JP6758299B2

JP6758299B2 - 抗炎症剤としてのｐｒｇ４の使用

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Publication number: JP6758299B2
Application number: JP2017535349A
Authority: JP
Inventors: ジェイ，グレゴリー，ディー．; サリヴァン，ベンジャミン，ディー．; シュミット，タンニン，エイヴリー; エルサイード，ハレド; トゥルイット，エドワード，アール．; クラウェッツ，ローマン; スズマイディンガー−チョドブスカ，ジョアンナ; チョドブスキー，アダム; ファリード，ジョード
Original assignee: ルブリス，エルエルシー．; ロードアイランドホスピタル
Priority date: 2015-01-26
Filing date: 2016-01-26
Publication date: 2020-09-23
Anticipated expiration: 2036-01-26
Also published as: EA036291B1; CL2017001893A1; SG10201809947UA; ES2808199T3; ZA201705378B; US10967048B2; HK1247834A1; TN2017000270A1; EP3250221A1; WO2016123123A1; CA2972817A1; SG11201705636SA; IL253596B; AU2022200812A1; AU2016211694A1; JP2020189878A; CN107847556B; AU2016211694B2; BR112017015310A2; BR112017015310A8

Description

関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれている、２０１５年１月２６日に出願された米国特許仮出願第６２／１０７，７９９号および２０１５年１２月３０日に出願された米国特許仮出願第６２／２７３，０５９号の出願日の恩典を主張する。

[0002] 本発明は、ヒト糖タンパク質ＰＲＧ４またはルブリシンの新規使用に関する。より詳しくは、本発明は、炎症応答を低減または阻害するための、および炎症状態を処置するための、抗炎症剤としてのＰＲＧ４の使用に関する。

[0003] プロテオグリカン４遺伝子（PRG4）は、巨核球刺激因子（MSF）ならびにルブリシンとしても公知である「潤滑機能蛋白（Ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌｚｏｎｅｐｒｏｔｅｉｎ）」の高度グリコシル化された選択的スプライス変種および糖型をコードする。潤滑機能蛋白（Ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌｚｏｎｅｐｒｏｔｅｉｎ）は、最表層の軟骨外植片の表面で最初に位置特定され、条件培地中で同定された。ルブリシンは、滑液から初めて単離されて、ｉｎｖｉｔｒｏの軟骨−ガラス界面およびラテックス−ガラス界面で滑液と類似の潤滑能を有することが証明された。ルブリシンは後に、滑膜線維芽細胞の産物として同定され、その潤滑能が、エキソン６によってコードされるアミノ酸９４０個の大きいムチン様ドメイン内のＯ−結合β（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃオリゴ糖に依存することが発見された。ルブリシン分子は多様にグリコシル化されて、いくつかの天然起源のスプライス変種が報告されている。それらは本明細書において総称してＰＲＧ４と称される。ＰＲＧ４は、体内で、滑膜、腱、半月板などの関節軟骨の表面に、および他の部位の中で、眼の保護膜に存在することが示されており、関節の潤滑および滑膜の恒常性において重要な役割を有する。

[0004] 本出願者らの本発明の前では、ＰＲＧ４は、関節、腱、軟骨を潤滑すること、および細胞間相互作用を阻害するための力学的障壁として作用すること、などの力学的機能を提供する、単なる力学的特性を有するタンパク質であると認識されていた。しかし、本明細書において示されるように、本出願人は、ルブリシンが、境界潤滑および抗接着を提供するその能力を超える特性を有することを発見した。特に、本出願人は、ＰＲＧ４が、リガンド受容体相互作用に関与して、例えばＣＤ４４活性化、ＮＦ−κＢ移行、およびサイトカイン媒介性炎症をモジュレートする、というリガンドまたはシグナル伝達分子として作用するその能力により抗炎症特性を有することを決定した。

[0005] 本発明は、ルブリシンとしても公知であるＰＲＧ４のこれまで未知であった抗炎症特性を利用する。したがって、本発明は、例えば炎症応答を阻害または低減する方法、および炎症状態を処置する方法を提供する。ＰＲＧ４の抗炎症特性の発見の根底にあるのは、ＰＲＧ４がその抗炎症効果を達成する様々な推定のメカニズムの理解である。これらのメカニズムは、本出願人によって発見され、本出願人は、ＰＲＧ４がＣＤ４４受容体に結合して、ＣＤ４４受容体アンタゴニストとして作用することができることを決定した。その結果、ＰＲＧ４は、ＣＤ４４受容体シグナル伝達によって媒介される炎症促進性の応答を下方調節することができる。ＰＲＧ４がＣＤ４４のシグナル伝達に影響を及ぼすことができることは、ＮＦ−κＢの移行を下方調節する効果も有する。さらに、ＰＲＧ４を投与すると、多数の炎症促進性サイトカインの産生が阻害されること、ならびに炎症促進性サイトカインの誘導（例えば、ＴＮＦ−α）による細胞応答および増殖がモジュレートされることが示されており、この特徴はＰＲＧ４に固有であり、高分子量ヒアルロン酸などの他の潤滑剤にとって固有のものではない。したがって、ＰＲＧ４は、治療および予防の状況における多数の新規方法において、炎症応答の産生に関係するシグナル伝達経路に及ぼすその効果により、抗炎症作用を発揮するために使用することができる。

[0006] したがって、１つの態様において、本発明は、ＰＲＧ４を患者に全身投与する、または非軟骨性、非骨性、非骨、および非関節であるが、膀胱、角膜、または口腔表面組織ではない部位で局所投与することを含む、患者における炎症応答を低減または阻害する方法を提供する。

[0007] １つの実施形態において、ＰＲＧ４は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、経口、直腸内、口内頬側、または舌下投与、または吸入によって患者に全身投与される。

[0008] 本発明のもう１つの実施形態において、ＰＲＧ４含有組成物は、ＰＲＧ４を、患者のある位置に注射および／または留置するためのマトリクス／足場投与剤形に処方することによって、患者に簡便に投与することができる。そのようなＰＲＧ４含有組成物は、患者のある位置でＰＲＧ４を徐々に放出することができる徐放性製剤の剤形であり得る。適したマトリクス／足場投与剤形には、生体適合性のポリマー、ポリマーマトリクス、カプセル、マイクロカプセル、微粒子、拡散デバイス、およびリポソームが挙げられるがこれらに限定されるわけではない。本発明のそのような他の製剤は、マトリクスに会合するかまたは患者に投与されると、固体またはゲルを形成する液体を含む。ＰＲＧ４を含有するように処方されるそのような組成物に加えて、そのような組成物はまた、ＰＲＧ４を発現するように設計された組換えにより操作された細胞を含有するように処方されてもよい。ＰＲＧ４含有組成物は、直接注射、または直視下手術、もしくは腹腔鏡技法もしくは関節鏡技法の際に予め形成されたＰＲＧ４組成物を留置することを含む、患者の体内の位置にＰＲＧ４を導入するために任意の適した方法で投与することができる。

[0009] もう１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、患者に局所投与される、例えば局所外用的にまたは注射によって投与される。いくつかの実施形態において、ＰＲＧ４は、皮膚、腎臓、肺、肝臓、皮膚熱傷または外科的切開部などの創傷、甲状腺、膵臓、脾臓、胸腺、卵巣、精巣、子宮、副腎、下垂体、視床下部、尿道、前立腺、心臓、動脈または血管、心膜液、脳、胃から選択される部位で局所投与される。投与はまた、直腸、鼻、耳、咽頭、喉頭、気管を含む開口部で行われる。他の投与領域には、舌、後眼部、または腫瘍部位が挙げられる。投与はまた、小腸、大腸、結腸、または食道、咽頭、喉頭、気管、舌、後眼部、または腫瘍部位を含む内臓で行われる。いくつかの実施形態において、局所投与部位は、患者における炎症部位または炎症応答部位である。

[0010] もう１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、関節炎、骨関節炎、乾癬性関節炎、リウマチ性関節炎、糖尿病性網膜症、網膜炎症、網膜炎、シェーグレン症候群、黄斑変性、痛風、偽痛風、心膜炎、またはぶどう膜炎から選択される炎症状態を患っている患者に全身投与される。

[0011] もう１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、座瘡；急性臓器不全；急性呼吸促迫症候群（ARDS）；アジソン病；アレルギー性鼻炎；同種異系移植片拒絶；円形脱毛症；アルツハイマー病；アナフィラキシー；虫垂炎；喘息；アテローム性動脈硬化症；アトピー性皮膚炎；自己免疫性脱毛、自己免疫性甲状腺機能亢進症、自己免疫性下垂体機能低下症、多腺性自己免疫疾患を含む自己免疫疾患；ベーチェット病；脳損傷；気管支炎；がん；心肺バイパス症候群；心腎症候群；セリアック病；慢性光線性皮膚炎；慢性閉塞性肺疾患（COPD）；慢性腎不全；結腸炎；接触性皮膚炎；クローン病；皮膚筋炎；糖尿病；湿疹；肺気腫；異物拒絶；緑内障；糸球体腎炎；痛風；移植片対宿主病；グレーヴス病；ギラン・バレー症候群；橋本甲状腺炎；枯草熱；肝腎症候群；過敏症またはアレルギー；封入体筋炎；ウイルス、真菌、寄生虫、または微生物浸潤による感染症；炎症性腸疾患；炎症性腎疾患；熱もしくは化学物質曝露または放射線による損傷；刺激性腸症候群；虚血；肺炎症；モルフェア；多発性硬化症；菌状息肉腫；心筋梗塞；壊死；非感染性肺損傷；膵炎；悪性貧血；肺炎；多発筋炎；前立腺炎；偽痛風；乾癬；掌蹠膿疱症；壊疽性膿皮症；呼吸器アレルギー；強皮症；敗血症；血清病；セザリー症候群；皮膚アレルギー；卒中；全身性炎症応答症候群（SIRS）；全身性紅斑性狼瘡；全身性強皮症；Ｔ−細胞媒介性過敏疾患；移植片拒絶；銃創、ナイフ創、自動車事故、転倒、または戦闘による外傷；結核；潰瘍性大腸炎；心膜炎；蕁麻疹；および尋常性白斑から選択される炎症状態を患っている患者に全身または局所投与される。

[0012] さらなる実施形態において、患者における炎症応答は、患者が患っている炎症状態に関連する。

[0013] さらなる実施形態において、投与されるＰＲＧ４は、組換えヒトＰＲＧ４である。もう１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、シグナル配列を含まない配列番号１の配列を有する。１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、患者において境界潤滑を提供するには不十分な量で投与される。もう１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、例えば０．１μｇ／ｋｇ〜４，０００μｇ／ｋｇの範囲の量で、または例えば１０μｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬのＰＲＧ４濃度を含むＰＲＧ４溶液から適用される組織表面上のコーティングとして投与される。

[0014] １つの実施形態において、炎症応答の低減または阻害は、患者における炎症促進性サイトカインの産生レベルによって測定され得る。例えば、１つの実施形態において、炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７α、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＬ−３６、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン−α）、リンホトキシン−β、ＣＸＣ３１Ｌ（フラクタルキン）、ＣＸＣＬ−８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、ＣＸＣＬ１０、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−γ、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＥＧＦ、ＧＭＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＦＡＳＬ、４−ＩＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＦＧＦ−２、ＧＲＯ、ＭＤＣ、Ｒａｎｔｅｓ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ−２、ＥＰＯ、ＭＣＳＦ、ＭＩＰ３α、ＭＧ−ＣＳＦ、およびＧＣＳＦからなる群より選択される。

[0015] もう１つの態様において、本発明は、ＰＲＧ４を患者に投与することを含む、炎症状態を有する患者における炎症応答を低減または阻害する方法を提供する。炎症状態は、本明細書において言及される任意の状態であり得る。

[0016] １つの態様において、本発明は、患者にＰＲＧ４を投与することによって、患者における炎症応答を低減または阻害する方法を提供する。ＰＲＧ４の投与は、患者の細胞上のＣＤ４４受容体に結合して、患者における炎症促進性サイトカインの産生を低減もしくは阻害して、および／または患者の細胞におけるＮＦ−κＢの移行を低減もしくは阻害して、それによって患者における炎症応答を低減または阻害する。

[0017] もう１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、患者における炎症部位である、前記患者の非軟骨性組織、非骨組織、非骨性組織であるが、角膜、膀胱、または口腔組織ではない細胞にまたは細胞の近くに局所投与される。

[0018] さらなる実施形態において、細胞は、肥満細胞、脾細胞、肺細胞、腎細胞、脳細胞、心細胞、肝細胞、がん細胞、皮膚細胞、上皮細胞、内皮細胞、白血球、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞、筋細胞、尿道細胞、血管細胞、神経細胞、膵細胞、胃細胞、腸細胞、結腸細胞、直腸細胞、胆嚢細胞、幹細胞、または甲状腺細胞である。

[0019] さらなる実施形態において、ＰＲＧ４は、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、網膜細胞、角膜縁細胞、小柱網細胞、角膜細胞、結膜細胞、眼球細胞、または眼細胞に接触するように、患者に全身投与される。

[0020] なおもう１つの実施形態において、ＰＲＧ４が局所投与されるか全身投与されるかによらず、ＰＲＧ４は、患者において境界潤滑を提供するには不十分な量で投与される。例えば、１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、０．１μｇ／ｋｇ〜４，０００μｇ／ｋｇの範囲の量で投与される。

[0021] さらなる実施形態において、ＰＲＧ４の投与は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＭＣＰ−１、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、フラクタルキン、ＩＦＮ−α２、ＧＲＯ、ＭＣＰ−３、ＭＤＣ、ＥＰＯ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＭＣＳＦ、ＭＩＰ−３α、ＭＧ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−５、Ｇ−ＣＳＦ、Ｒａｎｔｅｓ、ＩＬ−１７α、またはＩＬ−１２ｐ７０からなる群より選択される炎症促進性サイトカインを低減または阻害する。

[0022] もう１つの態様において、本発明は、表面に存在するＣＤ４４への活性化リガンドの結合を阻害する方法を提供する。方法は、ＣＤ４４に結合してリガンドの結合を阻害するために十分な濃度のＰＲＧ４を、表面に曝露することを含む。１つの実施形態に従って、ＰＲＧ４は、ＣＤ４４に結合するためには十分であるが、境界潤滑を提供するには不十分である量で表面に存在する。もう１つの実施形態において、表面は哺乳動物の細胞膜であり、もう１つの実施形態において、表面は表面プラズモン共鳴検出器の表面である。なおもう１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、ｒｈＰＲＧ４（組換えヒトＰＲＧ４）またはｎｈＰＲＧ４（ネイティブヒトＰＲＧ４）である。

[0023] さらなる実施形態において、表面は、ヒト対象の表面である。もう１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、全身投与される。もう１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、患者に局所外用的に投与される。なおもう１つの実施形態において、ＰＲＧ４、例えばｒｈＰＲＧ４は、０．１μｇ／ｋｇ〜４，０００μｇ／ｋｇの範囲の量でヒト対象に投与される。もう１つの実施形態において、ＰＲＧ４、例えばｒｈＰＲＧ４は、用量あたり１〜１００μＬの少量で０．１μｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬの量で投与される。もう１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、例えば浣腸として用量あたり１００μＬ〜４Ｌの量で１０μｇ／ｍＬ〜４ｍｇ／ｍＬの量で投与される。

[0024] １つの実施形態において、表面がヒト対象の表面である場合、ヒトは、骨代謝障害を患っており、受容体にＰＲＧ４を曝露すると、破骨細胞の分化を低減または阻害する。さらなる実施形態において、ヒトは、炎症状態を患っている。例示的な炎症状態は、本明細書において上記の通りである。１つの実施形態において、受容体にＰＲＧ４、例えばｒｈＰＲＧ４を曝露すると、炎症を、または炎症状態の位置での炎症促進性サイトカインレベルを低減させる。

[0025] １つの実施形態に従って、細胞は、滑膜細胞、肥満細胞、脾細胞、肺細胞、腎細胞、脳細胞、心細胞、眼細胞、肝細胞、がん細胞、皮膚細胞、上皮細胞、または内皮細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、リウマチ性関節炎を有する対象の滑膜細胞、糖尿病者の膵細胞、喘息者の肺細胞、眼の感染症、熱傷、または他の刺激を有する対象の眼球細胞；結核または他の肺の感染症、損傷もしくは状態を有する対象の気管支または肺胞上皮細胞；嚢胞性線維症の対象の肺細胞；大腸炎またはクローン病を有する人の下位腸管上皮細胞；乾癬を有する対象の皮膚細胞；座瘡を有する対象の皮膚細胞；レーザーアブレーションによる処置後の対象の皮膚細胞、または敗血症を有する対象の内皮細胞である。なおもう１つの実施形態において、細胞はＴ細胞であるが、さらなる実施形態において、細胞はリンパ球、好中球、線維芽細胞、がん細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、好酸球、または内皮細胞である。

[0026] １つの実施形態に従って、表面にＰＲＧ４、例えばｒｈＰＲＧ４を曝露すると、ＣＤ４４の炎症促進性リガンドに拮抗する。１つの実施形態において、リガンドは、ヒアルロナン（ＨＡ）、ヒアルロナン血清由来ヒアルロナン結合タンパク質複合体（ＨＡ−ＳＨＡＰ）、またはマトリクスメタロプロテナーゼ（例えば、ＭＭＰ−９）である。もう１つの実施形態において、リガンドは、ヘモペキシン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ソマトメジン−Ｂ、オステオポンチン、ＯＫＴ３、またはＣ３ａ、ＣＤ３、ＣＤ４６などの補体関連タンパク質である。

[0027] もう１つの態様において、本発明は、例えばヒト対象の血液中の炎症促進性サイトカインレベルを低減または阻害する方法を提供する。方法は、炎症促進性サイトカインレベルを低減または阻害するために十分な量のＰＲＧ４を全身投与する工程を含む。例示的な炎症促進性サイトカインには、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＭＣＰ−１、ＥＧＦ、ＦＧＦ−２、フラクタルキン、ＩＦＮ−α２、ＧＲＯ、ＭＣＰ−３、ＭＤＣ、ＥＰＯ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＭＣＳＦ、ＭＩＰ−３α、ＭＧ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−５、Ｇ−ＣＳＦ、Ｒａｎｔｅｓ、ＩＬ−１７α、またはＩＬ−１２ｐ７０が挙げられる。

