CN113150112A - 抗人乳头瘤病毒16 e7的t细胞受体 - Google Patents

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Abstract

公开了对人乳头瘤病毒(HPV)16E7，E711‑19的HLA‑A2‑限制性表位具有抗原特异性的合成T细胞受体(TCR)。还提供了相关的多肽和蛋白、以及相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞和细胞群体。还提供了与本发明的TCR相关的抗体或其抗原结合部分以及药物组合物。还公开了检测哺乳动物中病况的存在的方法以及治疗或预防哺乳动物中的病况的方法，其中所述病况为癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌。

Description

抗人乳头瘤病毒16 E7的T细胞受体
相关申请的交叉引用
本专利申请是中国专利申请第201580031789.X号的分案申请，并要求于2014年5月29日提交的美国临时专利申请第62/004,335号的权益，所述临时专利申请通过引用整体并入本文。
关于政府支持的声明
本发明是与美国国立卫生研究院国家癌症研究所在项目号ZIABC010984-5和ZIABC011479的政府支持下一起完成的。政府享有本发明的某些权力。
以电子方式提交的材料通过引用并入
通过引用整体并入本文的是随本文同时提交的并且如下确定的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：名称为“720940_ST25.TXT”，日期为2015年5月28日的一份78,607字节的ASCII(文本)文件。
发明背景
一些癌症类型，例如宫颈癌的主要原因是人乳头瘤病毒(HPV)感染。尽管在诸如化疗的治疗中取得进展，但包括HPV相关癌症在内的许多癌症的预后可能很差。因此，存在对癌症，特别是HPV相关癌症的其他治疗的未得到满足的需求。
发明概述
本发明的实施方案提供了分离的或纯化的T细胞受体(TCR)，其对人乳头瘤病毒(HPV)16E7具有抗原特异性。
本发明的另一实施方案提供了包含人可变区和鼠恒定区的TCR，或TCR的功能变体，其中TCR和功能变体对人乳头瘤病毒(HPV)16E7具有抗原特异性。
本发明还提供了相关的多肽和蛋白以及相关的核酸、重组表达载体、宿主细胞和细胞群体。本发明还提供了与本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)相关的抗体或其抗原结合部分以及药物组合物。
本发明还提供了检测哺乳动物中病况的存在的方法以及治疗或预防哺乳动物中的病况的方法，其中病况为癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌。本发明的检测哺乳动物中病况的存在的方法包括(i)将包含病况的细胞的样品与本文所述的本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞、宿主细胞群体、抗体或其抗原结合部分、或药物组合物的任何一种相接触，从而形成复合物，以及(ii)检测所述复合物，其中检测到复合物指示哺乳动物中病况的存在，其中所述病况为癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌。
本发明的治疗或预防哺乳动物中的病况的方法包括以有效治疗或预防哺乳动物中病况的量向哺乳动物施用本文所述的TCR(包括其功能部分和功能变体)、多肽或蛋白的任何一种，包含编码本文所述的TCR(包括其功能部分和功能变体)、多肽、蛋白的任何一种的核苷酸序列的任何核酸或重组表达载体，或包含编码本文所述的TCR(包括其功能部分和功能变体)、多肽或蛋白的任何一种的重组载体的任何宿主细胞或宿主细胞群体，其中所述病况为癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌。
附图中几个视图的简述
图1为显示在与靶标(用HPV 16 E629-38肽脉冲刺激的293-A2细胞、用HPV 16E711-19肽脉冲刺激的293-A2细胞、用编码HPV 16 E6的质粒转导的624细胞、用编码HPV 16E7的质粒转导的624细胞、SCC152细胞、SCC90细胞、CaSki细胞、Alb细胞、Panc1细胞或SiHa细胞)共培养后，用编码嵌合抗-HPV 16 E7 TCR(有阴影的柱)的核苷酸序列转导的外周血淋巴细胞(PBL)分泌的干扰素(IFN)-γ(pg/mL)的柱状图。各靶细胞的HLA-A2和HPV-16 E7表达显示在图1的底部(“+”表示表达呈阳性，“–”表示表达呈阴性)。将未转导的细胞(无阴影的柱)用作阴性对照。
图2A-2R为显示来自用表1中所示的表达下述的重组表达载体之一转导(B-I和K-R)的第一供体(A-I)或第二供体(J-R)的细胞的百分比的点状图：HLA-A2/E711-19四聚体+/mTRBC-(左上象限)、HLA-A2/E711-19四聚体+/m TRBC+(右上象限)、HLA-A2/E711-19四聚体-/mTRBC-(左下象限)和HLA-A2/E711-19四聚体-/m TRBC+(右下象限)。各个象限的数值百分比提供在各点状图的上部。将未转导的细胞(A和J)用作阴性对照。
图3A和3B为显示在与靶标(624、CaSki、SCC90或SCC152细胞)共培养后，来自用表1中所示的重组表达载体之一转导的供体1(A)或供体2(B)的效应细胞的IFN-γ分泌的图。对于各靶细胞系，有阴影的柱(从左至右)对应于用下述载体转导的效应细胞：嵌合抗-HPV 16E7TCR(α/β)、Cys-修饰的TCR(α/β)、LVL-修饰的TCR(α/β)、LVL-Cys-修饰的TCR(α/β)、嵌合抗-HPV 16 E7 TCR(β/α)、Cys-修饰的TCR(β/α)、LVL-修饰的TCR(β/α)或LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)。将未转导的细胞(无阴影的柱)用作阴性对照。
图4为显示在与靶标(用HPV 16 E629-38肽脉冲刺激的293-A2细胞、用HPV 16E711-19肽脉冲刺激的293-A2细胞、用编码HPV 16 E6的质粒转导的624细胞、用编码HPV 16E7的质粒转导的624细胞、SCC152细胞、SCC90细胞、CaSki细胞、Ane细胞、Alb细胞、Panc1细胞或SiHa细胞)共培养后，用编码LVL-修饰的TCR(β/α)(SEQ ID NO:37)(有阴影的柱)的逆转录病毒载体转导的PBL分泌的IFN-γ(pg/mL)的图。各靶细胞的HLA-A2和HPV-16 E7表达显示在图4的底部(“+”表示表达呈阳性，“–”表示表达呈阴性)。将未转导的细胞(无阴影的柱)用作阴性对照。
图5为显示在无抗体(黑色柱)或在存在抗-MHC I类抗体(灰色柱)或抗-MHC II类抗体(无阴影的柱)的情况下，在与靶标(624细胞、SCC90细胞或CaSki细胞)共培养后，用编码LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)的逆转录病毒载体转导的PBL分泌的IFN-γ(pg/mL)的图。作为对照，在无抗体或在存在抗-MHC I类抗体或抗-MHC II类抗体的情况下，将PBL用DMF5 TCR转导并与624细胞共培养，或者用抗-MAGE A3 TCR转导并与526-CIITA细胞共培养。
图6A-6D为显示以不同的效应细胞：靶标比率，与用编码LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)(正方形)的逆转录病毒载体转导的效应细胞共培养的靶细胞CaSki(A)、SCC90(B)、SCC152(C)或624细胞(D)的特异性裂解(％)的图。将未转导的细胞(圆圈)用作阴性对照。
图7A和7B为显示在与用不同浓度的HPV 16 E711-19肽(A)或HPV16 E629-38肽(B)脉冲刺激的靶细胞共培养后，用编码LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)(有阴影的柱)或抗-HPV 16 E6 TCR DCA2E6(无阴影的柱)的逆转录病毒载体转导的PBL分泌的IFN-γ(pg/mL)的图。
图8A为显示在与靶标(624细胞、Caski细胞、SCC90细胞或SCC152细胞)共培养后，用编码LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)(黑色柱)或DCA2E6 TCR(灰色柱)的逆转录病毒载体转导的PBL分泌的IFN-γ(pg/mL)的图。将未转导的细胞(无阴影的柱)用作阴性对照。
图8B为显示在与靶标(用HPV 16 E629-38肽脉冲刺激的293-A2靶细胞、用HPV 16E711-19肽脉冲刺激的293-A2细胞、SCC152细胞、SCC90细胞、CaSki细胞、Ane细胞、Alb细胞、Panc1细胞或SiHa细胞)共培养后，用编码Cys-修饰的TCR(β/α)(黑色柱)或DCA2E6 TCR(灰色柱)的逆转录病毒载体转导的PBL分泌的IFN-γ(pg/mL)的图。将未转导的细胞(无阴影的柱)用作阴性对照。
发明详述
本发明的实施方案提供了分离的或纯化的T细胞受体(TCR)，其对人乳头瘤病毒(HPV)16 E7具有抗原特异性。
HPV16为最常见的与恶性肿瘤相关的HPV的亚型。不受特定理论或机制的束缚，HPV16被认为至少部分地通过癌蛋白E7的作用引起癌症，所述癌蛋白E7通过Rb失活保持癌细胞在细胞分裂周期中的活性。HPV 16 E7在癌细胞中组成型表达，并且在正常未感染的人组织中不表达。HPV 16 E7在多种人类癌症中表达，所述人类癌症包括但不限于宫颈癌、口咽癌、肛门癌、肛管癌、直肠肛门癌、阴道癌、外阴癌和阴茎癌。
本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)可以对任何HPV 16E7蛋白、多肽或肽具有抗原特异性。在本发明的实施方案中，TCR(包括其功能部分和功能变体)对HPV 16 E7蛋白具有抗原特异性，所述HPV 16 E7蛋白包含SEQ ID NO:1，由SEQ ID NO:1组成或基本上由SEQ ID NO:1组成。在本发明的优选实施方案中，TCR(包括其功能部分和功能变体)对HPV16 E711-19肽具有抗原特异性，所述HPV 16E711-19肽包含YMLDLQPET(SEQ ID NO:2)，由YMLDLQPET(SEQ ID NO:2)组成，或基本上由YMLDLQPET(SEQ ID NO:2)组成。
在本发明的实施方案中，本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)能够以主要组织相容性复合体(MHC)I类依赖性方式识别HPV16 E7。如本文所用，“MHC I类依赖性方式”意指当在MHC I类分子的背景中结合HPV 16 E7时，TCR(包括其功能部分和功能变体)引发免疫应答。MHC I类分子可以为本领域已知的任何MHC I类分子，例如HLA-A分子。在本发明的优选实施方案中，MHC I类分子为HLA-A2分子。
本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)提供许多优势，包括当由细胞表达时，用于过继性细胞转移。不受特定理论或机制的束缚，认为因为HPV 16 E7由多种癌症类型的HPV 16感染的细胞表达，所以本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)有利地提供破坏多种类型的HPV 16相关癌症的细胞的能力，并且因此能治疗或预防多种类型的HPV 16相关的癌症。另外，不受特定理论或机制的束缚，认为因为HPV 16 E7蛋白仅在癌细胞中表达，所以本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)有利地靶向癌细胞的破坏，同时最小化或消除正常的、非癌性细胞的破坏，从而降低毒性，例如使毒性最小化或消除毒性。此外，本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)可以有利地、成功地治疗或预防HPV阳性癌症，此类癌症不响应于其它治疗类型，诸如，例如，单独的化疗、手术或辐射。另外，本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)提供对HPV 16 E7的高度亲合识别，这可以有利地提供识别未经处理的肿瘤细胞(例如，未用干扰素(IFN)-γ处理的、未用编码HPV 16 E7和HLA-A2中的一种或两种的载体转染的、未用E711-19肽脉冲刺激的或它们的组合处理的肿瘤细胞)的能力。
如本文所用，短语“抗原特异性”意指TCR(包括其功能部分和功能变体)可以以高亲合力特异性结合并免疫识别HPV 16 E7。例如，在与用低浓度的HPV 16 E7肽(例如，约0.05ng/mL至约5ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL或5ng/mL)脉冲刺激的抗原阴性HLA-A2+靶细胞共培养后，如果表达TCR(包括其功能部分和功能变体)的T细胞分泌至少约200pg/mL或更多(例如，200pg/mL或更多、300pg/mL或更多、400pg/mL或更多、500pg/mL或更多、600pg/mL或更多、700pg/mL或更多、1000pg/mL或更多、5,000pg/mL或更多、7,000pg/mL或更多、10,000pg/mL或更多或20,000pg/mL或更多)的IFN-γ，则该TCR(或其功能部分或功能变体)可以被认为对HPV 16 E7具有“抗原特异性”。可选地或另外地，在与用低浓度的HPV 16 E7肽脉冲刺激的抗原阴性HLA-A2+靶细胞共培养后，如果表达TCR(包括其功能部分和功能变体)的T细胞分泌的IFN-γ是未转导的外周血淋巴细胞(PBL)背景水平的IFN-γ的至少两倍，则该TCR(或其功能部分或功能变体)可以被认为对HPV 16 E7具有“抗原特异性”。在与用较高浓度的HPV 16 E7肽脉冲刺激的抗原阴性HLA-A2+靶细胞共培养后，表达本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体)的细胞也可以分泌IFN-γ。
本发明提供了TCR，其包含两条多肽(即，多肽链)，如TCR的阿尔法(α)链、TCR的贝塔(β)链、TCR的伽玛(γ)链、TCR的德耳塔(δ)链或它们的组合。本发明TCR的多肽可包含任何氨基酸序列，前提是TCR对HPV 16 E7具有抗原特异性。
在本发明的实施方案中，TCR包含两条多肽链，每条多肽链包含含有TCR的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3的人可变区。在本发明的实施方案中，TCR包含第一多肽链和第二多肽链，所述第一多肽链包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR1(α链的CDR1)、含有SEQID NO:4的氨基酸序列的CDR2(α链的CDR2)和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR3(α链的CDR3)，所述第二多肽链包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR1(β链的CDR1)、含有SEQID NO:7的氨基酸序列的CDR2(β链的CDR2)和含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR3(β链的CDR3)。在这方面，本发明的TCR可以包含选自SEQ ID NO:3-8的任何一个或多个氨基酸序列。优选地，TCR包含SEQ ID NO:3-5或SEQ ID NO:6-8。在特别优选的实施方案中，TCR包含SEQ ID NO:3-8的氨基酸序列。
在本发明的实施方案中，TCR可以包含含有上文所示的CDR的TCR的可变区的氨基酸序列。在这方面，TCR可以包含SEQ ID NO:9(人α链的可变区)的氨基酸序列；SEQ ID NO:10的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:10的第2位的X为Ala或Gly(β链的可变区)；SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10两者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:10的第2位的X为Ala或Gly；SEQ IDNO:11(人β链的可变区)的氨基酸序列；或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11两者的氨基酸序列。当SEQ ID NO:10的第2位的X为Gly时，SEQ ID NO:10对应于SEQ ID NO:11。优选地，本发明的TCR包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10两者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:10的第2位的X为Ala。
本发明的TCR还可以包含来源于任何合适的物种，诸如，例如，人或小鼠的恒定区。在本发明的实施方案中，TCR还包含人恒定区。在这方面，TCR可以包含SEQ ID NO:14(人α链的恒定区)、SEQ ID NO:15(人β链的恒定区)或SEQ ID NO:14和15两者的氨基酸序列。
在本发明的实施方案中，本发明的TCR可以包含可变区和恒定区的组合。在这方面，TCR可以包含含有SEQ ID NO:9(人α链的可变区)和SEQ ID NO:14(人α链的恒定区)两者的氨基酸序列的α链；含有SEQ ID NO:11(人β链的可变区)和SEQ ID NO:15(人β链的恒定区)两者的氨基酸序列的β链；含有SEQ ID NO:10，其中SEQ ID NO:2的第2位的X为Ala或Gly(β链的可变区)和SEQ ID NO:15(人β链的恒定区)两者的氨基酸序列的β链；全部SEQ IDNO:9、11、14和15的氨基酸序列；或者全部SEQ ID NO:9、10、14和15的氨基酸序列。
在本发明的实施方案中，本发明的TCR可以包含TCR的α链和TCR的β链。本发明的TCR的α链和β链各自可以独立地包含任何氨基酸序列。在这方面，本发明的TCR的α链可以包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。这种类型的α链可以与TCR的任何β链成对。在这方面，本发明的TCR的β链可以包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。因此，本发明的TCR可以包含SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:12和13两者的氨基酸序列。优选地，本发明的TCR为包含SEQ ID NO:12和13两者的氨基酸序列的人TCR。
本发明的另一实施方案提供了包含人可变区和鼠恒定区的嵌合TCR或所述TCR的功能变体，其中所述TCR和功能变体对人乳头瘤病毒(HPV)16 E7具有抗原特异性。嵌合TCR或其功能变体可以包含如本文关于本发明的其它方面所述的任何CDR区。在本发明的另一实施方案中，嵌合TCR或其功能变体可以包含如本文关于本发明的其它方面所述的任何可变区。
当提到本文所述的TCR或TCR的任何成分(例如，互补决定区(CDR)、可变区、恒定区、α链和/或β链)时，本文使用的术语“鼠”或“人”意指分别来源于小鼠或人的TCR(或其成分)，即分别源自或同时由小鼠T细胞或人T细胞表达的TCR(或其成分)。
在本发明的实施方案中，本发明的嵌合TCR包含鼠恒定区。在这方面，TCR可以包含SEQ ID NO:17(鼠α链的恒定区)、SEQ ID NO:19(鼠β链的恒定区)或SEQ ID NO:17和19两者的氨基酸序列。在优选的实施方案中，本发明的TCR为包含人可变区和鼠恒定区两者的嵌合TCR。
在本发明的实施方案中，本发明的嵌合TCR可以包含可变区和恒定区的组合。在这方面，TCR可以包含含有SEQ ID NO:9(人α链的可变区)和SEQ ID NO:17(鼠α链的恒定区)两者的氨基酸序列的α链；含有SEQ ID NO:11(人β链的可变区)和SEQ ID NO:19(鼠β链的恒定区)两者的氨基酸序列的β链；含有SEQ ID NO:10，其中SEQ ID NO:10的第2位的X为Ala或Gly(β链的可变区)和SEQ ID NO:19(鼠β链的恒定区)两者的氨基酸序列的β链；全部SEQ IDNO:9、11、17和19的氨基酸序列；或全部SEQ ID NO:9、10、17和19的氨基酸序列。在实施方案中，本发明的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:20的全长β链。在这方面，TCR可以包含全部SEQID NO:9、17和20。
包括在本发明范围内的是本文所述的本发明的TCR的功能变体。本文使用的术语“功能变体”是指与亲本TCR、多肽或蛋白具有大量的或显著的序列同一性或相似性的TCR、多肽或蛋白，所述功能变体保留了其中产生变体的TCR、多肽或蛋白的生物活性。功能变体涵盖，例如，保留了以与亲本TCR、多肽或蛋白类似的程度、以与亲本TCR、多肽或蛋白相同的程度或以比亲本TCR、多肽或蛋白更高的程度特异性结合HPV 16 E7的能力的本文所述的TCR、多肽或蛋白(亲本TCR、多肽或蛋白)的那些变体，亲本TCR对HPV 16E7具有抗原特异性或亲本多肽或蛋白特异性结合HPV 16E7。关于亲本TCR、多肽或蛋白，功能变体的氨基酸序列与亲本TCR、多肽或蛋白的氨基酸序列可以，例如，具有至少约30％、50％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。
功能变体可以，例如，包含具有至少一个保守性氨基酸置换的亲本TCR、多肽或蛋白的氨基酸序列。保守性氨基酸置换为本领域已知的，并且包括其中具有某些物理和/或化学性质的一个氨基酸被更换为具有相同化学或物理性质的另一氨基酸的氨基酸置换。例如，保守性氨基酸置换可以为酸性氨基酸置换为另一酸性氨基酸(例如，Asp或Glu)、具有非极性侧链的氨基酸置换为具有非极性侧链的另一氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val等)、碱性氨基酸置换为另一碱性氨基酸(Lys、Arg等)、具有极性侧链的氨基酸置换为具有极性侧链的另一氨基酸(Asn、Cys、Gln、Ser、Thr、Tyr等)等。
可选地或另外地，功能变体可以包含具有至少一个非保守性氨基酸置换的亲本TCR、多肽或蛋白的氨基酸序列。在这种情况下，优选的是不会干扰或抑制功能变体的生物活性的非保守性氨基酸置换。优选地，非保守性氨基酸置换增强功能变体的生物活性，以使得与亲本TCR、多肽或蛋白相比，功能变体的生物活性增加。
在本发明的实施方案中，功能变体包含在α或β链的恒定区中具有一个、两个、三个或四个氨基酸置换的本文所述的任何TCR的氨基酸序列。优选地，功能变体包含在鼠恒定区中具有一个、两个、三个或四个氨基酸置换的本文所述的任何鼠恒定区的氨基酸序列。在一些实施方案中，与包含未置换的氨基酸序列的亲本TCR相比，包含置换的氨基酸序列的TCR(或其功能部分)有利地提供增加的HPV 16 E7+靶标的识别、增加的宿主细胞的表达和增加的抗肿瘤活性中的一种或多种。通常，TCRα和β链的鼠恒定区的置换的氨基酸序列SEQ IDNO:16和18分别与未置换的鼠恒定区氨基酸序列SEQ ID NO:17和19的全部或部分相对应，其中与SEQ ID NO:17相比，SEQ ID NO:16具有一个、两个、三个或四个氨基酸置换，并且与SEQ ID NO:19相比，SEQ ID NO:18具有一个氨基酸置换。在这方面，本发明的实施方案提供了包含以下氨基酸序列的TCR功能变体：(a)SEQ ID NO:16(α链的恒定区)，其中(i)第48位的X为Thr或Cys；(ii)第112位的X为Ser、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；(iii)第114位的X为Met、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；和(iv)第115位的X为Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；以及(b)SEQ ID NO:18(β链的恒定区)，其中第56位的X为Ser或Cys。在本发明的实施方案中，包含SEQ ID NO:16的TCR功能变体不包含SEQ IDNO:17(α链的未置换的鼠恒定区)。在本发明的实施方案中，包含SEQ ID NO:18的TCR功能变体不包含SEQ ID NO:19(β链的未置换的鼠恒定区)。
