JP4102437B2

JP4102437B2 - アクチビンおよびインヒビン刺激因子を含有する医薬組成物

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Publication number: JP4102437B2
Application number: JP51638897A
Authority: JP
Inventors: ファーガソン，マーク・ウィリアム・ジェイムズ
Original assignee: Renovo Ltd
Current assignee: Renovo Ltd
Priority date: 1995-10-21
Filing date: 1996-10-17
Publication date: 2008-06-18
Anticipated expiration: 2016-10-17
Also published as: ES2227610T3; WO1997015321A1; DE69633396T2; US7713933B2; DE69633396D1; CA2235412C; ATE275966T1; AU7313896A; US20040052795A1; CA2235412A1; JPH11514373A; AU715255B2; GB2306481A; PT855916E; GB9521608D0; DK0855916T3; ZA968785B; EP0855916B1; EP0855916A1

Description

本発明は、創傷または線維性障害の治癒を促進するための医薬組成物、特に創傷または線維性障害の、瘢痕形成が少ない治癒の促進、および慢性創傷の治癒の促進のための医薬組成物に関する。
“創傷または線維性障害”とは瘢痕組織の形成をもたらすかもしれないすべての状態を意味する。特に、これには、皮膚創傷の治癒、腱障害の修復、衝突損傷の治癒、角膜の傷などの眼科創傷の治癒、中枢神経系損傷（ＣＮＳ）の治癒、ＣＮＳに瘢痕組織の形成をもたらす状態、脳卒中の結果としての瘢痕組織形成、損傷または外科手術の結果などの組織付着（例えば腱治癒、腹部狭窄および付着などに適用される）が含まれる。線維性障害の例としては、胸部線維症、糸球体腎炎、肝硬変、全身性硬化症、強皮症、増殖性硝子体網膜症、心筋冬眠を含む心筋梗塞後の修復などがある。
特に、創傷または線維性障害の、瘢痕形成が少ない治癒の促進のための組成物は存在しない。瘢痕組織の形成は、治癒創傷に機械的な強度を与えるものであるが、見苦しく、そして組織の機能を損なう。
これは特に、ＣＮＳに瘢痕組織形成をもたらす創傷の場合であり、瘢痕組織は、切断また再生育の神経末端の再結合を阻害し、そしてこの末端の機能に大きい影響を与える。
慢性創傷の処置に用いられる組成物も存在しない。慢性創傷には、例えば静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍、床ずれ（褥瘡）があり、特に高齢患者または車椅子の患者に見られる。このような組成物は、治癒が緩慢である患者あるいは創傷治癒過程がまだ瘢痕になっていない患者にとって非常に有用である。このような組成物は創傷治癒を“キックスタート”せしめるのに用いられ、そして創傷または線維性障害の、瘢痕形成が少ない治癒を促進する組成物（例えばＰＣＴ／ＧＢ９３／００５８６）と併用され得るであろう。慢性創傷が治癒され得るだけでなく、慢性創傷が、瘢痕形成が少なく治癒され得る。
本発明は、創傷および線維性障害の、瘢痕形成が少ない治癒を促進するのに用いられるアクチビンおよび／またはインヒビンの刺激因子を提供する。
“刺激因子”とは活性アクチビンおよび／または活性インヒビンの質または効力をある部位で刺激し得るすべてのものを意味する。それはアクチビンまたはインヒビン自体（またはその薬学的に許容される塩）またはそのフラグメントまたは部分的に修飾された形を意味する。部分的修飾は、例えばアミノ酸残基の付加、除去また置換によってなされる。置換は例えば保護置換である。部分的修飾分子は、例えば親分子よりも長い半減期を有し、そのレセプターに対し異なる結合親和性を有し得る。フラグメントは少なくともアクチビンまたはインヒビンの部分を有し、そのレセプターを刺激するのに必要な部分である。他方、刺激因子は、例えばアクチビン代謝の阻害剤であり、あるいはアクチビン合成の刺激因子であり、あるいはアクチビンまたはインヒビンのバイオ前駆体であり得る。例えば、刺激因子は減成酵素により結合されたアクチビンまたはインヒビンのフラグメント同族体である。例えば、ミモトープ（Ｇeyse, Ｈ.Ｍ.et al., 1987, Ｊournal of Ｉmmunological Ｍethods, 102:259-274）は減成酵素により結合されたアクチビンまたはインヒビンのフラグメントをつくる。このようなミモトープは、酵素のレセプター部位に結合して、酵素に対するアクチビンまたはインヒビンの結合を競合的に阻害して、これによってその減成を阻害する。
