TW202325722A - 識別ｈｐｖ１６ ｅ７抗原之結合蛋白及其用途 - Google Patents

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索納爾 珍蓋爾威
丹尼爾 波拉克史密斯
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蓋賓 麥克比思
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Abstract

本文提供識別HPV16 E7抗原之結合蛋白及其用途。

Description

識別HPV16　E7抗原之結合蛋白及其用途
人類乳突狀瘤病毒(HPV)係一種在許多實體腫瘤中發現之致癌病毒(例如，美國每年診斷出20,000-30,000例HPV相關癌症)，引起多種惡性病，包括超過25%之頭頸癌、超過70%之口咽癌、超過90%之子宮頸癌及肛門癌以及超過60%之陰道癌、陰門癌及陰莖癌。出於多種原因，HPV抗原，諸如HPV E6及EPV E7蛋白，係引人關注之標靶，原因包括：1) HPV蛋白驅動腫瘤發生且對癌細胞存活而言係不可或缺的；2) HPV蛋白在每個腫瘤細胞中表現，藉此引起均質標靶表現；以及3)重要健康組織不表現HPV蛋白，藉此避免靶向HPV時對健康組織之毒性。來自靶向HPV抗原之TCR-T細胞療法的初始臨床資料顯示1期試驗(試驗NCT02858310)中治療之50%患者(12名患者中之6名)中的腫瘤收縮及客觀反應率。25% (12名患者中之3名)之患者顯示一或多個腫瘤完全消退。需要開發HPV特異性TCR免疫療法，以便治療以HPV抗原表現為特徵之病症。
本發明至少部分係基於識別HPV16 E7 11-19抗原之結合蛋白，包括T細胞受體(TCR)之發現。
在一個態樣中，提供一種結合蛋白，其包含：a)與選自由表1中所列之TCR α鏈CDR序列組成之群的TCR α鏈CDR序列具有至少約80%一致性的T細胞受體(TCR) α鏈CDR序列；及/或b)與選自由表1中所列之TCR β鏈CDR序列組成之群的TCR β鏈CDR序列具有至少約80%一致性的TCR β鏈CDR序列，其中該結合蛋白能夠與HPV16 E7 11-19免疫原性肽-MHC (pMHC)複合物結合，視情況其中結合親和力之K d小於或等於約5×10 -4M。
在另一態樣中，提供一種結合蛋白，其包含：a)與選自由表1中所列之TCR V α域序列組成之群的TCR V α域序列具有至少約80%一致性的TCR α鏈可變(V α)域序列；及/或b)與選自由表1中所列之TCR V β域序列組成之群的TCR V β域序列具有至少約80%一致性的TCR β鏈可變(V β)域序列，其中該結合蛋白能夠與HPV16 E7 11-19免疫原性肽-MHC (pMHC)複合物結合，視情況其中結合親和力之K d小於或等於約5×10 -4M。
在另一態樣中，提供一種結合蛋白，其包含：a)與選自由表1中所列之TCR α鏈序列組成之群的TCR α鏈序列具有至少約80%一致性的TCR α鏈序列；及/或b)與選自由表1中所列之TCR β鏈序列組成之群的TCR β鏈序列具有至少約80%一致性的TCR β鏈序列，其中該結合蛋白能夠與HPV16 E7 11-19免疫原性肽-MHC (pMHC)複合物結合，視情況其中結合親和力之K d小於或等於約5×10 -4M。
在又一態樣中，提供一種結合蛋白，其包含：a)選自由表1中所列之TCR α鏈CDR序列組成之群的TCR α鏈CDR序列；及/或b)選自由表1中所列之TCR β鏈CDR序列組成之群的TCR β鏈CDR序列，其中該結合蛋白能夠與HPV16 E7 11-19免疫原性肽-MHC (pMHC)複合物結合，視情況其中結合親和力之K d小於或等於約5×10 -4M。
在另一態樣中，提供一種結合蛋白，其包含：a)選自由表1中所列之TCR V α域序列組成之群的TCR α鏈可變(V α)域序列；及/或b)選自由表1中所列之TCR V β域序列組成之群的TCR β鏈可變(V β)域序列，其中該結合蛋白能夠與HPV16 E7 11-19免疫原性肽-MHC (pMHC)複合物結合，視情況其中結合親和力之K d小於或等於約5×10 -4M。
在另一態樣中，提供一種結合蛋白，其包含：a)選自由表1中所列之TCR α鏈序列組成之群的TCR α鏈序列；及/或b)選自由表1中所列之TCR β鏈序列組成之群的TCR β鏈序列，其中該結合蛋白能夠與HPV16 E7 11-19免疫原性肽-MHC (pMHC)複合物結合，視情況其中結合親和力之K d小於或等於約5×10 -4M。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明涵蓋之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一個實施例中，1) TCR α鏈CDR、TCR V α域及/或TCR α鏈由選自表1中所列之TRAV、TRAJ及TRAC基因之群的TRAV、TRAJ及/或TRAC基因或其片段編碼，及/或2) TCR β鏈CDR、TCR V β域及/或TCR β鏈由選自表1中所列之TRBV、TRBJ及TRBC基因之群的TRBV、TRBJ及/或TRBC基因或其片段編碼，及/或3)與表1中所列之同源參考CDR序列相比，該結合蛋白之各CDR具有至多五個胺基酸取代、插入、缺失或其組合。在另一實施例中，HPV16 E7 11-19免疫原性肽包含胺基酸序列YMLDLQPET。在另一實施例中，結合蛋白為嵌合、人類化或人類的。在又一實施例中，結合蛋白為TCR、TCR之抗原結合片段、單鏈TCR (scTCR)、嵌合抗原受體(CAR)或包含TCR及效應域之融合蛋白，視情況其中結合域包含跨膜域及細胞內效應域。在另一實施例中，TCR α鏈及TCR β鏈經共價連接，視情況其中TCR α鏈及TCR β鏈經由連接子肽共價連接。在另一實施例中，TCR α鏈及/或TCR β鏈共價連接至部分，視情況其中共價連接之部分包含親和力標籤或標記。在又一實施例中，親和力標籤係選自由以下組成之群：CD34富集標籤、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、鈣調蛋白結合蛋白(CBP)、蛋白C標籤、Myc標籤、HaloTag、HA標籤、Flag標籤、His標籤、生物素標籤及V5標籤，及/或其中標記為螢光蛋白。在另一實施例中，共價連接之部分係選自由以下組成之群：致炎因子、細胞介素、毒素、細胞毒性分子、放射性同位素或抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，結合蛋白與細胞表面上之pMHC複合物結合。在又一實施例中，MHC為MHC多聚體，視情況其中該MHC多聚體為四聚體。在另一實施例中，MHC為MHC I類分子。在另一實施例中，MHC包含MHC α鏈，該鏈為HLA血清型HLA-A*02。在又一實施例中，HLA對偶基因係選自由以下組成之群：HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205、HLA-A*0206及HLA-A*0207對偶基因。在另一實施例中，本文所述之結合蛋白與HPV16 E7 11-19肽-MHC (pMHC)複合物之結合引發免疫反應，視情況其中該免疫反應係T細胞反應。在另一實施例中，T細胞反應係選自由T細胞擴增(例如增殖)、細胞介素釋放及/或細胞毒性殺傷組成之群。在又一實施例中，結合蛋白能夠以小於或等於約1×10 -4M、小於或等於約5×10 -5M、小於或等於約1×10 -5M、小於或等於約5×10 -6M、小於或等於約1×10 -6M、小於或等於約5×10 -7M、小於或等於約1×10 -7M、小於或等於約5×10 -8M、小於或等於約1×10 -8M、小於或等於約5×10 -9M、小於或等於約1×10 -9M、小於或等於約5×10 -10M、小於或等於約1×10 -10M、小於或等於約5×10 -11M、小於或等於約1×10 -11M、小於或等於約5×10 -12M或小於或等於約1×10 -12M之K d與HPV16 E7 11-19免疫原性肽-MHC (pMHC)複合物特異性及/或選擇性地結合。在又一實施例中，與已知之T細胞受體相比，結合蛋白對該肽-MHC (pMHC)具有更高結合親和力。在另一實施例中，與已知之T細胞受體相比，結合蛋白對肽-MHC (pMHC)之結合親和力至少高出1.05倍。在另一實施例中，與已知之T細胞受體相比，結合蛋白誘導更高T細胞擴增、細胞介素釋放及/或細胞毒性殺傷。在又一實施例中，與已知之T細胞受體相比，結合蛋白誘導的T細胞擴增、細胞介素釋放及/或細胞毒性殺傷至少增加1.05倍。如本文所用，在一些實施例中，對倍數變化之提及可與任何所關注之參考模式進行比較，諸如與不同結合蛋白進行比較；與不同背景下相同結合蛋白進行比較，如與本文所述之其他藥劑組合，相同結合蛋白在不同免疫細胞中以不同水準表現；或其類似方面。在另一實施例中，標靶細胞為CaSki、SCC152或SCC090細胞株。在另一實施例中，標靶細胞為癌細胞，視情況其中該癌細胞為頭頸癌細胞、口咽癌細胞、子宮頸癌細胞、肛門癌細胞、陰道癌細胞、陰門癌細胞或陰莖癌細胞。在另一實施例中，本文所述之結合蛋白不與肽-MHC (pMHC)複合物結合，其中該肽包含胺基酸序列YMLDLQPET。在又一實施例中，本文所述之結合蛋白不與肽-MHC (pMHC)複合物結合，視情況其中該肽來源於SPTA1、MPL、HERC1、CPAMD8、INTS4、NUTM1或XM_00172256。此等基因係熟知的且所屬領域中公認根據以下NCBI基因ID編號進行注釋，各編號可在全球資訊網ncbi.nlm.nih.gov/gene獲得：SPTA1：基因ID 6708；MPL：基因ID 4352；HERC1：基因ID 8925；CPAMD8：基因ID 27151；INTS4：基因ID 92105；以及NUTM1：基因ID 256646。XM_00172256：映射至染色體20之異染色質著絲粒區且已自RefSeq注釋中移除，表明缺乏其表現之證據。
在又一態樣中，提供TCR α鏈及/或β鏈，其選自由表1中所列之TCR α鏈及β鏈序列組成之群。
在另一態樣中，提供一種經分離之核酸分子，其在嚴格條件下與編碼選自由表1中所列之多肽序列組成之群的多肽的核酸之補體，或與編碼選自由表1中所列之多肽序列組成之群的多肽的核酸具有至少約80%同源性的序列雜交，視情況其中該經分離之核酸分子包含1)選自表1中所列之TRAV、TRAJ及TRAC基因之群的TRAV、TRAJ及/或TRAC基因或其片段及/或2)選自表1中所列之TRBV、TRBJ及TRBC基因之群的TRBV、TRBJ及/或TRBC基因或其片段。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明涵蓋之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一個實施例中，核酸經密碼子最佳化以在宿主細胞中表現。
在另一態樣中，提供一種載體，其包含本文所述之經分離之核酸。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明涵蓋之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一個實施例中，載體為選殖載體、表現載體或病毒載體。在另一實施例中，載體進一步包含編碼CD8α、CD8β、顯性負性TGFβ受體II (DN-TGFβRII)、可選擇蛋白質標記物之核酸序列，視情況其中該可選擇蛋白質標記物為二氫葉酸還原酶(DHFR)。在另一實施例中，編碼CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物之核酸序列可操作地連接至編碼標籤之核酸。在又一實施例中，編碼標籤之核酸處於編碼CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物之核酸序列上游之5’，使得該標籤與CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物之N端融合。在另一實施例中，標籤為CD34富集標籤。在另一實施例中，單獨(例如編碼TCRα及/或TCRβ)或與編碼CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物之核酸序列組合的本文所述之經分離之核酸與內部核糖體進入位點或編碼自裂解肽之核酸序列相互連接。在又一實施例中，自裂解肽為P2A、E2A、F2A或T2A。
在又一態樣中，提供一種宿主細胞，其包含本文所述之經分離之核酸，包含本文所述之載體，及/或表現本文所述之結合蛋白，視情況其中該細胞經基因工程改造。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明涵蓋之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一個實施例中，宿主細胞包含TCR基因、HLA基因或兩者之染色體基因剔除。在另一實施例中，宿主細胞包含選自以下之HLA基因之剔除：α1巨球蛋白基因、α2巨球蛋白基因、α3巨球蛋白基因、β1微球蛋白基因、β2微球蛋白基因及其組合。在另一實施例中，宿主細胞包含選自TCR α可變區基因、TCR β可變區基因、TCR恆定區基因及其組合之TCR基因之剔除。在又一實施例中，宿主細胞表現CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物，視情況其中該可選擇蛋白質標記物為DHFR。在另一實施例中，CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物與CD34富集標籤融合。在另一實施例中，宿主細胞使用CD34富集標籤進行富集。在又一實施例中，宿主細胞為免疫細胞。在另一實施例中，免疫細胞為細胞毒性淋巴球、細胞毒性淋巴球前驅細胞、細胞毒性淋巴球先驅細胞、細胞毒性淋巴球幹細胞、CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4/CD8雙陰性T細胞、γδ (gamma delta) T細胞、自然殺手(NK)細胞、NK-T細胞、樹突狀細胞或其組合。在另一實施例中，T細胞為初始T細胞、中央記憶T細胞、效應記憶T細胞或其組合。在另一實施例中，T細胞為初級T細胞或T細胞株之細胞。在又一實施例中，T細胞不表現內源性TCR或具有內源性TCR之較低表面表現。在另一實施例中，宿主細胞在與標靶細胞接觸時能夠產生細胞介素或細胞毒性分子，該標靶細胞包括包含在MHC分子背景中之HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之肽-MHC (pMHC)複合物。在另一實施例中，宿主細胞在活體外、離體或活體內與標靶細胞接觸。在又一實施例中，細胞介素為TNF-α、IL-2及/或IFN-γ。在另一實施例中，細胞毒性分子為穿孔蛋白及/或顆粒酶，視情況其中細胞毒性分子為顆粒酶B。在另一實施例中，宿主細胞在與表現HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之標靶細胞接觸時能夠產生更高水準之細胞介素或細胞毒性分子。在又一實施例中，宿主細胞能夠產生至少高出1.05倍水準之細胞介素或細胞毒性分子。在另一實施例中，宿主細胞能夠殺傷包括包含在MHC分子背景中之HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之肽-MHC (pMHC)複合物的標靶細胞。在另一實施例中，殺傷係藉由殺傷分析來測定。在又一實施例中，殺傷分析中宿主細胞與標靶細胞之比率為20:1至0.625:1。在另一實施例中，標靶細胞為用1 µg/mL至50 pg/mL HPV16 E7 11-19肽進行脈衝輸送之T2細胞。在另一實施例中，宿主細胞在與表現HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之標靶細胞接觸時能夠殺傷更高數目之標靶細胞。在又一實施例中，宿主細胞能夠殺傷至少高出1.05倍之數目的標靶細胞。在另一實施例中，標靶細胞為CaSki、SCC152或SCC090細胞株。在另一實施例中，HPV16 E7 11-19免疫原性肽包含胺基酸序列YMLDLQPET。在又一實施例中，MHC分子為MHC I類分子。在另一實施例中，MHC分子包含MHC α鏈，該鏈為HLA血清型HLA-A*02。在另一實施例中，HLA對偶基因係選自由以下組成之群：HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06及HLA-A*02:07對偶基因。在又一實施例中，標靶細胞為選自由CaSki、SCC152及SCC090細胞株組成之群的細胞株，為表現HPV16 E7 11-19免疫原性肽之癌細胞，或不為siHa細胞株及/或不為NCI-H1792細胞株。在另一實施例中，癌細胞係選自由以下組成之群：頭頸癌細胞、口咽癌細胞、子宮頸癌細胞、肛門癌細胞、陰道癌細胞、陰門癌細胞及陰莖癌細胞。在另一實施例中，a)宿主細胞在與包括包含在MHC分子背景中之SPTA1、MPL、HERC1、CPAMD8、INTS4、NUTM1及/或XM_00172256肽抗原決定基之肽-MHC (pMHC)複合物的標靶細胞接觸時不誘導T細胞擴增、細胞介素釋放或細胞毒性殺傷，及/或b)宿主細胞不表現HPV16 E7 11-19抗原，未被本文所述之結合蛋白識別，不屬於血清型HLA-A*02，及/或不表現HLA-A*02對偶基因，諸如HLA-A*02:01及/或HLA-A*02:06。
在另一態樣中，提供本文所述之宿主細胞之群體。
在另一態樣中，提供一種組合物，其包含a)本文所述之結合蛋白、b)本文所述之經分離之核酸、c)本文所述之載體、d)本文所述之宿主細胞及/或e)本文所述之宿主細胞之群體，及載劑。
在又一態樣中，提供一種裝置或套組，其包含a)本文所述之結合蛋白、b)本文所述之經分離之核酸、c)本文所述之載體、d)本文所述之宿主細胞，及/或e)本文所述之宿主細胞之群體，該裝置或套組視情況包含偵測a)、d)及/或e)與pMHC複合物之結合之試劑。
在另一態樣中，提供一種產生本文所述之結合蛋白的方法，其中該方法包括以下步驟：(i)在適合允許該結合蛋白表現之條件下培養經轉型之宿主細胞，該宿主細胞已藉由包含編碼本文所述之結合蛋白之序列的核酸轉型；及(ii)回收所表現之結合蛋白。
在另一態樣中，提供一種產生表現本文所述之結合蛋白之宿主細胞的方法，其中該方法包括以下步驟：(i)將包含編碼本文所述之結合蛋白之序列的核酸引入宿主細胞中；(ii)在適合允許該結合蛋白表現之條件下培養經轉型之宿主細胞。
在又一態樣中，提供一種偵測HPV16 E7 11-19抗原及/或表現HPV16 E7 11-19之細胞之存在或不存在的方法，視情況其中該細胞為過度增殖細胞，該方法包括藉由使用至少一種本文所述之結合蛋白或至少一種本文所述之宿主細胞來偵測樣品中該HPV16 E7 11-19抗原之存在或不存在，其中偵測到HPV16 E7 11-19抗原表明存在HPV16 E7 11-19抗原及/或表現HPV16 E7 11-19之細胞。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明涵蓋之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一個實施例中，至少一種結合蛋白或至少一種宿主細胞與在MHC分子背景中之HPV16 E7 11-19肽形成複合物，且以螢光活化細胞分選(FACS)、酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫化學、西方墨點法或細胞內流式分析之形式偵測複合物。在另一實施例中，方法進一步包括自個體獲得樣品。在另一實施例中，方法進一步包括藉由骨髓生檢來確認表現HPV16 E7 11-19之細胞。
在另一態樣中，提供一種偵測個體中以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之程度的方法，其包括：a)使自個體獲得之樣品與至少一種本文所述之結合蛋白、至少一種本文所述之宿主細胞或本文所述之宿主細胞之群體接觸；及b)偵測反應性水準，其中與對照水準相比反應性水準更高指示該個體中以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之程度。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明涵蓋之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一個實施例中，對照水準為參考數字。在另一實施例中，對照水準為來自未患以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之個體的水準。
在另一態樣中，一種用於監測個體中以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之進展的方法，該方法包括：a)如本文所述，在第一時間點偵測個體樣品中HPV16 E7 11-19抗原水準或表現HPV16 E7 11-19之所關注細胞；b)在後續時間點重複步驟a)；及c)比較在步驟a)及b)中偵測到之HPV16 E7 11-19抗原水準或表現HPV16 E7 11-19之所關注細胞以監測個體中以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之進展，其中與步驟a)相比，步驟b)中偵測到之HPV16 E7 11-19水準或表現HPV16 E7 11-19之所關注細胞的不存在或降低表明該個體中以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發的進展受到抑制。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明涵蓋之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一個實施例中，在第一時間點與後續時間點之間，個體已進行治療以治療以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發。
在又一態樣中，一種評估療法對以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之功效的方法，其包括：a)在針對以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發向個體提供療法之至少一部分之前自個體獲得之第一樣品中，測定自個體獲得之樣品與至少一種本文所述之結合蛋白、至少一種本文所述之宿主細胞或本文所述之宿主細胞之群體之間的反應性之存在或水準，及b)在針對以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發提供療法之部分後自個體獲得之第二樣品中，測定自個體獲得之樣品與至少一種本文所述之結合蛋白、至少一種本文所述之宿主細胞或本文所述之宿主細胞之群體之間的反應性之存在或水準，其中相對於第一樣品，第二樣品中不存在反應性或反應性水準降低表明該療法有效治療該個體之以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明涵蓋之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一個實施例中，反應性水準由a)結合之存在及/或b) T細胞活化及/或效應功能指示。在另一實施例中，T細胞活化或效應功能為T細胞增殖、殺傷或細胞介素釋放。在另一實施例中，T細胞結合、活化及/或效應功能係使用螢光活化細胞分選(FACS)、酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫化學、西方墨點法或細胞內流式分析來偵測。
在另一態樣中，一種預防及/或治療個體中以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發的方法，其包括向該個體投與治療有效量的包含表現至少一種本文所述之結合蛋白之細胞的組合物。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明涵蓋之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一個實施例中，細胞為同種異體細胞、同基因型細胞或自體同源細胞。在另一實施例中，細胞經基因修飾。在另一實施例中，細胞包含TCR基因、HLA基因或TCR基因與HLA基因之染色體基因剔除。在又一實施例中，細胞包含選自以下之HLA基因之剔除：α1巨球蛋白基因、α2巨球蛋白基因、α3巨球蛋白基因、β1微球蛋白基因、β2微球蛋白基因及其組合。在另一實施例中，細胞包含選自以下之TCR基因之剔除：TCR α可變區基因、TCR β可變區基因、TCR恆定區基因及其組合。在另一實施例中，細胞表現CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物，視情況其中該可選擇蛋白質標記物為DHFR，且進一步視情況其中CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物與CD34富集標籤融合。在又一實施例中，細胞使用CD34富集標籤進行富集。在另一實施例中，為免疫細胞。在另一實施例中，免疫細胞為細胞毒性淋巴球、細胞毒性淋巴球前驅細胞、細胞毒性淋巴球先驅細胞、細胞毒性淋巴球幹細胞、CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4/CD8雙陰性T細胞、γδ (gamma delta) T細胞、自然殺手(NK)細胞、NK-T細胞、樹突狀細胞或其組合。在另一實施例中，T細胞為初始T細胞、中央記憶T細胞、效應記憶T細胞或其組合。在另一實施例中，T細胞為初級T細胞或T細胞株之細胞。在另一實施例中，T細胞不表現內源性TCR或具有內源性TCR之較低表面表現。在又一實施例中，細胞在與標靶細胞接觸時能夠產生細胞介素或細胞毒性分子，該標靶細胞包括包含在MHC分子背景中之HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之肽-MHC (pMHC)複合物。在另一實施例中，細胞介素為TNF-α、IL-2及/或IFN-γ。在另一實施例中，細胞毒性分子為穿孔蛋白及/或顆粒酶，視情況其中該細胞毒性分子為顆粒酶B。在另一實施例中，細胞在與表現HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之標靶細胞接觸時能夠產生更高水準之細胞介素或細胞毒性分子。在另一實施例中，胞能夠產生至少高出1.05倍水準之細胞介素或細胞毒性分子。在另一實施例中，宿主細胞能夠殺傷包括包含在MHC分子背景中之HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之肽-MHC (pMHC)複合物的標靶細胞。在又一實施例中，宿主細胞在與表現HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之標靶細胞接觸時能夠殺傷更高數目之標靶細胞。在另一實施例中，宿主細胞能夠殺傷高出至少1.05倍數目之標靶細胞。在另一實施例中，HPV16 E7 11-19免疫原性肽包含胺基酸序列YMLDLQPET。在又一實施例中，MHC分子為MHC I類分子。在另一實施例中，MHC分子包含MHC α鏈，該鏈為HLA血清型HLA-A*02。在另一實施例中，HLA對偶基因係選自由以下組成之群：HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06及HLA-A*02:07對偶基因。在又一實施例中，標靶細胞為個體中表現HPV16 E7 11-19抗原之非惡性細胞或過度增生性細胞。在另一實施例中，組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，組合物在個體中誘導針對表現HPV16 E7 11-19抗原之非惡性細胞或過度增生性細胞的免疫反應。在又一實施例中，組合物在個體中誘導針對表現HPV16 E7 11-19抗原之非惡性細胞或過度增生性細胞之抗原特異性T細胞免疫反應。在另一實施例中，抗原特異性T細胞免疫反應包含CD4 +輔助T淋巴球(Th)反應及CD8+細胞毒性T淋巴球(CTL)反應中之至少一者。在另一實施例中，病症與HPV感染相關。諸如HPV16感染。在另一實施例中，癌症為頭頸癌(例如頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))、口咽癌、子宮頸癌、肛門癌、陰道癌、陰門癌及/或陰莖癌。在又一實施例中，個體正接受或先前接受過造血細胞移植(HCT)，視情況其中該HCT包含不表現HPV16 E7 11-19抗原，未被本文所述之結合蛋白識別，不屬於血清型HLA-A*02，及/或不表現HLA-A*02:01對偶基因的細胞。在另一實施例中，HCT包括包含編碼HLA組分之基因之染色體剔除、編碼TCR組分之基因之染色體剔除或兩者的供體造血細胞。在另一實施例中，個體先前曾接受過清除淋巴細胞化學療法。在另一實施例中，清除淋巴細胞化學療法包含環磷醯胺(cyclophosphamide)、氟達拉濱(fludarabine)、抗胸腺細胞球蛋白或其組合。在另一實施例中，方法進一步包括向個體投與至少一種針對非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發的額外治療。在又一實施例中，至少一種針對非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發的額外治療係與組合物同時或依次投與。在另一實施例中，個體為以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症的動物模型及/或個體為哺乳動物，視情況其中該哺乳動物為人類、靈長類動物或嚙齒類動物。