在本发明的实施方案中，置换的氨基酸序列包括α和β链之一或两者的恒定区中的半胱氨酸置换，以提供半胱氨酸-置换的TCR。在α和β链中的相对的半胱氨酸提供二硫键，所述二硫键将置换的TCR的α和β链的恒定区彼此连接，并且其不存在于包含未置换的人恒定区或未置换的鼠恒定区的TCR中。在这方面，TCR的功能变体是半胱氨酸-置换的嵌合TCR，在该嵌合TCR中，SEQ ID NO:17的天然Thr48和SEQ ID NO:19的天然Ser56之一或两者可以被Cys置换。优选地，SEQ ID NO:17的天然Thr48和SEQ ID NO:19的天然Ser56均被Cys置换。在实施方案中，半胱氨酸-置换的嵌合TCR包含α链恒定区和β链恒定区，所述α链恒定区包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，其中第48位的X为Cys，第112位的X为天然Ser，第114位的X为天然Met，以及第115位的X为天然Gly；所述β链恒定区包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，其中第56位的X为Cys。优选地，半胱氨酸-置换的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的α链恒定区和含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的β链恒定区。本发明的半胱氨酸-置换的嵌合TCR可以包含除本文所述的任何CDR和/或可变区之外的置换的恒定区。在这方面，半胱氨酸-置换的嵌合TCR可以包含以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:3-5和24；(ii)SEQ IDNO:9和24；(iii)SEQ ID NO:6-8和23；(iv)SEQ ID NO:10和23，其中SEQ ID NO:10的第2位的X为Ala或Gly；(v)SEQ ID NO:11和23；(vi)SEQ ID NO:9和16；(vii)SEQ ID NO:10和18；(viii)SEQ ID NO:11和18；(ix)SEQ ID NO:3-5和16；或(x)SEQ ID NO:6-8和18。优选地，半胱氨酸-置换的嵌合TCR包含以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:3-8和23-24；(ii)SEQ ID NO:9-10和23-24；(iii)SEQ ID NO:9、11和23-24；(iv)SEQ ID NO:3-8、16和18；(v)SEQ ID NO:9-10、16和18；或(vi)SEQ ID NO:9、11、16和18。在实施方案中，Cys-置换的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:27的全长β链。在这方面，Cys-置换的嵌合TCR可以包含SEQ ID NO:9和24；SEQID NO:27；或全部SEQ ID NO:9、24和27。
在本发明的实施方案中，置换的氨基酸序列包括用疏水性氨基酸置换α和β链之一或两者的恒定区的跨膜(TM)结构域中的一个、两个或三个氨基酸以提供疏水性氨基酸-置换的TCR(在本文也称为“LVL-修饰的TCR”)。与TM结构域中没有疏水性氨基酸置换的TCR相比，TCR的TM结构域中的疏水性氨基酸置换可以增加TCR的TM结构域的疏水性。在这方面，TCR的功能变体为LVL-修饰的嵌合TCR，在该嵌合TCR中，SEQ ID NO:17的天然Ser112、Met114和Gly115中的一个、两个或三个可以独立地被Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp置换；优选被Leu、Ile或Val置换。优选地，SEQ ID NO:17的全部三个天然Ser112、Met114和Gly115可以独立地被Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp置换；优选被Leu、Ile或Val置换。在实施方案中，LVL-修饰的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的α链恒定区，其中第48位的X为天然Thr，第112位的X为Ser、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp，第114位的X为Met、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp，和第115位的X为Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp，以及含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的β链恒定区，其中包含SEQ ID NO:16的LVL-修饰的嵌合TCR不包含SEQ ID NO:17(α链的未置换的鼠恒定区)。优选地，LVL-修饰的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的α链恒定区以及含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的β链恒定区。本发明的LVL-修饰的嵌合TCR可以包含除本文所述的任何CDR和/或可变区之外的置换的恒定区。在这方面，LVL-修饰的嵌合TCR可以包含：(i)SEQ ID NO:3-5和21；(ii)SEQ ID NO:9和21；(iii)SEQ ID NO:6-8和19；(iv)SEQ ID NO:10和19，其中SEQ ID NO:10的第2位的X为Ala或Gly；(v)SEQ ID NO:11和19；(vi)SEQ ID NO:9和16；(vii)SEQ ID NO:3-5和16；(x)SEQ ID NO:6-8和18；(viii)SEQ IDNO:10和18；或(ix)SEQ ID NO:11和18。优选地，半胱氨酸-置换的嵌合TCR包含以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:3-8、19和21；(ii)SEQ ID NO:9-10、19和21；(iii)SEQ ID NO:9、11、19和21；(iv)SEQ ID NO:3-8、16和18；(v)SEQ ID NO:9-10、16和18；或(vi)SEQ ID NO:9、11、16和18。在实施方案中，LVL-修饰的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的全长α链以及含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的全长β链。在这方面，LVL-修饰的嵌合TCR可以包含SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:20和22两者。
在本发明的实施方案中，置换的氨基酸序列包括在α和β链之一或两者的恒定区中的半胱氨酸置换与用疏水性氨基酸置换α和β链之一或两者的恒定区的跨膜(TM)结构域中的一个、两个或三个氨基酸的组合(在本文也称为“半胱氨酸-置换的LVL-修饰的TCR”)。在这方面，TCR的功能变体为半胱氨酸-置换的LVL-修饰的嵌合TCR，在该嵌合TCR中，SEQ IDNO:17的天然Thr48被Cys置换；SEQ ID NO:17的天然Ser112、Met114和Gly115中的一个、两个或三个独立地被Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp置换；优选被Leu、Ile或Val置换；以及SEQ ID NO:19的天然Ser56被Cys置换。优选地，SEQ ID NO:17的全部三个天然Ser112、Met114和Gly115可以独立地被Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp置换；优选地被Leu、Ile或Val置换。在实施方案中，半胱氨酸-置换的LVL-修饰的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的α链恒定区，其中第48位的X为Cys，第112位的X为Ser、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp，第114位的X为Met、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp，和第115位的X为Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp，以及含有SEQ IDNO:18的氨基酸序列的β链恒定区，其中第56位的X为Cys，其中包含SEQ ID NO:16的半胱氨酸-置换的LVL-修饰的嵌合TCR不包含SEQ ID NO:17(α链的未置换的鼠恒定区)。优选地，半胱氨酸-置换的LVL-修饰的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的α链恒定区以及含有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的β链恒定区。本发明的半胱氨酸-置换的LVL-修饰的嵌合TCR可以包含除本文所述的任何CDR和/或可变区之外的置换的恒定区。在这方面，半胱氨酸-置换的LVL-修饰的嵌合TCR可以包含(i)SEQ ID NO:3-5和25；(ii)SEQ ID NO:9和25；(iii)SEQ ID NO:6-8和23；(iv)SEQ ID NO:10和23,其中SEQ ID NO:10的第2位的X为Ala或Gly；(v)SEQ ID NO:11和23；(vi)SEQ ID NO:3-5和16；(vii)SEQ ID NO:9和16；(viii)SEQID NO:6-8和18；(ix)SEQ ID NO:10和18；或(x)SEQ ID NO:11和18。优选地，半胱氨酸-置换的LVL-修饰的嵌合TCR包含以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:3-8、23和25；(ii)SEQ ID NO:9-10、23和25；(iii)SEQ ID NO:9、11、23和25；(iv)SEQ ID NO:3-8、16和18；(v)SEQ ID NO:9、10、16和18；或SEQ ID NO:9、11、16和18。在特别优选的实施方案中，半胱氨酸-置换的LVL-修饰的嵌合TCR包含含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的全长α链以及含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的全长β链。在这方面，Cys-置换的LVL-修饰的嵌合TCR可以包含SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:26和27两者。
TCR(或其功能变体)、多肽或蛋白可以基本上由本文所述的指定氨基酸序列组成，以使得TCR(或其功能变体)、多肽或蛋白的其它成分，例如，其它氨基酸不会实质上改变TCR(或其功能变体)、多肽或蛋白的生物活性。在这方面，本发明的TCR(或其功能变体)、多肽或蛋白可以例如基本上由SEQ ID NO:12、13、20、22、26、27、29和30中的任何一个氨基酸序列组成。另外，例如，本发明的TCR(包括其功能变体)、多肽或蛋白可以基本上由SEQ ID NO:9、10、11、14-19、21、23-25、SEQ ID NO:9和10两者、SEQ ID NO:9和11两者、SEQ ID NO:14和15两者、SEQ ID NO:16和18两者、SEQ ID NO:17和19两者、SEQ ID NO:23和24两者、SEQ IDNO:19和21两者、或SEQ ID NO:23和25两者的氨基酸序列组成。此外，本发明的TCR(包括其功能变体)、多肽或蛋白可以基本上由SEQ ID NO:3(α链的CDR1)、SEQ ID NO:4(α链的CDR2of)、SEQ ID NO:5(α链的CDR3)、SEQ ID NO:6(β链的CDR1)、SEQ ID NO:7(β链的CDR2)、SEQID NO:8(β链的CDR3)或它们的任意组合，例如SEQ ID NO:3-5；6-8；或3-8的氨基酸序列组成。
本发明还提供了包含本文所述的任何TCR(或其功能变体)的功能部分的多肽。本文使用的术语“多肽”包括寡肽并且是指通过一个或多个肽键连接的氨基酸的单链。
对于本发明的多肽，功能部分可以为包含其中产生部分的TCR(或其功能变体)的连续氨基酸的任何部分，前提是功能部分能特异性结合HPV 16 E7。当结合TCR(或其功能变体)使用时，术语“功能部分”是指本发明TCR(或其功能变体)的任何部分或片段，该部分或片段保留了其中产生部分的TCR(或其功能变体)(亲本TCR或其亲本功能变体)的生物活性。功能部分涵盖，例如，保留了以与亲本TCR(或其功能变体)类似的程度、以与亲本TCR(或其功能变体)相同的程度或以比亲本TCR(或其功能变体)更高的程度特异性结合HPV 16E7(例如，以HLA-A2-依赖性方式)或检测、治疗或预防癌症的能力的TCR(或其功能变体)的那些部分。就亲本TCR(或其功能变体)而言，功能部分可以包含，例如，亲本TCR(或其功能变体)的约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多。
功能部分可以在该部分的氨基端或羧基端或在两端处包含另外的氨基酸，所述另外的氨基酸不存在于亲本TCR或其功能变体的氨基酸序列。期望另外的氨基酸不干扰功能部分的生物功能，例如，特异性结合HPV 16 E7；和/或具有检测癌症、治疗或预防癌症的能力等。更期望的是，与亲本TCR或其功能变体的生物活性相比，另外的氨基酸增强生物活性。
多肽可以包含本发明的TCR或其功能变体的α和β链中的任一个或两者的功能部分，如包含本发明的TCR或其功能变体的α链和/或β链的可变区中的CDR1、CDR2和CDR3的一个或多个的功能部分。在本发明的实施方案中，多肽可以包含含有SEQ ID NO:3(α链的CDR1)、4(α链的CDR2)、5(α链的CDR3)、6(β链的CDR1)、7(β链的CDR2)、8(β链的CDR3)或它们的组合的氨基酸序列的功能部分。优选地，本发明的多肽包含含有SEQ ID NO:3-5；6-8；或全部SEQ ID NO:3-8的功能部分。更优选地，多肽包含含有全部SEQ ID NO:3-8的氨基酸序列的功能部分。
在本发明的实施方案中，本发明的多肽可以包含，例如，含有上文所示的CDR区的组合的本发明的TCR或其功能变体的可变区。在这方面，多肽可以包含SEQ ID NO:9(α链的可变区)、SEQ ID NO:10，其中SEQ ID NO:10的第2位的X为Ala或Gly(β链的可变区)、SEQ IDNO:11(β链的可变区)、SEQ ID NO:9和10两者、或SEQ ID NO:9和11两者的氨基酸序列。优选地，多肽包含SEQ ID NO:9和10两者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:10的第2位的X为Ala。
本发明的多肽还可以包含本文所述的来源于任何合适的物种，诸如，例如，人或小鼠的恒定区或本文所述的任何置换的恒定区。在这方面，多肽可以包含SEQ ID NO:14(人α链的恒定区)、SEQ ID NO:15(人β链的恒定区)、SEQ ID NO:16(如本文关于本发明的其它方面所述置换的α链的恒定区)、SEQ ID NO:17(鼠α链的恒定区)、SEQ ID NO:18(如本文关于本发明的其它方面所述置换的β链的恒定区)、SEQ ID NO:19(鼠β链的恒定区)、SEQ ID NO:21(LVL-修饰的α链的恒定区)、SEQ ID NO:23(Cys-置换的β链的恒定区)、SEQ ID NO:24(Cys-置换的α链的恒定区)、SEQ ID NO:25(Cys-置换的LVL-修饰的α链的恒定区)、SEQ IDNO:14和15两者、SEQ ID NO:16和18两者、SEQ ID NO:17和19两者、SEQ ID NO:19和21两者、SEQ ID NO:23和24两者、或SEQ ID NO:23和25两者的氨基酸序列。优选地，多肽包含SEQ IDNO:14和15两者、SEQ ID NO:16和18两者、SEQ ID NO:17和19两者、SEQ ID NO:19和21两者、SEQ ID NO:23和24两者、或SEQ ID NO:23和25两者。在实施方案中，包含SEQ ID NO:9和11之一或两者的氨基酸序列的多肽是分离的或纯化的。
在本发明的实施方案中，本发明的多肽可以包含可变区和恒定区的组合。在这方面，多肽可以包含SEQ ID NO:9和14两者、SEQ ID NO:9和16两者、SEQ ID NO:9和17两者、SEQ ID NO:9和21两者、SEQ ID NO:9和24两者、SEQ ID NO:9和25两者、SEQ ID NO:10和15两者、SEQ ID NO:10和18两者、SEQ ID NO:10和19两者、SEQ ID NO:10和23两者、SEQ IDNO:11和15两者、SEQ ID NO:11和18两者、SEQ ID NO:11和19两者、SEQ ID NO:11和23两者、全部SEQ ID NO:3-5和14、全部SEQ ID NO:3-5和16、全部SEQ ID NO:3-5和17、全部SEQ IDNO:3-5和21、全部SEQ ID NO:3-5和24、全部SEQ ID NO:3-5和25、全部SEQ ID NO:6-8和15、全部SEQ ID NO:6-8和18、全部SEQ ID NO:6-8和19、全部SEQ ID NO:6-8和23、全部SEQ IDNO:3-8和14-15、全部SEQ ID NO:3-8、16和18、全部SEQ ID NO:3-8、17和19、全部SEQ IDNO:3-8、19和21、全部SEQ ID NO:3-8、23和24、全部SEQ ID NO:3-8、23和25、全部SEQ IDNO:9-10和14-15、全部SEQ ID NO:9-10、16和18、全部SEQ ID NO:9-10、17和19、全部SEQ IDNO:9-10、19和21、全部SEQ ID NO:9-10、23和24、全部SEQ ID NO:9-10、23和25、全部SEQ IDNO:9、11和14-15、全部SEQ ID NO:9、11、16和18、全部SEQ ID NO:9、11、17和19、全部SEQ IDNO:9、11、19和21、全部SEQ ID NO:9、11、23和24、或全部SEQ ID NO:9、11、23和25。可以如本文关于本发明的其它方面所述来置换SEQ ID NO:16和18。在实施方案中，包含(i)SEQ IDNO:9和14以及(ii)SEQ ID NO:11和15之一或两者的氨基酸序列的多肽是分离的或纯化的。
在本发明的实施方案中，本发明的多肽可以包含本文所述的TCR或其功能变体之一的α或β链的整个长度。在这方面，本发明的多肽可以包含以下氨基酸序列：(i)SEQ IDNO:12、13、20、22、26、27、29、30中的任一个；(ii)SEQ ID NO:9、24和27；(iii)SEQ ID NO:9、17和20；或(iv)SEQ ID NO:9、10、16和18。可以如本文关于本发明的其它方面所述来置换SEQ ID NO:16和18。
可选地，本发明的多肽可以包含本文所述的TCR或其功能变体的α和β链。例如，本发明的多肽可以包含SEQ ID NO:12和13两者；SEQ ID NO:20和22两者；SEQ ID NO:26和27两者；全部SEQ ID NO:9、24和27；全部SEQ ID NO:9、17和20；或全部SEQ ID NO:9、10、16和18的氨基酸序列。优选地，多肽包含SEQ ID NO:12和13两者；SEQ ID NO:20和22两者；SEQID NO:26和27两者；全部SEQ ID NO:9、24和27；全部SEQ ID NO:9、17和20；或全部SEQ IDNO:9、10、16和18的氨基酸序列。可以如本文关于本发明的其它方面所述来置换SEQ ID NO:16和18。在实施方案中，包含SEQ ID NO:12和13之一或两者的氨基酸序列的多肽是分离的或纯化的。
本发明还提供了包含本文所述的多肽中的至少一种的蛋白。“蛋白”意指包含一条或多条多肽链的分子。在实施方案中，包含(a)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的氨基酸序列之一或两者，其中SEQ ID NO:10的第2位的X为Gly，或(b)SEQ ID NO:12和13之一或两者的蛋白是分离的或纯化的。
在实施方案中，本发明的蛋白可以包含含有SEQ ID NO:3-5的氨基酸序列的第一多肽链以及含有SEQ ID NO:6-8的氨基酸序列的第二多肽链。可选地或另外地，本发明的蛋白可以包含含有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的第一多肽链以及含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的第二多肽链，其中(i)SEQ ID NO:10的第2位的X为Ala或Gly，以及(ii)包含SEQ IDNO:9和10的蛋白，其中SEQ ID NO:10的第2位的X为Gly，是分离的或纯化的。蛋白可以，例如，包含含有(i)SEQ ID NO:12、(ii)SEQ ID NO:22、(iii)SEQ ID NO:26、(iv)SEQ ID NO:9和16、(v)SEQ ID NO:9和17、或(vi)SEQ ID NO:9和24的氨基酸序列的第一多肽链以及含有(i)SEQ ID NO:10和18，或(ii)SEQ ID NO:13、20和27中任一个的氨基酸序列的第二多肽链，其中包含SEQ ID NO:12和13的蛋白是分离的或纯化的，以及SEQ ID NO:16和18是如本文关于本发明的其它方面所述进行置换的。在这种情况下，本发明的蛋白可以为TCR。可选地，如果，例如，蛋白包含含有SEQ ID NO:12和13两者，SEQ ID NO:20和22两者，SEQ ID NO:26和27两者，全部SEQ ID NO:9、10、16和18，全部SEQ ID NO:9、17和20，全部SEQ ID NO:9、24和27的单条多肽链，或如果蛋白的第一和/或第二多肽链还包含其它氨基酸序列，例如，编码免疫球蛋白或其部分的氨基酸序列，则本发明的蛋白可以为融合蛋白。在这方面，本发明还提供了包含至少一种本文所述的本发明多肽以及至少一种其它多肽的融合蛋白。其它多肽可以作为融合蛋白的单独的多肽存在，或可以以这样的多肽存在：其与本文所述的本发明多肽之一框内(串联)表达。其它多肽可以编码任何肽分子或蛋白分子或它们的部分，包括但不限于免疫球蛋白，CD3，CD4，CD8，MHC分子，CD1分子，例如，CD1a、CD1b、CD1c、CD1d等。
融合蛋白可以包含一个或多个拷贝的本发明多肽和/或一个或多个拷贝的其它多肽。例如，融合蛋白可以包含1、2、3、4、5或更多拷贝的本发明的多肽和/或其它多肽。制备融合蛋白的合适的方法为本领域已知并且包括，例如，重组方法。参见，例如，Choi等,Mol.Biotechnol.31:193-202(2005)。
在本发明的一些实施方案中，本发明的TCR(及其功能部分和功能变体)、多肽和蛋白可以被表达为单个蛋白，其包含连接α链和β链的接头肽。在这方面，本发明的包含SEQ IDNO:12和13两者，SEQ ID NO:20和22两者，SEQ ID NO:26和27，全部SEQ ID NO:9、10、16和18，全部SEQ ID NO:9、17和20，全部SEQ ID NO:9、24和27的TCR(及其功能变体和功能部分)、多肽和蛋白还可以包含接头肽。接头肽可以有利地促进宿主细胞中重组的TCR(包括其功能部分和功能变体)、多肽和/或蛋白的表达。接头肽可以包含任何合适的氨基酸序列。例如，接头肽可以包含SEQ ID NO:28。在本发明的实施方案中，包含α链、β链和接头的蛋白可以包含SEQ ID NO:29(LVL-修饰的嵌合TCR)或SEQ ID NO:30(Cys-置换的LVL-修饰的嵌合TCR)。在宿主细胞表达包含接头肽的构建体后，接头肽可以被切除，从而产生分开的α和β链。