刺激因子はアクチビンまたはインヒビンの拮抗物質の拮抗物質であり得る。例えばフォリスタチンの拮抗物質である。
アクチビンは、ＴＧＦβスーパーファミリーの一員であって、このファミリーの他のものと同様に２型性タンパク質であり、ジスルフィド連結ベータＡまたはベータＢサブユニットからなっている。アクチビンの３種の異なる形はインビボで同定されており、アクチビンＡ（ベータａ、ベータａ）、アクチビンＢ（ベータｂ、ベータｂ）およびアクチビンＡＢ（ベータａ、ベータｂ）である。本明細書で“アクチビン”はアクチビンのすべての可能な型を意味する、インヒビンは、共通のアルファ鎖を共に有するベータａまたはベータＢのヘテロ二量体であり、インヒビンＡ（アルファ・ベータａ）およびインヒビンＢ（アルファ・ベータｂ）と呼ばれる。“インヒビン”とはインヒビンのすべての可能な形を意味する（Ｍassague, Ｊ., 1990,“Ｔhe Ｔransforming Ｇrowth Ｆactor Ｂeta Ｆamily”, Ａnnual Ｒeview of Ｃellular Ｂiochemistry, 6:587-641. Ｖale, Ｗ. et al., 1990,“Ｔhe Ｉnhibin/Ａctivin Ｆamily of Ｈormones and Ｇrowth Ｆactors”in Ｐeptide Ｇrowth Ｆactors and Ｔheir Ｒeceptors, Ｖolume II,Ｍ.Ｂ.Ｓporn and Ａ.Ｂ.Ｒoberts(eds), Ｓpringer-Ｖerlag, pages211-248）。
アクチビンまたはインヒビンの生物的応答は、タイプ１レセプター（アクチビンレセプター様キナーゼ（Ａｌｋ）２および４と呼ぶ）および透過膜セリン・スレオニン・キナーゼであるタイプ２レセプターのヘテロ型複合体として存在するレセプターにより導入される（Ｍatthews,Ｌ.Ｓ. and Ｖale, Ｗ.Ｗ., 1993,“Ｍolecular and Ｆunctional Ｃharacterisation of Ａctivin Ｒeceptors”, Ｒeceptor Ｖolume 3, pages 173-181）。フォリスタチンは、インビトロでアクチビンの拮抗物質として作用するアクチビン結合タンパク質であり、インビボではアクチビンをそのレセプターに提示する（Ｍichael, Ｕ. et al., 1993,“Ｆollistatins more than follicle stimulating hormone suppressing proteins”, Ｍolecular and Ｃellular Ｅndocrinology, Ｖolume 91, pages 1-11）。
アクチビンは下垂体における性腺刺激細胞の数を増加し、卵巣の顆粒膜細胞の分化を起こす（Ｍay, Ｋ.Ｅ., 1994,“Ｉnhibin and Ａctivin: Ｍolecular Ａspects of Ｒegulation and Ｆunction”, ＴＥＭ 5:407-415）。アクチビンＡもニューロン細胞の分化を高め（Ｓchubert, Ｄ. et al., 1990,“Ａctivin is a nerve cell survival molecule”, Ｎature, 344:868-870）、巨核球および赤血球細胞の分化を刺激し（Ｎishimura, Ｍ. et al., 1991,“Ｅffect of erythroid differentiation factor on megakaryocytic differentiation of Ｌ8057, a murine megakaryoblastic leukaemia cell line”, Ｂiochem Ｂiophysics Ｒesearch Ｃommunication, 181:1042-1047）、そしてアメリカツメガエルの初期発育段階における中胚葉形成をもたらす（Ｓmith, Ｊ.Ｃ. et al., 1990,“Ｉdentificati on of a potent Ｘenopus mesoderm inducing factor as a homologue of Ａctivin Ａ”, Ｎature, 345:729-731）。