在另一態樣中，提供一種表現載體，其包含與編碼CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物之核酸序列可操作地連接的啟動子，視情況其中該可選擇蛋白質標記物為DHFR。
進一步提供多個實施例，其可應用於本發明涵蓋之任何態樣及/或與本文所述之任何其他實施例組合。舉例而言，在一個實施例中，編碼CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物之核酸序列可操作地連接至編碼標籤之核酸，以使得標籤與CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物融合。在另一實施例中，編碼標籤之核酸處於編碼CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物之核酸序列上游之5’，使得標籤與CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物之N端融合。在另一實施例中，標籤為CD34富集標籤。在又一實施例中，載體進一步包含編碼TCRα及/或TCRβ之核酸序列。在另一實施例中，TCRα、TCRβ及/或DN-TGFβRII包含突變跨膜域及/或突變恆定域。在另一實施例中，突變跨膜域及/或突變恆定域增強TCRα、TCRβ及/或DN-TGFβRII之細胞表面表現，同時減少內源性TCRα、TCRβ及/或TGFβRII之表現。在又一實施例中，編碼CD8α、CD8β、DN-TGFβRII、可選擇蛋白質標記物、TCRα及/或TCRβ之核酸序列與內部核糖體進入位點或編碼自裂解肽之核酸序列相互連接。在另一實施例中，自裂解肽為P2A、E2A、F2A或T2A。在另一實施例中，載體進一步包含編碼選自由表1中所列之多肽序列組成之群的多肽的核酸序列，或與編碼選自由表1中所列之該等多肽序列組成之群的多肽的核酸具有至少約80%同源性的序列，視情況其中該經分離之核酸分子包含1)選自表1中所列之TRAV、TRAJ及TRAC基因之群的TRAV、TRAJ及/或TRAC基因或其片段及/或2)選自表1中所列之TRBV、TRBJ及TRBC基因之群的TRBV、TRBJ及/或TRBC基因或其片段。在另一實施例中，載體具有或包含表3中所示之核酸序列或其片段，視情況其中該片段編碼DN-TGFβRII。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2022年5月16日申請之美國臨時申請案第63/342,479號、2022年3月7日申請之美國臨時申請案第63/317,326號及2021年11月10日申請之美國臨時申請案第63/277,901號之權益；該等申請案之完整內容以引用之方式整體併入本文中。
本發明至少部分係基於識別HPV16 E7 11-19抗原(例如包含胺基酸序列YMLDLQPET之免疫原性肽)之結合蛋白，包括T細胞受體(TCR)之發現。
因此，本發明部分關於經鑑定之結合蛋白(例如，TCR)；表現結合蛋白(例如，TCR)之宿主細胞；包含結合蛋白(例如，TCR)及表現結合蛋白(例如，TCR)之宿主細胞之組合物；診斷、預後及監測T細胞對表現HPV16 E7 11-19抗原之細胞之反應的方法；以及用於預防及/或治療以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之方法，其藉由投與表現結合蛋白(例如，TCR)之宿主細胞來進行。 I. 定義
為方便起見，此處收集本說明書、實例及隨附申請專利範圍中所用之某些術語。
冠詞「一(a/an)」在本文中用於指該冠詞之一個或超過一個(亦即，至少一個)語法對象。舉例而言，「一要素」意謂一種要素或超過一種要素。
術語「投與」意謂向個體提供醫藥劑或組合物，且包括但不限於由醫學專業人員投與及自我投與。此涉及使用所屬領域技術人員已知之各種方法及遞送系統中之任一種將包含治療劑之組合物物理引入個體。在一些實施例中，本文所述之結合蛋白之投與途徑包括靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、脊髓或其他非經腸投與途徑，例如藉由注射或輸注。如本文所用，片語「非經腸投與」意謂除腸內及局部投與以外之投與模式，通常藉由注射，且包括不限於靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、鞘內、淋巴管內、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、包膜下、蛛網膜下腔、脊髓內、硬膜外及胸骨內註射及輸注，以及活體內電穿孔。或者，本文所述之結合蛋白可經由非注射途徑(non-parenteral route)投與，諸如局部、表皮或黏膜投與途徑，例如鼻內、口服、陰道、直腸、舌下或局部。施用亦可例如進行一次、複數次及/或在一或多個延長時段內進行。
如本文所用，術語「抗原」係指任何天然或合成之免疫原性物質，諸如蛋白質、肽或半抗原。抗原可為HPV16 E7 11-19抗原或其片段，需要針對其進行保護性或治療性免疫反應。
如本文所用，術語「佐劑」係指與單獨投與抗原相比，當在投與抗原之前、同時或之後投與時促進、延長及/或增強對抗原之免疫反應之品質及/或強度的物質。佐劑可增加由疫苗接種誘導之免疫反應之量級及持續時間。
如本文所用之術語「抗體」包括全抗體及其任何抗原結合片段(亦即，「抗原結合部分」)或單鏈。在一個實施例中，「抗體」係指包含藉由二硫鍵相互連接之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈之糖蛋白，或其抗原結合部分。各條重鏈由重鏈可變區(本文縮寫為V H)及重鏈恆定區構成。在某些天然存在之抗體中，重鏈恆定區由三個域，CH1、CH2及CH3構成。在某些天然存在之抗體中，各條輕鏈由輕鏈可變區(本文縮寫為V L)及輕鏈恆定區構成。輕鏈恆定區由一個域CL構成。V H及V L區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，其中散佈更保守之區域，稱為構架區(FR)。V H及V L各由三個CDR及四個FR構成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合，包括免疫系統之各種細胞(例如效應細胞)及經典補體系統之第一組分(Clq)。
術語「抗原呈現細胞」或「APC」包括專職抗原呈現細胞(例如，B淋巴球、單核球、樹突狀細胞、朗格漢斯細胞(Langerhans cell))，以及其他抗原呈現細胞(例如，角質細胞、內皮細胞、星形細胞、纖維母細胞及寡樹突細胞)。
如本文所用，諸如TCR之結合蛋白之術語「抗原結合部分」係指TCR之一或多個保留結合(例如，特異性及/或選擇性)抗原(例如，HPV16 E7 11-19抗原)之能力的部分。此類部分之長度例如為約8至約1500個胺基酸，長度合適為約8至約745個胺基酸，長度合適為約8至約300個，例如約8至約200個胺基酸，或約10至約50個或100個胺基酸。已顯示，TCR之抗原結合功能可由全長TCR之片段執行。涵蓋在TCR之術語「抗原結合部分」內之結合部分之實例包括：(i)由TCR之V α及V β域組成之Fv片段；(ii)分離之互補決定區(CDR)；或(iii)兩個或更多個分離之CDR之組合，其可視情況藉由合成連接子接合。此外，雖然V α及V β由分開之基因編碼，但可使用重組方法藉由合成連接子將其接合，使其能夠製成單個蛋白質鏈，其中V α及V β區域配對形成單價分子(稱為單鏈TCR (scTCR))。此類單鏈TCR亦意欲涵蓋在術語TCR之「抗原結合部分」內。此等TCR片段可使用所屬領域技術人員已知之習知技術獲得，且以與完全結合蛋白相同之方式針對實用性來篩選該等片段。抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由完整免疫球蛋白之酶促或化學裂解產生。
術語「互補決定區」及「CDR」與「高變區」或「HVR」同義，且在所屬領域中已知係指某些結合蛋白，諸如TCR可變區內之非連續胺基酸序列，其賦予抗原特異性及/或結合親和力。對於TCR，一般而言，各α鏈可變區(αCDR1、αCDR2及αCDR3)中存在三個CDR，且各β鏈可變區(βCDR1、βCDR2及βCDR3)中存在三個CDR。據信CDR3係負責識別經加工抗原之主要CDR。CDR1及CDR2主要與MHC相互作用。
術語「體液」係指自身體排泄或分泌之流體，以及通常不自身體排泄或分泌之流體(例如，羊水、水樣液、膽汁、血液及血漿、腦脊髓液、耵聹及耳垢、考珀液(cowper’s fluid)或射精前液、乳糜、食糜、糞便、女性射液、間隙液、細胞內液、淋巴液、月經、母乳、黏液、胸水、膿液、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、淚液、尿液、陰道潤滑液、玻璃樣液、嘔吐物)。在一些實施例中，體液包含免疫細胞，視情況其中免疫細胞為細胞毒性淋巴球，諸如細胞毒性T細胞及/或NK細胞、CD4+T細胞及其類似細胞。
術語「編碼區」係指核苷酸序列中包含轉譯成胺基酸殘基之密碼子之區域，而術語「非編碼區」係指核苷酸序列中不轉譯成胺基酸之區域(例如，5'及3'非轉譯區)。
術語「互補」係指兩條核酸股之區域之間或同一核酸股之兩個區域介於兩者之間的序列互補性之廣泛概念。已知第一核酸區之腺嘌呤殘基在第二核酸區之殘基為胸腺嘧啶或尿嘧啶之情況下能夠與同第一區反向平行之第二核酸區之殘基形成特定氫鍵(「鹼基配對」)。類似地，已知第一核酸股之胞嘧啶殘基在第二核酸股之殘基為鳥嘌呤之情況下能夠與同第一股反向平行之第二核酸股之殘基進行鹼基配對。若當核酸之第一區與相同或不同核酸之第二區以反向平行之方式排列時，第一區之至少一個核苷酸殘基能夠與第二區之殘基進行鹼基配對，則該兩個區域互補。在一些實施例中，第一區包含第一部分且第二區包含第二部分，其中當第一部分及第二部分以反向平行之方式排列時，第一部分之核苷酸殘基之至少約50%且在其他實施例中至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如至少約80%-100%能夠與第二部分中之核苷酸殘基進行鹼基配對。在一些實施例中，第一部分之所有核苷酸殘基均能夠與第二部分中之核苷酸殘基進行鹼基配對。
如本文所用，關於經活化之免疫細胞之術語「共刺激」包括共刺激分子提供誘導增殖或效應功能之非活化受體介導之第二信號(「共刺激信號」)的能力。例如，共刺激信號可能例如在已接收到T細胞受體介導之信號之T細胞中引起細胞介素分泌。已接收到例如經由活化受體的細胞受體介導之信號之免疫細胞在本文中稱為「經活化之免疫細胞」。
「CD3」在所屬領域中已知為具有六條鏈之多蛋白複合物(參見Abbas及Lichtman, Cellular and Molecular Immunology (第9版) (2018)；Janeway等人 (Immunobiology) (第9版) (2016))。在哺乳動物中，複合物包含一條CD3γ鏈、一條CD3δ鏈、兩條CD3ε鏈、及CD3ζ鏈之一種同源二聚體。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈係含有單個免疫球蛋白域之免疫球蛋白超家族之相關細胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈之跨膜區帶負電荷，該特徵據信允許此等鏈與T細胞受體鏈之帶正電荷區域或殘基締合。CD3γ、CD3δ及CD3ε鏈之細胞內尾部各含有單個保守模體，稱為基於免疫受體酪胺酸之活化模體或IT AM，而各CD3ζ鏈具有三個ITAM。不希望受理論束縛，咸信IT AM對於TCR複合物之信號傳導能力很重要。根據本發明使用之CD3可來自各種動物物種，包括人類、小鼠、大鼠或其他哺乳動物。
如本文所用，「TCR複合物之組分」係指TCR鏈(亦即，TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ)、CD3鏈(亦即，CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ)或由兩條或更多條TCR鏈或CD3鏈形成之複合物(例如TCRα及TCRβ之複合物、TCRγ及TCRδ之複合物、CD3ε及CD3δ之複合物、CD3γ及CD3ε之複合物、或TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ及兩條CD3ε鏈之子TCR複合物)。
「嵌合抗原受體」或「CAR」係指一種融合蛋白，其經工程改造以含有兩個或更多個以非天然存在或非天然存在於宿主細胞中之方式連接在一起的胺基酸序列，該融合蛋白在存在於細胞表面上時可用作受體。本發明所涵蓋之CAR可包括細胞外部分，其包含抗原結合域(亦即，獲自或源自免疫球蛋白或免疫球蛋白樣分子，諸如對HPV16 E7 11-19抗原具有特異性之TCR、單鏈TCR來源之結合蛋白、源自抗體之scFv、源自或獲自來自NK細胞之殺手免疫受體之抗原結合域)，該抗原結合域與跨膜域及一或多個細胞內信號傳導域(諸如效應域，視情況含有共刺激域)連接(參見例如Sadelain等人 (2013) Cancer Discov.3:388；亦參見Harris及Kranz (2016) Trends Pharmacol. Sci.37: 220；Stone等人 (2014) Cancer Immunol. Immunother.63:1163)。
如本文所用，術語「細胞毒性T淋巴球(CTL)反應」係指由細胞毒性T細胞誘導之免疫反應。CTL反應主要由CD8 +T細胞介導。
術語「基本上由……組成」不等同於「包含」，且係指申請專利範圍之具體材料或步驟，或不實質影響所主張之主題之基本特徵的彼等材料或步驟。例如，蛋白質域、區域或模組(例如，結合域、鉸鏈區、連接子模組)或蛋白質(可能具有一或多個域、區域或模組)在域、區域、模組或蛋白質之胺基酸序列包括在組合下最多佔域、區域、模組或蛋白質長度之20% (例如，最多15%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)且不顯著影響(亦即，不使活性降低超過50%，例如不超過40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或1%)域、區域、模組或蛋白質之活性(例如，結合蛋白之標靶結合親和力)的延伸、缺失、突變或其組合(例如，在胺基端或羧基端或域介於兩者之間的胺基酸)時「基本上由特定胺基酸序列組成」。
術語「確定適合個體之治療方案」意謂確定用於個體之治療方案(亦即，用於預防及/或治療個體之病毒感染之單一療法或不同療法之組合)，該治療方案係基於或基本上基於或至少部分基於根據本發明之分析結果開始、進行修改及/或結束。一個實例係在手術之後開始輔助療法，其目的為降低復發風險，另一實例將為修改特定化學療法之劑量。除根據本發明之分析結果以外，該確定亦可基於待治療個體之個人特徵。在大多數情況下，將由主治醫師或醫生執行對適合個體之治療方案之實際確定。
術語「顯性負性TGFβ受體」或「DN-TGFβR」係指抵抗TGFβ信號傳導之轉型生長因子(TGF) β受體變異體或突變體。存在五種II型受體(活化受體)及七種I型受體(信號傳播受體)。活性TGFβ受體為異四聚體，由兩個TGF β受體I (TGFβRI)及兩個TGFβ受體II (TGFβRII)組成。在一些實施例中，DN-TGFβR為DN-TGFβRII (亦即TGFβ受體II變異體或突變體)。在一些實施例中，抵抗TGFβ信號傳導在諸如T細胞之免疫細胞上的抑制作用，該TGFβ可由癌細胞產生，或由細胞環境內之其他免疫細胞，諸如由基質細胞、巨噬細胞、骨髓細胞、上皮細胞、自然殺手細胞及其類似細胞產生。TGFβ信號傳導抑制劑為所屬領域中熟知的，且包括不限於螯合受體且藉此抑制信號傳導之突變TGFβ；與TGFβ和/或TGFβ受體結合之抗體(例如樂德木單抗(lerdelimumab)、麥力木單抗(metlimumab)、非蘇木單抗(fressolimumab)及其類似物)；可溶性TGFβ結合蛋白，諸如螯合TGFβ之TGFβ受體之部分(例如TGFβRII-Fc融合蛋白)；或其他結合劑，諸如β-聚糖。代替本文所述之DN-TGFβR (例如DN-TGFβRII)或除其之外，可使用任何及所有已知之TGFβ信號傳導抑制劑。在一些實施例中，DN-TGFβR缺乏TGFβ介導之信號傳導所需的細胞內部分，諸如整個細胞內域、激酶信號傳導域等。DN-TGFβR構築體為所屬領域中熟知的。(代表性非限制性實施例參見Brand等人 (1993) J. Biol. Chem.268:11500-11503；Weiser等人 (1993) Mol. Cell Biol.13:7239-7247；Bollard等人 (2002) Blood99::3179-3187；PCT公開案WO 2009/152610；PCT公開案WO 2017/156484；Kloss等人 (2018) Mol. Ther.26:1855-1866；PCT公開案WO. 2019/089884；PCT公開案WO 2020/042647；以及PCT公開案WO 2020/042648。
在一些實施例中，包含一或多種本文所述之結合蛋白(例如TCR)之免疫細胞產物(例如經工程改造之T細胞)對β介導之免疫抑制具有抗性。如上文及本文中進一步所述，TGFβ為一種免疫抑制性細胞介素，由腫瘤細胞及腫瘤微環境中之細胞產生。TGFβ抑制細胞毒性及Th1輔助性T細胞之功能及擴增，導致對腫瘤特異性T細胞反應之抑制(Dahmani及Delisle (2018) Cancers 10:194)。T細胞中之TGFβ信號傳導可藉由顯性負性TGFβ II型受體(DN-TGFβRII)之表現而廢除(Wieser等人(1993) Mol. Cell. Biol.13:7239-7247；Bollard等人(2002) Blood99:3179-3187)。在與TGFβ結合時，野生型TGFβRII發生磷酸化且藉此活化TGFβRI且引發細胞內信號傳輸。在表現缺乏細胞內激酶域之截短TGFβRII (DN-TGFβRII)的細胞中此信號傳導級聯間斷，藉此導致細胞對TGFβ之抑制有抗性。DN-TGFβRII阻斷經工程改造之T細胞(CAR-T與TCR-T細胞)中的TGFβ信號傳導(Bollard等人 (2002) Blood99:3179-3187；Foster等人 (2008) J. Immunother.31:500-505；Kloss等人 (2018) Mol. Ther.26:1855-1866；Alabanza等人 (2022) Front. Immunol.13:832645；Silk等人 (2022) J. Immunol.208:169-180；Li等人 (2020) Front. Oncol.10:1117)。在代表性研究中，用於治療霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)之裝備有DN-TGFβRII之EBV特異性T細胞的評估顯示經DN-TGFβRII工程改造之T細胞為安全且有效的(Bollard等人 (2018) J. Clin. Oncol.36:1128-1139)。
「Kite T細胞受體」或「比較T細胞受體」係指在美國專利第10,174,098號及美國專利申請案第62/004,335號、第61/846,167號及第61/846,161號中報導之至少一種基準T細胞受體(例如，「Kite-439」)。在一些實施例中，「Kite」或「比較」T細胞受體具有表2中所示之序列。
如本文所用，「同源」係指同一核酸股之兩個區域之間或兩個不同核酸股之區域介於兩者之間的核苷酸序列相似性。當兩個區域中之核苷酸殘基位置由相同核苷酸殘基佔據時，則該等區域在彼位置處係同源的。若各區域之至少一個核苷酸殘基位置由相同殘基佔據，則第一區與第二區同源。兩個區域介於兩者之間的同源性以兩個區域之核苷酸殘基位置由相同核苷酸殘基佔據之比例表述。舉例而言，具有核苷酸序列5'-ATTGCC-3'之區域及具有核苷酸序列5'-TATGGC-3'之區域共享50%同源性。在一些實施例中，第一區域包含第一部分且第二區域包含第二部分，其中各部分之核苷酸殘基位置之至少約50%且在其他實施例中至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如至少約80%-100%由相同核苷酸殘基佔據。在一些實施例中，各部分之所有核苷酸殘基位置均由相同核苷酸殘基佔據。
術語「人類乳突狀瘤病毒」或「HPV」係指係指一種病毒家族，其一些亞型感染，諸如HPV16 (NCBI Ref. Seq. NC_001526.4)，與包括癌症之許多病症有關。在一些情況下，此類病症與HPV致癌蛋白E7 (例如咸信其靶向調節細胞生長控制之腫瘤抑制信號傳導路徑)有關。
如本文所用，術語「HPV16 E7 11-19抗原」或「HPV16 E7 11-19肽抗原」或「含HPV16 E7 11-19肽抗原」或「HPV16 E7 11-19抗原決定基」或「HPV16 E7 11-19肽抗原決定基」或「HPV16 E7 11-19b肽」係指HPV16 E7致癌蛋白之天然或合成產生之肽部分，其包含序列YMLDLQPET、由該序列組成或基本上由該序列組成。
術語「以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之過度增生性病症」可為任何過度增生性病症，其中HPV16 E7 11-19抗原存在於由個體中至少一些過度增殖細胞表現之MHC (例如HLA)複合物中。以HPV16 E7 11-19:HLA複合物為特徵之過度增生性病症之實例包括實體惡性病，諸如下文詳細描述之彼等惡性病。
術語「免疫反應」包括T細胞介導及/或B細胞介導之免疫反應。示例性免疫反應包括T細胞反應，例如細胞介素產生及細胞毒性。此外，術語免疫反應包括受T細胞活化間接影響之免疫反應，例如抗體產生(體液反應)及細胞介素反應性細胞(例如巨噬細胞)之活化。
T細胞共刺激受體之促效活性增強及/或抑制性受體之拮抗活性增強可能引起刺激免疫反應或免疫系統之能力增強。刺激免疫反應或免疫系統之能力增強可由EC 50之增加倍數或量測免疫反應之分析中之最大活性水準來反映，該分析例如量測細胞介素或趨化介素釋放、細胞溶解活性(直接在標靶細胞上測定或經由偵測CD107a或顆粒酶間接測定)及增殖之變化的分析。刺激免疫反應或免疫系統活性之能力可增強至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、350%、400%、500%或更多。
術語「免疫治療劑」可包括可刺激個體中宿主免疫系統對病毒感染產生免疫反應之任何分子、肽、抗體或其他藥劑。各種免疫治療劑可用於本文所述之組合物及方法。
術語「免疫細胞」係指源自骨髓中之造血幹細胞之任何免疫系統細胞，其產生兩種主要譜系：骨髓先驅細胞(產生骨髓細胞，諸如單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞、巨核細胞及顆粒球)；及淋巴先驅細胞(產生淋巴樣細胞，諸如T細胞、B細胞及自然殺手(NK)細胞)。示例性免疫系統細胞包括CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4 CD8雙陰性T細胞、gd T細胞、調控性T細胞、自然殺手細胞及樹突狀細胞。巨噬細胞及樹突狀細胞可稱為「抗原呈現細胞」或「APC」，其為特化細胞，當APC表面上與肽複合之主要組織相容性複合體(MHC)受體與T細胞表面之TCR相互作用時，該等細胞可活化T細胞。
「經分離之蛋白質」係指在自細胞中分離或藉由重組DNA技術產生時實質上不含其他蛋白質、細胞材料、分離介質及培養基之蛋白質，或在化學合成時實質上不含化學前驅物或其他化學物質之蛋白質。「經分離」或「經純化」之蛋白質或其生物活性部分實質上不含來自產生結合蛋白、抗體、多肽、肽或融合蛋白之細胞或組織來源的細胞材料或其他污染蛋白，或在化學合成時實質上不含化學前驅物或其他化學物質。用語「實質上不含細胞材料」包括生物標記物多肽或其片段之製劑，其中蛋白質係自分離出或重組產生該蛋白質之細胞之細胞組分中分離。在一實施例中，用語「實質上不含細胞材料」包括生物標記物蛋白或其片段之製劑，其具有少於約30% (以乾重計)之非生物標記物蛋白(本文中亦稱為「污染蛋白」)，或在一些實施例中，少於約25%、20%、15%、10%、5%、1%或更少或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如少於約1%至5%之非生物標記物蛋白。當重組產生結合蛋白、抗體、多肽、肽或融合蛋白或其片段(例如其生物活性片段)時，其可實質上不含培養基，亦即，培養基佔蛋白質製劑之體積不到約20%、15%、10%、5%、1%或更少或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如少於約1%至5%。
如本文所用，術語「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別(例如，IgM、IgG1、IgG2C及其類似類別)。
如本文所用，術語「K D」意欲指特定結合蛋白-抗原相互作用之解離平衡常數。可藉由標準結合蛋白-標靶分析，例如競爭分析、飽和分析或諸如ELISA或RIA之標準免疫分析來量測或測定本發明所涵蓋之結合蛋白之結合親和力。相對較低之Kd值指示相對較高之結合親和力(例如，小於或等於約5×10 -4M (500 uM)之Kd值包括1×10 -4M (100 uM)之Kd值且100 uM Kd指示與500 uM Kd相比結合親和力相對較高)。
「套組」係包含至少一種試劑，例如探針或小分子之任何製品(例如，包裝或容器)，該至少一種試劑用於特異性偵測及/或影響本發明所涵蓋之標記物的表現。套組可作為用於執行本發明所涵蓋之方法之單元來推銷、分售或銷售。套組可包含表現可用於本發明所涵蓋之方法之組合物所必需的一或多種試劑。在某些實施例中，套組可進一步包含參考標準，例如編碼不影響或調控控制細胞生長、分裂、遷移、存活或凋亡之信號傳導路徑之蛋白質的核酸。所屬領域之技術人員可設想許多此類對照蛋白，包括但不限於常見分子標籤(例如，綠色螢光蛋白及β-半乳糖苷酶)、未藉由GeneOntology參考歸類於任何涵蓋細胞生長、分裂、遷移、存活或凋亡之路徑中的蛋白質或者普遍存在之持家蛋白。套組中之試劑可在個別容器中提供，或在單一容器中以兩種或更多種試劑之混合物形式提供。此外，可包括描述套組內之組合物之用途的指導性材料。
如本文所用，術語「連接」係指兩個或更多個分子之締合。連接可為共價或非共價的。連接亦可為基因的(亦即，重組融合)。此類連接可使用多種公認之技術實現，諸如化學結合及重組蛋白產生。
在一些實施例中，「連接子」可指連接兩個蛋白質、多肽、肽、域、區域或模體之胺基酸序列，且可提供與兩個子結合域之相互作用相容的間隔功能，從而所得多肽保留對標靶分子之特異性結合親和力(例如，scTCR)或保留信號活性(例如，TCR複合物)。在一些實施例中，連接子由例如約2至約35個胺基酸或約4至約20個胺基酸或約8至約15個胺基酸或約15至約25個胺基酸構成。
術語「主要組織相容性複合體」(MHC)係指將肽抗原遞送至細胞表面之糖蛋白。MHC I類分子為異二聚體，具有跨鏈之膜(具有三個域)及非共價締合之b2微球蛋白。MHC II類分子由兩種跨膜糖蛋白a及b構成，該兩種糖蛋白均跨越膜。各條鏈具有兩個域。MHC I 類分子將源自胞質液之肽遞送至細胞表面，在表面上肽抗原-MHC (pMHC)複合物由CD8 +T細胞識別。MHC II類分子將源自囊泡系統之肽遞送至細胞表面，在表面上其由CD4 +T細胞識別。人類MHC被稱為人類白血球抗原(HLA)。
術語「預防(prevent/preventing/prevention)」、「預防性治療」及其類似術語係指降低個體發展疾病、病症或疾患之概率，該個體未患但有風險或容易發展疾病、病症或疾患。
術語「預後」包括對病毒感染之可能過程及結果或自疾病恢復之可能性的預測。在一些實施例中，統計演算法之使用提供對個體中病毒感染之預後。舉例而言，預後可為手術、病毒感染之臨床亞型之發展、一或多種臨床因素之發展或自疾病恢復。
如本文所用，胺基酸序列之間的「一致性百分比」與「同源性百分比」同義，其可使用由Karlin及Altschul修改((1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:5873-5877)之Karlin及Altschul演算法((1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:2264-2268)測定。將所提及之演算法併入至Altschul等人((1990) J. Mol. Biol.215:403-410)之NBLAST及XBLAST程式。用NBLAST程式執行BLAST核苷酸搜索，分數=100，字長=12，以獲得與本文所述之多核苷酸同源之核苷酸序列。用XBLAST程式執行BLAST蛋白質搜索，分數=50，字長=3，以獲得與參考多肽同源之胺基酸序列。為獲得間隙比對以達成比較目的，使用間隙BLAST，如Altschul等人 (1997) Nuc. Acids Res.25:3389-3402所述。當使用BLAST及間隙BLAST程式時，使用各別程式(例如，XBLAST及NBLAST)之預設參數。