本发明的蛋白可以为包含至少一种本文所述的本发明多肽的重组抗体。如本文所用，“重组抗体”是指包含至少一种本发明的多肽和抗体或其部分的多肽链的重组(例如，基因工程改造的)蛋白。抗体或其部分的多肽可以是抗体的重链、轻链、重链或轻链的可变区或恒定区、单链可变片段(scFv)或Fc、Fab或F(ab)2'片段等。抗体或其部分的多肽链可以作为重组抗体的单独的多肽存在。可选地，抗体或其部分的多肽链可以以这样的多肽存在：所述多肽与本发明的多肽框内(串联)表达。抗体或其部分的多肽可以为任何抗体或任何抗体片段(包括本文所述的任何抗体和抗体片段)的多肽。
本发明的TCR、多肽和蛋白(包括其功能变体)可以为任何长度，即可以包含任何数目的氨基酸，前提是TCR、多肽或蛋白(或其功能变体)保留它们的生物活性，例如，特异性结合HPV 16 E7；检测哺乳动物中的癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌；或治疗或预防哺乳动物中的癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌等的能力。例如，多肽可以为约50至约5000个氨基酸的长度，如50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸的长度。在这方面，本发明的多肽也包括寡肽。
本发明的TCR、多肽和蛋白(包括其功能变体)可以包含代替一个或多个天然存在的氨基酸的合成氨基酸。此类合成氨基酸为本领域已知的，并且包括例如氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰基氨甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’,N’-二苄基-赖氨酸、6-羟赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,γ-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
本发明的TCR、多肽和蛋白(包括其功能变体)可以被糖基化、酰胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-酰化、经由例如二硫桥而环化，或被转化成酸加成盐和/或任选地二聚化或聚合或缀合。
本发明的TCR、多肽和/或蛋白(包括其功能变体)可以通过本领域已知的方法获得。从头合成多肽和蛋白的合适的方法描述在诸如Chan等,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2005；Peptide andProteinDrug Analysis,ed.Reid,R.,Marcel Dekker,Inc.,2000；Epitope Mapping,ed.Westwood等,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2000的参考文献；以及美国专利第5,449,752号中。另外，多肽和蛋白可以利用标准的重组方法使用本文所述的核酸重组产生。参见，例如，Green and Sambrook,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY 2012；以及Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates andJohn Wiley&Sons,NY,1994。此外，本发明的一些TCR、多肽和蛋白(包括其功能变体)可以分离自和/或纯化自诸如植物、细菌、昆虫、哺乳动物(如大鼠、人等)的来源。分离和纯化的方法为本领域熟知的。可选地，本文所述的TCR、多肽和/或蛋白(包括其功能变体)可以通过诸如Synpep(Dublin,CA)、Peptide Technologies Corp.(Gaithersburg,MD)和MultiplePeptide Systems(San Diego,CA)的公司商业合成。在这方面，本发明的TCR(包括其功能变体)、多肽和蛋白可以为合成的、重组的、分离的和/或纯化的。
包括在本发明范围内的是包含本发明的TCR、多肽或蛋白(包括它们的任何功能变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞、宿主细胞群体或抗体或其抗原结合部分的任何一种的缀合物，例如，生物缀合物。缀合物以及通常合成缀合物的方法为本领域已知的(参见，例如，Hudecz,F.,Methods Mol.Biol.298:209-223(2005)和Kirin等,Inorg Chem.44(15):5405-5415(2005))。
本发明的实施方案提供了包含编码本文所述的TCR(包括其功能部分和功能变体)、多肽或蛋白的任何一种的核苷酸序列的核酸序列。本文使用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意指DNA或RNA的聚合物，其可为单链或双链的，合成的或由天然来源获得的(例如分离的和/或纯化的)，其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸，以及其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸间连键，如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键替代未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间存在的磷酸二酯。在实施方案中，核酸包括互补的DNA(cDNA)。通常优选的是核酸不包含任何插入、缺失、倒置和/或置换。然而，在一些情况下，如本文所讨论的，包含一个或多个插入、缺失、倒置和/或置换的核酸可能为合适的。
优选地，本发明的核酸为重组体。如本文所用，术语“重组体”是指(i)通过将天然或合成的核酸区段与可以在活细胞中复制的核酸分子连接而在活细胞外构建的分子，或(ii)由以上(i)中所述的那些分子的复制所产生的分子。为了本文的目的，复制可为体外复制或体内复制。
可以使用本领域已知的程序基于化学合成和/或酶促连接反应构建核酸。参见，例如，Green and Sambrook等，见上文和Ausubel等,见上文。例如，核酸可以使用天然存在的核苷酸或为增加分子的生物稳定性或增加杂交后形成的双链体的物理稳定性而设计的不同修饰的核苷酸(如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)化学合成。可以用于生成核酸的修饰的核苷酸的实例包括但不限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷(beta-D-mannosylqueosine)、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。可选地，本发明的一种或多种核酸可以购自诸如Macromolecular Resources(Fort Collins,CO)和Synthegen(Houston,TX)的公司。
核酸可以包含编码本文所述的TCR、多肽、蛋白或它们的功能变体的任何一种的任何核苷酸序列。在本发明的实施方案中，核苷酸序列可以包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:31(人的野生型TCR的α链，)、SEQ ID NO:32(人的野生型TCR的β链)、SEQ ID NO:33(LVL-修饰的嵌合TCR的α链)、SEQ ID NO:34(嵌合TCR的β链)、SEQ ID NO:35(Cys-置换的LVL-修饰的嵌合TCR的α链)、SEQ ID NO:36(Cys-置换的嵌合TCR的β链)、SEQID NO:31和32两者、SEQ ID NO:33和34两者、或SEQ ID NO:35和36两者。
在本发明的实施方案中，核酸包含非天然核苷酸序列。如果核苷酸序列在自然界中不存在，则该核苷酸序列可以被认为是“非天然的”。在一些实施方案中，核苷酸序列可以为密码子优化的。不受特定理论或机制的束缚，认为核苷酸序列的密码子优化增加mRNA转录物的翻译效率。核苷酸序列的密码子优化可以涉及将天然密码子置换为编码相同氨基酸，但可以被细胞内更容易获得的tRNA翻译的另一密码子，从而增加翻译效率。核苷酸序列的优化还可以减少干扰翻译的mRNA的二级结构，从而增加翻译效率。在本发明的实施方案中，密码子优化的核苷酸序列可以包含以下，由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:33-36、SEQ ID NO:33和34两者或SEQ ID NO:35和36两者。
本发明还提供了核酸，其包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或在严紧条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严紧条件下杂交的核苷酸序列优选在高严紧条件下杂交。“高严紧条件”意指核苷酸序列以可检测地强于非特异性杂交的量与靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性杂交。高严紧条件包括这样的条件：其区分具有精确互补序列的多核苷酸，或仅含有少数分散错配的多核苷酸与碰巧具有匹配核苷酸序列的一些小区域(例如，3-10个碱基)的随机序列。相比14-17个或更多个碱基的全长互补物，此类小的互补区域更容易熔解，并且高严紧杂交使得它们易于被区分。相对高的严紧条件将包括，例如，低盐和/或高温条件，如在约50-70℃的温度下通过约0.02-0.1M NaCl或等同物提供的。此类高严紧条件容许核苷酸序列与模板或靶链之间很少(如果有的话)的错配，并且特别适于检测任何本发明TCR(包括其功能部分和功能变体)的表达。通常应理解可以通过加入增加量的甲酰胺使条件更严紧。
本发明还提供包含与本文所述的任何核酸具有至少约70％或更多，例如，约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同一性的核苷酸序列的核酸。
本发明的核酸可以掺入至重组表达载体中。在这方面，本发明提供了包含本发明的任何核酸的重组表达载体。在本发明的实施方案中，重组表达载体包含编码α链、β链和接头肽的核苷酸序列。例如，在实施方案中，重组表达载体包含含有SEQ ID NO:39(编码嵌合α和β链的SEQ ID NO:20和22(在它们之间具有接头)，其中编码β链的核苷酸序列位于编码α链的核苷酸序列的5’处)或SEQ ID NO:40(编码嵌合α和β链的SEQ ID NO:26和27(在它们之间具有接头)，其中编码β链的核苷酸序列位于编码α链的核苷酸序列的5’处)的密码子优化的核苷酸序列。
为了本文的目的，术语“重组表达载体”意指基因修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当构建体包含编码mRNA、蛋白、多肽或肽的核苷酸序列，并且在足以在宿主细胞内表达mRNA、蛋白、多肽或肽的条件下将载体与宿主细胞接触时，所述基因修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体允许该宿主细胞表达mRNA、蛋白、多肽或肽。本发明的载体并非是整个天然存在的。然而，载体的部分可以为天然存在的。本发明的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，所述DNA和RNA可为单链或双链，合成的或部分由天然来源获得，并且可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在的、非天然存在的核苷酸间连键或这两种类型的连键。优选地，非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间连键不会阻碍载体的转录或复制。
本发明的重组表达载体可以为任何合适的重组表达载体，并且可被用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或这两者的那些载体，如质粒和病毒。载体可以选自pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,CA)、pET系列(Novagen,Madison,WI)、pGEX系列(PharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,CA)。也可使用噬菌体载体，如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。植物表达载体的实例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。优选地，重组表达载体为病毒载体，例如，逆转录病毒载体。在特别优选的实施方案中，重组表达载体为MSGV1载体。
在优选的实施方案中，重组表达载体包含编码本文所述的任何TCR(包括其功能部分和功能变体)的α链和β链的核苷酸序列，其中编码β链的核苷酸序列位于编码α链的核苷酸序列的5’处。在这方面，编码α链的核苷酸序列可以位于编码β链的核苷酸序列的3’处。不受特定理论或机制的束缚，认为相对于编码β链的核苷酸序列位于编码α链的核苷酸序列的3’处，编码β链的核苷酸序列位于编码α链的核苷酸序列的5’处可以提供增加的HPV 16 E7+靶标的识别、增加的宿主细胞的表达和增加的抗肿瘤活性中的任何一种或多种。在次优选的实施方案中，编码β链的核苷酸序列位于编码α链的核苷酸序列的3’处。在这方面，编码α链的核苷酸序列可以位于编码β链的核苷酸序列的5’处。在实施方案中，包含编码LVL-修饰的嵌合TCR(其包含本发明的SEQ ID NO:20和22)的密码子优化的核苷酸序列的MSGV1载体包含SEQ ID NO:37，其中编码β链的核苷酸序列位于编码α链的核苷酸序列的5’处。在另一实施方案中，包含编码Cys-置换的LVL-修饰的嵌合TCR(其包含本发明的SEQ ID NO:26和27)的密码子优化的核苷酸序列的MSGV1载体包含SEQ ID NO:38，其中编码β链的核苷酸序列位于编码α链的核苷酸序列的5’处。
本发明的重组表达载体可以使用在例如Green and Sambrook等,见上文以及Ausubel等,见上文中描述的标准重组DNA技术进行制备。可以制备含有在原核或真核宿主细胞中有功能的复制系统的表达载体的构建体，其为环状或线性的。复制系统可以来源于，例如，ColEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。
期望重组表达载体包含调控序列，如转录和翻译起始密码子和终止密码子，其对待引入载体的宿主细胞类型(例如细菌、真菌、植物或动物)为特异的，视情况而定并且考虑载体是否基于DNA或RNA。
重组表达载体可以包含一个或多个标记基因，所述标记基因允许对转化或转染的宿主细胞进行选择。标记基因包括杀菌剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性，与营养缺陷型宿主细胞互补以提供原养型等。本发明表达载体的合适标记基因包括，例如新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。
重组表达载体可以包含天然或非天然的启动子，其可操作地连接至编码TCR、多肽或蛋白(包括其功能变体)的核苷酸序列或可操作地连接至与编码TCR、多肽或蛋白(包括其功能变体)的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列。启动子的选择，例如强、弱、可诱导的、组织特异的和发育特异的，在本领域普通技术人员的能力内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在本领域技术人员的能力内。启动子可以为非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子或在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中存在的启动子。
本发明的重组表达载体可以被设计用于瞬时表达、用于稳定表达或两者。另外，可以制备用于组成型表达或用于诱导型表达的重组表达载体。此外，可以制备包含自杀基因的重组表达载体。
如本文所用，术语“自杀基因”是指引起表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以为，该基因在细胞中表达后赋予对药剂例如药物的敏感性，并且当细胞与药剂接触或暴露于药剂时引起细胞死亡的基因。自杀基因为本领域已知的(参见，例如，Suicide Gene Therapy:Methods andReviews,Springer,Caroline J.(Cancer Research UKCentre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research,Sutton,Surrey,UK),Humana Press,2004)并且包括，例如，单纯性疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶基因、嘌呤核苷磷酸化酶基因和硝基还原酶基因。
本发明的另一实施方案还提供了包含本文所述的任何重组表达载体的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可以含有本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以为真核细胞，例如，植物、动物、真菌或藻类，或可以为原核细胞，例如，细菌或原生动物。宿主细胞可以为培养的细胞或原代细胞，即直接分离自生物体，例如人。宿主细胞可以为贴壁细胞或悬浮细胞，即悬浮生长的细胞。合适的宿主细胞为本领域已知的并且包括，例如，DH5α大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体的目的，宿主细胞优选为原核细胞，例如，DH5α细胞。为了产生重组的TCR、多肽或蛋白的目的，宿主细胞优选为哺乳动物细胞。最优选地，宿主细胞为人细胞。虽然宿主细胞可以为任何细胞类型的细胞，可以源于任何类型的组织，并且可以为任何发育阶段的细胞，但宿主细胞优选为外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。更优选地，宿主细胞为T细胞。
为了本文的目的，T细胞可为任何T细胞，如培养的T细胞，例如原代T细胞或来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupTl等，或从哺乳动物获得的T细胞。如果从哺乳动物获得，则T细胞可从许多来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或液体。T细胞也可被富集或纯化。优选地，T细胞为人T细胞。更优选地，T细胞为分离自人的T细胞。T细胞可以为任何类型的T细胞并且可以为任何发育阶段的T细胞，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助性T细胞，例如Th1和Th2细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、记忆性T细胞(例如，中心记忆性T细胞和效应记忆性T细胞)、初始T细胞等。
本发明还提供了包含至少一种本文所述的宿主细胞的细胞群体。细胞群体可以为异质群体，除了至少一种不包含任何重组表达载体的其它细胞，例如宿主细胞(例如T细胞)，或T细胞之外的细胞，例如B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等之外，所述异质群体还包含含有所述的任何重组表达载体的宿主细胞。可选地，细胞群体可为大体上同质的群体，其中所述群体主要包含含有重组表达载体的宿主细胞(例如，基本上由其组成)。群体也可为克隆细胞群体，其中群体的所有细胞为包含重组表达载体的单个宿主细胞的克隆，以使得群体的所有细胞包含重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群体为克隆群体，所述克隆群体包含含有如本文所述的重组表达载体的宿主细胞。
在本发明的实施方案中，群体中细胞的数目可以快速地扩增。T细胞数目的扩增可以通过如例如，美国专利8,034,334；美国专利8,383,099；美国专利申请公开号2012/0244133；Dudley等,J.Immunother.,26:332-42(2003)；以及Riddell等,J.Immunol.Methods,128:189-201(1990)中所述的本领域已知的许多方法的任一个来实现。
本发明还提供了抗体或其抗原结合部分，其能特异性结合本文所述的任何TCR的功能部分(或其功能变体)。优选地，功能部分能特异性结合癌症抗原，例如，功能部分包含SEQ ID NO:3(α链的CDR1)、4(α链的CDR2)、5(α链的CDR3)、6(β链的CDR1)、7(β链的CDR2)、8(β链的CDR3)、SEQ ID NO:9(α链的可变区)、SEQ ID NO:10(β链的可变区)、SEQ ID NO:11(β链的可变区)或它们的组合，例如，3-5；6-8；3-8；9；10；11；9-10；或9和11的氨基酸序列。更优选地，功能部分包含SEQ ID NO:3-8；SEQ ID NO:9和10；或SEQ ID NO:9和11的氨基酸序列。在优选的实施方案中，抗体或其抗原结合部分能结合由全部6个CDR(α链的CDR1-3和β链的CDR1-3)形成的表位。抗体可以为本领域已知的任何类型的免疫球蛋白。例如，抗体可以为任何同种型的抗体，例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等。抗体可以为单克隆或多克隆的。抗体可以为天然存在的抗体，例如，分离和/或纯化自哺乳动物(例如，小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等)的抗体。可选地，抗体可以为基因工程改造的抗体，例如，人源化抗体或嵌合抗体。抗体可以为单体形式或聚合形式。另外，抗体可以对本发明TCR(或其功能变体)的功能部分具有任何水平的亲和力或亲合力。期望抗体对本发明的TCR的功能部分(或其功能变体)为特异的，以使得与其它肽或蛋白存在最小的交叉反应。
测试抗体结合本发明TCR的任何功能部分或功能变体的能力的方法为本领域已知的并且包括任何抗体-抗原结合测定，诸如，例如，放射性免疫测定(RIA)、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀和竞争性抑制测定(参见，例如Janeway等,下文和美国专利申请公开号2002/0197266A1)。
制备抗体的合适的方法为本领域已知的。例如，标准杂交瘤方法描述在，例如，
Figure BDA0003019631680000281
and Milstein,Eur.J.Immunol.,5,511-519(1976),Harlow and Lane(eds.),Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press(1988)以及C.A.Janeway等(eds.),Immunobiology,8th Ed.,Garland Publishing,New York,NY(2011))中。可选地，其它方法，如EBV-杂交瘤方法(Haskard and Archer,J.Immunol.Methods,74(2),361-67(1984)以及Roder等,Methods Enzymol.,121,140-67(1986))和噬菌体载体表达系统(参见，例如，Huse等,Science,246,1275-81(1989))为本领域已知的。此外，在非人动物中产生抗体的方法描述在，例如，美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352以及美国专利公开号2002/0197266A1中。
