CN112351792A - 用于创伤愈合的润滑素 - Google Patents

Abstract

本申请涉及也被称为润滑素的蛋白聚糖4蛋白在创伤愈合和组织再生、减少瘢痕形成和促进血管生成中的用途。

Description

用于创伤愈合的润滑素

与相关申请的交叉引用

本申请要求2018年6月21日提交的美国临时专利申请号62/688,163的优先权和利益，所述临时申请的全部内容通过参考并入本文。

技术领域

本发明涉及也被称为润滑素的人类糖蛋白PRG4的新用途。更具体来说，本发明涉及使用PRG4作为促进创伤愈合的药剂。

背景技术

蛋白聚糖4基因(PRG4)编码巨核细胞刺激因子(MSF)以及也被称为润滑素的“浅表区蛋白”的高度差异糖基化的剪接变体和糖型。浅表区蛋白最初被定位在来自于浅表区的外植体软骨的表面处，并在调制培养基中鉴定到。也被称为润滑素的PRG4首先从滑液分离，并在软骨-玻璃界面处和乳胶-玻璃界面中表现出与滑液相似的体外润滑能力。它在晚些时候被鉴定为滑膜成纤维细胞的产物，并且发现其润滑能力依赖于由外显子6编码的940个氨基酸的大的粘蛋白样结构域中的O-连接的β(1-3)Gal-GalNAc寡糖。润滑素分子被差异糖基化，并且已经报道了几种天然存在的剪接变体。它们在本文中被统称为PRG4。已显示PRG4在体内存在于滑膜、肌腱、关节软骨例如半月板的表面处以及眼睛的保护膜等部位中，并在关节润滑和滑膜体内平衡中发挥重要作用。

众所周知，润滑素减少承重表面之间的摩擦(Swann等，J Biol Chem,1981,256:5921-5；Schmidt等，JAMA Ophthalmol,2013,131(6):766-76)，因此关于其潜在益处的研究主要集中在关节上；然而，润滑素也在肝脏、心脏、肺、肾脏和其他组织中表达(Ikegawa等，Cytogenet Cell Genet,2000,90(3-4):291-7)，但它在这些组织中的作用仍然难以捉摸。屈曲指-关节病-髋内翻-心包炎(CACP)这种疾病与PRG4中的突变有关(Marcelino等，NatGenet,1999,23(3):319-22)，并且这些患者患有关节变性、慢性炎症和心包炎(Mannurita等，Eur J Hum Gen,2014,22:197-201)，这表明润滑素除了润滑之外还具有多种生物学功能。

在人类中，润滑素以高浓度存在于关节的滑液中(～400μg/mL)，并且以较低浓度(>100μg/mL)存在于血液中(Ikegawa等，Cytogenet Cell Genet,2000,90(3-4):291-7；Ai等，PLoS One,2015,10(e0116237))。然而，正如本文中所示，本申请人发现润滑素的特性不止其润滑和抗粘附特性。因此，尽管以前的出版物显示润滑素的丧失会导致组织变性(Jay等，Arthritis Rheum,2010,62(8):2382-91；Ruan等，Transl Med,2013,5(176)；Jay等，Matrix Biology,2014,39:17-24)，但本申请人相信，本发明第一次证实了润滑素在创伤愈合和组织再生中发挥作用。具体来说，本申请人发现润滑素在组织损伤部位处表达并引发促进创伤愈合的生理反应，从而抑制瘢痕形成。

发明内容

本发明利用了PRG4参与促进创伤愈合和组织再生这个以前未知的发现。本申请人的发现的基础在于对PRG4促进创伤愈合的推测机制的理解。正如本文中示出的，PRG4可以通过以下方式增强内源性修复和再生：1)抑制纤维化反应，2)增加血管生成和通往损伤的血液流量，3)调节炎性反应(例如巨噬细胞极化)，和4)召集免疫细胞和成熟干细胞(MSC)以介导组织修复。因此，PRG4可以以多种新颖方式用于实现创伤愈合。

因此，一方面，本发明提供了一种促进组织再生或创伤愈合并同时减少瘢痕形成的方法。所述方法包括在需要的患者中向创伤或组织损伤部位给药包含润滑素的药物制剂。在一个实施方式中，所述药物制剂可以包含可药用载体。

在一个实施方式中，所述润滑素是重组人类润滑素。在一个实施方式中，所述润滑素具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述润滑素与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少95％的氨基酸序列一致性。在另一个实施方式中，所述润滑素是人类润滑素的已知同源物或变体。

在一个实施方式中，所述创伤存在于皮肤中。例如，所述创伤存在于皮肤的表皮、真皮和/或下皮中。在一个实施方式中，所述创伤在表皮中。在另一个实施方式中，所述创伤在表皮和真皮中。在另一个实施方式中，所述创伤在表皮、真皮和下皮中。在另一个实施方式中，所述创伤在真皮和下皮中。在另一个实施方式中，所述创伤在下皮中。在另一个实施方式中，所述创伤在真皮中。

在一个实施方式中，所述创伤或组织损伤在眼中。例如，在一个实施方式中，所述创伤或组织损伤在角膜中。

在一个实施方式中，所述创伤或组织损伤是皮肤的割伤、刺伤、挫裂伤、撕裂伤、烧伤、刮伤或擦伤或手术切口。在另一个实施方式中，所述创伤是瘀伤。在另一个实施方式中，所述创伤是烧伤。在又一个实施方式中，所述创伤是皮肤溃疡。所述溃疡可以是褥疮(压迫)溃疡、糖尿病性溃疡或由细菌感染或坏死引起的溃疡。在另一个实施方式中，所述创伤或组织损伤可以是痤疮。在其他实施方式中，所述创伤或组织损伤是已从其手术切除以前形成的瘢痕组织的部位。在另一个实施方式中，所述创伤在非关节、非骨质和非骨骼的部位处，并且所述创伤不在骨骼、关节、关节软骨、肌腱或韧带中。

在一个实施方式中，所述润滑素以1μg/mL至1mg/mL的浓度提供。在另一个实施方式中，所述润滑素以100μg/mL的浓度提供。在其他实施方式中，所述润滑素以每cm²创伤面积50μg至1000μg的量提供。在其他实施方式中，所述润滑素以每cm²创伤面积50μg至500μg的量提供，而在另一个实施方式中，所述润滑素以每cm²创伤面积约75-100μg的量提供。在又一个实施方式中，所述润滑素以每cm²创伤面积10-150μg的量提供。

在其他实施方式中，所述含有润滑素的药物制剂作为溶液、悬液、乳液、洗剂、霜剂、凝胶、糊剂或软膏给药。在一个实施方式中，所述溶液作为滴剂局部给药在组织损伤部位处或注射在组织损伤部位处。在一个实施方式中，所述药物制剂被局部施用在组织损伤部位处，或通过注射给药到损伤部位。在其他实施方式中，所述药物制剂不包含透明质酸。

在另一个实施方式中，所述药物制剂作为施用到所述创伤的创伤敷料的浸渍物给药到所述创伤或组织损伤。

在一个实施方式中，所述药物制剂与镇痛剂一起给药或所述给药的药物组合物含有镇痛剂。例如，所述镇痛剂是利多卡因或苯佐卡因。

在一个实施方式中，所述药物制剂与抗生素或抗炎剂一起给药，或所述给药的药物组合物含有抗生素或抗炎剂。例如，所述抗生素是新霉素、多粘菌素b、杆菌肽、红霉素、瑞他莫林、磺胺乙酰钠、莫匹罗星、普莫卡因、磺胺嘧啶银、磺胺米隆或奥泽沙星。例如，所述抗炎剂是氢化可的松。

在一个实施方式中，本发明提供了一种包含润滑素的药物组合物，其用于促进组织再生或创伤愈合并同时减少瘢痕形成。在一个实施方式中，所述药物组合物可以包含可药用载体。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种在需要的患者的身体部位处诱导血管生成的方法。所述方法包括以足以诱导新血管形成的量向所述部位给药包含润滑素的药物制剂。在一个实施方式中，所述药物制剂可以包含可药用载体。

在一个实施方式中，所述润滑素是重组人类润滑素。在一个实施方式中，所述润滑素具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述润滑素与权利要求1所述的序列具有至少95％的氨基酸序列一致性。所述润滑素可以以1μg/mL至1μg/mL、例如100μg/mL的浓度提供。所述润滑素可以以每cm²部位面积10-150μg的量提供，而在另一个实施方式中，所述润滑素以每cm²部位面积75-100μg的量提供。

为了促进血管生成，可以例如将所述润滑素局部给药到所述部位或通过注射给药到所述部位。在一个实施方式中，所述药物制剂不包含透明质酸。在其他实施方式中，所述需要血管生成的部位是是组织损伤或创伤例如皮肤的割伤、刺伤、挫裂伤、撕裂伤、刮伤或擦伤、手术切口或烧伤或瘀伤或溃疡的部位。例如，所述组织损伤或创伤的部位可以是表皮，并且取决于创伤的深度可能包括真皮或下皮。

在一个实施方式中，所述组织损伤或创伤的部位在眼中，但不在角膜中。

在其他实施方式中，本发明提供了一种用于促进血管生成的药物组合物，其包含润滑素。在一个实施方式中，所述药物组合物可以包含可药用载体。

一方面，本发明提供了一种治疗或预防眼中的异常创伤愈合的方法。所述方法包括向遭受异常创伤愈合或具有异常创伤愈合风险的眼给药润滑素。在一个实施方式中，所述异常创伤愈合是角膜的瘢痕形成，而在另一个实施方式中，它是角膜混浊。根据一个实施方式，所述润滑素根据所述创伤的尺寸以1μg/mL至1mg/mL的浓度和/或每cm² 10-150μg的量提供。在一个实施方式中，所述润滑素与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的第25-1404位残基的序列具有至少95％的氨基酸序列一致性。在一个实施方式中，所述润滑素作为滴剂或软膏眼部给药。在一个实施方式中，所述润滑素在角质整形术、屈光性角膜切削术、激光上皮下角膜磨镶术或激光原位角膜磨镶术完成后给药到眼。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一张彩图。本专利或专利申请出版物的带有彩图的拷贝，将在提出申请并支付必要的费用后由专利局提供。

图1是示出了润滑素调控创伤愈合的提议机制的示意图。

图2是线图，示出了在从初始损伤之时起的数周过程中测量的C57BL/6小鼠的耳部创伤的直径(mm)(初始直径2mm的冲孔)。它显示出润滑素处理显著增加创伤愈合，而敲除润滑素阻断创伤愈合(n＝12/组)。