[0028] さらなる態様において、本発明は、細胞におけるＮＦ−κＢの移行を阻害する方法を提供する。方法は、ＮＦ−κＢを含有する細胞を、細胞表面受容体に結合してＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化を阻害するＰＲＧ４に接触させる工程を含む。さらなる実施形態において、ＰＲＧ４は、細胞表面上のＴＮＦ−α受容体またはＩＬ−１受容体を阻害する。

[0029] なおもう１つの実施形態において、細胞は、ＰＲＧ４を接触させたヒトの細胞である。さらなる実施形態において、細胞は、滑膜細胞、軟骨細胞、または骨細胞であるが、なおもう１つの実施形態において、細胞は、脾細胞、肺細胞、腎細胞、脳細胞、心細胞、脳細胞、肝細胞、上皮細胞、または内皮細胞である。

[0030]図１Ａ−ＣはＴＭＢ−ＥＬＩＳＡによって４５０ｎｍで検出した、組換えヒトＣＤ４４受容体への組換えヒトプロテオグリカン４（ｒｈＰＲＧ４）、高分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷＨＡ）、中分子量ヒアルロン酸（ＭＭＷＨＡ）の結合を証明するデータを表す棒グラフである。データは、１群あたりウェル３重測定の独立した実験４回の平均値を表す。図１ＡはＣＤ４４−ＩｇＧ_１ＦｃおよびＩｇＧ_１ＦｃへのｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷＨＡ、ＭＭＷＨＡ、およびビトロネクチンの結合を表す。星印（^＊）は、ＣＤ４４−ＩｇＧ_１Ｆｃのウェルにおける４５０ｎｍでの吸光度が、ｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷＨＡ、およびＭＭＷＨＡに関してＩｇＧ_１Ｆｃのウェルより統計学的に有意に高かった（ｐ＜０．００１）ことを示している。図１ＢはｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷＨＡ、およびＭＭＷＨＡの濃度依存的ＣＤ４４結合を示す。ｒｈＰＲＧ４へのＣＤ４４の結合は、ＨＭＷＨＡまたはＭＭＷＨＡより有意に高かった（ｐ＜０．００１）。星２つ（^＊＊）は、ｒｈＰＲＧ４へのＣＤ４４の結合が、ＭＭＷＨＡより有意に高かった（ｐ＜０．００１）ことを示している。図１Ｃは９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングしたＣＤ４４への結合に関する、ｒｈＰＲＧ４（５μｇ／ｍＬ）とＨＭＷＨＡまたはＭＭＷＨＡ（０．０１μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬ）のいずれかの競合を表す。星印（^＊）は、ＨＭＷＨＡ＋ｒｈＰＲＧ４ウェルにおけるＣＤ４４結合百分率がｒｈＰＲＧ４ウェルより有意に低かった（ｐ＜０．０５）ことを示している。（^＊＊）は、ＭＭＷＨＡ＋ｒｈＰＲＧ４ウェルにおけるＣＤ４４結合百分率がｒｈＰＲＧ４ウェルより有意に低かった（ｐ＜０．０５）ことを示している。 [0031]図２Ａ−Ｂは表面プラズモン共鳴を使用した、組換えＣＤ４４への組換えヒトプロテオグリカン４（ｒｈＰＲＧ４）の結合、およびＣＤ４４結合に対するｒｈＰＲＧ４と高分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷＨＡ）の間の競合を表す。図２Ａは固定されたＣＤ４４−ＩｇＧ_１Ｆｃに対するｒｈＰＲＧ４（３００μｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬ）の濃度依存的会合および解離を表すセンソグラムである。破線の曲線は、ＣＤ４４キメラタンパク質へのｒｈＰＲＧ４の結合曲線を表し、実線はフィットさせた１：１結合モデルを表す。図２Ｂは相対的応答−ＨＭＷＨＡ結合と、相対的応答−ｒｈＰＲＧ４結合の比較を示すプロットである。固定されたＣＤ４４−ＩｇＧ_１Ｆｃへの結合に関するｒｈＰＲＧ４とＨＭＷＨＡの競合。ｒｈＰＲＧ４を３００（１）、２５０（２）、２００（３）、１５０（４）、１００（５）、５０（６）、および０（７）μｇ／ｍＬで注入した。ｒｈＰＲＧ４の解離後、ＨＭＷＨＡを５０μｇ／ｍＬで注入した。ｒｈＰＲＧ４の濃度が増加すると、それに続いてＣＤ４４へのＨＭＷＨＡの結合が減少した。 [0032]図３Ａ−ＢはＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４の結合に及ぼす組換えヒトプロテオグリカン４（ｒｈＰＲＧ４）のシアリダーゼ−ＡおよびＯ−グリコシダーゼ消化の影響を示す。データは、１群あたりウェル３重測定の独立した実験４回の平均値を表す。図３ＡはＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４、シアリダーゼ−Ａ消化ｒｈＰＲＧ４、Ｏ−グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４、およびシアリダーゼ−Ａ＋Ｏ−グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４の結合を表す棒グラフである。異なる群の間の４５０ｎｍでの吸光度の値を、非消化ｒｈＰＲＧ４群の吸光度の値に対して標準化した。（^＊）は、シアリダーゼ−Ａ消化およびＯ−グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４結合が、非消化ｒｈＰＲＧ４と比較して有意に高かった（ｐ＜０．０１）ことを示す。（^＊＊）は、シアリダーゼ−Ａ＋Ｏ−グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４結合が、シアリダーゼ−Ａ消化、Ｏ−グリコシダーゼ消化、および非消化ｒｈＰＲＧ４と比較して有意に高かった（ｐ＜０．０１）ことを示している。図３ＢはｒｈＰＲＧ４、シアリダーゼ−Ａ消化ｒｈＰＲＧ４、Ｏ−グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４、ならびにシアリダーゼ−ＡおよびＯ−グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４の組み合わせのＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。ゲルをクマシーブルーによって一晩染色した。シアリダーゼ−ＡおよびＯ−グリコシダーゼによる消化によって、ｒｈＰＲＧ４の見かけの分子量は低減した。 [0033]図４Ａ−Ｂはリウマチ性関節炎線維芽細胞様滑膜細胞（ＲＡ−ＦＬＳ）のサイトカイン誘導性の増殖に及ぼす組換えヒトプロテオグリカン４（ｒｈＰＲＧ４）および高分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷＨＡ）処置の影響を示す。データは、処置あたりウェル３重測定の独立した実験３回の平均値を表す。図４ＡはｒｈＰＲＧ４およびＨＭＷＨＡによるサイトカイン誘導性のＲＡ−ＦＬＳ増殖の阻害を表す棒グラフである。（#）は、サイトカイン刺激ＲＡ−ＦＬＳが、無処置細胞より有意に高い（ｐ＜０．００１）吸光度を有したことを示す。（^＊）は、ＩＬ−１β刺激ＲＡ−ＦＬＳのｒｈＰＲＧ４（４０および８０μｇ／ｍＬ）またはＨＭＷＨＡ（４０および８０μｇ／ｍＬ）による処置が、無処置ＩＬ−１β刺激細胞と比較して細胞増殖を有意に低減させた（ｐ＜０．０５）ことを示している。（^＊＊）は、ｒｈＰＲＧ４（２０、４０および８０μｇ／ｍＬ）処置が、無処置ＴＮＦ−α刺激細胞と比較して細胞増殖を有意に低減させた（ｐ＜０．０５）ことを示している。図４ＢはＣＤ４４特異的抗体であるＩＭ７の存在下および非存在下でのｒｈＰＲＧ４およびＨＭＷＨＡによるサイトカイン誘導性のＲＡ−ＦＬＳ増殖の阻害を表す棒グラフである。（#）は、サイトカイン刺激ＲＡ−ＦＬＳが、無処置細胞より有意に高い（ｐ＜０．００１）吸光度を有したことを示している。（^＊）は、ｒｈＰＲＧ４またはＨＭＷＨＡ処置が、無処置ＩＬ−１βまたは（ｒｈＰＲＧ４またはＨＭＷＨＡ）＋ＩＭ７処置と比較して有意に低い（ｐ＜０．０５）細胞増殖を示したことを示す。（^＊＊）は、ｒｈＰＲＧ４処置が、無処置ＴＮＦ−αまたはｒｈＰＲＧ４＋ＩＭ７処置（ｐ＜０．０５）と比較して有意に低い（ｐ＜０．０５）細胞増殖を示したことを示し、この結果は、ＨＭＷＨＡでは再現されなかった。図４ＣはＲＡ−ＦＬＳにおけるＴＮＦ−α誘導性のＮＦ−κＢ核移行のｒｈＰＲＧ４による阻害を表す棒グラフである。ＴＮＦ−α＋ｒｈＰＲＧ４群におけるＮＦ−κＢ核移行は、ＴＮＦ−α単独またはＴＮＦ−α＋ｒｈＰＲＧ４＋ＩＭ７群より有意に低かった（ｐ＜０．００１）。ｒｈＰＲＧ４またはＮＦ−κＢ移行の阻害剤であるＭＧ１３２による処置は、ＴＮＦ−α処置ＲＡ−ＦＬＳと比較してＮＦ−κＢ核移行を有意に低減させた（ｐ＜０．００１）。 [0034]図５Ａ−ＣはＰｒｇ４−／−およびＰｒｇ４＋／＋滑膜細胞の増殖に及ぼす炎症促進性サイトカインの影響およびｒｈＰＲＧ４の効果を表す。図５Ａは抗ＣＤ４４抗体（IM7）（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）を使用して免疫細胞染色されたＰｒｇ４−／−およびＰｒｇ４＋／＋滑膜細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞における強い緑色蛍光は、Ｐｒｇ４＋／＋滑膜細胞と比較してＣＤ４４局在の増加を示している。図５ＢはＰｒｇ４−／−およびＰｒｇ４＋／＋滑膜細胞のサイトカイン誘導性の増殖を表す棒グラフを示す。Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞のＩＬ−１β誘導性の増殖は、Ｐｒｇ４＋／＋滑膜細胞のＩＬ−１β誘導性の増殖（ｐ＜０．００１）およびＰｒｇ４−／−滑膜細胞のＴＮＦ−α誘導性の増殖（ｐ＝０．００２）より有意に高かった。Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞のＴＮＦ−α誘導性の増殖は、Ｐｒｇ４＋／＋滑膜細胞のＴＮＦ−α誘導性の増殖より有意に高かった（ｐ＜０．００１）。図５ＣはＩＭ７の存在下および非存在下でのサイトカイン誘導性のＰｒｇ４−／−滑膜細胞増殖に及ぼすｒｈＰＲＧ４処置の影響の棒グラフを示す。（#）は、サイトカイン刺激Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞が無処置細胞と比較して有意に高い（ｐ＜０．００１）吸光度を有したことを示す。（^＊）は、ＩＬ−１β刺激Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞のｒｈＰＲＧ４処置が、無処置のＩＬ−１βまたはｒｈＰＲＧ４＋ＩＭ７処置と比較して細胞増殖を有意に低減させた（ｐ＜０．００１）ことを示す。（^＊＊）は、ＴＮＦ−α刺激Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞のｒｈＰＲＧ４処置が、無処置ＴＮＦ−αまたはｒｈＰＲＧ４＋ＩＭ７処置と比較して細胞増殖を有意に低減させた（ｐ＜０．００１）ことを示す。 [0035]完全長（非切断）ヒトＰＲＧ４（配列番号１：残基１４０４個）のアミノ酸配列である。残基１〜２４位（太字で示す）は、シグナル配列を表し、残基２５〜１４０４位は、ヒトＰＲＧ４の成熟配列を表す。糖タンパク質は、その活性型にリード配列を必要としない。 [0036]図７−１〜７−３は完全長のアミノ酸１４０４個のヒトＰＲＧ４タンパク質をコードするＰＲＧ４遺伝子（配列番号２）の核酸配列である。 [0036]図７−１〜７−３は完全長のアミノ酸１４０４個のヒトＰＲＧ４タンパク質をコードするＰＲＧ４遺伝子（配列番号２）の核酸配列である。 [0036]図７−１〜７−３は完全長のアミノ酸１４０４個のヒトＰＲＧ４タンパク質をコードするＰＲＧ４遺伝子（配列番号２）の核酸配列である。 [0037]図８Ａ−Ｂはリポ多糖の投与が炎症性サイトカインの産生をどのように上方調節するかを示す。図８Ａは食塩水（対照）のチャレンジ後およびリポ多糖のチャレンジ後の全血試料に存在する、測定されたそれぞれのサイトカインレベルを示す表である。様々なサイトカイン濃度は、二連決定の平均値を表し、ｐｇ／ｍＬ（ｎｇ／Ｌ）として表記する。図８Ｂはパーセント変化を棒グラフで示し、これはＬＰＳ刺激結果と食塩水対照の結果との比較に基づく。 [0038]図９Ａ−Ｂはルブリシンの投与が炎症性サイトカインの産生をどのように下方調節するかを示す。図９Ａは食塩水（対照）のチャレンジ後およびリポ多糖のチャレンジ後の全血試料に存在する、測定されたそれぞれのサイトカインレベルを示す表である。様々なサイトカインの濃度は、二連決定の平均値を表し、ｐｇ／ｍＬ（ｎｇ／Ｌ）として表記する。図９Ｂはそれぞれの個々のサイトカインのパーセント変化は、ルブリシン添加試料と食塩水対照試料との比較に基づき、棒グラフで示す。 [0039]図１０Ａ−Ｂはルブリシンの投与が、ＬＰＳ媒介性炎症性サイトカイン生成をどのように阻害するかを示す。図１０ＡはＬＰＳおよびルブリシンと共にＬＰＳをチャレンジ後の全血試料中に存在する、測定されたそれぞれのサイトカインレベルを示す表である。様々なサイトカインの濃度は、二連決定の平均値を表し、ｐｇ／ｍＬ（ｎｇ／Ｌ）として表記する。図１０Ｂはそれぞれの個々のサイトカインのパーセント変化は、ＬＰＳ単独とルブリシンを添加したＬＰＳとの比較に基づき、棒グラフで示す。 [0040]図１１Ａ−Ｂはルブリシンの投与が、ＴＮＦ−α媒介性の炎症性サイトカイン生成をどのように阻害するかを示す。図１１ＡはＴＮＦ−αならびにルブリシンおよびＴＮＦ−αをチャレンジ後の全血試料中に存在する、測定されたそれぞれのサイトカインレベルを示す表である。様々なサイトカインの濃度は、二連決定の平均値を表し、ｐｇ／ｍＬ（ｎｇ／Ｌ）として表記する。図１１Ｂはそれぞれの個々のサイトカインのパーセント変化は、ＴＮＦ−α単独とルブリシンを添加したＴＮＦ−αとの比較に基づき、棒グラフで示す。 [0041]図１２Ａ−Ｂはルブリシンの投与が、組織因子（TF）媒介性の炎症性サイトカイン生成をどのように阻害するかを示す。図１２ＡはＴＦならびにルブリシンおよびＴＦのチャレンジ後の全血試料中に存在する、測定されたそれぞれのサイトカインレベルを示す表である。様々なサイトカインの濃度は、二連決定の平均値を表し、ｐｇ／ｍＬ（ｎｇ／Ｌ）として表記する。図１２Ｂはそれぞれの個々のサイトカインのパーセント変化は、ＴＦ単独とルブリシンを添加したＴＦとの比較に基づき、棒グラフで示す。 [0042]術後に（半月板の不安定化；灰色の棒グラフ）組換えヒトルブリシンの関節内投与を受けた試験マウスから採取した血清試料中のＥＰＯ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−３α、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−７、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−５、Ｇ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＧＲＯ、ＩＬ−１７α、およびＩＬ−１２ｐ７０レベルを、手術を受けたがルブリシンではなくて食塩水を術後に投与された対照マウス（白色の棒グラフ）と比較して示すグラフである。 [0043]図１４Ａ−Ｂは組換えヒトルブリシンを曝露された、骨関節炎の滑膜細胞および正常なヒト滑膜細胞によって発現されたサイトカインレベルを示す棒グラフである。図１４ＡはＦＧＦ−２濃度を示す。図１４ＢはＩＬ−１Ｒａ濃度を示す。 [0044]雄性Ｌｅｗｉｓラットにおける尿酸一ナトリウム（MSU）結晶誘導性の足引っ込め圧（paw withdrawal pressure）（PWT）の変化に及ぼす組換えヒトプロテオグリカン４（rhPRG4）の関節内投与の影響を証明する。足引っ込め圧は、電子ＶｏｎＦｒｅｙ機器を使用して測定し、データをベースラインの値からのパーセント変化として表す。

[0045] 本明細書において開示される本発明は、ルブリシンとしても公知であるＰＲＧ４のこれまで未知で認識されていない抗炎症特性の発見に基づく。本発明は、ＰＲＧ４の抗炎症特性を利用して、ＰＲＧ４の多数の新規治療的および予防的使用を提供する。例えば、本発明は、炎症応答を阻害または低減させる方法および炎症状態を処置する方法を提供する。

[0046] 炎症応答は感染症および疾患と闘うために必要であるが、多くの炎症状態は、過度の、不良または不当な炎症応答の結果である。そのような状態は、例えば自己免疫状態、アレルギー反応、慢性炎症状態、および敗血症である。いくつかの状況において、炎症は、慢性疼痛または不快感を生じて、クオリティオブライフの低下に至るが、他の状況において、炎症は敗血症の場合のように生命を脅かし得る。したがって、炎症が過度で、不良または不当である場合に炎症を緩和するために、ＰＲＧ４を例えば抗炎症剤として使用することができるという発見は、慢性または急性の炎症状態を処置するために、および関連する炎症のレベルを調節、低減、または阻害するために有望である。