此外，噬菌体展示可用于生成本发明的抗体。在这方面，编码抗体的抗原结合可变(V)结构域的噬菌体文库可以使用标准的分子生物学和重组DNA技术生成(参见，例如，Green and Sambrook等(eds.),Molecular Cloning,A Laboratory Manual,4th Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(2012))。选择编码具有期望特异性的可变区的噬菌体来特异性结合期望抗原，并重建包含选定的可变结构域的完整或部分抗体。将编码重建抗体的核酸序列引入合适的细胞系，诸如用于杂交瘤产生的骨髓瘤细胞，以使得细胞分泌具有单克隆抗体特性的抗体(参见，例如，Janeway等,见上文,Huse等,见上文和美国专利6,265,150)。
抗体可以通过针对特定的重链和轻链免疫球蛋白基因而转基因的转基因小鼠产生。此类方法为本领域已知的并且描述在，例如美国专利5,545,806和5,569,825以及Janeway等,见上文中。
生成人源化抗体的方法为本领域熟知的并且详细描述在例如Janeway等,见上文，美国专利5,225,539、5,585,089和5,693,761，欧洲专利第0239400B1号以及英国专利第2188638号中。人源化抗体也可以使用，例如，美国专利5,639,641和Pedersen等,J.Mol.Biol.,235,959-973(1994)中所述的抗体表面重塑技术生成。
本发明还提供了本文所述的任何抗体的抗原结合部分。抗原结合部分可以为具有至少一个抗原结合位点的任何部分，如Fab、F(ab')2、dsFv、sFv、双抗体和三链抗体。
可以使用常规的重组DNA技术方法(参见，如，Janeway等，见上文)生成单链可变区片段(sFv)抗体片段，其由截短的Fab片段组成，所述截短的Fab片段包含经由合成肽连接至抗体轻链的V结构域的抗体重链的可变(V)结构域。类似地，二硫化物稳定的可变区片段(dsFv)可以通过重组DNA技术制备(参见，例如，Reiter等,Protein Engineering,7,697-704(1994))。然而，本发明的抗体片段不限于这些示例性的抗体片段类型。
另外，抗体或其抗原结合部分可修饰为包含可检测标记，诸如，例如放射性同位素、荧光团(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如金颗粒)。
本发明的TCR、多肽、蛋白(包括其功能变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)可以是分离的和/或纯化的。本文使用的术语“分离的”意指已经脱离其天然环境。本文使用的术语“纯化的”意指纯度已经增加，其中“纯度”为相对术语，并且不一定解释为绝对纯度。例如，纯度可以为至少约50％，可以大于60％、70％、80％、90％、95％或可以为100％。
本发明的TCR、多肽、蛋白(包括其功能变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)，在下文中其全部被统称为“本发明的TCR物质”，可以被配制成组合物，如药物组合物。在这方面，本发明提供了包含本文所述的TCR、多肽、蛋白、功能部分、功能变体、核酸、表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)的任何一种以及药学上可接受的载体的药物组合物。含有任何本发明的TCR物质的本发明的药物组合物可以包含多于一种本发明的TCR物质，例如，多肽和核酸，或两种或更多种不同的TCR(包括其功能部分和功能变体)。可选地，药物组合物可以包含与另一药物活性剂或药物如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗(rituximab)、长春碱、长春新碱等组合的本发明的TCR物质。
优选地，载体为药学上可接受的载体。关于药物组合物，载体可以为常规地用于考虑中的本发明的具体TCR物质的那些中的任何一种。此类药学上可接受的载体为本领域技术人员熟知的并且公众容易获得。优选的是在使用条件下无有害的副作用或毒性的药学上可接受的载体。
载体的选择将部分由本发明的具体TCR物质以及用于施用本发明TCR物质的具体方法来确定。因此，存在本发明的药物组合物的多种合适的制剂。合适的制剂可以包括任何用于口服、肠胃外、皮下、静脉内、肌内、动脉内、鞘内或腹膜内施用的那些制剂。可以使用多于一种途径来施用本发明的TCR物质，并且在某些情况下，特定的途径可以提供比另一途径更直接且更有效的应答。
优选地，本发明的TCR物质通过注射例如静脉内施用。当本发明的TCR物质为表达本发明的TCR(或其功能变体)的宿主细胞时，用于注射的细胞的药学上可接受的载体可以包括任何等渗载体，诸如，例如，生理盐水(约0.90％w/v的NaCl水溶液、约300mOsm/L的NaCl水溶液或约9.0g NaCl/L水)、NORMOSOL R电解质溶液(Abbott,Chicago,IL)、PLASMA-LYTEA(Baxter,Deerfield,IL)、约5％葡萄糖水溶液或林格氏乳酸盐水溶液。在实施方案中，药学上可接受的载体补充有人血清白蛋白。
为了本发明的目的，施用的本发明TCR物质的量或剂量(例如，本发明的TCR物质为一种或多种细胞时的细胞的数目)应足以在合理的时间范围内引起受试者或动物的例如治疗性或预防性响应。例如，本发明的TCR物质的剂量应在从施用时起约2小时或更久，例如12小时至24小时或更久时间的时段内足以结合癌症抗原或检测、治疗或预防癌症。在某些实施方案中，时间段甚至可以更久。剂量将由本发明的具体TCR物质的功效和动物(例如人)的状况以及待治疗的动物(例如人)的体重来确定。
用于确定施用剂量的许多测定为本领域已知的。为了本发明的目的，测定可用于确定待施用于哺乳动物的起始剂量，所述测定包括，将给定剂量的表达本发明TCR(或其功能变体或功能部分)、多肽或蛋白的T细胞施用于一组哺乳动物中的哺乳动物(各自被给予不同剂量的T细胞)后，比较靶细胞裂解或由此类T细胞分泌的IFN-γ所达到的程度。在施用某剂量后，靶细胞裂解或IFN-γ分泌所达到的程度可以通过本领域已知的方法测定。
本发明TCR物质的剂量也通过可能伴随本发明具体TCR物质的施用的任何不利副作用的存在、性质和程度来确定。通常，主治医师决定治疗每个个体患者的本发明TCR物质的剂量，这考虑到多种因素，如年龄、体重、一般健康、饮食、性别、待施用的本发明TCR物质、施用途径以及治疗病况的严重程度。在本发明的TCR物质为细胞群体的实施方案中，每次输注施用的细胞数目可以例如从约1×106至约1×1012个细胞或更多变化。在某些实施方案中，可以施用少于1x 106个细胞。
本领域普通技术人员应容易地理解本发明的TCR物质可以以许多方式进行修饰，以使得本发明TCR物质的治疗性或预防性功效通过修饰增加。例如，本发明的TCR物质可以直接地或通过桥间接地缀合于靶向部分。将化合物，例如本发明的TCR物质缀合于靶向部分的实践为本领域已知的。参见，例如，Wadwa等,J.Drug Targeting 3:111(1995)和美国专利5,087,616。本文使用的术语“靶向部分”是指这样的任何分子或试剂：其特异性识别并结合细胞表面受体，以使得靶向部分定向递送本发明TCR物质至其表面表达受体的细胞群体。靶向部分包括但不限于抗体或其片段、肽、激素、生长因子、细胞因子以及能结合于细胞表面受体(例如，上皮生长因子受体(EGFR)、T细胞受体(TCR)、B-细胞受体(BCR)、CD28、血小板来源的生长因子受体(PDGF)、烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)等)的任何其它天然或非天然的配体。本文使用的术语“桥”是指将本发明的TCR物质连接于靶向部分的任何试剂或分子。本领域普通技术人员意识到，本发明的TCR物质上对本发明TCR物质的功能并非必需的位点是附接桥和/或靶向部分的理想位点，前提是一旦附接到本发明的TCR物质，所述桥和/或靶向部分不会干扰本发明TCR物质的功能，即结合HPV 16 E7；或检测、治疗或预防癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌的能力。
预期本发明的药物组合物、TCR(包括其功能变体)、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞或细胞群体可以用于治疗或预防癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌的方法中。不受特定理论的束缚，认为本发明的TCR(及其功能变体)能特异性结合HPV 16 E7，以使得当由细胞表达时，TCR(或相关的本发明多肽或蛋白及其功能变体)能够介导针对表达HPV16 E7的靶细胞的免疫应答。在这方面，本发明提供了治疗或预防哺乳动物中病况的方法，其包括以有效治疗或预防哺乳动物中病况的量向哺乳动物施用本文所述的药物组合物、TCR(及其功能变体)、多肽或蛋白的任何一种，包含编码本文所述的TCR(及其功能变体)、多肽、蛋白的任何一种的核苷酸序列的任何核酸或重组表达载体，或包含编码本文所述的TCR(及其功能变体)、多肽或蛋白的任何一种的重组载体的任何宿主细胞或细胞群体，其中所述病况为癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌。
本文使用的术语“治疗”和“预防”以及源自于此的词汇不一定意味着100％或完全治疗或预防。相反，存在不同程度的治疗或预防，其被本领域普通技术人员认为具有潜在的益处或治疗效果。在这方面，本发明方法可以提供任何量或任何水平的治疗或预防哺乳动物的病况。此外，本发明方法提供的治疗或预防可以包括正在治疗或预防的病况例如癌症的一种或多种状况或症状的治疗或预防。例如，治疗或预防可以包括促进肿瘤的消退。另外，为了本文的目的，“预防”可以涵盖延迟病况或其症状或状况的发作。
还提供了检测哺乳动物中病况的存在的方法。所述方法包括(i)将包含来自哺乳动物的一种或多种细胞的样品与本文所述的本发明TCR(及其功能变体)、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体或其抗原结合部分、或药物组合物的任何一种相接触，从而形成复合物，以及检测所述复合物，其中检测到复合物指示哺乳动物中病况的存在，其中所述病况为癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌。
关于本发明的检测哺乳动物中病况的方法，细胞的样品可为包含全细胞其裂解物、或全细胞裂解物的一部分，例如细胞核或细胞质部分、全蛋白部分或核酸部分的样品。
为了本发明检测方法的目的，接触可以在相对于哺乳动物的体外或体内发生。优选地，接触为体外的。
另外，复合物的检测可以通过本领域已知的多种方法进行。例如，本文所述的本发明TCR(及其功能变体)、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、或抗体或其抗原结合部分可以用可检测标记，诸如，例如放射性同位素、荧光团(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE))、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶)和元素颗粒(例如，金颗粒)进行标记。
为了本发明方法的目的，其中施用宿主细胞或细胞群体时，所述细胞可为与哺乳动物同种异体或哺乳动物自体的细胞。优选地，细胞为哺乳动物自体的。
关于本发明方法，癌症可为任何癌症，包括急性淋巴细胞性癌症、急性骨髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或直肠肛门癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、阴道癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性癌症、结肠癌、食管癌、宫颈癌、胃肠道类癌肿瘤、胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、阴茎癌、胰腺癌、腹膜癌、网膜癌和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、输尿管癌和膀胱癌。优选的癌症为宫颈癌、口咽癌、肛门癌、肛管癌、直肠肛门癌、阴道癌、外阴癌或阴茎癌的任何一种。特别优选的癌症为HPV 16阳性癌症。虽然最常见的与HPV 16感染相关的癌症包括宫颈癌、口咽癌、肛门癌、肛管癌、直肠肛门癌、阴道癌、外阴癌和阴茎癌，但本发明方法可以用于治疗任何HPV 16阳性癌症，包括在其它解剖区出现的那些癌症。
本发明方法提及的哺乳动物可为任何哺乳动物。如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目的哺乳动物，如小鼠和仓鼠，以及兔形目的哺乳动物，如兔。优选的是哺乳动物来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(犬)。更优选的是哺乳动物来自偶蹄目，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)、或奇蹄目，包括马科动物(马)。最优选的是哺乳动物为灵长目、猿(Ceboids)目或猴(Simoids)目(猴)或类人猿亚目(人和猿)的哺乳动物。特别优选的哺乳动物为人。
本申请还涉及以下实施方案：
实施方案1.T细胞受体(TCR)或所述TCR的功能变体，所述T细胞受体(TCR)包含人可变区和鼠恒定区，其中所述TCR和所述功能变体对人乳头瘤病毒(HPV)16 E7具有抗原特异性。
实施方案2.分离的或纯化的T细胞受体(TCR)，其对人乳头瘤病毒(HPV)16 E7具有抗原特异性。
实施方案3.如实施方案2所述的分离的或纯化的TCR，其包含人恒定区。
实施方案4.如实施方案1所述的TCR或功能变体或者实施方案2或3所述的分离的或纯化的TCR，其中所述TCR对HPV 16 E711-19SEQ ID NO:2具有抗原特异性。
实施方案5.如实施方案1或4所述的TCR或功能变体或者实施方案2-4中任一项所述的分离的或纯化的TCR，其包含SEQ ID NO:3-8的氨基酸序列。
实施方案6.如实施方案1和4-5中任一项所述的TCR或功能变体或者实施方案2-5中任一项所述的分离的或纯化的TCR，其包含以下氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:9和
(b)SEQ ID NO:10，其中第2位的X为Ala或Gly。
实施方案7.如实施方案1和4-6中任一项所述的TCR或功能变体或者实施方案2-6中任一项所述的分离的或纯化的TCR，其包含以下氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:16，其中
(i)第48位的X为Thr或Cys；
(ii)第112位的X为Ser、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)第114位的X为Met、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；以及
(iv)第115位的X为Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；以及
(b)SEQ ID NO:18，其中第56位的X为Ser或Cys。
实施方案8.如实施方案1和4-7中任一项所述的TCR或功能变体或者实施方案2-7中任一项所述的分离的或纯化的TCR，其包含以下氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:14、17、21、24和25中的任一个；以及
(b)SEQ ID NO:15、19和23中的任一个。
实施方案9.如实施方案1和4-8中任一项所述的TCR或功能变体或者实施方案2-8中任一项所述的分离的或纯化的TCR，其包含以下氨基酸序列：
(a)(i)SEQ ID NO:12，(ii)SEQ ID NO:22，(iii)SEQ ID NO:26，(iv)SEQ ID NO:9和24，(v)SEQ ID NO:9和16或(vi)SEQ ID NO:9和17；以及
(b)(i)SEQ ID NO:10和18或(ii)SEQ ID NO:13、20和27中的任一个。
实施方案10.如实施方案1和4-9中任一项所述的TCR或功能变体或者实施方案2-9中任一项所述的分离的或纯化的TCR，其包含SEQ ID NO:29或30的氨基酸序列。
实施方案11.分离的或纯化的多肽，其包含以下的功能部分：(i)实施方案1和4-10中任一项所述的TCR或功能变体或者(ii)实施方案2-10中任一项所述的分离的或纯化的TCR，其中所述功能部分包含以下氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:3-5，(b)SEQ ID NO:6-8，或(c)SEQ ID NO:3-8。
实施方案12.多肽，其包含以下的功能部分：(i)实施方案1和4-10中任一项所述的TCR或功能变体，或者(ii)实施方案2-10中任一项所述的分离的或纯化的TCR，其中所述功能部分包含以下氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:9，(b)SEQ ID NO:10，或(c)SEQ ID NO:9和10，
其中SEQ ID NO:10的第2位的X为Ala或Gly，并且当SEQ ID NO:10的第2位的X为Gly时，所述多肽是分离的或纯化的。
实施方案13.多肽，其包含以下的功能部分：(i)实施方案1和4-10中任一项所述的TCR或功能变体，或者(ii)实施方案2-10中任一项所述的分离的或纯化的TCR，其中所述功能部分包含以下氨基酸序列：
(a)(i)SEQ ID NO:9和24；(ii)SEQ ID NO:9和17；(iii)SEQ ID NO:9和16；(iv)SEQ ID NO:10和18；或(v)SEQ ID NO:12、13、20、22、26、27、29和30中的任一个；
(b)SEQ ID NO:12和13；
(c)SEQ ID NO:20和22；
(d)SEQ ID NO:26和27；
(e)SEQ ID NO:9、24和27；
(f)SEQ ID NO:9、17和20；或
(f)SEQ ID NO:9、10、16和18，
其中包含SEQ ID NO:12和13之一或两者的氨基酸序列的多肽是分离的或纯化的。
实施方案14.包含实施方案11所述的至少一种多肽的分离的或纯化的蛋白或者包含实施方案12或13所述的至少一种多肽的蛋白。
实施方案15.如实施方案14所述的分离的或纯化的蛋白，其包含含有SEQ ID NO:3-5的氨基酸序列的第一多肽链和含有SEQ ID NO:6-8的氨基酸序列的第二多肽链。
实施方案16.如实施方案14或15所述的蛋白，其包含
第一多肽链，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，以及
第二多肽链，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，其中
(i)SEQ ID NO:10的第2位的X为Ala或Gly，以及
(ii)包含SEQ ID NO:9和10的蛋白，其中SEQ ID NO:10的第2位的X为Gly，是分离的或纯化的。
实施方案17.如实施方案14-16中任一项所述的蛋白，其包含
第一多肽链，其包含以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:12，(ii)SEQ ID NO:22，(iii)SEQ ID NO:26，(iv)SEQ ID NO:9和16，(v)SEQ ID NO:9和17，或(vi)SEQ ID NO:9和24，以及
第二多肽链，其包含以下氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:10和18，或(ii)SEQ ID NO:13、20和27中的任一个，
其中包含SEQ ID NO:12和13的蛋白是分离的或纯化的。
实施方案18.包含SEQ ID NO:29或30的蛋白。
实施方案19.如实施方案14-18中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白为融合蛋白。
实施方案20.如实施方案14-19中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白为重组抗体。
实施方案21.(a)核酸序列，其包含编码实施方案1和4-10中任一项所述的TCR或功能变体、实施方案12或13所述的多肽或者实施方案14和16-20中任一项所述的蛋白的核苷酸序列，或者
(b)分离的或纯化的核酸序列，其包含编码实施方案2-10中任一项所述的TCR、实施方案11-13中任一项所述的多肽或者实施方案14-20中任一项所述的蛋白的核苷酸序列。
实施方案22.如实施方案21所述的分离的或纯化的核酸，其包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:31和32两者的核苷酸序列。
实施方案23.如实施方案21所述的核酸，其包含以下核苷酸序列：(a)33-36中任一个，(b)SEQ ID NO:33和34，或(c)SEQ ID NO:35和36。
实施方案24.重组表达载体，其包含实施方案21-23中任一项所述的核酸。
实施方案25.如实施方案24所述的重组表达载体，其中编码β链的核苷酸序列位于编码α链的核苷酸序列的5’。
实施方案26.如实施方案24或25所述的重组表达载体，其包含SEQ ID NO:37、38、39或40。
实施方案27.宿主细胞，其包含实施方案24-26中任一项所述的重组表达载体。
实施方案28.如实施方案27所述的宿主细胞，其中所述细胞为人的。
实施方案29.细胞群体，其包含实施方案27或28所述的至少一种宿主细胞。
实施方案30.抗体或其抗原结合部分，其特异性结合以下的功能部分：(i)实施方案1和4-10中任一项所述的TCR或功能变体，或者(ii)实施方案2-10中任一项所述的分离的或纯化的TCR，其中所述功能部分包含SEQ ID NO:3-8的氨基酸序列。
实施方案31.药物组合物，其包含实施方案1和4-10中任一项所述的TCR或功能变体、实施方案2-10中任一项所述的分离的或纯化的TCR、实施方案11-13中任一项所述的多肽、实施方案14-20中任一项所述的蛋白、实施方案21-23中任一项所述的核酸、实施方案24-26中任一项所述的重组表达载体、实施方案27或28所述的宿主细胞、实施方案29所述的细胞群体、或实施方案30所述的抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的载体。
实施方案32.检测哺乳动物中病况的存在的方法，其包括：
(a)将包含来自所述哺乳动物的一种或多种细胞的样品与实施方案1和4-10中任一项所述的TCR或功能变体、实施方案2-10中任一项所述的分离的或纯化的TCR、实施方案11-13中任一项所述的多肽、实施方案14-20中任一项所述的蛋白、实施方案21-23中任一项所述的核酸、实施方案24-26中任一项所述的重组表达载体、实施方案27或28所述的宿主细胞、实施方案29所述的细胞群体、实施方案30所述的抗体或其抗原结合部分或者实施方案31所述的药物组合物接触，从而形成复合物，以及
(b)检测所述复合物，其中检测到所述复合物指示所述哺乳动物中病况的存在，其中所述病况为癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌。
实施方案33.实施方案1和4-10中任一项所述的TCR或功能变体、实施方案2-10中任一项所述的分离的或纯化的TCR、实施方案11-13中任一项所述的多肽、实施方案14-20中任一项所述的蛋白、实施方案21-23中任一项所述的核酸、实施方案24-26中任一项所述的重组表达载体、实施方案27或28所述的宿主细胞、实施方案29所述的细胞群体、实施方案30所述的抗体或其抗原结合部分或者实施方案31所述的药物组合物，其用于治疗或预防哺乳动物中的病况，其中所述病况为癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌。
实施方案34.用于实施方案33中的用途的TCR、功能变体、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体或其抗原结合部分、或药物组合物，其中所述病况为宫颈癌、口咽癌、肛门癌、肛管癌、直肠肛门癌、阴道癌、外阴癌或阴茎癌。
实施方案35.用于实施方案33或34中的用途的TCR、功能变体、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体或其抗原结合部分、或药物组合物，其中所述病况为HPV 16-阳性癌症。