アクチビンベータＡ鎖の標的とした破壊は、頭蓋顔面欠損を有するマウスをつくり、このマウスは生まれて２４時間以内に死んだ（Ｍatzuk, Ｍ.Ｍ． et al., 1995,“Ｆunctional analysis of activins during mammalian development”, Ｎature, 274:354-356）。このマウスはほほひげを欠き、異常なほほひげ小胞を有した。アクチビンレセプターＡｌｋ２およびＡｌｋ４（Ｖerschueren, Ｋ. et al., 1995,“Ｅxpression of type 1 and type 1Ｂ receptors for activin in mid-gestation mouse embryos suggests distinct functions in organogenesis”, Ｍechanisms of Ｄevelopment, 52:109-123）に加えて、アクチビンベータＡ鎖は、生育毛小胞および胚皮膚の間葉織において検出されているが、新生または成長した皮膚では検出されない（Ｒoberts, Ｖ.Ｊ. et al., 1991,“Ｅxpression of Ｉnhibin/Ａctivin sub-unit messenger ribonucleic acids during rat embryogenesis”, Ｅndocrinology 128:3122-3129; Ｒoberts, Ｖ.Ｊ. and Ｂarth, Ｓ.Ｌ., 1994,“Ｅxpression of messenger ribonucleic acids encoding the Ｉnhibin/Ａctivin system during mid and late gestation rat embryogenesis”, Ｅndocrinology, 134:914-923）。形質転換マウスにおけるアクチビン結合タンパク質、フォリスタチンの破壊は、異常なほほびげの生育および角質増殖皮膚をもたらした（Ｍatzuk, Ｍ.Ｍ. et al., 1995,“Ｍultiple defects and perinatal death in mice deficient in follistatin”, Ｎature, 374:360-363）。アクチビン／インヒビンベータｂサブユニットについての遺伝子の破壊は、瞼の発育に微妙な欠陥をもたらし（Ｖassaiil, Ａ. et al., 1994,“Ａctivin/Ｉnhibin beta b subunit chain disruption leads to defects in eyelid development and female reproduction”, Ｇenes and Ｄevelopment, 8:414-427）、一方、インヒビンアルファ鎖の標的とする破壊は性腺での腫瘍形成を起こした（Ｍatzuk, Ｍ.Ｍ. et al., 1992,“Ｉnhibin is a tumour suppressor gene with gonadal specificity in mice”, Ｎature, 360:313-319）。
創傷治癒、瘢痕または線維症におけるアクチビン、インヒビンまたはフォリスタチンの役割については報告されていない。
本発明者は、アクチビンおよびインヒビンが創傷治癒において繊維生長因子としての役割をなすことを見い出した。アクチビンおよびアクチビンとインヒビンのレセプターの高レベル発現がＴＧＦ−β₃と同様に（参照、ＰＣＴ／ＧＢ９３／００５８６）創傷後に創傷部位でみられる。このことは、アクチビンおよびインヒビンが顕著に再生的／エリスロイド性／神経学的／中胚葉誘発因子であるとの以前の考え方からすると特に驚くべきことである。
アクチビンおよびインヒビンはＴＧＦ−β₃に構造的に類似し、その類似性はＴＧＦ−β₁およびＴＧＦ−β₂よりも大きいことを見い出した。アクチビンおよびインヒビンはＴＧＦ−β₃が結合するレセプターに類似のレセプターに結合し、そのルートを経て瘢痕のコントロールを仲介するようである。
アクチビンに結合し、またＴＧＦ−β₃にも結合すると考えられているＡｃｔ２ａレセプターが、創傷治癒を、具体的には７日後の創傷を上方に調節することを見い出した。表１はＴＧＦ−βレセプターファミリーのイソ型の結合も詳しく示す。
アクチビンおよびインヒビンは、ＴＧＦ−β₃に似た抗瘢痕性を有し、同様の作用（参照、例えばＰＣＴ／ＧＢ９３／００５８６）に用いられ得る。
その刺激因子は、薬学的に許容される担体、希釈剤あるいは賦形剤と併用し得る。それは、創傷および線維性障害の、瘢痕形成が少ない治癒を促進する医薬の製造において、薬学的に許容される担体、希釈剤あるいは賦形剤と併用し得る。したがって、本発明は、創傷および線維性障害の、瘢痕形成が少ない治癒促進に使われる医薬の製造において、アクチビンおよび／またはインヒビンの刺激因子としての使用も提供する。
本発明の二つあるいはそれ以上の刺激因子は、もちろん単一組成物または医薬に含まれ、あるいは単一の処置で使用され得る。
薬学的に許容される担体、希釈剤あるいは賦形剤は、既知である−例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopeia（1984）Mack Publishing Company, Easton, PAを参照。
薬学的に許容される担体は、例えば中性の無菌クリーム、局所投与のためのゲルまたは粉末、あるいは注射、洗浄または吸入のための無菌溶液ならびにエアゾール剤を含み、傷を局所的に覆う無菌ガーゼを含み、腸内投与のために錠剤またはカプセルの形態をしており、あるいはその担体は生物ポリマー・パッチまたは植え込み用の徐放性デバイスを含む。
