KR20210024015A

KR20210024015A - 상처 치유에 사용하기 위한 루브리신

Info

Publication number: KR20210024015A
Application number: KR1020217001530A
Authority: KR
Inventors: 로만 크라웨츠; 살림 아부바커; 제프리 알란 비에르나스키; 탄닌 애버리 슈미트
Original assignee: 루브리스 엘엘씨
Priority date: 2018-06-21
Filing date: 2019-06-21
Publication date: 2021-03-04
Also published as: AU2019290206A1; MX2020013869A; CL2021001429A1; TW202017587A; CA3104296A1; EP3810181A1; JP2021527645A; CL2020003303A1; CN112351792A; WO2019246522A1; EP3810181A4; US20210260167A1; BR112020025148A2

Abstract

본 출원은 상처 치유 및 조직 재생, 흉터 형성 감소 및 혈관신생 촉진에서 루브리신으로도 공지된 프로테오글리칸 4 단백질의 용도에 관한 것이다.

Description

상처 치유에 사용하기 위한 루브리신

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2018년 6월 21일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 62/688,163에 대한 우선권 및 이익을 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 루브리신으로도 공지된 인간 당단백질 PRG4의 새로운 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 상처 치유를 촉진하기 위한 작용제로서 PRG4를 사용하는 것에 관한 것이다.

프로테오글리칸 4 유전자 (PRG4)는 거핵구 자극 인자 (MSF)뿐만 아니라 루브리신으로도 공지된 "표재 영역 단백질"의 고도로 당화된 상이한 스플라이스 변이체 및 당형 (glycoform)을 코딩한다. 표재 영역 단백질은 처음에는 표재 영역으로부터의 체외이식편 연골의 표면에 국한되었으며 조건화된 배지에서 확인되었다. 루브리신으로도 공지된 PRG4는 처음에는 활액으로부터 단리되었으며, 연골-유리질 경계면에서 및 라텍스-유리질 경계면에서 활액과 유사한 시험관내 윤활 능력을 나타내었다. 이는 후에 활막 섬유모세포의 생성물로 확인되었으며, 이의 윤활 능력은 엑손 6에 의해 코딩된 940개 아미노산의 큰 뮤신 유사 도메인 내의 O-연결된 β(1-3)Gal-GalNAc 올리고당류에 의존적인 것으로 밝혀졌다. 루브리신 분자는 차별적으로 당화되며, 여러 자연 발생 스플라이스 변이체가 보고되었다. 이들은 본원에서 총칭하여 PRG4로 지칭된다. PRG4는 체내에서 활막, 힘줄, 반달연골과 같은 관절 연골의 표면 및 다른 부위 중에서도 눈의 보호막에 존재하는 것으로 밝혀졌으며, 관절 윤활 및 활막 항상성에 중요한 역할을 한다.

루브리신은 하중 지지 표면 사이의 마찰을 감소시키는 것으로 널리 공지되어 있으며 (Swann et al., J Biol Chem, 1981, 256: 5921-5; Schmidt et al., JAMA Ophthalmol, 2013, 131(6):766-76), 따라서 잠재적인 이익에 대한 연구는 주로 관절에 초점을 맞추었다; 그러나, 루브리신은 간, 심장, 폐, 신장 및 다른 조직에서도 발현되지만 (Ikegawa et al., Cytogenet Cell Genet, 2000, 90(3-4):291-7), 이러한 조직에서의 그의 역할은 아직 정의하기 어렵다. 굴지증 관절병증 내반고 심장막염 (Camptodactyly Arthropathy Coxa Vara Pericarditis: CACP) 질환은 PRG4의 돌연변이와 연관이 있으며 (Marcelino et al., Nat Genet, 1999, 23(3):319-22), 이러한 환자들은 관절 퇴화, 만성 염증 및 심장막염을 앓으며 (Mannurita et al., Eur J Hum Gen, 2014, 22:197-201), 이는 루브리신이 윤활 외에도 다수의 생물학적 기능을 가지고 있음을 시사한다.

인간에서, 루브리신은 관절의 활액에서 고농도로 발견되고 (~400 μg/mL), 혈액에서는 더 낮은 농도로 관찰되었다 (>100 μg/mL) (Ikegawa et al., Cytogenet Cell Genet, 2000, 90(3-4):291-7; Ai et al. PLoS One, 2015, 10(e0116237)). 그러나, 본원에 나타난 바와 같이, 본 출원인은 루브리신이 그의 윤활 및 항부착 특성을 넘어서 확장된다는 것을 발견하였다. 따라서, 이전 공개물에서는 루브리신의 상실이 조직 퇴화로 이어질 수 있음을 보여준 반면 (Jay et al., Arthritis Rheum, 2010, 62(8):2382-91; Ruan et al., Transl Med, 2013, 5(176); Jay et al., Matrix Biology, 2014, 39:17-24), 본 출원인은 루브리신이 상처 치유 및 조직 재생에 중요한 역할을 한다는 것을 처음으로 입증하였다고 믿는다. 특히, 본 출원인은 루브리신이 조직 손상 부위에서 발현되고 상처 치유를 촉진하는 생리적 반응을 촉발하여 흉터 형성을 억제한다는 것을 발견하였다.

본 발명은 상처 치유 및 조직 재생을 촉진하는데 PRG4의 이전에 알려지지 않은 개입을 이용한다. 본 출원인의 기본 발견은 PRG4가 상처 치유를 촉진하는 추정 메커니즘에 대한 이해이다. 본원에 나타난 바와 같이, PRG4는 1) 섬유화 반응을 억제하고, 2) 혈관신생 및 손상으로의 혈류를 증가시키고, 3) 염증 반응 (예컨대, 대식세포 분극화)을 조절하고, 4) 조직 복구를 매개하도록 면역 세포 및 성체 줄기 세포 (MSC)를 동원함으로써 내인성 복구 및 재생을 향상시킬 수 있다. 따라서, PRG4는 상처를 치유하도록 하는 다수의 새로운 방식으로 사용될 수 있다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 흉터 형성을 감소시키면서 조직 재생 또는 상처 치유를 촉진하는 방법을 제공한다. 방법은 루브리신을 포함하는 제약 제제를 이를 필요로 하는 환자의 상처 또는 조직 손상 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 루브리신은 재조합 인간 루브리신이다. 한 실시양태에서, 루브리신은 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1의 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 루브리신은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 루브리신은 인간 루브리신의 공지된 상동체 또는 변이체이다.

한 실시양태에서, 상처는 피부에 존재한다. 예컨대, 상처는 피부의 표피, 진피 및/또는 하피에 존재한다. 한 실시양태에서, 상처는 표피에 있다. 또 다른 실시양태에서, 상처는 표피 및 진피에 있다. 또 다른 실시양태에서, 상처는 표피, 진피 및 하피에 있다. 또 다른 실시양태에서, 상처는 진피 및 하피에 있다. 또 다른 실시양태에서, 상처는 하피에 있다. 또 다른 실시양태에서, 상처는 진피에 있다.

한 실시양태에서, 상처 또는 조직 손상은 눈에 있다. 예컨대, 한 실시양태에서, 상처 또는 조직 손상은 각막에 있다.

한 실시양태에서, 상처 또는 조직 손상은 피부에 대한 자상, 천자창, 열상, 찢어짐, 화상, 긁힘 또는 찰과상, 또는 외과적 절개이다. 또 다른 실시양태에서, 상처는 타박상이다. 또 다른 실시양태에서, 상처는 화상이다. 또 다른 실시양태에서, 상처는 진피 궤양이다. 궤양은 욕창 (압박) 궤양, 당뇨병성 궤양이거나 박테리아 감염 또는 괴사로 인해 발생될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상처 또는 조직 손상은 여드름일 수 있다. 추가의 실시양태에서, 상처 또는 조직 손상은 이전에 형성된 흉터 조직이 외과적으로 절제된 부위이다. 또 다른 실시양태에서, 상처는 비-관절, 비-골 (non-osseous), 및 비-골 (non-osteal) 부위에 있고, 상처는 뼈, 관절, 관절 연골, 힘줄 또는 인대에 있지 않다.

한 실시양태에서, 루브리신은 1 μg/mL 내지 1 mg/mL의 농도로 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 루브리신은 100 μg/mL의 농도로 제공된다. 추가의 실시양태에서, 루브리신은 상처 면적 cm²당 50 μg 내지 1000 μg의 양으로 제공된다. 추가의 실시양태에서, 루브리신은 상처 면적 cm²당 50 μg 내지 500 μg의 양으로 제공되고, 또 다른 실시양태에서, 루브리신은 상처 면적 cm²당 약 75-100 μg의 양으로 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 루브리신은 상처 면적 cm²당 10-150 μg의 양으로 제공된다.

추가의 실시양태에서, 루브리신을 함유하는 제약 제제는 용액, 현탁액, 에멀젼, 로션, 크림, 겔, 페이스트 또는 연고로서 투여된다. 한 실시양태에서, 용액은 조직 손상 부위에 국소적으로 점적으로 또는 조직 손상 부위에 주사에 의해 투여된다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 조직 손상 부위에 국소적으로 적용되거나, 손상 부위에 주사에 의해 투여된다. 추가의 실시양태에서, 제약 제제는 히알루론산을 포함하지 않는다.

다른 실시양태에서, 제약 제제는 상처에 적용된 상처 드레싱의 함침물로서 상처 또는 조직 손상에 투여된다.

한 실시양태에서, 제약 제제는 진통제와 함께 투여되거나 투여되는 제약 조성물은 진통제를 함유한다. 예컨대, 진통제는 리도카인 또는 벤조카인이다.

한 실시양태에서, 제약 제제는 항생제 또는 항염증제와 함께 투여되거나, 투여되는 제약 조성물은 항생제 또는 항염증제를 함유한다. 예컨대, 항생제는 네오마이신, 폴리믹신 b, 바시트라신, 에리트로마이신, 레타파물린, 술파세타미드 나트륨, 무피로신, 프라목신, 은 술파디아진, 마페니드 또는 오제노악사신이다. 예컨대, 항염증제는 히드로코르티손이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 흉터 형성을 감소시키면서 조직 재생 또는 상처 치유를 촉진하는데 사용하기 위한 루브리신을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 혈관신생 유도를 필요로 하는 환자의 신체 부위에서 혈관신생을 유도하는 방법을 제공한다. 방법은 루브리신을 포함하는 제약 제제를 새로운 혈관 형성을 유도하기에 충분한 양으로 부위에 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 루브리신은 재조합 인간 루브리신이다. 한 실시양태에서, 루브리신은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는다. 한 실시양태에서, 루브리신은 청구항 1의 서열과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 루브리신은 1 μg/mL 내지 1 mg/mL의 농도, 예컨대 100 μg/mL로 제공될 수 있다. 루브리신은 부위 면적 cm²당 10-150 μg의 양으로 제공될 수 있고, 또 다른 실시양태에서 루브리신은 부위 면적 cm²당 75-100 μg의 양으로 제공된다.

혈관신생을 촉진하기 위해, 루브리신은, 예컨대 부위에 국소적으로 또는 주사에 의해 부위에 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 히알루론산을 포함하지 않는다. 추가의 실시양태에서, 혈관신생을 필요로 하는 부위는 피부에 대한 자상, 천자창, 열상, 찢어짐, 긁힘 또는 찰과상, 외과적 절개, 또는 화상 또는 타박상 또는 궤양과 같은 조직 손상 또는 상처 부위이다. 예컨대, 조직 손상 또는 상처 부위는 표피일 수 있고, 상처의 깊이에 따라 진피 또는 하피를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 조직 손상 또는 상처 부위는 눈에 있지만 각막에는 없다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 루브리신을 포함하는 혈관신생 촉진에 사용하기 위한 제약 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

한 측면에서 본 발명은 눈의 비정상적 상처 치유를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 방법은 비정상적 상처 치유를 겪고 있거나 그의 위험이 있는 눈에 루브리신을 투여하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 비정상적 상처 치유는 각막의 흉터형성이고, 다른 실시양태에서, 이는 각막 혼탁이다. 한 실시양태에 따라, 루브리신은 1 μg/mL 내지 1 mg/mL의 농도 및/또는 상처의 크기를 기준으로 하여 cm²당 10-150 μg의 양으로 제공된다. 한 실시양태에서, 루브리신은 서열식별번호: 1의 서열 또는 서열식별번호: 1의 잔기 25-1404와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 한 실시양태에서, 루브리신은 점적제 또는 연고로서 안과적으로 투여된다. 한 실시양태에서, 루브리신은 각막이식술 (keratinoplasty), 굴절교정 각막절제술(photorefractive keratectomy), 레이저 상피하 각막절삭성형술, 또는 레이저 정위치 (in situ) 각막절삭성형술의 완료 시 눈에 투여된다.

