하의 것을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다:

i) 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 하나 혹은 복수개(예를 들어 1개 내지 10개, 1개 내지 9개, 1개 내지 8개, 1개 내지 7개, 1개 내지 6개, 1개 내지 5개, 1개 내지 4개, 1개 내지 3개 또는 1개 혹은 2개)의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드;

ii) 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 하나 혹은 복수개(예를 들어 1개 내지 10개, 1개 내지 9개, 1개 내지 8개, 1개 내지 7개, 1개 내지 6개, 1개 내지 5개, 1개 내지 4개, 1개 내지 3개 또는 1개 혹은 2개)의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드;

iii) 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열과 약 80％ 이상, 예를 들어 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 91％ 이상, 약 92％ 이상, 약 93％ 이상, 약 94％ 이상, 약 95％ 이상, 약 96％ 이상, 약 97％ 이상 또는 약 98％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드;

iv) 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열과 약 80％ 이상, 예를 들어 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 91％ 이상, 약 92％ 이상, 약 93％ 이상, 약 94％ 이상, 약 95％ 이상, 약 96％ 이상, 약 97％ 이상 또는 약 98％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.

본원의 펩티드나 그것을 함유하는 의약 조성물(이하, 펩티드 등이라고 칭함)의 유효량이, 본 명세서에 기재된 질환이나 증상의 치료나 예방을 위해 대상에 투여된다.

본원에 있어서의 유효량이란, 본 명세서에 기재된 질환이나 증상의 치료나 예방에 충분한 양을 말한다. 본원에 있어서의 치료에는 경감, 지연, 저지, 개선, 관해, 치유, 완치 등이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한 본원에 있어서의 예방에는 경감, 지연, 저지 등이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다.

본원에 있어서의 대상으로서는 특별히 제한은 없으며, 포유류, 조류, 어류 등을 들 수 있다. 포유류로서는 인간 또는 비인간 동물을 들 수 있으며, 예를 들어 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 돼지, 개, 토끼, 햄스터, 모르모트, 말, 양, 고래 등을 예시할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본원에 있어서, 「대상」이라는 용어는 「환자」, 「개체」 및 「동물」과 호환적으로 사용된다.

본원의 펩티드 등의 투여 부위에 제한은 없으며, 연골 질환의 증상이 나타나는 부위 혹은 그 근방, 그것들과는 다른 부위(그들 이외의 부위), 연골 질환의 증상이 나타나는 부위로부터 이격된 부위, 연골 질환의 증상이 나타나는 부위로부터 원위에 있는 부위, 또는 연골 질환의 증상이 나타나는 부위에 대하여 원위이며 이소인 부위 등, 어떠한 부위에 투여되어도 본원의 펩티드 등은 그 효과를 발휘할 수 있다.

또한 본원의 펩티드 등은, 연골 질환의 증상이 나타나는 조직(예를 들어 관절)과는 다른 조직, 연골 질환의 증상이 나타나는 조직으로부터 이격된 조직, 연골 질환의 증상이 나타나는 조직으로부터 원위에 있는 조직, 또는 연골 질환의 증상이 나타나는 조직에 대하여 원위이며 이소에 있는 조직 등, 어떠한 조직에 투여되어도 그 효과를 발휘할 수 있다.

본원의 펩티드 등의 투여 방법으로서는 경구 투여 또는 비경구 투여를 들 수 있으며, 비경구 투여 방법으로서는 혈관내 투여(동맥내 투여, 정맥내 투여 등), 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 복강내 투여, 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 본원의 펩티드 등을 주사 투여, 예를 들어 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적(예를 들어, 피하, 피내, 피부 표면, 안구 혹은 안검결막, 비강 점막, 구강내 및 소화관 점막, 질ㆍ자궁내 점막 또는 손상 부위 등)으로 투여할 수 있다.

또한, 본원의 펩티드 등 대신에, 본원의 펩티드를 분비하는 세포, 해당 펩티드를 코딩하는 DNA, 해당 DNA가 삽입된 벡터, 해당 벡터를 포함하는 세포, 및 이것들을 함유하는 의약 조성물을 사용할 수도 있다.

또한, 환자의 연령, 증상에 따라 적절하게 투여 방법을 선택할 수 있다. 본원의 펩티드를 투여하는 경우, 예를 들어 1회의 투여에 대하여, 체중 1kg당 약 0.0000001mg 내지 약 1000mg의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 혹은, 예를 들어 환자당 약 0.00001 내지 약 100000mg/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 본원의 펩티드를 분비하는 세포나 해당 펩티드를 코딩하는 DNA가 삽입된 유전자 치료용 벡터를 투여하는 경우에도, 해당 펩티드의 양이 상기 범위 내가 되도록 투여할 수 있다. 그러나, 본원에 있어서의 의약 조성물은 이들 투여량에 제한되는 것은 아니다.

