TW202017587A - 用於促進傷口癒合之潤滑素(lubricin) - Google Patents

Abstract

本申請案係關於蛋白聚糖4蛋白質(亦稱為潤滑素)在傷口癒合及組織再生、減少疤痕形成及促進血管生成中之用途。

Description

用於促進傷口癒合之潤滑素(LUBRICIN)

本發明係關於人類糖蛋白PRG4 (亦稱為潤滑素)之新用途。更特定言之，其係關於使用PRG4作為用於促進傷口癒合之藥劑。

蛋白聚糖4基因(PRG4)編碼「淺表區蛋白質」(亦稱為潤滑素)之巨核細胞刺激因子(MSF)以及高度不同糖基化剪接變異體及糖型。淺表區蛋白質首先定位於來自淺表區之外植體軟骨的表面處且鑑別於改良性培養基中。首先自滑液分離PRG4 (亦稱為潤滑素)，且其在軟骨-玻璃界面及乳膠-玻璃界面中展現類似於滑液的活體外潤滑能力。稍後將其鑑別為滑液纖維母細胞之產物，且發現其潤滑能力依賴於由外顯子6編碼之940個胺基酸之較大黏蛋白類結構域內的O連接β (1-3) Gal-GalNAc寡醣。潤滑素分子經不同糖基化且已報導若干天然存在之剪接變異體。其在本文中共同稱為PRG4。已顯示PRG4存在於身體內在滑膜、肌腱、關節軟骨(諸如半月板)之表面處且在眼睛之保護膜以及其他部位中，且在關節潤滑及滑液穩定方面起重要作用。

廣泛已知潤滑素降低負荷承載表面之間的摩擦(Swann等人 ， J Biol Chem, 1981, 256: 5921-5；Schmidt等人， JAMA Ophthalmol, 2013, 131(6):766-76)，且因此對此潛在益處的研究已主要集中於關節；然而，潤滑素表現於肝臟、心臟、肺、腎臟及其他組織中(Ikegawa等人 ， Cytogenet Cell Genet, 2000, 90(3-4):291-7)，然而其在此等組織中之作用仍為難懂的。疾病鐘形關節病髖內翻心包炎(Camptodactyly Arthropathy Coxa Vara Pericarditis；CACP)與PRG4之突變有關(Marcelino等人， Nat Genet, 1999, 23(3):319-22)，且此等患者罹患關節退化、慢性發炎及心包炎(Mannurita等人， Eur J Hum Gen, 2014, 22:197-201)，其表明潤滑素具有除了潤滑以外的多種生物功能。

在人類中，潤滑素以高濃度可見於關節之滑液中(約400 μg/mL)，且已在血液中觀測到較低濃度(＞ 100 μg/mL)  (Ikegawa等人 ， Cytogenet Cell Genet, 2000, 90(3-4):291-7；Ai等人 PLoS One, 2015, 10(e0116237))。然而，如本文中所示，申請人已發現潤滑素之特性延伸超過其潤滑及抗黏附特性。因此，儘管先前公開案顯示潤滑素之損失可導致組織退化(Jay等人， Arthritis Rheum , 2010, 62(8):2382-91；Ruan等人， Transl Med, 2013, 5(176)；Jay等人， Matrix Biology, 2014, 39:17-24)，但申請人認為應首先證明潤滑素在傷口癒合及組織再生方面起關鍵作用。特定言之，申請人已發現潤滑素表現於組織損傷之部位處且引發促進傷口癒合之生理反應，藉此抑制疤痕形成。

本發明利用先前未知的PRG4在促進傷口癒合及組織再生中之參與。申請人發現之基礎為對PRG4促進傷口癒合之假定機制的理解。如本文中所示，PRG4可藉由以下增強內源性修復及再生：1)抑制纖維變性反應，2)增加血管生成及至損傷之血流量，3)調節發炎反應(例如，巨噬細胞極化)及4)募集免疫細胞及成體幹細胞(MSC)以介導組織修復。因此，PRG4可以多種新穎方式使用以實現傷口癒合。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種促進組織再生或傷口癒合但減少疤痕形成之方法。該方法包括向有需要之患者中之傷口或組織損傷部位投與包括潤滑素之醫藥製劑。在一個實施例中，該醫藥製劑可包括醫藥學上可接受之載劑。

在一個實施例中，潤滑素為重組人類潤滑素。在一個實施例中，潤滑素具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列。在另一實施例中，潤滑素與SEQ ID NO:1之胺基酸序列具有至少95%胺基酸序列一致性。在另一實施例中，潤滑素為人類潤滑素之已知同系物或變異體。

在一個實施例中，傷口存在於皮膚中。舉例而言，傷口存在於皮膚之表皮、真皮及/或下皮層中。在一個實施例中，傷口在表皮中。在另一實施例中，傷口在表皮及真皮中。在另一實施例中，傷口在表皮、真皮及下皮層中。在另一實施例中，傷口在真皮及下皮層中。在另一實施例中，傷口在下皮層中。在另一實施例中，傷口在真皮中。

在一個實施例中，傷口或組織損傷在眼睛中。舉例而言，在一個實施例中，傷口或組織損傷在角膜中。

在一個實施例中，傷口或組織損傷為皮膚之割傷、刺傷、裂傷、撕裂傷、燒傷、刮傷或擦傷或手術切口。在另一實施例中，傷口為瘀傷。在另一實施例中，傷口為燒傷。在又另一實施例中，傷口為皮膚潰瘍。潰瘍可為褥瘡(壓迫性潰瘍(pressure ulcer))、糖尿病性潰瘍或由細菌感染或壞死引起。在另一實施例中，傷口或組織損傷可為痤瘡。在另一實施例中，傷口或組織損傷為已以手術方式切除此前形成之疤痕組織的部位。在另一實施例中，傷口在為非關節、非骨質及非骨骼之部位處且傷口不在骨、關節、關節軟骨肌腱或韌帶中。

在一個實施例中，潤滑素係以1 μg/mL至1 mg/mL之濃度提供。在另一實施例中，潤滑素係以100 μg/mL之濃度提供。在另一實施例中，潤滑素係以每cm² 之傷口面積50 μg至1000 μg之量提供。在又一實施例中，潤滑素係以每cm² 之傷口面積50 μg至500 μg之量提供，而在另一實施例中，潤滑素係以每cm² 之傷口面積約75-100 μg之量提供。在又另一實施例中，潤滑素係以每cm² 之傷口面積10-150 μg之量提供。

在又一實施例中，含有潤滑素之醫藥製劑係作為溶液、懸浮液、乳液、洗劑、乳膏、凝膠、糊劑或軟膏投與。在一個實施例中，溶液係作為液滴局部地投與在組織損傷之部位處或藉由在組織損傷之部位處注射來投與。在一個實施例中，醫藥製劑局部地施加於組織損傷之部位處或藉由注射至損傷之部位來投與。在又一實施例中，醫藥製劑不包括玻尿酸。

在另一實施例中，醫藥製劑係作為施加至傷口之傷口敷料的浸漬物投與至傷口或組織損傷。

在一個實施例中，醫藥製劑係與止痛劑一起投與或所投與之醫藥組合物含有止痛劑。舉例而言，止痛劑為利多卡因(lidocaine)或苯佐卡因(benzocaine)。

在一個實施例中，醫藥製劑係與抗生素或消炎劑一起投與，或所投與之醫藥組合物含有抗生素或消炎劑。舉例而言，抗生素為新黴素、多黏菌素 b (polymyxin b)、枯草菌素(bacitracin)、紅黴素、瑞他帕林(retapamulin)、乙醯磺胺鈉(sulfacetamide sodium)、莫匹羅星(mupirocin)、普莫卡因(pramoxine)、磺胺嘧啶銀(silver sulfadiazine)、磺胺米隆(mafenide)或奧擇沙星(ozenoaxacin)。舉例而言，消炎劑為皮質醇(hydrocortisone)。

在一個實施例中，本發明提供一種包括潤滑素之醫藥組合物，其用於促進組織再生或傷口癒合但減少疤痕形成。在一個實施例中，醫藥組合物可包括醫藥學上可接受之載劑。

在另一實施例中，本發明提供一種在有需要之患者之體內的部位處誘發血管生成的方法。該方法涉及以足以誘發新血管形成之量向該部位投與包括潤滑素之醫藥製劑。在一個實施例中，該醫藥製劑可包括醫藥學上可接受之載劑。

在一個實施例中，潤滑素為重組人類潤滑素。在一個實施例中，潤滑素具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列。在一個實施例中，潤滑素與請求項1之序列具有至少95%胺基酸序列一致性。潤滑素可以1 μg/mL至1 mg/mL，例如100 μg/mL之濃度提供。潤滑素可以每cm² 部位之面積10-150 μg之量提供，而在另一實施例中，潤滑素係以每cm² 部位之面積75-100 μg之量提供。

為了促進血管生成，潤滑素可局部投與至該部位或例如藉由注射投與至該部位。在一個實施例中，醫藥製劑不包括玻尿酸。在又一實施例中，需要血管生成之部位為組織損傷或傷口，諸如皮膚之割傷、刺傷、裂傷、撕裂傷、刮傷或擦傷、手術切口或燒傷或瘀傷或潰瘍之部位。舉例而言，組織損傷或傷口之部位可為表皮且可視傷口之深度而定包括真皮或下皮層。

在一個實施例中，組織損傷或傷口之部位在眼睛中，而非在角膜中。

在又一實施例中，本發明提供一種用於促進血管生成的包括潤滑素之醫藥組合物。在一個實施例中，醫藥組合物可包括醫藥學上可接受之載劑。

在一態樣中，本發明提供一種治療或預防眼睛中之異常傷口癒合之方法。該方法涉及向罹患異常傷口癒合或處於異常傷口癒合風險下之眼睛投與潤滑素。在一個實施例中，異常傷口癒合為角膜結疤，而在另一實施例中其為角膜混濁。根據一個實施例，基於傷口之尺寸，潤滑素係以1 μg/mL至1 mg/mL之濃度及/或以每cm² 10-150 μg之量提供。在一個實施例中，潤滑素與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1之殘基25-1404之序列具有至少95%胺基酸序列一致性。在一個實施例中，潤滑素係以液滴或軟膏形式經眼投與。在一個實施例中，潤滑素係在完成角膜形成術、屈光性角膜切除術、雷射上皮下角膜重塑術或雷射原位角膜重塑術之後向眼睛投與。

本申請案主張2018年6月21日申請之美國臨時專利申請案第62/688,163號之優先權及權益，該申請案之全部內容以引用之方式併入本文中。

傷口癒合為組織在損傷之後修復本身之複雜過程且涉及各種生理過程，包括止血、發炎、增殖及新組織之生長，包括血管生成及組織之重塑或成熟。傷口為涉及身體組織中外部或內部破裂之損傷。舉例而言，傷口可為內部的，涉及身體內器官或組織上皮層之破裂，或其可為外部的，涉及皮膚或眼睛上皮層之破裂。傷口癒合係指修復此類傷口且身體組織中之破裂閉合的過程。