특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 컬러 도면(들)을 갖는 이 특허 또는 특허 출원 공개물의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불 시 청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 루브리신이 상처 치유를 조절하는 제안된 메커니즘을 보여주는 개략도이다.
도 2는 초기 손상 시점부터 몇 주에 걸쳐 측정된 C57BL/6 마우스의 귀에 있는 상처 (초기 2 mm 직경 펀치)의 직경 (mm)을 보여주는 선 그래프이다. 루브리신 처리는 상처 치유를 상당히 증가시키는 반면, 루브리신의 녹아웃은 상처 치유를 차단한다는 것을 보여준다 (n=12/그룹).
도 3은 마우스 귀 조직의 4장의 면역조직화학 염색 사진을 포함한다. 녹색 염색은 루브리신의 존재를 나타내는 반면, 청색 염색은 루브리신을 발현하지 않는 세포의 존재를 나타낸다. 나타난 바와 같이, 루브리신 녹아웃 마우스에서는 청색 염색의 존재로만 표시되는 바와 같이 루브리신이 존재하지 않는 반면 (왼쪽 하단 패널), MRL "슈퍼 치유자" 마우스에서는 조직 전체에 걸쳐 녹색 염색으로만 표시되는 바와 같이 루브리신이 샘플 전체에 걸쳐 풍부하다 (오른쪽 상단 패널). C57BL/6 루브리신 처리된 마우스에서는 비록 MRL 마우스와 동일한 정도는 아니지만 전체에 걸쳐 녹색 염색으로 표시되는 바와 같이 루브리신이 조직 전체에 걸쳐 가시적인 반면 (오른쪽 하단 패널), 비처리된 C57BL/6 마우스에서는 단지 약간의 녹색 반점과 함께 전체에 걸쳐 청색 염색으로 표시되는 바와 같이 루브리신이 없다 (왼쪽 상단 패널). 따라서, 도 3은 자발적 수퍼 치유자 (예컨대, MRL 마우스)에서 손상 후 루브리신 염색이 증가하며, 루브리신 염색이 손상 후 치유 증가 및 섬유화/흉터형성 감소와 상관 관계가 있음을 보여준다.
도 4는 초기 손상 시점부터 몇 주에 걸쳐 측정된 펀치 손상 부위의 마우스 귀에서 관류 단위 (PU)의 혈류를 보여주는 선 그래프이며, 루브리신 처리가 손상 부위에서 혈류를 상당히 증가시킨다는 것을 보여준다 (n=12/그룹).
도 5는 손상 부위를 둘러싼 치유 조직에서 CD31+ 혈관의 수에 의해 입증되는 바와 같이 펀치 손상을 겪고 있는 마우스 귀에서 혈관신생 수준을 보여주는 선 그래프이다. 귀 손상 후, 루브리신 처리된 동물에서는 증가된 혈관 수가 관찰되는 반면, 루브리신 KO 동물에서는 더 적은 혈관이 관찰된다 (n=12).
도 6은 DAPI 또는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌을 사용한 마우스 귀 조직의 일련의 면역조직화학 염색 이미지이며, 여기서 조직은 손상되지 않았으며 (상단 패널), 손상되고 담체가 투여되었으며 (중간 패널), 손상되고 PRG4가 투여되었다 (하단 패널). 적색은 중간엽 줄기 세포 (MSC)의 존재를 나타내며, 이는 손상되지 않은 조직에는 존재하지 않고, 담체만 투여된 손상된 조직에는 소수가 존재하고, 루브리신이 투여된 손상된 조직에는 이미지 전체에 걸쳐 적색 도트로 나타나는 바와 같이 다수가 존재한다. 도 6은 MSC가 손상 영역으로 이동하고 루브리신에 반응한다는 것을 보여준다. 귀에서 MSC (적색)는 손상되지 않은 조직에서는 다량으로 관찰되지 않지만 손상 후에는 관찰될 수 있다. 루브리신 처리를 통해 MSC는 귀의 훼손된 연골 구조를 완전히 재생시킨다 (n=5/그룹).
도 7은 표면 플라스몬 공명으로 측정된 공명 단위 (RU) 대 농도로 측정된 PAI-1 (플라스미노겐 활성제 억제제-1) 루브리신 결합 친화도를 나타내는 선 그래프이다. 루브리신은 PAI-1에 직접적으로 결합할 수 있으며, 결합 상수는 2.712 x 10^-6M으로 2개의 생체분자 간의 강력한 결합을 나타낸다.
도 8a-e는 루브리신이 다수의 세포 유형 및 생체내에서 HIF1a 및 VEGF를 어떻게 상향조절하는지 보여주는 그래프이다. 정상 및 골관절염 (OA) 인간 관절의 활막 섬유모세포는 루브리신 (100 μg/mL)에 노출되었다 (도 8a 및 8b). 정상 및 OA 세포에서, 루브리신은 HIF1a 및 VEGF mRNA의 발현을 상당히 상향조절하였다. 이 관찰은 HEK293 세포에서 검증되었으며, HIF1a 및 VEGF mRNA가 모두 루브리신 처리 후 상향조절되는 것으로 관찰되었다 (도 8c). 도 8a-c의 막대 그래프에서, 루브리신 처리는 왼쪽에 막대로 표시되고 (상단에 *로 표시됨) PBS 대조군은 오른쪽에 막대로 표시되며, 도 8a-c 각각에서 루브리신 막대는 PBS 막대보다 높다. ELISA는 VEGF의 수준을 검증하는데 사용되었다 (도 8d). 도 8d에서 왼쪽에서 오른쪽으로 가장 왼쪽에 있는 2개의 막대는 PBS (왼쪽) 또는 루브리신 (오른쪽)으로 처리된 정상 활막 세포에서 pg/mL의 단백질 농도를 나타내고, 가운데 2개의 막대는 PBS (왼쪽) 또는 루브리신 (오른쪽)으로 처리된 골관절염 활막 세포에서 pg/mL의 단백질 농도를 나타내고, 가장 오른쪽 막대는 PBS (왼쪽) 또는 루브리신 (오른쪽)으로 처리된 HEK293 세포에서 pg/mL의 단백질 농도를 나타낸다. 도 8e는 루브리신을 주사한 래트에서 루브리신 주사 후 14-28일에 VEGF가 전신적으로 상향조절되었음을 보여준다. *가 있는 제14일, 제29일 및 제24일에 점을 갖는 막대 그래프의 상단 선은 루브리신으로 처리된 마우스의 VEGF 수준을 나타내는 반면, 하단 선은 비처리된 마우스의 VEGF 수준을 나타낸다.
도 9는 루브리신 녹아웃 마우스 (KO)와 대비하여 C57BL/6에서 대식세포로부터 분비된 IL-1, IL-6 및 TNFα의 수준을 보여주는 막대 그래프이다. (*는 p <0.05의 유의성을 나타낸다). 루브리신 KO 대식세포의 분극화는 야생형 대조군과 비교하여 염증유발성 인자를 증가시킨다 (n=4).
도 10은 TLR4 녹아웃 세포, 루브리신 투여된 TLR4 녹아웃 세포, 루브리신 녹아웃 세포, 및 PAI-1 투여된 루브리신 녹아웃 세포에서 HIF1a 및 VEGF의 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 유전자 발현 수준은 리보솜 서브유닛 18s에 대해 정규화된다. 루브리신 처리 후 HIF1α 및 VEGF 상향조절은 TLR4 및 PAI-1과 무관하다 (n=5).
도 11은 귀 손상 1주일 후 손상 부위에서 C57BL/6 마우스, 루브리신 투여된 C57BL/6 마우스, 루브리신 녹아웃 (KO) 마우스의 CD14+ 대식세포 및 GR1+ 호중구의 존재를 보여주는 유동 세포측정 데이터이다. 데이터에 나타난 바와 같이, 손상 후, C57BL/6 및 루브리신 KO 마우스와 비교하여 루브리신 처리된 손상 부위 내에서 2배 많은 호중구 및 대식세포가 발견된다. (n=6/그룹, 3명의 남성 및 3명의 여성).
도 12는 전장 (말단절단되지 않은) 인간 PRG4의 아미노산 서열 (서열식별번호: 1: 1404개 잔기)이다. 잔기 1-24 (굵게 표시됨)는 신호 서열을 나타내고, 잔기 25-1404는 인간 PRG4의 성숙한 서열을 나타낸다. 당단백질은 활성 형태의 신호 서열을 필요로 하지 않는다.
도 13a-c는 전장 1404 AA 인간 PRG4 단백질을 코딩하는 PRG4 유전자에 대한 핵산 서열 (서열식별번호: 2)을 제공한다.
도 14a는 손상 4주 후 C57BL/6 마우스 및 PRG4 녹아웃 마우스에서 귀 펀치 상처의 사진이다. 원래 손상은 4 mm² 펀치였다. 왼쪽 귀는 대조군으로 담체 (DMSO)로 처리된 반면, 오른쪽 귀는 rhPRG4로 처리되었다. PRG4 처리된 귀에서 펀치 상처는 비처리된 귀에 비해 상당히 닫혔다.
도 14b는 표시된 바와 같이 귀 펀치 손상을 받고 DMSO 또는 rhPRG4로 처리된 C57BL/6 마우스 및 PRG4-/- 마우스에 대한 상처 면적 (mm²) 대 손상 후 시간 (주)의 선 그래프이다. 점선은 PRG4 처리를 나타낸다. N=12/그룹 (6명의 남성 및 6명의 여성). 원래 손상은 4 mm² 펀치였다.
도 14c-d는 표시된 바와 같이 귀 펀치 손상을 받고 DMSO 또는 rhPRG4로 처리된 C57BL/6 마우스, PAI-/- 마우스, TLR4-/- 마우스 및 PAI-/- TLR4-/- 마우스에 대한 상처 면적 (mm²) 대 손상 후 시간 (주)의 선 그래프이다. N=12/그룹 (6명의 남성 및 6명의 여성). 원래 손상은 4 mm² 펀치였다.
도 15는 귀 펀치로의 손상 이후 주어진 날에 대식세포 (F4/80+; 왼쪽) 및 중간엽 줄기 세포 (MSC; 오른쪽)에서 VEGF (상단), TGFβ (중간) 및 PRG4 (하단)의 상대적 발현을 보여주는 일련의 막대 그래프이다. (시점당 n=3).
도 16a-b는 C57BL/6 마우스, PRG4-/- 녹아웃 마우스 및 TLR4-/-에서 CD38+ 대식세포 (M1) 및 CD206+ 대식세포 (M2)의 존재를 보여주는 유동 세포측정 데이터뿐만 아니라 다양한 처리 그룹에서 CD38+ 세포의 백분율을 보여주는 막대 그래프를 포함한다.
도 17은 손상 4주 후 αSMA (백색)을 갖는 마우스 귀 조직의 일련의 면역조직화학 염색 이미지를 보여준다. 백색 선은 원래 상처 부위를 나타낸다. (n=6/그룹, 3명의 남성 및 3명의 여성).
도 18a-b는 표시된 바와 같이 rhPRG4 또는 DMSO로 처리된 손상되지 않은 C57BL/6 마우스 및 TLR4-/-로부터 취한 대식세포 (F4/80+) 및 MSC (Sca1+ CA140a+)의 존재를 보여주는 유동 세포측정 데이터뿐만 아니라 표시된 바와 같은 다양한 처리 그룹에서 상대적인 NFκB 발현 또는 상대적인 유전자 발현을 보여주는 막대 그래프를 포함한다. (n=6/그룹, 3명의 남성 및 3명의 여성).
도 19는 손상 후 몇 주 동안 측정된 손상 이전의 손상되지 않은 혈류 수준과 비교한 마우스 귀의 손상 부위의 혈류를 보여주는 선 그래프이다. rhPRG4 처리는 손상 부위에서 혈류를 상당히 증가시켰다. (n=6/그룹, 3명의 남성 및 3명의 여성). 원래 손상은 4 mm² 펀치였다.
도 20은 표시된 바와 같은 다양한 처리 그룹에서 손상 1주 후 손상된 마우스 귀 내의 mm²당 CD31+ 혈관의 수의 산점도이다. (n=6/그룹, 3명의 남성 및 3명의 여성). 원래 손상은 4 mm² 펀치였다.
도 21은 DAPI 또는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌을 사용한 마우스 귀 조직의 일련의 면역조직화학 염색 이미지이다. 상단 패널에서, 조직 샘플 전체에 걸쳐 널리 퍼진 청색 염색의 존재는 핵을 나타내며, 또한 이미지 전체에 존재하는 적색 염색의 존재는 MSC를 나타낸다. 이러한 MSC의 기여는 왼쪽 하단 패널 (PRG4로 처리)에서 새로운 조직 (#1 피부, #2 연골 및 #3 모공)으로 추적되는 반면, 오른쪽 패널의 DMSO 처리된 마우스에서 MSC는 섬유화-유사 조직 (#4)에 기여하였다.

상처 치유는 조직이 손상 후 자기자신을 복구하는 복잡한 과정으로, 지혈, 염증, 혈관신생을 포함한 새로운 조직의 증식 및 성장, 조직의 재형성 또는 성숙을 포함하는 다양한 생리적 과정을 포함한다. 상처는 신체 조직의 외부 또는 내부 파손을 수반하는 손상이다. 예컨대, 상처는 신체 내부의 기관 또는 조직의 상피층의 파손을 수반하는 내부일 수 있거나, 피부 또는 눈의 상피층의 파손을 수반하는 외부일 수 있다. 상처 치유는 이러한 상처가 복구되고 신체 조직의 파손이 닫히는 과정을 지칭한다.

조직 통합성/항상성을 회복하는 것은 삶과 죽음의 차이일 수 있기 때문에, 상처 치유 반응은 동물계에서 가장 원초적이고 보존된 생리적 반응 중 하나이다. 포유동물에서의 상처 치유는 주로 면역 세포, 및 성체 줄기 세포를 포함한 다른 조직 상주 세포를 조절하여 흉터 형성을 통해 상처 봉합을 매개할 수 있는 염증성 신호전달 분자에 의해 매개된다. 본원에서 입증되는 바와 같이, 본 출원인은 물고기에서 코끼리에 이르기까지 동물계 전체에서 발견되는 단백질인 루브리신 (Ikegawa et al., Cytogenet Cell Genet, 2000, 90(3-4):291-7)이 손상 직후 줄기 세포에서 고도로 발현됨을 관찰하였다.

본원에서 입증되는 바와 같이, 루브리신은 1) 섬유화 반응을 억제하고, 2) 혈관신생 및 손상으로의 혈류를 증가시키고, 3) 염증 반응을 조절하고 (예컨대, M1에 비해 M2로의 대식세포 분극화), 및 4) 조직 복구를 매개하도록 면역 세포와 성체 줄기 세포 (MSC)를 동원함으로써 내인성 상처 복구 및 조직 재생을 향상시킨다.

도 1은 루브리신이 이러한 효과를 달성하는 잠재적 메커니즘을 도시한다. 본질적으로, 정상 수준의 루브리신이 상처 부위에 존재하면 섬유화 및 증가된 염증유발성 시토카인은 흉터형성을 유발하는 반면, 루브리신이 생리적으로 이용가능한 수준보다 증가된 수준으로 상처 부위에 존재하면 섬유화가 억제되고, 대식세포는 M2 분극화를 나타내어 항염증성 시토카인의 발현을 유도하고, 다른 경로가 활성화되어 혈관신생 및 면역 및 중간엽 줄기 세포 (MSC) 동원을 유도하여 흉터 형성을 최소화하거나 전혀 없이 우수한 상처 치유가 가능하다. 따라서, 본 발명에 따라 및 본원에서 입증되는 바와 같이, 루브리신은 흉터 형성을 유발하는 섬유화를 감소 또는 억제할뿐만 아니라, 대식세포가 항염증성 시토카인의 발현을 유도하는 M2 분극화를 나타내도록 촉진하고, 혈관신생 및 면역 및 중간엽 줄기 세포 (MSC) 동원을 유도하는 다른 경로를 활성화시킴으로써 상처 치유 및 조직 재생을 촉진한다.