ＰＲＧ４タンパク質
[0047] ルブリシンとしても公知であるＰＲＧ４は、ヒトにおいてＰＲＧ４としても公知である巨核球刺激因子（MSF）遺伝子から発現される潤滑ポリペプチドである（ＮＣＢＩ受託番号ＡＫ１３１４３４−Ｕ７０１３６を参照されたい）。ルブリシンは、体の関節表面を被覆する遍在性の内因性糖タンパク質である。ルブリシンは、主に強力な細胞保護性で抗接着性の境界潤滑剤として作用する、高度表面活性（例えば、水を保持する）分子である。分子は、末端のタンパク質ドメインの間に位置する長い中心のムチン様ドメインを有し、それによって分子は組織表面に接着して表面を保護する。調べたすべての哺乳動物におけるその天然型は、ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）と少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列の多数の反復配列を含有する。天然のルブリシンは、典型的にプロリンとトレオニン残基を含み、ほとんどの反復配列において少なくとも１つのトレオニンがグリコシル化されている、この反復配列の多数の重複型を典型的に含む。Ｏ−結合糖側鎖に結合しているトレオニンは、ルブリシンの境界潤滑機能にとって重要である。側鎖部分は、典型的にβ（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ部分であり、β（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃは典型的にシアル酸またはＮ−アセチルノイラミン酸によってキャップされている。ポリペプチドはまた、Ｎ−結合オリゴ糖も含有する。天然起源の完全長のルブリシンをコードする遺伝子は、エキソン１２個を含み、天然起源のＭＳＦ遺伝子産物は、ヘモペキシン様およびソマトメジン様領域を含むビトロネクチンに対して多数のポリペプチド配列相同性を有するアミノ酸１，４０４個（分泌配列を含む）を含有する。中心に位置するエキソン６は、残基９４０個を含有する。エキソン６は反復配列に富むＯ−グリコシル化されたムチン様ドメインをコードする。

[0048] ルブリシンのタンパク質骨格のアミノ酸配列は、ヒトＭＳＦ遺伝子のエキソンの選択的スプライシングに応じて異なり得る。異質性に対するこのロバストネスは、研究者らが、中心のムチンドメインからアミノ酸４７４個が欠失しているが、それでもなお変異しているものの妥当な潤滑を達成するルブリシンの組換え型を作製した場合に例示された（Flannery et al., Arthritis Rheum 2009; 60（3）:840-7）。ＰＲＧ４は、これまで、単量体のみならず、Ｎ−およびＣ−末端の両方で保存されたシステインリッチドメインを通してジスルフィド結合した二量体および多量体としても存在することが示されている。ＬｕｂｒｉｓＬＬＣ社は、ヒトルブリシンの完全長の組換え型を開発した。この分子は、Ｓｅｌｅｘｉｓ社のチャイニーズハムスター卵巣細胞株（CHO-M）を使用して発現され、最終的な見かけの分子量は４５０〜６００ｋＤａであり、多分散性の多量体がしばしば１，０００ｋＤａまたはそれ超で測定されたが、これらは全てＳＤＳトリス酢酸３〜８％ポリアクリルアミドゲルで分子量標準物質と比較して推定された。総グリコシル化の中で、約半数が二糖単位（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ）を含み、半数が三糖単位（ＧａｌＮＡｃ−Ｇａｌ−シアル酸）を含む。この組換えヒトＰＲＧ４産生方法は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ第０１４／０６１８２７号パンフレットに開示されている。

[0049] 任意の１つまたは複数の様々なネイティブおよび組換えＰＲＧ４タンパク質およびアイソフォームを、本明細書において記述される様々な実施形態において利用してもよい。例として、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，４３３，１４２号明細書；第６，７４３，７７４号明細書；第６，９６０，５６２号明細書；第７，０３０，２２３号明細書、および第７，３６１，７３８号明細書は、様々な型のヒトＰＲＧ４発現産物を作製する方法を開示している。本発明の実践において使用するために好ましいのは、ＣＨＯ細胞から発現された、完全長のグリコシル化された組換えＰＲＧ４、またはルブリシンである。このタンパク質は、Ｏ−結合β（１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃオリゴ糖によって様々にグリコシル化された配列ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）の反復配列を含む中心エキソン、およびビトロネクチンに対して相同性を有するＮおよびＣ末端配列を含む、アミノ酸１，４０４個を含む（図６、配列番号１を参照されたい）。分子は、個々の分子のグリコシル化パターンが変化する多分散型であり、単量体、二量体、および多量体種を含み得る。

[0050] 本明細書において使用される用語「ＰＲＧ４」は、用語「ルブリシン」と互換的に使用される。広義には、これらの用語は、任意の機能的な単離または精製されたネイティブまたは組換えＰＲＧ４タンパク質、その相同体、機能的断片、アイソフォーム、および／または変異体を指す。全ての有用な分子は、エキソン６によってコードされる配列、またはその相同体もしくは切断型、例えば、好ましくはＯ−結合グリコシル化と共にこの中心のムチン様ＫＥＰＡＰＴＴ反復配列ドメイン内により少ない反復配列を有する改変型を含む。全ての有用な分子はまた、エキソン１〜５および７〜１２によってコードされる配列の少なくとも生物活性部分、すなわちＥＣＭおよび内皮表面に対するその親和性を分子に付与する原因となる配列を含む。特定の実施形態において、好ましいＰＲＧ４タンパク質は、ＰＲＧ４タンパク質の１つもしくは複数の生物活性部分、または潤滑断片などのその機能的断片、またはその相同体片を含む、平均分子量５０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、好ましくは２２４〜４６７ｋＤａを有する。より好ましい実施形態において、ＰＲＧ４タンパク質は、平均分子量２２０ｋＤａ〜約２８０ｋＤａの単量体を含む。

[0051] ＰＲＧ４タンパク質などのタンパク質を単離、精製、および組換え発現する方法は、当技術分野で周知である。特定の実施形態において、方法は、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲなどの標準的な分子生物学技術を使用して、ＰＲＧ４タンパク質またはアイソフォームをコードするｍＲＮＡおよびｃＤＮＡをクローニングおよび単離することから始まる。ＰＲＧ４タンパク質またはアイソフォームをコードする単離ｃＤＮＡを、発現ベクターにクローニングして、組換えＰＲＧ４タンパク質を産生するために宿主細胞において発現させ、細胞培養上清から単離する。組換えヒトＰＲＧ４を産生する方法は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ第０１４／０６１８２７号パンフレットに提供される。

[0052] 本明細書より以前のＰＲＧ４の機能は、ほぼ完全に関節間の摩擦の低減および摩耗の予防、ならびに眼と眼瞼表面の間などの境界組織の潤滑に関連していた。関節の維持におけるＰＲＧ４の機能的重要性は、ヒトにおいて屈指−関節症−内反股−心外膜炎（CACP）疾患症候群を引き起こす変異によって示されている。ＣＡＣＰは、内反股変形、心膜炎、および胸膜浸潤を伴う屈指、非炎症性の関節症、および肥厚性滑膜炎として現れる。同様に、ＰＲＧ４無効マウスでは、軟骨の劣化、およびその後の関節障害が観察された。したがって、ＰＲＧ４発現は、健康な滑膜関節の必要な成分である。しかし、本発明において記述される抗炎症剤としてＰＲＧ４タンパク質などの全身性の境界潤滑剤を使用することは、本出願人の知る限り、これまで示唆されていない。

抗炎症剤としてのＰＲＧ４
[0053] ＰＲＧ４の抗炎症特性の発見は、ＰＲＧ４がその抗炎症効果を達成する様々な推定のメカニズムの観察に基づく。ＰＲＧ４が抗炎症効果を生じる１つのメカニズムは、ＣＤ４４を必要とする。本出願人は、ＰＲＧ４がＣＤ４４受容体に結合して、ＣＤ４４受容体アンタゴニストとして作用することが可能であることを発見した。その結果、ＰＲＧ４は、ＣＤ４４受容体シグナル伝達によって媒介される炎症促進性の応答を下方調節することができる。

[0054] ＣＤ４４は、糖タンパク質であり、選択的スプライシングによって、および炎症において主要な役割を果たすグリコシル化によって生成される様々なアイソフォームを有する主要な細胞表面受容体であり（Cutly et al., J Cell Biol 1992; 116（4）:1055-62）、多様な細胞−細胞相互作用、腫瘍の転移、およびリンパ球の活性化に関係している。ＣＤ４４は、多数の哺乳動物細胞タイプにおいて発現され、その発現レベルは細胞タイプおよびその活性化状態によって異なる。がん様または新生物細胞も同様に、ＣＤ４４を発現することができ、そのような細胞上にＣＤ４４が存在することは、がんの調節および転移にＣＤ４４が関係することを示している。ヒトにおいて、ＣＤ４４は、第１染色体上のＣＤ４４遺伝子によってコードされる。ＣＤ４４を通してのシグナル伝達は、Ｔ細胞増殖およびＩＬ−２産生、ＮＫ細胞障害活性の用量依存的増強、ならびにマクロファージによるサイトカインおよびケモカインの産生、ならびに他の機能を誘導する。

[0055] ＣＤ４４の十分に確立されたリガンドは、高分子量ヒアルロナン（ＨＭＷＨＡ）であり、ＨＭＷＨＡは、他のＨＡ結合タンパク質に対して相同性を有するＣＤ４４の細胞外モチーフに結合して、その後ＨＭＷＨＡは細胞内に取り込まれる（Knudson et al., Matrix Biol 2002; 21（1）:15-23; Harada et al., J Biol Chem 2007; 282（8）:5597-607; Tibesku et al., Ann Rheum Dis 2006; 65（1）:105-8）。骨関節炎の実験モデルにおいて、軟骨のＣＤ４４発現は、疾患の進行と共に増加して、関節軟骨におけるＣＤ４４の発現は、ヒトにおける疾患の重症度と相関し得る（Fuchs et al., J Orthop Res 2004;22（4）:774-80; Zhang et al., Mod Rheumatol 2013; 23（6）:1186-91）。ＨＡ／ＣＤ４４相互作用は、多様な疾患状態で顕著である。結腸上皮から生じる癌腫は、ＨＡに富む微小環境で発生する傾向があり、上皮腫瘍細胞上のＣＤ４４受容体は、チロシンキナーゼ媒介性細胞生存経路を活性化し、それによって抑制されない細胞分裂および増殖が起こる（Misra S et al. Connect Tissue Res. 2008;49（3）:219-24）。内皮細胞上のＣＤ４４は、抗原活性化Ｔリンパ球上のＣＤ４４にＨＡを提示するように作用して、それによって例えば腎虚血再灌流モデルにおける炎症部位への白血球動員を指示するローリング相互作用（Johnson P et al. Inflamm Allergy Drug Targets. 2009 Jul;8（3）:208-20）、腎尿細管内皮細胞媒介性好中球動員の迅速なＣＤ４４による上方調節、ならびに腎機能および形態の悪化を媒介するが、ＣＤ４４が欠乏すると、発現される走化性因子のレベルとは無関係に好中球の流入が低減した（Rouschop KMA et al. J Am Soc Nephrol 2005; 16:2034-43）。

[0056] ＣＤ４４の役割は、細胞タイプ、炎症状態に応じて異なり、部位特異的であり得る。例として、ＣＤ４４が欠乏すると、大腸菌（E.coli）誘導性肺炎において炎症を増強することが見いだされたが、肺炎球菌（S.pneumonia）誘導性肺炎では炎症を増強せず、ＣＤ４４−ＨＡ依存的相互作用が大腸菌に対する炎症応答を増加させるよりむしろ制限し得ることを示唆している（Wang Q et al. Am J Pathol. 2002 Dec;161（6）:2219-28）。

[0057] 他のＣＤ４４リガンドには、細胞外マトリクス成分、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、およびラミニン（Naor et al., Adv Cancer Res 1997; 71:241-319; Knudson et al., Cell Mol. Life Sci. 2002; 59:36-44）、マトリクスメタロプロテナーゼ−９、ＨＡ血清由来ヒアルロナン結合タンパク質複合体（HA-SHAP）、ヘモペキシン、ＥＭＭＰＲＩＮ、ソマトメジン−Ｂ、オステオポンチン、ＯＫＴ３、または補体関連タンパク質（C3a、CD3、CD46など）が挙げられる。

[0058] 以下の実施例１に表されるデータによって示されるように、ルブリシン−ＣＤ４４相互作用は、この糖タンパク質が、その境界潤滑および力学的特性を超える機能を有することを示している。実際に、実施例１Ａ〜Ｄは、ルブリシンがリガンドとして作用して、ＣＤ４４に結合することを示している。したがって、ルブリシンがＣＤ４４に結合することから、ルブリシンは、それによってＣＤ４４による炎症促進性のシグナル伝達が起こる、ヒアルロン酸などのリガンドがＣＤ４４に結合するのを防止するＣＤ４４アンタゴニストとして使用することができる。さらに、これらの証明された抗炎症特性により、ルブリシンは、炎症状態を処置するための、炎症を低減または阻害するための、および炎症応答を低減または阻害するための薬剤として適応される。

[0059] 本出願人によって発見された、ＰＲＧ４が抗炎症効果を提供するもう１つのメカニズムは、ＮＦ−κＢの移行の下方調節である。ＮＦ−κＢは、ＤＮＡの転写を制御するタンパク質複合体であり、細胞の生存にとって肝要であり、感染症に対する免疫応答の調節において、および次いでサイトカイン産生の調節において重要な役割を果たしている。ＮＦ−κＢは、一般的にほとんど全ての動物細胞タイプの細胞質に存在し、ストレス、サイトカイン、フリーラジカル、紫外線照射、酸化ＬＤＬ、および細菌またはウイルス抗原などの刺激によって誘導されると、核に移行する。ＮＦ−κＢの不適切な調節は、がん、炎症および自己免疫疾患、敗血症ショック、ウイルス感染症、および不適切な免疫の発生に関連している。ＮＦ−κＢのシグナル伝達経路は長い間、プロトタイプの炎症促進性経路であると考えられてきた。ＮＦ−κＢシグナル伝達の活性化は、認識されている３つの経路の１つを通して一連の工程において誘発される：古典的、非古典的、および異型的ＩκＫ非依存的経路。その不活化状態では、ＮＦ−κＢは、ＩκＢに結合している。活性化シグナル（例えば、TNF-α、IL-1α、LPS、CD40、リンホトキシン、UV、HER2/Neu、Ｈ_２Ｏ_２、または他のリガンド）は、ＩκＢのリン酸化を引き起こし、その分解を誘発する。次に、遊離の非結合ＮＦ−κＢが核に移行して、例えば炎症促進性サイトカイン、ケモカイン、および接着分子の転写を活性化することができる。

[0060] 以下の実施例１Ｆに示されるように、ルブリシンの投与は、リウマチ性関節炎線維芽細胞様滑膜細胞モデルにおいてＮＦ−κＢの移行を低減させることができる。ＮＦ−κＢの移行に及ぼすＰＲＧ４の効果は、実施例１Ｆのデータによって示されるように、少なくともＣＤ４４に対するＰＲＧ４の効果によって媒介されるように思われる。これらのデータに基づき、ＰＲＧ４は、抗炎症剤として適応され、同様に炎症状態を処置するため、炎症を低減または阻害するため、および炎症応答を低減または阻害するための薬剤として適応される。ＰＲＧ４はまた、ＮＦ−κＢの移行を低減させることによって改善され得る任意の状態の処置としても適応される。この任意の状態は、ＮＦ−κＢが生得のおよび適応免疫系の両方によって産生される多くの炎症促進性サイトカインの発現の調節に関与する転写因子であることから、炎症状態を含む。

[0061] 本出願人はまた、ルブリシンが、未知メカニズムにより多数の炎症促進性サイトカインの産生を阻害または下方調節することによって、その抗炎症効果を達成することを観察した。以下の実施例２および３に表されるデータによって示されるように、ルブリシンは、炎症促進性サイトカインの産生を下方調節し、それによって抗炎症効果を有する。この効果は、リポ多糖（ＬＰＳ）媒介性炎症性サイトカイン生成、ＴＮＦ−α媒介性炎症性サイトカイン生成、および組織因子（ＴＦ）媒介性炎症性サイトカイン生成によって証明された。したがって、炎症促進性サイトカイン産生に及ぼすルブリシンの効果は、多数の異なる経路で確認されている。

[0062] ルブリシンはまた、抗接着剤／潤滑剤としてのその機能を通しても抗炎症効果を達成することができる。本出願人は、力学的ストレスを受けた細胞のミトコンドリアが変形して、その機能が障害され、活性酸素種を産生して、細胞死および局在化細胞破片の産生に至り、その結果としての局所炎症が起こり得ることを観察した。そのような力学的ストレスを受けた細胞に存在するまたはその付近に存在するルブリシンの潤滑作用は、ルブリシンが細胞およびそのミトコンドリアに対する力学的ストレスを緩和する程度に、限局性炎症の発生も阻害する。

[0063] したがって、その抗炎症特性により、ルブリシンは、例えば、炎症促進性サイトカイン生成を低減または阻害することを通して、炎症応答を低減または阻害するための疼痛−免疫モジュレーターおよび抗炎症剤として有用である。その結果、ルブリシンは、炎症状態を処置するための、炎症を低減または阻害するための、および炎症応答を低減または阻害するための薬剤として適応される。

[0064] したがって、これらの作用様式を通して、ＰＲＧ４は、炎症応答に関係する様々なシグナル伝達経路を下方調節する能力を有し、したがって抗炎症剤として有用である。本明細書において記述されるように、ＰＲＧ４の投与は、広く多様な炎症状態および疾患、ならびにそれらの疾患に関連する炎症を処置するために適応される。

抗炎症剤としてのＰＲＧ４の使用
[0065] 本明細書において開示されるＰＲＧ４の抗炎症特性のために、ＰＲＧ４は、これまで認められていない新規使用に関して適応される。特に、ＰＲＧ４は、抗炎症剤としての使用に関して適応され、炎症状態を処置するためおよび炎症を低減または阻害するために適応される。

[0066] １つの態様において、本発明は、ＰＲＧ４を患者に投与することによって、患者における炎症応答を低減または阻害する方法を提供する。いくつかの実施形態において、患者は、既に炎症状態を患っていてもよい。他の実施形態において、患者は、例えば再発性または慢性炎症状態を患っている場合、炎症エピソードを発症するリスクを有し得る。

[0067] いくつかの実施形態において、患者を「処置する」は、状態の悪化を予防することを伴い得るが、他の実施形態において、「処置する」は、状態に関連する炎症を緩和、低減、または阻害することを伴い得る。なお他の実施形態において、「処置する」は、患者における１つまたは複数の炎症促進性サイトカインレベルを低減させることを指し得る。

[0068] なおもう１つの態様において、本発明は、ＰＲＧ４が、患者に、非骨性、非軟骨性、非眼、非骨、非骨性、および非関節である部位、または膀胱、角膜、もしくは口腔の表面組織以外のそのような部位で投与される、患者にＰＲＧ４を投与することによって、患者における炎症応答を低減または阻害する方法を提供する。したがって、ＰＲＧ４を、骨または軟骨性組織に、眼の前部表面に、関節に、膀胱に、または口腔に局所または直接投与することは、本明細書において特許請求される主題の範囲外である。