傷口癒合反應在動物界中為最原始且最保守的生理反應之一，此係由於復原組織完整性/恆定可為生與死之間的差別。哺乳動物中之傷口癒合主要係藉由免疫細胞及發炎性信號傳導分子介導，該等免疫細胞及發炎性信號傳導分子可調節其他組織常駐細胞(包括成體幹細胞)以經由疤痕之形成介導傷口之閉合。如本文中所展現，申請人已觀測到潤滑素，一種可見於自魚至象之整個動物界中之蛋白質(Ikegawa等人， Cytogenet Cell Genet, 2000, 90(3-4):291-7)在損傷之後立即高度表現於幹細胞中。

如本文中所展現，潤滑素藉由以下增強內源性傷口修復及組織再生：1)抑制纖維變性反應，2)增加血管生成及至損傷之血流量，3)調節發炎反應(例如巨噬細胞朝向M2與M1極化)及4)募集免疫細胞及成體幹細胞(MSC)以介導組織修復。

圖1圖解潤滑素達成此等作用之潛在機制。基本上，當正常位準之潤滑素存在於傷口部位處時，纖維化及增加之促發炎細胞介素導致結疤，而當潤滑素以超過生理學上可用位準之增加的位準存在於傷口部位處時，纖維化得到抑制，巨噬細胞顯示導致消炎性細胞介素之表現的M2極化，且活化其他導致血管生成及免疫及間葉幹細胞(MSC)募集之路徑，從而產生具有最小疤痕形成至無疤痕形成之優良的傷口癒合。因此，根據本發明且如本文中所展現，潤滑素不僅藉由減少或抑制引起疤痕形成之纖維化，且亦藉由促進巨噬細胞顯示導致消炎性細胞介素之表現的M2極化，且由活化其他導致血管生成及免疫及間葉幹細胞(MSC)募集之路徑來促進傷口癒合及組織再生。

儘管許多組織在正常情況下展現充分的傷口癒合，但在主要傷害(損傷/疾病)持續之情況下，此可能導致慢性發炎及不當纖維變性修復。如在潰瘍性病變中顯而易見，慢性發炎防止癒合。儘管皮膚中之持續纖維化導致結疤及毀形，器官中基質之進行性沈積損害其結構及功能，從而引起疾病及死亡(Gurtner等人， Nature, 2008, 453:314)。

瞭解本文中所描述之傷口癒合中藉由潤滑素調節之路徑表明潤滑素可用於藉由同一種類之正常細胞促進受損組織之再生，且藉由調節潤滑素之表現，可藉由引發再生反應代替纖維變性修復反應來增強傷口癒合。

纖維變性修復反應導致疤痕組織形成。在此生理過程中，受損組織由於纖維化而經疤痕組織(而非正常組織)替代，從而導致膠原蛋白以與在正常皮膚中不同的方式沈積。然而，本發明之方法促進傷口癒合之生理方法，其導致組織之再生或新生，亦即，以新的正常的且功能性組織而非纖維結疤沈積物替代受損組織。舉例而言，根據本發明之方法，損壞或受損的組織經正常、健康細胞/組織替代，且疤痕形成在損傷之部位處減少或消除。如本文中所展現，此再生反應係由於潤滑素之以下能力：促進血管生成；抑制纖維變性反應；促進巨噬細胞自M1朝向M2極化，藉此將發炎反應自促發炎調節至消炎；及募集免疫細胞及成體幹細胞(MSC)以介導組織修復及組織損傷之部位。

因此，本發明提供一種促進傷口癒合或組織再生但減少疤痕形成之方法，其中向傷口投與潤滑素(PRG4)。根據本發明之一個實施例，在傷口之部位處觀測到之組織再生的位準大於在不使用外源性潤滑素之情況下將出現之位準，且疤痕形成之位準相比於在不使用外源性潤滑素之情況下將出現之位準降低。 PRG4 蛋白質

PRG4 (亦稱為潤滑素)為潤滑性多肽，其在人類中自巨核細胞刺激因子(MSF)基因(亦稱為PRG4)表現(參見NCBI寄存編號AK131434 - U70136)。潤滑素為一種普遍存在的內源性糖蛋白，其覆蓋身體之關節表面。潤滑素為高度表面活性分子(例如，固持至水上)，其主要起強力的細胞保護、抗黏附及邊界潤滑劑作用。該分子具有定位於末端蛋白質結構域之間的長中心黏蛋白類結構域，其允許分子黏著且保護組織表面。其在所有研究之哺乳動物中之天然形式含有與KEPAPTT (SEQ ID NO:3)至少50%一致的氨基酸序列之多個重複序列。天然潤滑素通常包含此重複序列之多種冗餘形式，該重複序列通常包括脯胺酸及蘇胺酸殘基，其中至少一個蘇胺酸在大部分重複序列中經糖基化。錨定蘇胺酸之O連接糖側鏈對於潤滑素之邊界潤滑功能為決定性的。側鏈部分通常為β(1-3)Gal-GalNAc部分，β(1-3)Gal-GalNAc通常經唾液酸或N-乙醯基神經胺糖酸封端。多肽亦含有N-連接寡醣。編碼天然存在之全長潤滑素之基因含有12個外顯子，且天然存在之MSF基因產物含有與玻璃連結蛋白(包括凝血酵素類及促生長因子類區域)具有多個多肽序列同源性的1,404個胺基酸(包括分泌序列)。中心定位之外顯子6含有940個殘基。外顯子6編碼富含重複序列之O-糖基化黏蛋白類結構域。

潤滑素之蛋白質主鏈的胺基酸序列可視人類MSF基因之外顯子的替代性拼接而不同。當研究人員創建自中心黏蛋白結構域缺少474個胺基酸之潤滑素的重組形式，儘管調低，但仍達成合理潤滑作用重組時，例示此抗異質性之穩固性(Flannery等人， Arthritis Rheum 2009; 60(3):840-7)。已顯示PRG4不僅作為單體存在且亦作為經由在N端與C端兩者處之保守性富含半胱胺酸之結構域二硫鍵鍵結的二聚體及多聚體存在。Lubris, LLC已研發出人類潤滑素之全長重組形式。使用Selexis中國倉鼠卵巢細胞株(CHO-M)來表現該分子，其中最終表觀分子量為450-600 kDa，其中多分散多聚體在1,000 kDa或更高下頻繁量測，全部均如相比於SDS tris-乙酸鹽3-8%聚丙烯醯胺凝膠上之分子量標準所估計。在總體糖基化中，約一半包含兩個糖單元(GalNAc-Gal)，且一半包含三個糖單元(GalNAc-Gal-唾液酸)。重組人類PRG4生產之此方法揭示於國際專利申請案第PCT/US014/061827號中。

各種原生及重組PRG4蛋白質及同功異型物中之任何一或多者可用於本文中所描述之各種實施例中。舉例而言，美國專利第6,433,142號；第6,743,774號；第6,960,562號；第7,030,223號；及第7,361,738號揭示如何製得人類PRG4表現產物之各種形式，該等專利中之每一者均以引用之方式併入本文中。較佳用於本發明之實踐中的為自CHO細胞表現之全長經糖基化重組PRG4或潤滑素。此蛋白質包含1,404個胺基酸(參見圖12；SEQ ID NO:1)，其包括包含經O-連接β(1-3)Gal-GalNAc寡醣不同地糖基化的序列KEPAPTT (SEQ ID NO: 3)之重複序列，且包括與玻璃連結蛋白具有同源性之N端及C端序列的中心外顯子。分子為多分散的，其中個體分子之糖基化型態不同，且可包含單體、二聚及多聚物種。

如本文中所使用，術語「PRG4」可與術語「潤滑素」互換使用。廣泛地，此等術語係指任何功能性經分離或經純化之原生或重組PRG4蛋白質，其同系物、功能性片段、同功異型物及/或突變體。所有適用分子包含由外顯子6編碼之序列或其同系物或截斷型式，例如，在此中心黏蛋白類KEPAPTT重複序列結構域內具有較少重複序列之型式，較佳具有O-連接糖基化。所有適用分子亦至少包含由外顯子1-5及7-12編碼之序列的生物活性部分，亦即，對賦予分子對ECM及內皮表面之親和力負責之序列。在某些實施例中，較佳PRG4蛋白質具有在50 kDa與500 kDa之間、較佳在224與467 kDa之間的平均莫耳質量，包含PRG4蛋白質或功能性片段(諸如潤滑片段)或其同系物之一或多個生物活性部分。在一更佳實施例中，PRG4蛋白質包含平均莫耳質量在220 kDa與約280 kDa之間的單體。

在一些實施例中，涵蓋與SEQ ID NO:1或與由PRG4之外顯子1-5及7-12編碼之序列或與SEQ ID NO:1之殘基25-1404具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%胺基酸序列一致性的功能性或生物活性PRG4片段及同系物。在一些實施例中，涵蓋與SEQ ID NO:1之殘基25-1404具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%序列一致性的功能性或生物活性PRG4片段及同系物。在另一實施例中，PRG4為重組人類潤滑素。在另一實施例中，PRG4具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列。在另一實施例中，PRG4具有SEQ ID NO:1之殘基25-1404之胺基酸序列。

為了測定兩個胺基酸序列或兩個核酸之一致性百分比，出於最佳比較目的而比對序列(例如，可將間隙引入於第一胺基酸序列或核酸序列中用於與第二胺基酸或核酸序列之最佳比對)。兩個序列之間的一致性百分比為序列共用之相同位置之數目的函數(亦即，同源性% = (相同位置之#/位置之總#)乘以100)。可使用數學算法來測定兩個序列之間的同源性百分比。用於比較兩個序列之數學演算法的一個非限制性實例為Karlin及Altschul, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-68之演算法，其如Karlin及Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-77中修改。將此算法併入Altschul等人，(1990) J. Mol. Biol., 215:403-10之NBLAST及XBLAST程式中。BLAST核苷酸搜尋可以用NBLAST程式執行，記分=100，字長=12。BLAST蛋白質搜尋可以用XBLAST程式執行，記分=50，字長=3。為了獲得用於比較目的之間隙比對，可如Altschul等人，(1997) Nucleic Acids Research, 25(17):3389-3402中所述利用間隙BLAST。當使用BLAST及間隙BLAST程式時，可使用各程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。

在一些實施例中，涵蓋與原生PRG4相比具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%活性(例如生物活性)的功能性PRG4片段及同系物。

用於蛋白質(諸如PRG4蛋白質)之分離、純化及重組表現的方法為此項技術中所熟知。在某些實施例中，該方法以使用標準分子生物學技術，諸如PCR或RT-PCR，選殖及分離編碼PRG4蛋白質或同功異型物之mRNA及cDNA開始。接著將編碼PRG4蛋白質或同功異型物之經分離之cDNA選殖至表現載體中且於宿主細胞中表現以產生重組PRG4蛋白質，且自細胞培養上清液分離。一種用於產生重組人類PRG4之方法提供於國際專利申請案第PCT/US014/061827號中。 待治療之傷口或組織損傷之類型