많은 조직이 정상적인 상황에서 적절한 상처 치유를 나타내지만, 일차적 상해 (손상/질환)가 지속되는 경우, 만성 염증 및 부적절한 섬유화 복구를 초래할 수 있다. 만성 염증은 궤양성 병변에서 명백한 것처럼 치유를 막는다. 피부의 지속적 섬유화는 흉터형성 및 기형을 유도하고, 기관에서 기질의 점진적인 침착은 구조 및 기능을 손상시켜 질환 및 사망을 유발한다 (Gurtner et al., Nature, 2008, 453:314).

본원에 기재된 상처 치유에서 루브리신에 의해 조절되는 경로의 이해는 루브리신이 동일한 종류의 정상 세포에 의한 손상된 조직의 재생을 촉진하는데 사용될 수 있으며, 루브리신의 발현을 조절함으로써 섬유화 복구 반응 대신 재생 반응을 촉발함으로써 상처 치유가 향상될 수 있다는 것을 시사한다.

섬유화 복구 반응은 흉터 조직 형성을 초래한다. 이 생리적 과정에서, 손상된 조직은 섬유화로 인해 (정상 조직보다는) 흉터 조직으로 대체되어 정상 피부와는 다른 방식으로 콜라겐이 침착된다. 그러나, 본 발명의 방법은 조직의 재생 또는 신생을 발생시키는 상처 치유에 대한 생리적 접근, 즉 손상된 조직을 섬유성 흉터형성 침착물보다는 새로운 정상 및 기능적 조직으로 대체하는 것을 촉진한다. 예컨대, 본 발명의 방법에 따라, 훼손되거나 손상된 조직은 정상적이고 건강한 세포/조직으로 대체되고, 손상 부위에서 흉터 형성이 감소되거나 제거된다. 본원에서 입증되는 바와 같이, 이러한 재생 반응은 혈관신생을 촉진하고, 섬유화 반응을 억제하고, M1로부터 M2로의 대식세포 분극화를 촉진하여 염증 반응을 염증유발에서 항염증으로 조정하고, 조직 복구 및 조직 손상 부위를 매개하도록 면역 세포 및 성체 줄기 세포 (MSC)를 동원하는 루브리신의 능력 때문이다.

따라서, 본 발명은 상처에 루브리신 (PRG4)을 투여하여 흉터 형성을 감소시키면서 상처 치유 또는 조직 재생을 촉진하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에 따라, 상처 부위에서 관찰된 조직 재생 수준은 외인성 루브리신을 사용하지 않고 발생할 수 있는 것보다 더 크고, 흉터 형성 수준은 외인성 루브리신을 사용하지 않았을 때와 비교하여 감소된다.

PRG4 단백질

루브리신으로도 지칭되는 PRG4는 인간에서 PRG4로도 공지된 거핵구 자극 인자 (MSF) 유전자로부터 발현되는 윤활 폴리펩티드이다 (NCBI 수탁 번호 AK131434-U70136 참조). 루브리신은 신체의 관절이 있는 표면을 덮는 편재하는 내인성 당단백질이다. 루브리신은 높은 표면 활성 분자로 (예컨대, 물을 보유함), 주로 강력한 세포보호, 항부착 및 경계 윤활제 역할을 한다. 분자는 분자가 조직 표면을 부착하고 이를 보호할 수 있도록 하는 말단 단백질 도메인 사이에 위치된 긴 중앙 뮤신-유사 도메인을 갖는다. 조사된 모든 포유동물에서 그의 천연 형태는 KEPAPTT (서열식별번호: 3)와 적어도 50% 동일한 아미노산 서열의 다중 반복을 함유한다. 천연 루브리신은 전형적으로 이 반복의 다중 중복 형태를 포함하며, 이는 전형적으로 프롤린 및 트레오닌 잔기를 포함하며, 적어도 하나의 트레오닌은 대부분의 반복에서 당화된다. 트레오닌 고정된 O-연결된 당 측쇄는 루브리신의 경계 윤활 기능에 중요하다. 측쇄 모이어티는 전형적으로 β(1-3)Gal-GalNAc 모이어티이고, β(1-3)Gal-GalNAc는 전형적으로 시알산 또는 N-아세틸뉴라민산으로 캡핑된다. 폴리펩티드는 또한 N-연결된 올리고당류를 함유한다. 자연-발생 전장 루브리신을 코딩하는 유전자는 12개의 엑손을 함유하고, 자연-발생 MSF 유전자 생성물은 헤모펙신-유사 및 소마토메딘-유사 영역을 포함하여 비트로넥틴에 대해 다중 폴리펩티드 서열 상동성을 갖는 1,404개의 아미노산 (분비 서열 포함)을 함유한다. 중앙에 위치된 엑손 6은 940개의 잔기를 함유한다. 엑손 6은 반복된 풍부한 O-당화된 뮤신-유사 도메인을 코딩한다.

루브리신의 단백질 백본의 아미노산 서열은 인간 MSF 유전자의 엑손의 대체 스플라이싱에 따라 달라질 수 있다. 이질성에 대한 이러한 견고성은 연구자들이 중앙 뮤신 도메인으로부터 약화되기는 하였지만 여전히 합리적인 윤활을 달성하는 474개 아미노산이 누락된 재조합 형태의 루브리신을 만들었을 때 예시되었다 (Flannery et al., Arthritis Rheum 2009; 60(3):840-7). PRG4는 단량체로서뿐만 아니라 N- 및 C-말단 모두에서 보존된 시스테인-풍부 도메인을 통해 디술파이드-결합된 이량체 및 다량체로서 존재하는 것으로 밝혀졌다. 루브리스, 엘엘씨 (Lubris, LLC)는 인간 루브리신의 전장 재조합 형태를 개발하였다. 분자는 셀렉시스 (Selexis) 차이니즈 햄스터 난소 세포주 (CHO-M)를 사용하여 발현되며, SDS 트리-아세테이트 3-8% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분자량 표준과 비교하여 평가되는 바와 같이, 최종 겉보기 분자량은 450-600 kDa이고, 다분산 다량체는 빈번하게 1,000 kDa 또는 그 초과에서 측정된다. 전체 당화 중 약 절반은 2개의 당 단위 (GalNAc-Gal)를 포함하고, 절반은 3개의 당 단위 (GalNAc-Gal-시알산)를 포함한다. 이러한 재조합 인간 PRG4 생성 방법은 국제 특허 출원 번호 PCT/US014/061827에 개시되어 있다.

다양한 천연 및 재조합 PRG4 단백질 및 이소형 중 임의의 하나 이상이 본원에 기재된 다양한 실시양태에서 이용될 수 있다. 예컨대, 미국 특허 번호 6,433,142; 6,743,774; 6,960,562; 7,030,223, 및 7,361,738은 다양한 형태의 인간 PRG4 발현 생성물을 만드는 방법을 개시하고 있으며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 실시에 사용하기에 바람직한 것은 CHO 세포로부터 발현된 전장의 당화된 재조합 PRG4 또는 루브리신이다. 이 단백질은 O-연결된 β(1-3)Gal-GalNAc 올리고당류로 다양하게 당화된 서열 KEPAPTT (서열식별번호: 3)의 반복을 포함하는 중앙 엑손을 포함하고, 및 비트로넥틴과 상동성을 갖는 N 및 C-말단 서열 포함하는 1,404개의 아미노산 (도 12; 서열식별번호: 1 참조)을 포함한다. 분자는 다양한 개별 분자의 당화 패턴으로 다분산되어 있으며, 단량체, 이량체 및 다량체 종을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "PRG4"는 용어 "루브리신"과 상호 교환적으로 사용된다. 광범위하게, 이러한 용어는 이의 임의의 기능적 단리 또는 정제된 천연 또는 재조합 PRG4 단백질, 상동체, 기능적 단편, 이소형 및/또는 돌연변이체를 지칭한다. 모든 유용한 분자는 엑손 6에 의해 코딩된 서열, 또는 이의 상동체 또는 말단절단된 버전, 예컨대, 바람직하게는 O-연결된 당화와 함께, 이 중앙 뮤신-유사 KEPAPTT-반복 도메인 내에서 더 적은 반복을 갖는 버전을 포함한다. 모든 유용한 분자는 또한 엑손 1-5 및 7-12에 의해 코딩된 서열의 적어도 생물학적 활성 부분, 즉 ECM 및 내피 표면에 대한 친화성을 분자에 부여하는데 책임이 있는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, PRG4 단백질의 하나 이상의 생물학적 활성 부분, 또는 윤활 단편과 같은 기능적 단편, 또는 그의 상동체를 포함하는 바람직한 PRG4 단백질은 평균 몰 질량이 50 kDa 내지 500 kDa, 바람직하게는 224 내지 467 kDa이다. 보다 바람직한 실시양태에서, PRG4 단백질은 평균 몰 질량이 220 kDa 내지 약 280 kDa인 단량체를 포함한다.

일부 실시양태에서, 서열식별번호: 1, 또는 PRG4의 엑손 1-5 및 7-12에 의해 코딩된 서열, 또는 서열식별번호: 1의 잔기 25-1404와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 기능적 또는 생물학적 활성 PRG4 단편 및 상동체가 고려된다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 1의 잔기 25-1404와 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 98% 서열 동일성을 갖는 기능적 또는 생물학적 활성 PRG4 단편 및 상동체가 고려된다. 또 다른 실시양태에서, PRG4는 재조합 인간 루브리신이다. 또 다른 실시양태에서, PRG4는 서열식별번호: 1의 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, PRG4는 서열식별번호: 1의 잔기 25-1404의 아미노산 서열을 갖는다.

2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산의 동일성 백분율을 결정하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다 (예컨대, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열에 갭이 도입될 수 있다). 2개의 서열 사이의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, 상동성% = (동일 위치의 #/전체 위치의 #) x 100). 2개의 서열 사이의 상동성 백분율은 수학적 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 2개의 서열의 비교에 사용되는 수학적 알고리즘의 비제한적인 예는 문헌 (Karlin and Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-77)에서와 같이 변형된 문헌 (Karlin and Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-68)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 문헌 (Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol., 215:403-10)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램에 포함된다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 단어 길이 = 12로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적으로 갭 정렬을 얻기 위해, 문헌 (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research, 25(17):3389-3402)에 기재된 바와 같이 갭 BLAST를 사용할 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 사용할 때 각각의 프로그램 (예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 기본값 파라미터를 사용할 수 있다.

일부 실시양태에서, 천연 PRG4와 비교하여 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98% 활성, 예컨대 생물학적 활성을 갖는 기능성 PRG4 단편 및 상동체가 고려된다.

PRG4 단백질과 같은 단백질의 단리, 정제 및 재조합 발현을 위한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 PCR 또는 RT-PCR과 같은 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 PRG4 단백질 또는 이소형을 코딩하는 mRNA 및 cDNA를 클로닝 및 단리하는 것으로 시작한다. PRG4 단백질 또는 이소형을 코딩하는 단리된 cDNA는 발현 벡터에 클로닝되고, 재조합 PRG4 단백질을 생성하기 위해 숙주 세포에서 발현되고, 세포 배양 상청액으로부터 단리된다. 재조합 인간 PRG4의 생성 방법은 국제 특허 출원 번호 PCT/US014/061827에 제공된다.

치료될 상처 또는 조직 손상의 유형

앞서 언급된 바와 같이, 상처는 신체 조직의 외부 또는 내부 파손을 수반하는 손상이다. 예컨대, 상처는 신체 내부의 기관 또는 조직의 상피층의 파손을 수반하는 내부일 수 있거나 피부 또는 눈의 상피층의 파손을 수반하는 외부일 수 있다. 상처 치유는 이러한 상처가 복구되고 신체 조직의 파손이 닫히는 과정을 지칭한다.

한 측면에서, 본 발명의 방법은 PRG4로의 피부의 상처 또는 손상된 조직의 치료를 제공한다. 상처는 표피, 진피, 또는 하피에 있을 수 있거나, 이러한 층 중 하나 이상에 있을 수 있다. 조직 손상은, 표피가 아직 손상되지 않았지만 진피, 하피 및 심지어 근육 조직에 대한 훼손이 존재하는 경우, 타박상, 혈종 또는 괴사를 갖는 경우에서와 같이 피부 표면 아래에 있을 수 있다.

본 발명의 방법은 자상, 열상, 찢어짐, 화상, 타박상, 찰과상, 천자창, 또는 외과적 절개와 같은 피부에 대한 상처의 치료를 고려한다. 궤양과 같은 상처의 치료도 본 발명에 의해 고려된다. 예컨대, 압박 궤양 (와창 또는 욕창), 당뇨병성 궤양, 또는 괴사 또는 감염으로 인한 궤양은 조직 재생을 촉진하고 흉터 형성을 감소시키기 위해 본 발명의 방법에 따라 루브리신으로 치료될 수 있다. 여드름은 피부의 상피 조직 파손을 수반하므로 여드름 치료도 고려된다.

본 발명의 방법은 또한 PRG4를 사용한 눈에 대한 상처의 치료 및 눈의 비정상적 상처 치유의 치료를 고려한다. 눈의 비정상적 상처 치유 및 상처 치유 장애는 염증 세포의 활성화, 성장 인자 및 시토카인의 방출, 안구 세포의 증식 및 분화, 모세혈관 투과성 증가, 기저막 기질 조성의 변경, 세포외 기질의 침착 증가, 섬유화, 신혈관증식 및 조직 재형성을 통해 심각한 안구 조직 훼손을 유도할 수 있다. 특히, 각막의 비정상적 상처 치유는 건강한 각막에 존재하지 않는 혈관 및 림프관을 생성할 수 있다. 또한, 각막 간질에 대한 손상이 항상 각막 흉터형성을 유발하는 것은 아니기 때문에, 각막 흉터형성은 눈에서 비정상적 상처 치유의 결과이다.