[0069] なおもう１つの態様において、本発明は、患者の細胞上のＣＤ４４受容体に結合する、患者における炎症促進性サイトカインの産生を低減もしくは阻害する、または患者の細胞におけるＮＦ−κＢの移行を低減もしくは阻害するＰＲＧ４を患者に投与することを含む、患者における炎症応答を低減または阻害する方法を提供する。結果として、患者は炎症応答の低減または阻害を経験する。

[0070] 患者は好ましくはヒトであるが、患者は任意の哺乳動物、例えばウマ、ウシ、ブタ、ラット、マウス、イヌ、またはネコであり得る。

[0071] ルブリシンは体内で自然に産生されるが、外因性のルブリシンを患者に投与しても、本発明の効果が観察される。したがって、１つの実施形態において、患者に投与されるＰＲＧ４は、外因性ヒトルブリシンであるが、もう１つの実施形態において、患者に投与されるＰＲＧ４は、組換えヒトルブリシン（rhPRG4）である。もう１つの実施形態において、ｒｈＰＲＧ４は、配列番号１の配列を有する。

[0072] １つの実施形態において、ＰＲＧ４は、境界潤滑を提供するには不十分な量で投与される。したがって、本発明に従う投与に関するルブリシンの治療有効量は、０．１μｇ／ｋｇ〜４，０００μｇ／ｋｇ、または０．１μｇ／ｋｇ〜１，０００μｇ／ｋｇ、または０．１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、または０．１〜５０μｇ／ｋｇの範囲である。もう１つの実施形態において、ルブリシンは、例えば０．１μｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬ、または１μｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、または１０μｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬの量で組織表面に適用することによって投与される。いくつかの実施形態において、ルブリシンは、用量あたり１〜１００μＬの少量で投与される。いくつかの実施形態において、ルブリシンは、１００μＬ〜４Ｌの大量で、例として浣腸として投与される。さらなる実施形態において、ルブリシンは、６０μｇ／ｍＬを超えない濃度で投与される。

[0073] 投与されるルブリシンの量は、炎症のレベルまたは位置、処置される状態の程度、患者の全身健康、薬剤、および投与経路などの変数に依存する。所望の血中レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、初回用量を、上限を超えて増加させることができる。あるいは、初回用量は、最適用量より少なくてもよく、処置の過程で用量を漸増させてもよい。最適な用量は、通例の実験によって決定することができる。

[0074] 投与の場合、ルブリシンは、好ましくは薬学的に許容される担体と組み合わせられる。本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」は、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を引き起こすことなく、妥当な利益／リスク比に釣り合って、ヒトおよび動物の組織に接触して使用するために適している緩衝液、担体、および賦形剤を意味する。担体は、製剤の他の成分と適合性であり、レシピエントに対して有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能な担体には、薬学的投与と適合性である緩衝液、溶媒、分散媒体、コーティング、等張および吸収遅延剤等が挙げられる。担体はまた、マトリクス、ハイドロゲル、ポリマー、組織足場構造、およびコラーゲンスポンジを含む吸収可能な担体材料などの生物材料を含み得る。薬学的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で公知である。有用な製剤は、薬学技術分野で周知の方法によって調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Mack Publishing Company, 1990）を参照されたい。非経口投与にとって適した製剤成分は、注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性調節剤が挙げられる。投与のためのルブリシンは、単位投与剤形で提示されてもよく、任意の適した方法によって調製することができ、意図される投与経路と適合性となるように処方すべきである。

[0075] 本発明は、ＰＲＧ４が患者に全身または局所投与され得ると企図する。局所投与は、炎症応答が特異的組織または臓器に局在して、例えば注射または局所投与によって組織または臓器に近づくことが可能である場合に是認され得る。しかし、本発明のいくつかの実施形態によって、全身投与もまた企図される。全身投与は、炎症応答が局在するが、局所投与が実現可能でないまたはそれ以外に適応される場合に是認され得る。全身投与はまた、炎症応答が、患者の１つの領域に局在していないが、患者の全身にまたは患者の１超の位置で見いだされる場合に是認され得る。さらに、炎症促進性の細胞は患者の循環系の中を移動することから、全身投与は、ＰＲＧ４が、例えば敗血症の処置において炎症促進性細胞と相互作用するおよびその活性を中和する最大の機会を確実に有するために最適な投与様式であり得る。

[0076] したがって、１つの実施形態において、ルブリシンは、炎症応答の低減もしくは阻害を達成するために、または炎症状態を処置するために全身投与される。例えば、ルブリシンは、経口、直腸内、舌下、口唇下、または口内頬側送達などの経腸投与で全身投与され得る。もう１つの実施形態において、ルブリシンは、鼻腔内、吸入、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、または経粘膜送達などの非経口的に全身投与され得る。

[0077] もう１つの実施形態において、ルブリシンは、炎症応答の低減もしくは阻害を達成するために、または炎症状態を処置するために局所投与される。例えば、ルブリシンは、体組織または臓器に局所外用的にまたは局所注射によって局所投与されてもよく、特異的な体組織または臓器に、その中に、またはその周囲にルブリシンのコーティングを提供してもよい。本発明の１つの実施形態に従って、ＰＲＧ４が局所投与される場合、これは非軟骨性、非骨性、非骨、および非関節であるが、角膜、口腔、または膀胱ではない位置、および組織に、その周囲に、またはその近位に投与される。例えば、１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、角膜もしくは周辺組織に、または軟骨性、骨、もしくは関節もしくは組織には局所投与されない。もう１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、膀胱または口に局所投与されない。しかし、もう１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、局所、例えば局所外用的にまたは注射によって眼の後部領域、皮膚、腎臓、肺、肝臓、創傷もしくは外科的切開部、甲状腺、膵臓、脾臓、胸腺、卵巣、精巣、子宮、副腎、下垂体、視床下部、尿道、前立腺、心臓、動脈もしくは血管、脳、または胃に投与される。投与はまた、直腸、鼻、耳、咽頭、喉頭、気管を含む開口部で行われる。他の投与領域には、舌、眼後部、または腫瘍部位が挙げられる。投与はまた、小腸、大腸、結腸、または食道を含む内臓に行われる。投与部位は、いくつかの実施形態において炎症部位であり得るが、他の実施形態において、投与部位は、投与しやすさに関して選択され得る。

[0078] さらなる実施形態において、ルブリシンは、甲状腺の中または甲状腺に注射することによって、痛風に関連する炎症を処置するために、甲状腺に局所投与される。もう１つの実施形態において、ルブリシンは、創傷または外科的切開部などの外傷または組織損傷部位に、その部位への注射または局所外用適用によって局所投与される。もう１つの実施形態において、ルブリシンは、局所外用投与によって皮膚に局所投与される。

[0079] 本発明の実践において使用するために、ＰＲＧ４は、担体中で、例えばリン酸緩衝食塩水に１μｇ／ｍＬ〜１，０００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１００〜５００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で懸濁して処方され得る。適した担体には、任意選択によりポリソルベートなどの界面活性剤と混合した、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（商標）（BASF, Parsippany, NJ）、またはリン酸緩衝食塩水（PBS）が挙げられる。担体は、製造および保存条件で安定でなければならず、微生物に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、およびその適した混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。

[0080] 投与のタイミングは、多様な要因および処置される状態に依存する。例えば、１つの実施形態において、慢性の状態に付随する炎症を処置するためのルブリシンの投与は、毎日、毎週、２週間に１回、１日２回、または毎月投与であり得る。もう１つの実施形態において、急性の状態に付随する炎症の処置は、例えば一定期間の静脈内点滴によるルブリシンの連続的投与を必要とし得る。

[0081] １つの実施形態において、炎症応答は、急性の炎症応答である。したがって、１つの実施形態において、本発明に従って処置される炎症状態、または患者が患っている炎症状態は、感染症、例えばウイルス、細菌、真菌、寄生虫感染症、または感染症に付随する微生物毒素への曝露；壊死、例えば虚血、外傷、物理的または化学的損傷、熱傷、または放射線によって引き起こされる壊死；破片、泥、外来組織、もしくは縫合糸、または他の医療用インプラントなどの異物；または例えばアナフィラキシー炎症に至るアレルギーなどの過敏症による免疫反応に関連するまたはそれらによって引き起こされる。もう１つの実施形態において、本発明に従って処置される炎症状態、または患者が患っている炎症状態は、持続的損傷、もしくは結核などの感染症、もしくは潰瘍；毒素への持続的曝露；アレルギー；または自己免疫状態などの慢性炎症応答に関連するまたはそれらにより引き起こされる。いくつかの慢性炎症状態には、糖尿病、がん、心血管疾患、アルツハイマー病、肺疾患（例えば、結核）、関節炎（例えば、痛風、骨関節炎）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、狼瘡、セリアック病等）、および神経科の疾患が挙げられる。

[0082] 本発明の方法によって処置され得る炎症状態には、座瘡；急性臓器不全；急性呼吸促迫症候群（ARDS）；アジソン病；アレルギー性鼻炎；同種異系移植片拒絶；円形脱毛症；アルツハイマー病；アナフィラキシー；虫垂炎；関節炎；喘息；アテローム性動脈硬化症；アトピー性皮膚炎；自己免疫性脱毛；自己免疫疾患；自己免疫性甲状腺機能亢進症；自己免疫性下垂体機能低下症；多腺性自己免疫疾患；ベーチェット病；脳損傷；気管支炎；がん；心肺バイパス症候群；心腎症候群；セリアック病；慢性光線性皮膚炎；慢性閉塞性肺疾患（COPD）；慢性腎不全；結腸炎；接触性皮膚炎；クローン病；皮膚筋炎；皮膚筋炎；糖尿病；糖尿病性網膜症；湿疹；肺気腫；異物拒絶；緑内障；糸球体腎炎；痛風；移植片対宿主病；グレーヴス病；ギラン・バレー症候群；橋本甲状腺炎；枯草熱；肝腎症候群；過敏症またはアレルギー；封入体筋炎；ウイルス、真菌、寄生虫、または微生物浸潤による感染症；炎症性腸疾患；炎症性腎疾患；熱もしくは化学物質曝露または放射線による損傷；刺激性腸症候群；虚血；肺炎症；黄斑変性；モルフェア；多発性硬化症；菌状息肉腫；心筋梗塞；壊死；非感染性肺損傷；骨関節炎；膵炎；悪性貧血；肺炎；多発筋炎；前立腺炎；偽痛風；乾癬；乾癬性関節炎；掌蹠膿疱症；壊疽性膿皮症；呼吸器アレルギー；網膜炎症；網膜炎；リウマチ性関節炎；強皮症；敗血症；血清病；セザリー症候群；シェーグレン症候群；皮膚アレルギー；卒中；全身性炎症応答症候群（SIRS）；全身性紅斑性狼瘡；全身性強皮症；Ｔ−細胞媒介性過敏疾患；移植片拒絶；銃創、ナイフ創、自動車事故、転倒、または戦闘による外傷；結核；潰瘍性大腸炎；蕁麻疹；ぶどう膜炎；心膜炎；または尋常性白斑が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。

[0083] いくつかの実施形態において、関節または骨の炎症状態および眼の炎症状態は、ＰＲＧ４の全身投与によって、ならびに眼、関節、軟骨、および骨の組織における炎症応答を低減または阻害することによって処置され得る。そのような炎症状態には、黄斑変性、ぶどう膜炎、網膜炎、ならびに骨関節炎、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎およびリウマチ性関節炎を含む関節炎が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。

[0084] ＰＲＧ４が細胞上のＣＤ４４受容体に結合するいくつかの実施形態において、細胞は、リンパ球（例えば、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、ＮＫ−細胞）、好中球、好酸球、好塩基球、および単球、マクロファージ、または樹状細胞などの白血球（すなわち、白血球）；副腎細胞；脳細胞；がん細胞；心細胞；軟骨細胞；結腸細胞；結膜細胞；角膜細胞；樹状細胞；内皮細胞；上皮細胞；線維芽細胞；胆嚢細胞；胃細胞；肝細胞；肥満細胞、樹状細胞、リンパ球、白血球またはマクロファージなどの免疫細胞；腸細胞；白血球；角膜縁細胞；肺細胞；リンパ球；マクロファージ；肥満細胞；筋細胞；神経細胞；眼球または眼細胞；骨芽細胞；破骨細胞；膵細胞；直腸細胞；腎細胞；網膜細胞；脾細胞；幹細胞；滑膜細胞；胸腺細胞；甲状腺細胞；小柱網細胞；尿道細胞；または血管細胞であり得る。しかし、この一覧は制限的ではない。

[0085] ＰＲＧ４の投与が、細胞におけるＮＦ−κＢの移行を低減または阻害するいくつかの実施形態において、細胞は、リンパ球（例えば、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、ＮＫ−細胞）、好中球、好酸球、好塩基球、および単球、マクロファージ、または樹状細胞などの白血球（すなわち、白血球）；副腎細胞；脳細胞；がん細胞；心細胞；軟骨細胞；結腸細胞；結膜細胞；角膜細胞；樹状細胞；内皮細胞；上皮細胞；線維芽細胞；胆嚢細胞；胃細胞；肝細胞；肥満細胞、樹状細胞、リンパ球、白血球またはマクロファージなどの免疫細胞；腸細胞；白血球；角膜縁細胞；肺細胞；リンパ球；マクロファージ；肥満細胞；筋細胞；神経細胞；眼球または眼細胞；骨芽細胞；破骨細胞；膵細胞；直腸細胞；腎細胞；網膜細胞；脾細胞；幹細胞；滑膜細胞；胸腺細胞；甲状腺細胞；小柱網細胞；尿道細胞；または血管細胞であり得る。しかし、この一覧は制限的ではない。

[0086] ＰＲＧ４が細胞上のＣＤ４４受容体に結合する、またはＰＲＧ４投与が細胞におけるＮＦ−κＢの移行を低減もしくは阻害するいくつかの実施形態において、細胞が、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、網膜細胞、角膜縁細胞、小柱網細胞、角膜細胞、結膜細胞、眼球細胞、または眼細胞である場合、ＰＲＧ４は、患者に全身投与される。

[0087] さらなる実施形態において、その産生がルブリシンの投与によって阻害または低減される炎症促進性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７α、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＬ−３６、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン−α）、リンホトキシン−β、ＣＸＣ３１Ｌ（フラクタルキン）、ＣＸＣＬ−８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、ＣＸＣＬ１０、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−γ、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＥＧＦ、ＧＭＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＦＡＳＬ、４−ＩＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＦＧＦ−２、ＧＲＯ、ＭＤＣ、Ｒａｎｔｅｓ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ−２、ＥＰＯ、ＭＣＳＦ、ＭＩＰ３α、ＭＧ−ＣＳＦ、またはＧＣＳＦである。さらなる実施形態において、ルブリシンの投与は、上記の炎症促進性サイトカインの１つもしくはそれ超、２つもしくはそれ超、３つもしくはそれ超、または４つもしくはそれ超のレベルを低減または阻害する。

[0088] １つの実施形態において、炎症促進性サイトカインの産生の低減または阻害は、投与前のレベルと比較してルブリシン投与後の患者から採取した体液試料中のサイトカインレベルがより低いことによって確認され得る。体液試料は、例えば、血液または血漿であり得る。所定のサイトカインレベルに及ぼすルブリシンの効果がルブリシンの投与後直ちに測定可能ではないことを考慮すると、低減または阻害は、ルブリシンの初回投与後数時間、数日、または数週間の間に観察され得る。

[0089] もう１つの態様において、本発明は、表面上に存在するＣＤ４４へのリガンドの結合を阻害する方法を提供する。この方法に従って、表面にルブリシンを曝露すると、ルブリシンはＣＤ４４に結合して、リガンドの結合を阻害する。

[0090] １つの実施形態において、表面は、哺乳動物細胞などの、ＣＤ４４を発現する細胞の表面であり得る。もう１つの実施形態において、表面は、表面プラズモン共鳴検出器の表面である。なおもう１つの実施形態において、細胞の表面はヒトの表面である。

[0091] １つの実施形態に従って、ＣＤ４４を発現する細胞には、リンパ球（例えば、Ｔ−細胞、Ｂ−細胞、ＮＫ−細胞）、好中球、好酸球、好塩基球、および単球、マクロファージ、および樹状細胞などの白血球（すなわち、白血球）；上皮細胞；内皮細胞；線維芽細胞；滑膜細胞；軟骨細胞；破骨細胞；骨芽細胞；心細胞；肥満細胞；筋細胞；肺細胞；腎細胞；肝細胞；脳細胞；脾細胞；尿道細胞；血管細胞；神経細胞；膵細胞；胃細胞；腸細胞；結腸細胞；直腸細胞、眼球細胞または眼細胞；胆嚢細胞および幹細胞が挙げられる。

[0092] もう１つの実施形態において、ＣＤ４４を発現する細胞は、新生物またはがん細胞である。１つの実施形態において、がん細胞には、乳がん細胞、結腸がん細胞、子宮内膜がん細胞、卵巣がん細胞、皮膚がん細胞、膀胱がん細胞、肝臓がん細胞、腎臓がん細胞、子宮頸がん細胞、肺がん細胞、舌がん細胞、膵臓がん細胞、非小細胞肺癌細胞、頭頚部がん細胞、前立腺がん細胞、子宮がん細胞、肝細胞癌細胞、胃がん細胞、鼻咽頭癌細胞、胆嚢がん細胞、肛門がん細胞、骨肉腫細胞、脂肪肉腫細胞、平滑筋肉腫細胞、横紋筋肉腫細胞、神経線維肉腫細胞、消化管間質腫瘍細胞、血管腫瘍細胞、線維肉腫細胞、リンパ腫細胞、および脳がん細胞が挙げられる。

[0093] 方法の１つの実施形態において、表面上に存在するＣＤ４４へのＰＲＧ４の結合によって阻害されるリガンドは、ヒアルロナン（HA）、ヒアルロナン血清由来ヒアルロナン結合タンパク質複合体（HA-SHAP）、マトリクスメタロプロテナーゼ−９、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンフォカイン、腫瘍壊死因子、増殖因子、またはホルモンであり得る。

[0094] この方法の１つの実施形態において、ルブリシンは、境界潤滑を提供するには不十分な量で提供される。本出願人は、ＣＤ４４結合に及ぼすルブリシンの効果が、境界潤滑を達成するために必要な濃度よりはるかに低い濃度で達成され得ることを決定した。したがって、１つの実施形態において、ルブリシンは、０．１μｇ／ｋｇ〜４，０００μｇ／ｋｇの範囲の量で投与される。１つの実施形態において、ルブリシンは、全身投与、すなわち静脈内、皮下、または筋肉内注射されるが、局所投与されてもよい。