如本文所用，片語「醫藥學上可接受之載劑」意謂參與將本發明化合物自身體之一個器官或部分攜帶或轉運至身體之另一個器官或部分的醫藥學上可接受之材料、組合物或媒劑，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑或溶劑囊封材料。
術語「重組宿主細胞」(或簡稱「宿主細胞」)係指包含非天然存在於細胞中之核酸之細胞，諸如已引入重組表現載體之細胞。應當理解，根據本發明之細胞不僅係指特定之主題細胞，且亦涵蓋此類細胞之後代。因為由於突變或環境影響可能在後世代中發生某些修飾，所以此類後代實際上可能與親代細胞不同，但仍包括在根據本發明之術語細胞之範圍內。
術語「癌症反應」、「對免疫療法之反應」或「對T細胞介導之細胞毒性調節劑/免疫療法組合療法之反應」係指過度增生性疾病(例如癌症)對癌症藥劑(諸如T細胞介導之細胞毒性調節劑及免疫療法)之任何反應，較佳係指在新輔助或輔助療法開始後腫瘤質量及/或體積之變化。術語「新輔助療法」係指在主要治療之前給予之治療。新輔助療法之實例可包括化學療法、放射療法及激素療法。可例如針對療效或在新輔助或輔助情況下評估過度增生性病症反應，其中藉由CT、PET、乳房X光攝影、超音波或觸診量測，全身介入後之腫瘤大小可與初始大小及尺寸進行比較。反應亦可藉由卡尺量測或生檢或手術切除後之腫瘤病理學檢查來評估。反應可以定量方式(如腫瘤體積變化百分比)或定性方式(如「病理完全反應」(pCR)、「臨床完全緩解」(cCR)、「臨床部分緩解」(cPR)、「臨床穩定疾病」(cSD)、「臨床進展性疾病」(cPD)或其他定性標準)記錄。過度增生性病症反應之評估可在新輔助或輔助療法開始後早期進行，例如在幾小時、幾天、幾週或較佳幾個月之後進行。反應評估之典型終點為新輔助化學療法終止或手術切除殘留腫瘤細胞及/或腫瘤床時。此通常為在開始新輔助療法後三個月。在一些實施例中，本文所述之治療性治療之臨床功效可藉由量測臨床受益率(CBR)來確定。臨床受益率藉由確定以下各者之總和來量測：在距離療法結束至少6個月之時間點的完全緩解(CR)患者百分比、部分緩解(PR)患者數量及穩定疾病(SD)患者數量。此公式之簡寫為CBR=6個月內CR+PR+SD。在一些實施例中，特定癌症治療方案之CBR為至少25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或更多。評估對癌症療法反應之其他標準與「存活」有關，包括以下所有內容：存活至死亡，亦稱為總存活期(其中死亡可能不考慮原因或與腫瘤相關)；「無復發存活期」(其中術語復發應包括局部復發及遠處復發)；無轉移存活期；無病存活期(其中術語疾病應包括癌症及與之相關之疾病)。該存活之長度可藉由參考定義之起點(例如診斷時間或治療開始時間)及終點(例如死亡、復發或轉移)來計算。此外，治療功效之標準可擴大到包括對化學療法之反應、存活概率、給定時段內之轉移概率及腫瘤復發概率。舉例而言，為確定適當閾值，可將特定癌症治療方案投與至個體群體且結果可與在投與任何癌症療法之前測定之生物標記物量測值相關。結果量測可能為對在新輔助環境中給與之療法的病理反應。或者，可在癌症療法後的一段時間內監測生物標記物量測值已知之個體之結果量測，諸如總存活期及無病存活期。在某些實施例中，投與之劑量為所屬領域已知之癌症治療劑之標準劑量。監測個體之時段可能有所不同。例如，可監測個體至少2個月、4個月、6個月、8個月、10個月、12個月、14個月、16個月、18個月、20個月、25個月、30個月、35個月、40個月、45個月、50個月、55個月或60個月。與癌症療法結果相關之生物標記物量測閾值可使用所屬領域熟知之方法，諸如實例部分中描述之彼等方法來確定。
如所指出，該等術語亦可指改善之預後，例如反映在複發時間增加，其為第一次復發之時期，將第二原發性癌症作為無復發證據之第一次事件或死亡進行審查；或總存活期增加，亦即自治療至任何原因死亡之時期。反應或做出反應意謂當暴露於刺激時達到有益終點。或者，負面或有害症狀在暴露於刺激時最小化、減輕或減弱。應當理解，評估腫瘤或個體將展現有利反應之可能性等同於評估腫瘤或個體將不會展現有利反應(亦即，將展現缺乏反應或無反應)之可能性。
術語「抗性」係指癌症樣品或哺乳動物對癌症療法之獲得性或天然抗性(亦即，對治療性治療無反應或對治療性治療之反應降低或有限)，諸如對治療性治療之反應降低5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多，諸如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多，或兩者之間的任何範圍(包括端點)。可藉由與獲得抗性之前的相同癌症樣品或哺乳動物進行比較，或藉由與已知對治療性治療無抗性之不同癌症樣品或哺乳動物進行比較來量測反應之降低。對化學療法之典型獲得性抗性稱為「多重抗藥性」。多重抗藥性可能由P-糖蛋白介導，或者可能由其他機制介導，或者可能在哺乳動物感染多重抗藥性微生物或微生物組合時發生。對治療性治療之抗性的測定係所屬領域中常規的，且在普通臨床醫師之技能範圍內，例如，可藉由如本文中描述為「敏化」之細胞增殖分析及細胞死亡分析來量測。在一些實施例中，術語「逆轉抗藥性」意謂在與未治療腫瘤之腫瘤體積相比，單獨主要癌症療法(例如，化學治療或放射療法)不能產生統計學上顯著之腫瘤體積減少的情況下，與未治療腫瘤之腫瘤體積相比，第二種藥劑與主要癌症療法(例如，化學治療或放射療法)組合使用能夠在統計顯著性程度上產生顯著腫瘤體積減少(例如，p＜0.05)。此通常適用於在未治療腫瘤呈對數生長時進行之腫瘤體積量測。
用於偵測或測定至少一種生物標記物之不存在、存在或水準之術語「樣品」通常為腦組織、腦脊髓液、全血、血漿、血清、唾液、尿液、糞樣(stool) (例如糞便(feces))、淚液及任何其他體液(例如，如上文在「體液」之定義下所描述)，或組織樣品(例如，活體組織切片)，諸如小腸、結腸樣品或手術切除組織。在一些實施例中，本發明所涵蓋之方法進一步包括在偵測或測定樣品中之至少一種標記物之不存在、存在或水準之前自個體獲得樣品。
術語「敏化」意謂以允許用癌症療法(例如，抗免疫檢查點、化學治療及/或放射療法)更有效地治療相關癌症之方式改變癌細胞或腫瘤細胞。在一些實施例中，正常細胞不會被影響至導致正常細胞受到療法過度損傷之程度。根據所屬領域已知之用於下文所述之特定治療及方法的方法量測對治療性治療之敏感性的增加或敏感性的降低，包括但不限於細胞增殖分析(Tanigawa等人 (1982) Cancer Res.42:2159-2164)及細胞死亡分析(Weisenthal等人 (1984) Cancer Res.94:161-173；Weisenthal等人 (1985) Cancer Treat Rep.69:615-632；Weisenthal等人, Kaspers G J L, Pieters R, Twentyman P R, Weisenthal L M, Veerman A J P編輯, Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma. Langhorne, P A: Harwood Academic Publishers, 1993:415-432；Weisenthal (1994) Contrib. Gynecol. Obstet.19:82-90)。亦可藉由量測一段時間內腫瘤大小之減小來量測動物之敏感性或抗性，例如，人類為6個月，且小鼠為4-6週。若與組合物或方法不存在下之治療敏感性或抗性相比，治療敏感性增加或抗性降低5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或更多，諸如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更多，或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，則此類組合物或方法敏化對治療性治療之反應。對治療性治療之敏感性或抗性的測定係所屬領域中常規的，且在普通臨床醫師之技能範圍內。應當理解，本文所述之用於增強癌症療法功效之任何方法可同樣應用於使過度增生性或其他癌細胞(例如，抗性細胞)對癌症療法敏感之方法。
術語「小分子」為所屬領域之術語且包括分子量小於約1000或分子量小於約500之分子。在一實施例中，小分子不僅僅包含肽鍵。在另一實施例中，小分子並非寡聚物。可針對活性進行篩選之示例性小分子化合物包括但不限於肽、肽模擬物、核酸、碳水化合物、小有機分子(例如聚乙醯類) (Cane等人 (1998) Science282:63-68)及天然產物提取物文庫。在另一實施例中，化合物為小有機非肽化合物。在另一實施例中，小分子並非生物合成的。
術語「特異性結合」係指結合蛋白與預定抗原結合。通常，當藉由結合分析，諸如表面電漿子共振(SPR)技術，在BIAcore™分析儀器中使用所關注抗原作為分析物且結合蛋白作為配位體測定時，結合蛋白以約小於或等於約5×10 -4M、小於或等於約1×10 -4M、小於或等於約5×10 -5M、小於或等於約1×10 -5M、小於或等於約5×10 -6M、小於或等於約1×10 -6M、小於或等於約5×10 -7M、小於或等於約1×10 -7M、小於或等於約5×10 -8M、小於或等於約1×10 -8M、小於或等於約5×10 -9M、小於或等於約1×10 -9M、小於或等於約5×10 -10M、小於或等於約1×10 -10M、小於或等於約5×10 -11M、小於或等於約1×10 -11M、小於或等於約5×10 -12M、小於或等於約1×10 -12M或更低，或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如約1-50微莫耳、1-100微莫耳、0.1-500微莫耳及其類似值之親和力(K D)結合。在一些實施例中，結合蛋白以比其結合除預定抗原或密切相關之抗原以外之非特異性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的親和力大至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、6.0倍、7.0倍、8.0倍、9.0或10.0倍的親和力與預定抗原結合。片語「識別抗原之結合蛋白」及「對抗原具特異性之結合蛋白」在本文中可與術語「與抗原特異性結合之結合蛋白」互換使用。選擇性結合係一個相對術語，係指結合蛋白區分一種抗原與另一種抗原之結合，諸如特定家族成員或抗原標靶與相關家族成員或抗原標靶之結合的能力。舉例而言，實例部分中提供之分析資料表明，本文所述之結合蛋白特異性地結合HPV16 E7 11-19免疫原性抗原決定基及/或選擇性地結合許多相關抗原決定基(例如，HPV16 E7 11-19免疫原性抗原決定基及密切相關之序列)，從而區分此類標靶與人類基因組中可用之眾多其他可能之抗原決定基。
術語「個體」係指任何健康動物、哺乳動物或人類，或任何罹患以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之動物、哺乳動物或人類。術語「個體」可與「患者」互換。
術語「存活」包括以下所有內容：存活至死亡，亦稱為總存活期(其中死亡可能不考慮原因或與腫瘤相關)；「無復發存活期」(其中術語復發應包括局部復發及遠處復發)；無轉移存活期；無病存活期(其中術語疾病應包括癌症及與之相關之疾病)。該存活之長度可藉由參考定義之起點(例如診斷時間或治療開始時間)及終點(例如死亡、復發或轉移)來計算。此外，治療功效之標準可擴大到包括對化學療法之反應、存活概率、給定時段內之轉移概率及腫瘤復發概率。
術語「協同作用」係指兩種或更多種藥劑(例如，本文所述之HPV16 E7 11-19相關藥劑及用於治療以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症之另一種療法)之組合作用大於單獨癌症藥劑/療法之單獨作用的總和。
如本文所用，術語「T細胞介導之反應」係指由T細胞介導之反應，包括效應T細胞(例如CD8 +細胞)及輔助T細胞(例如CD4 +細胞)。T細胞介導之反應包括例如T細胞細胞毒性及增殖。
「經轉錄之多核苷酸」或「核苷酸轉錄本」係與成熟mRNA之全部或一部分互補或同源之多核苷酸(例如，mRNA、hnRNA、cDNA或此類RNA或cDNA之類似物)，該成熟mRNA藉由生物標記物核酸之轉錄及(若存在) RNA轉錄本之正常轉錄後加工(例如剪接)以及RNA轉錄本之逆轉錄製成。
「T細胞」係一種免疫系統細胞，其在胸腺中成熟且產生T細胞受體(TCR)。T細胞可為初始T細胞(未暴露於抗原；與T CM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD 127及CD45RA表現增加，且CD45RO表現減少)、記憶T細胞( TM) (經歷過抗原及壽命長)及效應細胞(經歷過抗原、細胞毒性)。T M可進一步分為中央記憶T細胞(T CM，與初始T細胞相比，CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO及CD95表現增加，且CD54RA表現減少)及效應記憶T細胞(T EM，與初始T細胞或T CM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD45RA表現減少，且CD127表現增加)子集。效應T細胞(T E)係指經歷過抗原之CD8+細胞毒性T淋巴球，與T CM相比，CD62L、CCR7、CD28之表現減少，且對顆粒酶及穿孔蛋白呈陽性。其他示例性T細胞包括調控性T細胞，諸如CD4 +CD25 +(Foxp3 +)調控性T細胞及Treg17細胞，以及Tr1、Th3、CD8 +CD28及Qa-1限制性T細胞。
習知T細胞(亦稱為Tconv或Teff)具有效應功能(例如，分泌細胞介素、細胞毒性活性、抗自我識別及其類似功能)以藉助於其對一或多種T細胞受體之表現來增加免疫反應。Tcon或Teff一般定義為任何非Treg之T細胞群體且包括例如初始T細胞、活化T細胞、記憶T細胞、靜息Tcon或已分化為例如Th1或Th2譜系之Tcon。在一些實施例中，Teff為非Treg T細胞之子集。在一些實施例中，Teff為CD4+ Teff或CD8+ Teff，諸如CD4+輔助T淋巴球(例如，Th0、Th1、Tfh或Th17)及CD8+細胞毒性T淋巴球。如本文進一步所述，細胞毒性T細胞為CD8+ T淋巴球。「初始Tcon」為已在骨髓中分化且在胸腺中成功進行正向及負向中央選擇過程，但尚未藉由暴露於抗原而活化的CD4 +T細胞。初始Tcon之特徵通常在於L-選擇素(CD62L)之表面表現、活化標記物(諸如CD25、CD44或CD69)之缺乏以及記憶標記物(諸如CD45RO)之缺乏。因此，咸信初始Tcon為靜止且非分裂的，需要介白素7 (IL-7)及介白素15 (IL-15)進行體內恆定存活(至少參見WO 2010/101870)。在抑制免疫反應之背景下，此類細胞之存在及活性為非所需的。與Treg不同，Tcon並非無反應性的且可回應於基於抗原之T細胞受體活化而增生(Lechler等人 (2001) Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci.356:625-637)。
「T效應」(「T eff」或「T E」)細胞係指具有細胞溶解活性之T細胞(例如CD4+及CD8+ T細胞)，以及分泌細胞介素且活化及指導其他免疫細胞之T輔助(Th)細胞，但不包括調控性T細胞(Treg細胞)。
「T細胞受體」或「TCR」係指能夠結合(例如，特異性及/或選擇性)與MHC受體結合之抗原肽的免疫球蛋白超家族成員(具有可變結合域、恆定域、跨膜區及短細胞質尾；參見例如Janeway等人 (1997 ) Curr. Biol. Publ.4:33)。TCR可在細胞表面發現或以可溶形式存在，且通常由具有α及β鏈(亦分別稱為TCRα及TCRβ)或γ及δ鏈(亦分別稱為TCRγ及TCRδ)之異二聚體構成。與免疫球蛋白(例如抗體)一樣，TCR鏈之胞外部分(例如α鏈及β鏈)含有兩個免疫球蛋白域：N端之可變域(例如α鏈可變域或V α及β鏈可變域或V β；通常為基於Kabat編號之胺基酸1至116 (Kabat等人 (1991)「Sequences of Proteins of lmmunological Interest, US Dept .Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 第5版)，及在C端且與細胞膜相鄰之一個恆定域(例如，α鏈恆定域或C α，通常為基於Kabat之胺基酸117至259；β鏈恆定域或C β，通常為基於Kabat之胺基酸117至295)。亦與免疫球蛋白一樣，可變域含有由構架區(「FR」)分隔之互補決定區(「CDR」，亦稱為高變區或「HVR」) (參見例如Fores等人 (1990) Proc. Natl. Acad Sci. US.A.87:9138；Chothia等人 (1988) EMBO J.7:3745；Lefranc等人 (2003) Dev. Comp. Immunol.27:55)。在一些實施例中，在T細胞(或T淋巴細胞)之表面上發現TCR，且與CD3複合物締合。本發明涵蓋之TCR之來源可來自各種動物物種，諸如人類、小鼠、大鼠、兔或其他哺乳動物。
術語「T細胞受體」或「TCR」應理解為涵蓋完整TCR以及其抗原結合部分或抗原結合片段。在一些實施例中，TCR為完整或全長TCR，包括呈αβ形式或γδ形式之TCR。在一些實施例中，TCR為小於全長TCR但與MHC分子中結合之特定肽結合，諸如與MHC-肽複合物結合之抗原結合部分。在一些情況下，TCR之抗原結合部分或片段可僅含有全長或完整TCR之部分域，但仍能夠結合完整TCR所結合之肽抗原決定基，諸如MHC-肽複合物。在一些情況下，抗原結合部分含有TCR之可變域，諸如TCR之可變α鏈及可變β鏈，該等可變域足以形成與特定MHC-肽複合物結合之結合位點。一般而言，TCR之可變鏈含有參與肽、MHC及/或MHC-肽複合物之識別的互補決定區(CDR)。
國際免疫遺傳學資訊系統(IMGT)建立命名法(亦參見Scaviner及Lefranc (2000) Exp. Clin. Immunogenet.17:83-96及97-106；Folch及Lefranc (2000) Exp. Clin. Immunogenet,17:107-114；T Cell Receptor Factsbook」, (2001) LeFranc及LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8)。IMGT提供用於描述TCR之獨特序列，且本文所述之序列可藉由參考本文提供之此類獨特序列來鑑定。TCR序列可在imgt.org之IMGT資料庫中公開獲得。
如上所述，天然α/β異二聚體TCR具有α鏈及β鏈。廣義上，各條鏈包含可變區、接合區及恆定區，且β鏈通常在可變區與接合區之間亦含有短的多樣性區，但此多樣性區通常被認為係接合區之一部分。各可變區包含嵌入構架序列中之三個高變CDR (互補決定區)。熟知CDR3為抗原識別之主要介體。存在若干種類型之α鏈可變(Vα)區及若干種類型之β鏈可變(Vβ)區，其藉由其構架、CDR1及CDR2序列以及部分定義之CDR3序列來區分。Vα類型在IMGT命名法中由獨特TRAV編號表示。例如，「TRAV4」定義一種TCR Vα區，其具有獨特構架及CDR1及CDR2序列，以及由在TCR之間保守之胺基酸序列部分定義但亦包括在TCR之間發生變化之胺基酸序列的CDR3序列。類似地，「TRBV2」定義一種TCR Vβ區，其具有獨特構架及CDR1及CDR2序列，但僅具有部分定義之CDR3序列。已知在α及β基因座內分別存在54個α可變基因，其中44個為功能性的，及67個β可變基因，其中42個為功能性的。
類似地，TCR之接合區由獨特IMGT TRAJ及TRBJ命名法定義，且恆定區由IMGT TRAC及TRBC命名法定義。β鏈多樣性區在IMGT命名法中簡稱為TRBD，且如前所述，串聯之TRBD/TRBJ區通常被一起視為接合區。
編碼TCR α及β鏈之基因池位於不同染色體上，且含有獨立之V、(D)、J及C基因區段，此等基因區段在T細胞發育過程中藉由重排而聚集在一起。由於54個TCR α可變基因與61個α J基因之間或67個β可變基因、兩個β D基因及13個β J基因之間發生大量可能重組事件，所以此引起T細胞α及β鏈極高多樣性。重組過程並不精確，且在CDR3區內引入進一步多樣性。各α及β可變基因亦可包含對偶基因變異體，在IMGT命名法中分別指定為TRAVxx*01及*02，或TRBVx-x*01及*02，從而進一步增加變異量。同樣，一些TRBJ序列具有兩種已知之變異。(請注意，缺乏「*」限定符意謂相關序列只有一個對偶基因已知)。由重組及胸腺選擇產生之人類TCR之天然譜系估計包含大約10 6個獨特β鏈序列，由CDR3多樣性確定(Arstila等人 (1999) Science286:958-961)，且甚至可能更高(Robins等人 (2009) Blood114:4099-4107)。估計各β鏈與至少25條不同α鏈配對，從而產生進一步多樣性(Arstila等人 (1999) Science 286:958-961)。
因此，術語「TCR α可變域」係指TRAV區及TRAJ區之串聯；僅TRAV區；或TRAV及部分TRAJ區，且術語TCR α恆定域係指胞外TRAC區，或C端截短或全長TRAC序列。同樣，術語「TCR β可變域」係指TRBV區及TRBD/TRBJ區之串聯；僅TRBV區及TRBD區；僅TRBV區及TRBJ區；或TRBV區及部分TRBD區及/或TRBJ區，且術語TCR β恆定域係指胞外TRBC區，或C端截短或全長TRBC序列。此等TCR α可變域及TCR β可變域命名法分別類似地適用於γ/δ TCR之TCR γ及TCR δ鏈之可變域。普通技術人員可例如藉由可公開獲得之IMGT資料庫獲得TRAV、TRAJ、TRAC、TRBV、TRBJ及TRBC基因序列。
術語「TCR複合物」係指CD3與TCR締合形成之複合物。例如，TCR複合物可由CD3γ鏈、CD3δ鏈、兩條CD3ε鏈、CD3ζ鏈之同源二聚體、TCRα鏈及TCRβ鏈組成。或者，TCR複合物可由CD3γ鏈、CD3δ鏈、兩條CD3ε鏈、CD3ζ鏈之同源二聚體、TCRγ鏈及TCRδ鏈組成。
術語「治療作用」係指藥理學活性物質在動物，尤其是哺乳動物，且更尤其在人類中引起之局部或全身作用。因此，該術語意謂意欲用於診斷、治癒、緩解、治療或預防動物或人類之疾病或用於增強其所需身體或精神發育及狀況之任何物質。
術語「治療有效量」及「有效量」意謂一種物質以適於任何治療之合理效益/風險比在動物中之至少一個細胞亞群中產生一些所需作用，諸如所需局部或全身治療作用的量。在一些實施例中，物質之治療有效量將視該物質之治療指數、溶解度、藥物動力學、半衰期及其類似因素而定。可在細胞培養物或實驗動物中藉由例如用於測定LD 50及ED 50之標準醫藥學程序來測定主題化合物之毒性及治療功效。在一些實施例中，使用展現大治療指數之組合物。在一些實施例中，可量測LD 50(致死劑量)，且相對於不投與藥劑，其在投與藥劑時可例如降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更多。類似地，可量測ED 50(亦即，達成症狀之半最大抑制之濃度)，且相對於不投與藥劑，其在投與藥劑時可例如增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或或更多。類似地，亦可量測IC 50，且相對於不投與藥劑，其在投與藥劑時可例如增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或更多。在一些實施例中，在一種分析中，T細胞免疫反應可增加至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至100%。在另一實施例中，可實現病毒負荷量降低至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至100%。
術語「治療」係指所關注之疾患(例如，疾病或病症)的治療性管理或改善。治療可包括但不限於向個體投與藥劑或組合物(例如醫藥組合物)。通常進行治療以努力以對個體有益之方式改變疾病之進程(該術語用於指示任何疾病、病症、症候群或需要或可能需要療法之不良狀況)。治療效果可包括逆轉、減輕疾病或疾病之一或多種症狀或表現、降低其嚴重性、延遲其發作、治癒其、抑制其進展及/或降低其發生或複發之可能性。理想之治療效果包括但不限於預防疾病發生或複發、減輕症狀、減少疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或緩解疾病狀態及緩解或改善預後。治療劑可投與至患有疾病或相對於一般人群成員具有增加之疾病發展風險之個體。在一些實施例中，可將治療劑投與至患有疾病但不再顯示疾病證據之個體。可投與藥劑，例如以降低明顯疾病復發之可能性。可預防性地投與治療劑，亦即，在疾病之任何症狀或表現出現之前投與。「預防性治療」係指為尚未患疾病或未顯示疾病證據之個體提供醫療及/或手術治療，以例如降低疾病發生之可能性或降低疾病發生時之嚴重程度。個體可能已被鑑定為處於顯現疾病之風險中(例如，相對於普通人群具有增加之風險或具有增加顯現疾病可能性之風險因素。
術語「無反應性」包括癌細胞對療法之折射性，或治療性細胞，諸如免疫細胞對刺激，例如經由活化受體或細胞介素之刺激的折射性。可能會出現無反應性，例如由於暴露於免疫抑制劑或暴露於高劑量之抗原。如本文所用，術語「無能」或「耐受性」包括對活化受體介導之刺激的折射性。此折射性通常為抗原特異性的，且在停止暴露於耐受性抗原後仍然存在。舉例而言，T細胞無能(與無反應性相對)之特徵在於缺乏例如IL-2之細胞介素之產生。當T細胞暴露於抗原且在無第二信號(共刺激信號)之情況下接收第一信號(T細胞受體或CD-3介導之信號)時，會出現T細胞無能。在此等條件下，細胞再暴露於相同抗原(即使再暴露在共刺激多肽之存在下發生)導致不能產生細胞介素，因此不能增殖。然而，若與細胞介素(例如，IL-2)一起培養，無能T細胞可能會增殖。例如，藉由用ELISA或使用指示細胞株之增殖分析法量測到T淋巴球不產生IL-2，亦可觀測到T細胞無能。或者，可使用報導基因構築體。例如，無能T細胞無法啟動由5' IL-2基因增強子控制下之異源啟動子或增強子內可能發現之AP1序列多聚體誘導的IL-2基因轉錄(Kang等人 (1992) Science257:1134)。
術語「可變區」或「可變域」係指與免疫球蛋白超家族結合蛋白(例如，TCR)與抗原之結合有關的免疫球蛋白超家族結合蛋白之域(例如，TCR α鏈或β鏈(或對於γδ TCR為γ鏈及δ鏈))。天然TCR之α鏈及β鏈(分別為V α及V β)之可變域通常具有相似之結構，各域均包含四個保守構架區(FR)及三個CDR。V α域由兩個獨立之DNA區段，亦即可變基因區段及接合基因區段(V-J)編碼；V β域由三個獨立之DNA區段，亦即可變基因區段、多樣性基因區段及接合基因區段(V-D-J)編碼。單個V α或V β域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，可使用V α或V β域自結合抗原之TCR中分離出結合特定抗原之TCR，以分別篩選互補V α或V β域之文庫。
術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸之核酸分子。在一些實施例中，載體為游離基因組，亦即能夠進行染色體外複製之核酸。在一些實施例中，載體為能夠自主複製及/或表現與其連接之核酸之彼等載體。能夠引導可操作性連接之基因之表現的載體在本文中稱為「表現載體」。一般而言，在重組DNA技術中使用之表現載體通常呈「質體」形式，質體一般係指環狀雙股DNA環，其載體形式不與染色體結合。在本說明書中，「質體」及「載體」可互換使用，因為質體為最常用之載體形式。然而，如所屬領域之技術人員將瞭解，本發明意欲包括提供等效功能且隨後在所屬領域中為人所知的此類其他形式之表現載體。
特定蛋白質之胺基酸序列與可編碼該蛋白質之核苷酸序列之間存在已知且確定之對應關係，如由遺傳密碼所定義(如下所示)。同樣，特定核酸之核苷酸序列與由彼核酸編碼之胺基酸序列之間存在已知且確定之對應關係，如由遺傳密碼所定義。 遺傳密碼 丙胺酸(Ala、A)              GCA、GCC、GCG、GCT 精胺酸(Arg、R)             AGA、ACG、CGA、CGC、CGG、CGT 天冬醯胺(Asn、N)         AAC、AAT 天冬胺酸(Asp、D)         GAC、GAT 半胱胺酸(Cys、C)          TGC、TGT 麩胺酸(Glu、E)              GAA、GAG 麩醯胺(Gln、Q)             CAA、CAG 甘胺酸(Gly、G)             GGA、GGC、GGG、GGT 組胺酸(His、H)              CAC、CAT 異白胺酸(Ile、I)             ATA、ATC、ATT 白胺酸(Leu、L)              CTA、CTC、CTG、CTT、TTA、TTG 離胺酸(Lys、K)              AAA、AAG 甲硫胺酸(Met、M)         ATG 苯丙胺酸(Phe、F )TTC、TTT 脯胺酸(Pro、P)              CCA、CCC、CCG、CCT 絲胺酸(Ser、S)               AGC、AGT、TCA、TCC、TCG、TCT 蘇胺酸(Thr、T)              ACA、ACC、ACG、ACT 色胺酸(Trp、W)             TGG 酪胺酸(Tyr、Y)              TAC、TAT 纈胺酸(Val、V)              GTA、GTC、GTG、GTT 終止信號(末端)              TAA、TAG、TGA