如先前所陳述，傷口為涉及身體組織中之外部或內部破裂的損傷。舉例而言，傷口可為內部的，涉及身體內器官或組織上皮層之破裂，或其可為外部的，涉及皮膚或眼睛上皮層之破裂。傷口癒合係指修復此類傷口且身體組織中之破裂閉合的過程。

在一個態樣中，本發明之方法提供使用PRG4對皮膚之傷口或受損組織的治療。傷口可在表皮、真皮或下皮層中或在此等層中之一或多者中。組織損傷可在皮膚之表面下方，諸如為淤血、血腫或壞死之情況，此時在表皮可能尚未受損，但存在對真皮、下皮層及甚至肌肉組織之損害。

本發明之方法涵蓋對皮膚傷口之治療，該等皮膚傷口諸如割傷、裂傷、撕裂傷、燒傷、瘀傷、擦傷、刺傷或手術切口。本發明亦涵蓋對諸如潰瘍之傷口的治療。舉例而言，壓迫性潰瘍(pressure ulcers)(褥瘡(bed sores/decubitus))、糖尿病性潰瘍或由壞死或感染引起之潰瘍可經潤滑素根據本發明之方法治療以促進組織再生且減少疤痕形成。亦涵蓋痤瘡之治療，此係由於痤瘡涉及皮膚之上皮組織的破裂。

本發明之方法亦涵蓋使用PRG4對眼睛傷口之治療及對眼睛中之異常傷口癒合的治療。眼睛中之異常傷口癒合及傷口癒合病症可能經由以下導致重度眼部組織損壞：發炎細胞之活化、生長因子及細胞介素之釋放、眼細胞之增殖及分化、毛細管滲透性增加、基底膜基質組合物之改變、細胞外基質沈積增加、纖維化、新血管生成及組織重塑。特定言之，角膜中之異常傷口癒合可導致不存在於健康角膜中之血液及淋巴血管的產生。此外，因為對角膜基質之損傷並不總是誘發角膜結疤，因此角膜結疤為眼睛中異常傷口癒合之結果。

因此，本發明之方法提供使用PRG4來治療眼睛之傷口或受損組織。在一個實施例中，本發明之一種方法提供藉由向眼睛投與潤滑素來治療異常傷口癒合或傷口癒合病症。可向眼睛中傷口之特定位置投與潤滑素或其一般可向眼睛投與。可經治療之一些傷口包括由對眼睛的眼睛手術引起之彼等傷口。舉例而言，在一個實施例中，本發明之方法預防及/或治療由眼睛曝露至雷射輻射產生之角膜混濁。在一個實施例中，本發明之方法促進角膜中之傷口癒合，藉此預防或抑制與對角膜之手術傷害或創傷(包括與侵入性或非侵入性角膜手術相關聯之創傷)相關聯之角膜疤痕組織的形成。舉例而言，對角膜之創傷可由雷射角膜形成術程序或屈光性角膜切除術(PRK)或雷射原位角膜重塑術(LASIK)或雷射上皮下角膜重塑術(LASEK)引起。在其他實施例中，向眼睛投與PRG4促進角膜傷口癒合。舉例而言，根據本發明之方法向眼睛投與PRG4可用於治療或預防角膜結疤。角膜結疤可由尤其例如帶狀疱疹(shingles)、單純疱疹1或2、隱形眼鏡使用或由事故或損傷造成之角膜刮傷或燒傷引起。在一些實施例中，向眼睛投與PRG4以減少例如在角膜中預先存在之疤痕組織的存在，其可能由於角膜混濁而引起視覺模糊或降低。根據一個實施例，眼睛為人眼。根據一個實施例，當眼睛經受疾病或損傷時，眼睛處於異常傷口癒合之風險下。舉例而言，手術傷害，諸如(但不限於)PRK、LASEK或LASIK或自觸碰眼睛之物體意外損傷眼睛可使眼睛處於異常傷口癒合之風險下。舉例而言，可損壞眼睛之疾病(諸如前述病毒性疾病)亦使眼睛處於異常傷口癒合之風險下。

本發明之方法提供對超出皮膚之組織及器官之內部損傷的治療，例如，由於諸如因跌倒、汽車事故、刺傷或刀傷產生之創傷、槍擊或鈍力創傷；內出血或淤血；或手術傷害。因此，可向神經系統(大腦、脊髓、神經)之組織、肌肉組織、上皮組織或結締組織投與潤滑素以在減少疤痕組織形成的同時，促進傷口癒合及組織再生。本發明亦涵蓋對耳朵、眼睛、嘴唇、腎臟、肝臟、胰臟、肺、胃、食道、氣管、膀胱、腸道、結腸、心臟、內分泌器官或血管之傷口治療及減少其結疤。對於內部損傷治療，潤滑素可藉由局部注射投與，或經由手術干預局部投與。亦涵蓋用於傷口癒合之靜脈內全身性投與。本發明涵蓋對體內手術傷口之治療，該等手術傷口諸如穿孔或打破諸如胃腸道中之上皮組織的彼等手術傷口。

在一個實施例中，待治療之傷口在為非骨質、非骨骼及非關節之位置中。在一個實施例中，待治療之傷口不為骨或關節或關節軟骨或肌腱或韌帶中之傷口。因此，本發明包括促進組織再生或傷口癒合但減少疤痕形成之方法，其中向有需要之患者中之傷口或組織損傷之部位投與PRG4，其中該傷口不在骨或關節或關節軟骨或肌腱或韌帶中。本發明包括促進組織再生或傷口癒合但減少疤痕形成之方法，其中向有需要之患者中之傷口或組織損傷之部位投與PRG4，其中該傷口在為非骨質、非骨骼及非關節之位置中。在一個實施例中，待治療之傷口不為軟骨中之傷口。因此，本發明包括促進組織再生或傷口癒合但減少疤痕形成之方法，其中向有需要之患者中之傷口或組織損傷之部位投與PRG4，其中該傷口不在軟骨中。在一個實施例中，待治療之傷口為軟骨中的傷口，該軟骨不為關節軟骨。因此，本發明包括促進組織再生或傷口癒合但減少疤痕形成之方法，其中向有需要之患者中之傷口或組織損傷之部位投與PRG4，其中該傷口不在關節軟骨中。舉例而言，該軟骨可在耳朵或鼻中。

本發明亦提供用於移除患者中存在之疤痕或減少該疤痕之出現的方法，無論該等疤痕是否在皮膚上或體內別處。根據此類方法，可例如藉由手術切除及移除疤痕組織，且可將潤滑素提供至疤痕移除區域，以促進此前存在之疤痕部位處的組織再生。

本發明之方法提供可將含有重組人類潤滑素之醫藥組合物作為傷口敷料之浸漬物施加至傷口或組織損傷。傷口敷料可為紗布、墊片或繃帶。可浸漬有潤滑素之材料包括棉、聚酯、嫘縈或前述織物之摻混物、海藻酸鈣或海藻酸鈉、聚乙烯、聚胺基甲酸酯膜或泡沫、聚丙烯酸酯、聚丙烯、纖維素、聚酯膜、耐綸、氨綸或用於繃帶或傷口敷料之其他適合材料。

根據本發明之方法，待治療之傷口或組織損傷在人類患者身上/體內。然而，亦涵蓋對馬或狗或其他哺乳動物之治療。在此類獸醫應用中，可使用來自正治療之具體物種之原生或重組潤滑素。

此外，本發明亦提供用於誘發血管生成之方法。舉例而言，根據本發明，一種誘發血管生成之方法涉及將包括潤滑素之醫藥組合物施加至需要血管生成之患者之身體上的部位。該部位可為例如皮膚之傷口，諸如割傷、燒傷、擦傷、刺傷或裂傷，或該部位可為人體之器官或其他組織中之損傷。 PRG4 之投與

儘管PRG4天然地在體內產生，但在向患者中組織損傷之部位投與外源性PRG4時觀測到本發明之作用。因此，在一個實施例中，向患者投與之PRG4為外源性人類PRG4，而在另一實施例中，向患者投與之PRG4為重組人類PRG4 (rhPRG4)。在另一實施例中，rhPRG4具有SEQ ID NO:1之序列，而在另一實施例中，rhPRG4具有SEQ ID NO:1之殘基25-1404之序列。

可藉由多種方法向患者投與PRG4。舉例而言，可向傷口之部位局部投與PRG4，或可例如藉由注射向傷口之部位局部投與PRG4。亦可藉由靜脈內投與來全身性投與PRG4。

所投與PRG4之量將視諸如傷口之尺寸、傷口之深度及體內傷口之位置的變數而定。

在一些實施例中，根據本發明用於局部地或藉由局部注射向組織損傷之部位投與之PRG4的治療有效量在0.1 μg/kg至4000 μg/kg，或0.1 μg/kg至1000 μg/kg，或0.1 μg/kg至100 μg/kg，或0.1至50 μg/kg範圍內。在一些實施例中，所投與PRG4之治療有效量在0.1 mg/kg至100 mg/kg，或1 mg/kg至100 mg/kg，或1 mg/kg至10 mg/kg範圍內。所投與PRG4亦可在0.1 μg/mL至30 mg/mL，或1 μg/mL至10 mg/mL，或10 μg/mL至1 mg/mL，或10 μg/mL至500 μg/mL，或50 μg/mL至150 μg/mL範圍內。在一些實施例中，以約100 μg/mL之濃度投與PRG4。在一些實施例中，以每劑量1至100 μL之較小量投與PRG4。

在某些實施例中，每次向傷口投與之潤滑素總量為2 mg至10 mg，例如，2 mg至10 mg、2 mg至5 mg、2 mg至3 mg、3 mg至4 mg、4 mg至5 mg、5 mg至6 mg、6 mg至7 mg、7 mg至8 mg、8 mg至9 mg、9 mg至10 mg或5 mg至10 mg。在某些實施例中，向傷口投與多於10 mg之潤滑素。涵蓋於本發明中的為用於靜脈內投與之PRG4之劑量係用於局部(topical/local)投與之劑量的至少1.5倍，或至少2倍，或至少3倍，或至少4倍，或至少5倍，或至少10倍。