图3包括了小鼠耳部组织的免疫组织化学染色的四张照片。绿色染色显示存在润滑素，而蓝色染色显示存在不表达润滑素的细胞。正如所示，在润滑素敲除小鼠中不存在润滑素(左下图)，正如由只存在蓝色染色所表明的，而在MRL“超级愈合者”小鼠中，在整个样品中润滑素丰富(右上图)，正如由只有绿色染色遍布整个组织所表明的。在C57BL/6润滑素处理的小鼠中，润滑素在整个组织中可见(右下图)，正如由绿色染色遍布所表明的，尽管程度不如在MRL小鼠中，而在未处理的C57BL/6小鼠中不存在润滑素(左上图)，正如由蓝色染色遍布并且只有几个小绿色斑点所表明的。因此，图3显示了在自发的超级愈合者(例如MRL小鼠)中在损伤后润滑素染色增加，并且润滑素染色与愈合的增加和损伤胡纤维化/瘢痕形成的减少相关。

图4是线图，示出了在从初始损伤之时起的数周过程中测量的小鼠耳中冲孔损伤部位处的血流，单位为灌注量单位(PU)，并显示出润滑素处理显著提高损伤部位处的血流(n＝12/组)。

图5是线图，示出了遭受冲孔损伤的小鼠耳中的血管生成水平，正如由损伤部位周围的愈合组织中CD31+血管的数目所表明的。在耳部损伤后，在润滑素处理的动物中观察到血管数目的增加，而在润滑素KO动物中观察到较少的血管(n＝12)。

图6是用DAPI或4′,6-二脒基-2-苯基吲哚对小鼠耳部组织进行的免疫组织化学染色的一系列图像，其中所述组织尚未受损(上图)、已经受损并给药载体(中图)和已经受损并给药PRG4(下图)。红色指示存在间充质干细胞(MSC)，其不存在于非损伤组织中，少量存在于只给药载体的损伤组织中，并大量存在于给药润滑素的损伤组织中，正如由遍布图像的红点所指示。图6显示MSC迁移到损伤区域并对润滑素做出响应。在耳中，在未受损组织中没有观察到大量MSC(红色)，但在损伤后可以观察到。使用润滑素处理，MSC完全填充耳的受损的软骨结构(n＝5/组)。

图7是演示了通过表面等离子体共振测量到的以共振单位(RU)度量的PAI-1(纤溶酶原激活物抑制剂-1)的润滑素结合亲和性随浓度而变的线图。润滑素能够直接结合PAI-1，并且结合常数为2.712x 10^-6M，指示了所述两种生物分子之间的强烈结合。

图8A-E是示出了在多种细胞类型中和体内润滑素如何上调HIF1a和VEGF的图。将来自于正常和骨关节炎(OA)人类关节的滑膜成纤维细胞暴露到润滑素(100μg/mL)(图8A和8B)。在正常和OA细胞中，润滑素显著上调HIF1a和VEGF mRNA的表达。这个观察在HEK293细胞中得到验证，在其中观察到在润滑素处理后HIF1a和VEGF mRNA两者均被上调(图8C)。在图8A-C的条形图中，润滑素处理被显示为左侧的条(顶上带有*)，PBS对照是右侧的条，并且在图8A-C的每一者中润滑素条均高于PBS条。使用ELISA来确认VEGF的水平(图8D)。在图8D中，从左至右，两个最左侧的条表示用PBS(左)或润滑素(右)处理的正常滑膜细胞中以pg/mL为单位的蛋白质浓度，中间的两个条表示用PBS(左)或润滑素(右)处理的骨关节炎滑膜细胞中以pg/mL为单位的蛋白质浓度，并且最右侧的条表示用PBS(左)或润滑素(右)处理的HEK293细胞中以pg/mL为单位的蛋白质浓度。图8E示出了在用润滑素注射的大鼠中，在润滑素注射后14-28天VEGF被系统性上调。带有第14、29、和24天的点的条形图的具有*的上方线表示用润滑素处理的大鼠中的VEGF水平，而下方的线表示在未处理的大鼠中的VEGF水平。

图9是示出了在C57BL/6相比于润滑素敲除小鼠(KO)中，从巨噬细胞分泌的IL-1、IL-6和TNFα的水平的条形图(*指示p<0.05的显著性)。润滑素KO巨噬细胞的极化引起与野生型对照相比促炎性因子的增加(n＝4)。

图10是示出了在TLR4敲除细胞、给药润滑素的TLR4敲除细胞、润滑素敲除细胞和给药PAI-1的润滑素敲除细胞中HIF1a和VEGF的水平的条形图。基因表达水平被归一化到核糖体亚基18s。在润滑素处理后HIF1α和VEGF的上调不依赖于TLR4和PAI-1(n＝5)。

图11是流式细胞术数据，显示了在C57BL/6小鼠、给药润滑素的C57BL/6小鼠和润滑素敲除(KO)小鼠中，在耳损伤后一周在损伤部位处存在CD14+巨噬细胞和GR1+嗜中性粒细胞。正如所述数据显示的，在损伤后，与C57BL/6和润滑素KO小鼠相比，在使用润滑素处理的小鼠的损伤部位中发现多两倍的嗜中性粒细胞和巨噬细胞(每组n＝6，3只雄性和3只雌性)。

图12是全长(非截短的)人类PRG4的氨基酸序列(SEQ ID NO：1：1404个残基)。第1-24位残基(用粗体显示)代表信号序列，第25-1404位残基代表人类PRG4的成熟序列。所述糖蛋白在其活性形式下不需要所述信号序列。

图13A-C提供了编码全长1404AA人类PRG4蛋白的PRG4基因的核酸序列(SEQ IDNO：2)。

图14A是在C57BL/6小鼠和PRG4敲除小鼠中，在损伤后4周耳部冲孔创伤的照片。原始损伤是4mm²的冲孔。左耳用载体(DMSO)治疗作为对照，而右耳用rhPRG4治疗。与未治疗的耳相比，在PRG4治疗的耳中所述冲孔创伤已显著闭合。

图14B是接受耳部冲孔损伤并如所指示的用DMSO或rhPRG4治疗的C57BL/6小鼠和PRG4-/-小鼠在数周内的以mm²为单位的创伤面积随损伤后时间而变的线图。点线表示PRG4治疗。每组N＝12，6只雄性和6只雌性。原始损伤是4mm²的冲孔。

图14C-D是接受耳部冲孔损伤并如所指示的用DMSO或rhPRG4治疗的C57BL/6小鼠、PAI-/-小鼠、TLR4-/-小鼠和PAI-/-TLR4-/-小鼠在数周内的以mm²为单位的创伤面积随损伤后时间而变的线图。每组N＝12，6只雄性和6只雌性。原始损伤是4mm²的冲孔。

图15是示出了在从耳部冲孔损伤后起的给定天，巨噬细胞(F4/80+；左)和间充质干细胞(MSC；右)中VEGF(上)、TGFβ(中)和PRG4(下)的相对表达的一系列条形图(每个时间点n＝3)。

图16A-B包括了显示在C57BL/6小鼠、PRG4-/-敲除小鼠和TLR4-/-中存在CD38+巨噬细胞(M1)和CD206+巨噬细胞(M2)的流式细胞术数据，以及示出了各个不同治疗组中CD38+细胞的百分率的条形图。

图17示出了在损伤后4周用αSMA对小鼠耳部组织进行免疫组织化学染色(白色)的一系列图像。白色线描绘了原始创伤部位(每个组n＝6，3只雄性和3只雌性)。

图18A-B包括了从所指示的未损伤的C57BL/6小鼠和用rhPRG4或DMSO治疗的TLR4-/-获取的显示了巨噬细胞(F4/80+)和MSC(Sca1+CA140a+)的存在的流式细胞术数据，以及示出了在所示的各个不同治疗组中相对NFκB表达或相对基因表达的条形图(每个组n＝6，3只雄性和3只雌性)。

图19是示出了在从损伤起数周的一段时间内测量到的小鼠耳中损伤部位处的血流相对于损伤前的未损伤血流水平的线图。rhPRG4治疗显著提高损伤部位处的血流(每个组n＝6，3只雄性和3只雌性)。原始损伤是4mm²的冲孔。

图20是在所示的各个不同治疗组中，在损伤后一周受损的小鼠耳中每mm²的CD31+血管的数目的散点图(每个组n＝6，3只雄性和3只雌性)。原始损伤是4mm²的冲孔。

图21是用DAPI或4′,6-二脒基-2-苯基吲哚进行的小鼠耳的免疫组织化学染色的一系列图像。在上图中，遍及整个组织样品的蓝色染色的存在指示了核，也遍及所述图像出现的红色染色的存在指示了MSC。在左下图(使用PRG4的治疗)中追踪到这些MSC对新组织的贡献(#1皮肤，#2软骨，和#3毛囊)，而在右图上的DMSO治疗的小鼠中，MSC对纤维化样组织有贡献(#4)。

发明详述

创伤愈合是组织在损伤后借以修复自身的复杂过程，并涉及各种不同的生理过程，包括止血、炎症、增殖和包括血管生成、组织的重塑或成熟在内的新组织的生长。创伤是涉及身体组织的外部或内部破坏的损伤。例如，创伤可以是内部的，涉及身体内部的器官或组织的上皮层的破坏，或者它们可以是外部的，涉及皮肤或眼的上皮层的破坏。创伤愈合是指修复此类创伤并闭合身体组织中的破裂的过程。

创伤愈合反应是动物界中最原始和保守的生理反应之一，因为恢复组织完整性/体内平衡可能是生命与死亡之间的差异。哺乳动物中的创伤愈合主要是由免疫细胞和炎症信号分子介导，所述信号分子可以调控包括成年干细胞在内的其他组织驻留细胞，通过瘢痕的形成来介导创伤的闭合。正如本文证明的，本申请人已观察到，一种普遍存在于从鱼类到大象的动物界中蛋白质润滑素(Ikegawa等，Cytogenet Cell Genet,2000,90(3-4):291-7)，在损伤后立即在干细胞中高表达。

正如本文中证实的，润滑素通过下述效应增强内源创伤修复和组织再生：1)抑制纤维化反应，2)提高血管生成和通往损伤的血流，3)调控炎性反应(例如巨噬细胞向M2或M1的极化)，和4)召集免疫细胞和成年干细胞(MSC)以介导组织修复。

图1图解了润滑素实现这些效应的可能机制。本质上说，当在创伤部位处存在正常水平的润滑素时，纤维化和增加的促炎性细胞因子导致瘢痕形成，而当润滑素以超过生理上可获得的高水平存在于创伤部位处时，纤维化被抑制，巨噬细胞表现出M2极化，导致抗炎性细胞因子的表达，并且其他途径被激活，引起血管生成以及免疫和间充质干细胞(MSC)召集，导致优越的创伤愈合，具有极少或没有瘢痕形成。因此，根据本发明并且正如本文中证实的，润滑素不仅通过减少或抑制引起瘢痕形成的纤维化，而且通过促进巨噬细胞表现出M2极化从而导致抗炎性细胞因子的表达，并通过其他途径的活化从而引起血管生成以及免疫和间充质干细胞(MSC)召集，来促进创伤愈合和组织再生。