遺傳密碼之一個重要且熟知之特徵為其冗餘性，由此，對於用於製備蛋白質之大多數胺基酸而言，可採用多於一個編碼核苷酸三聯體(如上文所說明)。因此，許多不同核苷酸序列可編碼既定胺基酸序列。此類核苷酸序列被視為在功能上等效，因為其在所有生物體中產生相同胺基酸序列(儘管某些生物體可能比其他生物體更有效地轉譯一些序列)。此外，有時可在既定核苷酸序列中發現嘌呤或嘧啶之甲基化變異體。此類甲基化不影響三核苷酸密碼子與對應胺基酸之間的編碼關係。
鑑於前述，可使用編碼生物標記物核酸(或其任何部分)之DNA或RNA之核苷酸序列，使用遺傳密碼將DNA或RNA轉譯成胺基酸序列來衍生多肽胺基酸序列。同樣，對於多肽胺基酸序列，可自遺傳密碼推斷出可編碼該多肽之對應核苷酸序列(由於其冗餘性，其將產生用於任何既定胺基酸序列之多個核酸序列)。因此，本文中對編碼多肽之核苷酸序列之描述及/或揭示應被視為亦包括對由該核苷酸序列編碼之胺基酸序列之描述及/或揭示。類似地，本文中對多肽胺基酸序列之描述及/或揭示應被視為亦包括對可編碼該胺基酸序列之所有可能核苷酸序列之描述及/或揭示。 II. 結合蛋白
在本發明涵蓋之一個態樣中，本文提供結合蛋白，其結合(例如特異性及/或選擇性)包含在MHC分子(例如MHC I類分子)背景中之HPV16 E7 11-19免疫原性肽的肽-MHC (pMHC)複合物。在一些實施例中，結合蛋白能夠與HPV16 E7 11-19肽-MHC (pMHC)複合物結合(例如，特異性及/或選擇性地)，K d小於或等於約5×10 -4M、小於或等於約1×10 -4M、小於或等於約5×10 -5M、小於或等於約1×10 -5M、小於或等於約5×10 -6M、小於或等於約1×10 -6M、小於或等於約5×10 -7M、小於或等於約1×10 -7M、小於或等於約5×10 -8M、小於或等於約1×10 -8M、小於或等於約5×10 -9M、小於或等於約1×10 -9M、小於或等於約5×10 -10M、小於或等於約1×10 -10M、小於或等於約5×10 -11M、小於或等於約1×10 -11M、小於或等於約5×10 -12M、小於或等於約1×10 -12M，或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如約1-50微莫耳、1-100微莫耳、0.1-500微莫耳及其類似範圍之間。在一些實施例中，MHC分子包含MHC α鏈，該鏈為HLA血清型HLA-A*02。在一些實施例中，HLA對偶基因係選自由以下組成之群：HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205、HLA-A*0206及HLA-A*0207對偶基因。在一特定實施例中，HLA對偶基因為HLA-A*0201。在一些實施例中，本文提供之結合蛋白經基因工程改造、分離及/或純化。
在一些實施例中，結合蛋白對HPV16 E7 11-19肽-MHC (pMHC)之結合親和力比已知之T細胞受體(例如，本文所述之Kite TCR)高。舉例而言，結合蛋白對HPV16 E7 11-19肽-MHC (pMHC)之結合親和力比已知之T細胞受體(例如，本文所述之Kite TCR)可高至少1.2倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1000倍、5000倍、10000倍、50000倍、100000倍、500000倍、1000000倍或更多，或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如1.2倍至2倍。
在一些實施例中，當與以某一水準或更低水準表現HPV16 E7 11-19之標靶細胞接觸時，與已知之T細胞受體(例如，本文所述之Kite TCR)相比，結合蛋白誘導更高T細胞擴增、細胞介素釋放及/或細胞毒性殺傷。舉例而言，在本文所述之任何態樣之一些實施例中，HPV16 E7 11-19水準可根據每百萬之轉錄本表示，且可例如小於或等於約1,000個轉錄本/百萬轉錄本(TPM)、950 TPM、900 TPM、850 TPM、800 TPM、750 TPM、700 TPM、650 TPM、600 TPM、550 TPM、500 TPM、450 TPM、400 TPM、350 TPM、300 TPM、250 TPM、200 TPM、150 TPM、100 TPM、95 TPM、90 TPM、85 TPM、80 TPM、75 TPM、70 TPM、65 TPM、60 TPM、55 TPM、50 TPM、45 TPM、40 TPM、35 TPM、34 TPM、33 TPM、32 TPM、31 TPM、30 TPM、29 TPM、28 TPM、27 TPM、26 TPM、25 TPM、24 TPM、23 TPM、22 TPM、21 TPM、20 TPM、19 TPM、18 TPM、17 TPM、16 TPM、15 TPM、14 TPM、13 TPM、12 TPM、11 TPM、10 TPM、9 TPM、8 TPM、7 TPM、6 TPM、5 TPM、4 TPM、3 TPM、2 TPM及1 TPM，或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如小於或等於約1,000 TPM至小於或等於約35 TPM)。在一些實施例中，低HPV16 E7 11-19表現水準稱為「雜合表現」，意謂介於約1 TPM與約35 TPM之間，或之間的任何範圍，包括端點，諸如32 TPM或1-32 TPM。較高表現為36 TPM劑更高。如本文進一步描述，TPM係根據熟知之技術量測，諸如RNA-Seq，且多種細胞株、組織類型及其類似物之基因表現TPM資料為所屬領域中熟知(參見例如全球資訊網上portals.broadinstitute.org之布羅德研究院癌細胞株百科全書(Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE))。在一些實施例中，當與表現HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之標靶細胞接觸時，與已知之T細胞受體(例如本文所述之Kite TCR)相比，結合蛋白誘導T細胞擴增、細胞介素釋放及/或細胞毒性殺傷增加至少1.2倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1000倍或更多倍，或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如1.2倍至2倍。
在一些實施例中，HPV16 E7 11-19之表現使用RNA定序(RNA-seq)來偵測。RNA-seq一般包括以下步驟：獲得含有遺傳物質之樣品，自獲得之樣品分離總RNA，自總RNA製備擴增之cDNA文庫，對擴增之cDNA文庫進行定序，且對擴增之cDNA進行分析及剖析以評估不同轉錄本之表現水準。樣品可為細胞群體、組織樣品、生檢樣品、細胞培養物或單細胞。可使用所屬領域已知之任何方法自生物樣品分離總RNA。在某些實施例中，總RNA係自血漿中提取的。血漿RNA提取描述於Enders等人, 「The Concentration of Circulating Corticotropin-Releasing Homer mRNA in Material Plasma Is Inclined in Preclampsia」, Clinr中。如其中所述，在離心步驟之後收集之血漿與Trizol LS試劑(Invitrogen)及氯仿混合。將混合物離心且將水層轉移至新管中。向此水層中添加乙醇。接著將混合物置於RNeasy微型管柱(Qiagen)中且根據製造商之建議進行加工。
在一些實施例中，本文所述之RNA-seq包括自總RNA製備擴增之cDNA之步驟。例如，製備cDNA且在不稀釋之情況下隨機擴增經分離之RNA樣品，或者將經分離之RNA中之遺傳物質混合物分散至個別反應樣品中。在某些實施例中，擴增在3'末端隨機開始且貫穿樣品中之整個轉錄組以擴增mRNA及未聚腺苷酸化之轉錄本。藉由此種方式，對雙股cDNA擴增產物進行最佳化，以產生用於下一代定序平台之定序文庫。適用於藉由本發明所涵蓋之方法擴增cDNA之套組包括例如Ovation® RNA-Seq系統。
在一些實施例中，本文所述之RNA-seq包括對擴增之cDNA進行定序之步驟。任何已知之定序方法均可用於對擴增之cDNA混合物進行定序，包括單分子定序方法。在某些實施例中，藉由全轉錄組鳥槍法定序對擴增之cDNA進行定序。全轉錄組鳥槍法定序可使用各種下一代定序平台進行，諸如Illumina®基因組分析平台、ABI SOLiD™定序平台或Life Science之454定序平台。
在一些實施例中，本文所述之RNA-seq進一步包括對cDNA進行數位計數及分析。擴增樣品中各轉錄本之擴增序列數量可藉由序列讀取(每一擴增股讀取一次)來量化。在一些實施例中，每百萬之轉錄本(TPM)用於量化特定轉錄本之表現水準。TPM可按照Wagner等人 (2012) Theory in Biosciences131:281-285中所示來計算，其內容藉以引用之方式整體併入本文中。
在一些實施例中，結合蛋白不與肽-MHC (pMHC)複合物結合，視情況其中該肽來源於SPTA1、MPL、HERC1、CPAMD8、INTS4、NUTM1或XM_00172256。
在一些實施例中，結合蛋白不與SPTA1-、MPL-、HERC1-、CPAMD8-、INTS4-、NUTM1-及/或XM_00172256-肽-MHC (pMHC)複合物結合。
在一些實施例中，本文提供之結合蛋白包括以下(例如，包含以下、基本上由以下組成或由以下組成)：a)與選自由表1中所列之TCR α序列組成之群的TCR α鏈序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致性的TCR α鏈序列；及/或b)與選自由表1中所列之TCR β鏈序列組成之群的TCR β鏈序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致性的TCR β鏈序列。
在一些實施例中，本文提供之結合蛋白包括以下(例如，包含以下、基本上由以下組成或由以下組成)：a)選自由表1中所列之TCR α鏈序列組成之群的TCR α鏈序列；及/或b)選自由表1中所列之TCR β鏈序列組成之群的TCR β鏈序列。
在一些實施例中，本文提供之結合蛋白包括以下(例如，包含以下、基本上由以下組成或由以下組成)：a)與選自由表1中所列之TCR V α域序列組成之群的TCR α鏈可變(V α)域序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致性的TCR α鏈可變(V α)域序列；及/或b)與選自由表1中所列之TCR V β域序列組成之群的TCR β鏈可變(V β)域序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致性的TCR β鏈可變(V β)域序列。
在一些實施例中，本文提供之結合蛋白包括以下(例如，包含以下、基本上由以下組成或由以下組成)：a)選自由表1中所列之TCR V α域序列組成之群的TCR α鏈可變(V α)域序列；及/或b)選自由表1中所列之TCR V β域序列組成之群的TCR β鏈可變(V β)域序列。
在一些實施例中，本文提供之結合蛋白包括(例如，包含至少一種(例如，一種、兩種或三種，諸如單獨CDR3或與CDR1及CDR2組合)、基本上由其組成或由其組成)與選自由表1中所列之TCR α鏈CDR序列組成之群的TCR α鏈CDR序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致性的TCR α鏈互補決定區(CDR)序列。咸信CDR3為負責識別經加工之抗原的主要CDR，且CDR1及CDR2主要與MHC相互作用，因此，在一些實施例中，提供包含單獨的來自表1中所列之TCR α鏈之CDR3及/或單獨的來自表1中所列之TCR β鏈之CDR3的結合蛋白，各CDR3具有如本段所述之序列同源性。
在一些實施例中，本文提供之結合蛋白亦可包括(例如，包含至少一種(例如，一種、兩種或三種，諸如單獨CDR3或與CDR1及CDR2組合)、基本上由其組成或由其組成)與選自由表1中所列之TCR β鏈CDR序列組成之群的TCR β鏈CDR序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致性的TCR β鏈互補決定區(CDR)序列。如上文所述，咸信CDR3為負責識別經加工之抗原的主要CDR，且CDR1及CDR2主要與MHC相互作用，因此，在一些實施例中，提供包含單獨的來自表1中所列之TCR β鏈之CDR3及/或單獨的來自表1中所列之TCR α鏈之CDR3的結合蛋白，各CDR3具有如本段所述之序列同源性。
在一些實施例中，本文提供之結合蛋白包括(例如，包含至少一種(例如，一種、兩種或三種)、基本上由其組成或由其組成)表1中所列之TCR α鏈互補決定區(CDR)。
在一些實施例中，本文提供之結合蛋白亦可包括(例如，包含至少一種(例如，一種、兩種或三種)、基本上由其組成或由其組成)表1中所列之TCR β鏈互補決定區(CDR)。
在一些實施例中，本文提供之結合蛋白包括以下(例如，包含以下、基本上由以下組成或由以下組成)：與表1中所列之TCR Cα序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致性的TCR α鏈恆定區(C α)序列。
在一些實施例中，本文提供之結合蛋白亦可包括以下(例如，包含以下、基本上由以下組成或由以下組成)：與表1中所列之TCR C β序列具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致性的TCR β鏈恆定區(C β)序列。
在一些實施例中，本文提供之結合蛋白包括以下(例如，包含以下、基本上由以下組成或由以下組成)：選自由表1中所列之TCR C α序列組成之群的TCR α鏈恆定區(C α)序列。
在一些實施例中，本文提供之結合蛋白亦可包括以下(例如，包含以下、基本上由以下組成或由以下組成)：選自由表1中所列之TCR C β序列組成之群的TCR β鏈恆定區(C β)序列。
在一些實施例中，本文所提供之結合蛋白包含嵌合、人類化、人類、靈長類動物或嚙齒類動物(例如，大鼠或小鼠)恆定區。舉例而言，人類可變區可與鼠科動物恆定區嵌合，或鼠科動物可變區可用人類恆定區及/或人類構架區人類化。在一些實施例中，可使恆定區突變以修飾功能性(例如，在TCR α及β鏈中之相對殘基位置中引入非天然存在之半胱胺酸取代以提供可用於增加TCR α與β鏈之間的親和力的二硫鍵)。類似地，可在恆定區之跨膜域中進行突變以修飾功能性(例如，藉由用疏水性胺基酸引入非天然存在之殘基取代來增加疏水性)。在一些實施例中，可對恆定區進行突變以增加細胞表面表現。 表 1 E7-11-28 WT序列(與「E7-11-28 MGTM」相同之CDR) α鏈： TRAV25/TRAJ37/TRAC α鏈DNA序列 ATGCTGCTGATCACCTCCATGCTGGTGCTGTGGATGCAGCTGAGCCAAGTGAACGGCCAGCAAGTGATGCAGATCCCTCAGTACCAGCACGTGCAAGAAGGCGAGGACTTCACCACCTACTGCAACAGCAGC ACCACACTGAGCAAC ATCCAGTGGTACAAGCAGCGGCCTGGCGGACACCCTGTGTTTCTGATCCAG CTGGTCAAGTCCGGCGAAGTG AAGAAGCAGAAGCGGCTGACCTTCCAGTTCGGCGAGGCCAAGAAGAACAGCAGCCTGCACATCACCGCCACACAGACCACAGATGTGGGCACCTACTTC TGCGCTGGCATCGGTAGCAGCAACACCGGTAAGCTCATCTTT GGGCAAGGGACAACTTTACAAGTAAAACCAGatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc α鏈蛋白質序列 MLLITSMLVLWMQLSQVNGQQVMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSS TTLSN IQWYKQRPGGHPVFLIQ LVKSGEV KKQKRLTFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYF CAGIGSSNTGKLIF GQGTTLQVKPDiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss β鏈： TRBV2/TRBJ2-7/TRBC1 β鏈DNA序列 ATGGATACCTGGCTCGTGTGTTGGGCCATCTTTAGCCTGCTGAAGGCCGGACTGACCGAGCCTGAAGTGACCCAGACTCCAAGCCATCAAGTGACTCAGATGGGGCAAGAAGTCATTCTGCGTTGCGTGCCCATC AGCAACCACCTGTAC TTTTATTGGTATCGCCAGATCCTGGGCCAGAAAGTGGAATTCCTGGTGTCC TTCTACAACAATGAGATC TCCGAGAAGTCCGAGATCTTCGACGACCAGTTCTCCGTGGAAAGACCCGACGGCAGCAACTTCACACTGAAGATCCGGTCTACCAAACTTGAGGACTCCGCTATGTATTTT TGTGCAATCACAGGTCGCGTTTCATATGAGCAATATTTC GGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggctttacctcggtgtcctaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcctgctagggaaggccaccctgtatgctgtgctggtcagcgcccttgtgttgatggccatggtcaagagaaaggatttc β鏈蛋白質序列 MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQTPSHQVTQMGQEVILRCVPI SNHLY FYWYRQILGQKVEFLVS FYNNEI SEKSEIFDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLEDSAMYF CAITGRVSYEQYF GPGTRLTVTEdlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsvsyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf E7-11-176野生型序列 α鏈： TRAV29DV5/TRAJ41/TRAC α鏈DNA序列 Atggccatgctgctgggagccagcgtgctgattctttggctccagcctgactgggtcaacagccagcagaagaacgacgatcagcaagtgaagcagaacagccccagcctgagcgtgcaagaaggcagaatctccatcctgaactgcgactacacc aactctatgttcgactac ttcctgtggtacaagaagtaccccgccgagggacccacctttctgatcagc atcagctccatcaaggacaag aacgaggacggccggttcaccgtgtttctgaacaagagcgccaagcacctgagcctgcacatcgtgccttctcagcctggggattccgccgtgtatttc tgcGCCGCAAAAAATTCAAATTCAGGTTATGCCCTCAACTTT GGCAAAGGCACCTCGCTGTTGGTCACACCCCatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc α鏈蛋白質序列 MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYT NSMFDY FLWYKKYPAEGPTFLIS ISSIKDK NEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYF CAAKNSNSGYALNF GKGTSLLVTPHiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss β鏈： TRBV24-1/TRBJ2-6/TRBC1 β鏈DNA序列 ATGGCCAGCCTGCTGTTCTTCTGCGGCGCCTTTTATCTGCTCGGCACCGGCTCTATGGACGCCGACGTTACACAGACCCCTCGGAACAGAATCACCAAGACCGGCAAGCGGATCATGCTGGAATGCAGCCAGACC AAGGGCCACGACCGG ATGTACTGGTACAGACAGGATCCAGGACTGGGCCTGCAGCTGATCTACTAC AGCTTCGACGTGAAGGAC ATCAACAAGGGCGAGATCAGCGACGGCTACAGCGTGTCAAGACAGGCCCAGGCCAAGTTCAGCCTGAGCCTGGAAAGCGCTATCCCCAACCAGACTGCCCTGTACTTC TGCGCCACTTCCGATCGCTCCTCCGGCGCCAACGTTCTTACCTTT GGGGCCGGCAGCAGGCTGACCGTGCTGGaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggctttacctcggtgtcctaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcctgctagggaaggccaccctgtatgctgtgctggtcagcgcccttgtgttgatggccatggtcaagagaaaggatttc β鏈蛋白質序列 MASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQT KGHDR MYWYRQDPGLGLQLIYY SFDVKD INKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTALYF CATSDRSSGANVLTF GAGSRLTVLEdlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsvsyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf E7-11-194野生型序列 α鏈： TRAV25/TRAJ37/TRAC α鏈DNA序列 Atgctgctgatcacctccatgctggtgctgtggatgcagctgagccaagtgaacggccagcaagtgatgcagatccctcagtaccagcacgtgcaagaaggcgaggacttcaccacctactgcaacagcagc accacactgagcaac atccagtggtacaagcagcggcctggcggacaccctgtgtttctgatccag ctggtcaagtccggcgaagtg aagaagcagaagcggctgaccttccagttcggcgaggccaagaagaacagcagcctgcacatcaccgccacacagaccacagatgtgggcacctacttc TGCGCTGGGCTCGGTTCCTCTAATACTGGTAAACTGATTTTT GGGCAAGGGACAACTTTACAAGTAAAACCAGatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc α鏈蛋白質序列 MLLITSMLVLWMQLSQVNGQQVMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSS TTLSN IQWYKQRPGGHPVFLIQ LVKSGEV KKQKRLTFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYF CAGLGSSNTGKLIF GQGTTLQVKPDiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss β鏈： TRBV2/ TRBJ2-7/TRBC1 β鏈DNA序列 ATGGATACCTGGCTCGTGTGTTGGGCCATCTTTAGCCTGCTGAAGGCCGGACTGACCGAGCCTGAAGTGACCCAGACTCCAAGCCATCAAGTGACTCAGATGGGGCAAGAAGTCATTCTGCGTTGCGTGCCCATC AGCAACCACCTGTAC TTTTATTGGTATCGCCAGATCCTGGGCCAGAAAGTGGAATTCCTGGTGTCC TTCTACAACAATGAGATC 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atatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc α鏈蛋白質序列 MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYS NSAFQY FMWYRQYSRKGPELLMY TYSSGN KEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYL CAMAGSGNTGKLIF GQGTTLQVKPDiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss β鏈： TRBV7-9/TRBJ2-4/TRBC1 β鏈DNA序列 ATGGGAACCTCTCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGTCTGCTGGGAGCCGATCATGCCGATACGGGAGTGTCCCAGGATCCTCGGCACAAGATTACCAAGAGGGGCCAGAACGTGACCTTCCGCTGTGACCCTATC AGCGAGCACAACCGG CTGTATTGGTACAGACAGACACTCGGCCAGGGGCCTGAATTTCTCACATAC TTCCAGAACGAAGCCCAG CTGGAAAAGTCCCGGCTGCTGAGCGATAGATTTTCCGCCGAGAGGCCCAAGGGCTCCTTCAGCACTCTGGAAATTCAGCGCACCGAGCAGGGCGACTCTGCCATGTATCTG TGCGCCTCATCATCCTCTACAAAAAATATTCAGTATTTC GGCGCCGGGACCCGGCTCTCAGTGCTGGaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggctttacctcggtgtcctaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcctgctagggaaggccaccctgtatgctgtgctggtcagcgcccttgtgttgatggccatggtcaagagaaaggatttc β鏈蛋白質序列 MGTSLLCWMALCLLGADHADTGVSQDPRHKITKRGQNVTFRCDPI SEHNR LYWYRQTLGQGPEFLTY FQNEAQ LEKSRLLSDRFSAERPKGSFSTLEIQRTEQGDSAMYL CASSSSTKNIQYF GAGTRLSVLEdlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsvsyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdf E7-11-28 MGTM 密碼子最佳化序列(亦稱為「TCR28」或「28」或「TCR-200-A02」。