따라서, 본 발명의 방법은 PRG4를 사용하여 눈의 상처 또는 손상된 조직의 치료를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 루브리신을 눈에 투여함으로써 눈의 비정상적 상처 치유 또는 상처 치유 장애의 치료를 제공한다. 루브리신은 눈의 상처의 특정 위치에 투여되거나 일반적으로 눈에 투여될 수 있다. 치료될 수 있는 일부 상처는 안구 수술로 인한 상처를 포함한다. 예컨대, 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 레이저 조사에 대한 눈의 노출로 인한 각막 혼탁을 예방 및/또는 치료한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 각막에서 상처 치유를 촉진하여, 침습적 또는 비침습적 각막 수술과 관련된 외상을 포함하여 각막에 대한 외과적 상해 또는 외상과 관련된 각막 흉터 조직의 형성을 방지 또는 억제한다. 예컨대, 각막에 대한 외상은 레이저 각막이식술 또는 굴절교정 각막절제술 (PRK) 또는 레이저 정위치 각막절삭성형술 (LASIK) 또는 레이저 상피하 각막절삭성형술 (LASEK)로 인해 발생할 수 있다. 다른 실시양태에서, 눈에 대한 PRG4의 투여는 각막 상처 치유를 촉진한다. 예컨대, 본 발명의 방법에 따라 PRG4를 눈에 투여하여 각막 흉터형성을 치료 또는 예방할 수 있다. 각막 흉터형성은 다른 것 중에서, 예컨대 대상포진, 단순 포진 1 또는 2, 콘택트 렌즈 사용, 사고 또는 손상으로 인한 각막의 긁힘 또는 화상 등으로 인해 발생될 수 있다. 일부 실시양태에서, PRG4는, 예컨대 각막의 혼탁으로 인해 시야가 흐려지거나 감소될 수 있는 각막에서 기존의 흉터 조직의 존재를 감소시키기 위해 눈에 투여된다. 한 실시양태에 따라, 눈은 인간의 눈이다. 한 실시양태에 따라, 눈은 질환 또는 손상을 당할 때 비정상적 상처 치유의 위험에 놓인다. 예컨대, 제한 없이 PRK, LASEK 또는 LASIK와 같은 외과적 상해 또는 우발적 손상 또는 물체가 눈에 닿은 눈은 눈을 비정상적 상처 치유의 위험에 놓이게 할 수 있다. 예컨대, 눈을 훼손시킬 수 있는 전술된 바이러스성 질환과 같은 질환도 눈을 비정상적 상처 치유의 위험에 놓이게 한다.

본 발명의 방법은, 예컨대 낙상, 자동차 사고, 찌르기 또는 칼에 의한 상처, 총상, 둔기 외상과 같은 외상으로 인한 피부 너머의 조직 및 기관에 대한 내부 손상; 내부 출혈 또는 타박상; 또는 외과적 상해의 치료를 제공한다. 따라서, 루브리신은 신경계 조직 (뇌, 척수, 신경), 근육 조직, 상피 조직 또는 결합 조직에 투여되어 흉터 조직의 형성을 감소시키면서 상처 치유 및 조직 재생을 촉진할 수 있다. 귀, 눈, 입술, 신장, 간, 췌장, 폐, 위, 식도, 기도, 방광, 장, 결장, 심장, 내분비 기관 또는 혈관에 대한 상처의 치료 및 흉터형성의 감소가 또한 본 발명에 의해 고려된다. 내부 손상의 치료를 위해, 루브리신은 국부 주사로 투여되거나 외과적 개입을 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 상처 치유를 위한 정맥내 전신 투여도 고려된다. 본 발명은 위장관에서와 같은 상피 조직을 천공하거나 파괴하는 것과 같은 신체의 외과적 상처의 치료를 고려한다.

한 실시양태에서, 치료될 상처는 비-골 (non-osseous), 비-골 (non-osteal), 및 비-관절 위치에 있다. 한 실시양태에서, 치료될 상처는 뼈 또는 관절 또는 관절 연골 또는 힘줄 또는 인대의 상처에 있지 않다. 따라서, 본 발명은 PRG4를 흉터 형성을 감소시키면서 조직 재생 또는 상처 치유의 촉진을 필요로 하는 환자의 상처 또는 조직 손상 부위에 투여하는, 흉터 형성을 감소시키면서 조직 재생 또는 상처 치유를 촉진하는 방법을 포함하며, 여기서 상처는 뼈 또는 관절 또는 관절 연골 또는 힘줄 또는 인대에 있지 않다. 본 발명은 PRG4를 흉터 형성을 감소시키면서 조직 재생 또는 상처 치유의 촉진을 필요로 하는 환자의 상처 또는 조직 손상 부위에 투여하는, 흉터 형성을 감소시키면서 조직 재생 또는 상처 치유를 촉진하는 방법을 포함하며, 여기서 상처는 비-골 (non-osseous), 비-골 (non-osteal), 및 비-관절 위치에 있다. 한 실시양태에서, 치료될 상처는 연골의 상처에 있지 않다. 따라서, 본 발명은 PRG4를 흉터 형성을 감소시키면서 조직 재생 또는 상처 치유의 촉진을 필요로 하는 환자의 상처 또는 조직 손상 부위에 투여하는, 흉터 형성을 감소시키면서 조직 재생 또는 상처 치유를 촉진하는 방법을 포함하며, 여기서 상처는 연골에 있지 않다. 한 실시양태에서, 치료될 상처는 관절 연골이 아닌 연골의 상처이다. 따라서, 본 발명은 PRG4를 흉터 형성을 감소시키면서 조직 재생 또는 상처 치유의 촉진을 필요로 하는 환자의 상처 또는 조직 손상 부위에 투여하는, 흉터 형성을 감소시키면서 조직 재생 또는 상처 치유를 촉진하는 방법을 포함하며, 여기서 상처가 관절 연골에 있지 않다. 예컨대, 연골은 귀 또는 코에 있을 수 있다.

본 발명은 또한 피부 또는 신체의 다른 부위에 있는 환자의 기존 흉터의 외관을 제거하거나 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법에 따라, 예컨대 외과적 절제에 의해 흉터 조직을 제거하고, 흉터 제거 영역에 루브리신을 제공하여 기존 흉터 부위에서 조직 재생을 촉진할 수 있다.

본 발명의 방법은 재조합 인간 루브리신을 함유하는 제약 조성물이 상처 드레싱의 함침물로서 상처 또는 조직 손상에 적용될 수 있음을 제공한다. 상처 드레싱은 거즈, 패드 또는 붕대일 수 있다. 루브리신이 함침될 수 있는 물질은 면, 폴리에스테르, 레이온, 또는 전술된 패브릭의 블렌드, 칼슘 또는 나트륨 알기네이트, 폴리에틸렌, 폴리우레탄 필름 또는 포움, 폴리아크릴레이트, 폴리프로필렌, 셀룰로스, 폴리에스테르 필름, 나일론, 엘라스탄, 또는 붕대 또는 상처 드레싱을 위한 다른 적합한 재료를 포함한다.

본 발명의 방법에 따라, 치료될 상처 또는 조직 손상은 인간 환자에 있다. 그러나, 말 또는 개, 또는 다른 포유동물의 치료도 고려된다. 이러한 수의학 적용에서, 치료되는 특정 종으로부터의 천연 또는 재조합 루브리신이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 또한 혈관신생을 유도하는 방법을 제공한다. 예컨대, 본 발명에 따라, 혈관신생을 유도하는 방법은 루브리신을 포함하는 제약 조성물을 혈관신생을 필요로 하는 환자의 신체 부위에 적용하는 단계를 포함한다. 부위는 예를 들어 상처, 예컨대 피부의 자상, 화상, 찰과상, 천자창 또는 열상일 수 있거나, 부위는 인체의 기관 또는 다른 조직의 손상일 수 있다.

PRG4의 투여

PRG4는 체내에서 자연적으로 생성되지만, 본 발명의 효과는 환자의 조직 손상 부위에 외인성 PRG4를 투여할 때 관찰된다. 따라서, 한 실시양태에서, 환자에게 투여되는 PRG4는 외인성 인간 PRG4이고, 또 다른 실시양태에서, 환자에게 투여되는 PRG4는 재조합 인간 PRG4 (rhPRG4)이다. 또 다른 실시양태에서, rhPRG4는 서열식별번호: 1의 서열을 갖고, 또 다른 실시양태에서, rhPRG4는 서열식별번호: 1의 잔기 25-1404의 서열을 갖는다.

PRG4는 다수의 방법에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 예컨대, PRG4는 상처 부위에 국소적으로 투여될 수 있거나, PRG4는, 예컨대 주사에 의해 상처 부위에 국부적으로 투여될 수 있다. PRG4는 또한 정맥내 투여로 전신적으로 투여될 수 있다.

투여되는 PRG4의 양은 상처의 크기, 상처의 깊이 및 신체에서의 상처의 위치와 같은 변수에 따라 달라질 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 국소적으로 또는 국부 주사에 의해 조직 손상 부위에 투여하기 위한 PRG4의 치료적 유효량은 0.1 μg/kg 내지 4000 μg/kg, 또는 0.1 μg/kg 내지 1000 μg/kg, 또는 0.1 μg/kg 내지 100 μg/kg, 또는 0.1 내지 50 μg/kg의 범위이다. 일부 실시양태에서, 투여되는 PRG4의 치료적 유효량은 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 또는 1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 또는 1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 범위이다. 투여되는 PRG4는 또한 0.1 μg/mL 내지 30 mg/mL, 또는 1 μg/mL 내지 10 mg/mL, 또는 10 μg/mL 내지 1 mg/mL, 또는 10 μg/mL 내지 500 μg/mL, 또는 50 μg/mL 내지 150 μg/mL의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, PRG4는 약 100 μg/mL의 농도로 투여된다. 일부 실시양태에서, PRG4는 용량 당 1 내지 100 μL의 적은 부피로 투여된다.

특정 실시양태에서, 총 2 mg 내지 10 mg, 예컨대 2 mg 내지 10 mg, 2 mg 내지 5 mg, 2 mg 내지 3 mg, 3 mg 내지 4 mg, 4 mg 내지 5 mg, 5 mg 내지 6 mg, 6 mg 내지 7 mg, 7 mg 내지 8 mg, 8 mg 내지 9 mg, 9 mg 내지 10 mg, 또는 5 mg 내지 10 mg의 양의 루브리신이 한번에 상처에 투여된다. 특정 실시양태에서, 10 mg 초과의 루브리신이 상처에 투여된다. 본 발명에서는 정맥내 투여에 사용되는 PRG4의 용량이 국소 또는 국부 투여에 사용되는 용량보다 적어도 1.5배, 또는 적어도 2배, 또는 적어도 3배, 또는 적어도 4배, 또는 적어도 5배, 또는 적어도 10배 높은 것이 고려된다.

특정 실시양태에서, 상처에 투여되는 루브리신의 양은 상처의 크기를 기준으로 한다. 예컨대, 투여되는 루브리신의 양은 상처 면적 cm²당 10 μg 내지 1000 μg 범위, 또는 상처 면적 cm²당 50 μg 내지 500 μg 범위, 또는 상처 면적 cm²당 50 μg 내지 300 μg 범위, 또는 상처 면적 cm²당 10 μg 내지 150 μg 범위, 또는 상처 면적 cm²당 5 μg 내지 100 μg 범위, 또는 상처 면적 cm²당 25 μg 내지 150 μg 범위, 또는 상처 면적 cm²당 40 μg 내지 120 μg 범위, 또는 상처 면적 cm²당 70 μg 내지 100 μg 범위, 또는 상처 면적 cm²당 50 μg 내지 150 μg 범위, 또는 상처 면적 cm²당 75 μg 내지 100 μg 범위, 또는 상처 면적 cm²당 약 80 μg의 양이다. 루브리신을 전달하기 위한 제약 조성물의 제형에 따라, 제형 내의 루브리신의 양은 담체로부터 상처 부위로 전술된 양의 루브리신의 전달을 보장하기 위해 조정될 필요가 있을 수 있다. 치료적 유효량의 루브리신을 담체로부터 전달하기 위한 제형의 조정은 관련 기술분야의 기술 내에 있다.

조직 손상 부위로의 루브리신 투여는 상처 치유가 완료될 때까지 매일, 격일, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 매주 1회 또는 격주로 수행될 수 있다. 완전한 치료는, 예컨대 1주, 2주, 3주 또는 1개월이 걸릴 수 있다. 만성 피부 병태를 치료하는 경우, 병태가 해결을 필요로 하는 한 치료를 계속할 수 있다.

PRG4의 전신 투여가 또한 본 발명의 일부 실시양태에 의해 고려된다. 예컨대, PRG4는 장관 방식으로, 예컨대 경구, 직장, 설하, 순측하 또는 협측 전달로 전신적으로 투여될 수 있다. PRG4는 비경구 방식으로, 예컨대 비강으로, 흡입, 정맥내, 근육내, 피하, 진피내 또는 경점막 전달에 의해 전신적으로 투여될 수 있다.

PRG4를 눈으로 전달하기 위해, 루브리신은 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 겔에 혼입될 수 있다. PRG4의 안과 조성물은, 예컨대 안구 표면에 놓인 각막에 약물을 전달할 수 있는 콜라겐 쉴드, 콘택트 렌즈 또는 다른 고체 매트릭스의 사용을 통해 눈에 전달될 수 있다. PRG4는 점적제 또는 연고로서 눈에 전달될 수도 있다. 예컨대, PRG4는 눈의 표면 또는 눈의 막힌주머니 (cul de sac)에 적용되거나 눈의 세정 (irrigation)에 의해 적용될 수 있다. 안과 적용에서, PRG4는 상처 또는 손상이 발생한 후 가능한 한 빨리 PRG4가 상처 또는 손상 부위와 접촉을 유지하고 누관을 통해 빠르게 플러싱되지 않도록 하는 방법을 통해 상처 또는 손상 위치에 전달되어야 한다. 그러나, 이것이 발생하는 경우, 치유를 보장하기 위해 상처 표면과의 지속적인 접촉을 보장하도록 PRG4를 재적용해야 할 수 있다.