在某些實施例中，向傷口投與之潤滑素之量基於傷口之尺寸。舉例而言，所投與潤滑素之量在每cm² 之傷口面積10 μg至1000 μg範圍內，或在每cm² 之傷口面積50 μg至500 μg範圍內，或在每cm² 之傷口面積50 μg至300 μg範圍內，或在每cm² 之傷口面積10 μg至150 μg範圍內，或在每cm² 之傷口面積5 μg至100 μg範圍內，或在每cm² 之傷口面積25 μg至150 μg範圍內，或在每cm² 之傷口面積40 μg至120 μg範圍內，或在每cm² 之傷口面積70 μg至100 μg範圍內，或在每cm² 之傷口面積50 μg至150 μg範圍內、在每cm² 之傷口面積75 μg至100 μg範圍內，或以每cm² 之傷口面積約80 μg之量。視用於遞送潤滑素之醫藥組合物之調配物而定，可能需要調節調配物中之潤滑素的量以確保將潤滑素之前述量自載劑遞送至傷口部位。調節調配物以確保自載劑遞送治療有效量之潤滑素在此項技術中之技能內。

可每天、隔日、每三天、每四天、每五天、每六天、每週一次或每隔一週向組織損傷部位投與潤滑素，直至傷口癒合完成為止。完全治療可耗費例如一週、兩週、三週或一個月。在治療慢性皮膚病況之情況下，只要病況需要消退，治療可繼續。

PRG4之全身性投與亦由本發明之一些實施例涵蓋。舉例而言，PRG4可以經腸方式，諸如經口、經直腸、舌下、唇下或經頰遞送全身性投與。PRG4可以非經腸方式，諸如經鼻、藉由吸入、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內或經黏膜的遞送全身性投與。

對於將PRG4遞送至眼睛，潤滑素可併入至溶液、懸浮液、乳液或凝膠中。PRG4之眼用組合物可經由例如使用膠原膜、隱形眼鏡或置放於眼表面上能夠將藥物遞送至角膜之其他固體基質來遞送至眼睛。PRG4亦可以液滴或軟膏形式遞送至眼睛。舉例而言，PRG4可施加至眼睛表面或眼睛之結膜囊(cul-de-sac)，或藉由灌洗眼睛施加。在眼用應用中，PRG4應儘快在傷口或損傷發生之後遞送至傷口或損傷之位置，且經由允許PRG4與傷口或損傷之部位保持接觸且不被快速沖洗掉至淚管中的方法遞送。然而，若此確實發生，則可能必需再施加PRG4以確保與傷口表面繼續接觸從而確保癒合。

本文中所涵蓋之PRG4之全身性投與的較佳途徑為靜脈內投與。最佳劑量可視諸如傷口之尺寸、傷口之位置及組織損壞之位準及類型的變數藉由常規實驗確定。對於全身性投與，投與在0.1 mg/kg與100 mg/kg之間、替代地在0.5 mg/kg及50 mg/kg之間、替代地在1 mg/kg與25 mg/kg之間、替代地在2 mg/kg與10 mg/kg之間、替代地在5 mg/kg與10 mg/kg之間、替代地在0.05-1.50 mg/kg之間的劑量且可例如每日一次、每週一次、每週兩次、每週三次、每隔一週一次給予，直到達成損傷之完全癒合為止。 醫藥調配物

對於用於傷口癒合及促進血管生成，所投與PRG4較佳與醫藥學上可接受之載劑組合。醫藥學上可接受之載劑包括與合理益處/風險比相稱、適用於與人類及動物之組織接觸，而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症的緩衝劑、載劑及賦形劑。在與調配物之其他成分相容及不對接受者有害之意義上，載體應為「可接受的」。醫藥學上可接受之載劑包括與醫藥投與相容之緩衝劑、溶劑、分散介質、包衣、等張劑及吸收延遲劑及其類似者。

對於以溶液形式遞送之PRG4，適合載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。適合載劑亦可包括含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇)及其適合混合物之溶劑或分散介質。載劑在製造及儲存條件下應為穩定的，且應抗微生物保存。載劑用於醫藥活性物質之用途為此項技術中已知。舉例而言，參見Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版 (Mack Publishing Company, 1990)。

在一些實施例中，PRG4之醫藥調配物為無菌的。醫藥製劑之滅菌可經由已知機制達成。

含有潤滑素之醫藥製劑之pH通常在3與11之間、更佳在5與9之間或在6與8之間且最佳在7與8之間，諸如7至7.5。

對於局部投與，可將潤滑素併入至糊劑、軟膏、乳膏、洗劑、凝膠、香膏或油膏或其他懸浮液或乳液中。此類藥物組合物可包括水；油；增稠劑，諸如纖維素、果膠、甲基纖維素或卡波普；緩衝劑，諸如檸檬酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑或酒石酸鹽緩衝劑；螯合劑，諸如EDTA或檸檬酸；乳化劑，諸如蠟、鯨蠟硬脂醇或聚山梨醇酯20；保濕劑，諸如丙三醇、甘油基脂肪酸酯、丙二醇或聚乙二醇；滲透增強劑，諸如DMSO、尿素、三乙醇胺(triethanolamide)、醇、脂肪酸、脂肪酸酯、多元醇、月桂基硫酸鈉、氯苄烷銨、氯化十六烷基吡錠、卵磷脂、Spans®、Tweens®、泊洛沙姆、miglyol®或丙二醇；及/或防腐劑，諸如苯甲酸、醇、四級銨化合物或諸如硫柳汞之有機汞化合物。軟膏、香膏或油膏可包括例如石油膏或石蠟脂，且可由油性基底、吸收基底、油包水乳液基底、水包油乳液基底或水溶性基底製得。乳膏及乳液可包括油包水或水包油乳液。凝膠可包括有包括化學或物理凝膠或單相或二相系統之水凝膠或有機凝膠基底。適用於此等局部製劑之基底可包括石蠟脂、白凡士林、黃軟膏或白軟膏、礦物油、羊毛脂、膽固醇、十八烷醇、聚乙二醇、白蠟、卡波姆、羧基甲基纖維素或羥基丙基甲基纖維素。局部製劑之基底應與皮膚相容、穩定、平滑、柔韌、非刺激性的，並且能夠吸收水或其他液體製劑且釋放所併入潤滑素醫藥活性。基底應為可滅菌的。糊劑、軟膏、乳膏、洗劑、凝膠、香膏或油膏之製備為熟習此項技術者所知。

對於經眼投與，可將PRG4併入至經眼可接受調配物，例如溶液或軟膏或凝膠或膠原蛋白插入物中。調配物可提供PRG4之持續釋放。舉例而言，用於眼睛之PRG4的持續釋放調配物可經由膠原蛋白插入物達成。

根據一些實施例，提供包括潤滑素及抗生素之醫藥製劑。可投與之抗生素之實例包括阿米卡星(amikacin)、慶大黴素、康黴素(kanamycin)、新黴素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、妥布黴素(tobramycin)、巴龍黴素(paromomycin)、鏈黴素、觀黴素(spectinomycin)、格爾德黴素(geldanamycin)、除莠黴素(herbimycin)、利福昔明(rifaximim)、氯碳頭孢(loracarbef)、厄他培南(ertapenem)、多尼培南(doripenem)、亞胺培南(imipenem)、西司他汀(cilastatin)、美羅培南(meropenem)、頭孢羥胺苄(cefadroxil)、頭孢唑林(cefazolin)、頭孢拉定(cephradine)、吡硫頭孢菌素(cephapirin)、頭孢噻吩(cephalothin)、頭孢氨(cephalexin)、頭孢克洛(cefaclor)、西福斯汀(cefoxiting)、頭孢替坦(cefotetan)、頭孢孟多(cefamandole)、頭孢美唑(cefmetazole)、頭孢尼西(cefonicid)、氯碳頭孢(loracarbef)、頭孢丙烯(cefprozil)、頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢克肟(cefixime)、頭孢地尼(cefdinir)、頭孢妥侖(cefditoren)、頭孢哌酮(cefoperazone)、頭孢噻肟(cefotaxime)、頭孢泊肟(cefpodoxime)、頭孢布烯(ceftibuten)、頭孢唑肟(ceftizoxime)、拉氧頭孢(moxalactam)、頭孢曲松(ceftriaxone)、頭孢吡肟(cefepime)、頭孢洛林酯(ceftaroline fosamil)、頭孢吡普(ceftobiprole)、替考拉寧(teicoplanin)、萬古黴素(vancomycin)、特拉萬星(telavancin)、達巴萬星(dalbavancin)、奧利萬星(oritavancin)、克林達黴素(clindamycin)、林可黴素(lincomycin)、達托黴素(daptomycin)、阿奇黴素(azithromycin)、克拉黴素、紅黴素、羅紅黴素(roxithromycin)、泰利黴素(telithromycin)、螺旋黴素(spiramycin)、氨曲南(azetreonam)、呋喃唑酮(furazolidone)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、利奈唑胺(linezolide)、潑斯唑來(posizolid)、特地唑胺(torezolid)、阿莫西林(amoxicillin)、安比西林(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、雙氯西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、美洛西林(mezlocillin)、二甲氧苯青黴素(methicillin)、乙氧萘青黴素(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、青黴素G、青黴素G、哌拉西林(piperacillin)、替莫西林(temocillin)、替卡西林(ticarcillin)、枯草菌素(bacitracin)、可利斯汀(colistin)、多黏菌素B (polymyxin B)、環丙沙星(ciprofloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、那氟沙星(nadifloxacin)、萘啶酸(nalidixic acid)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin)、格雷沙星(grepafloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、替馬沙星(temafloxacin)、磺胺米隆(mafenide)、磺胺醋醯胺、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺二甲氧嗪(sulfadimethoxine)、柳氮磺吡啶(sulfanilamide)、柳氮磺胺吡啶、磺胺異噁唑(sulfisoxazole)、甲氧苄啶-磺胺甲基異噁唑(trimethoprim-sulfamethoxazole)、磺醯胺基柯衣定(sulfonamidochrysoidine)、地美環素(demeclocycline)、多西環素、美他環素(metacycline)、二甲胺四環素、土黴素、四環素、氯法齊明(clofazimine)、氨苯碸(dapsone)、捲曲黴素(capreomycine)、環絲氨酸(cycloserine)、乙胺丁醇(ethambutol)、乙硫異菸胺(ethionamide)、異菸肼(isoniazid)、吡嗪醯胺(pyrazinamide)、甲哌利福黴素(rifampicin)、利福平、利福布汀(rifabutin)、利福噴丁、鏈黴素、阿斯凡納明(arsphenamine)、氯黴素(chloramphenicol)、弗斯黴素(fosmomycin)、梭鏈孢酸、甲硝噠唑、莫匹羅星(mupirocin)、平板黴素(platensimycin)、奎奴普丁/達福普汀(quinuprisitin/dalfopristin)、甲磺氯黴素(thiamphenicol)、泰格環黴素、磺甲硝咪唑(tinidazole)或三甲氧苄二氨嘧啶(trimethoprim)。

根據一些實施例，提供包括潤滑素及止痛劑或麻醉劑之醫藥製劑。舉例而言，止痛劑或麻醉劑可為利多卡因(lidocaine)、四卡因(tetracaine)、苯佐卡因(benzocaine)、丙胺卡因(prilocaine)、二丁卡因(dibucaine)、普莫卡因(pramoxine)、丙美卡因(proparacaine)、丙氧間卡因(proxymetacaine)、阿美索卡因(amethocaine)、胺苯丁酯(butamben)或奧布卡因(oxybuprocaine)。實例 1 - 「超治癒者」 MRL 小鼠中之潤滑素表現