[0095] １つの実施形態において、ＣＤ４４を発現する細胞は、哺乳動物細胞であり、もう１つの実施形態において、細胞はヒト細胞である。本発明は、リガンドによるＣＤ４４結合および／または活性化が関係する疾患および病的状態を処置するために多数の状況において応用され得る。

[0096] ＣＤ４４シグナル伝達が、がんの進行に関係して、同様に特定の化学療法剤の有効性を妨害し得ることが、証拠により示唆されている。例えば、デキサメタゾン、化学療法剤による処置に対する多発性骨髄腫の耐性は、ＣＤ４４とＨＡとの会合によって引き起こされ得ることが示されている（Ohwada et al., Eur J Heamatol 2008; 80:245）。したがって、１つの実施形態において、ルブリシンを使用してがん細胞表面上のＣＤ４４に結合させて、がん細胞の増殖、生存性、進行、または転移活性に関係するＣＤ４４シグナル伝達を阻害することができる。もう１つの実施形態において、ルブリシンは、がんを処置するために、または腫瘍の増殖もしくは進行を遅らせるために、がんを有するまたはがんを発症するリスクを有する患者に投与される。もう１つの実施形態に従って、ルブリシンは、がんの化学療法または放射線処置と同時に投与され得る。したがって、１つの実施形態において、ルブリシンは、がんを処置するために投与されるか、またはがんを処置するためにもう１つのがんの薬物または処置と共に投与される、がんを有する患者に投与される。１つの実施形態において、がんはヒト対象のがんである。

[0097] もう１つの実施形態において、がんは副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳがん、基底細胞皮膚がん、乳がん、キャッスルマン病、子宮頚がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、隆起性皮膚線維肉腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、眼のがん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（GIST）、胃がん、妊娠性絨毛疾患、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頚部がん、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん下咽頭がん、白血病、肺がん、肝臓がん、リンパ腫、悪性中皮腫、メルケル細胞癌、黒色腫、多発性骨髄腫、骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経内分泌がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および口咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、腎臓がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、扁平上皮がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、またはウィルムス腫瘍である。

[0098] ＣＤ４４はまた、糖尿病の進行に関係しており、ＣＤ４４の遮断が抗糖尿病効果を提供し得ることを示唆する証拠がある。ＨＡは、膵臓の島細胞に見いだされており、島細胞上のＣＤ４４にＨＡが結合すると、島細胞の炎症および破壊が起こり、それによってインスリン依存性糖尿病が起こる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、糖尿病を有するまたは糖尿病を発症するリスクを有する患者にルブリシンを投与することによって、糖尿病を予防または処置する方法を提供する。もう１つの実施形態において、ルブリシンは、ＣＤ４４に結合するために十分な濃度で膵細胞に接触し、それによって膵臓におけるＣＤ４４とＨＡの間の相互作用を阻害または低減する。

[0099] もう１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、クローン病または大腸炎などの炎症性腸疾患を処置するために使用され得る。そのような場合、ＰＲＧ４の濃縮溶液を、単純な摂取、浣腸、栄養チューブ、Ｇ−チューブ、Ｊ−チューブ、または人工肛門形成によって消化管に導入する。摂取の場合、ＰＲＧ４を、好ましくは生物分解性の錠剤、封入体、またはカプセル内に被包化してもよく、錠剤、封入体、またはカプセル剤は、患者の消化管に存在する条件に曝露された場合に分解するまたはそうでなければ解離する物質で作製される。そのような経口製剤は、徐放性送達システムとしてポリマー中に存在し得る。経口製剤は、薬物送達技術において周知であり、当業者は、そのような錠剤、封入体、またはカプセル剤を、ＰＲＧ４の摂取可能な送達に関して必要に応じて選択することができる。

[00100] もう１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、卒中、塞栓、または外傷によって引き起こされた脳の損傷を処置するために使用され得る。脳の損傷の処置のために、ＰＲＧ４の濃縮溶液を卒中、塞栓、または外傷後の脳損傷後の限られた時間内にＩＶ注射する。あるいは、ＰＲＧ４を脳手術の際に、前記手術の際の脳の位置に留置してもよい。そのような組成物の脳への投与は、血管を安定化させて、血管の透過性を制限し、同様に抗炎症効果を与えるように設計される。

[00101] もう１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、アレルギーおよび／または呼吸器感染症に関連する症状を低減するために使用され得る。そのような症状には、例を挙げれば、うっ血、後鼻漏、咳、くしゃみ、鼻水、いがらっぽい喉、皮膚の痒み、および痒い涙目が挙げられる。本発明の１つの実施形態において、アレルギー症状を患っているまたは発症するリスクを有する患者の体表面、例えば、皮膚または呼吸器、例えば上気道に、症状を改善するために十分量のＰＲＧ４含有組成物を投与する工程を含む、そのような症状を示すまたはそのような症状を発症するリスクを有する患者を処置する方法が提供される。本実施形態の方法は、少なくとも１つのアレルギーおよび／または上気道感染症の症状を改善するために十分な量のＰＲＧ４を含む鼻腔内組成物の量を患者の鼻または鼻腔の粘膜表面に鼻腔内に沈着させることを含み得る。１つの実施形態において、ＰＲＧ４含有鼻腔内組成物は、経鼻スプレーとして投与される。

[00102] アレルギーは、ある種の炎症であり、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、およびいくつかの眼のアレルギー疾患などの病気を含む適応免疫応答である。これは、抗原チャレンジに対するＴｈ２媒介性の液性応答によって特徴付けられる。典型的なＩ型過敏性アレルギー反応において、アレルゲンに最初に曝露されると、Ｂ細胞は、ＩｇＥ抗体を産生し、これは肥満細胞／好塩基球の表面に結合して、それらの細胞をアレルゲンに対して感作する。同じ抗原にその後曝露されると、肥満細胞が即時に脱顆粒を起こし、ヒスタミン、プロスタグランジン、ロイコトリエン（LTC4、LTD4、LTE4）、ケモカイン（CXCL8、CXCL10、CCL2、CCL4、CCL5）、プロテアーゼ（トリプターゼ、キマーゼ）、ならびにＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３などのサイトカインを放出する（Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. New York: Garland Science 2001; Larche et al., Nat Rev Immunol. 2006; 6（10）:761-71）。これらのエフェクター分子は、小さい血管の拡張、血管透過性の増加、大量の粘液産生、および平滑筋の局所収縮を引き起こし、それによって、アレルギー反応に関連する周知の症状が起こる。数時間後に、アレルギー反応の後期相により、好酸球、好塩基球、およびＴｈ２リンパ球が反応部位に動員される。好酸球は、好酸球カチオン性タンパク質、主要塩基性タンパク質、好酸球ペルオキシダーゼ、および好酸球由来神経毒などの一連の顆粒タンパク質、ならびに酸化的ストレスおよびリボヌクレアーゼ活性を通して領域をきれいにするように作用する一連の活性酸素種（過酸化物）を放出する。好酸球の応答は、浸潤する生物に対して毒性であるが、アレルギー反応の近位で宿主細胞も同様に破壊する。

[00103] 組織損傷および炎症細胞動員の陽性のフィードバックループが確立された後、当初のアレルゲンへの持続的な曝露がないにもかかわらず、慢性炎症状態が持続することがある（Murdoch JR, Lloyd CM. Chronic Inflammation and Asthma. Mutat Res. 2010; Aug 7;690（1-2）:24-39. doi: 10.1016/j.mrfmmm.2009.09.005. Epub 2009 Sep 19）。特に慢性炎症は組織のリモデリングを伴い、それによって、上皮障壁機能の障害、マトリクスメタロプロテナーゼ発現の障害、および粘液腺の肥大ならびにＴＧＦ−β媒介性線維症が起こる（Murdoch et al.）。例として、慢性喘息では好酸球媒介性損傷および線維芽細胞によるその後のマトリクス合成のサイクルが繰り返されることによって、気道は肥厚して狭窄し、弾性が低くなり、この気道のリモデリングは障害の慢性度に直接関連している（Murdoch et al.）。主要な喘息治療は炎症の低減（コルチコステロイド）をねらいとしており、リモデリングの改善に示す効能は限定的であることは注目に値する（Murdoch et al.; Ward C, Walters H., Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2006; Feb;5（1）:43-8）。そのような異常な組織リモデリングおよびＴＧＦ−β媒介性線維症はまた、患者内の部位での繰り返し手術に関連することが見出され得る。

[00104] したがって、本発明の１つの実施形態において、ＰＲＧ４含有組成物を、慢性アレルギー応答を有する組織に適用することは、エアロゾル化ＰＲＧ４の吸入によるアレルゲンクリアランスの改善ならびに炎症の低減により恩典が得られるであろう。そのような組成物の境界潤滑能はまた、上皮への粘液微粒子の接着を防止すると共に、非常に高い電荷を有するＰＲＧ４分子が吸湿性であり、上皮との界面に沿って水を保持することから、水和を改善する。ＰＲＧ４含有組成物の適用後の組織表面潤滑の改善により、微粒子（大量のムチン、破片、およびアレルゲンを含む）と上皮間の摩擦が低減されることから、アレルゲンの力学的クリアランスに必要な力はより小さくなる。摩擦がより少なくなることによって、例えば気流および粘膜繊毛クリアランス（呼吸器系）を通しての力学的クリアランスに必要な力はより小さくなり、その結果組織損傷および炎症がより少なくなる。慢性アレルギーを患っている患者へのＰＲＧ４含有組成物の投与はまた、線維芽細胞の接着の防止を通して線維症を緩和させ、線維症応答全体を低減させる。

[00105] 理論に拘束されたくはないが、本発明のこの態様は、免疫調節障害またはアレルゲンへの慢性的曝露に関連する続発症によって、抗原、ＰＡＭＰ、およびＤＡＭＰの力学的クリアランスの障害、ならびに繰り返しリモデリングに関連する組織機能の障害が起こり得るという認識に一部基づいている。ルブリシンは、アレルゲンまたは細胞破片の力学的クリアランスを促進することができる。これらのプロセスは炎症を増強するのみならず、呼吸器、眼、または皮膚などの組織に対する長期障害を引き起こし、陽性のフィードバックループ条件が類似であると考えられる。

[00106] さらなる証拠により、ＣＤ４４−ＨＡ相互作用によって、しばしば糖尿病に関連する状態である脾臓の腫脹が起こり得ることが示唆されている。したがって、本発明の１つの態様は、脾臓の炎症および腫脹を防止するために、脾臓にルブリシンを接触させる方法を提供する。もう１つの実施形態において、ルブリシンを、ＣＤ４４に結合するために十分な濃度で脾細胞に接触させて、それによって脾臓における腫脹および炎症を低減させる。

[00107] ＣＤ４４はまた、滑膜組織にも存在し、リウマチ性関節炎を有する患者において上方調節されている。ＣＤ４４発現滑膜細胞が、ヒトリウマチ性関節炎患者から得た滑膜液中のＨＡ−ＳＨＡＰに結合することが示されている。形成される複合体の量は、炎症の程度に正比例する。このことは、実施例４に示されるデータによって証明される。したがって、ルブリシンの全身投与は、リウマチ性関節炎を患っている患者において炎症を減少させるための処置として適応される。１つの実施形態において、ルブリシンは、ＣＤ４４上方調節の効果を遮断して、炎症を低減するために、リウマチ性関節炎を有する患者に全身投与される。１つの実施形態において、ルブリシンは、静脈内経路を通して定期的に投与される。もう１つの実施形態において、ルブリシンは、外部の携帯型ポンプを通して、皮下留置カテーテルによって送達される。

[00108] ＣＤ４４−ＨＡ相互作用はまた、血液−網膜障壁での有害な白血球移動および前眼部免疫病理学（Xu H, et al. Journal of Leukocyte Biology 2002; 72（6）:1133-41）、ならびに可溶性のＣＤ４４レベルと視野喪失の重症度との間に有意な相関が見出されている緑内障（Mokbel TH et al., Clin Experiment Ophthalmol. 2010 Aug;38（6）:560-5）において重要な役割を有し得る。１つの態様において、ｒｈＰＲＧ４は、ＣＤ４４に拮抗して、ＨＡ相互作用を阻止するために眼に投与される。１つの実施形態において、注射されたｒｈＰＲＧ４は、炎症を低減させて、血流を改善させ、網膜細胞の生存性を改善する。もう１つの実施形態において、眼に注射されたｒｈＰＲＧ４は、原発開放隅角緑内障におけるＣＤ４４媒介性小柱網の目詰まりを防止して、それによって眼内圧を低下させる。もう１つの実施形態において、ｒｈＰＲＧ４は、房水内の可溶性ＣＤ４４を不活化して、それによって可溶性ＣＤ４４の細胞障害性を防止する。もう１つの実施形態において、ｒｈＰＲＧ４は、膜貫通ＣＤ４４に拮抗して、細胞外ドメインのメタロプロテナーゼによる切断を阻止して、可溶性ＣＤ４４の増加を防止する。もう１つの実施形態において、ルブリシンを眼に注射すると、後部ぶどう膜炎に関連する、飛蚊症、かすみ目、および光視症などの眼の続発症を低減させる。もう１つの実施形態において、ルブリシンを眼に注射すると、低分子量ＨＡ分解産物の会合体が相互作用するのを防止することによって、ＣＤ４４およびＲＨＡＭＭ媒介性血管新生および内皮細胞遊走を阻止する。他の実施形態は、黄斑変性、網膜炎、網膜血管炎、網脈絡膜炎、血管新生、および糖尿病性網膜症のＣＤ４４媒介性の進行を予防するために、ルブリシンの注射または眼への局所外用適用が挙げられる。例えば、局在化の眼の環境を考慮して、ルブリシンは、０．１μｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬの量で、用量あたり少量（１〜１００μＬ）で投与される。

[00109] 本発明のなおもう１つの実施形態において、ｒｈＰＲＧ４は、上記の方法および組成物を使用して、非ＣＤ４４媒介性眼障害を処置するために利用され得る。そのような場合、ルブリシンの注射または局所外用適用は、黄斑変性、網膜炎、網膜血管炎、網脈絡膜炎、血管新生、および糖尿病性網膜症の非ＣＤ４４媒介性の進行を防止するために使用され得る。

[00110] もう１つの態様において、本発明は、炎症促進性サイトカインレベルを阻害または低減するために十分量のＰＲＧ４を全身的に、吸入的に、または局所外用的に投与することを含む、体における炎症促進性サイトカインレベルを低減または阻害する方法を提供する。１つの実施形態において、方法は、１つの炎症促進性サイトカインレベルを低減または阻害するが、別の実施形態では、方法は、１つ超の炎症促進性サイトカインレベルを低減または阻害する。血液中の炎症促進性サイトカインレベルを増加させ、本発明に従って処置される患者が患っている炎症応答を引き起こす例示的な炎症状態、損傷、および自己免疫状態は、本出願を通して開示されている。

[00111] １つの実施形態に従って、その産生がルブリシンの投与によって阻害または低減され得るサイトカインには、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７α、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＬ−３６、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン−α）、リンホトキシン−β、ＣＸＣ３１Ｌ（フラクタルキン）、ＣＸＣＬ−８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、ＣＸＣＬ１０、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−γ、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＥＧＦ、ＧＭＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＦＡＳＬ、４−ＩＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＦＧＦ−２、ＧＲＯ、ＭＤＣ、Ｒａｎｔｅｓ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ−２、ＥＰＯ、ＭＣＳＦ、ＭＩＰ３α、ＭＧ−ＣＳＦ、またはＧＣＳＦが挙げられる。

[00112] １つの実施形態において、血液はヒト血液である。さらなる実施形態において、血液は、炎症応答または炎症状態を有するヒト患者の血液である。１つの実施形態において、炎症応答または状態は、組織に対する損傷の結果であるが、他の実施形態において、炎症応答は自己免疫状態の結果であり、なお他の実施形態において、炎症応答は細菌もしくはウイルス感染症または毒素の存在の結果である。なおもう１つの実施形態において、患者は、敗血症を患っているまたは敗血症のリスクを有する。

[00113] さらなる実施形態において、ヒト細胞は、肥満細胞、樹状細胞、リンパ球、白血球、またはマクロファージなどの免疫細胞；上皮細胞；内皮細胞；線維芽細胞；滑膜細胞；軟骨細胞；破骨細胞；骨芽細胞；心細胞；肥満細胞；肺細胞；腎細胞；肝細胞；脳細胞；脾細胞；膀胱または尿道細胞；血管細胞；神経細胞；膵細胞；胃細胞；腸細胞；結腸細胞；直腸細胞；網膜細胞；角膜縁細胞；小柱網細胞；角膜細胞；結膜細胞；眼球または眼細胞；胆嚢細胞；またはがん細胞である。

[00114] １つの実施形態において、ルブリシンは、境界潤滑を提供するには不十分な量で投与され、すなわち、ルブリシンは、０．１μｇ／ｋｇ〜４，０００μｇ／ｋｇの範囲で投与される。もう１つの実施形態において、ルブリシンは、０．１μｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬの量で、用量あたり１〜１００μＬの少量で投与される。もう１つの実施形態において、ルブリシンは、用量あたり１００μＬ〜４Ｌの量で投与される。１つの実施形態において、ルブリシンは、全身投与によってヒト患者に提供される。

[00115] 特定の実施形態において、細胞は、例えばＬＰＳ、フラジェリン等などのウイルスまたは細菌毒素への曝露によって引き起こされた敗血症を患っているまたは敗血症を発症するリスクを有する患者の細胞である。したがって、１つの態様において、ルブリシンは、敗血症の処置として適応される。

[00116] さらなる態様において、本発明は、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化を阻害するＰＲＧ４を細胞に接触させることによって、細胞におけるＮＦ−κＢの移行を阻害する方法を提供する。１つの実施形態において、ＰＲＧ４は、ＣＤ４４に結合することによって、またはＣＤ４４シグナル伝達を低減もしくは阻害することによって、または他の細胞表面結合受容体と相互作用することによって、ＮＦ−κＢの移行を間接的に阻害する。ＰＲＧ４は、本明細書において上記の本発明の実施形態に従って、全身投与などによって投与され得る。細胞は、ヒト細胞であり得て、特に本発明に関連して本明細書において記述される例示的な任意のヒト細胞であり得る。

[00117] さらなる実施形態において、ＰＲＧ４媒介性のＮＦ−κＢの移行の低減または阻害によって、血液中の炎症促進性サイトカインレベルの低減が起こり、それによって炎症状態を処置するために使用され得る。例示的な炎症状態は、本出願を通して記述されている。