본원에서 고려되는 PRG4의 바람직한 전신 투여 경로는 정맥내 투여이다. 최적의 용량은 상처의 크기, 상처의 위치, 및 조직 훼손의 수준 및 유형과 같은 변수에 따라 통상적인 실험으로 결정될 수 있다. 전신 투여를 위해, 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 대안적으로 0.5 mg/kg 내지 50 mg/kg, 대안적으로 1 mg/kg 내지 25 mg/kg, 대안적으로 2 mg/kg 내지 10 mg/kg, 대안적으로 5 mg/kg 내지 10 mg/kg, 대안적으로 0.05-1.50 mg/kg의 용량이 투여되며, 손상의 치유가 완료될 때까지, 예컨대 매일 1회, 매주 1회, 매주 2회, 매주 3회, 격주 1회 제공될 수 있다.

제약 제형

상처 치유 및 혈관신생 촉진에 사용하기 위해, 투여되는 PRG4는 바람직하게는 제약상 허용되는 담체와 조합된다. 제약상 허용되는 담체는 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 버퍼, 담체 및 부형제를 포함한다. 담체(들)는 제형의 다른 성분과 혼화성일 수 있고 수용자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용되는" 것이어야 한다. 제약상 허용되는 담체는 제약 투여에 적합한 버퍼, 용매, 분산 매질, 코팅, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.

용액으로 전달되는 PRG4를 위해, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, 크레모포(Cremophor) ELTM (바스프 (BASF), 뉴저지주 파시파니) 또는 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)를 포함한다. 적합한 담체는 또한, 예컨대 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질을 포함할 수 있다. 담체는 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하며, 미생물에 대해 보호되어야 한다. 제약 활성 물질에 대한 담체의 사용은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)을 참조한다.

일부 실시양태에서, PRG4의 제약 제형은 무균이다. 제약 제제의 멸균은 공지된 메커니즘을 통해 달성가능하다.

루브리신을 함유하는 제약 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 보다 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대 7 내지 7.5이다.

국소 투여를 위해, 루브리신은 페이스트, 연고, 크림, 로션, 겔, 밤, 살브 또는 다른 현탁액 또는 에멀젼에 혼입될 수 있다. 이러한 제약 조성물은 물; 오일; 셀룰로스, 펙틴, 메틸셀룰로스 또는 카르보폴과 같은 증점제; 시트레이트 버퍼, 포스페이트 버퍼, 또는 타르트레이트 버퍼와 같은 완충제; EDTA 또는 시트르산과 같은 킬레이트제; 왁스, 세토스테아릴 알콜, 폴리소르베이트 20과 같은 유화제; 글리세린, 글리세릴 지방산 에스테르, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 보습제; DMSO, 우레아, 트리에탄올아미드, 알콜, 지방산, 지방산 에스테르, 폴리올, 나트륨 라우릴 술페이트, 벤잘코늄 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드, 레시틴, 스판®, 트윈®, 폴록사머, 미글리올®, 또는 프로필렌 글리콜과 같은 투과 증진제; 및/또는 벤조산, 알콜, 4차 암모늄 화합물 또는 티메로살과 같은 유기 수은 화합물과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 연고, 밤 또는 살브는, 예컨대 석유 젤리 또는 바셀린을 포함할 수 있으며, 유성 베이스, 흡수 베이스, 유중수 에멀젼 베이스, 수중유 에멀젼 베이스 또는 수용성 베이스로 제조될 수 있다. 크림 및 로션은 유중수 또는 수중유 에멀젼에 물을 포함할 수 있다. 겔은 히드로겔 또는 화학적 또는 물리적 겔 또는 단일 또는 2-상 시스템을 포함하는 유기겔 베이스를 포함할 수 있다. 이러한 국소 제제에 적합한 베이스는 바셀린, 백색 바셀린, 황색 또는 백색 연고, 미네랄 오일, 라놀린, 콜레스테롤, 스테아릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜, 백색 왁스, 카보머, 카르복시메틸셀룰로스 또는 히드록 시프로필 메틸셀룰로스를 포함할 수 있다. 국소 제제를 위한 베이스는 피부에 적합하고, 안정적이고, 매끄럽고, 유연하고, 자극적이지 않아야 하며, 물 또는 다른 액체 제제를 흡수할 수 있고 혼입된 루브리신 제약 활성제를 방출할 수 있어야 한다. 베이스는 멸균가능해야 한다. 페이스트, 연고, 크림, 로션, 겔, 밤, 또는 살브의 제조는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

안구 투여를 위해, PRG4는 안과적으로 허용되는 제형, 예컨대 용액 또는 연고 또는 겔 또는 콜라겐 삽입물에 혼입될 수 있다. 제형은 PRG4의 지속적인 방출을 제공할 수 있다. 예컨대, 눈을 위한 PRG4의 지속 방출 제형은 콜라겐 삽입을 통해 달성될 수 있다.

일부 실시양태에 따라, 루브리신 및 항생제를 포함하는 제약 제제가 제공된다. 투여될 수 있는 항생제의 예는 아미카신, 젠타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 네틸미신, 토브라마이신, 파로모마이신, 스트렙토마이신, 스펙티노마이신, 겔다나마이신, 헤르비마이신, 리팍시밈, 로라카르베프, 에르타페넴, 도리페넴, 이미페넴, 실라스타틴, 메로페넴, 세파드록실, 세파졸린, 세프라딘, 세파피린, 세팔로틴, 세팔렉신, 세파클로르, 세폭시팅, 세포테탄, 세파만돌, 세프메타졸, 세포니시드, 로라카르베프, 세프프로질, 세푸록심, 세픽심, 세프디니르, 세프디토렌, 세포페라존, 세포탁심, 세프포독심, 세프티부텐, 세프티족심, 목살락탐, 세프트리악손, 세페핌, 세프타롤린 포사밀, 세프토비프롤, 테이코플라닌, 반코마이신, 텔라반신, 달바반신, 오리타반신, 클린다마이신, 린코마이신, 답토마이신, 아지트로마이신, 클라리트로마이신, 에리트로마이신, 록시트로마이신, 텔리트로마이신, 스피라마이신, 아즈트레오남, 푸라졸리돈, 니트로푸란토인, 리네졸리드, 포시졸리드, 토레졸리드, 아목시실린, 암피실린, 아즐로실린, 디클로악실린, 플루클록사실린, 멕스클로실린, 메티실린, 마프실린, 옥사실린, 페니실린 G, 페니실린 G, 피페라실린, 테모실린, 티카르실린, 바시트라신, 콜리스틴, 폴리믹신 B, 시프로플록사신, 에녹사신, 가티플록사신, 게미플록사신, 레보플록사신, 로메플록사신, 목시플록사신, 나디플록사신, 날리딕스산, 노르플록사신, 오플록사신, 트로바플록사신, 그레파플록사신, 스파르플록사신, 테마플록사신, 마페니드, 술파세타미드, 술파디아진, 술파디메톡신, 술파닐아미드, 술파살라진, 술피속사졸, 트리메토프림-술파메톡사졸, 술폰아도크리소이딘, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 메타사이클린, 미노사이클린, 옥시테트라사이클린, 테트라사이클린, 클로파지민, 답손, 카프레모이신, 클리클로세린, 에탐부톨, 에티온아미드, 이소니아지드, 피라진아미드, 리팜피신, 리팜핀, 리파부린, 리파펜틴, 스트렙토마이신, 아르페나민, 클로람페니콜, 포스모마이신, 푸시드산, 메트로니다졸, 무피로신, 플라텐시마이신, 퀴누프리시틴/달포프리스틴, 티암페니콜, 티게사이클린, 티니다졸, 또는 트리메토프림을 포함한다.

일부 실시양태에 따라, 루브리신 및 진통제 또는 마취제를 포함하는 제약 제제가 제공된다. 예컨대, 진통제 또는 마취제는 리도카인, 테트라카인, 벤조카인, 프리올로카인, 디부카인, 프라목신, 프로파라카인, 프록시메타카인, 아메토카인, 부탐벤 또는 옥시부프로카인일 수 있다.

실시예 1―"슈퍼 치유자" MRL 마우스에서 루브리신 발현

본 출원인은 자발적인 재생 능력을 갖는 동물 (예컨대, MRL "슈퍼-치유자" 마우스)이 일반적으로 손상 후 루브리신 발현 증가를 나타낸다는 것을 발견하였다. 이는 하기와 같이 마우스 모델을 사용하여 밝혀졌다.

귀에 2 mm 직경 펀치 손상을 입힌 후, MRL 마우스, C57BL/6 대조군 마우스 (비처리), 루브리신 처리된 C57BL/6 마우스 및 루브리신 녹아웃 마우스의 귀 조직 샘플에 대해 면역조직화학 염색을 실시하여 손상 3일 후 조직에서 루브리신의 존재를 관찰하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 녹색 염색은 루브리신의 존재를 나타내는 반면, 청색 염색은 루브리신이 없는 일반 세포를 나타낸다. 예상대로, 청색 염색만으로 입증되는 바와 같이 루브리신 녹아웃 마우스에서는 루브리신이 존재하지 않는 반면 (왼쪽 하단 패널), 이미지 전체에 걸쳐 조밀한 녹색 형광에 의해 입증되는 바와 같이 MRL "슈퍼 치유자" 마우스에서는 루브리신이 샘플 전체에 걸쳐 풍부하였다 (오른쪽 상단 패널). C57BL/6 루브리신 처리된 마우스에서는, 루브리신이 MRL 마우스에서와 동일한 정도로 존재하지는 않았지만, 청색 및 녹색의 균일한 혼합에 의해 입증되는 바와 같이 조직 전체에 걸쳐 가시적인 반면 (오른쪽 하단 패널), 비처리된 C57BL/6 마우스에서는 단지 청색 염색으로만 입증되는 바와 같이 루브리신이 없었다 (왼쪽 상단 패널).

MRL 마우스는 또한 감소된 흉터형성과 함께 손상에 대해 재생 반응을 나타내었다. 이 실험은 증가된 루브리신 염색이 손상 후 상처 치유 증가 및 섬유화/흉터형성 감소와 관련이 있음을 입증한다.

이러한 관찰은 루브리신이 손상 후 복구 (흉터) 대 재생 반응을 조절하는 역할을 한다는 것을 시사한다.

실시예 2―마우스의 임계-크기 귀 상처에서 외인성 루브리신의 효과

귀는 상피, 모공, 선 조직 및 연골을 포함하는 3개의 배엽층 모두로부터의 조직을 함유하기 때문에 재생을 연구하는데 이상적인 모델이다. 따라서, 상처 치유에 대한 외인성 루브리신의 효과를 관찰하기 위해 마우스 모델을 사용하였다.

각각의 마우스는 제0일에 귀에서 2 mm 직경 펀치를 받았다. 24마리의 마우스는 C57BL/6 마우스였고, 12마리는 루브리신 녹아웃 마우스 (Prg4^tm1Mawa; 잭슨 라보라토리즈 (Jackson Laboratories), 메인주 바 하버)였다. C57BL/6 마우스의 절반 (n=12)에 25 μL 루브리신을 손상 시점, 및 손상 후 1, 2 및 3주에 100 μg/mL의 농도로 펀치 부위에 국소적으로 투여하였다. 다른 12마리의 C57BL/6 마우스는 루브리신을 받지 않았다.

관찰된 상처 크기에 대한 효과

마우스는 펀치 후 매주 1회 관찰되었으며, 각각의 이미지에서 공지된 참조 표준과 함께 상처 부위를 촬영하여 상처의 크기를 측정하였다. 결과는 도 2에 나타나 있으며, 손상 후 4주까지 루브리신이 투여된 C57BL/6 마우스에서는 평균 상처 직경이 펀치 크기의 절반인 약 1.0 mm였던 반면, 루브리신을 받지 못한 C57BL/6 마우스의 상처 크기는 평균 1.50 mm에 가까웠다는 것을 보여준다. 녹아웃 마우스는 상처 크기가 가장 작게 감소하였다. 이 데이터는 루브리신 처리가 상처 치유를 상당히 증가시키는 반면 루브리신을 녹아웃시키면 상처 치유를 차단한다는 것을 보여준다.

손상 부위에서 혈관신생 및 혈류에 대한 효과

루브리신이 손상 부위에서 혈관신생 및 혈류에 대해 효과를 갖는지를 결정하기 위해, 귀 손상 부위에서 혈류를 C57Bl/6 처리 및 대조군 마우스뿐만 아니라 루브리신 KO 마우스에서 측정하였다. 관류를 결정하기 위해 레이저 굴절 스펙클 패턴을 사용하는 정량적 방법인 레이저 스펙클 관류 이미징 (LSPI)을 사용하여 측정치를 얻었다. 이미지 노출 시간은 15 msec였다. 고해상도 이미지를 LSPI 알고리즘을 사용하여 처리하여 이 장치에 대해 이전에 정의되고 검증된 임의의 단위인 관류 단위 (PU)로 측정된 정량적 색상 관류 맵을 생성하였다 (Forrester et al., (2002) Med Biol Eng Comput 40:687-697; Forrester et al., (2004) EEE Trans Biomed Eng 51:2074-2084). 혈류는 1주에 1회 정량화되었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 손상 부위에서 혈류 수준은 루브리신을 받지 않은 마우스에 비해 및 루브리신 KO 마우스에 비해 루브리신을 받은 C57BL/6 마우스에서 상당히 증가되었으며, 이는 상처 부위에 외인성 루브리신을 투여하면 상처 조직으로의 혈류가 상당히 증가한다는 것을 시사한다.

증가된 혈류의 관찰을 감안하여, 마우스는 또한 혈관신생, 즉 새로운 혈관의 형성에 대해 시험되었다. 혈관신생은 손상 1주일 후에 표준 면역조직화학 염색을 사용하여 측정되었고, 양성 혈관의 수는 이러한 이미지로부터 정량화되었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 비처리된 C57BL/6 마우스와 비교하여 루브리신을 받은 C57BL/6 마우스의 치유 조직에서 CD31+ 혈관의 수가 증가되었다. 녹아웃 마우스는 혈관이 훨씬 적었으며, 이는 루브리신이 치유 조직에서 혈관신생에 긍정적 효과를 갖는다는 것을 입증한다.

도 19에 나타난 바와 같이, rhPRG4는 손상 1, 2, 3 및 4주 후 측정된, 귀 펀치 상처에 의해 손상된 마우스에서 측정된 바와 같이 조직 손상 부위로의 혈류를 상당히 증가시켰다. 나타난 바와 같이, TLR4-/- 마우스 (담체 또는 rhPRG4로 처리됨) 및 rhPRG4로 처리된 C57BL/6 마우스는 손상 후 가장 높은 수준의 혈류를 가졌다.