本発明に従って製造されたアクチビンおよび／またはインヒビンの刺激因子および医薬品は、クリーム、ゲル、粉末またはドレッシングのような局所投与用の組成物の形態であり、注射、洗浄、吸入の溶液またはエアゾール剤であり、腸内投与用に錠剤またはカプセルといった形態である。それらは、また生物分解性ポリマー・パッチまたは植え込み用の徐放性デバイスを含み、最初の大量放出の後に徐々に放出する外科的な処置には有効である。このリストは不完全であり、当業者なら簡単に思い付くような、ほかに多くの利用法があり得るということが認められる。
アクチビンおよび／またはインヒビンの刺激因子を含む本発明の他の形態には、包帯；ヒアルロン酸のような、生物適合性、生物分解性および非炎症性の送達媒体；移植組織；皮内注射；腹腔内投与、静脈内投与あるいは経口投与等による、例えば線維性障害、重度の外傷、熱傷用の組織治療；角膜の創傷または瘢痕用の目薬；付着を処置するフィルムおよびバリアーをも含まれる。
創傷および線維性障害の、瘢痕形成が少ない治癒を促進する組成物および薬剤の適用は、よく知られており（例えばPCT/GB93/00586，PCT/GB92/00570とUS5,520,926参照）、本発明はこれらを合体する。
その刺激因子は、創傷および線維性障害の、瘢痕形成が少ない治癒を促進する組成物と併用され得る。
その刺激因子は、慢性的な創傷の治癒を促進する組成物と併せて使用され得る。
この発明により提供される方法は、アクチビンおよび／またはインヒビンといった刺激因子を含む創傷または線維性障害の、瘢痕形成が少ない治癒を促進する方法である。
刺激は、部位へのアクチビンおよび／またはインヒビン自体の投与あるいはアクチビンおよび／またはインヒビンの刺激因子の投与により達成される。「部位」なる用語は、創傷または線維性障害の部位という意味である。その刺激因子は本発明による刺激因子である。例えばフォリスタチンの拮抗物質である。
アクチビンおよび／またはインヒビンは創傷直前に刺激され得る。創傷後に直ちに刺激されるのが好ましい。創傷後、１４日以内、好ましくは７日以内、さらに好ましくは３日以内に刺激されることが望ましい。
本方法は、創傷または線維性障害の、瘢痕形成が少ない治癒を促進する方法として使用し得る。
本方法は、慢性創傷の治癒を促進する方法として使用し得る。
本発明は、創傷および線維性障害の、瘢痕形成が少ない治癒を促進する形態を示した以下の詳述からさらに明らかになる。これは例示のみである。
実験
最初の実験は、制御組織に関する創傷組織におけるアクチビンの発現プロフィールを測定するために行った。これらの結果は、アクチビンまたはその関連分子インヒビン（アクチビンと同じレセプターに結合する）の外因性添加またはアクチビンの結合タンパク質（フォリスタチン）の拮抗作用が、抗瘢痕活性を有するという結論をもたらした。次いで、これを二つの実験に付し、第１はアクチビンＡの使用に関し、第２はインヒビンの使用に関するものであった。実験の結果、アクチビンおよびインヒビンが抗瘢痕効果を有する。
実験１
創傷
成熟雄ＣＤ１マウスをハロタン、酸化二窒素および酸素を使用して麻酔した。各動物に４ヶ所の傷を付け、それぞれ中心線から約１cm、頭蓋の基線から２０および４０cmであった。傷は１cmであり、皮筋まで（それを含む）であった。動物を殺し、創傷後１、３、７、１４、２８、６０および８０日に創傷を取り出した。少なくとも４匹の別々の動物の４つの傷を各実験で分析した。創傷を切除し、パラホルムアルデヒドに固定し、脱水し、in situハイブリダイゼーション用に調製したワックスに封埋（無RNAase条件下で）し、またはＯＣＴ（Miles Scientific）中に凍結し、凍結切断し、免疫細胞化学に使用した。
in situハイブリダイゼーションのために、アンチセンスリボプローブをAct2aレセプター、ActR1（Alk2）およびActRIB（Alk4）に対して構築した。
免疫細胞化学のために、アクチビンを認識する一次抗体を使用し、ＦＩＴＣ（フルオレッセインイソチオシアネート）標識２次抗体を使用したストレプトアビジンビオチン増幅を使用して検出した。
コントロールとして、非創傷成熟および胎児Ｅ１６（胚芽の日１６）皮膚を使用した。
結果
創傷後３および７日に、アクチビンについて促進された染色が創傷部位で見られ、創傷縁の線維芽細胞および顆粒組織に優性であった。染色は創傷後１４日までに通常レベルに戻った。抗体が優性にアクチンβＡ鎖を認識するため、これは顆粒組織中の優性同位体（isoform）であると考えられる。
Act2AレセプターのメッセンジャーＲＮＡは創傷後７日目に創傷縁および顆粒組織で上方制御されていた。Alk2（ActRI）レセプターは正常皮膚の間葉で発現されたが、創傷端または顆粒組織で有意な上昇は検出されなかった。比較して、ActRIB（Alk4）レセプターは、正常皮膚真皮でかなり低いレベルで存在するが、皮膚創傷縁および創傷の顆粒組織で、特に創傷後７および１４日に上方制御されていた。