在一些實施例中，編碼TCR之密碼子最佳化α鏈及β鏈DNA序列可如表3中提供之載體，諸如載體pNVVD160中所示使用。) α鏈： TRAV25/TRAJ37/MGTM修飾之TRAC α鏈DNA序列 ATGCTGCTGATCACCTCCATGCTGGTGCTGTGGATGCAGCTGAGCCAAGTGAACGGCCAGCAAGTGATGCAGATCCCTCAGTACCAGCACGTGCAAGAAGGCGAGGACTTCACCACCTACTGCAACAGCAGC ACCACACTGAGCAAC ATCCAGTGGTACAAGCAGCGGCCTGGCGGACACCCTGTGTTTCTGATCCAG CTGGTCAAGTCCGGCGAAGTG AAGAAGCAGAAGCGGCTGACCTTCCAGTTCGGCGAGGCCAAGAAGAACAGCAGCCTGCACATCACCGCCACACAGACCACAGATGTGGGCACCTACTTC TGCGCTGGCATCGGTAGCAGCAACACCGGTAAGCTCATCTTT GGGCAAGGGACAACTTTACAAGTAAAACCAGacatccagaaccccgaccccgccgtgtaccagctgagggactccaagtccagcgacaagagcgtgtgtctgtttacggacttcgacagccagaccaacgtgagtcaaagcaaggacagcgacgtctacataacggataagaccgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaacagcgccgtggcctggtccaacaagagcgacttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcatcatccccgaggacaccttcttccccagcagcgacgtgccctgcgacgtgaaactggtggagaagtccttcgagacagacaccaatctgaactttcagaacctgctggtgatcgtgctgcggattctgctgctgaaagtggccggcttcaatctgctgatgaccctgcggctgtggagc α鏈蛋白質序列 MLLITSMLVLWMQLSQVNGQQVMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSS TTLSN IQWYKQRPGGHPVFLIQ LVKSGEV KKQKRLTFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYF CAGIGSSNTGKLIF GQGTTLQVKPDiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpssdvpcdvklveksfetdtnlnfqnllvivlrilllkvagfnllmtlrlws β鏈： TRBV2/TRBJ2-7/MGTM修飾之TRBC β鏈DNA序列 ATGGATACCTGGCTCGTGTGTTGGGCCATCTTTAGCCTGCTGAAGGCCGGACTGACCGAGCCTGAAGTGACCCAGACTCCAAGCCATCAAGTGACTCAGATGGGGCAAGAAGTCATTCTGCGTTGCGTGCCCATC AGCAACCACCTGTAC TTTTATTGGTATCGCCAGATCCTGGGCCAGAAAGTGGAATTCCTGGTGTCC TTCTACAACAATGAGATC TCCGAGAAGTCCGAGATCTTCGACGACCAGTTCTCCGTGGAAAGACCCGACGGCAGCAACTTCACACTGAAGATCCGGTCTACCAAACTTGAGGACTCCGCTATGTATTTT TGTGCAATCACAGGTCGCGTTTCATATGAGCAATATTTC GGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAgaagatctgaacaaggtgttccctccagaggtggccgtgttcgagccttctaaggccgagatcgcccacacacaaaaagccaccctcgtgtgcctggccaccggctttttccccgaccacgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcactccggcgtgtcaacggatccccagcctctgaaagaacagcctgccctgaacgacagccggtactgcctgagctccagactgagagtgtccgccaccttctggcagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttttacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacacaaatcgtgtctgccgaagcctggggaagagccgattgcggcatcaccagcgcctcctatcaccagggcgtgctgagcgccacaatcctgtacgaaatcctgctgggcaaggccaccctgtacgccgtgctggtgtctgctctggtgctgatggccatggtcaagcggaaggactttggcagcggcagagccaaaaggtccgggagcggt β鏈蛋白質序列 MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQTPSHQVTQMGQEVILRCVPI SNHLY FYWYRQILGQKVEFLVS FYNNEI SEKSEIFDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLEDSAMYF CAITGRVSYEQYF GPGTRLTVTEdlnkvfppevavfepskaeiahtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgitsasyhqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdfgsgrakrsgsg 完整β及α ORF DNA序列(「弗林蛋白酶(Furin)-P2A」位點中帶下劃線之斜體區域編碼允許在單個卡匣中表現兩條多肽鏈之序列」) ATACCTGGCTCGTGTGTTGGGCCATCTTTAGCCTGCTGAAGGCCGGACTGACCGAGCCTGAAGTGACCCAGACTCCAAGCCATCAAGTGACTCAGATGGGGCAAGAAGTCATTCTGCGTTGCGTGCCCATC AGCAACCACCTGTAC TTTTATTGGTATCGCCAGATCCTGGGCCAGAAAGTGGAATTCCTGGTGTCC TTCTACAACAATGAGATC TCCGAGAAGTCCGAGATCTTCGACGACCAGTTCTCCGTGGAAAGACCCGACGGCAGCAACTTCACACTGAAGATCCGGTCTACCAAACTTGAGGACTCCGCTATGTATTTT TGTGCAATCACAGGTCGCGTTTCATATGAGCAATATTTC GGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAgaagatctgaacaaggtgttccctccagaggtggccgtgttcgagccttctaaggccgagatcgcccacacacaaaaagccaccctcgtgtgcctggccaccggctttttccccgaccacgtggaactgtcttggtgggtcaacggcaaagaggtgcactccggcgtgtcaacggatccccagcctctgaaagaacagcctgccctgaacgacagccggtactgcctgagctccagactgagagtgtccgccaccttctggcagaacccccggaaccacttcagatgccaggtgcagttttacggcctgagcgagaacgacgagtggacccaggacagagccaagcccgtgacacaaatcgtgtctgccgaagcctggggaagagccgattgcggcatcaccagcgcctcctatcaccagggcgtgctgagcgccacaatcctgtacgaaatcctgctgggcaaggccaccctgtacgccgtgctggtgtctgctctggtgctgatggccatggtcaagcggaaggactttggcagcggcagagccaaaaggtccgggagcggt GCGACAAACTTTAGCCTGTTGAAACAAGCCGGCGACGTTGAAGAGAACCCCGGACC TATGCTGCTGATCACCTCCATGCTGGTGCTGTGGATGCAGCTGAGCCAAGTGAACGGCCAGCAAGTGATGCAGATCCCTCAGTACCAGCACGTGCAAGAAGGCGAGGACTTCACCACCTACTGCAACAGCAGC ACCACACTGAGCAAC ATCCAGTGGTACAAGCAGCGGCCTGGCGGACACCCTGTGTTTCTGATCCAG CTGGTCAAGTCCGGCGAAGTG AAGAAGCAGAAGCGGCTGACCTTCCAGTTCGGCGAGGCCAAGAAGAACAGCAGCCTGCACATCACCGCCACACAGACCACAGATGTGGGCACCTACTTC TGCGCTGGCATCGGTAGCAGCAACACCGGTAAGCTCATCTTT GGGCAAGGGACAACTTTACAAGTAAAACCAGacatccagaaccccgaccccgccgtgtaccagctgagggactccaagtccagcgacaagagcgtgtgtctgtttacggacttcgacagccagaccaacgtgagtcaaagcaaggacagcgacgtctacataacggataagaccgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaacagcgccgtggcctggtccaacaagagcgacttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcatcatccccgaggacaccttcttccccagcagcgacgtgccctgcgacgtgaaactggtggagaagtccttcgagacagacaccaatctgaactttcagaacctgctggtgatcgtgctgcggattctgctgctgaaagtggccggcttcaatctgctgatgaccctgcggctgtggagc 完整β及α ORF蛋白質序列(「弗林蛋白酶-P2A」位點中帶下劃線之斜體區域允許在單個卡匣中表現兩條多肽鏈」)」) MDTWLVCWAIFSLLKAGLTEPEVTQTPSHQVTQMGQEVILRCVPI SNHLY FYWYRQILGQKVEFLVS FYNNEI SEKSEIFDDQFSVERPDGSNFTLKIRSTKLEDSAMYF CAITGRVSYEQYF GPGTRLTVTEdlnkvfppevavfepskaeiahtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgitsasyhqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdfgsgrakrsgsg ATNFSLLKQAGDVEENPGP MLLITSMLVLWMQLSQVNGQQVMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSS TTLSN IQWYKQRPGGHPVFLIQ LVKSGEV KKQKRLTFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYF CAGIGSSNTGKLIF GQGTTLQVKPDiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpssdvpcdvklveksfetdtnlnfqnllvivlrilllkvagfnllmtlrlws E7-11-176 MGTM 密碼子最佳化序列(亦稱為「TCR176」或「176」) α鏈： TRAV29DV5/TRAJ41/MGTM修飾之TRAC α鏈DNA序列 Atggccatgctgctgggagccagcgtgctgattctttggctccagcctgactgggtcaacagccagcagaagaacgacgatcagcaagtgaagcagaacagccccagcctgagcgtgcaagaaggcagaatctccatcctgaactgcgactacacc aactctatgttcgactac ttcctgtggtacaagaagtaccccgccgagggacccacctttctgatcagc atcagctccatcaaggacaag aacgaggacggccggttcaccgtgtttctgaacaagagcgccaagcacctgagcctgcacatcgtgccttctcagcctggggattccgccgtgtatttc tgcGCCGCAAAAAATTCAAATTCAGGTTATGCCCTCAACTTT GGCAAAGGCACCTCGCTGTTGGTCACACCCCacatccagaaccccgaccccgccgtgtaccagctgagggactccaagtccagcgacaagagcgtgtgtctgtttacggacttcgacagccagaccaacgtgagtcaaagcaaggacagcgacgtctacataacggataagaccgtgctggacatgcggagcatggacttcaagagcaacagcgccgtggcctggtccaacaagagcgacttcgcctgcgccaacgccttcaacaacagcatcatccccgaggacaccttcttccccagcagcgacgtgccctgcgacgtgaaactggtggagaagtccttcgagacagacaccaatctgaactttcagaacctgctggtgatcgtgctgcggattctgctgctgaaagtggccggcttcaatctgctgatgaccctgcggctgtggagc α鏈蛋白質序列 MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYT NSMFDY FLWYKKYPAEGPTFLIS ISSIKDK NEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDSAVYF CAAKNSNSGYALNF GKGTSLLVTPHiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpssdvpcdvklveksfetdtnlnfqnllvivlrilllkvagfnllmtlrlws β鏈： TRBV24-1/TRBJ2-6/MGTM修飾之TRBC β鏈DNA序列 ATGGCCAGCCTGCTGTTCTTCTGCGGCGCCTTTTATCTGCTCGGCACCGGCTCTATGGACGCCGACGTTACACAGACCCCTCGGAACAGAATCACCAAGACCGGCAAGCGGATCATGCTGGAATGCAGCCAGACC AAGGGCCACGACCGG ATGTACTGGTACAGACAGGATCCAGGACTGGGCCTGCAGCTGATCTACTAC 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KEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSDSATYL CAMAGSGNTGKLIF GQGTTLQVKPDiqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpssdvpcdvklveksfetdtnlnfqnllvivlrilllkvagfnllmtlrlws 表 2 Kite TCR 序列 ( 亦稱為「比較」 ) ：α鏈： TRAV1-2/TRAJ7/密碼子最佳化小鼠恆定α α鏈DNA序列 ATGTGGGGTGTCTTCCTTTTGTACGTCAGCATGAAGATGGGAGGCACTACTGGGCAAAACATAGATCAGCCTACCGAAATGACTGCTACCGAGGGAGCCATTGTCCAAATCAACTGCACCTATCAG ACTAGCGGCTTCAATGGA CTCTTCTGGTACCAACAGCATGCGGGCGAAGCACCTACCTTCTTGTCCTAT AATGTCTTGGATGGTCTC GAAGAGAAAGGCAGATTCTCCAGTTTCCTCAGCCGGAGCAAGGGATACTCATATCTTCTCCTGAAAGAGCTTCAGATGAAGGATTCTGCATCCTATCTC TGTGCTTCAGTCGATGGCAATAACCGACTCGCCTTT 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CGCCAACGCGGTAATTTCCCCGATCGGTTCTCTGGGCACCAGTTCCCAAACTACTCAAGTGAGTTGAACGTAAATGCTCTCCTCCTCGGAGACTCCGCCCTCTACTTG TGTGCCAGTTCTCTTGGTTGGCGGGGCGGCCGATACAATGAACAATTTTTT GGACCTGGTACTCGGCTGACCGTGCTAGaggacctgcgcaacgtcaccccaccaaaggtcagtttgtttgagccatcaaaggcggagatcgccaacaaacagaaagctacgctcgtgtgtttggctcggggcttcttcccagaccacgtagaactttcctggtgggtcaatggaaaggaggttcattccggagtgtgcactgatccccaagcgtacaaggaatccaactatagctactgtctctcatctcggctccgggtgagtgcgacattctggcataatcctcggaaccactttcgatgccaagtgcagtttcatgggttgagcgaggaagacaagtggcccgagggcagtcctaaaccagtcactcaaaacataagcgccgaggcatggggtagagccgattgtgggattactagcgcttcataccaacaaggggtattgagcgctacaattctttacgaaattctcctcggcaaggcgacgctctacgccgtactggtgtctactctcgtggttatggcaatggtgaaacggaaaaacagc β鏈蛋白質序列 MAPGLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPK SGHDT VSWYQQALGQGPQFIFQ YYEEEE RQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYL CASSLGWRGGRYNEQFF GPGTRLTVLEdlrnvtppkvslfepskaeiankqkatlvclargffpdhvelswwvngkevhsgvctdpqaykesnysyclssrlrvsatfwhnprnhfrcqvqfhglseedkwpegspkpvtqnisaeawgradcgitsasyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvstlvvmamvkrkns 完整β及α ORF DNA序列 ATGGCCCCGGGGCTTTTGTGTTGGGCCTTGCTTTGTTTGCTTGGGGCAGGCTTGGTGGATGCTGGAGTCACACAGTCACCCACACACCTCATTAAAACCAGGGGACAACAAGTCACTCTGCGCTGCAGTCCTAAG TCAGGCCATGACACA GTTTCCTGGTATCAACAGGCTCTGGGGCAGGGCCCTCAGTTCATTTTCCAA TATTACGAGGAAGAGGAA CGCCAACGCGGTAATTTCCCCGATCGGTTCTCTGGGCACCAGTTCCCAAACTACTCAAGTGAGTTGAACGTAAATGCTCTCCTCCTCGGAGACTCCGCCCTCTACTTG TGTGCCAGTTCTCTTGGTTGGCGGGGCGGCCGATACAATGAACAATTTTTT GGACCTGGTACTCGGCTGACCGTGCTAGaggacctgcgcaacgtcaccccaccaaaggtcagtttgtttgagccatcaaaggcggagatcgccaacaaacagaaagctacgctcgtgtgtttggctcggggcttcttcccagaccacgtagaactttcctggtgggtcaatggaaaggaggttcattccggagtgtgcactgatccccaagcgtacaaggaatccaactatagctactgtctctcatctcggctccgggtgagtgcgacattctggcataatcctcggaaccactttcgatgccaagtgcagtttcatgggttgagcgaggaagacaagtggcccgagggcagtcctaaaccagtcactcaaaacataagcgccgaggcatggggtagagccgattgtgggattactagcgcttcataccaacaaggggtattgagcgctacaattctttacgaaattctcctcggcaaggcgacgctctacgccgtactggtgtctactctcgtggttatggcaatggtgaaacggaaaaacagc AGAGCCAAAAGAAGTGGTTCTGGCGCGACGAATTTTAGTTTGCTTAAGCAAGCCGGAGATGTGGAGGAAAATCCTGGACCGATGTGGGGTGTCTTCCTTTTGTACGTCAGCATGAAGATGGGAGGCACTACTGGGCAAAACATAGATCAGCCTACCGAAATGACTGCTACCGAGGGAGCCATTGTCCAAATCAACTGCACCTATCAG ACTAGCGGCTTCAATGGA CTCTTCTGGTACCAACAGCATGCGGGCGAAGCACCTACCTTCTTGTCCTAT AATGTCTTGGATGGTCTC GAAGAGAAAGGCAGATTCTCCAGTTTCCTCAGCCGGAGCAAGGGATACTCATATCTTCTCCTGAAAGAGCTTCAGATGAAGGATTCTGCATCCTATCTC TGTGCTTCAGTCGATGGCAATAACCGACTCGCCTTT GGAAAAGGGAATCAAGTGGTCGTCATACCGaatattcagaaccccgaaccagccgtatatcagttgaaggacccaagatctcaggatagtacactctgtttgtttacggactttgactcacaaatcaacgtcccgaagactatggaaagtggtacgttcatcacagataagtgcgttctggacatgaaggctatggactcaaagagcaacggggcaattgcttggtccaaccagacaagctttacctgtcaggacatttttaaggagactaatgctacttatccctccagcgacgttccgtgtgatgcgactcttaccgagaagtcttttgagaccgatatgaatctcaacttccagaatctgctggtgatcgttctgcggatcctgcttctgaaggttgcaggattcaatcttcttatgactctccggctctggtcttca 完整β及α ORF蛋白質序列 MAPGLLCWALLCLLGAGLVDAGVTQSPTHLIKTRGQQVTLRCSPK SGHDT VSWYQQALGQGPQFIFQ YYEEEE RQRGNFPDRFSGHQFPNYSSELNVNALLLGDSALYL CASSLGWRGGRYNEQFF GPGTRLTVLEdlrnvtppkvslfepskaeiankqkatlvclargffpdhvelswwvngkevhsgvctdpqaykesnysyclssrlrvsatfwhnprnhfrcqvqfhglseedkwpegspkpvtqnisaeawgradcgitsasyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvstlvvmamvkrkns RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMWGVFLLYVSMKMGGTTGQNIDQPTEMTATEGAIVQINCTYQ TSGFNG LFWYQQHAGEAPTFLSY NVLDGL EEKGRFSSFLSRSKGYSYLLLKELQMKDSASYL CASVDGNNRLAF GKGNQVVVIPNiqnpepavyqlkdprsqdstlclftdfdsqinvpktmesgtfitdkcvldmkamdsksngaiawsnqtsftcqdifketnatypssdvpcdatlteksfetdmnlnfqnllvmvlrilllkvagfnllmtlrlwss *表1提供代表性TCR序列，該等TCR序列根據MHC血清型呈現分組且根據MHC血清型呈現且由分小組之TCR結合之不同肽分小組。描述及主張個別TCR，諸如表中代表性示例之彼等TCR，以及結合單獨或與MHC複合之本文所述之肽抗原決定基序列的結合蛋白種類，諸如本文提供之表中分組之彼等結合蛋白。此外，提供本文所述之各條TCR α鏈之TRAV、TRAJ及TRAC基因，以及本文所述之各條TCR β鏈之TRBV、TRBJ及TRBC基因。本文所述之各TCR之序列作為各命名TCR之同源α鏈及β鏈對提供。對本文描述之TCR序列進行註釋。可變域序列大寫。恆定域序列小寫。CDR1、CDR2及CDR3序列使用粗體及帶下劃線之文字進行註釋。CDR1、CDR2及CDR3按自左(N端)至右(C端)之標准出現順序顯示。本文所述之各條TCR α鏈之TRAV、TRAJ及TRAC基因，以及本文所述之各條TCR β鏈之TRBV、TRBJ及TRBC基因根據本文所述之熟知之IMGT命名法進行註釋。類似地，TRAV及TRBV之CDR1及CDR2為所屬領域中熟知，因為其係基於熟知且注釋之TRAV及TRBV序列(例如，如例如可在imt.org獲得之IMGT及可在iedb.org獲得之IEDB的資料庫中所注釋)。 