尽管许多组织在正常情况下表现出足够的创伤愈合，但在原始伤害(损伤、疾病)持续存在的情况下，这可能引起慢性炎症和不适当的纤维化修复。慢性炎症阻止愈合，正如在溃疡性病变部位中明显看到的。尽管皮肤中的持续纤维化导致瘢痕形成和毁容，但器官中基质的逐渐沉积损害它们的结构和功能，引起疾病和死亡(Gurtner等，Nature,2008,453:314)。

对本文中描述的在创伤愈合中由润滑素调控的途径的理解，表明润滑素可用于促进受损组织通过相同种类的正常细胞的再生，并且通过调控润滑素的表达，可以通过触发再生反应代替纤维化修复反应来增强创伤愈合。

所述纤维化修复反应导致瘢痕组织形成。在这个生理过程中，受损组织由于纤维化而被瘢痕组织(而不是正常组织)代替，引起胶原蛋白以不同于正常皮肤中的方式沉积。然而，本发明的方法促进一种创伤愈合的生理方法，导致组织的再生或新生，也就是说用新的正常且有功能的组织而不是纤维状的形成瘢痕的沉积物代替受损组织。例如，根据本发明的方法，受伤或受损组织被正常的健康细胞/组织代替，并且在损伤部位处瘢痕形成被减少或消除。正如本文中证实的，这种再生反应是由于润滑素促进血管生成，抑制纤维化反应，促进巨噬细胞从M1向M2极化从而将炎性反应从促炎性调节到抗炎性，以及召集免疫细胞和成年干细胞(MSC)从而介导组织和组织损伤部位的修复的能力。

因此，本发明提供了一种促进创伤愈合或组织再生并在同时减少瘢痕形成的方法，在所述方法中将润滑素(PRG4)给药到所述创伤。根据本发明的一个实施方式，在所述创伤部位处观察到的组织再生水平高于在不使用外源润滑素时观察到的水平，并且瘢痕形成水平与不使用外源润滑素时观察到的水平相比降低。

PRG4蛋白

也被称为润滑素的PRG4是一种润滑性多肽，其在人类中从也被称为PRG4的巨核细胞刺激因子(MSF)基因表达(参见NCBI登记号AK131434–U70136)。润滑素是包被身体的关节表面的一种遍在内源糖蛋白。润滑素是一种具有高表面活性的分子(例如保持在水面上)，其主要起到强力细胞保护、抗粘附和边界润滑剂的作用。所述分子在末端蛋白结构域之间具有长的中央黏蛋白样结构域，允许所述分子附着并保护组织表面。在所有调查过的哺乳动物中，它的天然形式含有与KEPAPTT(SEQ ID NO：3)至少50％一致的氨基酸序列的多个重复。天然润滑素通常含有多个冗余形式的这种重复序列，所述重复序列通常包含脯氨酸和苏氨酸残基，并且在大多数重复序列中至少一个苏氨酸被糖基化。所述苏氨酸锚定的O-连接糖链对于润滑素的边界润滑功能来说是关键的。所述侧链组成部分通常是β(1-3)Gal-GalNAc组成部分，并且β(1-3)Gal-GalNAc通常被唾液酸或N-乙酰神经氨酸封端。所述多肽还含有N-连接的寡糖。编码天然存在的全长润滑素的基因含有12个外显子，并且天然存在的MSF基因产物含有1,404个氨基酸(包括分泌序列)，具有与玻连蛋白同源的多个多肽序列，包括血色素结合蛋白样和生长调节素样区域。位于中央的外显子6含有940个残基。外显子6编码所述富含重复序列的O-糖基化的黏蛋白样结构域。

润滑素的蛋白质骨架的氨基酸序列可能随着人类MSF基因的外显子的可选剪接而有所不同。这种针对非均质性的鲁棒性被示例如下：当研究人员产生从中央黏蛋白结构域缺失474个氨基酸的重组形式的润滑素时，仍然获得了尽管减弱但仍合理的润滑(Flannery等，Arthritis Rheum 2009；60(3):840-7)。已显示PRG4不仅作为单体存在，而且作为通过在N-和C-端两者处保守的富含半胱氨酸的结构域二硫键合的二聚体和多聚体存在。Lubris,LLC已开发出全长的重组形式的人类润滑素。所述分子使用Selexis中华仓鼠卵巢细胞系(CHO-M)表达，最终表观分子量为450–600kDa，通常测量到的多分散多聚体为1,000kDa或更大，所有分子量都是通过在SDS tris-乙酸盐3–8％聚丙烯酰胺凝胶上与分子量标准品进行比较而估算的。在完全糖基化情况下，大约一半含有两个糖单元(GalNAc-Gal)，一半含有三个糖单元(GalNAc-Gal-唾液酸)。这种重组人类PRG4生产方法公开在国际专利申请号PCT/US014/061827中。

各种不同的本源和重组PRG4蛋白和亚型中的任一者或多者可用于本文中描述的各个实施方式中。例如，美国专利号6,433,142、6,743,774、6,960,562、7,030,223和7,361,738公开了如何制造各种不同形式的人类PRG4表达产物，每个所述专利通过参考并入本文。在本发明的实践中优选地使用从CHO细胞表达的全长糖基化重组PRG4或润滑素。这种蛋白包含1,404个氨基酸(参见图12；SEQ ID NO：1)，包括包含用O-连接的β(1-3)Gal-GalNAc寡糖进行各种不同糖基化的序列KEPAPTT(SEQ ID NO：3)的重复序列的中央外显子，并包括与玻连蛋白具有同源性的N和C-端序列。所述分子是多分散的，各个分子的糖基化模式可变，并且可以包含单体、二聚体和多聚体形式。

当在本文中使用时，术语“PRG4”可以与术语“润滑素”互换使用。广义上，这些术语是指任何有功能的、分离或纯化的本源或重组PRG4蛋白、同源物、功能性片段、亚型和/或其突变体。所有有用的分子均包含由外显子6编码的序列或其同源物或截短的版本，例如在这个优选地同时具有O-连接的糖基化的中央黏蛋白样KEPAPTT重复序列结构域内具有较少重复序列的版本。所有有用的分子还至少包含由外显子1-5和7-12编码的序列的生物活性部分，即负责赋予所述分子对ECM和内皮细胞表面的亲和性的序列。在某些实施方式中，优选的PRG4蛋白具有50kDa至500kDa之间、优选地224至467kDa之间的平均摩尔质量，包含所述PRG4蛋白的一个或多个生物活性部分或有功能的片段例如润滑片段或其同源物。在更优选实施方式中，PRG4蛋白包含平均摩尔质量在220kDa至约280kDa之间的单体。

在某些实施方式中，设想了有功能或生物活性的PRG4片段和同源物，其与SEQ IDNO：1或与PRG4的外显子1-5和7-12编码的序列或与SEQ ID NO：1的第25-1404位残基具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的氨基酸序列一致性。在某些实施方式中，设想了有功能或生物活性的PRG4片段和同源物，其与SEQ ID NO：1的第25-1404位残基具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的序列一致性。在另一个实施方式中，所述PRG4是重组人类润滑素。在另一个实施方式中，所述PRG4具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。在另一个实施方式中，所述PRG4具有SEQ ID NO：1的第25-1404位残基的氨基酸序列。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分一致性，将所述序列出于最佳比较的目的比对(例如可以在第一个氨基酸或核酸序列的序列中引入空位，用于与第二个氨基酸或核酸序列最佳对齐)。两个序列之间的百分一致性是所述序列共有的一致位置的数目的函数(即同源性％＝(一致位置的数目/位置总数)x 100)。两个序列之间的百分同源性的确定可以使用数学算法来实现。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin和Altschul，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2264-68中的算法，其在Karlin和Altschul，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-77中进行了改良。这种算法并并入到Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.,215:403-10的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可以使用NBLAST程序进行，评分＝100，字长＝12。BLAST蛋白质搜索可以使用XBLAST程序进行，评分＝50，字长＝3。为了出于比较的目的获得带空位的比对，可以使用如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Research,25(17):3389-3402中所描述的带空位BLAST。当使用BLAST和带空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。

在某些实施方式中，设想了有功能的PRG4片段和同源物，其与本源PRG4相比具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的活性，例如生物学活性。

用于蛋白质例如PRG4蛋白的分离、纯化和重组表达的方法在本领域中是公知的。在某些实施方式中，所述方法始于使用标准的分子生物学技术例如PCR或RT-PCR克隆和分离编码PRG4蛋白或亚型的mRNA和cDNA。然后将所述编码PRG4蛋白或亚型的分离的cDNA克隆到表达载体中，在用于生产重组PRG4蛋白的宿主细胞中表达，并从细胞培养上清液分离。用于生产重组人类PRG4的方法提供在国际专利申请号PCT/US014/061827中。

待治疗的创伤或组织损伤的类型

如前文所述，创伤是涉及身体组织中的外部或内部破裂的损伤。例如，创伤可以是内部的，涉及身体内部的器官或组织的上皮层的破坏，或者它们可以是外部的，涉及皮肤或眼的上皮层的破坏。创伤愈合是指修复此类创伤并闭合身体组织中的破裂的过程。

一方面，本发明提供了一种用PRG4治疗皮肤的创伤或受损组织的方法。创伤可以在表皮、真皮或下皮中或在这些层中的一者或多者中。组织损伤可以在皮肤表面下方，例如在瘀伤、血肿或坏死的情况下，此时表皮可能尚未受损，但存在对真皮、下皮和甚至肌肉组织的损伤。

本发明的方法设想了治疗皮肤的创伤，例如割伤、挫裂伤、撕裂伤、烧伤、瘀伤、擦伤、刺伤或手术切口。本发明还设想了创伤例如溃疡的治疗。例如，根据本发明的方法可以用润滑素治疗压迫溃疡(褥疮)、糖尿病性溃疡或由坏死或感染引起的溃疡，以促进组织再生并减少瘢痕形成。还设想了痤疮的治疗，因为痤疮涉及皮肤的上皮组织的破裂。

本发明的方法还设想了使用PRG4治疗眼部创伤和治疗眼中的异常创伤愈合。眼中的异常创伤愈合和创伤愈合障碍可能通过炎性细胞的活化、生长因子和细胞因子的释放、眼细胞的增殖和分化、毛细血管通透性的提高、基底膜基质组成的改变、细胞外基质的沉积增加、纤维化、新生血管化和组织重塑，引起严重的眼组织伤害。具体来说，角膜中的异常创伤愈合可能导致在健康角膜中不存在的血管和淋巴管的产生。此外，由于对角膜基质的损伤不总是引起角膜瘢痕形成，因此角膜瘢痕形成是眼中异常创伤愈合的结果。