正常成熟マウス皮膚において、Alk2およびAlk4は真皮および表皮でそれぞれ優勢に発現された。正常成熟皮膚のアクチビンの染色は、真皮において著しく低いレベルであった。しかしながら、胚芽日１６のマウス胎児皮膚は、特に胎児真皮でアクチビンの有意な染色を示した。
これらの染色パターンは、アクチビンおよびそのレセプターが胎児皮膚に存在し、成熟皮膚において創傷治癒の間に再誘導されることを示す。胎児の創傷が、胚芽日１６で瘢痕無しで（Whitby, D.J.およびFerguson, M.W.J.,“The extracellular matrix of lip wounds in fetal, neonatal and adult mice”, Development, 112:651-668, 1991）、および炎症、従ってＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の少ないレベルであるが、ＴＧＦβ３の促進された内因性皮膚レベルで（Whitby, D.J.およびFerguson, M.W.J., 1991,“Immunohistochemical localisation of growth factors and fetal wound healing”, Developmental Biology, 147:207-215）治癒するため、アクチビンがこの瘢痕無しの胎児創傷治癒において役割を担っていると考えるのは理にかなっている。従って、アクチビン、またはその関連分子インヒビン（アクチビンと同じレセプターに結合する）の外因性添加またはアクチビンの結合タンパク質（フォリスタチン）の拮抗作用が、抗瘢痕活性を有する。
これを調べるために、以下の実験を行った：
実験２
材料および方法
組み換えウシアクチビンＡ（４μg）をInnogenetics, Belgium（Cat. No. CY-035）から得た。アクチビンＡを、最初に０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有の滅菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で凍結乾燥粉末を元に戻して製造し、次いでＰＢＳ／ＢＳＡで希釈して３用量を得た：１００ng／ml；５０ng／ml；および２５ng／ml。
１２匹の年齢および体重（２２０ｇ−２５０ｇ）が同じである成熟雄Sprague-Dawleyラットを、ハロタン、酸化二窒素および酸素の当量部の混合物を使用して麻酔した。背表面を剃り、７０％アルコールを綿棒でふいた。４つの１cmの直線状の全厚（皮筋まで（それを含む））切傷を、決定した解剖学的位置である頭蓋の基線から５cmおよび８cm、および中心線からそれぞ１cmに付けた。
動物当り４つの創傷のうち２つをアクチビンＡ１００μl投与量で、一つをＰＢＳ１００μlで処置し、残りを処置せずに置いた。全ての注射を皮下的に、切傷の各端に約５０μlを、できるだけ創傷に近いが、それを刺すことなく行い、１日１回、３日間、傷つける直前（０日）に開始して投与した。
１２匹の動物を投与用量に従って３群に分けた。４匹の動物に１００ng／mlアクチビンＡの１００μl（即ち、１０ng／１００μl注射）を、４匹に５０ng／ml（即ち、５ng／１００μl注射）を、残りの４匹は２５ng／ml（即ち、２．５ng／１００μl注射）に注射した。創傷を覆わず、縫合しなかった。６匹の動物（そのうち２匹は処置動物）をｐｗ（創傷後）７日に、残りの６匹を創傷８０日後に、全てクロロホルムの過投与および続く首脱臼により殺した。ＰＣベースイメージキャプチャーシステムを使用して無傷の剃った皮膚の肉眼的映像を保存した。背面皮膚を除去し、完全な厚さの傷を、傷の回り約０．５cmの余分な正常な皮膚と共に切除した。組織の半分を形式的食塩水に固定し、慣用のワックス組織学に従って処理し、残りの半分をＯＣＴ封埋媒体に浸し、免疫細胞化学分析のために液体窒素で急激に凍結させた。
ワックス組織学
７μm切片を標準ミクロトームで切断し、切片をヘマトキシリンとエオシンで染色して、細胞性および血管発生を試験し、コラーゲン組織に関してマッソンのトリクローム染色した。
結果
肉眼
可視アナログ採点システムを、正常、非創傷皮膚を意味する０から、増大瘢痕を意味する１０までで創案した。１０cmの印をしていない直線を白紙に書き、新たに殺したラットの各背中表面の４つの瘢痕を、各瘢痕について別の線で、０から１０の間の線に沿って印をおくすることにより採点した。８０日目の瘢痕のみを採点した（即ち、６匹のラット）。
アクチビンＡで処置した創傷の肉眼での見かけは非常に良好であった。瘢痕はかなり変化するが、最も少ない用量は、コントロールと比較した時、肉眼で最も良好な質の瘢痕であった。
顕微鏡
１０ng／１００μl注射：