以下实施例进一步阐明本发明，但当然不应理解为以任何方式限制其范围。
实施例1
本实施例显示从瘤形成物中分离人抗-HPV 16 E7 TCR。
从十四名患者获得来自HPV 16-阳性宫颈上皮内瘤样病变(CIN)II/III的淋巴细胞样品。患者先前已经接受了靶向HPV 16 E7的多次疫苗。使用如先前所述的快速扩增方案(REP)(Dudley等,J.Immunother.26:332-42(2003)和Riddell等,J.Immunol.Methods 128:189-201(1990))扩增宫颈浸润淋巴细胞(CIL)的数目。简言之，将TIL与经辐射的(40Gy)同种异体外周血单核细胞“饲养”细胞在具有30ng/mL抗CD3抗体和6000IU/mL IL-2的完全培养基(CM)中培养。在与用gp100肽、重叠11个氨基酸残基且横跨HPV 16 E6的全长的15-merE6肽库、重叠11个氨基酸残基且横跨HPV 16 E7的全长的15-mer E7肽库、或OKT3脉冲刺激的自体的树突细胞(DC)共培养后，通过测量干扰素(IFN)-γ的分泌来筛选扩增数目的CIL的HPV 16 E7的反应性。一名患者(5048)的CD8+CIL被鉴定为具有HPV 16 E7反应性。还发现患者5048表达HLA-A*02:01。
HLA-A*02:01/E711-19的四聚体被用于确定靶向表位HPV 16 E711-19的来自患者5048的T细胞的存在。使用磁珠分离利用抗-PE抗体分离四聚体-结合的细胞并且进行有限稀释克隆。筛选四聚体结合的T细胞克隆并且鉴定高度结合的克隆。
分离结合HLA-A2/E711-19四聚体的克隆的TCR的α和β链的可变区，并且使用5’cDNA末端快速扩增(RACE)聚合酶链式反应(PCR)测序。包含编码野生型人α链的可变区(其包含SEQ ID NO:9)的cDNA的核苷酸序列获得自TRAV1-2*01/TRAJ7*01。包含编码野生型人β链的可变区(其包含SEQ ID NO:11)的cDNA的核苷酸序列获得自TRBV5-6*01/TRBJ2-1/TRBD2。
实施例2
本实施例显示经转导以表达包含人可变区和小鼠恒定区的嵌合抗-HPV 16 E7TCR的外周血T细胞，表现出HLA-A2/E711-19四聚体的CD8-独立性结合并且识别HLA-A2+HPV-16+肿瘤系。
如下制备包含核苷酸序列的MSGV1重组表达载体，所述核苷酸序列编码含有来源于实施例1的野生型人TCR的人可变区和小鼠恒定区的嵌合抗-HPV 16 E7 TCR。重组表达载体中的核苷酸序列编码实施例1的TCR的α链的可变区和β链的可变区，除了在β链(前导序列)的可变区的第2位，丙氨酸置换天然甘氨酸，以便在重组表达载体中提供NcoI限制位点和Kozak序列。将编码α和β链的鼠恒定区的核苷酸序列(分别为SEQ ID NO:17和19)插入载体来代替各自的人恒定区以提供编码嵌合TCR的核苷酸序列。编码小核糖核酸病毒2A肽(SEQ ID NO:28)的密码子优化的核苷酸序列位于α链与β链之间。编码嵌合α和β链以及接头的核苷酸序列对于在人组织中的表达为密码子优化的。
用来自编码嵌合TCR的MSGV1重组表达载体或编码完全的鼠抗-HPV 16 E7 TCR的载体的逆转录病毒转导外周血细胞。将未转导的细胞用作阴性对照。将转导的细胞用抗-CD8和抗-TRBC(小鼠恒定区)抗体标记并且通过流式细胞术测试与HLA-A2/E711-19四聚体的结合。未转导的细胞(CD8+和CD8-两者)和转导以表达在先前实验中鉴定的对照小鼠抗-HPV16 E7 TCR的细胞(CD8+和CD8-两者)不结合四聚体。用嵌合HPV-16 E7 TCR转导的CD8+和CD8-细胞结合四聚体。因此，用嵌合TCR转导的PBL以CD8-独立性方式结合HLA-A2/E711-19四聚体。还观察到，约50％的转导的表达嵌合TCR的β链的T细胞不结合四聚体。
在单独的实验中，用具有大约50％的转导效率的编码嵌合TCR的MSGV1重组表达载体转导外周血淋巴细胞(PBL)。通过荧光-激活的细胞分选(FACS)测量HLA-A2/E711-19四聚体结合，并且在刺激之后第8天发现25％的细胞结合四聚体。在刺激之后，将转导的细胞与靶标(用HPV 16 E629-38肽(对照)脉冲刺激的293-A2细胞、用HPV 16 E711-19肽脉冲刺激的293-A2细胞、用编码HPV 16 E6的质粒转导的624细胞、用编码HPV 16 E7的质粒转导的624细胞、SCC152细胞、SCC90细胞、CaSki细胞、Alb细胞、Panc1细胞或SiHa细胞)共培养10天。将未转导的细胞用作对照。测量IFN-γ。结果显示在图1中。如图1所示，用编码嵌合TCR的MSGV1重组表达载体转导的PBL以HLA-A2-限制性方式特异性识别HPV 16 E7-阳性肿瘤细胞系和其它HLA-A2+HPV16 E7+靶标。用第二供体的细胞获得的结果是类似的。
实施例3
本实施例显示制备包含人可变区和小鼠恒定区的嵌合抗-HPV 16E7 TCR的方法，其中TCR的α链的恒定区的跨膜(TM)区中的三个天然氨基酸残基各自被疏水性氨基酸残基置换。
如下制备编码包含人可变区和小鼠恒定区的嵌合TCR的核苷酸序列，其中TCR的α链的恒定区的跨膜(TM)区中的三个天然氨基酸残基各自被疏水性氨基酸残基置换。将编码实施例2的嵌合TCR的α和β链的核苷酸序列克隆成单核苷酸序列，其中编码β链的核苷酸序列位于编码α链的核苷酸序列的5’处并且编码小核糖核酸病毒2A肽(SEQ ID NO:28)的核苷酸序列位于α与β链之间。关于野生型α链小鼠恒定区SEQ ID NO:17，α链的TM区中的三个天然的氨基酸残基(即，分别为在第112、114和115位的Ser、Met和Gly)分别被Leu、Ile和Val置换。组合的核苷酸序列对于在人组织中的表达为密码子优化的以提供载体插入物(SEQ IDNO:39)。将载体插入物克隆至MSGV1表达载体中，从而产生SEQ ID NO:37。载体编码的TCR包含α链和β链，所述α链包含含有SEQ ID NO:22的氨基酸序列，所述β链包含含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列(“LVL-修饰的TCR”或“LVL TCR”)。
实施例4
本实施例显示制备包含人可变区和小鼠恒定区的嵌合抗-HPV 16E7 TCR的方法，其中在β和α链中的天然氨基酸残基各自被半胱氨酸残基置换。
如下修饰实施例2的TCR以在α和β链各自的恒定区中包含Cys置换。将编码实施例2的TCR的α链的恒定区(氨基酸SEQ ID NO:17)的核苷酸序列修饰以用Cys置换第48位的天然Thr。将编码实施例2的TCR的β链的恒定区(SEQ ID NO:19)的核苷酸序列修饰以用Cys置换第56位的天然Ser。将编码α和β链的核苷酸序列克隆成单核苷酸序列，其中编码β链的核苷酸序列位于编码α链的核苷酸序列的5’处并且编码小核糖核酸病毒2A肽(SEQ ID NO:28)的核苷酸序列位于α与β链之间。组合的核苷酸序列对于在人组织中的表达为密码子优化的以提供载体插入物。将载体插入物克隆至MSGV1表达载体中。由载体编码的TCR包含α链和β链，所述α链包含含有SEQ ID NO:9和24的氨基酸序列，所述β链包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列(“Cys-修饰的TCR”或“Cys TCR”)。
如下对实施例3的TCR(LVL-修饰的TCR)进一步修饰以在α和β链各自的恒定区中包含Cys置换。将编码实施例3的LVL-修饰的TCR的α链的恒定区(氨基酸SEQ ID NO:21)的核苷酸序列修饰以用Cys置换第48位的天然Thr。将编码实施例3的LVL-修饰的TCR的β链的恒定区(SEQ ID NO:19)的核苷酸序列修饰以用Cys置换第56位的天然Ser。将编码α和β链的核苷酸序列克隆成单核苷酸序列，其中编码β链的核苷酸序列位于编码α链的核苷酸序列的5’处并且编码小核糖核酸病毒2A肽(SEQ ID NO:28)的核苷酸序列位于α与β链之间。组合的核苷酸序列对于在人组织中的表达为密码子优化的以提供载体插入物(SEQ ID NO:40)。将载体插入物克隆至MSGV1表达载体中，从而产生SEQ ID NO:38。由载体编码的TCR包含α链和β链，所述α链包含含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列，所述β链包含含有SEQ ID NO:27的氨基酸序列(“LVL-Cys-修饰的TCR”或“LVL-Cys TCR”)。
实施例5
本实施例显示编码实施例2的嵌合抗-HPV 16 E7 TCR的重组表达载体的修饰改善HPV 16 E711-19四聚体的结合并且改善HPV 16+肿瘤细胞系的识别。
用表1中所示的重组表达载体之一转导来自两名供体的PBL。
表1
Figure BDA0003019631680000431
Figure BDA0003019631680000441
在刺激之后第8天，使用抗-HPV 16 E711-19四聚体和抗-小鼠(m)TRBC抗体，通过流式细胞术测试来自两名正常供体的转导的PBL的HPV 16 E711-19四聚体的结合。将未转导的细胞用作阴性对照。结果显示在图2A-2R中。在以上各图中给出了各个象限中检测到的染色细胞的百分比。如图2A-2R中所示，与用其中α链位于β链的5’处的重组表达载体转导的细胞相比，用其中β链位于α链的5’处的重组表达载体转导的细胞显示出改善的四聚体结合。也如图2A-2R所示，与用实施例2的TCR转导的细胞相比，用Cys-修饰的TCR、LVL-修饰的TCR或LVL-Cys-修饰的TCR转导的细胞各自显示出改善的四聚体结合。
在单独的实验中，在刺激之后，将转导细胞与624细胞、CaSki细胞、Scc90细胞或Scc152细胞共培养11天，并且测量IFN-γ分泌。将未转导的细胞用作阴性对照。结果显示在图3A和3B中。如图3A和3B所示，与用实施例2的TCR转导的细胞相比，用Cys-修饰的TCR、LVL-修饰的TCR或LVL-Cys-修饰的TCR转导的细胞各自显示出改善的HPV 16+肿瘤系的识别。也如图3A-3B所示，与用其中α链位于β链的5’处的重组表达载体转导的细胞相比，用其中β链位于α链的5’处的重组表达载体转导的细胞通常显示出改善的HPV 16+肿瘤系的识别。
如通过流式细胞术所测量的，与用其中α链位于β链的5’处的重组表达载体转导的细胞相比，用其中β链位于α链的5’处的重组表达载体转导的细胞还显示出改善的表达。
实施例6
本实施例显示用编码LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)的重组表达载体转导的T细胞显示出HPV-16 E711-19四聚体的CD8-独立性结合。
用编码实施例4的LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)的MSGV1重组表达载体转导外周血细胞。将转导的细胞用抗-CD8、抗-TRBC(小鼠恒定区)抗体和HLA-A2/E711-19四聚体标记并且通过流式细胞术分析。来自两个供体的CD8+转导的细胞和CD8-转导的细胞均结合四聚体，这显示出CD8-独立性结合。
实施例7
本实施例显示经转导以表达LVL-修饰的TCR(β/α)的外周血T细胞特异性识别HPV16 E711-19肽和HPV 16+肿瘤细胞系。
用编码实施例3的LVL-修饰的TCR(β/α)(SEQ ID NO:37)的重组表达载体转导PBL。使用如先前所述的快速扩增方案(REP)(Dudley等,J.Immunother.26:332-42(2003)和Riddell等,J.Immunol.Methods128:189-201(1990))进行细胞数目的快速扩增。简言之，将TIL与经辐射的(40Gy)同种异体外周血单核细胞“饲养”细胞在具有30ng/mL抗CD3抗体和6000IU/mL IL-2的完全培养基(CM)中培养。将扩增的转导细胞与靶标(用HPV 16 E629-38肽(对照)脉冲刺激的293-A2细胞、用HPV 16 E711-19肽脉冲刺激的293-A2细胞、用编码HPV 16E6的质粒转导的624细胞、用编码HPV 16 E7的质粒转导的624细胞、SCC152细胞、SCC90细胞、CaSki细胞、Alb细胞、Panc1细胞、Ane细胞或SiHa细胞)共培养。测量IFN-γ。结果显示在图4中。如图4中所示，用编码LVL-修饰的TCR(β/α)的重组表达载体转导的PBL以HLA-A2-限制性方式特异性识别HPV 16 E7-阳性肿瘤细胞系和其它HLA-A2+HPV16 E7+靶标。用第二供体的细胞获得的结果是类似的。
实施例8
本实施例显示经转导以表达LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)的外周血T细胞特异性识别HPV 16+肿瘤细胞系以及该识别被抗-MHC I类抗体阻断。本实施例还显示这些转导的T细胞特异性杀伤HPV 16+HLA-A2+肿瘤细胞系。
用编码LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)的重组表达载体转导PBL。使用如实施例7所述的REP进行细胞数目的快速扩增。在无抗体(黑色柱)或在存在抗-MHC I类抗体(灰色柱)或抗-MHC II类抗体(无阴影的柱)的情况下，将转导的细胞与靶标(624细胞、SCC90细胞或CaSki细胞)共培养。作为对照，在无抗体或在存在抗-MHC I类抗体或抗-MHCII类抗体的情况下，将PBL用DMF5 TCR转导并与624细胞共培养或者用抗-MAGE A3 TCR转导并与526-CIITA细胞共培养。测量IFN-γ。结果显示在图5中。如图5中所示，经转导以表达LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)的外周血T细胞特异性识别HPV 16+肿瘤细胞系并且该识别被抗-MHC I类抗体阻断。
在单独的实验中，将转导的效应细胞与靶标(CaSki细胞、SCC90细胞、SCC152细胞或624细胞)以不同效应细胞：靶标比率共培养。将未转导的效应细胞用作阴性对照。结果显示在图6A-6D中。如图6A-6D中所示，用编码LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)的重组表达载体转导的PBL显示出HPV 16+HLA-A2+肿瘤系的特异性杀伤。
实施例9
本实施例显示经转导以表达LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)的外周血T细胞具有与抗-HPV 16 E6 TCR DCA2E6类似的功能亲合力。本实施例还显示在与除了SCC90细胞之外的CaSki和SCC152细胞共培养后，与用DCA2E6 TCR转导的细胞相比，经转导以表达LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)的外周血T细胞显示出更多的IFN-γ产生。
用编码LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)或DCA2E6的重组表达载体转导PBL。将转导的细胞与用无肽或浓度为1μM至1pM的HPV 16 E711-19肽或HPV 16 E629-38肽脉冲刺激的T2细胞共培养。测量IFN-γ。结果显示在图7A和7B中。如图7A和7B所示，经转导以表达LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)的PBL具有与抗-HPV 16 E6 TCR DCA2E6类似的功能亲合力。用来自第二供体的细胞获得的结果是类似的。
在单独的实验中，PBL被转导以表达LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)(SEQ ID NO:38)或DCA2E6。将未转导的细胞用作阴性对照。将细胞与靶标(624细胞、Caski细胞、SCC90细胞或SCC152细胞)共培养。测量IFN-γ。结果显示在图8A中。如图8A所示，在与除了SCC90细胞之外的CaSki和SCC152细胞共培养后，与用DCA2E6 TCR转导的细胞相比，经转导以表达LVL-Cys-修饰的TCR(β/α)的外周血T细胞显示出更多的IFN-γ产生。
在单独的实验中，PBL被转导以表达Cys-修饰的TCR(β/α)(SEQ ID NO:9、24和27)或DCA2E6。将未转导的细胞用作阴性对照。将细胞与靶标(用HPV 16 E629-38肽(对照)脉冲刺激的293-A2细胞、用HPV16 E711-19肽脉冲刺激的293-A2细胞、SCC152细胞、SCC90细胞、CaSki细胞、Alb细胞、Ane细胞、Panc1细胞或SiHa细胞)共培养。测量IFN-γ。结果显示在图8B中。如图8B所示，在与除了SCC90细胞之外的CaSki和SCC152细胞共培养后，与用DCA2E6 TCR转导的细胞相比，经转导以表达Cys-修饰的TCR(β/α)的外周血T细胞显示出更多的IFN-γ产生。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利在此通过引用并入，其程度如同每份参考文献单独地和具体地表示为通过引用并入并且在本文以其整体示出。
在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用的术语“一个/一种”和“所述”和“至少一种/一个”以及类似的指示物应被解释为覆盖单数和复数两者，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。术语“至少一种/一个”之后一项或多项列表(例如，“A和B中的至少一种/一个”)的使用应被解释为意指选自列出的项中的一项(A或B)或两个或更多个列出的项的组合(A和B)，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式的术语(即意指“包括，但不限于”)，除非另外指明。本文数值的范围的描述仅旨在用作分别提及属于范围内的每个单独数值的速记法，除非本文另外指出，并且每个单独的数值均并入说明书中如同其被单独的列举出一样。本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有的实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅仅意图更好地阐明本发明，并且不会对以其它方式要求保护的本发明范围构成限制。不应将本说明书中的语言解释为表明任何未要求保护的组分对实施本发明是必要的。
本发明的优选实施方案在本文中描述，包括发明人已知的实施该发明的最佳模式。对本领域的普通技术人员来说，阅读上述说明后这些优选的实施方案中的改变可以是显而易见的。发明人期望熟练的技术人员酌情利用这些改变，并且发明人意欲以不同于本文具体描述的方式实施该发明。因此，在适用法律允许的情况下，本发明包括在所附的权利要求中所引用主题的所有修改和等同物。此外，在其所有可能的改变中上述要素的任何组合涵盖于本发明中，除非本文另外说明或上下文中明显矛盾。
序列表
<110> 美国卫生和人力服务部
<120> 抗人乳头瘤病毒16 E7的T细胞受体
<130> 720940
<150> US 62/004335
<151> 2014-05-29
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 1
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
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Lys Pro
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<212> PRT
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<222>
<223> 合成的
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<222>
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<220>
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<222>
<223> 合成的
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 9
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100 105 110
Arg Leu Ala Phe Gly Lys Gly Asn Gln Val Val Val Ile Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<220>
<221> SITE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为Ala或Gly
<400> 10
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Gly Leu Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys
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Asp Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe
50 55 60
Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Leu Gly Trp Arg Gly Gly Arg Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
130 135
<210> 11
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 11
Met Gly Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Leu Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys
20 25 30
Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly His
35 40 45
Asp Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe
50 55 60
Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Leu Gly Trp Arg Gly Gly Arg Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
130 135
<210> 12
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 12
Met Trp Gly Val Phe Leu Leu Tyr Val Ser Met Lys Met Gly Gly Thr
1 5 10 15
Thr Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly
20 25 30
Ala Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly
35 40 45
Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser
50 55 60
Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe
65 70 75 80
Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln
85 90 95
Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Ser Val Asp Gly Asn Asn
100 105 110
Arg Leu Ala Phe Gly Lys Gly Asn Gln Val Val Val Ile Pro Asn Ile
115 120 125
Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser
130 135 140
Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val
145 150 155 160
Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu
165 170 175
Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser
180 185 190
Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile
195 200 205
Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys
210 215 220
Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn
225 230 235 240
Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe
245 250 255
Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265
<210> 13
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 13
Met Gly Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Leu Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys
20 25 30
Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly His
35 40 45
Asp Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe
50 55 60
Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Leu Gly Trp Arg Gly Gly Arg Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro
130 135 140
Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val
165 170 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser
180 185 190
Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg
195 200 205
Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn
210 215 220
Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu
225 230 235 240
Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val
245 250 255
Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser
260 265 270
Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu
275 280 285
Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met
290 295 300
Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 14
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 14
Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys
1 5 10 15
Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr
20 25 30
Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser
65 70 75 80
Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp
85 90 95
Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe
100 105 110
Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
115 120 125
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 15
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 15
Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
50 55 60
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
65 70 75 80
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
85 90 95
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
100 105 110
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
115 120 125
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
130 135 140
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
145 150 155 160
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
165 170 175
Ser Arg Gly
<210> 16
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<220>
<221> SITE
<222> (48)..(48)
<223> Xaa为Thr或Cys
<220>
<221> SITE
<222> (112)..(112)
<223> Xaa为Ser、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp
<220>
<221> SITE
<222> (114)..(114)
<223> Xaa为Met、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp
<220>
<221> SITE
<222> (115)..(115)
<223> Xaa为Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp
<400> 16
Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg
1 5 10 15
Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile
20 25 30
Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Xaa
35 40 45
Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr
65 70 75 80
Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr
85 90 95
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Xaa
100 105 110
Val Xaa Xaa Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
115 120 125
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135
<210> 17
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 17
Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg
1 5 10 15
Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile
20 25 30
Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr
65 70 75 80
Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr
85 90 95
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser
100 105 110
Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
115 120 125
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135
<210> 18
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<220>
<221> SITE
<222> (57)..(57)
<223> Xaa为Ser或Cys
<400> 18
Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Xaa Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys
50 55 60
Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala
65 70 75 80
Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe
85 90 95
His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro
100 105 110
Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly
115 120 125
Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu
130 135 140
Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser
145 150 155 160
Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
165 170
<210> 19
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 19
Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys
50 55 60
Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala
65 70 75 80
Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe
85 90 95
His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro
100 105 110
Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly
115 120 125
Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu
130 135 140
Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser
145 150 155 160
Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
165 170
<210> 20
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 20
Met Ala Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Leu Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys
20 25 30
Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly His
35 40 45
Asp Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe
50 55 60
Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Leu Gly Trp Arg Gly Gly Arg Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro
130 135 140
Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser
180 185 190
Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp
225 230 235 240
Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asn Ser
305
<210> 21
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 21
Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg
1 5 10 15
Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile
20 25 30
Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr
35 40 45
Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr
65 70 75 80
Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr
85 90 95
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu
100 105 110
Val Ile Val Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
115 120 125
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135
<210> 22
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 22
Met Trp Gly Val Phe Leu Leu Tyr Val Ser Met Lys Met Gly Gly Thr
1 5 10 15
Thr Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly
20 25 30
Ala Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly
35 40 45
Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser
50 55 60
Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe
65 70 75 80
Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln
85 90 95
Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Ser Val Asp Gly Asn Asn
100 105 110
Arg Leu Ala Phe Gly Lys Gly Asn Gln Val Val Val Ile Pro Asn Ile
115 120 125
Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln
130 135 140
Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val
145 150 155 160
Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu
165 170 175
Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser
180 185 190
Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala
195 200 205
Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys
210 215 220
Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile
225 230 235 240
Val Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met
245 250 255
Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260
<210> 23
<211> 173
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 23
Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro
1 5 10 15
Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
20 25 30
Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
35 40 45
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys
50 55 60
Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala
65 70 75 80
Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe
85 90 95
His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro
100 105 110
Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly
115 120 125
Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu
130 135 140
Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser
145 150 155 160
Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
165 170
<210> 24
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 24
Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg
1 5 10 15
Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile
20 25 30
Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys
35 40 45
Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr
65 70 75 80
Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr
85 90 95
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser
100 105 110
Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
115 120 125
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135
<210> 25
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 25
Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg
1 5 10 15
Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile
20 25 30
Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys
35 40 45
Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala
50 55 60
Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr
65 70 75 80
Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr
85 90 95
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu
100 105 110
Val Ile Val Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
115 120 125
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135
<210> 26
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 26
Met Trp Gly Val Phe Leu Leu Tyr Val Ser Met Lys Met Gly Gly Thr
1 5 10 15
Thr Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly
20 25 30
Ala Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly
35 40 45
Leu Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser
50 55 60
Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe
65 70 75 80
Leu Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln
85 90 95
Met Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Ser Val Asp Gly Asn Asn