実施例１：ＰＲＧ４がＣＤ４４に拮抗してＣＤ４４媒介性の炎症経路を阻害する実験的証拠
[00118] ヒトプロテオグリカン４とＣＤ４４受容体との相互作用、および炎症促進性サイトカイン誘導性の滑膜細胞増殖に及ぼすこの相互作用の結果を評価するために、以下の実験を実施した。

[00119] ＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４の結合および高分子量ヒアルロン酸（HMWHA）との競合を、直接酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）および表面プラズモン共鳴を使用して評価した。ｒｈＰＲＧ４のシアリダーゼ−ＡおよびＯ−グリコシダーゼ消化を行って、ＣＤ４４結合を、ＥＬＩＳＡを使用して評価した。リウマチ性関節炎線維芽細胞様滑膜細胞（RA-FLS）を、２０、４０、および８０μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４またはＨＭＷＨＡの存在下または非存在下で、インターロイキン−１β（IL-1β）または腫瘍壊死因子α（TNF-α）によって４８時間刺激して、細胞増殖を測定した。抗ＣＤ４４抗体（IM7）と同時インキュベートすることによって、ＣＤ４４の関与を評価した。ｒｈＰＲＧ４の抗増殖効果を、ＩＭ７の存在下または非存在下でＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αによるＰｒｇ４−／−滑膜細胞の処置後に調べた。

[00120] 最初に、変数を正規性および等分散に関して調べた。両方の仮定を満たした変数を、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定、または分散分析（ANOVA）の後に２群の比較および２超の群の比較に関するテューキーの事後検定を使用して統計学的有意性に関して試験した。正規性仮定を満たさなかった変数を、ランクについてマン・ホイットニーのＵ検定またはＡＮＯＶＡを使用して検定した。統計学的有意性の水準を、α＝０．０５に設定した。データを、平均値±標準偏差としてグラフ表示する。

１Ａ．直接ＥＬＩＳＡを使用した、ＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４、高分子量ＨＡ、中分子量ＨＡ、およびビトロネクチンの結合
[00121] 高結合マイクロタイタープレート（Corning, Sigma Aldrich, USA）を、ＰＢＳ緩衝液（ウェルあたり１００μＬ）中で４００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４（Ｍｒ≒２４０ＫＤａ）、高分子量ＨＡ（HMW HA;Ｍｒ≒１，５００ＫＤａ）（R & D System, USA）、中分子量ＨＡ（MMW HA;Ｍｒ≒３００ＫＤａ）（R & D System）およびビトロネクチン（Ｍｒ≒７５ＫＤａ）（Sigma Aldrich）によって４℃で一晩コーティングした。ｒｈＰＲＧ４は、ＣＨＯ−Ｍ細胞（Lubris, Framingham, MA, USA）により産生された完全長の産物である。ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０によって洗浄後、ウェルを２％ウシ血清アルブミン（BSA、３００μＬ／ウェル）によって室温で少なくとも２時間ブロックした。各１μｇ／ｍＬ（ウェルあたり１００μＬ）のＣＤ４４−ＩｇＧ_１Ｆｃ（R & D systems）またはＩｇＧ_１Ｆｃ（R & D systems）をプレートに加えて、室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０によって洗浄後、抗ＩｇＧ_１Ｆｃ−ＨＲＰ（Sigma Aldrich）を１：１０，０００希釈（ウェルあたり１００μＬ）で加えて、室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アッセイを１ステップＴｕｒｂｏＴＭＢＥＬＩＳＡ試薬（ThermoScientific, USA）を使用して発色させ、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。データは、それぞれ１群あたりウェル３重測定の独立したアッセイ４回の平均値を表す。

[00122] ＣＤ４４−ＩｇＧ_１Ｆｃ融合タンパク質およびＩｇＧ_１ＦｃへのｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷＨＡ、ＭＭＷＨＡ、およびビトロネクチンの結合を図１Ａに表す。ＣＤ４４−ＩｇＧ_１Ｆｃ群における４５０ｎｍの吸光度は、ｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷＨＡ、およびＭＭＷＨＡコーティングウェルに関してＩｇＧ_１Ｆｃ群の吸光度より有意に高かった（ｐ＜０．００１）。これに対し、ビトロネクチンコーティングウェルではＣＤ４４−ＩｇＧ_１ＦｃとＩｇＧ_１Ｆｃとの間に有意差はなかった。

[00123] これらのデータは、ｒｈＰＲＧ４がＣＤ４４に結合して、ＨＭＷＨＡのＣＤ４４結合を妨害することを示している。ｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷＨＡおよびＭＭＷＨＡは、キメラＣＤ４４に対して、極めて低い非特異的結合で特異的に結合する。これに対し、ルブリシンと有意な配列相同性を共有するビトロネクチンは、ＣＤ４４結合に対していかなる特異性も示さない。ｒｈＰＲＧ４がＣＤ４４に結合することから、これはＣＤ４４のアンタゴニストとして機能して、それによってＣＤ４４炎症促進性シグナル伝達を妨害し得る。

１Ｂ．直接ＥＬＩＳＡを使用した、ＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷＨＡ、およびＭＭＷＨＡの濃度依存的結合ならびにＣＤ４４への結合に関するｒｈＰＲＧ４とＨＡとの競合
[00124] ＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷＨＡ、およびＭＭＷＨＡの濃度依存的結合を、４００，２００、１００、２０、４、２、および０．１μｇ／ｍＬの高分子によってマイクロタイタープレートをコーティングすることによって実施した。アッセイは上記の通りに実施した。ＩｇＧ_１Ｆｃウェルの吸光度の値をＣＤ４４−ＩｇＧ_１Ｆｃウェルの吸光度の値から差し引いて、補正されたＣＤ４４ＩｇＧ_１Ｆｃ吸光度値を４００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４群の値に対して標準化して、データをＣＤ４４への結合百分率として表記した。組換えＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷＨＡ、およびＭＭＷＨＡの濃度依存的結合を図１Ｂに表す。組換えＣＤ４４結合百分率は、４００、１００、２０、４、および２μｇ／ｍＬ濃度のＨＭＷＨＡまたはＭＭＷＨＡコーティングウェルと比較して、ｒｈＰＲＧ４コーティングウェルにおいて有意に高かった（ｐ＜０．００１）。さらに、組換えＣＤ４４結合百分率は、２００μｇ／ｍＬ濃度のＭＭＷＨＡコーティングウェルと比較してｒｈＰＲＧ４コーティングウェルにおいて有意に高かった（ｐ＜０．００１）。０．１μｇ／ｍＬ濃度では、ｒｈＰＲＧ４、ＨＭＷＨＡ、およびＭＭＷＨＡコーティングウェルにおけるＣＤ４４結合百分率に有意差はなかった。データはそれぞれ１群あたりウェル３重測定の独立したアッセイ４回の平均値を表す。

[00125] ＣＤ４４への結合に関するｒｈＰＲＧ４とＨＭＷＨＡまたはＭＭＷＨＡのいずれかとの間の競合を評価するために、マイクロタイタープレートを１μｇ／ｍＬ（１００μＬ／ウェル）のＣＤ４４−ＩｇＧ_１ＦｃまたはＩｇＧ_１Ｆｃのいずれかによって４℃で一晩コーティングした。次に、ウェルをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０によって洗浄して、２％ＢＳＡ（３００μＬ／ウェル）を使用して室温で少なくとも２時間ブロックした。５μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４、またはｒｈＰＲＧ４（５μｇ／ｍＬ）と０．０１、０．０５、０．２５、１、５、もしくは５０μｇ／ｍＬのＨＭＷＨＡもしくはＭＭＷＨＡとの組み合わせをウェルに加えて（１００μＬ／ウェル）、室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０によって洗浄後、ルブリシン特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ９Ｇ３）を１：１０００（１００μＬ／ウェル）で加えて、室温で６０分間インキュベートした。ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０によって洗浄後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Thermo Scientific）の１：１，０００希釈液を加えて（１００μＬ／ウェル）、室温で６０分間インキュベートした。アッセイは上記の通りに行った。ＩｇＧ_１Ｆｃウェルの吸光度の値を、ＣＤ４４−ＩｇＧ_１Ｆｃウェルの吸光度の値から差し引いて、ｒｈＰＲＧ４＋ＨＡ群の補正吸光度の値をｒｈＰＲＧ４群の吸光度の値に対して標準化して、データをＣＤ４４への結合百分率として表記した。データは、それぞれ１群あたりウェル３重測定の独立したアッセイ４回の平均値を表す。

[00126] 組換えＣＤ４４への結合におけるｒｈＰＲＧ４とＨＭＷＨＡまたはＭＭＷＨＡとの間の競合を、図１Ｃに表す。０．０５、０．２５、１、５および２５μｇ／ｍＬのＨＭＷＨＡまたはＭＭＷＨＡは、ＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４の結合を有意に低減させた（ｐ＜０．０５）。

[00127] これらのデータは、ｒｈＰＲＧ４が、ＨＭＷＨＡと同等の親和性で濃度依存的にＣＤ４４に結合することを証明する。さらに、ｒｈＰＲＧ４は、ＣＤ４４との結合に関してＨＭＷＨＡと競合する。過剰量のＨＭＷＨＡまたはＭＭＷＨＡの存在は、ＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４の結合をおよそ５０％低減させた。これらのデータは、ｒｈＰＲＧ４がＣＤ４４のアンタゴニストであり、したがってＣＤ４４炎症促進性シグナル伝達を妨害する能力を有することを示唆している。

１Ｃ．表面プラズモン共鳴を使用した、ＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４の濃度依存的結合およびｒｈＰＲＧ４とＨＭＷＨＡとの間の競合
[00128] ｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４−ＩｇＧＦｃへの結合を、表面プラズモン共鳴（Biacore T100, GE Healthcare Lifesciences, NJ, USA）を使用して調べた。図１Ｃを参照されたい。ヒト抗体捕捉キット（GE Life Sciences）を使用して一連のＳチップを官能化して、ＣＤ４４−ＩｇＧ_１ＦｃまたはＩｇＧ_１Ｆｃのいずれかを、フローセル１（Fc₁）およびフローセル２（Fc₂）における官能化チップの表面にそれぞれ結合させた。ｒｈＰＲＧ４を、濃度３００、２５０、２００、１５０、１００、および５０μｇ／ｍＬで３０μＬ／分で８分間注入した後、０．１％ＨＥＰＥＳ、１．５ＭＮａＣｌ、３０ｍＭＥＤＴＡ、および０．５％Ｐ２０（GE Life Sciences）を使用して１０分間解離させた。チップの表面を、各サイクルの終了時に３ＭＭｇＣｌ_２の１分間のパルスによって再生した。各検体濃度を二連で注入した。得られた曲線を二重に参照した（すなわち、Fc₂-Fc₁、０μｇ／ｍＬ曲線を差し引いた後）。結合速度論および結合親和性は、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアによって１：１結合／コンフォメーショナル変化モデル、または定常状態平衡をそれぞれ使用して決定した。ＣＤ４４への結合に関するｒｈＰＲＧ４とＨＭＷＨＡの間の競合を調べるために、ｒｈＰＲＧ４を、上記のように０〜３００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で注入した。解離相の終了後、ＨＭＷＨＡを５０μｇ／ｍＬ（３０μＬ／分）で１分間注入した。次に、ＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４（様々な濃度）の二重参照結合シグナルを、ｒｈＰＲＧ４注入後のＣＤ４４へのＨＭＷＨＡの結合によって生成された結合シグナルに対してプロットした。

[00129] 組換えＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４の結合を、表面プラズモン共鳴を使用して確認した。ｒｈＰＲＧ４は、固定されたＣＤ４４−ＩｇＧ_１Ｆｃに対して濃度依存的会合および解離を示し（図２Ａ）、ｒｈＰＲＧ４の分子量２４０ｋＤａに基づいて、見かけのＫ_ｄ≒３８ｎＭであった。ｒｈＰＲＧ４は、ＨＭＷＨＡ結合シグナル強度（ｘ−軸）とｒｈＰＲＧ４結合シグナル強度（ｙ−軸）の間の反比例関係によって示されるように、組換えＣＤ４４へのＨＭＷＨＡの結合を妨害した（図２Ｂ）。

[00130] これらのデータは、ｒｈＰＲＧ４がＨＭＷＨＡと同等の親和性で濃度依存的にＣＤ４４に結合することを証明している。さらに、実施例１Ｂおよび１Ｃに証明されるように、ＣＤ４４に結合したｒｈＰＲＧ４の存在は、ＨＭＷＨＡがＣＤ４４に結合するのを濃度依存的に防止し、ｒｈＰＲＧ４およびＨＭＷＨＡが、受容体上の共通の結合部位を共有することを示し得る。ＨＡＳＦ濃度がルブリシンの濃度のほぼ１０倍高い関節の環境においても、本明細書において示される競合的結合データに基づくと、ルブリシンは、滑膜細胞および軟骨細胞表面上のＣＤ４４に結合して、ＨＡの存在下でもＣＤ４４媒介性生物機能を発揮することができ、それによってそうでなければ炎症を促進するメディエータを妨害することによって関節の恒常的役割を提供すると予想される。

１Ｄ．ＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４の結合に及ぼすムチンドメイングリコシル化の除去の影響
[00131] ルブリシンの境界潤滑能は、Ｏ−結合（β１−３）Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃオリゴ糖によって媒介される（Jay et al., Glucoconj J 2001; 18（10）:807-15）。ノイラミニダーゼとβ１，３，６ガラクトシダーゼ消化とを組み合わせると、ルブリシンの境界潤滑能が５０％低減した（Jay et al., Glucoconj J 2001; 18（10）:807-15）。ＲＡＳＦ試料から単離されたルブリシンは、増加したコア１グリコシル化構造を含有し、Ｌ−セレクチンリガンドの一部であると提唱される硫酸化エピトープを示す（Estrella et al., Biochem J 2010; 429（2）:359-67）。さらに、ＲＡＳＦからのルブリシンは、グリコシル化依存的にＬ−セレクチンに結合して、ＲＡを有する患者の炎症を有する滑膜およびＳＦに動員された多形核顆粒球を覆う（Jin et al. J Biol Chem 2012; 287（43）:35922-33）。

[00132] ｒｈＰＲＧ４を、シアリダーゼＡ（Prozyme, USA）、Ｏ−グリコシダーゼ（New England Biolabs, USA）またはシアリダーゼ−ＡとＯ−グリコシダーゼの組み合わせを使用して、３７℃で１６時間消化した。シアリダーゼＡ消化において、酵素（１Ｕ／２００μＬ）１２μＬを、ｒｈＰＲＧ４に総反応容積１８０μＬおよびｒｈＰＲＧ４の最終濃度３００μｇ／ｍＬとなるように加えた。Ｏ−グリコシダーゼ消化において、酵素（４千万単位／ｍＬ）４．８μＬをｒｈＰＲＧ４に総反応容積１８０μＬおよびｒｈＰＲＧ４の最終濃度３００μｇ／ｍＬとなるように加えた。シアリダーゼ−ＡおよびＯ−グリコシダーゼ消化において、酵素を上記と同じ容量で使用して、上記と同じ総反応容積および最終ｒｈＰＲＧ４濃度でｒｈＰＲＧ４と共にインキュベートした。ｒｈＰＲＧ４の見かけの分子量に及ぼすシアリダーゼ−ＡおよびＯ−グリコシダーゼ消化の効果を、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（NuPage, life technologies, USA）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。ｒｈＰＲＧ４または酵素消化ｒｈＰＲＧ４の全量２０μＬを還元条件（２００ｍＶで６０分間）で泳動させた後、ＧｅｌｃｏｄｅＢｌｕｅＳｔａｉｎ（Thermo Scientific, USA）を使用して染色した。酵素消化されたｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４への結合を、上記の直接ＥＬＩＳＡアプローチおよび３０μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４コーティング濃度を使用して非消化ｒｈＰＲＧ４と比較した。データは、それぞれ１群あたりウェル３重測定の独立した実験４回の平均値を表す。

[00133] シアリダーゼ−Ａ消化によって、図３Ａに示されるように、無処置対照と比較してＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４の結合百分率の有意な増加（ｐ＜０．００１）が起こった。同様に、Ｏ−グリコシダーゼ消化によって、無処置対照と比較してＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４の結合百分率の有意な増加（ｐ＝０．００８）が起こった。シアリダーゼ−Ａ消化およびＯ−グリコシダーゼ同時消化ｒｈＰＲＧ４の間の百分率ＣＤ４４結合に有意差はなかった（ｐ＝０．１０５）。シアリダーゼ−ＡおよびＯ−グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４への結合百分率は、シアリダーゼ−Ａ消化ｒｈＰＲＧ４（ｐ＝０．００７）、Ｏ−グリコシダーゼ消化ｒｈＰＲＧ４（ｐ＜０．００１）、および無処置対照（ｐ＜０．００１）より有意に高かった。ｒｈＰＲＧ４をシアリダーゼ−ＡおよびＯ−グリコシダーゼによって消化すると、ｒｈＰＲＧ４の見かけの分子量はおよそ２００ｋＤａに低減された（図３Ｂ）。

[00134] シアル酸の除去およびＯ−グリコシル化は、ｒｈＰＲＧ４によるＣＤ４４結合を有意に増加させた（ｐ＜０．００１）。シアリダーゼ−ＡおよびＯ−グリコシダーゼ処置によって、個々に、ＣＤ４４受容体へのｒｈＰＲＧ４の結合が増強した。累積的なシアリダーゼ−ＡおよびＯ−グリコシダーゼ消化によって、個々の酵素消化と比較してｒｈＰＲＧ４によるＣＤ４４へのさらにより有意な結合が起こった。シアリダーゼ−Ａは、糖タンパク質から分岐および非分岐の末端シアル酸残基を切断するが、Ｏ−グリコシダーゼは、糖タンパク質からのコア１および２の除去を触媒する。ＣＤ４４結合の増強は、コア１グリコシル化もシアル酸末端残基のいずれもＣＤ４４へのｒｈＰＲＧ４の結合にとって必要ではないことを示している。したがって、ｒｈＰＲＧ４タンパク質に及ぼすシアリル化およびコア１グリコシル化のレベルは、ＰＲＧ４のＣＤ４４への結合能にとって必須ではない。これに対し、これらの残基の除去によって、ｒｈＰＲＧ４の半剛性の棹状構造のコンフォメーションの変化が起こり、それによってＣＤ４４との相互作用が増強され得る。