表 3 載體： pTSLV102-MSCV-E7-11-28-MGTM-Q-CD8-opttggaagggctaattcactcccaaagaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattagcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaagaactgctgatatcgagcttgctacaagggactttccgctggggactttccagggaggcgtggcctgggcgggactggggagtggcgagccctcagatcctgcatataagcagctgctttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcgccgaattaattcacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacaggCGcGCcagagatccagtttggacCTgcAGGTGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGtTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGCGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTtGCTTCTtGCTTCTGTTtGtGtGCTTCTGCTCCCtGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTtGGtGgGCCAGTCCTCtGATAGACTGtGTCcCCtGGaTACCCGTAcggtaccgctagcgccaccATGGATACCTGGCTCGTGTGTTGGGCCATCTTTAGCCTGCTGAAGGCCGGACTGACCGAGCCTGAAGTGACCCAGACTCCAAGCCATCAAGTGACTCAGATGGGGCAAGAAGTCATTCTGCGTTGCGTGCCCATCAGCAACCACCTGTACTTTTATTGGTATCGCCAGATCCTGGGCCAGAAAGTGGAATTCCTGGTGTCCTTCTACAACAATGAGATCTCCGAGAAGTCCGAGATCTTCGACGACCAGTTCTCCGTGGAAAGACCCGACGGCAGCAACTTCACACTGAAGATCCGGTCTACCAAACTTGAGGACTCCGCTATGTATTTTTGTGCAATCACAGGTCGCGTTTCATATGAGCAATATTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAAGATCTGAACAAGGTGTTCCCTCCAGAGGTGGCCGTGTTCGAGCCTTCTAAGGCCGAGATCGCCCACACACAAAAAGCCACCCTCGTGTGCCTGGCCACCGGCTTTTTCCCCGACCACGTGGAACTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAAGAGGTGCACTCCGGCGTGTCAACGGATCCCCAGCCTCTGAAAGAACAGCCTGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGAGCTCCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTTTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACAGAGCCAAGCCCGTGACACAAATCGTGTCTGCCGAAGCCTGGGGAAGAGCCGATTGCGGCATCACCAGCGCCTCCTATCACCAGGGCGTGCTGAGCGCCACAATCCTGTACGAAATCCTGCTGGGCAAGGCCACCCTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCTCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGACTTTGGCAGCGGCAGAGCCAAAAGGTCCGGGAGCGGTGCGACAAACTTTAGCCTGTTGAAACAAGCCGGCGACGTTGAAGAGAACCCCGGACCTATGCTGCTGATCACCTCCATGCTGGTGCTGTGGATGCAGCTGAGCCAAGTGAACGGCCAGCAAGTGATGCAGATCCCTCAGTACCAGCACGTGCAAGAAGGCGAGGACTTCACCACCTACTGCAACAGCAGCACCACACTGAGCAACATCCAGTGGTACAAGCAGCGGCCTGGCGGACACCCTGTGTTTCTGATCCAGCTGGTCAAGTCCGGCGAAGTGAAGAAGCAGAAGCGGCTGACCTTCCAGTTCGGCGAGGCCAAGAAGAACAGCAGCCTGCACATCACCGCCACACAGACCACAGATGTGGGCACCTACTTCTGCGCTGGCATCGGTAGCAGCAACACCGGTAAGCTCATCTTTGGGCAAGGGACAACTTTACAAGTAAAACCAGACATCCAGAACCCCGACCCCGCCGTGTACCAGCTGAGGGACTCCAAGTCCAGCGACAAGAGCGTGTGTCTGTTTACGGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGAGTCAAAGCAAGGACAGCGACGTCTACATAACGGATAAGACCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATCATCCCCGAGGACACCTTCTTCCCCAGCAGCGACGTGCCCTGCGACGTGAAACTGGTGGAGAAGTCCTTCGAGACAGACACCAATCTGAACTTTCAGAACCTGCTGGTGATCGTGCTGCGGATTCTGCTGCTGAAAGTGGCCGGCTTCAATCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGAGCAGCAGGGCTAAGAGGTCCGGCAGCGGAGCCACCAATTTTTCCCTGCTGAAACAGGCTGGTGACGTGGAAGAAAACCCTGGCCCCATGGCGCTGCCCGTCACCGCGCTGCTGCTGCCCCTGGCGCTGCTGTTACACGCCGCTCGGCCAGAGCTTCCCACCCAGGGCACATTCTCCAACGTGTCCACCAATGTGTCGGGAGGCGGCGGATCGTCCCAGTTCAGAGTGTCCCCTCTGGACCGCACCTGGAACCTGGGCGAGACCGTGGAGCTGAAATGTCAGGTCCTGCTGAGCAACCCGACCTCCGGGTGCAGTTGGCTGTTCCAGCCGCGTGGTGCTGCCGCAAGCCCTACGTTCCTGCTTTACCTGAGCCAGAACAAGCCCAAGGCGGCCGAGGGCCTGGACACCCAGAGATTCTCCGGCAAGCGCCTGGGGGACACATTCGTGCTTACTTTGAGCGATTTCCGCAGAGAGAACGAGGGCTA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ATGCGCCCCAGGCTTTGGCTCCTTCTTGCTGCTCAGCTCACTGTCTTGCATGGCAACTCCGTTCTGCAGCAGACTCCCGCCTACATCAAGGTGCAGACGAACAAGATGGTGATGCTGTCATGCGAGGCCAAGATCTCTCTTTCAAATATGAGAATTTATTGGCTACGACAGCGCCAGGCCCCCTCCAGCGACAGCCACCACGAGTTCCTGGCGCTTTGGGATTCTGCTAAAGGCACCATCCATGGAGAGGAGGTGGAACAGGAGAAGATAGCTGTCTTCCGCGACGCATCCCGCTTCATCCTGAACCTGACCAGCGTGAAGCCGGAGGACAGCGGCATCTACTTCTGTATGATCGTTGGCTCCCCCGAGCTGACCTTCGGCAAAGGCACCCAGCTGTCCGTGGTGGACTTCCTGCCCACCACAGCCCAGCCAACCAAGAAATCCACCCTCAAGAAGCGCGTGTGCCGACTGCCCCGCCCTGAAACCCAGAAGGGCCCTCTGTGCTCCCCCATCACCCTTGGACTGCTGGTGGCGGGAGTCCTGGTGCTGCTCGTATCTCTGGGTGTCGCCATCCACCTGTGCTGCCGCCGCCGCCGCGCCCGCCTGAGGTTTATGAAACAGTTTTACAAGTGATAAATCGATGGAAGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTACTAGTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGTGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCACGGCTAGCGCCACCATGGGTCGGGGGCTGCTCAGGGGCCTGTGGCCGCTGCACATCGTCCTGTGGACGCGTATCGCCAGCACGATCCCACCGCACGTTCAGAAGTCGGTGAATAACGACATGATAGTCACTGACAACAACGGTGCAGTCAAGTTTCCACAACTGTGTAAATTTTGTGATGTGAGATTTTCCACCTGTGACAACCAGAAATCCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCACAGGAAGTCTGTGTGGCTGTATGGAGAAAGAATGACGAGAACATAACACTAGAGACAGTTTGCCATGACCCCAAGCTCCCCTACCATGACTTTATTCTGGAAGATGCTGCTTCTCCAAAGTGCATTATGAAGGAGAAGAAAAAGCCTGGTGAGACTTTCTTCATGTGTTCCTGTAGCTCTGATGAGTGCAATGACAACATCATCTTCTCAGAAGAATATAACACCAGCAATCCTGACTTGTTGCTAGTCATATTTCAAGTGACAGGCATCAGCCTCCTGCCACCACTGGGAGTTGCCATATCTGTCATCATCATCTTCTACTGCTACCGCGTGAACCGGCAGCAGAAGGCTAGTGGTTCAGGCGCAACGAATTTCTCTTTGCTGAAGCAGGCTGGGGATGTCGAAGAAAATCCGGGTCCAATGGTGGGCTCGCTCAACTGCATCGTAGCAGTCTCCCAGAATATGGGCATCGGGAAGAACGGTGATTTCCCGTGGCCCCCACTTCGCAACGAGAGCCGTTATTTCCAAAGAATGACTACAACCTCCTCCGTGGAGGGTAAGCAGAACCTGGTCATCATGGGGAAGAAGACCTGGTTCTCTATCCCTGAAAAAAACCGCCCCCTGAAGGGCCGCATCAACCTGGTGCTGAGCAGGGAACTCAAGGAGCCTCCTCAGGGCGCGCATTTTCTGAGCCGCTCATTGGATGACGCTCTCAAACTGACCGAACAGCCGGAGCTAGCCAACAAGGTGGACATGGTGTGGATCGTCGGAGGCTCCTCCGTGTACAAGGAGGCCATGAATCACCCCGGCCACTTGAAGCTGTTCGTCACCCGGATCATGCAGGACTTCGAGTCGGACACGTTCTTTCCAGAGATTGACCTGGAGAAGTACAAGCTGCTGCCCGAGTACCCGGGAGTTCTTAGTGATGTGCAGGAGGAGAAAGGCATCAAGTACAAATTTGAGGTGTACGAGAAGAACGACTAACGGTCCGTCCTGACCAATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACAGGTTACCTCAGTCTCCTAGGTACGTCTTATATCTATGAAAAAACATTCAAAAGCACAACATCTAGAAGAACTTACCTTTTTTCACCACTCTATTGCAAAGATATGTACCGATTTCTCTCGAAGTACAAAAAACCGCTAGTTTTCAAATTCACCTCAAGACTTTGAAAAAAAATTGAATCTGTCAATGTCAAATAAAATCAGAAACAAATGTCATAATGTTACGTTAATGTTGTCAGGTCGAAAAATAAAATTGCAAATAGAAATTTTGTTCCTTTTTTATTGGTTTTTATTGGTGGGAAAAATATTCCCTCTAACTGCAAAAGGGTTAATTATGTTAGAGGTAGAGTCGACAAGCTT pNVVD154_TSC-200-A02_TCR-28_MSCV-TCR28-CD8-EF1a-TGFR-DHFR載體圖 圖例：CD：分化簇。RNA-OUT：針對由sacB編碼之細菌聚果糖蔗糖酶之反義RNA。SV：猿猴病毒。TCR：T細胞受體，TIR：末端反向重複序列，QBend：小鼠抗人類CD34抗體，dnTGFbRII：顯性負性TGFβ受體II，DHFR：二氫葉酸還原酶選擇標記物 載體：pNVVD160_TSC-200-A02_TCR-28_MSCV-TCR28-CD8-EF1a-TGFR-DHFR GAATTCGTCGACGCTAGCTGGCTTGTTGTCCACAACCATTAAACCTTAAAAGCTTTAAAAGCCTTATATATTCTTTTTTTTCTTATAAAACTTAAAACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGATTTATATTAATTTTATTGTTCAAACATGAGAGCTTAGTACGTGAAACATGAGAGCTTAGTACATTAGCCATGAGAGCTTAGTACATTAGCCATGAGGGTTTAGTTCATTAAACATGAGAGCTTAGTACATTAAACATGAGAGCTTAGTACATACTATCAACAGGTTGAACTGCTGATCTGTACAGTAGAATTGGTAAAGAGAGTTGTGTAAAATATTGAGTTCGCACATCTTGTTGTCTGATTATTGATTTTTGGCGAAACCATTTGATCATATGACAAGATGTGTATCTACCTTAACTTAATGATTTTGATAAAAATCATTAGGTACCAATTACATTGCTTGCAATTAACCCTTTAACGGTTATAAGGATCTAGATGAGATAGAAAGATTTGGTTTTCGGATTTGTGTTACATAAGATGCCTAAAATAAAAATTGAGATTCAATTTTTTTTAAACTTTTTTTTAATTGGTGGTAAGAATATTCCCTCTACCTGTTTGAGAGTAATGAAATTGTAGTATGATTTTTCAACAAACTAAAAAAACAACATAAATCTCACATAATAACTTTATTTCAATCACACAATTGAATACCAATAGGTTGACAGTACTTACCAGCCTGCAGG TGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGTTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGCGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTTGCTTCTTGCTTCTGTTTGTGTGCTTCTGCTCCCTGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTTGGTGGGCCAGTCCTCTGATAGACTGTGTCCCCTGGATACCCGTACGGTACCGCTAGCGCCACC ATGGATACCTGGCTCGTGTGTTGGGCCATCTTTAGCCTGCTGAAGGCCGGACTGACCGAGCCTGAAGTGACCCAGACTCCAAGCCATCAAGTGACTCAGATGGGGCAAGAAGTCATTCTGCGTTGCGTGCCCATCAGCAACCACCTGTACTTTTATTGGTATCGCCAGATCCTGGGCCAGAAAGTGGAATTCCTGGTGTCCTTCTACAACAATGAGATCTCCGAGAAGTCCGAGATCTTCGACGACCAGTTCTCCGTGGAAAGACCCGACGGCAGCAACTTCACACTGAAGATCCGGTCTACCAAACTTGAGGACTCCGCTATGTATTTTTGTGCAATCACAGGTCGCGTTTCATATGAGCAATATTTCGGGCCGGGCACCAGGCTCACGGTCACAGAAGATCTCAATAAAGTGTTCCCCCCTGAGGTTGCGGTGTTTGAGCCGTCCAAAGCGGAGATTGCCCACACACAGAAAGCGACTTTGGTTTGTTTGGCGACAGGCTTTTTCCCTGACCACGTAGAGCTGTCTTGGTGGGTCAACGGCAAGGAGGTTCACAGCGGTGTGTCAACGGATCCCCAGCCTCTGAAAGAACAGCCTGCCCTGAACGACAGCCGGTACTGCCTGAGCTCCAGACTGAGAGTGTCCGCCACCTTCTGGCAGAACCCCCGGAACCACTTCAGATGCCAGGTGCAGTTTTACGGCCTGAGCGAGAACGACGAGTGGACCCAGGACAGAGCCAAGCCCGTGACACAAATCGTGTCTGCCGAAGCCTGGGGAAGAGCCGATTGCGGCATCACCAGCGCCTCCTATCACCAGGGCGTGCTGAGCGCCACAATCCTGTACGAAATCCTGCTGGGCAAGGCCACCCTGTACGCCGTGCTGGTGTCTGCTCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGCGGAAGGACTTTGGCAGCGGC AGAGCCAAAAGGTCCGGGAGCGGTGCGACAAACTTTAGCCTGTTGAAACAAGCCGGCGACGTTGAAGAGAACCCCGGACCT ATGCTGCTGATCACCTCCATGCTGGTGCTGTGGATGCAGCTGAGCCAAGTGAACGGCCAGCAAGTGATGCAGATCCCTCAGTACCAGCACGTGCAAGAAGGCGAGGACTTCACCACCTACTGCAACAGCAGCACCACACTGAGCAACATCCAGTGGTACAAGCAGCGGCCTGGCGGACACCCTGTGTTTCTGATCCAGCTGGTCAAGTCCGGCGAAGTGAAGAAGCAGAAGCGGCTGACCTTCCAGTTCGGCGAGGCCAAGAAGAACAGCAGCCTGCACATCACCGCCACACAGACCACAGATGTGGGCACCTACTTCTGCGCTGGCATCGGTAGCAGCAACACCGGTAAGCTCATCTTTGGGCAAGGGACAACTTTACAAGTAAAACCAGACATCCAGAACCCCGACCCCGCCGTGTACCAGCTGAGGGACTCCAAGTCCAGCGACAAGAGCGTGTGTCTGTTTACGGACTTCGACAGCCAGACCAACGTGAGTCAAAGCAAGGACAGCGACGTCTACATAACGGATAAGACCGTGCTGGACATGCGGAGCATGGACTTCAAGAGCAACAGCGCCGTGGCCTGGTCCAACAAGAGCGACTTCGCCTGCGCCAACGCCTTCAACAACAGCATCATCCCCGAGGACACCTTCTTCCCCAGCAGCGACGTGCCCTGCGACGTGAAACTGGTGGAGAAGTCCTTCGAGACAGACACCAATCTGAACTTTCAGAACCTGCTGGTGATCGTGCTGCGGATTCTGCTGCTGAAAGTGGCCGGCTTCAATCTGCTGATGACCCTGCGGCTGTGGAGCAGC AGGGCTAAGAGGTCCGGCAGCGGAGCCACCAATTTTTCCCTGCTGAAACAGGCTGGTGACGTGGAAGAAAACCCTGGCCCC ATGGCGCTGCCCGTCACCGCGCTGCTGCTGCCCCTGGCGCTGCTGTTACACGCCGCTCGGCCA GAGCTTCCCACCCAGGGCACATTCTCCAACGTGTCCACCAATGTGTCGGGAGGCGGCGGATCGTCCCAGTTCAGAGTGTCCCCTCTGGACCGCACCTGGAACCTGGGCGAGACCGTGGAGCTGAAATGTCAGGTCCTGCTGAGCAACCCGACCTCCGGGTGCAGTTGGCTGTTCCAGCCGCGTGGTGCTGCCGCAAGCCCTACGTTCCTGCTTTACCTGAGCCAGAACAAGCCCAAGGCGGCCGAGGGCCTGGACACCCAGAGATTCTCCGGCAAGCGCCTGGGGGACACATTCGTGCTTACTTTGAGCGATTTCCGCAGAGAGAACGAGGGCTACTATTTCTGTTCGGCGCTGAGCAATTCCATCATGTATTTCAGCCACTTTGTGCCAGTGTTCCTGCCTGCCAAGCCTACCACAACACCAGCTCCCCGTCCCCCGACTCCGGCGCCTACCATCGCGAGTCAACCGTTGAGCCTGAGGCCTGAGGCTTGTCGGCCCGCTGCGGGGGGTGCCGTCCACACCAGGGGCCTCGACTTTGCGTGCGACATCTATATTTGGGCGCCTCTGGCGGGTACCTGCGGGGTGCTGCTGCTGTCATTGGTGATTACCCTGTACTGCAATCACCGCAACCGCCGGCGGGTCTGTAAGTGCCCACGGCCTGTGGTCAAGTCCGGTGACAAACCGTCGCTCTCGGCTCGCTACGTG CGCGCTAAGCGCAGCGGTTCCGGGGCCACCAACTTTTCATTGCTGAAGCAGGCCGGTGATGTGGAGGAGAATCCAGGGCCC ATGCGCCCCAGGCTTTGGCTCCTTCTTGCTGCTCAGCTCACTGTCTTGCATGGCAACTCCGTTCTGCAGCAGACTCCCGCCTACATCAAGGTGCAGACGAACAAGATGGTGATGCTGTCATGCGAGGCCAAGATCTCTCTTTCAAATATGAGAATTTATTGGCTACGACAGCGCCAGGCCCCCTCCAGCGACAGCCACCACGAGTTCCTGGCGCTTTGGGATTCTGCTAAAGGCACCATCCATGGAGAGGAGGTGGAACAGGAGAAGATAGCTGTCTTCCGCGACGCATCCCGCTTCATCCTGAACCTGACCAGCGTGAAGCCGGAGGACAGCGGCATCTACTTCTGTATGATCGTTGGCTCCCCCGAGCTGACCTTCGGCAAAGGCACCCAGCTGTCCGTGGTGGACTTCCTGCCCACCACAGCCCAGCCAACCAAGAAATCCACCCTCAAGAAGCGCGTGTGCCGACTGCCCCGCCCTGAAACCCAGAAGGGCCCTCTGTGCTCCCCCATCACCCTTGGACTGCTGGTGGCGGGAGTCCTGGTGCTGCTCGTATCTCTGGGTGTCGCCATCCACCTGTGCTGCCGCCGCCGCCGCGCCCGCCTGAGGTTTATGAAACAGTTTTACAAGTGATAAATCGATGGAAGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCCCTGGAAGTTGCCACTCCAGTGCCCACCAGCCTTGTCCTAATAAAATTAAGTTGCATCATTTTGTCTGACTAGGTGTCCTTCTATAATATTATGGGGTGGAGGGGGGTGGTATGGAGCAAGGGGCAAGTTGGGAAGACAACCTGTAGGGCCTGCGGGGTCTATTGGGAACCAAGCTGGAGTGCAGTGGCACAATCTTGGCTCACTGCAATCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCGAGTTGTTGGGATTCCAGGCATGCATGACCAGGCTCAGCTAATTTTTGTTTTTTTGGTAGAGACGGGGTTTCACCATATTGGCCAGGCTGGTCTCCAACTCCTAATCTCAGGTGATCTACCCACCTTGGCCTCCCAAATTGCTGGGATTACAGGCGTGAACCACTGCTCCCTTCCCTGTCCTTCTGATTACTAGTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGTGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCACGGCTAGCGCCACCATGGGTCGGGGGCTGCTCAGGGGCCTGTGGCCGCTGCACATCGTCCTGTGGACGCGTATCGCCAGCACGATCCCACCGCACGTTCAGAAGTCGGTGAATAACGACATGATAGTCACTGACAACAACGGTGCAGTCAAGTTTCCACAACTGTGTAAATTTTGTGATGTGAGATTTTCCACCTGTGACAACCAGAAATCCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACCTCCATCTGTGAGAAGCCACAGGAAGTCTGTGTGGCTGTATGGAGAAAGAATGACGAGAACATAACACTAGAGACAGTTTGCCATGACCCCAAGCTCCCCTACCATGACTTTATTCTGGAAGATGCTGCTTCTCCAAAGTGCATTATGAAGGAGAAGAAAAAGCCTGGTGAGACTTTCTTCATGTGTTCCTGTAGCTCTGATGAGTGCAATGACAACATCATCTTCTCAGAAGAATATAACACCAGCAATCCTGACTTGTTGCTAGTCATATTTCAAGTGACAGGCATCAGCCTCCTGCCACCACTGGGAGTTGCCATATCTGTCATCATCATCTTCTACTGCTACCGCGTGAACCGGCAGCAGAAGGCTAGTGGTTCAGGCGCAACGAATTTCTCTTTGCTGAAGCAGGCTGGGGATGTCGAAGAAAATCCGGGTCCAATGGTGGGCTCGCTCAACTGCATCGTAGCAGTCTCCCAGAATATGGGCATCGGGAAGAACGGTGATTTCCCGTGGCCCCCACTTCGCAACGAGAGCCGTTATTTCCAAAGAATGACTACAACCTCCTCCGTGGAGGGTAAGCAGAACCTGGTCATCATGGGGAAGAAGACCTGGTTCTCTATCCCTGAAAAAAACCGCCCCCTGAAGGGCCGCATCAACCTGGTGCTGAGCAGGGAACTCAAGGAGCCTCCTCAGGGCGCGCATTTTCTGAGCCGCTCATTGGATGACGCTCTCAAACTGACCGAACAGCCGGAGCTAGCCAACAAGGTGGACATGGTGTGGATCGTCGGAGGCTCCTCCGTGTACAAGGAGGCCATGAATCACCCCGGCCACTTGAAGCTGTTCGTCACCCGGATCATGCAGGACTTCGAGTCGGACACGTTCTTTCCAGAGATTGACCTGGAGAAGTACAAGCTGCTGCCCGAGTACCCGGGAGTTCTTAGTGATGTGCAGGAGGAGAAAGGCATCAAGTACAAATTTGAGGTGTACGAGAAGAACGACTAACGGTCCGTCCTGACCAATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACAGGTTACCTCAGTCTCCTAGGTACGTCTTATATCTATGAAAAAACATTCAAAAGCACAACATCTAGAAGAACTTACCTTTTTTCACCACTCTATTGCAAAGATATGTACCGATTTCTCTCGAAGTACAAAAAACCGCTAGTTTTCAAATTCACCTCAAGACTTTGAAAAAAAATTGAATCTGTCAATGTCAAATAAAATCAGAAACAAATGTCATAATGTTACGTTAATGTTGTCAGGTCGAAAAATAAAATTGCAAATAGAAATTTTGTTCCTTTTTTATTGGTTTTTATTGGTGGGAAAAATATTCCCTCTAACTGCAAAAGGGTTAATTATGTTAGAGGTAGAGTCGACAAGCTT pNVVD160_TSC-200-A02_TCR-28_MSCV-TCR28-CD8-EF1a-TGFR-DHFR載體圖 圖例：CD：分化簇。RNA-OUT：針對由sacB編碼之細菌聚果糖蔗糖酶之反義RNA。SV：猿猴病毒。TCR：T細胞受體，TIR：末端反向重複序列，QBend：小鼠抗人類CD34抗體，dnTGFbRII：顯性負性TGFβ受體II，DHFR：二氫葉酸還原酶選擇標記物 * 對於表3中之載體，注釋如下：MSCV啟動子為粗體。β鏈使用粗體及斜體文字注釋。α鏈使用粗體及加下劃線文字注釋。Q標籤使用斜體及加下劃線文字注釋。CD8-α為斜體。CD8-β加下劃線。 *本文中之表1-3中包括肽抗原決定基，以及包含在全長上與表1-4中所列之任何SEQ ID NO之胺基酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更大一致性的胺基酸序列的多肽分子，或其一部分。此類多肽可具有本文進一步描述之全長肽或多肽之功能。 *表1-3中包括RNA核酸分子(例如，胸腺嘧啶用尿嘧啶置換)、編碼所編碼蛋白質之直系同源物之核酸分子，以及包含在全長上與表1-4中所列之任何序列之核酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更大一致性的核酸序列的DNA或RNA核酸序列，或其一部分。此類核酸分子可具有本文進一步描述之全長核酸之功能。
在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白可包含T細胞受體(TCR)、TCR之抗原結合片段或嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白可包含兩條多肽鏈，其中每一條均包含可變區，該可變區包含TCR α鏈之CDR3及TCR β鏈之CDR3，或TCR α鏈及TCR β鏈兩者之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，結合蛋白包含單鏈TCR (scTCR)，其包含TCR V α及TCR V β域兩者，但僅包含單個TCR恆定域(C α或C β)。術語「嵌合抗原受體」(CAR)係指一種融合蛋白，其經工程改造以含有兩個或更多個天然存在之胺基酸序列，該等序列以非天然存在或非天然存在於宿主細胞中之方式連接在一起，當存在於細胞表面上時，該融合蛋白可用作受體。本發明所涵蓋之CAR可包括細胞外部分，其包含抗原結合域(亦即，獲自或源自免疫球蛋白或免疫球蛋白樣分子，諸如抗體或TCR，或者源自或獲自來自NK細胞之殺手免疫受體之抗原結合域)，該抗原結合域與跨膜域及一或多個細胞內信號傳導域(視情況含有共刺激域)連接(參見例如Sadelain等人 (2013 ) Cancer Discov. 3:388；Harris及Kranz (2016) Trends Pharmacol. Sci.37:220；及Stone等人 (2014) Cancer Immunol. Immunother.63:1163)。
在一些實施例中，1) TCR α鏈CDR、TCR V α域及/或TCR α鏈由選自表1中所列之TRAV、TRAJ及TRAC基因之群的TRAV、TRAJ及/或TRAC基因或其片段編碼，及/或2) TCR β鏈CDR、TCR V β域及/或TCR β鏈由選自表1中所列之TRBV、TRBJ及TRBC基因之群的TRBV、TRBJ及/或TRBC基因或其片段編碼，及/或3)與表1中所列之同源參考CDR序列相比，該結合蛋白之各CDR具有至多五個胺基酸取代、插入、缺失或其組合。