유사하게, 도 20에서 입증되는 바와 같이, 귀에 대한 4 mm² 펀치 손상 1주 후, 손상된 귀 내에서 측정된 mm²당 CD31+ 혈관의 수로 측정되는 바와 같이, rhPRG4 처리된 마우스 및 Tlr4-/- 마우스에서는 증가된 혈관 수가 관찰되는 반면, Prg4-/- 동물에서는 더 적은 수의 혈관이 관찰되었다. 손상 부위에서 가장 높은 수준의 혈관신생은 PRG4 처리된 동물뿐만 아니라 TLR4-/- 동물에서 관찰되었다.

상처 부위로의 MSC 이동에 대한 효과

루브리신-매개된 복구에서 줄기 세포의 역할이 또한 조사되었다. 표지된 세포 집단의 운명을 추적하고 반응을 특성화하기 위해, 마우스가 7-9주령일 때, 마우스를 5일 연속 (1 mg/일) 동안 복강 (i.p.) 주사로 4-히드록시타목시펜 (4-OHT, 시그마 알드리치 (Sigma Aldrich))으로 유도하였다. 귀에서 Prx1-계통 MSC (tdTomato^+ve)를 운명 매핑하기 위해 샘플을 조직학/형광 이미징으로 검사하였다.

루브리신으로의 처리는 조직 손상 영역으로 중간엽 줄기 세포 (MSC) 이동을 발생시키는 것으로 관찰되었다. 손상 후 1주 이내에, 손상 부위에서 MSC의 상당한 증가가 관찰되었다. 그러나, 외인성 루브리신 처리를 통해서만 이러한 MSC가 새로운 귀 (귓바퀴 연골)의 재생에 기여하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 임의의 적색 도트가 부재하는 것으로 입증되는 바와 같이 손상되지 않은 귀 조직에서는 본질적으로 MSC가 관찰되지 않았다 (상단 패널). 그러나, MSC는 상처가 대조군으로서 담체로 처리된 (중간 패널) 및 루브리신으로 처리된 (하단 패널) 손상된 귀로부터의 조직에 존재하였다. 그러나, 루브리신 처리로 MSC는 귀의 훼손된 연골 구조를 완전히 재생시키는 반면, 루브리신이 없으면 MSC는 거의 같은 양으로 존재하지 않는다. 이 데이터는 루브리신이 조직 손상 부위로 성체 줄기 세포 (MSC)를 동원하여 조직 복구를 매개하는데 관여되며, 루브리신 처리가 정상적인 상처 치유 조건에서 관찰되는 것 이상으로 이러한 세포의 잠재력을 향상시키고 있음을 시사한다.

루브리신이 MSC에 영향을 주어 상처 치유를 촉진한다는 추가 증거가 도 21의 이미지에 나타나 있다. rhPRG4로 처리된 MSC 계통 리포터 마우스에서 전체 두께 귀 손상 후, Tomato 양성 세포 (MSC)의 운명 매핑은 이들이 연골 및 진피의 재생에 주요 기여자였으며 새로운 모공에 기여하였음을 나타내었다 (도 21, 왼쪽 이미지). 이러한 재생 반응은 비히클 (DMSO; 오른쪽 이미지)로 처리된 야생형 (C57BL/6) 마우스에서 관찰되지 않았으며, 흥미롭게도 계통 추적된 MSC 세포는 무질서한 섬유화 흉터를 발생시켰다 (도 21; 오른쪽 이미지).

면역 세포의 동원에 대한 효과

본 출원인은 루브리신 처리를 사용하여 손상 후 대식세포 집단 및 분극화를 조사하였다. 상처 부위 내에 존재하는 세포를 정량화하기 위해, 마우스를 초기 귀 상처 손상과 동일한 영역에서 2 mm 관통 귀 펀치로 재손상시켰다. 이는 손상 초기로부터 침착된 조직의 수집을 가능하게 하였다. 귀 조직은 제조 절차에 따라 젠틀맥스(gentleMACS)™ 해리기 (밀테니 (Milteny), 독일 베르기쉬 글라바흐)를 사용하여 해리되었다. 생성된 세포 현탁액을 여과시키고, 500 μl의 90% MeOH에 재현탁시키고, 실온에서 5-10분 동안 방치하였다. 이어서, 세포를 원심분리하고, 액체를 제거하고, 500 μl의 0.1% 트윈 (Tween) 20을 첨가하여 실온에서 20분 동안 세포를 투과시켰다. 세포를 다시 원심분리하고, 액체를 제거하고, 50 μl의 트윈 버퍼 및 0.5 μg의 항체를 각각의 튜브에 첨가하고, 실온에서 30-45분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 FACs 버퍼로 3회 세척한 다음, FACs 버퍼에 재현탁시켰다. 이어서, FACs 칼리버를 사용하여 세포를 측정하였다. 결과는 플로우조 (FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.

도 11에서 유동 세포측정 분석에 의해 나타난 바와 같이, CD14+ 대식세포 및 Gr1 호중구 둘 다의 증가된 동원이 대조군 및 루브리신 KO 마우스와 비교하여 루브리신 처리 후 손상된 귀에서 관찰되었다. 실제로, 비처리된 C67BL6/마우스 및 루브리신 KO 마우스와 비교하여 루브리신 처리된 C57BL/6 마우스의 손상 부위 내에서 약 2배 많은 면역 세포가 발견되었으며, 이는 외인성 루브리신을 상처 부위에 적용하면 부위에서 대식세포 및 호중구의 존재가 증가한다는 것을 입증한다.

가능한 작용 메커니즘

본원의 데이터는 루브리신 처리가 1) 섬유화 반응을 억제하고, 2) 혈관신생 및 손상으로의 혈류를 증가시키고, 3) 염증 반응 (예컨대, 대식세포 분극화)을 조절하고, 4) 조직 재생을 매개하도록 면역 세포 및 성체 줄기 세포 (MSC)를 동원함으로써 귀 내의 임계 크기 결함의 내인성 복구를 향상시킬 수 있음을 입증한다. 본원에 제공된 증거는 (Prg4-/- KO 마우스에 의해 입증되는 바와 같이) PRG4의 부재가 정상 치유를 심각하게 해치고, 루브리신이 상처 치유를 조절하기 위해 적어도 3개의 경로 (하나는 손상 부위에서 혈관신생 및 혈류 조절 수준에 작용하고 (NFĸB/HIF1α/VEGF), 하나는 섬유화 반응 (PAI-1)을 조절하고, 마지막은 대식세포의 M1 또는 M2 표현형으로의 분극화를 조정함 (TLR4))를 통해 작용함으로써 재생 반응을 촉진한다는 것을 보여준다. 본원에 제공된 증거는 이러한 다면발현 효과가 루브리신-결핍 (KO) 마우스에서는 발생하지 않기 때문에 특히 루브리신에 기인한다는 것을 시사한다. 이러한 예비 결과는 시험관내 및 생체내에서 루브리신이 상처 치유의 각각의 보존 단계 (혈액 응고, 염증, 조직 생성 및 조직 재형성)의 측면을 조정함으로써 손상 후 재생 반응 (치유)을 향상시키면서 복구 반응 (흉터형성)을 억제한다는 것을 시사한다.

결과는 루브리신이 단핵구/대식세포에서 TLR4와 상호작용하여 이들 면역 세포의 염증유발성 (M1) 대 항염증성 (M2) 분극화를 조절한다는 것을 시사한다. 동시에, 루브리신은 또한 PAI-1에 결합하여 섬유화 반응을 조절한다. 루브리신은 상응하게 NFĸB 신호전달을 조절하고, 이어서 HIF1α 및 VEGF 발현을 상향조절하여 상처 영역 내에서 혈류 및 혈관신생을 증가시킨다. 또한, 루브리신-매개된 복구에서 줄기 세포의 역할을 조사하였으며, 상처 영역 내의 조직-상주 MSC가 손상 직후 높은 수준의 루브리신 및 PAI-1을 모두 발현한다는 것을 발견하였다.

루브리신-PAI-1 상호작용

플라스미노겐 활성제 억제제-1 (PAI-1)은 세린 프로테아제 억제제 (세르핀 (serpin)) 유전자 패밀리의 구성원이며, 세린 프로테아제인 uPA 및 tPA의 억제제이다 (Ghosh et al., J Cell Physiol. 2012, 227(2):493-507). uPA/tPA의 억제는 플라스미노겐에서 플라스민으로의 전환뿐만 아니라 플라스민-의존적 MMP 활성화를 억제한다. 정상적인 상처 치유에서, PAI-1은 TGF-β에 의해 상향조절될 수 있으며, 그 후 uPA 및 tPA에 결합하여 비활성화한다 (Botta et al., J Cell Sci. 2012, 125(Pt 18):4241-52). 이는 MMP의 활성화 및 조직 재형성 (응괴 안정성)을 억제한다. 이는 상처 영역에서 섬유소를 증가시키고 주변 세포에 의한 콜라겐 1 생성을 상응하게 증가시켜 섬유화 패치 (흉터 형성)를 생성한다 (Castro et al., J. Biol Chem., 2014, 289(42):29001-13).

전형적으로 (심장 제외), PAI-1이 결핍된 동물은 섬유화 감소와 함께 손상 후 증가된 상처 치유를 나타내며 (Chan et al., Am J Pathol., 2001, 159(5):1681-8; Ghosh et al., PLoS One, 2013, 8(5):e63825), 이는 본 발명자들의 가설 및 예비 데이터와 일치한다. 그러나, PAI-1이 완전히 결여되면 혈전 형성/안정성 저하로 인해 상당한 혈액 손실 및 잠재적으로 사망이 발생할 수 있다 (Iwaki et al., J Thromb Haemost., 2011, 9(6):1200-6).

도 7에서 입증되는 바와 같이, 본원에 제공된 데이터는 루브리신이 PAI-1에 직접적으로 결합한다는 것을 보여준다. 루브리신의 PAI-1에 대한 결합은 비아코어 (Biacore) X100 SPR 기기 (GE 헬스케어 (GE Healthcare), 펜실베이니아주 피츠버그)를 사용하여 평가되었다. 인간 PAI-1 (R&D 시스템스 (R&D Systems), 미네소타주 미니애폴리스)은 표준 아민-커플링 화학을 사용하여 CM5 센서 칩 (GE 헬스케어, 영국 리틀 찰폰트)의 플로우 셀 2에 고정되어 300-500개의 반응 단위 (RU)를 생성하였다. 참조 셀 (플로우 셀 1)은 활성화 및 불활성화에 의해 제조되었다. 결합 검정은 0.01% (v/v) 트윈 20이 보충된 PBS 러닝 버퍼에서 수행되었다. 루브리신 용액을 러닝 버퍼로 버퍼 교환하고, 0.576 - 420 μg/mL 범위의 적어도 5개의 농도를 25℃에서 1분의 접촉 시간으로 30 μL/min의 유속으로 주입하였다. 결합된 루브리신은 1.5분 동안 해리를 모니터링한 후 1M NaCl을 주입하여 칩 표면으로부터 제거되었다. 루브리신이 2.712 x 10^-6의 결합 상수 (K_d)로 PAI-1에 직접적으로 결합할 수 있다는 것을 밝혀내었으며, 이는 2개의 분자 사이의 강한 친화성을 나타낸다.

PAI-1과 루브리신 사이의 상호작용은 PAI-1의 공지된 리간드인 비트로넥틴 (VTN) 내의 SMB 도메인과 거의 동일한 루브리신의 N-말단 소마토메딘 B (SMB) 도메인에 기인할 것 같다 (Arroyo De Prada et al., Eur J Biochem. 2002, 269:184). VTN은 PAI-1 활성 및 안정성을 조절하는데 중추적인 역할을 하는 것으로 공지되어 있다 (Jang et al., Surgery, 2000, 127(696); Zhou et al., Nat Struct Biol, 2003, 10:541). 이 데이터는 PAI-1의 루브리신 결합이 PAI-1 신호전달의 경쟁적 억제제로 작용하여 상처 치유 증가 및 섬유화 감소가 관찰되는 지점까지 활성을 억제하지만 응괴 형성이 억제되고 만성 출혈이 관찰되는 정도까지는 억제하지 않음을 시사한다.

또한, 도 17에 나타난 바와 같이, Pai-1 ^-/- 마우스 (DMSO 처리) 및 C57BL/6 마우스 (rhPRG4 처리)에서 귀 손상은 C57BL/6 마우스 (DMSO 처리)와 비교하여 α- 평활근 액틴 (α-SMA, 섬유화 마커) 발현이 현저히 적음을 나타낸다. 도 17의 이미지는 마우스의 귀 펀치 상처 모델에서 손상 후 4주에 촬영되었다. C57BL/6 마우스는 강한 αSNA 염색 (백색)을 나타낸 반면, C57BL/6 rhPRG4 처리된 마우스 및 PAI-1-/- 마우스에서는 감소된 αSMA 염색이 관찰된다.

루브리신-NFĸB/HIF1α/VEGF

본원에 제공된 데이터는 루브리신이 잠재적으로 NFĸB의 상류 및/또는 하류에서 HIF1α 의존적 경로를 통한 VEGF의 활성화를 통해 혈관신생을 조절한다는 것을 시사한다 (Fitzpatrick et al., J Immunol. 2011, 186(2):1091-6). 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 혈관 내피 세포에 대한 매우 특이적인 유사분열인자이다: 2개의 VEGF 대립형질 중 하나라도 결여된 동물은 심혈관계 발달의 결함으로 인해 출생 전에 사망한다 (Haiko et al., Mol Cell Biol. 2008 28(15):4843-50). 저산소증-유발된 VEGF 생성은 발달 동안 기관 형성을 수반하는 혈관신생을 자극한다. 따라서, HIF1α (저산소증-유발 인자)는 전형적으로 저산소 영역에서 VEGF의 강력한 활성제로 문헌에서 널리 공지되어 있다 (van Tuyl et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2005 288(1):L167-78; Arany et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 93(23):12969-73).