１Ｅ．炎症促進性サイトカイン誘導性のリウマチ性関節炎線維芽細胞様滑膜細胞の増殖およびｒｈＰＲＧ４またはＨＭＷＨＡ処置の影響
[00135] ＲＡを有する患者の滑液は、かなりの量の様々なＣＤ４４アイソフォームを含有し、これらは一般的にＯＡまたは正常な滑膜と比較して多量に存在する（Naor et al., Arthritis Res Ther 2003;5（3）:105-15; . Grisar et al., Clin Exp Rheumatol 2012; 30（1）:64-72）。リウマチ性関節炎線維芽細胞様滑膜細胞（RA-FLS）は、ＲＡを有する患者の滑液の浸潤性において重要な役割を果たしている。独自のＣＤ４４変種（CD44v7/8）の発現は、ｉｎｖｉｔｒｏでのＲＡ−ＦＬＳの増殖（Wibulswas et al., Am J Pathol 2000;157（6）:2037-2044）に関与しており、細胞表面ＣＤ４４に結合してその後受容体が切断される薬剤は、実験的関節炎モデルにおいて効能を示している（Runnels et al. Adv Ther 2010; 27（3）:168-80）。

[00136] これらの実験を実施するために、継代３〜６回目のリウマチ性関節炎線維芽細胞様滑膜細胞（RA-FLS；Cell Applications, USA）を使用した。滅菌９６ウェルプレートにおいて、ＲＡ−ＦＬＳ（８０μＬ中に細胞５，０００個／ウェル）を、１％ＦＢＳおよび１ｍＭピルビン酸塩を添加したＤＭＥＭ中で培養して、最終濃度２０、４０、または８０μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４またはＨＭＷＨＡの非存在下または存在下で、２０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトインターロイキン−１β（IL-1β；R & D systems）、または５ｎｇ／ｍＬ腫瘍壊死因子α（TNF-α；R & D systems）によって３７℃で４８時間刺激した。各ウェルの総容積は２００μＬであった。炎症の指標である細胞増殖は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ＡＱｕｅｏｕｓ１ボトル溶液細胞増殖アッセイ（MTS; Promega, USA）を使用して決定し、４９０ｎｍでの吸光度を決定した。データは、無処置対照ＲＡ−ＦＬＳと比較した４９０ｎｍでの吸光度の倍変化の数値として表す。データは、１つの処置あたり少なくともウェル３重測定の独立した実験３回の平均値を表す。ＣＤ４４のｒｈＰＲＧ４またはＨＭＷＨＡの効果への寄与を評価するために、ＲＡ−ＦＬＳを上記のＩＬ−１βまたはＴＮＦ−αで刺激した。ｒｈＰＲＧ４またはＨＭＷＨＡによる処置は、全てのＣＤ４４アイソフォームに対して保存されたエピトープを認識するＣＤ４４中和抗体であるＩＭ７（Abcam, USA）（Samson et al., Exp Eye Res, 2014; 127C:14-19）の１：２００の最終希釈液の非存在下または存在下で８０μｇ／ｍＬの最終濃度で実施した。各ウェルの総容量は２００μＬであった。実験群の細胞増殖を上記のように決定して、データを、無処置対照ＲＡ−ＦＬＳと比較した４９０ｎｍ吸光度の倍変化の数値として表記する。データは、１つの処置あたりウェル少なくとも３重測定の独立した実験３回の平均値を表す。

[00137] ４８時間の間にＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αによって誘導されたＲＡ−ＦＬＳ増殖を、図４Ａに示す。４０および８０μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４またはＨＭＷＨＡによる処置は、ＩＬ−１β刺激によるＲＡ−ＦＬＳ増殖を有意に抑制した（ｐ＜０．０５）。２０、４０、および８０μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４による処置は、ＴＮＦ−α刺激によるＲＡ−ＦＬＳ増殖を有意に抑制した（ｐ＜０．０５）。ＨＭＷＨＡによる処置では、ＴＮＦ−αによるＲＡ−ＦＬＳ増殖の抑制が起こらなかった。図４Ｂに示すように、ｒｈＰＲＧ４＋ＩＭ７またはＨＭＷＨＡ＋ＩＭ７によって処置したＩＬ−１β刺激ＲＡ−ＦＬＳと、ＩＬ−１β刺激ＲＡ−ＦＬＳとの間の吸光度の変化に有意差がなかったことから示されるように、ＩＭ７抗ＣＤ４４抗体による同時処置は、ＩＬ−１β刺激ＲＡ−ＦＬＳに及ぼすｒｈＰＲＧ４およびＨＭＷＨＡの効果を逆転させた。同様に、ＩＭ７抗体による同時処置は、ＴＮＦ−α誘導性ＲＡ−ＦＬＳ増殖に及ぼすｒｈＰＲＧ４の効果を逆転させた。

[00138] ４０および８０μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４およびＨＭＷＨＡは、ＩＬ−１β誘導性ＲＡ−ＦＬＳ増殖を有意に抑制した（ｐ＜０．０５）。２０、４０、および８０μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４は、ＴＮＦ−α誘導性ＲＡ−ＦＬＳ増殖を有意に抑制した（ｐ＜０．０５）。ＣＤ４４の中和は、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α刺激ＲＡ−ＦＬＳに及ぼすｒｈＰＲＧ４の効果、ならびにＩＬ−１β刺激ＲＡ−ＦＬＳに及ぼすＨＭＷＨＡの効果を逆転させた。

[00139] ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αは、ＲＡ−ＦＬＳ増殖を誘導し、ＴＮＦ−α刺激ではより大きい細胞増殖が観察され、他の公表された報告（例えば、Lacey et al. Arthritis Rheum 2003;48（1）:103-109）と一致する。ｒｈＰＲＧ４は、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α誘導性ＲＡ−ＦＬＳ増殖を、ＣＤ４４結合を必要とするメカニズムで阻害した。ｒｈＰＲＧ４およびＣＤ４４相互作用の下流の効果は、ＮＦ−κＢの核移行の阻害である。この細胞増殖アッセイにおいて、ＨＭＷＨＡは、ＩＬ−１β誘導性ＲＡ−ＦＬＳ増殖を阻害したが、ＴＮＦ−α誘導性増殖を阻害しなかった。ｒｈＰＲＧ４処置と同様に、ＨＭＷＨＡの効果は、ＣＤ４４抗体によって逆転され、この効果の媒介におけるＣＤ４４の役割を示している。

[00140] これらのデータは、ｒｈＰＲＧ４がＩＬ−１βまたはＴＮＦ−α刺激後のＲＡ−ＦＬＳに対して、抗増殖、抗炎症効果を発揮することを示している。興味深いことに、この抗増殖効果を証明するｒｈＰＲＧ４濃度は、一般的に、境界潤滑を提供するために必要な最適なｒｈＰＲＧ４濃度より低い。ｒｈＰＲＧ４のこの抗増殖効果はＣＤ４４相互作用によって媒介され、下流のＮＦ−κＢの核移行が阻害され、このことは治療用に適用したルブリシンがＣＤ４４依存的メカニズムを通して有害な細胞タイプの増殖に及ぼす炎症促進性サイトカインの効果を緩和し得ることを示唆している。

１Ｆ．ＲＡ−ＦＬＳのＴＮＦ−α刺激後のＮＦ−κＢの核移行に及ぼすｒｈＰＲＧ４処置の効果
[00141] ＲＡ−ＦＬＳ（細胞４００，０００個／ウェル）を培養してＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍＬ）によって刺激して、ｒｈＰＲＧ４（２００μｇ／ｍＬ）または市販のＮＦ−κＢの移行阻害剤ＭＧ１３２（３μＭ；Tocris Bioscience）によって無血清培地中で２４時間処置した。細胞を収集して、市販のキット（Thermo scientific）を使用して核抽出を行った。総タンパク質を、マイクロビシンコニン酸（ＢＣＡ）キット（Thermo scientific）を使用して測定し、および各実験群の核抽出物３μｇを使用した。核抽出物中の、ＮＦ−κＢのｐ５０サブユニットを、市販のＮＦ−κＢのＤＮＡ結合アッセイキット（Abcam）を使用して検出した。データは、無処置対照と比較してＮＦ−κＢの核内レベルの倍変化の数値として表す。ｒｈＰＲＧ４によるＮＦ−κＢ移行の阻害がＣＤ４４依存的であるか否かを評価するために、上記の実験をＩＭ７ＣＤ４４抗体（１：１，０００希釈）の存在下または非存在下で繰り返した。データは、処置あたりウェル少なくとも３重測定の独立した実験３回の平均値を表す。

[00142] ＴＮＦ−α処置によって、無処置対照と比較して有意なＮＦ−κＢ核移行が起こった（ｐ＜０．００１）（図４Ｃ）。ｒｈＰＲＧ４またはＮＦ−κＢ移行阻害剤ＭＧ１３２による処置によって、ＴＮＦ−α処置ＲＡ−ＦＬＳと比較してＮＦ−κＢ核移行が有意に低減された（ｐ＜０．００１）。ＴＮＦ−α＋ｒｈＰＲＧ４＋ＩＭ７群のＮＦ−κＢ核移行は、ＴＮＦ−α＋ｒｈＰＲＧ４群のＮＦ−κＢ移行より有意に高く（ｐ＜０．００１）、ＴＮＦ−α群とは有意差がなかった。したがって、ｒｈＰＲＧ４の抗増殖抗炎症効果は、ＣＤ４４相互作用によって媒介され、下流のＮＦ−κＢ核移行が阻害され、このことは、ｒｈＰＲＧ４がＣＤ４４依存的メカニズムを通してＮＦ−κＢ核移行の炎症促進効果を直接低減する能力を有することを示唆している。

１Ｇ．Ｐｒｇ４−／−およびＰｒｇ４＋／＋滑膜細胞の単離ならびにＣＤ４４免疫組織化学
[00143] 滑膜組織をＰｒｇ４−／−およびＰｒｇ４＋／＋雄性マウス（８〜１０週齢、遺伝子型あたり５〜８匹）から採取して、滅菌ＨＢＳＳ緩衝液中でプロナーゼ酵素（２ｍｇ／ｍＬ；Sigma Aldrich）によって３７℃で振とうさせながら３０分間消化した。この後、Ｉ型コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ；Sigma Aldrich）によって３７℃で振とうさせながら４時間消化した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを使用して酵素反応を停止させた。細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で増殖させて、Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞を継代２〜４回目の間に使用し、Ｐｒｇ４＋／＋滑膜細胞は、２回目の継代で使用した。

[00144] Ｐｒｇ４−／−およびＰｒｇ４＋／＋滑膜細胞を、チャンバースライドガラス（Thermo scientific）において増殖させた。細胞を４％ホルムアルデヒドで１５分間固定して、ＰＢＳ緩衝液によって２回洗浄した。細胞を０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００によって１０分間透過性にして、ＰＢＳ緩衝液によって３回洗浄した。細胞を２％ＢＳＡによって３０分間ブロックした。滑膜細胞をＩＭ７抗ＣＤ４４抗体（１：２００希釈）と共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳによって３回洗浄後、滑膜細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ラットＩｇＧ（Life Technologies）の１：４００希釈液と共に暗所で１時間インキュベートした。全てのインキュベーションは、特に明記されていない限り室温で実施した。ＰＢＳによって５分間洗浄後、ＤＡＰＩを含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ包埋培地（Vector Labs, Burlingame, CA, USA）を加えた。細胞を、ＮＩＳＥｌｅｍｅｎｔｓイメージングソフトウェアを使用してＮｉｋｏｎＥｃｌｉｐｓｅ９０ｉ蛍光顕微鏡によって撮像した。

[00145] Ｐｒｇ４−／−およびＰｒｇ４＋／＋滑膜細胞のＣＤ４４免疫細胞化学を図５Ａに示す。ＣＤ４４の局在およびＣＤ４４エピトープが占有されていないことを示す強い緑色蛍光が、Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞に関して観察された。あるいはＰｒｇ４＋／＋滑膜細胞に関しては緑色蛍光は全く観察されないかまたはかすかに観察され、ほとんどのＣＤ４４受容体（エピトープ）が占有されているか、またはネイティブのＰｒｇ４発現によって拮抗されたことを示している。ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α処置によって、無処置Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞と比較してＰｒｇ４−／−滑膜細胞の増殖の有意な増加が起こった（ｐ＜０．００１）（図５Ｂ）。これに対し、ＩＬ−１β刺激のみが、無処置Ｐｒｇ４＋／＋滑膜細胞と比較してＰｒｇ４＋／＋滑膜細胞増殖の有意な増加を示した（ｐ＜０．００１）。さらに、Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞のＬ−１βおよびＴＮＦ−α誘導性増殖の増加比は、Ｐｒｇ４＋／＋滑膜細胞のサイトカイン誘導性増殖の増加比より有意に高かった（ｐ＜０．００１）。

[00146] ｒｈＰＲＧ４による処置は、Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞のＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α誘導性増殖を有意に阻害した（ｐ＜０．００１）（図５Ｃ）。ＩＭ７と同時に処置すると、ｒｈＰＲＧ４の効果は逆転された。このことは、ＩＬ−１β＋ｒｈＰＲＧ４群およびＴＮＦ−α＋ｒｈＰＲＧ４群とそれぞれ比較して、ＩＬ−１β＋ｒｈＰＲＧ４＋ＩＭ７群およびＴＮＦ−α＋ｒｈＰＲＧ４＋ＩＭ７群におけるＰｒｇ４−／−滑膜細胞増殖の有意な増加（ｐ＜０．００１）によって例証される。ＴＮＦ−α＋ｒｈＰＲＧ４＋ＩＭ７群とＴＮＦ−α群との間にＰｒｇ４−／−滑膜細胞増殖の有意差はなかった。これに対し、Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞増殖は、ＩＬ−１β＋ｒｈＰＲＧ４＋ＩＭ７群よりＩＬ−１β群において有意に高かった（ｐ＜０．００１）。

[00147] Ｐｒｇ４−／−マウスは、Ｐｒｇ４＋／−およびＰｒｇ４＋／＋マウスと比較して表面フィブリル化および関節摩擦係数の増加によって証明されるように軟骨変性の初期兆候を示す（Jay et al., Arthritis Rheum, 2007; 56（11）:3662-9）。さらに、Ｐｒｇ４−／−マウスは年齢をマッチさせたＰｒｇ４＋／＋軟骨と比較して関節軟骨の活性化カスパーゼ−３軟骨細胞染色の増加を示し（Waller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2013; 110（15）: 5852-7）、およびＰｒｇ４−／−マウスでは滑膜過形成および過増殖が明白であるが、Ｐｒｇ４＋／−およびＰｒｇ４＋／＋マウスでは明白な滑膜過形成は認められない（Rhee et al., J. Clin. Invest, 2005; 115（3）:622-31）。Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞は、Ｐｒｇ４＋／＋滑膜細胞と比較して強いＣＤ４４染色を示す。さらに、炎症促進性サイトカインは、Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞の有意な増殖を誘導したが、Ｐｒｇ４＋／＋滑膜細胞に対しては認識可能な効果を示さなかった。併せて考慮すると、これらの知見は、ＲＡ−ＦＬＳの表現型に類似する増殖性の滑膜細胞表現型を有するＰｒｇ４−／−関節において炎症が進行中であることを示している。ｒｈＰＲＧ４は、サイトカイン誘導性のＰｒｇ４−／−滑膜細胞増殖を阻害し、この効果は、ｒｈＰＲＧ４−ＣＤ４４相互作用によって媒介された。ＣＤ４４を中和すると、ＴＮＦ−α刺激後のｒｈＰＲＧ４の抗増殖効果を完全に逆転し、ＩＬ−１β刺激後のｒｈＰＲＧ４の抗増殖効果を部分的に逆転した。Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１β刺激の状況におけるｒｈＰＲＧ４−ＣＤ４４相互作用に関連するこの差は、おそらくｒｈＰＲＧ４のＣＤ４４との相互作用能とは無関係に、ｒｈＰＲＧ４が他のシグナル伝達経路をモジュレートする能力のためであり得る。したがって、ｒｈＰＲＧ４は、Ｐｒｇ４−／−滑膜細胞のＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α誘導性増殖を、ＣＤ４４を伴うメカニズムで阻害し、したがって、ＣＤ４４シグナル伝達の炎症促進活性を下方調節することができるＣＤ４４のアンタゴニストである。

実施例２．ルブリシンは、ヒト全血系における炎症性サイトカインの産生をモジュレートする
[00148] リポ多糖（ＬＰＳ）は、グラム陰性菌の外膜に見出され、動物において強い免疫炎症応答を誘発する。炎症性サイトカインの産生に及ぼすＬＰＳチャレンジの効果を、様々なサイトカインの生成およびその産生のモジュレーションのプロファイルを調べるためにＢｉｏｃｈｉｐＡｒｒａｙ技術を使用して、クエン酸加ヒト全血において試験した。ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ、ＩＦＮｇ、ＴＮＦａ、ＩＬ１ａ、ＩＬ１ｂ、ＭＣＰ１、およびＥＧＦの生成を、試料に食塩水（１〜１０の比率）および１０μｇ／ｍＬＬＰＳを添加したクエン酸加ヒト全血試料において３７℃で６０分間試験した。これらの混合物を遠心沈降させて、上清の血漿を、ＲａｎｄｏｘＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒＢｉｏｃｈｉｐリーダー上の高感度サイトカインアレイを使用して、１４個の炎症バイオマーカーに関して分析した。これらの試験は二連で行い、表および図の形に要約した。図８Ａ〜Ｂに示されるように、リポ多糖を１：１０希釈で全血に加えると、明記された条件下で、炎症性サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびＭＣＰ−１の産生が増加した。ＩＬ２、ＩＦＮｇおよびＩＬ１ｂに変化は認められなかった。図８Ｂは、様々なパラメータのパーセント変化を示し、ＩＬ６、ＩＬ８、ＶＥＧＦおよびＴＮＦａの顕著な増加を明らかに証明する。

[00149] 同じアプローチを利用して、全血中の炎症性サイトカインの生成に及ぼすルブリシンの効果も、類似の実験設定を使用して試験した。これらの試験において、正常な健康なボランティアから採取したクエン酸加全血試料にルブリシンを添加することによって、ルブリシン（０．５７ｍｇ／ｍＬ）の効果を調べた。試料を、食塩水対照と共に試料中の炎症性サイトカインレベルに関して、６０分間インキュベートしてプロファイルを調べた。全血を遠心沈降させて、血漿を得て、これを、高感度サイトカインアッセイを使用して、様々な炎症性サイトカインに関してプロファイルを調べた。図９Ａ〜Ｂに示されるように、０．５７ｍｇ／ｍＬルブリシンを全血に添加すると、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＭＣＰ−１、およびＥＧＦの産生が減少した。最も顕著な減少は、ＶＥＧＦ、ＩＬ８、ＩＬ６、およびＩＬ１０で認められた。