ｐｗ７日目に創傷が上皮を再形成したので、上皮を非創傷上皮と同様に平らに除去した。創傷後（ｐｗ）７日目の一つの一貫した観察は、創傷の上部に多くの炎症性細胞はないが、下部にかなり多く存在するということであった。コントロール創傷（非処置およびＰＢＳ処置）もまた再上皮形成したが相乗に多くの炎症性細胞が分散していた。
ｐｗ８０日後、瘢痕の顕微鏡での見かけは良好であった。非創傷皮膚を意味する０から、増大瘢痕を意味する１０までの他の可視アナログ採点システムを使用した。平均得点を表２に示す。処置創傷の平均得点は２．６５、ＰＢＳ処置は３．３および非処置は３．６５であった。処置創傷におけるコラーゲンの配向は正常皮膚と非常に似ており、コラーゲン束は低い密度で詰められ、大きく、特に上皮に向かって、より多くの編かご状の見かけを有した（非創傷真皮は編かご状構造に配置されている）。
５ng／１００μl注射：
pw７日後に、創傷は全て上皮を再形成し、完全な細胞中および処置創傷はコントロール創傷と同じ見かけであった。処置創傷にはいくつかのバリエーションがあり、いくつかは非常に細胞性であり、他は多くの炎症性細胞を含まなかった。
ｐｗ８０日後、真皮構築は良好であり、それぞれ平均５．５および４．１であるＰＢＳおよび非処置コントロール創傷と比較して、平均スコアは３．１３であった。コラーゲンはよりオープンであり、また特に表皮に近い創傷の上部でより厚い束であった。
２．５ng／１００μl注射：
ｐｗ７日後、処置創傷はコントロール創傷と似ていた。
ｐｗ８０日後、処置創傷は合理的なコラーゲン構築を有し、それぞれ５．４５および４．２５の平均であるＰＢＳおよび非処置コントロール創傷と比較して、平均スコア５．２５であった。
結論
これらの実験は、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーであるアクチビンＡが抗瘢痕効果を有することを示す。
５ng／１００μl注射および１０ng／１００μl注射処置レジメは、コントロール創傷と比較して、非常に改善された瘢痕を示した。２．５ng／１００μl注射処置レジメは恐らく低濃度すぎた。最高投与量が傷への炎症性細胞の流入を減少するようであるというのは興味深い。ＴＧＦ−β₃で得られるのと同様の効果である。１０ng／１００μl注射アクチビンＡで処置したｐｗ８０日の顕微鏡での見かけは、コントロールより良好であり、５ng／１００μl注射もまたコントロールより良好であった。１０ng／１００μl注射と５ng／１００μl注射処置の比較は、１０ng／１００μl注射処置が優れているが、これらの動物のコントロール創傷もまた良好であり、恐らくアクチビンＡの高用量の全身的効果によるものであった。最低量（２．５ng／１００μl）はまた瘢痕を僅かに改善するが、顕微鏡結果はコントロール創傷と近かった。
創傷の肉眼での見かけは非常に変化するが、中間（５ng／１００μl注射）および最低（２．５ng／ml注射）投与量で処置した創傷は、各コントロールと比較して良好であった。最高（１０ng／１００μl注射）投与量で処置した創傷は、肉眼で非常に変化するが、同じ動物のコントロール創傷の質により打ち消され得、従って恐らく高用量のアクチビンＡによる全身効果により改善された。
実験３
材料および方法
ブタインヒビン（バイアル当たり２０μg）をNational Institute for Biological Standards and Control, Potters Bar, UK（Cat. No. 86/690）から得た。
インヒビンを０．１％ＢＳＡ含有滅菌ＰＢＳで元に戻し、２０μg／mlの貯蔵溶液とし、更に０．１、１および５μg／mlに希釈した（即ち、１０、１００および５００ng／１００μl注射）。
パイロット実験
年齢および体重（２２０ｇ−２５０ｇ）が同じの１２匹の成熟Sprague-Dawleyラットを等量部のハロタン、酸化二窒素および酸素の混合物を使用して麻酔した。背表面を剃り、７０％アルコールを綿棒でふいた。４つの１cmの直線状の完全な厚さ（皮筋まで（それを含む））の切傷を、決定した解剖学的位置である頭蓋の基線から５cmおよび８cm、および中心線からそれぞ１cmに付けた。
動物当たり２つの傷をインヒビン１００μl、一つをＰＢＳ／ＢＳＡまたはＰＢＳ単独１００μlのいずれかで処置し、一つを処置せずに置いた。全ての注射は皮下であった。最初の注射を創傷部位に、創傷前（０日）に、次いで創傷２日後に行った。５０μlを切傷の両端に、できるだけ創傷に近いが、それを壊すことなく送達した。
１２匹の動物を投与用量に従って３群に分けた。４匹の動物に一日１０ng／１００μlを、４匹に１００ng／１００μlを、残りの４匹に５００ng／１００μlを注射した。創傷を覆わず、縫合しなかった。６匹の動物（そのうち２匹は処置動物）をｐｗ（創傷後）７日に、残りの６匹を創傷８０日後に、全てクロロホルムの過投与および続く首脱臼により殺した。ＰＣベースイメージキャプチャーシステムを使用して無傷の剃った皮膚の肉眼的映像を保存した。背面皮膚を除去し、完全な厚さの傷を、傷の回りの約０．５cmの正常皮膚のマージンと共に切除した。組織の半分を形式的食塩水に固定し、慣用のワックス組織学に従って処理し、残りの半分をＯＣＴ封埋媒体に浸し、免疫細胞化学分析のために液体窒素で急激に凍結させた。