申請人發現，具有自發性再生能力之動物(諸如MRL 「超治癒者」小鼠)通常在損傷之後展現潤滑素表現增加。此係如下使用小鼠模型測定。

在接受2 mm直徑耳朵穿孔損傷之後，使來自MRL小鼠、C57BL/6對照小鼠(未經治療)、經潤滑素治療之C57BL/6小鼠及潤滑素基因剔除小鼠之耳朵的組織樣品經受免疫組織化學染色以觀察損傷後3天組織中潤滑素之存在。如圖3中所示，綠色染色顯示潤滑素之存在，而藍色染色指示無潤滑素之常規細胞。如所預期，如僅由藍色染色之存在所證明，無潤滑素存在於潤滑素基因剔除小鼠中(左下圖)，而在MRL「超治癒者」小鼠中，如由整個影像中之密集綠色螢光所展現，潤滑素在整個樣品中為豐富的(右上圖)。在C57BL/6經潤滑素治療之小鼠中，儘管如由藍色及綠色之均勻混合物所證明，潤滑素在整個組織中為可見的(右下圖)，但潤滑素存在之程度與MRL小鼠中不相同，而在未經治療C57BL/6小鼠中，如僅由藍色染色所證明，不存在潤滑素(左上圖)。

MRL小鼠亦在減少結疤之情況下展現對損傷之再生反應。此實驗表明增加之潤滑素染色與損傷後傷口癒合增加及纖維化/結疤減少相關。

此等觀察結果表明，潤滑素在調節損傷後修復(疤痕)與再生反應關係方面起作用。實例 2 - 外源性潤滑素在小鼠中臨界 尺寸耳朵傷口中之作用

耳朵為研究再生之理想模型，此係由於其含有來自包括上皮、毛囊、腺組織及軟骨之全部三個胚層的組織。因此，為了觀察外源性潤滑素對傷口癒合之作用，使用小鼠模型。

在第0天使各小鼠經受2 mm直徑之耳朵穿孔。24隻小鼠為C57BL/6小鼠，同時12隻為潤滑素基因剔除小鼠(Prg4 ^tm1Mawa ; Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine)。在損傷時及損傷後1、2及3週以100 μg/mL之濃度向一半C57BL/6小鼠(n = 12)穿孔部位局部投與25 μL潤滑素。其他12隻C57BL/6小鼠並未接受潤滑素。對所觀察傷口尺寸之作用

在穿孔後每週一次觀測小鼠且在各影像中藉由拍攝傷口部位用已知參考標準量測傷口之尺寸。結果顯示於圖2中，該圖顯示截至損傷後四週，投與潤滑素之C57BL/6小鼠中之平均傷口直徑為大約1.0 mm (穿孔尺寸之一半)，而並未接受潤滑素之C57BL/6小鼠具有平均更接近於1.50 mm之傷口尺寸。基因剔除小鼠具有最小的傷口尺寸減小。此資料顯示潤滑素治療顯著增加傷口癒合，而基因剔除潤滑素阻斷傷口癒合。對損傷部位處血管生成及血流量之作用

為了判定潤滑素是否對損傷部位處之血管生成及血流量具有作用，在C57BL/6治療及對照小鼠以及潤滑素KO小鼠中量測耳朵損傷部位處之血流量。使用雷射斑點灌注成像(LSPI)，一種使用雷射折射斑點型態測定灌注之定量方法來獲得量測結果。影像曝光時間為15毫秒。使用常規LSPI演算法來處理高解析度影像以產生以灌注單位(PU) (此前針對此儀器定義且驗證之任意單位)所量測之定量彩色灌注圖(Forrester等人， (2002)Med Biol Eng Comput 40:687-697；Forrester等人， (2004)EEE Trans Biomed Eng 51:2074-2084)。每週一次定量血流量。如圖4中所示，損傷部位處之血流量位準在接受潤滑素之C57BL/6小鼠中顯著增加超過並未接受潤滑素之彼等小鼠及潤滑素KO小鼠，從而表明向傷口部位投與外源性潤滑素顯著增加流向受傷組織之血流量。

考慮到血流量增加之觀測結果，亦針對血管生成，亦即新血管之形成測試小鼠。在損傷後一週使用標準免疫組織化學染色來量測血管生成且自彼等影像定量陽性血管之數目。

如圖5中所示，相比於未經治療之C57BL/6小鼠，增加數目之CD31⁺ 血管佔據接受潤滑素之C57BL/6小鼠之癒合組織。基因剔除小鼠具有甚至較少的血管，從而表明潤滑素對癒合組織中之血管生成具有積極作用。

如圖19中所示，如在受到耳朵穿孔傷口損傷之小鼠中所量測在損傷後1、2、3及4週所量測，rhPRG4顯著增加流向組織損傷部位之血流量。如所示，TLR4 -/-小鼠(經載劑或rhPRG4治療)及經rhPRG4治療之C57BL/6小鼠在損傷後具有最高的血流量位準。

類似地，如在圖20中所展現，在4 mm² 耳朵穿孔損傷後1週，如藉由在受損耳朵內所量測之每mm² CD31+血管之數目所量測，在經rhPRG4治療之小鼠及Tlr4 -/- 小鼠中觀測到血管數目增加，而在Prg4 -/- 動物中觀測到較少血管。在經PRG4治療之動物以及TLR4-/-動物中觀測到損傷部位處血管生成之最高位準。對 MSC 遷移至傷口部位之作用

亦研究幹細胞在潤滑素介導之修復中的作用。為了跟蹤命運圖且表徵經標記細胞群體之反應，當小鼠在7-9週齡之間時，用4-羥基他莫昔芬(4-OHT，Sigma Aldrich )藉由在5 (五)個連續日(1 mg/天)期間腹膜內(i.p.)注射來誘發小鼠。為了在耳朵中繪製Prx1 - 譜系MSC (tdTomato^{+ ve} )命運圖，藉由組織學/螢光成像檢查樣品。

觀測到用潤滑素治療導致間葉幹細胞(MSC)遷移至組織損傷之區域。在損傷後1週內，在損傷部位處觀測到MSC之實質性增加。然而，僅在外源性潤滑素治療之情況下，此等MSC確實促進新耳朵(耳軟骨)之再生。如圖6中所示，如由不存在任何紅點(上圖)所證明，基本上未在未受損耳朵組織中觀測到MSC。然而，MSC存在於來自受損耳朵之組織中，在該等受損耳朵中傷口經作為對照(中間圖)之載劑治療且經潤滑素治療(下圖)。然而，在潤滑素治療之情況下，MSC完全重新移殖於損壞的耳朵軟骨結構，而在無潤滑素之情況下，MSC當前不呈幾乎相同的量。此資料表明，潤滑素參與將成體幹細胞(MSC)募集至組織損傷之部位以介導組織修復，且潤滑素治療將此等細胞之潛能增強至在正常傷口癒合條件下觀測到之程度以上。

潤滑素影響MSC促進傷口癒合之進一步證據顯示於圖21中之影像中。在經rhPRG4治療之MSC譜系報導體小鼠中之全厚度耳朵損傷後，Tomato陽性細胞(MSC)之命運圖顯示其主要促進軟骨及真皮再生且促進新毛囊(圖21，左側之影像)。未在經媒劑治療之野生型(C57BL/6)小鼠中觀測到此再生反應(DMSO；右手側之影像)，且有趣的係，追蹤譜系之MSC細胞引起紊亂的纖維變性疤痕(圖21；右手側之影像)。對募集免疫細胞之作用

申請人檢查在損傷之後用潤滑素治療之巨噬細胞群體及極化。為了定量存在於傷口部位內之細胞，使小鼠在初始耳朵創傷相同區域中再受2 mm徹底耳朵打孔損傷。此允許收集初次損傷沈積之組織。使用組織活細胞均質機(gentleMACS™ Dissociator)(Milteny, Bergisch Gladbach, Germany)根據製造商程序解離耳朵組織。過濾所得細胞懸浮液且再懸浮於500 μl之90% MeOH中且在室溫靜置5-10分鐘。接著離心細胞，移除液體，且添加500 μl之0.1% Tween 20以在室溫滲透細胞20分鐘。再離心細胞，移除液體，且將50 μl之Tween緩衝液及0.5 μg之抗體添加至各試管中且在室溫在暗處培育30-45分鐘。接著用FACs緩衝液洗細胞三次，接著再懸浮於FACs緩衝液中。接著使用FACs測徑規來量測細胞。使用FlowJo軟體分析結果。

如圖11中之流動式細胞測量術分析所示，相比於對照及潤滑素KO小鼠，在潤滑素治療後之受損耳朵中觀測到CD14⁺ 巨噬細胞與Gr1嗜中性白血球兩者之募集增加。事實上，相比於未經治療C67BL/6小鼠及潤滑素KO小鼠，在經潤滑素治療之C57BL/6小鼠之損傷部位內發現大約兩倍免疫細胞，證明外源性潤滑素施加至傷口部位導致該部位之巨噬細胞及嗜中性白血球的存在增加。可能的作用機制

本文中之資料證明，潤滑素治療可藉由以下增強耳朵內臨界尺寸缺陷的內源性修復：1)抑制纖維變性反應，2)增加血管生成及流向損傷之血流，3)調節發炎反應(例如巨噬細胞極化)及4)募集免疫細胞及成體幹細胞(MSCs)以介導組織再生。本文中所提供之證據顯示缺乏PRG4嚴重損害正常癒合(如由Prg4 -/- KO小鼠證明)，且表明潤滑素經至少三種路徑作用來促進再生反應以調節傷口癒合，一種作用於損傷部位之血管生成量及血流量調節(NFĸB/HIF1α/VEGF)，一種調節纖維變性反應(PAI-1)，及最後一種調節巨噬細胞之極化為M1或M2表型(TLR4)。本文中所提供之證據表明此等多效性作用可特別歸因於潤滑素，因為該等作用不發生於潤滑素缺乏(KO)之小鼠中。此等活體外及活體內初步結果表明，潤滑素抑制修復反應(結疤)，但在損傷之後藉由調節以下傷口癒合之各守恆階段的態樣來增強再生反應(癒合)：凝血、發炎、組織產生及組織重塑。

結果表明，潤滑素與單核球/巨噬細胞上之TLR4相互作用以調節此等免疫細胞之促發炎(M1)相對於消炎(M2)極化。同時，潤滑素亦結合至PAI-1以調節纖維變性反應。潤滑素相應地調節NFĸB信號傳導，其繼而上調HIF1α及VEGF表現以提高傷口區域內之血流量及血管生成。吾人亦已研究幹細胞在潤滑素介導之修復中的作用且發現傷口區域內之常駐組織的MSC在損傷之後立即表現高位準之潤滑素與PAI-1兩者。潤滑素 - PAI - 1 相互作用

纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑-1 (PAI-1)為絲胺酸蛋白酶抑制劑(絲胺酸蛋白酶抑因子)基因家族之成員及絲胺酸蛋白酶uPA及tPA之抑制劑(Ghosh等人 ， J Cell Physiol. 2012, 227(2):493-507)。對uPA/tPA之抑制導致對纖維蛋白溶酶原轉換為纖維蛋白溶酶以及纖維蛋白溶酶依賴性MMP活化之抑制。在正常傷口癒合中，PAI-1可由TGF-β上調且接著結合至uPA及tPA且使之失活 (Botta等人， J Cell Sci. 2012, 125(Pt 18):4241-52)。此抑制MMP之活化及組織重塑(凝塊穩定性)。此導致傷口區域處之纖維蛋白增加及由周圍細胞產生膠原蛋白1的相應增加，從而產生纖維變性斑塊(疤痕形成) (Castro等人， J. Biol Chem., 2014, 289(42):29001-13)。

通常(除在心臟中之外)，缺乏PAI-1之動物在損傷之後展現傷口癒合增加，伴以纖維化減少，(Chan等人 ， Am J Pathol., 2001, 159(5):1681-8；Ghosh等人 ， PLoS One, 2013, 8(5):e63825)，其與吾人之假設及基本資料一致。然而，完全缺乏PAI-1可由於血凝塊形成/穩定性不良而導致實質性失血且可能導致死亡(Iwaki等人， J Thromb Haemost., 2011, 9(6):1200-6)。

如圖7中所展現之本文中所提供之資料顯示，潤滑素直接結合至PAI-1。使用Biacore X100 SPR儀器(GE Healthcare, Pittsburg PA)來評定潤滑素與PAI-1之結合。使用標準胺耦合之化學物質來使人類PAI-1 (R&D Systems, Minneapolis, MN)固定至CM5感測器晶片(GE Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom)之流量槽2上，從而產生300-500個反應單位(RU)。參考細胞(流量槽1)係藉由活化及去活化製備。結合分析係在補充有0.01% (v/v) Tween 20之PBS操作緩衝液中執行。將潤滑素溶液緩衝交換成操作緩衝液且至少5個在0.576 - 420 µg/mL範圍內之濃度係在25℃下以30 µL/min之流動速率注入，接觸時間1 min。在監測解離1.5 min之後藉由注入1 M NaCl來自晶片表面移除所結合之潤滑素。吾人確定，潤滑素能夠以2.712 × 10^{- 6} 之結合常數(K_d )直接結合至PAI-1，該結合常數指示兩個分子之間的較強親和力。

PAI-1與潤滑素之間的相互作用很可能係由潤滑素之N端促生長因子B (SMB)結構域所致，該N端促生長因子B (SMB)結構域幾乎與玻璃連結蛋白(VTN；PAI-1之已知配位體)內之SMB結構域相同(Arroyo De Prada等人 ， Eur J Biochem. 2002, 269:184)。已知VTN在調節PAI-1活性及穩定性方面起關鍵作用(Jang等人 ， Surgery, 2000, 127(696)；Zhou等人 ， Nat Struct Biol, 2003, 10:541)。資料表明PAI-1之潤滑素結合充當PAI-1信號傳導之競爭性抑制劑，將其活性抑制到觀測到傷口癒合增加及纖維化減少之點，而非至抑制凝塊形成且觀測到慢性失血之程度。

此外，如圖17中所示，相比於C57BL/6小鼠(經DMSO治療)，Pai - 1 ^-/- 小鼠(經DMSO治療)及C57BL/6小鼠(經rhPRG4治療)中之耳朵損傷證明顯著較少的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA，纖維變性標記)表現。圖17中之影像係在損傷後四週在小鼠中之耳朵穿孔傷口模型中攝取。C57BL/6小鼠顯示穩固的αSNA染色(白色)，而在C57BL/6經rhPRG4治療及PAI-1-/-小鼠中觀測到αSMA染色減少。潤滑素 -NFĸB/HIF1α/VEGF

本文中所提供之資料表明，潤滑素經由VEGF之活化經由可能在NFĸB之上游及/或下游的HIF1α依賴性路徑調節血管生成(Fitzpatrick等人 ， J Immunol. 2011, 186(2):1091-6)。血管內皮生長因子(VEGF)為血管內皮細胞之高度特異性有絲分裂原：甚至缺乏兩個VEGF等位基因中之一者的動物因為心臟血管系統發育之缺陷在出生前死亡(Haiko等人 ， Mol Cell Biol. 2008 28(15):4843-50)。低氧誘發之VEGF產生刺激血管生成，在發育期間伴隨器官形成。因此，HIF1α (低氧誘導因子)在文獻中作為VEGF之強力活化劑而熟知，通常在低氧之領域中(van Tuyl等人， Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2005 288(1):L167-78；Arany等人 ， Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 93(23):12969-73)。

如由圖8A-E中之資料所示，潤滑素在多種細胞類型中及活體內上調HIF1a及VEGF。為了在活體外展現此作用，使來自正常及骨關節炎(OA)人類關節之滑液纖維母細胞曝露於潤滑素(100 μg/mL；2 mL)(圖8A-B)，且在24小時之後進行量測。在正常及OA細胞中，外源性潤滑素之投與顯著上調HIF1a (圖8A)及VEGF (圖8B) mRNA之表現。此觀測結果在HEK293細胞中得以驗證，其中觀測到HIF1a與VEGF mRNA兩者皆在潤滑素治療(100 μg/mL；2 mL)之後24小時上調(圖8C)。

如圖8D中所示，ELISA用於驗證曝露於PBS載劑(對照)或潤滑素(100 μg/mL；2mL)之正常滑液細胞、骨關節炎滑液細胞及HEK293細胞中之VEGF蛋白質之位準。在各類型之細胞中，潤滑素之存在將VEGF之位準顯著上調超過對照。

圖8E中之資料進一步展現外源投與之潤滑素對增加VEGF蛋白質位準之活體內作用。在此實驗中，5隻史泊格多利大鼠經由尾部靜脈注射注入有潤滑素(200 μg/kg)；且在第0、14、20及24天使用ELISA來檢定血清中之VEGF位準。如圖8E中所示，相比於並未接受潤滑素之大鼠中之VEGF位準(其展現VEGF表現之穩定位準)，VEGF在潤滑素注射之後14-24天顯著地全身性上調。

此外，此潤滑素-VEGF路徑為HIF1α依賴性的，此係由於經HIF1α抑制劑治療之細胞在潤滑素治療之後不展現VEGF表現的增加。

此外，吾人自經rhPRG4治療或未經rhPRG4治療之耳朵傷口分離巨噬細胞(F4/80⁺ )及間葉幹細胞(MSC)。如圖15中所示，吾人觀測到，rhPRG4顯著增加巨噬細胞而非MSC中之血管內皮生長因子(Vegf )表現，且亦顯著減少巨噬細胞及MSC中之Tgf β表現。此等結果亦展現Prg4 表現在損傷後MSC中上調，且外源性rhPRG4抑制內源性Prg4 之表現(負反饋)。此外，儘管眾所周知TGF β 上調Prg4 (Schmidt等人， Osteoarthr . Cartil. 2008,16 , 90；Jones等人， Eur. Cell. Mater, 2007, 13;40)，吾人目前顯示在rhPRG4與Tgf β 表現之間存在負反饋迴路。

此前已顯示，Tlr4 ^-/- 巨噬細胞具有M2極化偏向(Orr等人 ， Diabetes 2012, 61:2718)，且吾人發現經rhPRG4治療之C57BL/6巨噬細胞亦展現M2偏向(圖16A-B)。由於VEGF之增加與巨噬細胞之消炎(M2)極化相關聯(Lai等人， J. Cell. Mol. Med., 2018, 23:14027；Wheeler等人 PLoS One 2018, 13: e0191040)，吾人自C57BL/6及Tlr4 ^-/- 小鼠分離骨髓單核球且使其朝向M2表型極化。

自小鼠分離單核球且使其分化成巨噬細胞(M0)；接著使其極化成具有LPS (M1)之促發炎性巨噬細胞或具有IL-4 (M2)之消炎巨噬細胞。提供於圖16A-B中之結果顯示，C57BL/6單核球衍生之巨噬細胞在rhPRG4存在下顯示M1極化減弱及M2極化增強。來自Prg4 ^-/- 小鼠之巨噬細胞展現M1極化增強及M2極化減弱，其可藉由rhPRG4治療拯救且顯示PRG4或PRG4之缺乏調節巨噬細胞之極化。此等作用似乎為TLR4依賴性的，此係由於Tlr4 ^-/- 巨噬細胞展現M1極化減弱及M2極化增強，其不由rhPRG4治療改變。此外，用rhPRG4治療Tlr4 ^-/- 巨噬細胞不具有累加作用，表明rhPRG4調節極化之能力為TLR4依賴性的。

此外，如圖18A-B中所示，吾人已確定rhPRG4治療亦上調NFκB活性。自未受損小鼠分離巨噬細胞及MSC且經由tdTomato報導載體監測NFκB活化。圖18A-B中呈現之資料顯示rhPRG4治療上調來自未受損小鼠之巨噬細胞及MSC中之NFκB表現。此似乎獨立於TLR4出現，此係由於在TLR4-/-小鼠與C57BL/6小鼠之間觀測到同一反應。吾人此前已顯示，rhPRG4活體外與活體內(Iqbal等人， 2016,Sci Rep ., 6: 18910)且經由使用NFκB報導體調節NFκB信號傳導，如圖18A-B中所示，吾人已展現rhPRG4治療後之NFκB及Hiflα 及Vegf 之併發活化。然而，僅巨噬細胞而非MSC顯示Hiflα 及VegF 表現增加，從而表明在曝露於PRG4後的促血管生成反應係由巨噬細胞而非MSC驅動。

圖18A-B亦表明rhPRG4經由HIF1α之VEGF的活化調節血管生成。此可能發生在NFĸB下游(Fitzpatrick,等人 ， J. Immunol., 2011, 186:1091)。低氧誘發之VEGF產生刺激血管生成，伴隨在發育期間器官形成。因此，HIF1α (低氧誘導因子)在文獻中作為VEGF之強力活化劑而熟知，通常在低氧之領域中(Van Tuyl等人， Am . J . Physiol . Lung Cell . Mol . Physiol . 2005, 288:L167)。圖18A-B中之活體外資料及圖15中之離體資料顯示用rhPRG4治療巨噬細胞在mRNA位準上增加Vegf 。潤滑素 -TLR4 相互作用