도 8a-e의 데이터에 나타난 바와 같이, 루브리신은 다수의 세포 유형 및 생체내에서 HIF1a 및 VEGF를 상향조절한다. 이 효과를 시험관내에서 입증하기 위해 정상 및 골관절염 (OA) 인간 관절로부터의 활막 섬유모세포를 루브리신 (100 μg/mL; 2 mL)에 노출시키고 (도 8a-b), 24 시간 후 측정을 수행하였다. 정상 및 OA 세포에서, 외인성 루브리신의 투여는 HIF1a (도 8a) 및 VEGF (도 8b) mRNA의 발현을 상당히 상향조절하였다. 이 관찰은 HEK293 세포에서 검증되었으며, 여기서 HIF1a 및 VEGF mRNA는 모두 루브리신 처리 (100 μg/mL; 2 mL) 24시간 후에 상향조절되는 것으로 관찰되었다 (도 8c).

도 8d에 나타난 바와 같이, ELISA를 사용하여 PBS 담체 (대조군) 또는 루브리신 (100 μg/mL; 2 mL)에 노출된 정상 활막 세포, 골관절염 활막 세포, 및 HEK293 세포에서 VEGF 단백질의 수준을 검증하였다. 각각의 유형의 세포에서, 루브리신의 존재는 대조군에 비해 VEGF의 수준을 상당히 상향조절하였다.

도 8e의 데이터는 증가하는 VEGF 단백질 수준에 대한 외인적으로 투여된 루브리신의 생체내 효과를 추가로 입증한다. 이 실험에서 5마리의 스프라그 돌리 (Sprague Dawley) 마우스에게 꼬리 정맥 주사를 통해 루브리신 (200 μg/kg)을 주사하고; 혈청 내 VEGF 수준을 제0일, 제14일, 제20일 및 제24일에 ELISA를 사용하여 검정하였다. 도 8e에 나타난 바와 같이, VEGF는 루브리신을 받지 않은 래트의 VEGF 수준과 비교하여 루브리신을 주사한지 14-24일 후 전신적으로 상당히 상향조절되었으며, 이는 지속적인 수준의 VEGF 발현을 입증하였다.

또한, HIF1α 억제제로 처리된 세포는 루브리신 처리 후 VEGF 발현 증가를 나타내지 않았으므로, 이 루브리신-VEGF 경로는 HIF1α에 의존적이다.

또한, rhPRG4로 처리되거나 rhPRG4 없이 처리된 귀 상처로부터 대식세포 (F4/80⁺) 및 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 단리하였다. 도 15에 나타난 바와 같이, rhPRG4가 MSC가 아닌 대식세포에서 혈관 내피 성장 인자 (Vegf) 발현을 상당히 증가시켰으며, 또한 대식세포 및 MSC에서 Tgfβ 발현을 상당히 감소시켰음을 관찰하였다. 이러한 결과는 또한 Prg4 발현이 손상 후 MSC에서 상향조절되며, 외인성 rhPRG4가 내인성 Prg4의 발현을 억제한다는 것을 입증한다 (음성 피드백). 또한, TGFβ가 Prg4를 상향조절하는 것으로 공지되어 있지만 (Schmidt et al., Osteoarthr. Cartil. 2008, 16, 90; Jones et al., Eur. Cell. Mater, 2007, 13;40), 본 발명자들은 이제 rhPRG4와 Tgfβ 발현 사이에 음성 피드백 루프가 있음을 보여준다.

이전에 Tlr4 ^-/- 대식세포가 M2 분극화 편향을 갖는 것으로 입증되었으며 (Orr et al., Diabetes 2012, 61:2718), 본 발명자들은 rhPRG4로 처리된 C57BL/6 대식세포가 또한 M2 편향을 나타낸다는 것을 확인하였다 (도 16a-b). VEGF의 증가는 대식세포의 항염증 (M2) 분극화와 관련되기 때문에 (Lai et al., J. Cell. Mol. Med., 2018, 23:14027; Wheeler et al. PLoS One 2018, 13: e0191040), C57BL/6 및 Tlr4 ^-/- 마우스로부터 골수 단핵구를 단리하고, 그들을 M2 표현형으로 분극화하였다.

단핵구를 마우스로부터 단리하고 대식세포 (M0)로 분화시켰다; 이어서, 이들을 LPS로 염증유발성 대식세포로 (M1) 또는 IL-4로 항염증성 대식세포로(M2) 분극화하였다. 도 16a-b에 제공된 결과는 C57BL/6 단핵구 유래된 대식세포가 rhPRG4의 존재 하에 감소된 M1 분극화 및 향상된 M2 분극화를 나타낸다는 것을 보여준다. Prg4 ^-/- 마우스로부터의 대식세포는 향상된 M1 분극화 및 감소된 M2 분극화를 나타내며, 이는 rhPRG4 처리에 의해 구조될 수 있으며, PRG4 또는 PRG4의 결여가 대식세포의 분극화를 조절한다는 것을 보여준다. 이러한 영향은 Tlr4 ^-/- 대식세포가 감소된 M1 분극화 및 향상된 M2 분극화를 나타내므로 TLR4에 의존적인 것으로 보이며, 이는 rhPRG4 처리에 의해 변경되지 않는다. 또한, Tlr4 ^-/- 대식세포를 rhPRG4로 처리하는 것은 부가적인 효과가 없었으며, 이는 rhPRG4가 분극화를 조절하는 능력이 TLR4-의존적이라는 것을 시사한다.

또한, 도 18a-b에 나타난 바와 같이, rhPRG4 처리가 또한 NFκB 활성을 상향조절한다는 것을 밝혀내었다. 대식세포 및 MSC를 손상되지 않은 마우스로부터 단리하고, NFκB 활성화를 tdTomato 리포팅 벡터를 통해 모니터링하였다. 도 18a-b에 제시된 데이터는 rhPRG4 처리가 손상되지 않은 마우스로부터의 대식세포 및 MSC에서 NFκB 발현을 상향조절한다는 것을 보여준다. 이는 TLR4^-/- 마우스와 C57BL/6 마우스간에 동일한 반응이 관찰되었기 때문에 TLR4와 무관하게 발생하는 것으로 보인다. 본 발명자들은 이전에 rhPRG4가 시험관내 및 생체내 모두에서 NFκB 신호전달을 조절한다는 것을 입증하였으며 (Iqbal et al., 2016, Sci Rep., 6: 18910), NFκB 리포터를 사용하여, 도 18a-b에 나타난 바와 같이, rhPRG4 처리 후 NFκB 및 Hiflα 및 Vegf의 동시 활성화을 입증하였다. 그러나, MSC가 아닌 대식세포만이 Hiflα 및 VegF 발현이 증가시켰으며, 이는 PRG4에 노출 시 혈관신생촉진 반응이 MSC가 아닌 대식세포에 의해 유도됨을 시사한다.

도 18a-b는 또한 rhPRG4가 HIF1α를 통한 VEGF의 활성화를 통해 혈관신생을 조절한다는 것을 시사한다. 이것은 잠재적으로 NFĸB의 하류에서 발생한다 (Fitzpatrick, et al., J. Immunol., 2011, 186:1091). 저산소증-유발된 VEGF 생성은 발달 동안 기관 형성을 수반하는 혈관신생을 자극한다. 따라서, HIF1α (저산소증-유발 인자)는 전형적으로 저산소 영역에서 VEGF의 강력한 활성제로 문헌에서 널리 공지되어 있다 (Van Tuyl et al., Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2005, 288:L167). 도 18a-b의 시험관내 데이터 및 도 15의 생체외 데이터는 rhPRG4로의 대식세포 처리가 mRNA 수준에서 Vegf를 증가시킨다는 것을 보여준다.

루브리신-TLR4 상호작용

TLR은 주로 선천성 면역계에 관여하는 대식세포에 의해 발현되는 중요한 부류의 패턴-인식 수용체이다. TLR이 활성화되면 선천성 면역 세포 반응이 촉발된다 (Parker et al., Clin Exp Immunol. 2007;147:199-207, Zhang et al., Cell Mol Life Sci. 2006;63:2901-7). TLR은 병원균에 의해 발현되는 병원체-관련된 미생물 패턴 (PAMP), 또는 괴사 또는 죽어가는 세포로부터 방출되는 위험-관련된 분자 패턴 (DAMP/알라민)으로 공지된 고도로 보존된 모티프를 인식한다 (Rickard et al., Cell. 2014;157:1175-88). TLR4는 정상적인 상처 치유에 필요하며 (Suga et al., J Dermatol Sci. 2014 73(2):117-24; Dasu et al., J Diabetes Complications. 2013 27(5):417-21), TLR4가 결여된 마우스는 M2 (또는 항염증성) 표현형에 대한 편향을 보이므로 M1 대 M2 분극화에 필요하다 (Orr et al., Diabetes. 2012 61(11):2718-27).

루브리신-결핍 마우스에서 대식세포 분극화를 조사하였다. 도 9에 나타난 바와 같이, 루브리신-결핍 (KO) 마우스의 대식세포는 M1 (염증유발성) 분극화 편향을 나타내며, 야생형 대조군 마우스보다 상당히 많은 IL-1, IL-6 및 TNFα를 생성한다. 다시 말해서, 루브리신 녹아웃 마우스에서 대식세포의 분극화는 야생형 대조군과 비교하여 염증유발성 인자의 증가를 초래한다. TLR4 녹아웃 동물의 대식세포가 M2 편향을 나타낸다는 점을 감안할 때 (Gupta et al., Biochem Biophys Res Commun. 2016 477(3):503-8), 이는 루브리신의 존재가 TLR4를 적어도 부분적으로 비활성화시키는 반면, 루브리신 부재 하에서, TLR4 활성화는 대식세포의 염증유발성 분극화를 초래한다는 것을 시사한다.

또한, 도 16a-b에 나타낸 데이터에서, PRG4로의 대식세포 처리가 M1을 억제하고 M2 분극화를 향상시키며 TLR-4 의존적이라는 것을 밝혀내었다. 도 16a-b는 Prg4 ^-/- 마우스에서 대식세포 분극화가 M1 (염증유발성) 분극화 편향을 나타내는 반면, rhPRG4로 처리된 C57BL/6 대식세포는 M2 편향을 나타낸다는 것을 보여준다.

PAI-1-VEGF-TLR4 신호전달

PAI-1, VEGF 및 TLR4 신호전달 경로는 다수의 수준에서 서로 상호작용하며 (Siegel-Axel et al., Diabetologia. 2014 57(5):1057-66; Wu et al., Am J Pathol. 2014 184(6):1900-10; Biernaskie et al., Cell Stem Cell. 2009 5(6):610-23), 본 발명자들의 데이터는 이러한 경로 각각이 시험관내에서 독립적이라는 것을 시사한다. 도 10에 나타난 바와 같이, 루브리신 처리 후 VEGF 전사의 증가는 TLR4 녹아웃 세포가 루브리신 처리 후에도 여전히 VEGF를 발현하기 때문에 TLR4 독립적이었다. 또한, 도 10에서 입증되는 바와 같이, 루브리신 녹아웃 세포를 재조합 PAI-1로 처리했을 때 VEGF의 증가가 관찰되지 않았으며, 이는 루브리신 처리 후 VEGF 상향조절이 PAI-1과 무관하다는 것을 시사한다.

PRG4 매개된 재생 반응은 TLR4 및 PAI-1을 통해 작용한다.

도 14a-d에 기재된 데이터는 rhPRG4가 국소적으로 적용될 때 상처 치유를 향상시키고, Prg4의 부재는 정상 치유를 심각하게 손상시킨다는 것을 분명히 입증한다 (도 14a). 본원에 기재된 마우스 귀 상처 모델로부터의 결과는 이러한 PRG4 매개된 재생 반응이 TLR4 및 플라스미노겐 활성제 억제제-1 (PAI-1)을 통해 작용한다는 것을 시사한다. 특히, Tlr4 ^-/- 및 Pai-1 ^-/- 마우스는 (C57BL/6과 비교하여) 개선된 귀 상처 치유를 제공하고, rhPRG4의 외인성 전달은 이 두 균주 모두에서 이 효과를 더욱 향상시킨다 (도 14c-d). 또한, Tlr4 ^-/- Pai-1 ^-/- 이중 녹아웃은 rhPRG4 처리된 C57BL/6 마우스와 동일한 재생 반응을 나타낸다. 그러나, Tlr4 ^-/- Pai-1 ^-/- 마우스에 rhPRG4를 첨가하여도 귀 상처 치유에 부가적인 효과가 없다 (도 14d). 이는 TLR4 및 PAI-1 신호전달이 귀 상처 치유의 음성 조절자이고 C57BL/6 마우스에서 rhPRG4 처리가 이러한 신호전달 경로를 억제하여 재생 잠재력을 증가시킨다는 것을 시사한다.

실시예 4: 인간 환자에서 상처 치료

당뇨병성 궤양

인간 환자는 여러 발가락에 당뇨병성 궤양을 앓는다. 각각의 궤양을 검사하고 세정한다. 100 μg/mL의 양의 재조합 인간 루브리신을 함유하는 용액을 멸균 포스페이트 완충된 식염수 중 일련의 점적으로 각각의 궤양에 적용한다. 80 μg의 루브리신이 궤양 조직의 평방 센티미터당 적용된다. 용액이 마르면 각각의 궤양에 적절한 붕대를 감는다. 치료는 4주 동안 매주 반복된다. 치료가 완료된 후, 궤양이 치유되고 조직이 재생되었다. 이전에 손상된 부위에 눈에 띄는 흉터 조직이 없다.

표피 찰과상

인간 환자는 자전거 사고 후 팔, 다리 및 위에 일반적으로 "도로 발진"으로 공지된 찰과상을 보인다. 상처를 세정하고, 재조합 인간 루브리신을 포함하는 멸균 겔을 벗겨진 피부에 국소적으로 도포하고 적절한 붕대로 덮는다. 상처 조직의 평방 센티미터당 적어도 80 μg의 루브리신을 도포한다. 치료는 4주 동안 매주 반복되며, 재도포 시, 루브리신 연고는 아직 치유되지 않은 조직의 나머지 영역에만 도포된다. 따라서, 매주 더 적은 조직이 루브리신 연고의 도포를 필요로 한다. 도로 발진이 마침내 치유되면 가시적인 흉터형성이 없다.