ワックス組織学：７μｍ切片を標準ミクロトームで切断し、切片をヘマトキシリンとエオシンで染色して、細胞性および血管発生を試験し、コラーゲン組織に関してマッソンのトリクローム染色した。
結果
肉眼
可視アナログ採点システムを、正常、非創傷皮膚を意味する０から、増大瘢痕を意味する１０までで創案した。１０cmの印をしていない直線を白紙に書き、新たに殺したラットの各背中表面の４つの瘢痕を、各瘢痕について別の線で、０から１０の間の線に沿って印をおくことにより採点した。８０日目の瘢痕のみを採点した（即ち、６匹のラット、２４の創傷）。
インヒビンで処置した創傷の肉眼での見かけは８０日で非常に変化した。最高量（５００ng／注射）で処置した創傷で、一つは非常に良好であり、優れた直線瘢痕であったが、残りはコントロールと同様であった。ＰＢＳ／ＢＳＡで処置した創傷もまた非処置コントロールと同様であった。インヒビンの中間投与量で処置した創傷もまたコントロール創傷と同様であった。最低の投与量で処置した二つの創傷は非常に良好な直線瘢痕を有し、回りの非創傷部位とかろうじて識別できたが、他の瘢痕はコントロールと同様の見かけであった。全体として、肉眼での結果はインヒビンの最低または最高の投与量が瘢痕を改善し得ることを示した。
組織学
創傷形成後７日
全体的に、処置した創傷は、７日目で非処置またはＰＢＳ処置対照創傷と類似した。この創傷は炎症細胞を多く含んでおり、再上皮化しており、その幅は不定であった。ＰＢＳ／ＢＳＡで処置した対照創傷は、非常に細胞性であり、非常に幅が広く、再上皮化していないものもあった。
創傷形成後８０日
正常な創傷のない皮膚を示す０から肥大性瘢痕形成を示す１０までの範囲の目視アナログ評点システム（visual analogue scoring system）を用いて、創傷形成後８０日目で組織学スライドのスコアをつけた（表３）。最大用量のインヒビン（５００ng／１００μl注射）で処置した創傷のなかには、良好な皮膚構造を持つものもあり、そのコラーゲン束は厚く、創傷のない皮膚の正常な籠織り模様に類似する無作為組織化状態であった。その他の創傷の多くでは、コラーゲンは密集しており、平行に並んでいて、対照創傷と類似した。平均スコアは、インヒビン５００ng／１００μl注射で処置した創傷では４．４９であり、非処置対照創傷では５．６であり、ＰＢＳ対照創傷では５．０８であった。中間用量（１００ng／１００μl注射）で処置した創傷はＰＢＳ対照と類似しており（スコアはそれぞれ７．５８と７．９であった）、コラーゲン繊維は厚いが、殆ど創傷の頂部で密集して束になっていた（非処置対照は、この群の中では４．９という良好なスコアであった）。最低用量のインヒビン（１０ng／１００μl注射）で処置した創傷のコラーゲンは、目が粗く（open）無作為に配向しているが、これも創傷の頂部であり、コラーゲンは非常に密集して束になっていた。これらの創傷は、対照に類似するスコアであった（表３参照）。
結論
最大用量のインヒビンは、肉眼データと相関する顕微鏡結果によると僅かに抗瘢痕形成作用を持つようであった。ＰＢＳ／ＢＳＡ対照は、創傷形成後８０日目と創傷形成後７日目でよりひどい瘢痕を形成するようであり、その創傷は非常に多数の炎症細胞を含有した。ＰＢＳ単独でインヒビンを再構成するとより著しい抗瘢痕形成作用を与えることができる。
実施例４
追試実験
材料および方法
ブタインヒビン（バイアル当たり２０μg）は、National Institute for Biological Standards and Control,Potters Bar,UK（カタログ番号86/690）から入手した。
インヒビンは、０．１％ＢＳＡ含有滅菌ＰＢＳで再構成して、２０μg／mlのストック溶液とし、更に２．５、１０および１５μg／mlに希釈した（即ち、２５０、１０００および１５００ng／１００μl注射）。
使用した外科的技術は、使用した動物数（１８；ｎ＝７２）を除外する前のものであり、創傷形成後４０日目で余分な時点があった。
動物１匹当たり２カ所の創傷をインヒビン１００μl用量で処置し、１つはＰＢＳ／ＢＳＡまたはＰＢＳ単独のいずれか１００μlを含み、１つは非処置のままにした。注射は全て皮内であった。最初の注射は、創傷部位に創傷形成直後（０日）、次いで、創傷後２日間投与した。創傷を裂くことなく創傷にできるだけ近い切口の各側に沿って５０μlを送達した。