因此，本发明提供了一种使用PRG4治疗眼部的创伤或受损组织的方法。在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗眼中的异常创伤愈合或创伤愈合障碍的方法，所述方法包括向所述眼给药润滑素。可以将所述润滑素给药到眼中特定的创伤位置，或者可以将它总体给药到眼。一些可以治疗的创伤包括由眼科手术引起的眼部创伤。例如，在一个实施方式中，本发明的方法预防和/或治疗由眼暴露于激光辐射而引起的角膜混浊。在一个实施方式中，本发明的方法促进角膜中的创伤愈合，从而阻止或抑制与角膜的手术伤害或外伤、包括与侵入性或非侵入性角膜手术相伴的外伤相关的角膜瘢痕组织的形成。例如，角膜的外伤可能由激光角膜成形术或屈光性角膜切削术(PRK)或激光原位角膜磨镶术(LASIK)或激光上皮下角膜磨镶术(LASEK)引起。在其他实施方式中，向眼给药PRG4促进角膜的创伤愈合。例如，根据本发明的方法向眼给药PRG4，可用于治疗或预防角膜瘢痕形成。角膜瘢痕形成可能由例如带状疱疹、单纯性疱疹1或2、隐形眼镜的使用或角膜由于意外或受伤而刮伤或烧伤引起。在某些实施方式中，将PRG4给药到眼以减少例如角膜中先前存在的瘢痕组织的存在，所述瘢痕组织的存在由于角膜的混浊可以导致视力模糊或下降。根据一个实施方式，所述眼是人眼。根据一个实施方式，所述眼在遭受疾病或损伤时处于异常创伤愈合的风险中。例如，手术伤害例如但不限于PRK、LASEK或LASIK或意外伤害或由触碰眼的物体引起的眼损伤，可以使眼处于异常创伤愈合的风险中。例如，可以损害眼的疾病例如前述病毒性疾病，也使眼处于异常创伤愈合的风险中。

本发明的方法提供了对皮肤之外的组织和器官的内部损伤的治疗，所述损伤由例如跌倒、车祸、刺伤或刀伤、枪击或钝力外伤、内部出血或瘀伤或手术伤害引起。因此，可以将润滑素给药到神经系统的组织(大脑、脊髓、神经)、肌肉组织、上皮组织或结缔组织，以促进创伤愈合和组织再生，同时减少瘢痕组织的形成。本发明还设想了对耳、眼、嘴唇、肾脏、肝脏、胰腺、肺、胃、食道、气管、膀胱、肠、结肠、心脏、内分泌器官或血管的创伤的治疗和瘢痕形成的减少。对于内伤的治疗来说，润滑素可以通过局部注射或通过手术干预局部给药。还设想了静脉内全身给药以用于创伤愈合。本发明设想了对体内手术创伤的治疗，例如那些穿孔或破坏上皮组织例如在胃肠道中的手术创伤

在一个实施方式中，所述待治疗的创伤在非骨质、非骨骼且非关节的部位中。在一个实施方式中，所述待治疗的创伤不是骨骼或关节或关节软骨或肌腱或韧带中的创伤。因此，本发明包括促进组织再生或创伤愈合并同时减少瘢痕形成的方法，其中将PRG4给药到需要的患者中的创伤或组织损伤部位，其中所述创伤不在骨骼或关节或关节软骨或肌腱或韧带中。本发明包括促进组织再生或创伤愈合并同时减少瘢痕形成的方法，其中将PRG4给药到需要的患者中的创伤或组织损伤部位，其中所述创伤在非骨质、非骨骼且非关节的部位中。在一个实施方式中，所述待治疗的创伤不是软骨中的创伤。因此，本发明包括促进组织再生或创伤愈合并同时减少瘢痕形成的方法，其中将PRG4给药到需要的患者中的创伤或组织损伤部位，其中所述创伤不在软骨中。在一个实施方式中，所述待治疗的创伤是软骨中的创伤，所述软骨不是关节软骨。因此，本发明包括包括促进组织再生或创伤愈合并同时减少瘢痕形成的方法，其中将PRG4给药到需要的患者中的创伤或组织损伤部位，其中所述创伤不是关节软骨。例如，所述软骨可以在耳或鼻中。

本发明还提供了用于消除或减少患者中出现的现有瘢痕的方法，不论所述瘢痕是在皮肤上还是身体中的别处。根据此类方法，可以例如通过手术切除移除瘢痕组织，并将润滑素提供到瘢痕移除的区域，以促进以前存在的瘢痕部位处的组织再生。

本发明的方法提供了一种含有重组人类润滑素的药物组合物，其可以作为创伤敷料的浸渍物施用到创伤或组织损伤。所述创伤敷料可以是纱布、药棉或绷带。可以用润滑素浸渍的材料包括棉、聚酯、人造丝或上述织物的掺混物、藻酸钙或藻酸钠、聚乙烯、聚氨酯薄膜或泡沫、聚丙烯酸酯、聚丙烯、纤维素、聚酯薄膜、尼龙、弹性纤维或其他适合用于绷带或创伤敷料的材料。

根据本发明的方法，所述待治疗的创伤或组织损伤在人类患者上/中。然而，也设想了马或狗或其他哺乳动物的治疗。在此类兽医应用中，可以使用来自于所治疗的特定物种的本源或重组润滑素。

此外，本发明还提供了诱导血管生成的方法。例如，根据本发明，一种诱导血管生成的方法包括将包含润滑素的药物组合物施用到患者身体上需要血管生成的部位。所述部位可以是例如皮肤的创伤例如割伤、烧伤、擦伤、刺伤或挫裂伤，或者所述部位可以是人体的器官或其他组织中的损伤。

PRG4的给药

尽管PRG4在体内天然产生，但本发明的效果在将外源PRG4给药到患者中的组织损伤部位时观察到。因此，在一个实施方式中，所述给药到患者的PRG4是外源人类PRG4，而在另一个实施方式中，所述给药到患者的PRG4是重组人类PRG4(rhPRG4)。在另一个实施方式中，rhPRG4具有SEQ ID NO：1的序列，而在另一个实施方式中，所述rhPRG4具有SEQ ID NO：1的第25-1404位残基的序列。

PRG4可以通过大量方法给药到所述患者。例如，所述PRG4可以外用给药到创伤部位，或所述PRG4可以例如通过注射局部给药到创伤部位。PRG4也可以通过静脉内注射系统性给药。

给药的PRG4的量取决于多种变量，例如创伤的尺寸、创伤的深度和创伤在身体中的位置。

在某些实施方式中，根据本发明用于外用或通过局部注射给药到组织损伤部位的PRG4的治疗有效量在0.1μg/kg至4000μg/kg或0.1μg/kg至1000μg/kg或0.1μg/kg至100μg/kg或0.1至50μg/kg的范围内。在某些实施方式中，给药的PRG4的治疗有效量在0.1mg/kg至100mg/kg或1mg/kg至100mg/kg或1mg/kg至10mg/kg的范围内。给药的PRG4也可以在0.1μg/mL至30mg/mL或1μg/mL至10mg/mL或10μg/mL至1mg/mL或10μg/mL至500μg/mL或50μg/mL至150μg/mL的范围内。在某些实施方式中，PRG4以约100μg/mL的浓度给药。在某些实施方式中，PRG4以每剂1至100μL的小体积给药。

在某些实施方式中，一次将总量为2mg至10mg的润滑素给药到所述创伤，例如2mg至10mg、2mg至5mg、2mg至3mg、3mg至4mg、4mg至5mg、5mg至6mg、6mg至7mg、7mg至8mg、8mg至9mg、9mg至10mg或5mg至10mg。在某些实施方式中，将超过10mg的润滑素给药到所述创伤。在本发明中设想了用于静脉内给药的PRG4的剂量比用于外用或局部给药的剂量高至少1.5倍或至少2倍或至少3倍或至少4倍或至少5倍或至少10倍。

在某些实施方式中，给药到所述创伤的润滑素的量基于所述创伤的尺寸。例如，给药的润滑素的量在每cm²创伤面积10μg至1000μg的范围内，或在每cm²创伤面积50μg至500μg的范围内，或在每cm²创伤面积50μg至300μg的范围内，或在每cm²创伤面积10μg至150μg的范围内，或在每cm²创伤面积5μg至100μg的范围内，或在每cm²创伤面积25μg至150μg的范围内，或在每cm²创伤面积40μg至120μg的范围内，或在每cm²创伤面积70μg至100μg的范围内，或在每cm²创伤面积50μg至150μg的范围内，或在每cm²创伤面积75μg至100μg的范围内，或为每cm²创伤面积约80μg的量。取决于用于递送润滑素的药物组合物的剂型，所述剂型中润滑素的量可能需要调整，以确保将上述量的润滑素从载体递送到创伤部位。调整所述剂型以确保从载体递送治疗有效量的润滑素，在本领域的技术范围之内。

润滑素向组织损伤部位的给药可以每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周或每两周一次进行，直至创伤愈合完成。完整的治疗可能花费例如一周、两周、三周或一个月。在治疗慢性皮肤病症的情况下，治疗可能持续长达所述病症消解所需的时间。

本发明的某些实施方式也设想了PRG4的系统性给药。例如，PRG4可以以肠内方式系统性给药，例如口、直肠、舌下、唇下或颊递送。PRG4可以以肠胃外方式系统性递送，例如鼻、通过吸入、静脉内、肌肉内、皮下、真皮内或透粘膜递送。

为了将PRG4递送到眼，可以将润滑素并入到溶液、悬液、乳液或凝胶中。PRG4的眼用组合物可以通过例如使用胶原蛋白罩、隐形眼镜或能够将药物递送到角膜的放置在眼表面上的其他固体基质递送到眼。PRG4也可以作为滴剂或软膏递送到眼。例如，可以将PRG4施用到眼的表面或眼的凹陷部，例如通过眼的冲洗。在眼科医院中，PRG4应该在创伤或损伤发生后尽可能快地递送到所述创伤或损伤的位置，并通过允许PRG4与创伤或损伤部位保持接触而不被快速冲洗到泪管中的方法。然而，如果发生了这种情况，则可能必需重新施用PRG4以确保与创伤表面的持续接触，从而确保愈合。

本文中设想的PRG4的系统性给药的优选途径是静脉内给药。最适剂量可以通过常规实验根据多种变量来确定，例如创伤的尺寸、创伤的部位、组织损伤的水平和类型。对于系统性给药来说，给药0.1mg/kg至100mg/kg之间、或0.5mg/kg至50mg/kg之间、或1mg/kg至25mg/kg之间、或2mg/kg至10mg/kg之间、或5mg/kg至10mg/kg之间、或0.05-1.50mg/kg之间的剂量，并且可以例如每天一次、每周一次、每周两次、每周三次、每两周一次给药，直至实现损伤的完全愈合。