在一些實施例中，本文所揭示之結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段或嵌合抗原受體(CAR))為嵌合的(例如，包含來自多於一個供體或物種之胺基酸殘基或模體)、人類化(例如，包含來自非人類生物體之殘基，該等殘基發生改變或經取代以降低人類之免疫原性風險)或人類的。
用於產生經工程改造之結合蛋白(諸如TCR、CAR及其抗原結合片段)之方法為所屬領域中熟知(例如Bowerman等人 (2009) Mol. Immunol.5:3000；美國專利第6,410,319號；美國專利第7,446,191號；美國專利公開案第2010/065818號；美國專利第8,822,647號；PCT公開案第WO 2014/031687號；美國專利第7,514,537號；及Brentjens等人 (2007) Clin. Cancer Res.73:5426)。
在一些實施例中，本文所述之結合蛋白係在細胞表面上表現之TCR或其抗原結合片段，其中與內源性TCR相比，細胞表面表現之TCR能夠更有效地與CD3蛋白締合。當在如T細胞之細胞之表面上表現時，與內源性結合蛋白(諸如內源性TCR)相比，本發明所涵蓋之結合蛋白(諸如TCR)亦可具有更高的在細胞上之表面表現。在一些實施例中，本文提供一種CAR，其中CAR之結合域包含抗原特異性TCR結合域(參見例如Walseng等人 (2017) Scientific Reports7:10713)。
亦提供經修飾之結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段或CAR)，其可根據熟知方法使用本文所揭示之具有一或多個V α及/或V β序列之結合蛋白作為起始物質對經修飾之結合蛋白進行工程改造來製備，該經修飾之結合蛋白可具有與起始結合蛋白相比發生改變之特性。可藉由修飾一個或兩個可變區(亦即，V α及/或V β)內，例如一或多個CDR區內及/或一或多個構架區內之一或多個殘基來對結合蛋白進行工程改造。或者或另外，可藉由修飾恆定區內之殘基來對結合蛋白進行工程改造。
另一類型之可變區修飾係使V α及/或V βCDR1、CDR2及/或CDR3區內之胺基酸殘基發生突變，由此改良所關注之結合蛋白之一或多種結合特性(例如，親和力)。可執行定點突變誘發或PCR介導之突變誘發以引入突變，且可在如本文所述及實例中所提供之活體外、離體或活體內分析中評估對蛋白結合或其他所關注之功能特性之影響。在一些實施例中，可引入保守修飾(如上文所論述)。突變可為胺基酸取代、添加或缺失。在一些實施例中，突變為取代。此外，通常CDR區內不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基經修飾。
在一些實施例中，本文所述之結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段或CAR)相對於天然存在之TCR可具有一或多個胺基酸取代、缺失或添加。在一些實施例中，與表1中所列之同源參考CDR序列相比，結合蛋白之各CDR具有至多五個胺基酸取代、插入、缺失或其組合。胺基酸之保守取代係熟知的且可天然存在或可在重組產生結合蛋白時引入。可使用所屬領域中已知之突變誘發方法將胺基酸取代、缺失及添加引入至蛋白質中(參見例如Sambrook等人 (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)。可採用寡核苷酸定點特異性(或區段特異性)突變誘發程序來提供經改變之多核苷酸，該經改變之多核苷酸具有根據所需取代、缺失或插入發生改變之特定密碼子。或者，可使用隨機或飽和突變誘發技術，諸如丙胺酸掃描突變誘發、易錯聚合酶鏈反應突變誘發及寡核苷酸定向突變誘發來製備免疫原多肽變異體(參見例如Sambrook等人, 同上)。
一般技術人員已知之多種準則指示在肽或多肽中之特定位置處經取代之胺基酸是否為保守的(或相似的)。舉例而言，相似胺基酸或保守胺基酸取代係其中胺基酸殘基經具有相似側鏈之胺基酸殘基置換的取代。相似胺基酸可包括於以下類別中：具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)；具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)；具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、組胺酸)；具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)；具有β-分支鏈側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)，及具有芳族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸)。脯胺酸被視為較難以歸類，其與具有脂族側鏈之胺基酸(例如，白胺酸、纈胺酸、異白胺酸及丙胺酸)共享特性。在一些實施例中，用麩醯胺酸取代麩胺酸或用天冬醯胺取代天冬胺酸可被視為相似取代，因為麩醯胺酸及天冬醯胺分別為麩胺酸及天冬胺酸之醯胺衍生物。如所屬領域中應理解，藉由對多肽之胺基酸序列及其保守胺基酸取代與第二多肽之序列進行比較來測定兩種多肽之間的「相似性」(例如，使用GENEWORKS™、Align、BLAST演算法或本文中描述且在所屬領域中實踐之其他演算法)。
在一些實施例中，經編碼之結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段或CAR)可包含「信號肽」(亦稱為前導序列、前導肽或轉運肽)。信號肽使新合成之多肽靶向其在細胞內部或外部之適當位置。在定位或分泌期間或者一旦定位或分泌已完成，可自多肽中移除信號肽。具有信號肽之多肽在本文中稱作「前蛋白」且已移除信號肽之多肽在本文中稱作「成熟」蛋白或多肽。在一些實施例中，本文所述之結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段或CAR)包含成熟V α域、成熟V β域或兩者。在一些實施例中，本文所述之結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段或CAR)包含成熟TCR β-鏈、成熟TCR α-鏈或兩者。
在一些實施例中，結合蛋白為融合蛋白，其包含：(a)包含TCR或其抗原結合片段之細胞外組分；(b)包含效應域或其功能部分之細胞內組分；及(c)連接細胞外組分及細胞內組分之跨膜域。在一些實施例中，融合蛋白能夠與肽-MHC (pMHC)複合物結合(例如，特異性及/或選擇性地)，該肽-MHC複合物包含在MHC分子(例如，MHC I類分子)背景中之HPV16 E7 11-19免疫原性肽。在一些實施例中，MHC分子包含MHC α鏈，該鏈為HLA血清型HLA-A*02。在一些實施例中，HLA對偶基因係選自由以下組成之群：HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205、HLA-A*0206及HLA-A*0207對偶基因。在特定實施例中，HLA對偶基因為HLA-A*0201。
如本文所用，「效應域」或「免疫效應域」係融合蛋白或受體之細胞內部分或域，當接收到適當信號時，其可直接或間接促進細胞中之免疫反應。在一些實施例中，效應域係來自免疫細胞蛋白或其部分或免疫細胞蛋白複合物，當進行結合(例如，CD3ζ)時，或當該免疫細胞蛋白或其部分或免疫細胞蛋白複合物直接與標靶分子結合且觸發免疫細胞中之效應域之信號轉導時，該效應域接收信號。
當效應域含有一或多個信號傳導域或模體，諸如細胞內基於酪胺酸之活化模體(ITAM)，諸如在共刺激分子中發現之彼等時，其可直接促進細胞反應。不希望受理論束縛，咸信在T細胞受體或包含T細胞效應域之融合蛋白與配位體銜接之後，ITAM可用於T細胞活化。在一些實施例中，細胞內組分或其功能部分包含ITAM。示例性免疫效應域包括但不限於來自以下之彼等域：CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD79A、CD79B、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、Wnt、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2或其任何組合。在一些實施例中，效應域包含淋巴球受體信號傳導域(例如，CD3ζ或其功能部分或變異體)。
在其他實施例中，融合蛋白之細胞內組分包含選自以下之共刺激域或其功能部分：CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD2、CD5、ICAM-l (CD54)、LFA-l (CD11a/CD18)、ICOS (CD278)、GITR、CD30、CD40、BAFF-R、HVEM、LIGHT、MKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3、與CD83結合(例如，特異性及/或選擇性地)之配位體或其功能變異體，或其任何組合。在一些實施例中，細胞內組分包含CD28共刺激域或其功能部分或變異體(其可視情況包括在原生CD28蛋白之位置186-187處之LL-GG突變(例如，Nguyen等人 (2003) Blood702:4320)、4-1BB共刺激域或其功能部分或變異體，或兩者。
在一些實施例中，效應域包含CD3ε胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體。在其他實施例中，效應域包含CD27胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體。在其他實施例中，效應域包含CD28胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體。在其他實施例中，效應域包含4-1BB胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體。在其他實施例中，效應域包含OX40胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體。在其他實施例中，效應域包含CD2胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體。在其他實施例中，效應域包含CD5胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體。在其他實施例中，效應域包含ICAM-l胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體。在其他實施例中，效應域包含LFA-l胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體。在其他實施例中，效應域包含ICOS胞內域或其功能(例如，信號傳導)部分，或其功能變異體。
本發明所涵蓋之細胞外組分及細胞內組分藉由跨膜域連接。如本文所用，「跨膜域」係跨膜蛋白中可插入至細胞膜中或橫跨細胞膜之部分。跨膜域具有三維結構，該結構在細胞膜中熱力學穩定且長度一般介於約15個胺基酸至約30個胺基酸之範圍內。跨膜域之結構可包含α螺旋、β桶、β折疊、β螺旋或其任何組合。在一些實施例中，跨膜域包含或源自已知之跨膜蛋白(例如，CD4跨膜域、CD8跨膜域、CD27跨膜域、CD28跨膜域或其任何組合)。
在一些實施例中，融合蛋白之細胞外組分進一步包含安置於結合域與跨膜域之間的連接子。如本文中當提及融合蛋白中連接結合域與跨膜域之組分時所用，「連接子」可為具有約兩個胺基酸至約500個胺基酸之胺基酸序列，其可為藉由連接子連接之兩個區域、域、模體、片段或模組之間的構形移動提供可撓性及空間。舉例而言，本發明所涵蓋之連接子可使結合域遠離表現融合蛋白之宿主細胞之表面定位以使得能夠實現宿主細胞與標靶細胞之間的適當接觸、抗原結合及活化(Patel等人 (1999) Gene Therapy6:412-419)。連接子長度可基於所選標靶分子、所選結合抗原決定基或抗原結合域捕獲及親和力而變化以使抗原識別增至最大(參見例如Guest等人 (2005) Immunother.28:203-11，及PCT公開案第WO 2014/031687號)。示例性連接子包括具有甘胺酸-絲胺酸胺基酸鏈之彼等連接子，該甘胺酸-絲胺酸胺基酸鏈具有一個至約十個Gly xSer y重複序列，其中x及y各自獨立地為0至10之整數，其限制條件在於x及y不同時為0 (例如，(Gly 4Ser) 2、(Gly 3Ser) 2、Gly 2Ser或其組合，諸如((Gly 3Ser) 2Gly 2Ser))。
在一些實施例中，本發明涵蓋之結合蛋白可與部分共價連接。在一些實施例中，共價連接之部分包含親和力標籤或標記。親和力標籤可選自由以下組成之群：麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、鈣調蛋白結合蛋白(CBP)、蛋白C標籤、Myc標籤、HaloTag、HA標籤、Flag標籤、His標籤、生物素標籤及V5標籤。標記可為螢光蛋白。在一些實施例中，共價連接之部分係選自由以下組成之群：致炎因子、抗炎劑、細胞介素、毒素、細胞毒性分子、放射性同位素或抗體，諸如單鏈Fv。
結合蛋白可與用於成像、研究、治療學、治療診斷學、醫藥學、化學療法、螯合療法、靶向藥物遞送及放射療法之劑結合。在一些實施例中，結合蛋白可與可偵測劑結合或融合，該等可偵測劑諸如螢光團、近紅外染料、對比劑、奈米粒子、含金屬奈米粒子、金屬螯合物、X射線對比劑、PET劑、金屬、放射性同位素、染料、放射性核素螯合劑或可用於成像之另一合適材料。在一些實施例中，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個可偵測部分可連接至結合蛋白。放射性同位素之非限制性實例包括α發射體、β發射體、正電子發射體及γ發射體。在一些實施例中，金屬或放射性同位素係選自由以下組成之群：錒、鋂、鉍、鎘、銫、鈷、銪、釓、銥、鉛、鑥、錳、鈀、釙、鐳、釕、釤、鍶、鎝、鉈及釔。在一些實施例中，金屬為錒、鉍、鉛、鐳、鍶、釤或釔。在一些實施例中，放射性同位素為錒-225或鉛-212。在一些實施例中，近紅外染料不容易由生物組織及體液淬滅。在一些實施例中，螢光團係發射波長在650 nm與4000 nm之間的電磁輻射之螢光劑，此類發射用於偵測此類劑。可用作結合分子之螢光染料之非限制性實例包括DyLight-680、DyLight-750、VivoTag-750、DyLight-800、IRDye-800、VivoTag-680、Cy5.5、ZQ800或靛青綠(ICG)。在一些實施例中，近紅外染料通常包括花青染料(例如，Cy7、Cy5.5及Cy5)。用作根據本發明之結合分子之螢光染料的額外非限制性實例包括吖啶橙或吖啶黃、Alexa Fluors® (例如，Alexa Fluor® 790、750、700、680、660及647)及其任何衍生物、7-放線菌素D、8-苯胺基萘-1-磺酸、ATTO®染料及其任何衍生物、金胺-若丹明染色劑及其任何衍生物、苯蒽酮(bensantrhone)、比曼恩(bimane)、9-10-雙(苯基乙炔基)蒽、5,12-雙(苯基乙炔基)萘、雙苯甲醯亞胺、腦彩虹、鈣黃綠素、羧基螢光素及其任何衍生物、1-氯-9,10-雙(苯基乙炔基)蒽及其任何衍生物、DAPI、DiOC6、DyLight® Fluors®及其任何衍生物、艾吡可酮(epicocconone)、溴化乙錠、FlAsH-EDT2®、Fluo dye及其任何衍生物、FluoProbe®及其任何衍生物、螢光素及其任何衍生物、Fura®及其任何衍生物、GelGreen®及其任何衍生物、GelRed®及其任何衍生物、螢光蛋白及其任何衍生物、m同功型蛋白及其任何衍生物(諸如mCherry)、赫他明(hetamethine)染料及其任何衍生物、郝思特(hoeschst)染色劑、亞胺基香豆素、印度黃、indo-1及其任何衍生物、來若丹(laurdan)、螢光黃及其任何衍生物、螢光素及其任何衍生物、螢光素酶及其任何衍生物、部花青及其任何衍生物、尼羅染料(nile dye)及其任何衍生物、苝、焰紅染料(phloxine)、藻染料及其任何衍生物、碘化丙啶、比染因(pyranine)、若丹明及其任何衍生物、核糖綠、RoGFP、紅螢烯、二苯乙烯及其任何衍生物、磺醯若丹明及其任何衍生物、SYBR及其任何衍生物、突觸-pH敏感性綠色螢光蛋白(synapto-pHluorin)、四苯基丁二烯、tris四鈉、德州紅(Texas Red)、達旦黃(Titan Yellow)、TSQ、繖形酮、紫蒽酮、黃色螢光蛋白及YOYO-1。其他合適螢光染料包括但不限於螢光素及螢光素染料(例如，異硫氰酸螢光素或FITC、萘基螢光素、4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基螢光素、6-羧基螢光素或FAM等)、羧花青、部花青、苯乙烯染料、氧雜菁染料(oxonol dye)、藻紅蛋白、紅螢素、曙紅、若丹明染料(例如，羧基四甲基-若丹明或TAMRA、羧基若丹明6G、羧基-X-若丹明(ROX)、麗絲胺若丹明B (lissamine rhodamine B)、若丹明6G、若丹明綠、若丹明紅、四甲基若丹明(TMR)等)、香豆素及香豆素染料(例如，甲氧基香豆素、二烷基胺基香豆素、羥基香豆素、胺基甲基香豆素(AMCA)等)、Oregon Green™染料(例如，Oregon Green™ 488、Oregon Green™ 500、Oregon Green™ 514等)、Texas Red®、Texas Red®-X、SPECTRUM RED®、SPECTRUM GREEN®、花青染料(例如，CY-3、Cy-5、CY-3.5、CY-5.5等)、Alexa Fluor®染料(例如，Alexa Fluor® 350、Alexa Fluor® 488、Alexa Fluor® 532、Alexa Fluor® 546、Alexa Fluor® 568、Alexa Fluor® 594、Alexa Fluor® 633、Alexa Fluor® 660、Alexa Fluor® 680等)、BODIPY®染料(例如，BODIPY® FL、BODIPY® R6G、BODIPY® TMR、BODIPY® TR、BODIPY® 530/550、BODIPY® 558/568、BODIPY® 564/570、BODIPY® 576/589、BODIPY® 581/591、BODIPY® 630/650、BODIPY® 650/665等)、IRDye (例如，IRD40™、IRD 700™、IRD 800™等)及其類似物。此項技術中熟知額外合適之可偵測劑(例如PCT公開案No. PCT/US14/56177)。放射性同位素之非限制性實例包括α發射體、β發射體、正電子發射體及γ發射體。在一些實施例中，金屬或放射性同位素係選自由以下組成之群：錒、鋂、鉍、鎘、銫、鈷、銪、釓、銥、鉛、鑥、錳、鈀、釙、鐳、釕、釤、鍶、鎝、鉈及釔。在一些實施例中，金屬為錒、鉍、鉛、鐳、鍶、釤或釔。在一些實施例中，放射性同位素為錒-225或鉛-212。
結合蛋白可與放射增敏劑或光敏劑結合。放射增敏劑之實例包括但不限於：ABT-263、ABT-199、WEHI-539、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、吉西他濱(gemcitabine)、依他硝唑(etanidazole)、米索硝唑(misonidazole)、替拉紮明(tirapazamine)及核酸鹼基衍生物(例如，鹵化嘌呤或嘧啶，諸如5-氟去氧尿苷)。光敏劑之實例包括但不限於：發光時產生熱之螢光分子或珠粒、奈米粒子、卟啉及卟啉衍生物(例如，二氫卟酚、細菌綠素(bacteriochlorin)、異細菌綠素、酞青及萘酞青)、金屬卟啉、金屬酞青、白芷素、硫屬元素哌喃鹽染料(chalcogenapyrrillium dye)、葉綠素、香豆素、黃素及相關化合物(諸如咯嗪及核黃素)、富勒烯(fullerene)、去鎂葉綠素酸(pheophorbide)、焦去鎂葉綠素酸、花青(例如，部花青540)、去鎂葉綠素、噻呋啉(sapphyrin)、特沙呋啉(texaphyrin)、紫紅素(purpurin)、卟啉烯、吩噻嗪鎓(phenothiazinium)、亞甲藍衍生物、萘二甲醯亞胺、尼羅藍衍生物、醌類、苝醌(例如金絲桃素(hypericin)、竹紅菌素(hypocrellin)及尾孢菌素(cercosporin))、補骨脂素(psoralen)、醌類、類視色素(retinoid)、若丹明、噻吩、威爾丁(verdin)、呫噸染料(xanthene dye) (例如曙紅、紅螢素、孟加拉玫紅(rose bengal))、卟啉之二聚物及寡聚物形式，以及諸如5-胺基乙醯丙酸之前藥。有利地，此方法允許同時使用治療劑(例如，藥物)及電磁能(例如，輻射或光)兩者高特異性靶向所關注細胞(例如，免疫細胞)。在一些實施例中，結合蛋白與該劑融合，或與該劑共價或非共價連接，例如直接連接或經由連接子連接。
在一些實施例中，結合蛋白可經化學修飾。舉例而言，可使結合蛋白發生突變以修飾肽特性，諸如可偵測性、穩定性、生物分佈、藥物動力學、半衰期、表面電荷、疏水性、結合位點、pH、功能及其類似特性。N-甲基化係可在本發明所涵蓋之結合蛋白中發生之甲基化之一個實例。在一些實施例中，可藉由對遊離胺進行甲基化，諸如藉由用甲醛及氰基硼氫化鈉進行還原甲基化來修飾結合蛋白。
化學修飾可包含聚合物、聚醚、聚乙二醇、生物聚合物、兩性離子聚合物、聚胺基酸、脂肪酸、樹枝狀聚合物、Fc區、簡單飽和碳鏈(諸如棕櫚酸酯或肉豆蔻酸酯)或白蛋白。具有Fc區之結合蛋白之化學修飾可為融合Fc-蛋白。聚胺基酸可包括例如具有重複之單個胺基酸之聚胺基酸序列(例如聚甘胺酸)，及具有可遵循或可不遵循一模式之混合聚胺基酸序列之聚胺基酸序列，或前述之任何組合。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之結合蛋白可經修飾。在一些實施例中，該等修飾與親本結合蛋白具有實質或顯著序列一致性以產生維持親本結合蛋白之一或多種生物物理及/或生物學活性(例如，維持pMHC結合特異性)之功能變異體。在一些實施例中，突變為保守胺基酸取代。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之結合蛋白可包含合成胺基酸來替代一或多個天然存在之胺基酸。此類合成胺基酸係所屬領域中熟知的，且包括例如胺基環己烷甲酸、正白胺酸、a-胺基正癸酸、高絲胺酸、S-乙醯胺基甲基-半胱胺酸、反式-3-羥基脯胺酸及反式-4-羥基脯胺酸、4-胺基苯丙胺酸、4-硝基苯丙胺酸、4-氯苯丙胺酸、4-羧基苯丙胺酸、β-苯基絲胺酸β-羥基苯丙胺酸、苯基甘胺酸、a-萘基丙胺酸、環己基丙胺酸、環己基甘胺酸、吲哚啉-2-甲酸、1,2,3,4-四氫異喹啉-3-甲酸、胺基丙二酸、胺基丙二酸單醯胺、N'-苯甲基-N'-甲基-離胺酸、Ν',Ν'-二苯甲基-離胺酸、6-羥基離胺酸、鳥胺酸、a-胺基環戊烷甲酸、oc-胺基環己烷甲酸、a-胺基環庚烷甲酸、a-(2-胺基-2-降莰烷)-甲酸、α,γ-二胺基丁酸、β-二胺基丙酸、高苯丙胺酸及oc-第三丁基甘胺酸。
本發明所涵蓋之結合蛋白可經糖基化、醯胺化、羧化、磷酸化、酯化、N-醯化、環化(例如，經由二硫橋)，或轉化為酸加成鹽，及/或視情況二聚化或聚合或結合。
在一些實施例中，可使用疏水性部分之附接(諸如附接至N端、C端或內部胺基酸)來延長本發明所涵蓋之肽之半衰期。在其他實施例中，結合蛋白可包括可影響例如血清半衰期之轉譯後修飾(例如，甲基化及/或醯胺化)。在一些實施例中，簡單碳鏈(例如，藉由肉豆蔻醯化及/或棕櫚醯化)可與結合蛋白結合。在一些實施例中，簡單碳鏈可使結合蛋白容易與未結合材料分離。舉例而言，可用於使結合蛋白與未結合材料分離之方法包括但不限於溶劑萃取及逆相層析。親脂部分可經由與血清白蛋白可逆結合來延長半衰期。經結合之部分可為經由與血清白蛋白可逆結合來延長肽之半衰期的親脂部分。在一些實施例中，親脂部分可為膽固醇或膽固醇衍生物，包括膽甾烯、膽甾烷、膽甾二烯及氧化固醇。在一些實施例中，結合蛋白可與肉豆蔻酸(十四烷酸)或其衍生物結合。在其他實施例中，結合蛋白可與半衰期修飾劑偶合(例如，結合)。半衰期修飾劑之實例包括但不限於：聚合物、聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉、聚乙烯醇、水溶性聚合物、兩性離子水溶性聚合物、水溶性聚(胺基酸)、脯胺酸、丙胺酸及絲胺酸之水溶性聚合物、含有甘胺酸、麩胺酸及絲胺酸之水溶性聚合物、Fc區、脂肪酸、棕櫚酸、或與白蛋白結合之分子。在一些實施例中，間隔子或連接子可與結合蛋白偶合，諸如用作間隔子或連接子之1個、2個、3個、4個或更多個胺基酸殘基，以便促進與另一分子之結合或融合，以及促進肽自此類結合或融合之分子裂解。在一些實施例中，結合蛋白可與例如可修飾或實現結合蛋白之特性之變化的其他部分結合。
結合蛋白可諸如藉由固相肽合成或溶液相肽合成以重組或合成方式產生。可藉由已知之合成方法，諸如使用茀基甲氧羰基(Fmoc)化學或藉由丁氧羰基(Boc)化學來進行多肽合成。多肽片段可以酶或合成方式接合在一起。
在本發明所涵蓋之一態樣中，本文提供產生本文所述之結合蛋白之方法，其包括以下步驟：(i)在適合允許結合蛋白表現之條件下培養經轉型之宿主細胞，該宿主細胞已藉由包含編碼該結合蛋白之序列之核酸轉型；及(ii)回收所表現之結合蛋白。
舉例而言，可用於分離及純化重組產生之結合蛋白之方法可包括自將結合蛋白分泌至培養基中之合適宿主細胞/載體系統獲得上清液，及接著使用市售過濾器濃縮培養基。濃縮後，可將濃縮物應用於單一合適純化基質或一系列合適基質，諸如親和力基質或離子交換樹脂。可採用一或多個逆相HPLC步驟來進一步純化重組多肽。當自天然環境中分離免疫原時，亦可使用此等純化方法。用於大規模製造本文所述之一或多種結合蛋白之方法包括批量細胞培養，對其進行監測及控制以維持適當培養條件。可根據本文中所描述且在所屬領域中已知之方法來純化結合蛋白。
在本文揭示之任何實施例中，編碼之結合蛋白能夠與包含在MHC分子(例如，MHC I類分子)背景中之HPV16 E7 11-19免疫原性肽的肽-MHC (pMHC)複合物結合。在一些實施例中，MHC分子包含MHC α鏈，該鏈為HLA血清型HLA-A*02。在一些實施例中，HLA對偶基因係選自由以下組成之群：HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205、HLA-A*0206及HLA-A*0207對偶基因。
熟知多種用於評估結合親和力及/或確定結合分子是否與特定配位體(例如，肽抗原-MHC複合物)結合(例如，特異性及/或選擇性地)之分析。諸如藉由使用所屬領域中熟知之多種結合分析中之任一者來測定結合蛋白對標靶(諸如標靶多肽之T細胞肽抗原決定基)之結合親和力係在熟練技術人員之水準內。舉例而言，在一些實施例中，可使用Biacore™機器來測定兩種蛋白質之間的複合物之結合常數。可藉由監測當緩衝液通過晶片時折射率相對於時間之變化來測定複合物之解離常數(K D)。用於量測一種蛋白質與另一蛋白質之結合的其他合適分析包括例如免疫分析，諸如酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)及放射免疫分析(RIA)，或藉由經由螢光、UV吸收、圓二色性或核磁共振(NMR)監測蛋白質之光譜或光學特性之變化來測定結合。其他示例性分析包括但不限於西方墨點法、ELISA、分析性超速離心、光譜分析及表面電漿子共振(Biacore™)分析(參見例如Scatchard等人 (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci.51:660；Wilson (2002) Science295:2103；Wolff等人 (1993) Cancer Res.53:2560；及美國專利第5,283,173號及第5,468,614號)、流動式細胞測量術、定序及用於偵測所表現之核酸之其他方法。在一實例中，藉由使用經標記之多聚體，諸如MHC-抗原四聚體，例如藉由流動式細胞測量術評估與各種濃度之四聚體之結合來量測對標靶之表觀親和力。在一代表性實例中，使用一系列濃度之經標記之四聚體的2倍稀釋來量測結合蛋白之表觀K D，接著藉由非線性回歸來確定結合曲線，表觀K D經測定為產生半最大結合之配位體濃度。 III .核酸及載體
在本發明所涵蓋之一態樣中，本文提供核酸分子，其編碼本文所述之結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段、CAR及其類似物)、肽及其片段。
在一些實施例中，核酸分子在嚴格條件下與諸如在全長上與編碼選自由表1中所列之多肽序列組成之群的多肽的核酸具有至少約至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致性之序列的補體雜交。
在一些實施例中，核酸分子在嚴格條件下與編碼選自由表1中所列之多肽序列組成之群的多肽的核酸之補體雜交。
在一些實施例中，核酸分子包含編碼選自由表1中所列之多肽序列組成之群的多肽之核苷酸序列(例如，包含其、基本上由其組成或由其組成)。