100 105 110
Arg Leu Ala Phe Gly Lys Gly Asn Gln Val Val Val Ile Pro Asn Ile
115 120 125
Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln
130 135 140
Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val
145 150 155 160
Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu
165 170 175
Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser
180 185 190
Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala
195 200 205
Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys
210 215 220
Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile
225 230 235 240
Val Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met
245 250 255
Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260
<210> 27
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 27
Met Ala Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Leu Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys
20 25 30
Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly His
35 40 45
Asp Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe
50 55 60
Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Leu Gly Trp Arg Gly Gly Arg Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro
130 135 140
Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys
180 185 190
Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp
225 230 235 240
Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asn Ser
305
<210> 28
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 28
Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
1 5 10 15
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 29
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 29
Met Ala Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Leu Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys
20 25 30
Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly His
35 40 45
Asp Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe
50 55 60
Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Leu Gly Trp Arg Gly Gly Arg Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro
130 135 140
Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser
180 185 190
Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp
225 230 235 240
Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asn Ser Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
305 310 315 320
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
325 330 335
Trp Gly Val Phe Leu Leu Tyr Val Ser Met Lys Met Gly Gly Thr Thr
340 345 350
Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala
355 360 365
Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu
370 375 380
Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu
405 410 415
Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Met
420 425 430
Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Ser Val Asp Gly Asn Asn Arg
435 440 445
Leu Ala Phe Gly Lys Gly Asn Gln Val Val Val Ile Pro Asn Ile Gln
450 455 460
Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp
465 470 475 480
Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro
485 490 495
Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp
500 505 510
Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn
515 520 525
Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr
530 535 540
Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser
545 550 555 560
Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile Val
565 570 575
Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr
580 585 590
Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595
<210> 30
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 30
Met Ala Pro Gly Leu Leu Cys Trp Ala Leu Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Leu Val Asp Ala Gly Val Thr Gln Ser Pro Thr His Leu Ile Lys
20 25 30
Thr Arg Gly Gln Gln Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Lys Ser Gly His
35 40 45
Asp Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Ala Leu Gly Gln Gly Pro Gln Phe
50 55 60
Ile Phe Gln Tyr Tyr Glu Glu Glu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Phe Pro
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly His Gln Phe Pro Asn Tyr Ser Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Val Asn Ala Leu Leu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Leu Gly Trp Arg Gly Gly Arg Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro
130 135 140
Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys
180 185 190
Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp
225 230 235 240
Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asn Ser Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
305 310 315 320
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
325 330 335
Trp Gly Val Phe Leu Leu Tyr Val Ser Met Lys Met Gly Gly Thr Thr
340 345 350
Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala
355 360 365
Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu
370 375 380
Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser Tyr
385 390 395 400
Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu
405 410 415
Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Met
420 425 430
Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Ser Val Asp Gly Asn Asn Arg
435 440 445
Leu Ala Phe Gly Lys Gly Asn Gln Val Val Val Ile Pro Asn Ile Gln
450 455 460
Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp
465 470 475 480
Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro
485 490 495
Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp
500 505 510
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515 520 525
Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr
530 535 540
Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser
545 550 555 560
Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile Val
565 570 575
Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr
580 585 590
Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595
<210> 31
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 31
atgtggggag ttttccttct ttatgtttcc atgaagatgg gaggcactac aggacaaaac 60
attgaccagc ccactgagat gacagctacg gaaggtgcca ttgtccagat caactgcacg 120
taccagacat ctgggttcaa cgggctgttc tggtaccagc aacatgctgg cgaagcaccc 180
acatttctgt cttacaatgt tctggatggt ttggaggaga aaggtcgttt ttcttcattc 240
cttagtcggt ctaaagggta cagttacctc cttttgaagg agctccagat gaaagactct 300
gcctcttacc tctgtgcttc cgtagatggg aacaacagac tcgcttttgg gaaggggaac 360
caagtggtgg tcataccaaa tatccagaac cctgaccctg ccgtgtacca gctgagagac 420
tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta ttcaccgatt ttgattctca aacaaatgtg 480
tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc acagacaaaa ctgtgctaga catgaggtct 540
atggacttca agagcaacag tgctgtggcc tggagcaaca aatctgactt tgcatgtgca 600
aacgccttca acaacagcat tattccagaa gacaccttct tccccagccc agaaagttcc 660
tgtgatgtca agctggtcga gaaaagcttt gaaacagata cgaacctaaa ctttcaaaac 720
ctgtcagtga ttgggttccg aatcctcctc ctgaaagtgg ccgggtttaa tctgctcatg 780
acgctgcggc tgtggtccag ctga 804
<210> 32
<211> 945
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 32
atgggccccg ggctcctctg ctgggcactg ctttgtctcc tgggagcagg cttagtggac 60
gctggagtca cccaaagtcc cacacacctg atcaaaacga gaggacagca agtgactctg 120
agatgctctc ctaagtctgg gcatgacact gtgtcctggt accaacaggc cctgggtcag 180
gggccccagt ttatctttca gtattatgag gaggaagaga gacagagagg caacttccct 240
gatcgattct caggtcacca gttccctaac tatagctctg agctgaatgt gaacgccttg 300
ttgctggggg actcggccct ctatctctgt gccagcagct tgggatggcg ggggggccgt 360
tacaatgagc agttcttcgg gccagggaca cggctcaccg tgctagagga cctgaaaaac 420
gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 480
aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttctaccccg accacgtgga gctgagctgg 540
tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacag acccgcagcc cctcaaggag 600
cagcccgccc tcaatgactc cagatactgc ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 660
ttctggcaga acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 720
aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cctgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 780
tggggtagag cagactgtgg cttcacctcc gagtcttacc agcaaggggt cctgtctgcc 840
accatcctct atgagatctt gctagggaag gccaccttgt atgccgtgct ggtcagtgcc 900
ctcgtgctga tggccatggt caagagaaag gattccagag gctag 945
<210> 33
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 33
atgtggggtg tcttcctttt gtacgtcagc atgaagatgg gaggcactac tgggcaaaac 60
atagatcagc ctaccgaaat gactgctacc gagggagcca ttgtccaaat caactgcacc 120
tatcagacta gcggcttcaa tggactcttc tggtaccaac agcatgcggg cgaagcacct 180
accttcttgt cctataatgt cttggatggt ctcgaagaga aaggcagatt ctccagtttc 240
ctcagccgga gcaagggata ctcatatctt ctcctgaaag agcttcagat gaaggattct 300
gcatcctatc tctgtgcttc agtcgatggc aataaccgac tcgcctttgg aaaagggaat 360
caagtggtcg tcataccgaa tattcagaac cccgaaccag ccgtatatca gttgaaggac 420
ccaagatctc aggatagtac actctgtttg tttacggact ttgactcaca aatcaacgtc 480
ccgaagacta tggaaagtgg tacgttcatc acagataaga cggttctgga catgaaggct 540
atggactcaa agagcaacgg ggcaattgct tggtccaacc agacaagctt tacctgtcag 600
gacattttta aggagactaa tgctacttat ccctccagcg acgttccgtg tgatgcgact 660
cttaccgaga agtcttttga gaccgatatg aatctcaact tccagaatct gctggtgatc 720
gttctgcgga tcctgcttct gaaggttgca ggattcaatc ttcttatgac tctccggctc 780
tggtcttcat gataa 795
<210> 34
<211> 924
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 34
atggccccgg ggcttttgtg ttgggccttg ctttgtttgc ttggggcagg cttggtggat 60
gctggagtca cacagtcacc cacacacctc attaaaacca ggggacaaca agtcactctg 120
cgctgcagtc ctaagtcagg ccatgacaca gtttcctggt atcaacaggc tctggggcag 180
ggccctcagt tcattttcca atattacgag gaagaggaac gccaacgcgg taatttcccc 240
gatcggttct ctgggcacca gttcccaaac tactcaagtg agttgaacgt aaatgctctc 300
ctcctcggag actccgccct ctacttgtgt gccagttctc ttggttggcg gggcggccga 360
tacaatgaac aattttttgg acctggtact cggctgaccg tgctagagga cctgcgcaac 420
gtcaccccac caaaggtcag tttgtttgag ccatcaaagg cggagatcgc caacaaacag 480
aaagctacgc tcgtgtgttt ggctcggggc ttcttcccag accacgtaga actttcctgg 540
tgggtcaatg gaaaggaggt tcattccgga gtgtccactg atccccaagc gtacaaggaa 600
tccaactata gctactgtct ctcatctcgg ctccgggtga gtgcgacatt ctggcataat 660
cctcggaacc actttcgatg ccaagtgcag tttcatgggt tgagcgagga agacaagtgg 720
cccgagggca gtcctaaacc agtcactcaa aacataagcg ccgaggcatg gggtagagcc 780
gattgtggga ttactagcgc ttcataccaa caaggggtat tgagcgctac aattctttac 840
gaaattctcc tcggcaaggc gacgctctac gccgtactgg tgtctactct cgtggttatg 900
gcaatggtga aacggaaaaa cagc 924
<210> 35
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 35
atgtggggtg tcttcctttt gtacgtcagc atgaagatgg gaggcactac tgggcaaaac 60
atagatcagc ctaccgaaat gactgctacc gagggagcca ttgtccaaat caactgcacc 120
tatcagacta gcggcttcaa tggactcttc tggtaccaac agcatgcggg cgaagcacct 180
accttcttgt cctataatgt cttggatggt ctcgaagaga aaggcagatt ctccagtttc 240
ctcagccgga gcaagggata ctcatatctt ctcctgaaag agcttcagat gaaggattct 300