药物剂型

对于在创伤愈合和促进血管生成中的使用来说，给药的PRG4优选地与可药用载体相组合。可药用载体包括适合与人类和动物的组织相接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益风险比相称的缓冲剂、载体和赋形剂。所述载体在与所述剂型的其他成分相容并且对接受者无害的意义上应该是“可接受的”。可药用载体包括与药物给药相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣剂、等渗和吸收延迟剂等。

对于作为溶液递送的PRG4来说，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。适合的载体也可以包括含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其适合的混合物的溶剂或分散介质。所述载体应该在制造和储存条件下稳定，并且应该针对微生物防腐。将载体用于药物活性物质在本领域中是已知的。例如，参见《Remington制药学》(Remington’s PharmaceuticalSciences)第18版(Mack Publishing Company,1990)。

在某些实施方式中，PRG4的药物剂型是无菌的。药物制剂的除菌可以通过已知机制来实现。

含有润滑素的药物制剂的pH通常在3至11之间，更优选地在5至9之间或6至8之间，最优选地在7至8之间，例如7至7.5。

对于外用给药来说，可以将润滑素并入到糊剂、软膏、霜剂、洗剂、凝胶、香脂剂或油膏或其他悬液或乳液中。此类药物组合物可以包含水，油类，增稠剂例如纤维素、果胶、甲基纤维素或卡波姆，缓冲剂例如柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂或酒石酸盐缓冲剂，螯合剂例如EDTA或柠檬酸，乳化剂例如蜡、鲸蜡硬脂醇或聚山梨酸酯20，保湿剂例如甘油、甘油脂肪酸酯、丙二醇或聚乙二醇，渗透增强剂例如DMSO、尿素、三乙醇酰胺、醇类、脂肪酸、脂肪酸酯、多元醇、月桂基硫酸钠、苯扎氯铵、氯化十六烷基吡啶、卵磷脂、

泊洛沙姆、

或丙二醇，和/或防腐剂例如苯甲酸、醇类、季铵化合物或有机汞化合物例如硫柳汞。软膏、香脂剂或油膏可以包含例如矿脂或凡士林，并且可以由油质基料、吸收基料、油包水乳液基料、水包油乳液基料或水溶性基料制成。霜剂和洗剂可以包含油包水或水包油乳液。凝胶可以包含水凝胶或有机凝胶基料，包括化学或物理凝胶或单相或两相系统。适合用于这些外用制剂的基料可以包括凡士林、白凡士林、黄色或白色软膏、矿物油、羊毛脂、胆甾醇、硬脂醇、聚乙二醇、白蜡、卡波姆、羧甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素。用于外用制剂的基料应该与皮肤相容、稳定、光滑、柔韧、无刺激性并且能够吸收水或其他液体制剂并释放出并入的润滑素药物活性物质。基料应该是可灭菌的。糊剂、软膏、霜剂、洗剂、凝胶、香脂剂或油膏的制备对于本领域技术人员来说是已知的。

对于眼部给药来说，可以将PRG4并入到可眼用剂型例如溶液或软膏或凝胶或胶原蛋白嵌块中。剂型可以提供PRG4的持续释放。例如，用于眼的PRG4的持续释放剂型可以通过胶原蛋白嵌块来实现。

根据某些实施方式，提供了一种包含润滑素和抗生素的药物制剂。可以给药的抗生素的实例包括阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龙霉素、链霉素、壮观霉素、格尔德霉素、除莠霉素、利福昔明、氯碳头孢、厄他培南、多尼培南、亚胺培南、西司他丁、美罗培南、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢拉啶、头孢匹林、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢替坦、头孢孟多、头孢美唑、头孢尼西、氯碳头孢、头孢罗齐、头孢呋辛、头孢克肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢布烯、头孢唑肟、拉氧头孢、头孢曲松、头孢吡肟、头孢洛林酯、头孢吡普、替考拉宁、万古霉素、替拉万星、达巴万星、奥利万星、克林霉素、林可霉素、达托霉素、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、罗红霉素、泰利霉素、螺旋霉素、氨曲南、呋喃唑酮、硝基呋喃妥因、利奈唑胺、泼斯唑来、特地佐利、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、青霉素G、哌拉西林、替莫西林、替卡西林、杆菌肽、粘杆菌素、多粘菌素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、那氟沙星、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、格帕沙星、司帕沙星、替马沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺地索辛、氨苯磺胺、柳氮磺胺吡啶、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、磺胺柯衣定、地美环素、多西环素、甲烯土霉素、米诺环素、土霉素、四环素、氯法齐明、氨苯砜、卷曲霉素、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙硫异烟胺、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、利福平、利福布汀、利福喷丁、链霉素、胂凡纳明、氯霉素、磷霉素、夫西地酸、甲硝唑、莫匹罗星、平板霉素、奎奴普丁/达福普丁、甲砜霉素、替加环素、替哨唑或甲氧苄啶。

根据某些实施方式，提供了一种包含润滑素和镇痛剂或麻醉剂的药物制剂。例如，所述镇痛剂或麻醉剂可以是利多卡因、丁卡因、苯佐卡因、丙胺卡因、地布卡因、普莫卡因、丙美卡因、丙氧间卡因、阿美索卡因、氨苯丁酯或奥布卡因。

实施例1-润滑素在“超级愈合者”MRL小鼠中的表达

本申请人发现具有自发再生能力的动物(例如MRL“超级愈合者”小鼠)通常在损伤后表现出润滑素表达的提高。这使用如下所述的小鼠模型来确定。

在接受对耳部的直径2mm的冲孔损伤后，在损伤后3天对来自于MRL小鼠、C57BL/6对照小鼠(未处理)、润滑素处理的C57BL/6小鼠和润滑素敲除小鼠的耳部的组织样品进行免疫组织化学染色，以观察组织中润滑素的存在。正如图3中所示，绿色染色示出了润滑素的存在，而蓝色染色指示没有润滑素的正常细胞。正如预期的，在润滑素敲除小鼠中不存在润滑素(左下图)，正如通过自有蓝色染色所证实的，而在MRL“超级愈合者”小鼠中润滑素在整个样品中丰富存在(右上图)，正如由遍布整个图像的浓密蓝色荧光所证实的。在C57BL/6润滑素处理的小鼠中，在整个组织中可以看到润滑素(右下图)，正如蓝色和绿色的均衡混合物所证实的，尽管润滑素不以与MRL小鼠中相同的程度存在，而在未处理的C57BL/6小鼠中不存在润滑素(左上图)，正如由仅仅蓝色染色所证实的。

MRL小鼠也表现出伴有瘢痕形成减少的对损伤的再生反应。本实验证实了润滑素染色的增加与创伤愈合的增加和损伤后纤维化/瘢痕形成的减少相关。

这些观察表明润滑素在调控损伤后的修复(瘢痕)相对于再生反应中发挥作用。

实施例2-在小鼠中外源润滑素在临界尺寸的耳部创伤中的效果

耳是研究再生的理想模型，因为它含有来自于所有三种胚层的组织，包括上皮、毛囊、腺体组织和软骨。因此，为了观察外源润滑素对创伤愈合的影响，使用了小鼠模型。

在第0天对每只小鼠的耳进行直径2mm的冲孔。24只小鼠是C57BL/6小鼠，而12只小鼠是润滑素敲除小鼠(Prg4^tm1Mawa；Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)。一半的C57BL/6小鼠(n＝12)在损伤时和损伤后1、2和3周将25μL浓度为100μg/mL的润滑素局部给药到冲孔部位。其他12只C57BL/6小鼠不接受润滑素。

对观察到的创伤尺寸的影响

在冲孔后每周一次观察所述小鼠，通过对创伤部位照相并使用每张图像中的已知参比标准品测量创伤的尺寸。结果示出在图2中，其显示了到创伤后4周为止，给药润滑素的C57BL/6小鼠中的平均创伤直径为大约1.0mm，即冲孔尺寸的一半，而未接受润滑素的C57BL/6小鼠具有平均接近1.50mm的创伤尺寸。敲除小鼠的创伤尺寸减小最少。这个数据显示润滑素处理显著提高创伤愈合，而敲除润滑素阻断创伤愈合。

对损伤部位处的血管生成和血流的影响

为了确定润滑素对损伤部位处的血管生成和血流是否具有影响，在C57Bl/6处理和对照小鼠以及润滑素KO小鼠中测量了耳损伤部位处的血流。测量值使用激光散斑灌注成像(LSPI)来获得，这是一种使用激光折射散斑图案来确定灌注的定量方法。图像曝光时间为15msec。高分辨率图像使用定制的LSPI算法来处理，以产生以灌注单位(PU)度量的定量彩色灌注图，所述PU是以前为这种仪器定义且验证过的任意单位(Forrester等，(2002)MedBiol Eng Comput 40:687–697；Forrester等，(2004)EEE Trans Biomed Eng 51:2074–2084)。血流每周定量一次。如图4中所示，在接受润滑素的C57BL/6小鼠中，与未接受润滑素的小鼠和润滑素KO小鼠相比损伤部位处的血流水平显著提高，表明外源润滑素向创伤部位的给药显著增加了通往受伤组织的血流。

考虑到血流增加这一观察，也测试了小鼠的血管生成，即新血管的形成。血管生成在损伤后一周使用标准的免疫组织化学染色来测量，并从这些图像定量阳性血管的数目。

如图5中所示，与未处理的C57BL/6小鼠相比，在接受润滑素的C57BL/6小鼠的愈合组织中发现CD31⁺血管数目增加。敲除小鼠具有甚至更少的血管，证实了润滑素对愈合组织中的血管生成具有正面影响。

如图19中所示，在通过耳部冲孔创伤而损伤的小鼠中，正如在损伤后1、2、3和4周测量到的，rhPRG4显著提高通往组织损伤部位的血流。正如所示，TLR4-/-小鼠(用载体或rhPRG4处理)和用rhPRG4处理的C57BL/6小鼠在损伤后具有最高的血流水平。

同样地，正如在图20中证实的，在对耳进行4mm²冲孔损伤后1周，在rhPRG4处理的小鼠和Tlr4-/-小鼠中观察到血管数目的增加，而在Prg4-/-动物中观察到较少的血管，正如通过在受损耳中测量到的每mm²的CD31+血管数目所度量的。在PRG4处理的动物以及TLR4-/-动物中观察到损伤部位处最高的血管生成水平。

对MSC向创伤部位的迁移的影响

也调查了干细胞在润滑素介导的修复中的作用。为了跟踪标记的细胞群体的命运并表征它们的响应，当小鼠在7-9周龄之间时，通过在连续5天中腹膜内(i.p.)注射4-羟基他莫昔芬(4-OHT，Sigma Aldrich)(每天1mg)对小鼠进行诱导。为了对耳中的Prx1谱系MSC(tdTomato^+ve)的命运进行作图，通过组织学/荧光染色来检查样品。