TLR為由參與先天免疫系統之巨噬細胞主要表現之重要類別的型態識別受體。一旦TLR活化，引發先天免疫細胞反應(Parker等人， Clin Exp Immunol. 2007;147:199-207, Zhang等人， Cell Mol Life Sci. 2006;63:2901-7)。 TLR識別已知為病原體相關聯微生物型態(PAMP)之高度保守性基元，其由病原體或自壞死或死亡細胞釋放之危險相關聯分子型態(DAMP/Alarmin)表現(Rickard等人， Cell. 2014;157:1175-88)。TLR4為正常傷口癒合所需(Suga等人， J Dermatol Sci. 2014 73(2):117-24；Dasu等人， J Diabetes Complications. 2013 27(5):417-21)且為M1 相對於M2極化所需，此係由於不含TLR4之小鼠顯示對M2 (或消炎)表型之偏向(Orr等人， Diabetes. 2012 61(11):2718-27)。

吾人檢查了缺乏潤滑素之小鼠中之巨噬細胞極化。如圖9中所示，缺乏潤滑素之(KO)小鼠之巨噬細胞顯示M1 (促發炎)極化偏向且比野生型對照小鼠產生顯著更多的IL-1、IL-6及TNFα。換言之，潤滑素基因剔除小鼠中之巨噬細胞之極化相比於野生型對照導致促發炎因子增加。鑒於TLR4基因剔除動物之巨噬細胞展現M2偏向(Gupta等人， Biochem Biophys Res Commun. 2016 477(3):503-8)，此表明潤滑素之存在至少部分使TLR4失活，而在不存在潤滑素之情況下，TLR4活化導致巨噬細胞之促發炎極化。

此外，在圖16A-B中所顯示之資料中，吾人確定用PRG4治療巨噬細胞抑制M1且增強M2極化且為TLR-4依賴性的。圖16A-B顯示Prg4 ^-/- 小鼠中之巨噬細胞極化顯示M1 (促發炎)極化偏向，而經rhPRG4治療之C57BL/6巨噬細胞展現M2偏向。PAI-1-VEGF-TLR4 信號傳導

PAI-1、VEGF及TLR4信號傳導路徑在多個位準上彼此相互作用(Siegel-Axel等人 ， Diabetologia. 2014 57(5):1057-66；Wu等人 ， Am J Pathol. 2014 184(6):1900-10；Biernaskie等人 ， Cell Stem Cell. 2009 5(6):610-23)，吾人之資料表明此等路徑中之每一者在活體外為獨立的。如圖10中所示，潤滑素治療之後的VEGF轉錄之增加為TLR4獨立的，此係由於TLR4基因剔除細胞在潤滑素治療之後仍表現VEGF。另外，如圖10中所展現，當用重組PAI-1治療潤滑素基因剔除細胞時，未觀測到VEGF增加，表明潤滑素治療之後的VEGF上調獨立於PAI-1。PRG4 介導之再生反應經由 TLR4 及 PAI - 1 起作用

圖14A-D中所描述之資料明確展現rhPRG4在局部施加時增強傷口癒合，且不存在Prg4 嚴重損害正常癒合(圖14A)。來自本文中所描述之小鼠耳朵傷口模型的結果表明此PRG4介導之再生反應正經由TLR4及纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑-1 (PAI-1)起作用。具體言之，Tlr4 ^-/- 及Pai - 1 ^-/- 小鼠呈現經改善之耳朵傷口癒合(相對於C57BL/6)，且rhPRG4之外源性遞送在兩種此等菌株中皆進一步增強此作用(圖14C-D)。此外，Tlr4 ^-/- Pai - 1 ^-/- 雙重基因剔除展現與經rhPRG4治療之C57BL/6小鼠相同的再生反應。然而，將rhPRG4添加至Tlr4 ^-/- Pai - 1 ^-/- 小鼠中對耳朵傷口癒合不具有累加作用。(圖14D)。此表明TLR4及PAI-1信號傳導為耳朵傷口癒合之負調節因子且C57BL/6小鼠中之rhPRG4治療抑制此等信號傳導路徑以提高再生潛能。實例 4 ：治療人類患者中之傷口 糖尿病性潰瘍

人類患者在數根腳趾上呈現糖尿病性潰瘍。檢查且清潔各潰瘍。將含有100 μg/mL之量的重組人類潤滑素的溶液以無菌磷酸鹽緩衝鹽水中之一系列液滴形式施加至各潰瘍。每平方公分之潰瘍組織施加80 μg之潤滑素。一旦溶液乾燥，將適當繃帶置放於各潰瘍上。每週重複該治療持續四週。在治療完成之後，潰瘍已癒合且組織已再生。在之前受損之部位處不存在可辨的疤痕組織。表皮擦傷

人類患者呈現擦傷，其通常已知為騎車事故之後的臂、腿及胃上方之「路疹(road rash)」。清潔傷口且將包含重組人類潤滑素之無菌凝膠局部施加至擦傷的皮膚且以適當繃帶覆蓋。每平方公分之受傷組織施加至少80 μg之潤滑素。每週重複治療持續四週，且在再施加之時，僅將潤滑素軟膏施加至尚未癒合之組織的剩餘區域。因此，每一週，較少組織需要施加潤滑素軟膏。當路疹最終癒合時，不存在可見結疤。割傷或裂傷

人類患者在右手之食指上呈現3 cm裂傷。清潔裂傷且將含有重組人類潤滑素之軟膏施加至裂傷，隨後用數根縫合線縫合裂傷。施加繃帶。每天將含有潤滑素之軟膏以每cm損傷長度約80 μg之量再次施加至受影響區域。在一週之後移除縫線。將潤滑素軟膏每日施加至傷口持續再一週，直到縫合痕跡已消失為止。未在裂傷之部位處觀測到疤痕形成。眼部損傷

在接受屈光性角膜切除術之後，人類患者在一隻眼睛中罹患角膜混濁。向患者開處含有PRG4之滴眼劑。該患者每天4次向眼睛之結膜囊施加2滴0.05 mL 100 μg/mL PRG4之液滴，藉由快速眨眼來將PRG4施加至角膜表面。在一週之後，角膜混濁已清除且患者之視覺不再混濁。

本專利或申請案檔案含有至少一個彩製圖式。在申請且支付必要費用後，專利局將提供具有彩色圖式之本專利或專利申請公開案之複本。

圖1為顯示潤滑素調節傷口癒合之所提議機制之示意圖。

圖2為顯示如自初始損傷時間開始之數週時程內所量測在C57BL/6小鼠(初始2 mm直徑穿孔)之耳中之傷口的直徑(mm)之線圖。其顯示潤滑素治療顯著增加傷口癒合，而基因剔除潤滑素阻斷傷口癒合(n = 12/組)。

圖3包括來自小鼠耳朵之組織之免疫組織化學染色的四張像片。綠色染色顯示潤滑素之存在，而藍色染色顯示存在不表現潤滑素之細胞。如所示，在潤滑素基因剔除小鼠中，如僅由藍色染色之存在所表示，不存在潤滑素(左下圖)，而在MRL「超治癒者」小鼠中，如僅由遍及組織之綠色染色所表示，潤滑素在整個樣品中為豐富的(右上圖)。在C57BL/6經潤滑素治療之小鼠中，如由綠色染色所表示，潤滑素可見於整個組織中(右下圖)，但遍及程度與MRL小鼠中不同，而在未經治療C57BL/6小鼠中，如由僅具有少數微小的綠色斑點之遍及之藍色染色所表示，不存在潤滑素(左上圖)。因此，圖3顯示在自發性超治癒者(例如MRL小鼠)中在損傷之後潤滑素染色增加，且潤滑素染色在損傷之後與癒合增加及纖維化/結疤減少相關。

圖4為顯示如自初始損傷時間開始之數週時程內所量測在小鼠耳中穿孔損傷之部位處灌注單位(PU)之血流量的線圖且顯示潤滑素治療顯著增加損傷部位處之血流量(n = 12/組)。

圖5為顯示如由圍繞損傷部位之癒合組織中之CD31+血管數目所展現的罹患穿孔損傷之小鼠耳朵中之血管生成位準的線圖。在耳朵損傷之後，在經潤滑素治療之動物中觀測到血管數目增加，而在潤滑素KO動物中觀測到較少血管(n = 12)。

圖6為用DAPI或4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚免疫組織化學染色小鼠耳朵組織之一系列影像，其中組織尚未受損(上圖，A)、組織已受損且投與載劑(中間圖，B)及組織已受損且投與PRG4 (下圖，C)。紅色指示間葉幹細胞(MSC)之存在，其中如由遍及影像之紅點所指示，無一者存在於未受損組織中，少數存在於單獨投與載劑之受損組織中且許多存在於投與潤滑素之受損組織中。圖6顯示MSC遷移至損傷區域且回應於潤滑素。在耳朵中，未在未受損組織中觀測到大量MSC(紅色)，但可在損傷之後觀測到。在潤滑素治療之情況下，MSC完全重新填充損壞的耳朵軟骨結構(n = 5/組)。

圖7為展現如藉由表面電漿子共振所量測之如在共振單元(RU)中所量測之PAI-1 (纖維蛋白溶酶原活化劑抑制劑-1)潤滑素結合親和力對濃度的線圖。潤滑素能夠直接結合PAI-1且結合常數為2.712 × 10^{- 6} M，指示兩個生物分子之間的較強結合。

圖8A-E為顯示潤滑素如何在多種細胞類型中且在活體內上調HIF1a及VEGF之圖表。將來自正常及骨關節炎(OA)人類關節之滑液纖維母細胞曝露於潤滑素(100 μg/mL)(圖8A及圖8B)。在正常及OA細胞中，潤滑素顯著上調HIF1a及VEGF mRNA之表現。此觀測結果驗證於HEK293細胞中，其中觀測到在潤滑素治療之後HIF1a與VEGF mRNA兩者皆上調(圖8C)。在圖8A-C之條形圖中，潤滑素治療顯示為左側上之條柱(頂部有^* )且PBS對照為右側上之條柱，且在圖8A-C中之每一者中，潤滑素條柱高於PBS條柱。ELISA用以驗證VEGF之位準(圖8D)。在圖8D中，自左至右，兩個最左側條柱表示在經PBS (左)或潤滑素(右)治療之正常滑液細胞中以pg/mL為單位的蛋白質濃度，中間兩個條柱表示在經PBS (左)或潤滑素(右)治療之骨關節炎滑液細胞中以pg/mL為單位的蛋白質濃度且最右側條柱表示在經PBS (左)或潤滑素(右)治療之HEK293細胞中以pg/mL為單位的蛋白質濃度。圖8E顯示在注射有潤滑素之大鼠中，在潤滑素注射之後14-28天VEGF全身性地上調。具有條形圖(在第14天、第20天及第24天具有^* 之點)的頂部線表示經潤滑素治療之大鼠中之VEGF位準，而較低線表示未經治療大鼠中之VEGF位準。