자상 또는 열상

인간 환자는 오른손 검지에 3 cm의 열상을 보인다. 열상을 세정하고, 재조합 인간 루브리신을 함유하는 연고를 열상에 도포한 후, 열상을 여러 봉합으로 꿰맨다. 붕대를 적용한다. 매일 루브리신을 함유하는 연고를 손상 길이 cm당 약 80 μg의 양으로 피해를 입은 영역에 재도포한다. 1주일 후 봉합사를 제거한다. 루브리신 연고를 봉합사 자국이 사라질 때까지 1주일 동안 매일 상처에 도포한다. 열상 부위에 흉터 형성이 관찰되지 않는다.

안구 손상

인간 환자는 굴절교정 각막절제술을 받은 후 한쪽 눈에 각막 혼탁이 생긴다. 환자는 PRG4를 함유하는 점안제로 처방된다. 환자는 100 μg/mL PRG4의 2개의 0.05 mL 점적을 매일 4회 눈의 막힌주머니에 적용하고, 빠른 눈 깜박임으로 PRG4를 각막 표면에 적용한다. 1주일 후, 각막 혼탁이 사라지고, 환자의 시력이 더 이상 흐려지지 않는다.

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acaataaagt cagcacatct 780 cccaagatca caacagcaaa accaataaat cccagaccca gtcttccacc taattctgat 840 acatctaaag agacgtcttt gacagtgaat aaagagacaa cagttgaaac taaagaaact 900 actacaacaa ataaacagac ttcaactgat ggaaaagaga agactacttc cgctaaagag 960 acacaaagta tagagaaaac atctgctaaa gatttagcac ccacatctaa agtgctggct 1020 aaacctacac ccaaagctga aactacaacc aaaggccctg ctctcaccac tcccaaggag 1080 cccacgccca ccactcccaa ggagcctgca tctaccacac ccaaagagcc cacacctacc 1140 accatcaagt ctgcacccac cacccccaag gagcctgcac ccaccaccac caagtctgca 1200 cccaccactc ccaaggagcc tgcacccacc accaccaagg agcctgcacc caccactccc 1260 aaggagcctg cacccaccac caccaaggag cctgcaccca ccaccaccaa gtctgcaccc 1320 accactccca aggagcctgc acccaccacc cccaagaagc ctgccccaac tacccccaag 1380 gagcctgcac ccaccactcc caaggagcct acacccacca ctcccaagga gcctgcaccc 1440 accaccaagg agcctgcacc caccactccc aaagagcctg cacccactgc ccccaagaag 1500 cctgccccaa ctacccccaa ggagcctgca cccaccactc ccaaggagcc tgcacccacc 1560 accaccaagg agccttcacc caccactccc aaggagcctg cacccaccac caccaagtct 1620 gcacccacca ctaccaagga gcctgcaccc accactacca agtctgcacc caccactccc 1680 aaggagcctt cacccaccac caccaaggag cctgcaccca ccactcccaa ggagcctgca 1740 cccaccaccc ccaagaagcc tgccccaact acccccaagg agcctgcacc caccactccc 1800 aaggaacctg cacccaccac caccaagaag cctgcaccca ccgctcccaa agagcctgcc 1860 ccaactaccc ccaaggagac tgcacccacc acccccaaga agctcacgcc caccaccccc 1920 gagaagctcg cacccaccac ccctgagaag cccgcaccca ccacccctga ggagctcgca 1980 cccaccaccc ctgaggagcc cacacccacc acccctgagg agcctgctcc caccactccc 2040 aaggcagcgg ctcccaacac ccctaaggag cctgctccaa ctacccctaa ggagcctgct 2100 ccaactaccc ctaaggagcc tgctccaact acccctaagg agactgctcc aactacccct 2160 aaagggactg ctccaactac cctcaaggaa cctgcaccca ctactcccaa gaagcctgcc 2220 cccaaggagc ttgcacccac caccaccaag gagcccacat ccaccacctc tgacaagccc 2280 gctccaacta cccctaaggg gactgctcca actaccccta aggagcctgc tccaactacc 2340 cctaaggagc ctgctccaac tacccctaag gggactgctc caactaccct caaggaacct 2400 gcacccacta ctcccaagaa gcctgccccc aaggagcttg cacccaccac caccaagggg 2460 cccacatcca ccacctctga caagcctgct ccaactacac ctaaggagac tgctccaact 2520 acccccaagg agcctgcacc cactaccccc aagaagcctg ctccaactac tcctgagaca 2580 cctcctccaa ccacttcaga ggtctctact ccaactacca ccaaggagcc taccactatc 2640 cacaaaagcc ctgatgaatc aactcctgag ctttctgcag aacccacacc aaaagctctt 2700 gaaaacagtc ccaaggaacc tggtgtacct acaactaaga ctcctgcagc gactaaacct 2760 gaaatgacta caacagctaa agacaagaca acagaaagag acttacgtac tacacctgaa 2820 actacaactg ctgcacctaa gatgacaaaa gagacagcaa ctacaacaga aaaaactacc 2880 gaatccaaaa taacagctac aaccacacaa gtaacatcta ccacaactca agataccaca 2940 ccattcaaaa ttactactct taaaacaact actcttgcac ccaaagtaac tacaacaaaa 3000 aagacaatta ctaccactga gattatgaac aaacctgaag aaacagctaa accaaaagac 3060 agagctacta attctaaagc gacaactcct aaacctcaaa agccaaccaa agcacccaaa 3120 aaacccactt ctaccaaaaa gccaaaaaca atgcctagag tgagaaaacc aaagacgaca 3180 ccaactcccc gcaagatgac atcaacaatg ccagaattga accctacctc aagaatagca 3240 gaagccatgc tccaaaccac caccagacct aaccaaactc caaactccaa actagttgaa 3300 gtaaatccaa agagtgaaga tgcaggtggt gctgaaggag aaacacctca tatgcttctc 3360 aggccccatg tgttcatgcc tgaagttact cccgacatgg attacttacc gagagtaccc 3420 aatcaaggca ttatcatcaa tcccatgctt tccgatgaga ccaatatatg caatggtaag 3480 ccagtagatg gactgactac tttgcgcaat gggacattag ttgcattccg aggtcattat 3540 ttctggatgc taagtccatt cagtccacca tctccagctc gcagaattac tgaagtttgg 3600 ggtattcctt cccccattga tactgttttt actaggtgca actgtgaagg aaaaactttc 3660 ttctttaagg attctcagta ctggcgtttt accaatgata taaaagatgc agggtacccc 3720 aaaccaattt tcaaaggatt tggaggacta actggacaaa tagtggcagc gctttcaaca 3780 gctaaatata agaactggcc tgaatctgtg tattttttca agagaggtgg cagcattcag 3840 cagtatattt ataaacagga acctgtacag aagtgccctg gaagaaggcc tgctctaaat 3900 tatccagtgt atggagaaat gacacaggtt aggagacgtc gctttgaacg tgctatagga 3960 ccttctcaaa cacacaccat cagaattcaa tattcacctg ccagactggc ttatcaagac 4020 aaaggtgtcc ttcataatga agttaaagtg agtatactgt ggagaggact tccaaatgtg 4080 gttacctcag ctatatcact gcccaacatc agaaaacctg acggctatga ttactatgcc 4140 ttttctaaag atcaatacta taacattgat gtgcctagta gaacagcaag agcaattact 4200 actcgttctg ggcagacctt atccaaagtc tggtacaact gtccttagac tgatgagcaa 4260 aggaggagtc aactaatgaa gaaatgaata ataaattttg acactgaaaa acattttatt 4320 aataaagaat attgacatga gtataccagt ttatatataa aaatgttttt aaacttgaca 4380 atcattacac taaaacagat ttgataatct tattcacagt tgttattgtt tacagaccat 4440 ttaattaata tttcctctgt ttattcctcc tctccctccc attgcatggc tcacacctgt 4500 aaaagaaaaa agaatcaaat tgaatatatc ttttaagaat tcaaaactag tgtattcact 4560 taccctagtt cattataaaa aatatctagg cattgtggat ataaaactgt tgggtattct 4620 acaacttcaa tggaaattat tacaagcaga ttaatccctc tttttgtgac acaagtacaa 4680 tctaaaagtt atattggaaa acatggaaat attaaaattt tacactttta ctagctaaaa 4740 cataatcaca aagctttatc gtgttgtata aaaaaattaa caatataatg gcaataggta 4800 gagatacaac aaatgaatat aacactataa cacttcatat tttccaaatc ttaatttgga 4860 tttaaggaag aaatcaataa atataaaata taagcacata tttattatat atctaaggta 4920 tacaaatctg tctacatgaa gtttacagat tggtaaatat cacctgctca acatgtaatt 4980 atttaataaa actttggaac attaaaaaaa taaattggag gcttaaaaaa aaaaaaaaaa 5040 a 5041 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr 1 5

Claims

흉터 형성을 감소시키면서 조직 재생 또는 상처 치유의 촉진을 필요로 하는 환자의 상처 또는 조직 손상 부위에 루브리신을 포함하는 제약 제제를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 상처 또는 조직 손상 부위는 뼈, 관절, 관절 연골, 힘줄 또는 인대가 아닌 것인, 상기 환자에서 흉터 형성을 감소시키면서 조직 재생 또는 상처 치유를 촉진하는 방법.
제1항에 있어서, 루브리신이 재조합 인간 루브리신인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 루브리신이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1의 잔기 25-1404를 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신이 서열식별번호: 1의 서열 또는 서열식별번호: 1의 잔기 25-1404와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상처 또는 조직 손상이 눈에 있는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상처 또는 조직 손상이 각막에 있는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상처가 피부의 표피, 진피, 및/또는 하피 층(들)에 존재하는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상처가 피부에 대한 자상, 천자창, 열상, 찢어짐, 긁힘, 또는 찰과상, 또는 외과적 절개인 방법.
제1항 내지 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상처가 타박상인 방법.
제1항 내지 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상처가 화상인 방법.
제1항 내지 제4항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상처가 진피 궤양인 방법.
제11항에 있어서, 궤양이 욕창 (압박 궤양), 당뇨병성 궤양, 또는 박테리아 감염으로 인한 궤양인 방법.
삭제됨
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신이 1 μg/mL 내지 1 mg/mL의 농도로 제공되는 것인 방법.
제14항에 있어서, 루브리신이 100 μg/mL의 농도로 제공되는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신이 상처 면적 cm²당 10-150 μg의 양으로 제공되는 것인 방법.
제16항에 있어서, 루브리신이 상처 면적 cm²당 75-100 μg의 양으로 제공되는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 및 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 제제가 용액, 현탁액, 에멀젼, 로션, 크림, 겔, 페이스트, 또는 연고로서 투여되는 것인 방법.
제18항에 있어서, 제약 제제가 상처에 국소적으로 적용되는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 및 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 제제가 상처에 적용되는 상처 드레싱의 함침물로서 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 및 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 제제가 항생제 또는 항염증제 또는 진통제를 추가로 포함하거나 항생제, 항염증제, 또는 진통제와 함께 투여되는 것인 방법.
제21항에 있어서, 진통제가 리도카인 또는 벤조카인인 방법.
제22항에 있어서, 항생제가 네오마이신, 폴리믹신 b, 바시트라신, 에리트로마이신, 레타파물린, 술파세타미드 나트륨, 무피로신, 프라목신, 은 술파디아진, 마페니드, 또는 오제노악사신인 방법.
제1항 내지 제12항 및 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제약 제제를 상처 부위에 액체 점적으로 또는 주사에 의해 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제12항 및 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 제제가 히알루론산을 포함하지 않는 것인 방법.
뼈, 관절, 관절 연골, 힘줄 또는 인대에 있지 않은 상처 또는 조직 손상 부위에서 흉터 형성을 감소시키면서 조직 재생 또는 상처 치유를 촉진하는데 사용하기 위한, 루브리신을 포함하는 제약 조성물.
루브리신을 포함하는 제약 제제를 새로운 혈관 형성을 유도하기에 충분한 양으로 뼈, 관절, 관절 연골, 힘줄, 또는 인대에 있지 않은 부위에 투여하는 단계를 포함하는, 혈관신생의 유도가 필요한 환자의 신체의 상기 부위에서 혈관신생을 유도하는 방법.
제27항에 있어서, 루브리신이 재조합 인간 루브리신인 방법.
제27항 또는 제28항에 있어서, 루브리신이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 1의 잔기 25-1404를 갖는 것인 방법.
제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신이 서열식별번호: 1의 서열 또는 서열식별번호: 1의 잔기 25-1404와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신이 1 μg/mL 내지 1 mg/mL의 농도로 제공되는 것인 방법.
제31항에 있어서, 루브리신이 100 μg/mL의 농도로 제공되는 것인 방법.
제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신이 부위 면적 cm²당 10-150 μg의 양으로 제공되는 것인 방법.
제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신이 부위 면적 cm²당 75-100 μg의 양으로 제공되는 것인 방법.
제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신이 부위에 국소적으로 투여되는 것인 방법.
제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신이 주사에 의해 부위에 투여되는 것인 방법.
제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 제약 제제가 히알루론산을 포함하지 않는 것인 방법.
제27항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 신체의 부위가 피부 또는 각막을 제외한 눈인 방법.
삭제됨
뼈, 관절, 관절 연골, 힘줄, 또는 인대에 있지 않은 부위에서 혈관신생을 촉진하는데 사용하기 위한, 루브리신을 포함하는 제약 조성물.
제26항 또는 제40항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제약 조성물.
루브리신을 비정상적 상처 치유를 겪고 있거나 그의 위험이 있는 눈에 투여하는 단계를 포함하는, 눈의 비정상적 상처 치유를 치료 또는 예방하는 방법.
제42항에 있어서, 비정상적 상처 치유가 각막의 흉터형성인 방법.
제42항에 있어서, 비정상적 상처 치유가 각막 혼탁인 방법.
제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신이 1 μg/mL 내지 1 mg/mL의 농도로 제공되는 것인 방법.
제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신이 상처 크기를 기준으로 하여 cm²당 10-150 μg의 양으로 제공되는 것인 방법.
제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신이 서열식별번호: 1의 서열 또는 서열식별번호: 1의 잔기 25-1404와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신이 점적제 또는 연고로서 안과적으로 투여되는 것인 방법.
제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 루브리신이 각막이식술, 굴절교정 각막절제술, 레이저 상피하 각막절삭성형술, 또는 레이저 정위치 각막절삭성형술의 완료 시 눈에 투여되는 것인 방법.