观察到使用润滑素的处理引起间充质干细胞(MSC)向组织损伤区域的迁移。在损伤后1周内，在损伤部位处观察到MSC的实质性增加。然而，只有在使用外源润滑素处理的情况下这些MSC才有助于新耳(耳软骨)的再生。如图6中所示，在未损伤的耳组织中基本上没有观察到MSC，正如不存在任何红点所证实的(上图)。然而，在创伤用作为对照的载体处理(中图)和用润滑素处理(下图)的情况下，在来自于受损耳的组织中存在MSC。然而，在润滑素处理的情况下，MSC完全重新填充了耳的受损软骨结构，而没有润滑素的情况下，MSC不以近似相同的量存在。该数据表明润滑素参与将成年干细胞(MSC)召集到组织损伤部位以介导组织修复，并且润滑素处理将这些细胞的潜力提高到高于在正常创伤愈合条件下所观察到的潜力。

润滑素影响MSC以促进创伤愈合的进一步证据示出在图21中的图像中。在全厚度耳部损伤后，在用rhPRG4处理的MSC谱系报告小鼠中，Tomato阳性细胞(MSC)的命运作图显示出它们是软骨和真皮再生的主要贡献者，并对新毛囊有贡献(图21，左侧图像)。这种再生反应在用介质处理的野生型(C57BL/6)小鼠中没有观察到(DMSO；右侧图像)，并且有趣的是，谱系示踪的MSC细胞产生无组织的纤维化瘢痕(图21；右侧图像)。

对免疫细胞的召集的影响

本申请人在使用润滑素处理损伤后检查了巨噬细胞群体和极化。为了对创伤部位中存在的细胞进行定量，通过在与初始耳部创伤损伤相同的区域中进行2mm耳冲孔，将小鼠重新损伤。这允许收集从损伤开始时沉积的组织。将所述耳组织用gentleMACS^TM解离器(Milteny,Bergisch Gladbach,Germany)按照制造商的程序进行解离。将得到的细胞悬液过滤并重悬浮在500μl 90％MeOH中，在室温放置5-10分钟。然后将所述细胞离心，除去液体并添加500μl 0.1％Tween 20，以将所述细胞在室温通透化20分钟。将细胞再次离心，除去液体，向每个管添加50μl Tween缓冲液和0.5μg抗体，并在室温下在暗处温育30-45分钟。然后将所述细胞用FACS缓冲液清洗三次，然后重悬浮在FACS缓冲液中。然后使用FACSCaliber测量所述细胞。结果使用FlowJo软件进行分析。

如图11中的流式细胞术分析所示，与对照和润滑素KO小鼠相比，在润滑素处理后在受损的耳中观察到CD14⁺巨噬细胞和Gr1嗜中性粒细胞两者的召集。事实上，与未处理的C67BL/6小鼠和润滑素KO小鼠相比，在润滑素处理的C57BL/6小鼠中的损伤部位中发现多大约2倍的免疫细胞，证实了向创伤部位施用外源润滑素引起所述部位处巨噬细胞和嗜中性粒细胞的存在的增加。

可能的作用机制

本文中的数据证实了润滑素处理可以通过下述效应增强耳中临界尺寸的缺损的内源修复：1)抑制纤维化反应，2)增加血管生成和通往损伤的血流，3)调控炎性反应(例如巨噬细胞极化)，和4)召集免疫细胞和成年干细胞(MSC)以介导组织再生。本文中提供的证据显示，PRG4的不存在严重损害正常愈合(正如由Prg4-/-KO小鼠所证实的)，并表明润滑素通过经至少三个途径起作用促进再生反应来调控创伤愈合，一个途径在损伤部位处的血管生成和血流调控的水平上起作用(NF_KB/HIF1α/VEGF)，一个途径调控纤维化反应(PAI-1)，最后一个途径调控巨噬细胞向M1或M2表型的极化(TLR4)。本文中提供的证据表明这些多效性效应具体来说可归因于润滑素，因为它们在润滑素缺陷(KO)小鼠中不发生。这些体外和体内的初步结果表明润滑素在损伤后抑制修复反应(瘢痕形成)同时增强再生反应(愈合)，这通过调节创伤愈合的每个保守阶段的各个方面来实现：血液凝结，炎症，组织生成和组织重塑。

结果表明，润滑素与单核细胞/巨噬细胞上的TLR4相互作用，以调控这些免疫细胞的促炎性(M1)与抗炎性(M2)极化。同时，润滑素还与PAI-1结合，以调控纤维化反应。润滑素相应地调控NF_KB信号传导，其进而上调HIF1α和VEGF表达，以增加创伤区域内的血流和血管生成。我们也已调查了干细胞在润滑素介导的修复中的作用，并发现创伤区域内的组织驻留性MSC在损伤后立即表达高水平的润滑素和PAI-1两者。

润滑素-PAI-1相互作用

纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)基因家族的成员，并且是丝氨酸蛋白酶uPA和tPA的抑制剂(Ghosh等，J Cell Physiol.2012,227(2):493-507)。uPA/tPA的抑制导致纤溶酶原向纤溶酶的转化以及纤溶酶依赖性MMP活化的抑制。在正常的创伤愈合中，PAI-1可以被TGF-β上调，然后结合并失活uPA和tPA(Botta等，J CellSci.2012,125(Pt 18):4241-52)。这抑制了MMP的活化和组织重塑(凝块稳定性)。这导致创伤区域处血纤蛋白的增加和周围细胞的胶原蛋白1生产的相应增加，产生纤维化斑块(瘢痕形成)(Castro等，J.Biol Chem.,2014,289(42):29001-13)。

通常(除了在心脏中之外)，缺乏PAI-1的动物在损伤后表现出创伤愈合的增加和纤维化的减少(Chan等，Am J Pathol.,2001,159(5):1681-8；Ghosh等，PLoS One,2013,8(5):e63825)，这与我们的假设和初步数据相一致。然而，PAI-1的完全缺失由于不良的血凝块形成/稳定性而可以引起实质性失血，并可能导致死亡(Iwaki等，J Thromb Haemost.,2011,9(6):1200-6)。

正如在图7中所证实的，本文中提供的数据显示润滑素直接与PAI-1结合。润滑素与PAI-1的结合使用Biacore X100 SPR仪器(GE Healthcare,Pittsburg PA)来评估。使用标准的胺偶联化学将人类PAI-1(R&D Systems,Minneapolis,MN)固定化在CM5传感器芯片(GE Healthcare,Little Chalfont,United Kingdom)的流动池2上，产生300-500个响应单位(RU)。通过活化和失活制备参比池(流动池1)。所述结合测定法在增补有0.01％(v/v)Tween 20的PBS运行缓冲液中进行。将润滑素溶液的缓冲液更换为运行缓冲液，并将0.576-420μg/mL范围内的至少5种浓度以30μL/min的流速和1min的接触时间在25℃下进样。在监测解离1.5min后，通过进样1M NaCl从芯片表面除去结合的润滑素。我们确定了润滑素能够以2.712x10^-6的结合常数(K_d)与PAI-1直接结合，所述结合常数表明了这两种分子之间的强烈亲和性。

PAI-1与润滑素之间的相互作用可能是由润滑素的N-端生长调节素B(SMB)结构域造成的，所述结构域与PAI-1的已知配体玻连蛋白(VTN)中的SMB结构域几乎一致(ArroyoDe Prada等，Eur J Biochem.2002,269:184)。已知VTN在调控PAI-1活性和稳定性中发挥关键作用(Jang等，Surgery,2000,127(696)；Zhou等，Nat Struct Biol,2003,10:541)。所述数据表明润滑素与PAI-1的结合作为PAI-1信号传导的竞争性抑制剂起作用，将它的活性抑制到可以观察到创伤愈合增加和纤维化减少的程度，但未到凝块形成被抑制并且可以观察到慢性失血的程度。

此外，如图17中所示，与DMSO处理的C57BL/6小鼠相比，在Pai-1^-/-(DMSO处理)和C57BL/6(rhPRG4处理)的小鼠中的耳部损伤表现出明显更少的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，纤维化标志物)。图17中的图像在小鼠中的耳部冲孔创伤模型中，在损伤后4周时获取。C57BL/6小鼠显示出健壮的αSNA染色(白色)，而在rhPRG4处理的C57BL/6小鼠和PAI-1-/-小鼠中观察到减少的αSMA染色。

润滑素-NF_KB/HIF1α/VEGF

本文中提供的数据表明润滑素通过经可能在NF_KB上游和/或下游的HIF1α依赖性途径激活VEGF来调控血管生成(Fitzpatrick等，J Immunol.2011,186(2):1091-6)。血管内皮生长因子(VEGF)是血管内皮细胞的高度特异性的有丝分裂原：即使缺少两个VEGF等位基因之一的动物也因心血管系统发育的缺陷而在分娩之前死亡(Haiko等，Mol CellBiol.2008 28(15):4843-50)。低氧诱导的VEGF产生在发育期间刺激与器官形成相伴的血管生成。因此，在文献中公知HIF1α(低氧可诱导的因子)是VEGF的有效激活剂，通常是在低氧区域中(van Tuyl等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2005 288(1):L167-78；Arany等，Proc Natl Acad Sci U S A.1996 93(23):12969-73)。

如图8A-E中的数据所示，润滑素在多种细胞类型中和体内上调HIF1a和VEGF。为了在体外证实这种效应，将来自于正常和骨关节炎(OA)人类关节的滑膜成纤维细胞暴露于润滑素(100μg/mL；2mL)(图8A-B)，并在24小时后进行测量。在正常和OA细胞中，外源润滑素的给药显著上调HIF1a(图8A)和VEGF(图8B)mRNA的表达。这个观察在HEK293细胞中得到验证，在其中观察到在润滑素处理(100μg/mL；2mL)后24小时HIF1a和VEGF mRNA两者均被上调(图8C)。

如图8D中所示，使用ELISA确认了暴露于PBS载体(对照)或润滑素(100μg/mL；2mL)的正常滑膜细胞、骨关节炎滑膜细胞和HEK293细胞中的VEGF蛋白水平。在每种类型的细胞中，与对照相比，润滑素的存在显著上调VEGF的水平。

图8E中的数据还证实了外源给药的润滑素对提高VEGF蛋白水平的体内效应。在这个实验中，将5只Sprague Dawley大鼠通过尾静脉注射注入润滑素(200μg/kg)；并在第0、14、20和24天使用ELISA测定血清中的VEGF水平。如图8E中所示，与表现出稳态VEGF表达水平的未接受润滑素的大鼠中的VEGF水平相比，在润滑素注射后14-24天VEGF被系统性地显著上调。