圖9為顯示自C57BL/6對潤滑素基因剔除小鼠(KO)中之巨噬細胞分泌之IL-1、IL-6及TNFα位準的條形圖。 (*指示p ＜ 0.05之顯著性)。相比於野生型對照，潤滑素KO巨噬細胞之極化導致促發炎因子之增加(n = 4)。

圖10為顯示TLR4基因剔除細胞、投與潤滑素之TLR4基因剔除細胞、潤滑素基因剔除細胞及投與PAI-1之潤滑素基因剔除細胞中的HIF1a及VEGF位準之條形圖。基因表現之位準經正規化為核糖體次單元18s。潤滑素治療之後的HIF1α及VEGF上調與TLR4及PAI-1無關(n = 5)。

圖11為顯示在耳朵損傷之後一週在C57BL/6小鼠、投與潤滑素之C57BL/6小鼠中且在潤滑素基因剔除(KO)小鼠中損傷部位處存在CD14+巨噬細胞及GR1+嗜中性白血球的流動式細胞測量資料。如資料顯示，在損傷之後，相比於C57BL/6及潤滑素KO小鼠，在經潤滑素治療之損傷部位內可見兩倍嗜中性白血球及巨噬細胞。(n = 6/組，其中3隻雄性及3隻雌性)。

圖12為全長(未截斷)人類PRG4 (SEQ ID NO:1:1404殘基)之胺基酸序列。殘基1-24 (以粗體顯示)表示信號序列且殘基25-1404表示人類PRG4之成熟序列。 糖蛋白不需要呈其活性形式之信號序列。

圖13A-C提供編碼全長1404 AA人類PRG4蛋白質之PRG4基因(SEQ ID NO:2)的核酸序列。

圖14A為在損傷之後4週C57BL/6小鼠中及PRG4基因剔除小鼠中耳朵穿孔傷口之像片。原始損傷為4 mm² 穿孔。左耳經作為對照之載劑(DMSO)治療，而右耳經rhPRG4治療。相比於未經治療耳朵，經PRG4治療之耳朵中之穿孔傷口已顯著閉合。

圖14B為如所指示受到耳朵穿孔損傷且經DMSO或rhPRG4治療之C57BL/6小鼠及PRG4 -/-小鼠的以mm² 為單位之傷口面積對以週為單位之損傷後時間的線圖。虛線表示PRG4治療。N = 12/組，其中6隻雄性及6隻雌性。原始損傷為4 mm² 穿孔。

圖14C-D為如所指示受到耳朵穿孔損傷且經DMSO或rhPRG4治療之C57BL/6小鼠、PAI -/-小鼠、TLR4 -/-小鼠及PAI -/- TLR4 -/-小鼠的以mm² 為單位之傷口面積對以週為單位之損傷後時間的線圖。N = 12/組，其中6隻雄性及6隻雌性。原始損傷為4 mm² 穿孔。

圖15為顯示在自從因耳朵穿孔而損傷之給定日子巨噬細胞(F4/80+；左側)及間葉幹細胞(MSC；右側)中VEGF (頂部)、TGFβ (中間)及PRG4 (底部)之相對表現的一系列條形圖。 (n = 3/時間點)。

圖16A-B包括顯示在C57BL/6小鼠、PRG4 -/-基因剔除小鼠及TLR4 -/-中存在CD38+巨噬細胞(M1)及CD206+巨噬細胞(M2)的流動式細胞測量資料以及在各種治療組中顯示CD38+細胞之百分比的條形圖。

圖17顯示在損傷後4週用αSMA (白色)免疫組織化學染色之小鼠耳朵組織之一系列影像。白線描繪原始傷口部位。 (n = 6/組，其中3隻雄性及3隻雌性)。

圖18A-B包括顯示取自如所指示之未受損C57BL/6小鼠及經rhPRG4或DMSO治療之TLR4 -/-的巨噬細胞(F4/80+)及MSC (Sca1+CA140a+)之存在的流動式細胞測量資料以及在如所示之各種治療組中顯示相對NFκB表現或相對基因表現的條形圖。(n = 6/組，其中3隻雄性及3隻雌性)。

圖19為顯示在自損傷開始數週之時段內所量測之小鼠耳朵中損傷部位處的血流量相對於損傷之前的未受損血流量位準的線圖。rhPRG4治療顯著增加損傷部位處之血流量。(n = 6/組，其中3隻雄性及3隻雌性)。原始損傷為4 mm² 穿孔。

圖20為在如所示之各種治療組中在損傷之後一週受損小鼠耳朵內每mm² CD31+血管之數目的散佈圖。 (n = 6/組，其中3隻雄性及3隻雌性)。原始損傷為4 mm² 穿孔。

圖21為用DAPI或4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚免疫組織化學染色小鼠耳朵組織之一系列影像。在頂部圖中，藍色染色普遍存在於整個組織樣本中，指示細胞核，且存在紅色染色，亦存在於整個影像中，指示MSC。在左下圖(經PRG4治療)中發現此等MSC促成新組織(#1皮膚、#2軟骨及#3毛囊) ，而在右圖上之經DMSO治療之小鼠中，MSC促成纖維變性類組織(#4)。

Claims (49)

1. 一種促進組織再生或傷口癒合但減少疤痕形成之方法，其包含向有需要之患者之傷口或組織損傷部位投與包含潤滑素之醫藥製劑。
2. 如請求項1之方法，其中該潤滑素為重組人類潤滑素。
3. 如請求項1至2中任一項之方法，其中該潤滑素具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1之殘基25-1404之胺基酸序列。
4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該潤滑素與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1之殘基25-1404之序列具有至少95%胺基酸序列一致性。
5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該傷口或組織損傷在眼睛中。
6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該傷口或組織損傷在角膜中。
7. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該傷口存在於皮膚之表皮、真皮及/或下皮層中。
8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該傷口為皮膚之割傷、刺傷、裂傷、撕裂傷、刮傷或擦傷，或手術切口。
9. 如請求項1至4或7中任一項之方法，其中該傷口為瘀傷。
10. 如請求項1至4或7中任一項之方法，其中該傷口為燒傷。
11. 如請求項1至4或7中任一項之方法，其中該傷口為皮膚潰瘍。
12. 如請求項11之方法，其中該潰瘍為褥瘡(壓迫性潰瘍(pressure ulcer))、糖尿病性潰瘍，或由細菌感染引起之潰瘍。
13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該傷口為在非關節、非骨質(non-osseous)及非骨骼(non-osteal)之部位，且該傷口不在骨、關節、關節軟骨、肌腱或韌帶中。
14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該潤滑素係以1 μg/mL至1 mg/ mL之濃度提供。
15. 如請求項14之方法，其中該潤滑素係以100 μg/mL之濃度提供。
16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該潤滑素係以每cm² 之傷口面積10 μg至150 μg之量提供。
17. 如請求項16之方法，其中該潤滑素係以每cm² 之傷口面積75 μg至100 μg之量提供。
18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該醫藥製劑係以溶液、懸浮液、乳液、洗劑(lotion)、乳膏、凝膠、糊劑或軟膏投與。
19. 如請求項18之方法，其中該醫藥製劑經局部施加至傷口。
20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該醫藥製劑係以施加至傷口之傷口敷料的浸漬物投與。
21. 如請求項1至20中任一項之方法，其中該醫藥製劑進一步包含抗生素或消炎劑或止痛劑，或與抗生素、消炎劑或止痛劑一起投與。
22. 如請求項21之方法，其中該止痛劑為利多卡因(lidocaine)或苯佐卡因(benzocaine)。
23. 如請求項22之方法，其中該抗生素為新黴素、多黏菌素 b (polymyxin b)、枯草菌素(bacitracin)、紅黴素、瑞他帕林(retapamulin)、乙醯磺胺鈉(sulfacetamide sodium)、莫匹羅星(mupirocin)、普莫卡因(pramoxine)、磺胺嘧啶銀(silver sulfadiazine)、磺胺米隆(mafenide)或奧擇沙星(ozenoaxacin)。
24. 如請求項1至23中任一項之方法，其包含將該醫藥製劑以液滴或藉由注射於傷口部位投與。
25. 如請求項1至24中任一項之方法，其中該醫藥製劑不包括玻尿酸。
26. 一種用於促進組織再生或傷口癒合但減少疤痕形成之醫藥組合物，其包含潤滑素。
27. 一種在有需要之患者體內的部位誘發血管生成之方法，其包含向該部位投與足以誘發新血管形成之量之包含潤滑素之醫藥製劑。
28. 如請求項27之方法，其中該潤滑素為重組人類潤滑素。
29. 如請求項27至28中任一項之方法，其中該潤滑素具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1之殘基25-1404之胺基酸序列。
30. 如請求項27至29中任一項之方法，其中該潤滑素與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1之殘基25-1404之序列具有至少95%胺基酸序列一致性。
31. 如請求項27至30中任一項之方法，其中該潤滑素係以1 μg/mL至1 mg/mL之濃度提供。
32. 如請求項31之方法，其中該潤滑素係以100 μg/mL之濃度提供。
33. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該潤滑素係以每cm² 該部位之面積10 μg至150 μg之量提供。
34. 如請求項27至32中任一項之方法，其中該潤滑素係以每cm² 該部位之面積75 μg至100 μg之量提供。
35. 如請求項27至34中任一項之方法，其中該潤滑素經局部投與該部位。
36. 如請求項27至34中任一項之方法，其中該潤滑素係藉由注射投與該部位。
37. 如請求項27至36中任一項之方法，其中該醫藥製劑不包括玻尿酸。
38. 如請求項27至37中任一項之方法，其中該體內之部位為皮膚或不包括角膜之眼睛。
39. 如請求項27至38中任一項之方法，其中該體內之部位為非關節、非骨質及非骨骼部位，且該部位不在骨、關節或關節軟骨中。
40. 一種用於促進血管生成之醫藥組合物，其包含潤滑素。
41. 如請求項26或40之醫藥組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
42. 一種治療或預防眼睛中異常傷口癒合之方法，其包含向罹患異常傷口癒合或處於異常傷口癒合風險之眼睛投與潤滑素。
43. 如請求項42之方法，其中該異常傷口癒合為角膜結疤。
44. 如請求項42之方法，其中該異常傷口癒合為角膜混濁(haze)。
45. 如請求項42至44中任一項之方法，其中該潤滑素係以1 μg/mL至1 mg/mL之濃度提供。
46. 如請求項42至45中任一項之方法，其中該潤滑素係以基於該傷口之尺寸每cm² 10 μg至150 μg之量提供。
47. 如請求項42至46中任一項之方法，其中該潤滑素與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1之殘基25-1404之序列具有至少95%胺基酸序列一致性。
48. 如請求項42至47中任一項之方法，其中該潤滑素係以液滴或軟膏經眼投與。
49. 如請求項42至48中任一項之方法，其中該潤滑素係在完成角膜形成術(keratinoplasty)、屈光性角膜切除術(photorefractive kertectomy)、雷射上皮下角膜重塑術(keratomileusis)或雷射原位角膜重塑術時投與眼睛。

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