[00150] ＬＰＳ媒介性炎症性サイトカイン生成に及ぼすルブリシンの効果を、ＢｉｏｃｈｉｐＡｒｒａｙ技術を使用して試験した。これらの試験において、１０ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ単独および１０ｎｇ／ｍＬＬＰＳの添加後に０．５７ｍｇ／ｍＬルブリシンを添加したクエン酸加全血における様々な炎症性サイトカインの生成を比較した。試料を全て、６０分間インキュベートして、遠心沈降させて血漿を得た。この血漿を、ＢｉｏｃｈｉｐＡｒｒａｙを使用して炎症性サイトカインに関して分析した。ＬＰＳを全血に１：１０希釈で添加した。図１０Ａ〜Ｂに示されるように、ルブリシンの存在により、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＭＣＰ−１、およびＥＧＦの減少が起こったが、上記のようにＬＰＳ単独の存在ではこれらのサイトカインのそれぞれの産生の増加が起こった。図１０Ｂに示すように、ルブリシンによって、ＥＧＦ、ＩＬ１０、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ１、ＩＬ１ｂ、およびＴＮＦレベルの顕著な減少が起こった。これらのデータは、ルブリシンの添加が、ＬＰＳ媒介性の炎症性サイトカイン生成を有意に妨害することを示唆しており、ルブリシンが抗炎症特性を有することを示している。

[00151] ＴＮＦ−α媒介性炎症性サイトカイン生成に及ぼすルブリシンの効果をＢｉｏｃｈｉｐＡｒｒａｙ技術を使用して試験した。組換えＴＮＦ−αを全血における炎症性サイトカイン生成の誘因として使用した。様々なサイトカインのＴＮＦ−α媒介性の生成に及ぼすルブリシンの効果を試験した。濃度１００ｍｇ／ｍＬのＴＮＦ−αのみを全血に添加して、これを３７℃で６０分間インキュベートした。ＴＮＦ−αは１：１０希釈で全血に添加した。様々なサイトカインのＴＮＦ−α媒介性生成に及ぼすルブリシンのモジュレーション性効果を、ＴＮＦ−αを添加する直前に０．５７ｍｇ／ｍＬルブリシンを全血に添加することによって試験した。６０分後、遠心沈降によって血漿を得て、ＲａｎｄｏｘＢｉｏｃｈｉｐアレイを使用して炎症性サイトカインに関して分析した。図１１Ａ〜Ｂに示されるように、ＴＮＦ−α単独のチャレンジではこれらのそれぞれのサイトカインが産生されたにもかかわらず、ルブリシンの存在によって、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、およびＥＧＦが減少した。図１１Ｂは、ルブリシンが、１０〜１００％の範囲でサイトカインレベルを減少させたことを示している。ＴＮＦ−αによって刺激されたサイトカイン発現の最も劇的な減少は、ルブリシンの非存在下での刺激と比較して刺激されたＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α（ルブリシンは、明らかにＴＮＦ−α産生の陽性のフィードバックループを阻止した）の低減であることが見出された。これらのデータは、ルブリシンの投与がＴＮＦ−α媒介性炎症性サイトカイン生成を有意に妨害することを示唆しており、ルブリシンが抗炎症特性を有することを示している。

[00152] 組換え組織因子（ＴＦ）媒介性炎症性サイトカイン生成に及ぼすルブリシンの効果を、ＢｉｏｃｈｉｐＡｒｒａｙ技術を使用して試験した。これらの試験において、リコンビプラスチン銘柄（IL Laboratories）の組織因子を、ヒト全血における炎症性サイトカインの生成を誘発するために使用した。組織因子を全血に添加する前に０．５７ｍｇ／ｍＬルブリシンを添加することによってルブリシンの効果を試験した。組織因子単独を陽性対照として使用した。血液試料を遠心沈降させて、血漿を回収した。この血漿を、ＲａｎｄｏｘＢｉｏｃｈｉｐアレイにおいて炎症性サイトカインプロファイルに関して調べた。ＴＦは、全血に１：１０希釈で添加した。図１２Ａ〜Ｂに示されるように、ルブリシンの存在によって、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＭＣＰ−１、およびＥＧＦが減少したが、ＴＦ単独によるチャレンジによって、これらのそれぞれのサイトカインの産生が起こった。図１２Ｂに示されるように、ルブリシンは、組織因子添加試料においてＴＮＦ−αおよびＶＥＧＦレベルの顕著な減少を生じた。これらのデータは、ルブリシンの投与がＴＦ媒介性炎症性サイトカイン生成を有意に妨害することを示唆しており、ルブリシンが抗炎症特性を有することを示している。

[00153] これらの試験は、ルブリシンが、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）、ＴＮＦ−α、および組織因子を添加した全血において様々な炎症性サイトカインの生成を阻害することができることを示している。これらの作用物質は全て、炎症のメディエータである。このように、ルブリシンは、広く多様なメディエータによる炎症性サイトカインの生成を下方調節することができる。

実施例３．ルブリシンはｉｎｖｉｖｏで炎症促進性サイトカインのレベルを低減する
[00154] ルブリシンが、ｉｎｖｉｖｏで炎症促進性サイトカインレベルをモジュレートできるか否かを決定するために、ラットモデルを使用した。ラット９匹に手術を行って半月板を不安定化させた（ＤＭＭ手術）。術後７日目に、それぞれのラットに用量２００μｇ／ｋｇのルブリシンを１回関節内投与した。対照ラットには、等量の食塩水を注射した。試験マウスから採取した血清試料中のサイトカインレベルを、手術を受けたが、術後にルブリシンを投与しなかった対照マウスと比較した。ルブリシンの用量を投与した３週間後に試料を採取して、ＬｕｍｉｎｅｘＭｕｌｔｉｐｌｅｘプラットフォームを使用して分析した。結果を図１３に示し、ＥＰＯ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＭＣＳＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−３α、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−７、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−５、Ｇ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−６、ＧＲＯ、ＩＬ−１７α、およびＩＬ−１２ｐ７０に関して測定されたレベルを示す。ＩＬ−１８、ＭＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、およびＧＲＯのレベルは全て、食塩水単独を注射されたラットと比較して、ルブリシンを投与したラットで低減された。より具体的には、炎症性サイトカインのこのパターンは、ＬＰＳおよびＴＦメディエータ（一般的にこのモデルで上方調節されなかった）のＴＮＦ−α／ＩＬ−６／ＩＬ−８優勢型プロファイルとは異なったことから、このことは、ルブリシンの広い抗炎症効果を示している。それにもかかわらず、ルブリシンは、ｉｎｖｉｖｏで炎症促進性サイトカイン産生を有意に低減することができた。

実施例４．ヒト骨関節炎滑膜細胞によって分泌されたサイトカインレベルに及ぼすルブリシンの効果
[00155] 滑膜液細胞を正常な患者および骨関節炎（ＯＡ）患者から得て、免疫細胞の枯渇後にＣＤ９０＋細胞を精製した。細胞を１０，０００個／ウェルで播種して、ＤＭＥＭ、熱不活化ＨｙｃｌｏｎｅＦＢＳ（１０％）、およびＡｎｔｉ−Ａｎｔｉ（１％）を含有する培地中に浮遊させた。アッセイは、細胞浮遊液（細胞＋培地）１８０μＬ、およびリガンド２０μＬを全量２００μＬとして含有した。組換えルブリシン（ｒｈＰＲＧ４）を９０μｇ／ｍＬの濃度で細胞に導入して、陰性対照はＰＢＳであった。プレートを５％ＣＯ_２、３７℃で２４時間インキュベートした後、上清をＬｕｍｉｎｅｘＭｕｌｔｉｐｌｅｘプラットフォームによるサイトカイン分析のために収集した。図１４Ａ〜Ｂに示すように、ルブリシンをＰＢＳ条件と比較すると、正常な細胞は、サイトカイン反応にいかなる変化も示さなかった。しかし、ＯＡ細胞は、ルブリシンに曝露されるとＦＧＦ−２およびＩＬ−１Ｒａサイトカインの下方調節を示した。したがって、本明細書において試験した骨関節炎の細胞などの、すでに炎症応答を示している細胞においても、ルブリシンの投与は、これらの細胞から発現された炎症促進性サイトカインレベルを低減させる能力を有する。

実施例５．脳損傷の処置
[00156] 頭部外傷の際には、しばしば脳組織の挫傷および血管完全性の破壊が起こり、それによってくも膜下出血および／または硬膜下血腫が起こる。その結果、ニューロンが失われて、脳機能障害が起こる。さらに、ＣＶＡおよびＴＩＡでは、１つまたは複数の血管内凝固が形成され、遮断の下流の脳の部分においてニューロンを含む脳細胞への酸素および栄養供給が遮断される。このことによってもニューロンの破壊が起こり、それによって脳機能が障害される。損傷に対する脳の免疫応答は、炎症促進性メディエータの産生の増加および損傷領域への白血球の動員を伴う。このことは、「半影」と称される、損傷部位周囲の脳の領域におけるニューロンの損傷に関与して、脳の損傷を悪化させる。神経炎症は、二次損傷の重要なメカニズムの１つであり、外傷後神経炎症が外傷性脳損傷後に起こる神経損傷に有意に関与することは十分に確立されている。そのような脳損傷を制限する１つの方法は、損傷後短期間（時間）での薬剤の投与であり、それによって神経炎症を低減させ、結果としての神経損傷を低減させる。したがって、本発明の１つの実施形態において、ルブリシンとしても公知であるｒｈＰＲＧ４は、脳損傷を制限する手段として、脳における圧を軽減するために血管を通してまたは手術の際に全身投与することができる。そのような処置の根拠は、以下に示される結果によって裏付けられる。

[00157] 制御式皮質衝撃を伴う確立された脳損傷モデルを使用してラットに外傷性脳損傷を作製したおよそ１時間後に、ｒｈＰＲＧ４をおよそ２．５ｍｇ／Ｋｇの用量で試験ラットに静脈内投与した。対照ラットには、通常の食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を静脈内に投与した。１日後、脳を摘出して、外傷後病変周囲の大脳皮質試料を、ウェスタンブロッティングを使用して分析した。分析から、ｒｈＰＲＧ４が、対照と比較して炎症促進性メディエータの外傷後産生を低減することが証明された。

[00158] ガレクチン３は、その脳の発現が外傷性脳損傷後に急速に増加して長期間にわたって高レベルで維持されるが、これは７４％下方調節された。正常な食塩水処置ラットと比較すると、ｒｈＰＲＧ４処置ラットでも、損傷した脳実質への単球の外傷後流入の程度の６０％低減が観察され、ｒｈＰＲＧ４はまた、マトリクスメタロプロテナーゼ−９の外傷後合成を実質的に（９４％）減弱させて、プロマトリクスメタロプロテナーゼ２のその酵素的活性型への変換を（６４％）阻害した。さらに、ｒｈＰＲＧ４は、外傷性脳組織におけるアルブミンレベルを評価することによって評価した血液脳関門の透過性を８０％低減させた。

[00159] 蛍光標識ｒｈＰＲＧ４を注射すると、それが脳の損傷領域の脳実質に入ることが示されたが、これは損傷を受けていない脳の領域には全く存在しない。単球細胞株ＴＨＰ−１を伴うｉｎｖｉｔｒｏ試験の結果と共に、これらの知見は、ｒｈＰＲＧ４が、浸潤性の炎症細胞の走化性活性を直接阻害することによって、ならびに炎症促進性メディエータの産生およびシグナル伝達を省略することによって、外傷後神経炎症の程度を制限することを示している。

[00160] このように、ｒｈＰＲＧ４は、脳の損傷領域を選択的に標的として、オフターゲット薬理学的効果の可能性を低減させる。組換えｈＰＲＧ４は、炎症促進性メディエータの外傷後産生および炎症細胞の流入を低減させることによって、外傷性脳損傷によって引き起こされる神経炎症の程度を高い効能で制限する。同様に、ｒｈＰＲＧ４は、血液脳関門を安定化する独自の能力を示す。脳損傷において観察される血液脳関門の機能障害は、損傷の急性期におけるニューロンの死に関与するのみならず、損傷を受けた脳における進行性の神経変性変化、その結果としての神経学転帰の不良に至ることから、この新規ｒｈＰＲＧ４特性の発見は、脳損傷の処置にとって非常に重要である。

実施例６．炎症性腸疾患の処置
[00161] 炎症性腸疾患は、活性化Ｔ細胞のサイトカイン媒介性の動員によって特徴付けられ、それによって酸化的損傷および腸管上皮の摩耗が起こる。潰瘍性大腸炎（ＵＣ）またはクローン病を有する人の２５％〜４０％が、回腸痩肛門吻合術、または結腸および直腸の一部を切除する直腸結腸切除術などの手術へと進行し得る。一般的な治療法には、コルチコステロイドなどの広域スペクトルの抗炎症薬、抗ＴＮＦ抗体、または腸管ホーミングＴ細胞遊走を防止することをねらいとするより標的化された抗インテグリン抗体が挙げられる。これらのアプローチのいずれも、これらのアプローチに付随する感染症およびがんなどの重篤な副作用のために、長期療法として適していない。これに対し、組換えｈＰＲＧ４は、失われた上皮グリコカリックスを補充してサイトカイン発現を局所的に低減させるために、腸管に選択的に適用することができる。主として結腸の炎症性腸疾患のサイトカインプロファイルが最近特徴付けされたことにより、対照と比較して、ＵＣにおいてＴＮＦ−α、ＧＲＯ、ＣＣＬ１１（エオタキシン）の増加、クローン病においてＩＬ−６の増加、ならびにＵＣおよびクローン病の両者においてＩＬ−８の増加が明らかとなった（Korolkova et al., Clin Med Insights Gastroenerol 2015 May 6;8:29-44）。ルブリシンは、これらのサイトカインの発現を有意に低減させることが示されている。１つの実施形態において、ｒｈＰＲＧ４は、浣腸によって、または経口針、腸洗浄、溶液を飲むことによって、もしくはカプセル化された丸剤（例えば、微粒子カプセル化、ナノ粒子カプセル化、ポリマーカプセル化等）によって経口投与される。例として、腸管適合性の緩衝塩類溶液に懸濁した濃度範囲１０μｇ／ｍＬ〜２００μｇ／ｍＬのｒｈＰＲＧ４の１００ｍＬ〜４Ｌ、より好ましくは濃度範囲５０μｇ／ｍＬ〜１５０μｇ／ｍＬの２００ｍＬ〜５００ｍＬの浣腸投与は、グリコカリックスを補充して、Ｔ細胞ホーミングを防止し、投与されたルブリシンの局所でサイトカイン発現を下方調節する。ｒｈＰＲＧ４の投与によって、上皮障壁機能が改善され、血管透過性が減少し、プロテアーゼ活性に対する感受性が減少し、および栄養吸収が改善する。特定の実施形態において、クエン酸マグネシウム、または他の下剤をルブリシン投与の２４時間前までに投与した後、適切に絶食する。

実施例７．痛風の処置
[00162] 尿酸ナトリウム結晶を注射したラットを、痛風のモデルとして試験した。尿酸ナトリウム結晶の投与の２４時間後、ラットは、関節痛を発症した。尿酸結晶を導入した２４時間後、ラット２匹に食塩水を投与して、別の２匹にｒｈＰＲＧ４を注射した。これらのラットを１２時間毎にＶｏｎＦｒｅｙ法を利用して試験した。この方法は、罹患した脚の足底を細いフィラメントワイヤで触れることによって、関節炎症の結果としての求心性の疼痛感作を決定する。図１５に示すデータは、ｒｈＰＲＧ４を投与されたラットが、プラセボを投与されたラットより疼痛が少なかったことを示している。

[00163] 本発明の好ましい実施形態を、本明細書において示し、記述してきたが、そのような実施形態は、単なる例として提供されていることは当業者に明らかであろう。本発明から逸脱することなく、多数の変更、変化、および置換が当業者に想起される。本発明の実施において、本明細書に記述の本発明の実施形態に対する様々な代替を使用してもよいと理解すべきである。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにその等価物は、特許請求の範囲に含まれると意図される。

[00164] 本発明の他の特徴および利点は、好ましい実施形態の説明からおよび特許請求の範囲から明らかであろう。本発明のこれらおよび他の多くの変化および実施形態は、説明および実施例を参照して当業者に明らかであろう。

Claims

患者における脳損傷に関連する炎症応答を低減または阻害するための医薬組成物であって、プロテオグリカン４（ＰＲＧ４）を含む、医薬組成物。
患者に全身投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
前記患者の脳に局所投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
注射によって局所投与される、請求項１に記載の医薬組成物。
手術の際に局所的に局所投与される、請求項３または４に記載の医薬組成物。
前記局所投与がＰＲＧ４溶液からＰＲＧ４のコーティングを提供する、請求項３〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
ＰＲＧ４が、外因性ヒトＰＲＧ４である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
ＰＲＧ４が、組換えヒトＰＲＧ４である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
ＰＲＧ４がシグナル配列を含まない配列番号１の配列を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
ＰＲＧ４が患者において境界潤滑を提供するには不十分な量で投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
ＰＲＧ４が、０．１μｇ／ｋｇ〜４０００μｇ／ｋｇの範囲の量で投与される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記患者における炎症応答の低減または阻害が、患者における炎症促進性サイトカインのレベルによって測定可能である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
炎症促進性サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７α、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５、ＩＬ−３６、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン−α）、リンホトキシン−β、ＣＸＣ３１Ｌ（フラクタルキン）、ＣＸＣＬ−８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、ＣＸＣＬ１０、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω、ＩＦＮ−γ、ＶＥＧＦ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＥＧＦ、ＧＭＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＦＡＳＬ、４−ＩＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＦＧＦ−２、ＧＲＯ、ＭＤＣ、Ｒａｎｔｅｓ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＦＧＦ−２、ＥＰＯ、ＭＣＳＦ、ＭＩＰ３α、ＭＧ−ＣＳＦ、およびＧＣＳＦからなる群より選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
前記脳損傷が、外傷性脳損傷である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記ＰＲＧ４が、損傷部位周囲の脳領域におけるニューロンの損傷を軽減または阻害する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
前記患者が、ヒトである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。