此外，这个润滑素-VEGF途径是HIF1α依赖性的，因为用HIF1α抑制剂处理的细胞在润滑素处理后未表现出VEGF表达的提高。

此外，我们从用或未用rhPRG4处理的耳部创伤分离了巨噬细胞(F4/80⁺)和间充质干细胞(MSC)。我们观察到rhPRG4在巨噬细胞但不在MSC中显著提高血管内皮生长因子(Vegf)表达，并且也在巨噬细胞和MSC中显著降低Tgfβ表达，如图15中所示。这些结果还证实在损伤后MSC中的Prg4表达被上调，并且外源rhPRG4抑制内源Prg4的表达(负反馈)。此外，尽管已知TGFβ上调Prg4(Schmidt等，Osteoarthr.Cartil.2008,16,90；Jones等，Eur.Cell.Mater,2007,13；40)，但我们现在显示在rhPRG4与Tgfβ表达之间存在负反馈回路。

以前已显示，Tlr4^-/-巨噬细胞具有M2极化偏倚性(Orr等，Diabetes 2012,61:2718)，并且我们发现用rhPRG4处理的C57BL/6巨噬细胞也表现出M2偏倚性(图16A-B)。由于VEGF的提高与巨噬细胞的抗炎性(M2)极化相关(Lai等，J.Cell.Mol.Med.,2018,23:14027；Wheeler等，PLoS One 2018,13:e0191040)，因此我们从C57BL/6和Tlr4^-/-小鼠分离了骨髓单核细胞，并使它们向M2表型极化。

从小鼠分离单核细胞并将它们分化成巨噬细胞(M0)；然后将它们用LPS极化成促炎性巨噬细胞(M1)或用IL-4极化成抗炎性巨噬细胞(M2)。图16A-B中提供的结果显示，在rhPRG4存在下，C57BL/6单核细胞来源的巨噬细胞表现出减少的M1极化和增强的M2极化。来自于Prg4^-/-小鼠的巨噬细胞表现出增强的M1极化和减少的M2极化，这可以通过rhPRG4处理来挽救，并显示出PRG4或PRG4的缺乏调控巨噬细胞的极化。这些影响似乎是TLR4依赖性的，因为Tlr4^-/-巨噬细胞表现出减少的M1极化和增强的M2极化，其不被rhPRG4处理所改变。此外，用rhPRG4处理Tlr4^-/-巨噬细胞没有累加效应，表明rhPRG4调控极化的能力是TLR4依赖性的。

此外，我们已确定rhPRG4处理也上调NFκB活性，如图18A-B中所示。从未损伤小鼠分离巨噬细胞和MSC，并通过tdTomato报告载体监测NFκB激活。图18A-B中呈现的数据显示，在来自于非损伤小鼠的巨噬细胞和MSC中，rhPRG4处理上调NFκB表达。这似乎独立于TLR4进行，因为在TLR4-/-小鼠与C57BL/6小鼠之间观察到一些反应。我们以前已显示rhPRG4在体外和体内均调控NFκB信号传导(Iqbal等，2016,Sci Rep.,6:18910)，并且通过使用NFκB报告物，我们已证实了在rhPRG4处理后NFκB与Hiflα和Vegf的并行激活，正如在图18A-B中所示。然而，只有巨噬细胞但不是MSC显示出提高的Hiflα和VegF表达，表明在暴露于PRG4后的促血管生成反应由巨噬细胞而不是MSC驱动。

图18A-B还表明rhPRG4通过经HIF1α激活VEGF来调控血管生成。这可能发生在NF_KB下游(Fitzpatrick等，J.Immunol.,2011,186:1091)。在发育期间，低氧诱导的VEGF产生刺激与器官形成相伴的血管生成。因此，在文献中公知HIF1α(低氧可诱导的因子)是VEGF的有效激活剂，通常是在低氧区域中(Van Tuyl等，Am.J.Physiol.LungCell.Mol.Physiol.2005,288:L167)。图18A-B中的体外数据和图15中的离体数据显示用rhPRG4处理巨噬细胞在mRNA水平上提高Vegf。

润滑素-TLR4相互作用

TLR是主要由巨噬细胞表达的参与先天性免疫系统的模式识别受体的重要类别。一旦TLR被激活后，先天性免疫细胞应答被触发(Parker等，Clin Exp Immunol.2007；147:199-207；Zhang等，Cell Mol Life Sci.2006；63:2901-7)。TLR识别由病原体表达的被称为病原体相关微生物模式(PAMP)或从坏死或垂死的细胞释放的危险相关分子模式(DAMP/警报素)的高度保守的基序(Rickard等，Cell.2014；157:1175-88)。TLR4为正常的创伤愈合所需(Suga等，J Dermatol Sci.2014 73(2):117-24；Dasu等，J DiabetesComplications.2013 27(5):417-21)，并且为M1相对于M2极化所需，因为缺少TLR4的小鼠显示出朝向M2(或抗炎性)表型的偏倚性(Orr等，Diabetes.2012 61(11):2718-27)。

我们在润滑素缺陷小鼠中研究了巨噬细胞极化。如图9中所示，润滑素缺陷(KO)小鼠的巨噬细胞表现出M1(促炎性)极化偏倚性，并且与野生型对照小鼠相比产生明显更多的IL-1、IL-6和TNFα。换句话说，在润滑素敲除小鼠中巨噬细胞的极化导致与野生型对照相比促炎性因子的增加。考虑到TLR4敲除动物的巨噬细胞表现出M2偏倚性(Gupta等，BiochemBiophys Res Commun.2016 477(3):503-8)，这表明润滑素的存在至少部分失活TLR4，而在不存在润滑素的情况下，TLR4活化导致巨噬细胞的促炎性极化。

此外，在图16A-B中展示的数据中，我们确定了用PRG4处理巨噬细胞抑制M1并增强M2极化，并且是TLR-4依赖性的。图16A-B显示，Prg4^-/-小鼠中的巨噬细胞极化表现出M1(促炎性)极化偏倚性，而用rhPRG4处理的C57BL/6巨噬细胞表现出M2偏倚性。

PAI-1-VEGF-TLR4信号传导

PAI-1、VEGF和TLR4信号传导途径在多个水平上彼此相互作用(Siegel-Axel等，Diabetologia.2014 57(5):1057-66；Wu等，Am J Pathol.2014 184(6):1900-10；Biernaskie等，Cell Stem Cell.2009 5(6):610-23)，我们的数据表明这些途径中的每一者在体外是独立的。如图10中所示，润滑素处理后VEGF转录的增加是TLR4不依赖性的，因为TLR4敲除细胞在润滑素处理后仍表达VEGF。另外，如图10中所证实的，当用重组PAI-1处理润滑素敲除细胞时，没有观察到VEGF提高，表明润滑素处理后的VEGF上调不依赖于PAI-1。

PRG4介导的再生反应通过TLR4和PAI-1起作用

图14A-D中描述的数据清楚地证实rhPRG4在局部施用时增强创伤愈合，并且Prg4的不存在严重损害正常愈合(图14A)。本文中描述的来自于小鼠耳部创伤模型的结果表明这种PRG4介导的再生反应通过TLR4和纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)起作用。具体来说，Tlr4^-/-和Pai-1^-/-小鼠表现出改善的耳部创伤愈合(相对于C57BL/6)，并且rhPRG4的外源递送在这两个株系中进一步增强这种效果(图14C-D)。此外，Tlr4^-/-Pai-1^-/-双敲除表现出与rhPRG4处理的C57BL/6小鼠相同的再生反应。另外，向Tlr4^-/-Pai-1^-/-小鼠添加rhPRG4对耳部创伤愈合没有累加效果(图14D)。这表明TLR4和PAI-1信号传导是耳部创伤愈合的负调控物，并且在C57BL/6小鼠中rhPRG4处理抑制这些信号传导途径，从而提高再生潜力。

实施例4：在人类患者中治疗创伤

糖尿病性溃疡

一位人类患者在几个脚趾上呈现糖尿病性溃疡。检查每个溃疡并进行清洁。作为在无菌磷酸盐缓冲盐水中的一系列滴剂，将含有量为100μg/mL的重组人类润滑素的溶液施用到每个溃疡。每平方厘米溃疡组织施用80μg润滑素。在所述溶液干燥后，将适合的绷带放置在每个溃疡上。每周重复所述治疗共4周。在治疗完成后，溃疡已经愈合并且组织已经再生。在以前的受损部位处没有可察觉的瘢痕组织。

表皮擦伤

一位人类患者在自行车事故后在手臂、大腿和腹部上呈现出通常被称为“皮肉严重擦伤”的擦伤。将所述创伤清洁，将包含重组人类润滑素的无菌凝胶局部使用到擦伤的皮肤，并用适合的绷带覆盖。每平方厘米创伤组织施用至少80μg润滑素。每周重复所述治疗共4周，并在重新施用后，将润滑素软膏仅仅施用到尚未愈合的剩余组织区域。因此在每一周，越来越少的组织需要施用所述润滑素软膏。当所述皮肉严重擦伤最终愈合时，不存在可见的瘢痕形成。

割伤或挫裂伤

一位人类患者在右手食指上呈现3cm挫裂伤。将所述挫裂伤清洁，将含有重组人类润滑素的软膏施用到所述挫裂伤，然后用几根缝合线缝合所述挫裂伤。施加绷带。每天将含有润滑素的软膏以每cm损伤长度约80μg的量重新施用到所述受损区域。一周后拆除缝合线。将润滑素软膏每天施用到所述创伤共一周，直至缝合标记消失。在所述挫裂伤部位处没有观察到瘢痕形成。

眼部损伤

在接受屈光性角膜切削术后，一位人类患者在一只眼中发生角膜混浊。为所述患者处方含有PRG4的滴眼液。所述患者每天四次向眼的凹陷处施用2滴100μg/mL PRG4，每滴0.05mL，通过快速眨眼将所述PRG4施用到角膜表面。一周后，角膜混浊已被清除，所述患者的视力不再模糊。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种在需要的患者中促进组织再生或创伤愈合并同时减少瘢痕形成的方法，所述方法包括所述患者中的创伤或组织损伤部位给药包含润滑素的药物制剂，其中所述创伤或组织损伤部位不在骨骼、关节、关节软骨、肌腱或韧带中。

2.权利要求1所述的方法，其中所述润滑素是重组人类润滑素。

3.权利要求1-2中的任一项所述的方法，其中所述润滑素具有SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：1的第25-1404位残基的氨基酸序列。

4.权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述润滑素与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的第25-1404位残基的序列具有至少95％的氨基酸序列一致性。

5.权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述创伤或组织损伤在眼中。

6.权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中所述创伤或组织损伤在角膜中。

7.权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述创伤存在于皮肤的表皮、真皮和/或下皮层中。

8.权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中所述创伤是皮肤的割伤、刺伤、挫裂伤、撕裂伤、刮伤或擦伤或手术切口。