gcatcctatc tctgtgcttc agtcgatggc aataaccgac tcgcctttgg aaaagggaat 360
caagtggtcg tcataccgaa tattcagaac cccgaaccag ccgtatatca gttgaaggac 420
ccaagatctc aggatagtac actctgtttg tttacggact ttgactcaca aatcaacgtc 480
ccgaagacta tggaaagtgg tacgttcatc acagataagt gcgttctgga catgaaggct 540
atggactcaa agagcaacgg ggcaattgct tggtccaacc agacaagctt tacctgtcag 600
gacattttta aggagactaa tgctacttat ccctccagcg acgttccgtg tgatgcgact 660
cttaccgaga agtcttttga gaccgatatg aatctcaact tccagaatct gctggtgatc 720
gttctgcgga tcctgcttct gaaggttgca ggattcaatc ttcttatgac tctccggctc 780
tggtcttcat gataa 795
<210> 36
<211> 924
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 36
atggccccgg ggcttttgtg ttgggccttg ctttgtttgc ttggggcagg cttggtggat 60
gctggagtca cacagtcacc cacacacctc attaaaacca ggggacaaca agtcactctg 120
cgctgcagtc ctaagtcagg ccatgacaca gtttcctggt atcaacaggc tctggggcag 180
ggccctcagt tcattttcca atattacgag gaagaggaac gccaacgcgg taatttcccc 240
gatcggttct ctgggcacca gttcccaaac tactcaagtg agttgaacgt aaatgctctc 300
ctcctcggag actccgccct ctacttgtgt gccagttctc ttggttggcg gggcggccga 360
tacaatgaac aattttttgg acctggtact cggctgaccg tgctagagga cctgcgcaac 420
gtcaccccac caaaggtcag tttgtttgag ccatcaaagg cggagatcgc caacaaacag 480
aaagctacgc tcgtgtgttt ggctcggggc ttcttcccag accacgtaga actttcctgg 540
tgggtcaatg gaaaggaggt tcattccgga gtgtgcactg atccccaagc gtacaaggaa 600
tccaactata gctactgtct ctcatctcgg ctccgggtga gtgcgacatt ctggcataat 660
cctcggaacc actttcgatg ccaagtgcag tttcatgggt tgagcgagga agacaagtgg 720
cccgagggca gtcctaaacc agtcactcaa aacataagcg ccgaggcatg gggtagagcc 780
gattgtggga ttactagcgc ttcataccaa caaggggtat tgagcgctac aattctttac 840
gaaattctcc tcggcaaggc gacgctctac gccgtactgg tgtctactct cgtggttatg 900
gcaatggtga aacggaaaaa cagc 924
<210> 37
<211> 7310
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> 合成的
<400> 37
ccatggcccc ggggcttttg tgttgggcct tgctttgttt gcttggggca ggcttggtgg 60
atgctggagt cacacagtca cccacacacc tcattaaaac caggggacaa caagtcactc 120
tgcgctgcag tcctaagtca ggccatgaca cagtttcctg gtatcaacag gctctggggc 180
agggccctca gttcattttc caatattacg aggaagagga acgccaacgc ggtaatttcc 240
ccgatcggtt ctctgggcac cagttcccaa actactcaag tgagttgaac gtaaatgctc 300
tcctcctcgg agactccgcc ctctacttgt gtgccagttc tcttggttgg cggggcggcc 360
gatacaatga acaatttttt ggacctggta ctcggctgac cgtgctagag gacctgcgca 420
acgtcacccc accaaaggtc agtttgtttg agccatcaaa ggcggagatc gccaacaaac 480
agaaagctac gctcgtgtgt ttggctcggg gcttcttccc agaccacgta gaactttcct 540
ggtgggtcaa tggaaaggag gttcattccg gagtgtccac tgatccccaa gcgtacaagg 600
aatccaacta tagctactgt ctctcatctc ggctccgggt gagtgcgaca ttctggcata 660
atcctcggaa ccactttcga tgccaagtgc agtttcatgg gttgagcgag gaagacaagt 720
ggcccgaggg cagtcctaaa ccagtcactc aaaacataag cgccgaggca tggggtagag 780
ccgattgtgg gattactagc gcttcatacc aacaaggggt attgagcgct acaattcttt 840
acgaaattct cctcggcaag gcgacgctct acgccgtact ggtgtctact ctcgtggtta 900
tggcaatggt gaaacggaaa aacagcagag ccaaaagaag tggttctggc gcgacgaatt 960
ttagtttgct taagcaagcc ggagatgtgg aggaaaatcc tggaccgatg tggggtgtct 1020
tccttttgta cgtcagcatg aagatgggag gcactactgg gcaaaacata gatcagccta 1080
ccgaaatgac tgctaccgag ggagccattg tccaaatcaa ctgcacctat cagactagcg 1140
gcttcaatgg actcttctgg taccaacagc atgcgggcga agcacctacc ttcttgtcct 1200
ataatgtctt ggatggtctc gaagagaaag gcagattctc cagtttcctc agccggagca 1260
agggatactc atatcttctc ctgaaagagc ttcagatgaa ggattctgca tcctatctct 1320
gtgcttcagt cgatggcaat aaccgactcg cctttggaaa agggaatcaa gtggtcgtca 1380
taccgaatat tcagaacccc gaaccagccg tatatcagtt gaaggaccca agatctcagg 1440
atagtacact ctgtttgttt acggactttg actcacaaat caacgtcccg aagactatgg 1500
aaagtggtac gttcatcaca gataagacgg ttctggacat gaaggctatg gactcaaaga 1560
gcaacggggc aattgcttgg tccaaccaga caagctttac ctgtcaggac atttttaagg 1620
agactaatgc tacttatccc tccagcgacg ttccgtgtga tgcgactctt accgagaagt 1680
cttttgagac cgatatgaat ctcaacttcc agaatctgct ggtgatcgtt ctgcggatcc 1740
tgcttctgaa ggttgcagga ttcaatcttc ttatgactct ccggctctgg tcttcatgat 1800
aagaattctg cagtcgacgg taccgcgggc ccgggatccg ataaaataaa agattttatt 1860
tagtctccag aaaaaggggg gaatgaaaga ccccacctgt aggtttggca agctagctta 1920
agtaacgcca ttttgcaagg catggaaaat acataactga gaatagagaa gttcagatca 1980
aggttaggaa cagagagaca gcagaatatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt 2040
cctgccccgg ctcagggcca agaacagatg gtccccagat gcggtcccgc cctcagcagt 2100
ttctagagaa ccatcagatg tttccagggt gccccaagga cctgaaaatg accctgtgcc 2160
ttatttgaac taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc tgctccccga 2220
gctcaataaa agagcccaca acccctcact cggcgcgcca gtcctccgat agactgcgtc 2280
gcccgggtac ccgtgtatcc aataaaccct cttgcagttg catccgactt gtggtctcgc 2340
tgttccttgg gagggtctcc tctgagtgat tgactacccg tcagcggggg tctttcatgg 2400
gtaacagttt cttgaagttg gagaacaaca ttctgagggt aggagtcgaa tattaagtaa 2460
tcctgactca attagccact gttttgaatc cacatactcc aatactcctg aaatccatcg 2520
atggagttca ttatggacag cgcagaaaga gctggggaga attgtgaaat tgttatccgc 2580
tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat 2640
gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 2700
tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 2760
ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 2820
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<220>
<221>
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ggccctcagt tcattttcca atattacgag gaagaggaac gccaacgcgg taatttcccc 240
gatcggttct ctgggcacca gttcccaaac tactcaagtg agttgaacgt aaatgctctc 300
ctcctcggag actccgccct ctacttgtgt gccagttctc ttggttggcg gggcggccga 360
tacaatgaac aattttttgg acctggtact cggctgaccg tgctagagga cctgcgcaac 420
gtcaccccac caaaggtcag tttgtttgag ccatcaaagg cggagatcgc caacaaacag 480
aaagctacgc tcgtgtgttt ggctcggggc ttcttcccag accacgtaga actttcctgg 540
tgggtcaatg gaaaggaggt tcattccgga gtgtgcactg atccccaagc gtacaaggaa 600
tccaactata gctactgtct ctcatctcgg ctccgggtga gtgcgacatt ctggcataat 660
cctcggaacc actttcgatg ccaagtgcag tttcatgggt tgagcgagga agacaagtgg 720
cccgagggca gtcctaaacc agtcactcaa aacataagcg ccgaggcatg gggtagagcc 780
gattgtggga ttactagcgc ttcataccaa caaggggtat tgagcgctac aattctttac 840
gaaattctcc tcggcaaggc gacgctctac gccgtactgg tgtctactct cgtggttatg 900
gcaatggtga aacggaaaaa cagcagagcc aaaagaagtg gttctggcgc gacgaatttt 960
agtttgctta agcaagccgg agatgtggag gaaaatcctg gaccgatgtg gggtgtcttc 1020
cttttgtacg tcagcatgaa gatgggaggc actactgggc aaaacataga tcagcctacc 1080
gaaatgactg ctaccgaggg agccattgtc caaatcaact gcacctatca gactagcggc 1140
ttcaatggac tcttctggta ccaacagcat gcgggcgaag cacctacctt cttgtcctat 1200
aatgtcttgg atggtctcga agagaaaggc agattctcca gtttcctcag ccggagcaag 1260
ggatactcat atcttctcct gaaagagctt cagatgaagg attctgcatc ctatctctgt 1320
gcttcagtcg atggcaataa ccgactcgcc tttggaaaag ggaatcaagt ggtcgtcata 1380
ccgaatattc agaaccccga accagccgta tatcagttga aggacccaag atctcaggat 1440
agtacactct gtttgtttac ggactttgac tcacaaatca acgtcccgaa gactatggaa 1500
agtggtacgt tcatcacaga taagtgcgtt ctggacatga aggctatgga ctcaaagagc 1560
aacggggcaa ttgcttggtc caaccagaca agctttacct gtcaggacat ttttaaggag 1620
actaatgcta cttatccctc cagcgacgtt ccgtgtgatg cgactcttac cgagaagtct 1680
tttgagaccg atatgaatct caacttccag aatctgctgg tgatcgttct gcggatcctg 1740
cttctgaagg ttgcaggatt caatcttctt atgactctcc ggctctggtc ttcatgataa 1800

Claims (21)

1.缀合物，其包含分离的或纯化的T细胞受体(TCR)，所述T细胞受体对人乳头瘤病毒(HPV)16 E7具有抗原特异性并且包含SEQ ID NO：3的α链CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：4的α链CDR2氨基酸序列、SEQ ID NO：5的α链CDR3氨基酸序列、SEQ ID NO：6的β链CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：7的β链CDR2氨基酸序列以及SEQ ID NO：8的β链CDR3的氨基酸序列。
2.重组表达载体，其包含核酸，所述核酸包含编码TCR的核苷酸序列，所述TCR对HPV 16E7具有抗原特异性并且包含SEQ ID NO：3的α链CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：4的α链CDR2氨基酸序列、SEQ ID NO：5的α链CDR3氨基酸序列、SEQ ID NO：6的β链CDR1氨基酸序列、SEQ IDNO：7的β链CDR2氨基酸序列以及SEQ ID NO：8的β链CDR3的氨基酸序列，
其中所述载体选自质粒、病毒载体、噬菌体载体和动物表达载体。
3.重组表达载体，其包含核酸，所述核酸包含(a)自杀基因和(b)编码TCR的核苷酸序列，所述TCR对HPV 16 E7具有抗原特异性并且包含SEQ ID NO：3的α链CDR1氨基酸序列、SEQID NO：4的α链CDR2氨基酸序列、SEQ ID NO：5的α链CDR3氨基酸序列、SEQ ID NO：6的β链CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：7的β链CDR2氨基酸序列以及SEQ ID NO：8的β链CDR3的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其中所述自杀基因选自单纯性疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。
5.如权利要求2-4中任一项所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体是病毒载体。
6.如权利要求2-4中任一项所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体是逆转录病毒载体。
7.如权利要求2-4中任一项所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体是MSGV1载体。
8.药物组合物，其包含药学上可接受的载体和表达TCR的一种或多种宿主细胞，所述TCR对HPV 16 E7具有抗原特异性并且包含SEQ ID NO：3的α链CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：4的α链CDR2氨基酸序列、SEQ ID NO：5的α链CDR3氨基酸序列、SEQ ID NO：6的β链CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：7的β链CDR2氨基酸序列以及SEQ ID NO：8的β链CDR3的氨基酸序列，其中所述药物组合物被配制用于注射施用。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于肠胃外或静脉内施用。
10.如权利要求8或9所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体与接受者的血液是等渗的。
11.如权利要求8或9所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体包括生理盐水、电解质、5％葡萄糖水溶液或林格氏乳酸盐水中的一种或多种。
12.如权利要求8或9所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体补充有人血清蛋白。
13.表达对HPV 16 E7具有抗原特异性的TCR的一种或多种宿主细胞在制备用于检测，治疗或预防哺乳动物病况的药物中的用途，其中：
所述一种或多种宿主细胞对所述哺乳动物是自体的或同种异体的，
所述TCR包含SEQ ID NO：3的α链CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：4的α链CDR2氨基酸序列、SEQ ID NO：5的α链CDR3氨基酸序列、SEQ ID NO：6的β链CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：7的β链CDR2氨基酸序列以及SEQ ID NO：8的β链CDR3的氨基酸序列，以及
所述病况是HPV阳性癌症、HPV 16感染或HPV阳性初癌。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述一种或多种宿主细胞对所述哺乳动物是自体的。
15.如权利要求13所述的用途，其中所述一种或多种宿主细胞对所述哺乳动物是同种异体的。
16.如权利要求1所述的缀合物，权利要求2-4中任一项所述的重组表达载体，权利要求8或9所述的药物组合物，或权利要求13-15中任一项所述的用途，其中所述TCR包含鼠恒定区。
17.如权利要求1所述的缀合物，权利要求2-4中任一项所述的重组表达载体，权利要求8或9所述的药物组合物，或权利要求13-15中任一项所述的用途，其中所述TCR对HPV16E711-19 SEQ ID NO：2具有抗原特异性。
18.如权利要求1所述的缀合物，权利要求2-4中任一项所述的重组表达载体，权利要求8或9所述的药物组合物，或权利要求13-15中任一项所述的用途，其中所述TCR包含以下的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：9和
(b)SEQ ID NO：10，其中第2位的X是Ala或Gly。
19.如权利要求1所述的缀合物，权利要求2-4中任一项所述的重组表达载体，权利要求8或9所述的药物组合物，或权利要求13-15中任一项所述的用途，其中所述TCR包含以下的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：16，其中
(i)第48位的X是Thr或Cys；
(ii)第112位的X是Ser、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；
(iii)第114位的X是Met、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；和
(iv)第115位的X是Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met或Trp；和
(b)SEQ ID NO：18，其中第56位的X是Ser或Cys。
20.如权利要求1所述的缀合物，权利要求2-4中任一项所述的重组表达载体，权利要求8或9所述的药物组合物，或权利要求13-15中任一项所述的用途，其中所述TCR包含以下的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：14、17、21、24和25中的任一项；和
(b)SEQ ID NO：15、19和23中的任一项。
21.如权利要求1所述的缀合物，权利要求2-4中任一项所述的重组表达载体，权利要求8或9所述的药物组合物，或权利要求13-15中任一项所述的用途，其中所述TCR包含以下的氨基酸序列：
(a)(i)SEQ ID NO：12，(ii)SEQ ID NO：22，(iii)SEQ ID NO：26，(iv)SEQ ID NO：9和24，(v)SEQ ID NO：9和16或(vi)SEQ ID NO：9和17；和
(b)(i)SEQ ID NO：10和23，(ii)SEQ ID NO：10和18，(iii)SEQ ID NO：10和19，或(iv)SEQ ID NO：13、20和27中的任一项。
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