본원의 의약 조성물은 통상법에 따라 제제화할 수 있으며(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A]), 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 모두 포함하는 것이어도 된다. 예를 들어 계면 활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않으며, 기타 상용의 담체나 첨가제를 적절하게 사용할 수 있다. 구체적으로는, 경질 무수 규산, 유당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로오스칼슘, 카르멜로오스나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복시메틸셀룰로오스, 옥수수 전분, 무기 염류, 정제수, 생리 식염수, 글리세린 등을 들 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로서 본 명세서에 원용된다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 더 예시되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

관절 연골 결손증에 대한 HMGB1 단편 펩티드의 유효성의 평가

(1) 재료 및 방법

i) 약제 조제

인간 유래의 HMGB1 단백질의 아미노산 잔기 1-44(서열 번호: 1)를 포함하는 펩티드를 고상법에 의해 화학 합성하였다. 이하, 당해 HMGB1 단편 펩티드를 HMGB1 펩티드(1-44)라고 칭하고, 실시예에 대응하는 도면에 있어서는 「1-44」로 생략하여 표기한다.

ii) 연골 결손 모델 마우스의 작성

C57BL/6J 마우스(6-7주령, 수컷, 야생형)를 니혼 클레아로부터 구입 후, 8주령이 될 때까지 동물 시설 내에 순화시켰다(8주령 시에 체중 약 25g). 1.5-2.0％(v/v)의 이소플루레인 흡입 마취 하에서, 연골 결손을 작성하는 측의 하지의 면도를 행하고, 슬관절 중앙에 가위로 약 1㎝의 세로 피부 절개를 가하였다. 현미경 하에 슬개 주위 내측 접근으로 날카로운 날(#11)을 사용하여 약 1㎝의 관절 절개를 행하고, 슬개골을 외측으로 탈구시켰다. 대퇴골 도르래를 확인하고, 0.5mm 직경의 수동 드릴(메이신저(MEISINGER)사제)을 사용하여 도르래의 중심에 0.5×0.5×0.5mm의 연골 결손을 작성하였다. 생리 식염수로 관절내 세정을 행한 후, 슬개골 탈구가 일어나지 않도록 관절낭을 8-0 바이크릴로 연속 봉합하고, 피부를 5-0 나일론사로 봉합하였다.

iii) 펩티드의 투여

상기한 바와 같이 작성한 연골 결손 모델 마우스를 HMGB1 펩티드(1-44) 투여군(n=16) 및 대조군(n=16)으로 나누었다. HMGB1 펩티드(1-44) 투여군에는, 연골 결손을 작성한 직후에, 생리 식염수를 용매로 하여 1㎍/μL의 농도로 조정한 HMGB1 펩티드(1-44) 용액을 100μL/마리의 양(펩티드의 투여량으로서는 4mg/kg)으로 미정맥으로부터 투여하고, 그 후에도 동일한 용량으로 연골 결손 작성 후(이하, 간단히 「수술 후」라고도 칭함) 4주까지 2회/주의 빈도로 투여하였다. 대조군에는, HMGB1 펩티드(1-44) 투여군과 동일한 스케줄로, 생리 식염수를 100μL/마리의 양으로 미정맥으로부터 투여하였다.

iv) 펩티드의 투여에 의한 효과의 평가

HMGB1 펩티드(1-44) 투여군 및 대조군 모두, 수술 후 2, 4, 8 및 12주의 각 시점에서 4마리씩 마우스를 희생시키고, 슬관절의 연골 결손 작성 부위를 취출하여 현미경 관찰 및 조직 염색을 행하였다. 현미경 관찰에서는 웨인 스코어링 시스템을 사용하여, 하기 표 1에 나타내는 기준에 따라 육안 소견을 스코어화하여 연골 조직의 상태를 평가하였다. 또한, 조직학적 평가를 위해 연골 조직의 절편을 작성하여 사프라닌 O 염색을 행하고, 하기 표 2에 나타내는 기준에 따라 조직상으로부터 와키타니 스코어를 산출하여 연골 조직의 상태를 평가하였다.

(2) 결과

i) 현미경 관찰(육안 소견)

수술 후 2, 4, 8 및 12주에 있어서의 슬관절 연골 결손 부위 및 그 주변의 현미경 관찰 결과를 도 1에 도시한다. HMGB1 펩티드(1-44) 투여군의 연골 결손 부위는, 대조군과 비교하여 보다 정상에 가까운 상태까지 회복되어 있는 것이 관찰되었다. 웨인 스코어에 대해서도 HMGB1 펩티드(1-44) 투여군 쪽이 대조군보다 높았다(도 2).

ii) 조직학적 평가

연골 조직 절편의 사프라닌 O 염색의 결과, HMGB1 펩티드(1-44) 투여군에서는 적색으로 강하게 물드는 영역(유리 연골이라고 생각됨)이 연골 결손 작성 부위의 전체에 걸쳐 관찰되어, 결손된 연골 조직이 완전히 재생되고 있는 것이 확인되었다(도 3 및 5). 또한, 와키타니 스코어에 의한 평가에서도 HMGB1 펩티드(1-44) 투여군의 값은 대조군과 비교하여 유의미하게 낮아, 관절의 연골 결손에 대한 HMGB1 펩티드의 치료 효과가 나타났다(도 4 및 6).