9.权利要求1-4或7中的任一项所述的方法，其中所述创伤是瘀伤。

10.权利要求1-4或7中的任一项所述的方法，其中所述创伤是烧伤。

11.权利要求1-4或7中的任一项所述的方法，其中所述创伤是皮肤溃疡。

12.权利要求11所述的方法，其中所述溃疡是褥疮(压迫溃疡)、糖尿病性溃疡或由细菌感染引起的溃疡。

13.权利要求1-12中的任一项所述的方法，其中所述润滑素以1μg/mL至1mg/mL的浓度提供。

14.权利要求13所述的方法，其中所述润滑素以100μg/mL的浓度提供。

15.权利要求1-12或14中的任一项所述的方法，其中所述润滑素以每cm²创伤面积10-150μg的量提供。

16.权利要求15所述的方法，其中所述润滑素以每cm²创伤面积75-100μg的量提供。

17.权利要求1-12或13-16中的任一项所述的方法，其中所述药物制剂作为溶液、悬液、乳液、洗剂、霜剂、凝胶、糊剂或软膏给药。

18.权利要求17所述的方法，其中所述药物制剂被局部施用到所述创伤。

19.权利要求1-12或13-18中的任一项所述的方法，其中所述药物制剂作为施用到所述创伤的创伤敷料的浸渍物给药。

20.权利要求1-12或13-19中的任一项所述的方法，其中所述药物制剂还包含抗生素或抗炎剂或镇痛剂，或与抗生素、抗炎剂或镇痛剂一起给药。

21.权利要求20所述的方法，其中所述镇痛剂是利多卡因或苯佐卡因。

22.权利要求21所述的方法，其中所述抗生素是新霉素、多粘菌素b、杆菌肽、红霉素、瑞他莫林、磺胺乙酰钠、莫匹罗星、普莫卡因、磺胺嘧啶银、磺胺米隆或奥泽沙星。

23.权利要求1-12或13-22中的任一项所述的方法，其包括将所述药物制剂作为液体滴剂或注射在创伤部位处进行给药。

24.权利要求1-12或13-23中的任一项所述的方法，其中所述药物制剂不包含透明质酸。

25.一种用于在不在骨骼、关节、关节软骨、肌腱或韧带中的创伤或组织损伤部位处促进组织再生或创伤愈合并同时减少瘢痕形成的药物组合物，其包含润滑素。

26.一种在需要的患者身体中不在骨骼、关节、关节软骨、肌腱或韧带中的部位处诱导血管生成的方法，所述方法包括以足以诱导新血管形成的量向所述部位给药包含润滑素的药物制剂。

27.权利要求26所述的方法，其中所述润滑素是重组人类润滑素。

28.权利要求26-27中的任一项所述的方法，其中所述润滑素具有SEQ ID NO：1或SEQID NO：1的第25-1404位残基的氨基酸序列。

29.权利要求26-28中的任一项所述的方法，其中所述润滑素与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：1的第25-1404位残基的序列具有至少95％的氨基酸序列一致性。

30.权利要求26-29中的任一项所述的方法，其中所述润滑素以1μg/mL至1mg/mL的浓度提供。

31.权利要求30所述的方法，其中所述润滑素以100μg/mL的浓度提供。

32.权利要求26-31中的任一项所述的方法，其中所述润滑素以每cm²部位面积10-150μg的量提供。

33.权利要求26-31中的任一项所述的方法，其中所述润滑素以每cm²部位面积75-100μg的量提供。

34.权利要求26-33中的任一项所述的方法，其中所述润滑素被局部给药到所述部位。

35.权利要求26-33中的任一项所述的方法，其中所述润滑素通过注射给药到所述部位。

36.权利要求26-35中的任一项所述的方法，其中所述药物制剂不包含透明质酸。

37.权利要求26-36中的任一项所述的方法，其中所述身体部位是皮肤或不包括角膜的眼睛。

38.一种用于在不在骨骼、关节、关节软骨、肌腱或韧带中的部位处促进血管生成的药物组合物，其包含润滑素。

39.权利要求25或38所述的药物组合物，其还包含可药用载体。

40.一种在眼中治疗或预防异常创伤愈合的方法，所述方法包括向遭受异常创伤愈合或具有异常创伤愈合风险的眼给药润滑素。

41.权利要求40所述的方法，其中所述异常创伤愈合是角膜瘢痕形成。

42.权利要求40所述的方法，其中所述异常创伤愈合是角膜混浊。

43.权利要求40-42中的任一项所述的方法，其中所述润滑素以1μg/mL至1mg/mL的浓度提供。

44.权利要求40-43中的任一项所述的方法，其中所述润滑素根据所述创伤的尺寸以每cm² 10-150μg的量提供。

45.权利要求40-44中的任一项所述的方法，其中所述润滑素与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：1的第25-1404位残基的序列具有至少95％的氨基酸序列一致性。

46.权利要求40-45中的任一项所述的方法，其中所述润滑素作为滴剂或软膏眼部给药。

47.权利要求40-46中的任一项所述的方法，其中所述润滑素在角质整形术、屈光性角膜切削术、激光上皮下角膜磨镶术或激光原位角膜磨镶术完成后给药到眼。

Claims (49)

1.一种促进组织再生或创伤愈合并同时减少瘢痕形成的方法，所述方法包括向需要的患者中的创伤或组织损伤部位给药包含润滑素的药物制剂。

2.权利要求1所述的方法，其中所述润滑素是重组人类润滑素。

3.权利要求1-2中的任一项所述的方法，其中所述润滑素具有SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：1的第25-1404位残基的氨基酸序列。

4.权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述润滑素与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的第25-1404位残基的序列具有至少95％的氨基酸序列一致性。

5.权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述创伤或组织损伤在眼中。

6.权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中所述创伤或组织损伤在角膜中。

7.权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述创伤存在于皮肤的表皮、真皮和/或下皮层中。

8.权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中所述创伤是皮肤的割伤、刺伤、挫裂伤、撕裂伤、刮伤或擦伤或手术切口。

9.权利要求1-4或7中的任一项所述的方法，其中所述创伤是瘀伤。

10.权利要求1-4或7中的任一项所述的方法，其中所述创伤是烧伤。

11.权利要求1-4或7中的任一项所述的方法，其中所述创伤是皮肤溃疡。

12.权利要求11所述的方法，其中所述溃疡是褥疮(压迫溃疡)、糖尿病性溃疡或由细菌感染引起的溃疡。

13.权利要求1-12中的任一项所述的方法，其中所述创伤位于非关节、非骨质和非骨骼的部位处，并且所述创伤不在骨骼、关节、关节软骨、肌腱或韧带中。

14.权利要求1-13中的任一项所述的方法，其中所述润滑素以1μg/mL至1mg/mL的浓度提供。

15.权利要求14所述的方法，其中所述润滑素以100μg/mL的浓度提供。

16.权利要求1-15中的任一项所述的方法，其中所述润滑素以每cm²创伤面积10-150μg的量提供。

17.权利要求16所述的方法，其中所述润滑素以每cm²创伤面积75-100μg的量提供。

18.权利要求1-17中的任一项所述的方法，其中所述药物制剂作为溶液、悬液、乳液、洗剂、霜剂、凝胶、糊剂或软膏给药。

19.权利要求18所述的方法，其中所述药物制剂被局部施用到所述创伤。

20.权利要求1-19中的任一项所述的方法，其中所述药物制剂作为施用到所述创伤的创伤敷料的浸渍物给药。

21.权利要求1-20中的任一项所述的方法，其中所述药物制剂还包含抗生素或抗炎剂或镇痛剂，或与抗生素、抗炎剂或镇痛剂一起给药。

22.权利要求21所述的方法，其中所述镇痛剂是利多卡因或苯佐卡因。

23.权利要求22所述的方法，其中所述抗生素是新霉素、多粘菌素b、杆菌肽、红霉素、瑞他莫林、磺胺乙酰钠、莫匹罗星、普莫卡因、磺胺嘧啶银、磺胺米隆或奥泽沙星。

24.权利要求1-23中的任一项所述的方法，其包括将所述药物制剂作为液体滴剂或注射在创伤部位处进行给药。

25.权利要求1-24中的任一项所述的方法，其中所述药物制剂不包含透明质酸。

26.一种用于促进组织再生或创伤愈合并同时减少瘢痕形成的药物组合物，其包含润滑素。

27.一种在需要的患者的身体部位处诱导血管生成的方法，所述方法包括以足以诱导新血管形成的量向所述部位给药包含润滑素的药物制剂。

28.权利要求27所述的方法，其中所述润滑素是重组人类润滑素。

29.权利要求27-28中的任一项所述的方法，其中所述润滑素具有SEQ ID NO：1或SEQID NO：1的第25-1404位残基的氨基酸序列。

30.权利要求27-29中的任一项所述的方法，其中所述润滑素与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：1的第25-1404位残基的序列具有至少95％的氨基酸序列一致性。

31.权利要求27-30中的任一项所述的方法，其中所述润滑素以1μg/mL至1mg/mL的浓度提供。

32.权利要求31所述的方法，其中所述润滑素以100μg/mL的浓度提供。

33.权利要求27-32中的任一项所述的方法，其中所述润滑素以每cm²部位面积10-150μg的量提供。

34.权利要求27-32中的任一项所述的方法，其中所述润滑素以每cm²部位面积75-100μg的量提供。

35.权利要求27-34中的任一项所述的方法，其中所述润滑素被局部给药到所述部位。

36.权利要求27-34中的任一项所述的方法，其中所述润滑素通过注射给药到所述部位。

37.权利要求27-36中的任一项所述的方法，其中所述药物制剂不包含透明质酸。

38.权利要求27-37中的任一项所述的方法，其中所述身体部位是皮肤或不包括角膜的眼睛。

39.权利要求27-38中的任一项所述的方法，其中所述身体部位是非关节、非骨质和非骨骼部位，并且所述部位不在骨骼、关节或关节软骨中。

40.一种用于促进血管生成的药物组合物，其包含润滑素。

41.权利要求26或40所述的药物组合物，其还包含可药用载体。

42.一种在眼中治疗或预防异常创伤愈合的方法，所述方法包括向遭受异常创伤愈合或具有异常创伤愈合风险的眼给药润滑素。

43.权利要求42所述的方法，其中所述异常创伤愈合是角膜瘢痕形成。

44.权利要求42所述的方法，其中所述异常创伤愈合是角膜混浊。

45.权利要求42-44中的任一项所述的方法，其中所述润滑素以1μg/mL至1mg/mL的浓度提供。

46.权利要求42-45中的任一项所述的方法，其中所述润滑素根据所述创伤的尺寸以每cm² 10-150μg的量提供。

47.权利要求42-46中的任一项所述的方法，其中所述润滑素与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：1的第25-1404位残基的序列具有至少95％的氨基酸序列一致性。

48.权利要求42-47中的任一项所述的方法，其中所述润滑素作为滴剂或软膏眼部给药。

49.权利要求42-48中的任一项所述的方法，其中所述润滑素在角质整形术、屈光性角膜切削术、激光上皮下角膜磨镶术或激光原位角膜磨镶术完成后给药到眼。

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