動物１８匹を投与用量に従い３つのグループに分けた。動物６匹に毎日２５０ngを１００μl注射し、次の６匹は１０００ng、残りの６匹は１５００ngで処置した。創傷にはカバーも縫合もしなかった。各処置グループから２匹ずつ、６匹の動物を創傷形成後７日で、次の６匹は創傷後４０日で、残りの６匹は創傷後８０日で、全てクロロホルム過剰投与と首の脱臼により屠殺した。ＰＣベースの影像検索システムを用いて無傷の剃毛した皮膚の肉眼的影像をセーブした。背側皮膚を除去し、創傷周辺の正常皮膚を余分におよそ０．５cmとって全厚創傷を切り取った。その組織の半分はホルマール塩水中に固定して定型のワックス組織学用に処理し、もう一方の半分はＯＣＴ包埋培地に浸し、免疫細胞化学分析用に液体窒素で急凍させた。
ワックス組織学
標準ミクロトームにより７μm切片を切り取り、その切片を細胞性および脈管形成について試験するためのヘマトキシリンおよびエオシン（Haematoxylin & Eosin）で染色し、さらにコラーゲン組織化のためにメイソン・トリクロム（Masson’s Trichrome）染色した。
結果
肉眼
正常な創傷のない皮膚を示す０から肥大性瘢痕形成を示す１０までの範囲の標準目視アナログ評点システムを用いた。１０cmの見えない線を白紙片に引き、屠殺したばかり各ラットの剃毛背側表面上の４つの瘢痕を、各瘢痕毎に別の線で０と１０の間の線に沿って記しを付けることによりスコアをつけた。４０日および８０日目の瘢痕のみスコアをつけた（即ち、各時点でラット６匹、２４創傷）。
４０日目の肉眼分析では、最大用量のインヒビン（１５００ng／１００μl注射）で処置した創傷は、１０００ng／１００μl注射または２５０ng／１００μl注射で処理した創傷（それぞれ、平均スコア５と４．６）と比較して明らかに最も小さい瘢痕であることが示された。しかしながら、８０日目で、最低用量のインヒビン（２５０ng／１００μl注射）で処置した創傷の平均肉眼スコア（４．５１）は、２つのより高用量（１５００ng／１００μl注射および１０００ng／１００μl注射）の場合のスコアよりもかなり良く、それぞれ５．２７５と５．３７５というよく似た平均スコアであった。
組織学
創傷形成後７日
創傷形成後７日目で創傷は全て再上皮化した。ＰＢＳ処置と非処置対照創傷との間には何の相異もなかった。１５００ng／１００μl注射および１０００ng／１００μl注射で処置した創傷ベースでは多数の炎症細胞があり、対照創傷と比べ新たなコラーゲン量はそれほど多くなかった。２５０ng／１００μl注射で処置した創傷は、幅が狭く、炎症細胞を多く含有せず、新たなコラーゲン量が多かった。
創傷形成後４０日および８０日
標準目視類似物スコアシステムを用いて、４０日目と８０日目の創傷を評価した。結果は表４に示す。
４０日目、２５０ng／１００μl注射で処置した創傷は最悪の皮膚構造であり、コラーゲンは密集して束になって平行に並んでおり、これは平均スコア７．４に反映された。１０００ng／１００μl注射で処置した創傷は、平均スコア６．０であり、ＰＢＳ処置対照創傷（６．２）と似ていた。１０００および１５００ng／１００μl注射で処置したグループ中の非処置対照創傷は、最高の平均スコアを持ち、これは恐らく全身性作用を示している。創傷の組織学的スコアは肉眼での外観と一致しており、これはこの段階で観察された優れた皮膚構造に反映された（４．７）。
創傷後８０日目で、２５０ng／１００μl注射で処置した創傷の組織学的外観は、１０００または１５００ng／１００μl注射で処置した創傷よりも良好であった。コラーゲン束は、特に瘢痕の頂部、表皮の真下では、より低い密集度で束になっており、より無作為に配向していた。この用量で処置した瘢痕のうち１つだけは幅が広く、質が悪かった。１０００ng／１００μl注射処置を施した創傷は、創傷全体でコラーゲンが密集して束になっており、１５００ng／１００μl注射で処置した創傷は、あるものはその頂部で比較的目の粗いコラーゲン配向を有したが、コラーゲンが特に密集している所からすれば、全般的に非常に幅が広かった。
要約
これらの結果は、この研究で使用した最低用量のインヒビン（２５０ng／１００μl注射）が抗瘢痕形成作用を持つことを示している。予備実験からは、５００ng／１００μl注射の用量もまた僅かに抗廠痕形成作用を持つことが示された。故に、インヒビンを外部から添加すると抗瘢痕作用が生じるようであり、そのデータはインヒビンの最適用量がこの処置型では２５０から５００ng／１００μl注射の間であることを示している。

Claims

活性成分としてアクチビンを含む、当該活性成分の有効量を５ng／１００μｌ以上の濃度で適用することにより、皮膚創傷および線維性障害の、瘢痕形成が少ない治癒を促進するための、薬物。
創傷が慢性創傷である、請求項１に記載の薬物。
薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤と併用して処方される、請求項１または２に記載の薬物。
創傷形成の直前または直後に使用する、請求項１−３のいずれかに記載の薬物。
創傷形成から１４日間以内に使用する、請求項１−３のいずれかに記載の薬物。
創傷形成から７日間以内に使用する、請求項５に記載の薬物。
創傷形成から３日間以内に使用する、請求項６に記載の薬物。