실시예 2

관절 연골의 조직 염색

방법

실시예 1과 동일한 방법으로 연골 결손 모델 마우스를 작성하고, 그대로 사육을 계속하였다. 수술 후 12주의 시점에서 당해 마우스로부터 슬관절의 연골 결손 작성 부위를 포함하는 조직을 취출하여 파라핀 절편을 작성하고, 항II형 콜라겐 항체를 사용한 면역 염색과 사프라닌 O 염색을 행하였다. 또한, 동일 계통의 정상 마우스로부터도 슬관절의 연골 조직을 취출하여 파라핀 절편을 작성하고, 마찬가지로 II형 콜라겐의 면역 염색과 사프라닌 O 염색을 행하였다.

결과

연골 결손 모델 마우스의 수술 후 12주에 있어서의 슬관절의 연골 결손 작성 부위의 조직(즉, 연골 결손의 작성 후, 자연 수복에 맡긴 경우의 조직)은, 사프라닌 O 염색 및 II형 콜라겐의 면역 염색 중 어느 것에 있어서도 거의 양성 반응을 나타내지 않았다는 점에서, 유리 연골이 아닌 것을 확인할 수 있었다(도 7).

한편, 정상 마우스의 슬관절의 연골 조직(유리 연골인 것이 알려져 있음)은, 사프라닌 O 염색 및 II형 콜라겐의 면역 염색 중 어느 것에 있어서도, 상기 연골 결손 모델 마우스의 수술 후 12주에 있어서의 연골 결손 작성 부위와 비교하여 명백하게 강한 양성 반응을 나타내었다(도 8). 또한, 사프라닌 O 염색의 양성 영역과 II형 콜라겐 면역 염색의 양성 영역이 잘 대응하고 있는 것도 확인할 수 있었다.

고찰

실시예 1에 기재된 HMGB1 펩티드(1-44) 투여군의 수술 후 12주에 있어서의 슬관절의 연골 조직(도 3 및 도 5)은, 사프라닌 O 염색에 있어서 정상 마우스의 슬관절의 연골 조직(도 8 좌측)과 마찬가지의 강한 양성 반응을 나타내고 있다. 따라서, HMGB1 펩티드(1-44)의 투여에 의해 재생된 연골 조직은, 유리 연골을 포함하는 정상적인 관절 연골 조직과 동등한 조직이라고 생각된다.

본원의 펩티드를 포함하는 의약 조성물은 자연적으로는 재생될 수 없는 관절 연골을 완전한 형태로 재생할 수 있기 때문에, 기존의 치료약으로는 충분한 효과가 얻어지지 않는 연골 질환의 환자에 대하여 엄청난 은혜를 초래할 것으로 기대된다.

SEQUENCE LISTING <110> Osaka University <120> An agent for the treatment of cartilage disease <130> 675238 <150> JP 2018-200866 <151> 2018-10-25 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 1 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys 35 40 <210> 2 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 210 215 <210> 3 <211> 648 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgggcaaag gagatcctaa gaagccgaga ggcaaaatgt catcatatgc attttttgtg 60 caaacttgtc gggaggagca taagaagaag cacccagatg cttcagtcaa cttctcagag 120 ttttctaaga agtgctcaga gaggtggaag accatgtctg ctaaagagaa aggaaaattt 180 gaagatatgg caaaagcgga caaggcccgt tatgaaagag aaatgaaaac ctatatccct 240 cccaaagggg agacaaaaaa gaagttcaag gatcccaatg cacccaagag gcctccttcg 300 gccttcttcc tcttctgctc tgagtatcgc ccaaaaatca aaggagaaca tcctggcctg 360 tccattggtg atgttgcgaa gaaactggga gagatgtgga ataacactgc tgcagatgac 420 aagcagcctt atgaaaagaa ggctgcgaag ctgaaggaaa aatacgaaaa ggatattgct 480 gcatatcgag ctaaaggaaa gcctgatgca gcaaaaaagg gagttgtcaa ggctgaaaaa 540 agcaagaaaa agaaggaaga ggaggaagat gaggaagatg aagaggatga ggaggaggag 600 gaagatgaag aagatgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaataa 648

Claims

이하의 (a) 내지 (c) 중 어느 것에 기재된 물질을 함유하는, 연골 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 조성물:
(a) 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HMGB1 단편 펩티드;
(b) 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 하나 혹은 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
(c) 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열과 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
제1항에 있어서, 연골 질환이 외상성 연골 결손증, 변형성 관절증 또는 이단성 골연골염인 의약 조성물.
이하의 (a) 내지 (c) 중 어느 것에 기재된 물질을 함유하는, 연골 질환의 환자에 있어서 유리 연골을 재생하기 위한 의약 조성물:
(a) 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 HMGB1 단편 펩티드;
(b) 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서 하나 혹은 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 혹은 부가된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및
(c) 서열 번호: 1에 기재된 아미노산 서열과 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
제3항에 있어서, 연골 질환이 외상성 연골 결손증, 변형성 관절증 또는 이단성 골연골염인 의약 조성물.