在一些實施例中，核酸包含編碼至少一種(例如，一種、兩種或三種)表1中所述之TCR α鏈CDR的核苷酸序列(例如，包含其、基本上由其組成或由其組成)。在一些實施例中，核酸包含編碼具有與表1中所述之TCR V α域序列至少約至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致之胺基酸序列的TCR V α域的核苷酸序列(例如，包含其、基本上由其組成或由其組成)。在一些實施例中，核酸包含編碼具有與表1中所述之TCR α鏈序列至少約至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致之胺基酸序列的TCR α鏈的核苷酸序列(例如，包含其、基本上由其組成或由其組成)。
在一些實施例中，核酸包含編碼至少一種(例如，一種、兩種或三種)表1中所述之TCR β鏈CDR的核苷酸序列(例如，包含其、基本上由其組成或由其組成)。在一些實施例中，核酸包含編碼具有與表1中所述之TCR V β域序列至少約至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致之胺基酸序列的TCR V β域的核苷酸序列(例如，包含其、基本上由其組成或由其組成)。在一些實施例中，核酸包含編碼具有與表1中所述之TCR β鏈序列至少約至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致之胺基酸序列的TCR β鏈的核苷酸序列(例如，包含其、基本上由其組成或由其組成)。
術語「核酸」包括「多核苷酸」、「寡核苷酸」及「核酸分子」，且通常意謂DNA或RNA之聚合物，其可為單股或雙股，自天然來源合成或獲得(例如，分離及/或純化)，其可含有天然、非天然或改變之核苷酸，且可含有天然、非天然或改變之核苷酸間鍵，諸如胺基磷酸酯鍵或硫代磷酸酯鍵，而不是在未修飾之寡核苷酸之核苷酸之間發現的磷酸二酯。在一個實施例中，核酸包含互補DNA (cDNA)。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之核酸為重組的。如本文所用，術語「重組」係指(i)藉由將天然或合成核酸區段與可在活細胞中復制之核酸分子接合而在活細胞外構築之分子，或(ii)由上面(i)中描述之彼等分子之複製產生的分子。出於本文之目的，複製可為活體外/離體復制或活體內復制。
可使用所屬領域已知之程序基於化學合成及/或酶促連接反應構築核酸。例如參見Green及Sambrook等人, 上述。舉例而言，可使用天然存在之核苷酸或各種經修飾之核苷酸化學合成核酸，此等核苷酸經設計以提高分子之生物學穩定性或提高雜交後形成之雙鏈體之物理穩定性(例如硫代磷酸酯衍生物及經吖啶取代之核苷酸)。可用於產生核酸之經修飾之核苷酸的實例包括但不限於5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙醯胞嘧啶、5-(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基胺基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基奎苷、肌苷、N 6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N 6-取代之腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基胺基甲基尿嘧啶、5-甲氧基胺基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基奎苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N 6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、懷丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、奎苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3-(3-胺基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶及2,6-二胺基嘌呤。或者，本發明所涵蓋之一或多種核酸可購自公司，諸如Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)。
在一個實施例中，核酸包含密碼子最佳化之核苷酸序列。不受特定理論或機制之束縛，據信核苷酸序列之密碼子最佳化提高mRNA轉錄本之轉譯效率。核苷酸序列之密碼子最佳化可能涉及將天然密碼子取代為另一個編碼相同胺基酸，但可由細胞內更容易獲得之tRNA轉譯之密碼子，從而提高轉譯效率。核苷酸序列之最佳化亦可減少會干擾轉譯之二級mRNA結構，從而提高轉譯效率。在一些實施例中，本文所述之核苷酸序列針對在宿主細胞(例如，免疫細胞，例如T細胞)中之表現進行密碼子最佳化。
本發明亦提供一種核酸，其包含與本文所述之任何核酸之核苷酸序列互補的核苷酸序列或在嚴格條件下與本文所述之任何核酸之核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
在嚴格條件下雜交之核苷酸序列可在高嚴格條件下雜交。「高嚴格條件」意謂核苷酸序列以比非特異性雜交可偵測地強的量與標靶序列(本文所述之任何核酸之核苷酸序列)特異性雜交。高嚴格條件包括將具有精確互補序列之多核苷酸或僅含有少數分散錯配之多核苷酸與恰好具有與核苷酸匹配之幾個小區域(例如，3-10個鹼基)之隨機序列區分開來的條件。與14-17個或更多個鹼基之全長補體相比，此類互補之小區域更容易融化，且高嚴格雜交使其易於區分。相對高之嚴格條件將包括例如低鹽及/或高溫條件，諸如由約0.02-0.1 M NaCl或等效物在約50-70℃之溫度下提供。此類高嚴格條件幾乎不容許核苷酸序列與模板或標靶股之間的錯配，且特別適合偵測任何本發明之TCR之表現。普遍理解，藉由添加遞增量之甲醯胺可使條件變得更加嚴格。
本發明亦提供一種核酸，其包含與本文所述之任何核酸至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的核苷酸序列。
通常，該核酸為DNA或RNA分子，其可包括於合適載體，諸如質體、黏質體、游離基因組、人工染色體、噬菌體或病毒載體中。
術語「載體」、「選殖載體」及「表現載體」意謂可將DNA或RNA序列(例如，外來基因)引入至宿主細胞中，以便將宿主轉型且促進所引入序列之表現(例如，轉錄及轉譯)的媒劑。因此，本發明所涵蓋之另一目標係關於一種包含本發明所涵蓋之核酸之載體。
此類載體可包含調控元件，諸如啟動子、增強子、終止子及其類似物，以在向個體投與後引起或引導該多肽之表現。用於動物細胞表現載體之啟動子及增強子之實例包括SV40之早期啟動子及增強子(Mizukami T等人 1987)、莫洛尼小鼠白血病病毒之LTR啟動子及增強子(Kuwana Y等人 1987)、免疫球蛋白H鏈之啟動子(Mason J O等人 1985)及增強子(Gillies S D等人 1983)及其類似物。
可使用任何動物細胞表現載體。合適載體之實例包括pAGE107 (Miyaji H等人 1990)、pAGE103 (Mizukami T等人 1987)、pHSG274 (Brady G等人 1984)、pKCR (O'Hare K等人 1981)、pSG1 β d2-4-(Miyaji H等人 1990)及其類似物。質體之其他代表性實例包括包含複製起點之複製質體，或整合質體，諸如pUC、pcDNA、pBR及其類似物。病毒載體之代表性實例包括腺病毒、逆轉錄病毒、慢病毒、疱疹病毒及AAV載體。此類重組病毒可藉由所屬領域中已知之技術產生，諸如藉由轉染包裝細胞或藉由用輔助質體或病毒瞬時轉染產生。病毒包裝細胞之典型實例包括PA317細胞、PsiCRIP細胞、GPenv陽性細胞、293細胞等。用於產生此類複制缺陷型重組病毒之詳細方案為所屬領域中熟知且可見於例如PCT公開案WO 95/14785、PCT公開案WO 96/22378、美國專利第5,882,877號、美國專利第6,013,516號、美國專利第4,861,719號、美國專利第5,278,056號及PCT公開案WO 94/19478。
在一些實施例中，表現載體為奈米質體。本文中使用之術語「奈米質體」係指具有減少之細菌序列的環狀DNA序列，其為所需載物插入物提供較小質粒。載體之尺寸減小引起轉染時DNA誘發之毒性有限且可能在細胞中持續更長時間，可能在細胞中持續更長時間，可能在轉染之後活力更佳，且可能易位效率更高。在一些實施例中，奈米質體為無抗生素抗性標記物之奈米質體。在一些實施例中，奈米質體包含選擇標記物及/或無義抑制基因標記物。由於骨架尺寸小，例如＜500 bp骨架，所以此類奈米質體最大化所需載物插入物之尺寸。所需載物插入物(例如真核轉殖基因)可為可遞送至標靶細胞之任何尺寸，例如至多50 kb、45 kb、40 kb、35 kb、30 kb、25 kb、20 kb、18 kb、15 kb、12 kb、10 kb、5.0 kb、4.5 kb、4.0 kb、3.5 kb、3.0 kb、2.8 kb、2.5 kb、2.2 kb、2 kb、1.8 kb、1.5 kb、1.2 kb、1 kb或之間的任何範圍，包括端點，諸如8-12 kb。其亦提供高轉殖基因表現且減少轉殖基因沉默，使與載物在經工程改造之細胞之基因組中之無規整合相關的載物之整合效率可調。
在一些實施例中，奈米質體可包含表3中提供之載體中所示的元件(例如R6K及RNA-OUT)。舉例而言，在一些實施例中，奈米質體包含最小化的細菌ColE1或R6K複製起點(其使此類奈米質體在細菌宿主菌株中可複製)、可選擇標記物(例如細菌RNA可選擇標記物)及真核基因區。RNA可選擇標記物為載體負載的表現的非轉譯RNA，其調節染色體表現之標靶基因，以選擇該載體。此可為質體負載的無義抑制tRNA，其調節無義可抑制之可選擇染色體標靶，諸如美國專利第6,977,174號中描述且以引用之方式併入本文中。此亦可為質體負載的反義抑制RNA、抑制RNA-IN調節之標靶的RNA-OUT基因、抑制RNAII調節之標靶的pMB1質體起點編碼之RNAI、抑制RNA II調節之標靶的IncB質體pMU720起點編碼之RNAI、抑制Hok調節之標靶的質體RI之ParB基因座Sok、抑制flmA調節之標靶的F質體之Flm基因座FlmB、諸如例如Wagner等人 (2002) Adv. Genet.46:361及Franch及Gerdes (2000) Current Opin. Microbiol.3:159中描述之天然反義抑制RNA或經工程改造之抑制RNA，諸如小的合成小RNA，如SgrS、MicC或MicF骨架，如Park等人 (2013) Nature Biotechnology31:170-174中所述。
由無抗生素之RNA-OUT選擇系統及製造此類奈米質體之方法產生的示例性奈米質體描述於例如PCT公開案第WO 2008153733號、美國專利第9,737,620號、美國專利公開案第2010/0303859號及美國專利第9,109,012號，以引用之方式整體併入本文中。額外示例性奈米質體描述於例如PCT申請案第PCT/US2013/000259號、第PCT/US2013/00067號及第PCT/US2013/00068號以及美國專利公開案第2015/0275221號，各以引用之方式整體併入本文中。
奈米質體可購得。舉例而言，Nature Technology公司(Aldevron子公司)提供奈米質體載體，其將RNA可選擇標記物與R6K、ColE2或ColE2相關之複製起點組合。此等奈米質體載體包括例如NTC9385C、NTC9685C、NTC9385R、NTC9685R載體以及其修飾，諸如PCT申請案第PCT/US 13/00068號中揭示之彼等載體；NTC9385R-BE、NTC9385Ra-O1及NTC9385Ra-O2載體，諸如美國專利第10,144,935號中所述；以及NTC9385C2、NTC9385C2a、NTC9385R2、NTC9385R2a、NTC9385R2b、NTC9385Ra、NTC9385RaF及NTC9385RbF複製型小環載體，諸如美國專利公開案第2021/0189407號中所述，各以引用之方式整體併入本文中。
在一些實施例中，組合物包含表現載體，該表現載體包含編碼本文所述之結合蛋白或多肽或其片段之開讀框。在一些實施例中，核酸包括表現開讀框所必需之調控元件。此類元件可包括例如啟動子、起始密碼子、終止密碼子及聚腺苷酸化信號。另外，可包括增強子。此等元件可操作地連接至編碼結合蛋白、多肽或其片段之序列。
在一些實施例中，載體進一步包含編碼CD8α、CD8β、顯性負性TGFβ受體(例如DN-TGFβRII)、可選擇蛋白質標記物之核酸序列，視情況其中該可選擇蛋白質標記物為二氫葉酸還原酶(DHFR)。在某些實施例中，編碼CD8α、CD8β、DN-TGFβR及/或可選擇蛋白質標記物之核酸序列可操作地連接至編碼標籤(例如，CD34富集標籤)之核酸。在特定實施例中，本文所述之核酸序列，諸如編碼TCRα、TCRβ、CD8α、CD8β、DN-TGFβR及/或可選擇蛋白質標記物之核酸序列與內部核糖體進入位點或編碼自裂解肽(例如P2A、E2A、F2A或T2A)之核酸序列等相互連接。
在一些實施例中，本文提供之表現載體包含與SEQ ID NO. 27中所述之任何核酸至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的核苷酸序列。
啟動子之實例包括但不限於來自猿病毒40 (SV40)之啟動子；小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子；來自人類免疫缺乏病毒(HIV)之啟動子，諸如HIV長末端重複序列(LTR)啟動子；來自莫洛尼病毒之啟動子；來自巨細胞病毒(CMV)之啟動子，諸如CMV即刻早期啟動子；來自愛普斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr Virus，EBV)之啟動子；來自勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，RSV)之啟動子；以及來自諸如人類肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅蛋白、人類肌肉肌酸及人類金屬硫蛋白之人類基因之啟動子。合適聚腺苷酸化信號之實例包括但不限於SV40聚腺苷酸化信號及LTR聚腺苷酸化信號。
除表現所需之調控元件以外，核酸分子中亦可包括其他元件。此類額外元件包括增強子。增強子包括上文所述之啟動子。在一些實施例中，增強子/啟動子包括例如人類肌動蛋白、人類肌凝蛋白、人類血紅蛋白、人類肌肉肌酸及病毒增強子，諸如來自CMV、RSV及EBV之彼等增強子/啟動子。
在一些實施例中，核酸可操作地併入如下文進一步描述之載劑或遞送載體中。可用遞送載體包括但不限於生物可降解微膠囊、免疫刺激複合物(ISCOM)或脂質體以及經基因工程改造之減毒活載劑，諸如病毒或細菌。
在一些實施例中，載體為病毒載體，諸如慢病毒、逆轉錄病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相關病毒、痘瘡病毒、桿狀病毒、鷄痘(Fowl pox)病毒、禽痘(AV-pox)病毒、經修飾之安卡拉痘瘡(MVA)病毒及其他重組病毒。舉例而言，慢病毒載體可用於感染T細胞。
在一些實施例中，重組表現載體能夠將多核苷酸遞送至合適宿主細胞，例如T細胞或抗原呈現細胞，亦即在其細胞表面上展示肽/MHC複合物之細胞(例如，樹突狀細胞)且缺乏CD8。在一些實施例中，宿主細胞為免疫細胞，諸如人類免疫系統細胞。例如，免疫系統細胞可為CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4/CD8雙陰性T細胞、gd T細胞、自然殺手細胞、樹突狀細胞或其任何組合。在一些實施例中，其中T細胞為宿主，T細胞可為初始T細胞、中央記憶T細胞、效應記憶T細胞或其任何組合。因此，重組表現載體亦可包括例如淋巴組織特異性轉錄調控元件(TRE)，諸如B淋巴球、T淋巴球或樹突狀細胞特異性TRE。淋巴組織特異性TRE為所屬領域中已知(參見例如Thompson等人 (1992) Mol. Cell. Biol.72:1043；Todd等人 (1993) J. Exp. Med.777:1663；及Penix等人 (1993) J. Exp. Med.775:1483)。
在一些實施例中，重組表現載體包含編碼TCR α 鏈、TCR β鏈及/或連接子肽之核苷酸序列。例如，在一些實施例中，重組表現載體包含編碼結合蛋白之全長TCR α及TCR β鏈(其中連接子位於之間)之核苷酸序列，其中編碼β鏈之核苷酸序列位於編碼α鏈之核苷酸序列之5'。在一些實施例中，核苷酸序列編碼全長TCR α及TCR β鏈(其中連接子位於之間)，其中編碼TCR β鏈之核苷酸序列位於編碼TCR α鏈之核苷酸序列之3'。在一些實施例中，全長TCR α及/或TCR β鏈經其片段替換。
如下進一步所述，本發明所涵蓋之另一態樣係關於一種已經根據本發明之核酸及/或載體轉染、感染或轉型之細胞。宿主細胞可包括任何可接受載體或併入核酸及/或蛋白質之個別細胞或細胞培養物，以及任何子代細胞。該術語亦涵蓋宿主細胞之後代，無論在遺傳學上或表型上相同或不同。合適宿主細胞可視載體而定，且可包括哺乳動物細胞、動物細胞、人類細胞、猿細胞、昆蟲細胞、酵母細胞及細菌細胞。此等細胞可藉由使用病毒載體、經由磷酸鈣沈澱轉型、DEAE-葡聚醣、電穿孔、顯微注射或其他方法來誘導併入載體或其他材料(參見例如Sambrook等人(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第 2 版(Cold Spring Harbor Laboratory))。術語「轉型」意謂將「外來」(亦即，外部或細胞外)基因、DNA或RNA序列引入宿主細胞，使得宿主細胞將表現所引入之基因或序列，從而產生所需物質，通常為由所引入之基因或序列編碼之蛋白質或酶。接受且表現所引入之DNA或RNA之宿主細胞已「經轉型」。
舉例而言，在一些實施例中，經工程改造之免疫細胞(例如T細胞)可包含如下全T細胞(CD4 +與CD8 +T細胞)，其藉由轉座子/轉座酶介導之基因遞送進行工程改造以表現編碼諸如重組T細胞受體(TCR)之α及β鏈之元件的遺傳載物，該重組T細胞受體對特定MHC上呈現之既定標靶抗原(例如I類HLA)具有特異性。額外元件可由載體表現，諸如選自由以下組成之群之一或多個元件：a)能夠接合CD4 +T細胞之CD8α及CD8β共受體；b)與CD8α之胺基端融合的CD34來源之QBEND/10抗原決定基標籤以能夠在活體外及活體內追蹤經工程改造之細胞；c)顯性負性II型TGFβ受體(DN-TGFβRII)以克服腫瘤介導之免疫抑制；及d)選擇標記物，諸如二氫葉酸還原酶(DHFRdm)之突變形式，以在製造過程期間便於富集經工程改造之細胞。外源TCR之α及β鏈及CD8之α及β鏈可在單一啟動子(諸如鼠科幹細胞病毒(MSCV)啟動子)控制下由單一mRNA分子編碼。在自裂解肽元件(諸如P2A位點)處之轉譯後加工可產生獨立多肽，以致於產生與載體中之各元件對應的四種個別多肽。類似地，DN-TGFβRII及DHFRdm可由經單一啟動子(諸如人類延伸因子1α (EF1α)啟動子)驅動之單一mRNA分子編碼。在自裂解肽元件(諸如P2A位點)處之轉譯後加工可產生與載體中之各個別元件對應的獨立多肽。
本發明所涵蓋之核酸可用於在合適表現系統中產生本發明所涵蓋之重組多肽。術語「表現系統」意謂在合適條件下例如表現由載體所攜帶且引入至宿主細胞之外來DNA編碼之蛋白質的宿主細胞及相容性載體。
常見表現系統包括大腸桿菌宿主細胞及質體載體、昆蟲宿主細胞及桿狀病毒載體以及哺乳動物宿主細胞及載體。宿主細胞之其他實例包括但不限於原核細胞(諸如細菌)及真核細胞(諸如酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等)。特定實例包括大腸桿菌；克魯維酵母屬( Kluyveromyces)或酵母屬( Saccharomyces)酵母；哺乳動物細胞株(例如，Vero細胞、CHO細胞、3T3細胞、COS細胞等)；以及初級或所建立之哺乳動物細胞培養物(例如，由淋巴母細胞、纖維母細胞、胚胎細胞、上皮細胞、神經細胞、脂肪細胞等產生)。實例亦包括小鼠SP2/0-Ag14細胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、二氫葉酸還原酶基因(下文稱為「DHFR基因」)缺陷型CHO細胞(Urlaub G等人(1980))、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC CRL 1662，下文稱為「YB2/0細胞」)及其類似細胞。在一些實施例中，使用YB2/0細胞，因為當在此細胞中表現時，嵌合或人類化結合蛋白之ADCC活性有所增強。
本發明亦涵蓋產生表現本發明所涵蓋之結合蛋白、肽及其片段之重組宿主細胞的方法，該方法包括由以下組成之步驟：(i)將如上文所述之重組核酸或載體活體外或離體引入至勝任宿主細胞中，(ii)活體外或離體培養所獲得之重組宿主細胞，及(iii)視情況，選擇表現該等結合蛋白、肽及其片段之細胞。此類重組宿主細胞可用於本發明所涵蓋之診斷、預後及/或治療方法。
在另一態樣中，本發明提供經分離之核酸，其在選擇性雜交條件下與本文所揭示之多核苷酸雜交。因此，此實施例之多核苷酸可用於分離、偵測及/或定量包含此類多核苷酸之核酸。舉例而言，本發明所涵蓋之多核苷酸可用於鑑定、分離或擴增寄存文庫中之部分或全長純系。在一些實施例中，多核苷酸為自人類或哺乳動物核酸文庫分離或以其他方式與來自該文庫之cDNA互補的基因組序列或cDNA序列。在一些實施例中，cDNA文庫包含至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多，或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如至少約80%-100%之全長序列。可將cDNA文庫正規化以增加稀有序列之表示。低嚴格或中等嚴格雜交條件通常但非排他地用於相對於互補序列具有降低之序列一致性的序列。中等嚴格及高嚴格條件可視情況用於具更高一致性之序列。低嚴格條件允許具有約70%序列一致性之序列的選擇性雜交，且可用於鑑定直系同源或同種同源序列。視情況，本發明所涵蓋之多核苷酸將編碼由本文所述之多核苷酸編碼之結合蛋白的至少一部分。本發明所涵蓋之多核苷酸包括可用於與編碼本發明所涵蓋之結合蛋白之多核苷酸選擇性雜交的核酸序列(參見例如Ausubel, 上述及Colligan, 上述)。 IV. 宿主細胞
在本發明所涵蓋之一態樣中，本文提供宿主細胞，其表現本文所述之結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段、CAR或包含TCR及效應域之融合蛋白)。在一些實施例中，宿主細胞包含本文所述之核酸或載體。
在一些實施例中，編碼結合蛋白之多核苷酸用於轉型、轉染或轉導宿主細胞(例如，T細胞)以用於授受性轉移療法。已描述核酸定序及特定TCR定序之進展(例如，Robins等人 (2009) Blood114:4099；Robins等人 (2010) Sci. Translat. Med.2:47ra64；Robins等人 (2011) J. Imm. Meth.；及Warren等人 (2011) Genome Res.21:790)且可在實踐本發明所涵蓋之實施例之過程中採用。類似地，用所需核酸轉染或轉導T細胞之方法為所屬領域中熟知(例如，美國專利公開案第US 2004/0087025號)以及使用具有所需抗原特異性之T細胞之授受性轉移程序(例如，Schmitt等人(2009) Hum. Gen.20:1240；Dossett等人 (2009) Mol. Ther.77:742；Till等人 (2008) Blood772:2261；Wang等人 (2007) Hum. Gene Ther.18:112；Kuball等人 (2007) Blood709:2331；美國專利公開案2011/0243972；美國專利公開案2011/0189141；及Leen等人 (2007) Ann. Rev. Immunol.25:243)。
可修飾任何合適之免疫細胞以包括本發明所涵蓋之異源多核苷酸，包括例如T細胞、NK細胞或NK-T細胞。在一些實施例中，細胞可為初級細胞或細胞株之細胞。在一些實施例中，經修飾之免疫細胞包含CD4 +T細胞、CD8 +T細胞或兩者。出於本文之目的，T細胞可為任何T細胞，諸如培養之T細胞，例如初級T細胞，或來自培養之T細胞株之T細胞，例如Jurkat、SupTl等，或自哺乳動物獲得之T細胞。若自哺乳動物獲得，則T細胞可自多種來源獲得，包括但不限於血液、骨髓、淋巴結、胸腺或其他組織或體液。T細胞亦可富集或純化。在一些實施例中，T細胞為人類T細胞。在一些實施例中，T細胞為自人類分離之T細胞。T細胞可為任何類型之T細胞，且可處於任何發育階段，包括但不限於細胞毒性淋巴球、細胞毒性淋巴球前驅細胞、細胞毒性淋巴球先驅細胞、細胞毒性淋巴球幹細胞、CD4 +/CD8 +雙陽性T細胞、CD4 +輔助T細胞(例如Th1及Th2細胞)、CD4 +T細胞、CD8 +T細胞(例如，細胞毒性T細胞)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、記憶T細胞(例如中央記憶T細胞及效應記憶T細胞)、初始T細胞及其類似物。
任何合適方法可用於轉染或轉導細胞，例如T細胞，或投與本文所述之方法所涵蓋之核苷酸序列或組合物。將多核苷酸遞送至宿主細胞之方法包括例如使用陽離子聚合物、類脂分子及某些商業產品，例如in vivo-jetPEI®。其他方法包括離體轉導、注射、電穿孔、DEAE-葡聚醣、音波加載、脂質體介導之轉染、受體介導之轉導、微粒轟擊、轉座子介導之轉移及其類似方法。轉染或轉導宿主細胞之更進一步之方法採用載體，在本文中進一步詳細描述。
如本文所述之經修飾之免疫細胞可使用用於分析T細胞活性之方法進行功能表徵，包括測定T細胞結合、活化或誘導，且亦包括測定抗原特異性T細胞反應。實例包括測定T細胞增殖、T細胞細胞介素釋放、抗原特異性T細胞刺激、MHC限制性T細胞刺激、CTL活性(例如，藉由偵測預加載標靶細胞之 51Cr釋放)、T細胞表型標記物表現之變化以及T細胞功能之其他量度。
進行此等及類似分析之程序可見於例如Lefkovits (Immunology Methods Manual: Hie Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998)，以及Current Protocols in Immunology, Weir, (1986) Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA；Mishell及Shigii (編輯) (1979) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA；Green及Reed (1998) Science281:1309，以及其中引用之參考文獻。
在一些實施例中，可藉由評估與不同濃度之MHC多聚體之結合來量測對結合蛋白(諸如TCR或其抗原結合部分)之表觀親和力。「MHC-肽多聚體染色」係指用於偵測抗原特異性T細胞之分析法，在一些實施例中，其特徵在於MHC分子之四聚體，各包含具有與至少一種抗原同源(例如，一致或相關)之胺基酸序列的相同肽(例如，HPV16 E7 11-19免疫原性肽)，其中復合物能夠與識別同源抗原之結合蛋白，諸如TCR或其抗原結合部分結合。各MHC分子均可用生物素分子標記。生物素化MHC/肽可藉由添加卵白素進行多聚化(例如四聚化)，卵白素可進行螢光標記。
多聚體可藉由流動式細胞測量術經由螢光標記進行偵測。在一些實施例中，pMHC多聚體分析用於偵測或選擇本發明所涵蓋之親和力增強之結合蛋白，諸如TCR或其抗原結合部分。在一些實例中，使用一系列濃度之經標記之多聚體的2倍稀釋來量測結合蛋白，諸如TCR或其抗原結合部分之表觀K D，接著藉由非線性回歸來確定結合曲線，表觀K D經測定為產生半最大結合之配位體濃度。
細胞介素之水準可使用本文所述之方法來確定，諸如ELISA、ELISPOT、細胞內細胞介素染色及流動式細胞測量術及其組合(例如細胞內細胞介素染色及流動式細胞測量術)。
由抗原特異性引發或刺激免疫反應引起之免疫細胞增殖及純系擴增可藉由以下來測定：分離淋巴球，諸如周邊血液細胞或來自淋巴結之細胞之樣品中的循環淋巴球，用抗原刺激該等細胞且諸如藉由併入氚化胸苷或非放射性分析，諸如MTT分析及其類似分析，量測細胞介素產生、細胞增殖及/或細胞活力。本文所述之免疫原對Th1免疫反應與Th2免疫反應之間的平衡的影響可例如藉由測定Th1細胞介素(諸如IFN-g、IL-12、IL-2及TNF-b)以及2型細胞介素(諸如IL-4、IL-5、IL-9、IL-10及IL-13)之水準來檢查。
本發明所涵蓋之宿主細胞可包含編碼如本文所述之結合蛋白之單一多核苷酸，或結合蛋白可由多於一種多核苷酸編碼。換言之，結合蛋白之組分或部分可由兩種或更多種多核苷酸編碼，其可含於單一核酸分子上或可含於兩種或更多種核酸分子上。
此外，如下文及實施例中進一步描述，本發明涵蓋之宿主細胞可在與結合蛋白或其組分相同的多核苷酸或不同的多核苷酸上編碼及/或表現除如本文所述之結合蛋白之外的有用輔助蛋白。舉例而言，宿主細胞可編碼及/或表現CD8α、CD8β、DN-TGFβR (例如DN-TGFβRII)及/或可選擇蛋白質標記物，視情況其中可選擇蛋白質標記物為DHFR。
在一些實施例中，編碼本發明所涵蓋之結合蛋白之兩個或更多個組分或部分的多核苷酸包含在單個開讀框中可操作性連接之兩個或更多個編碼序列。此類安排可有利地允許所需基因產物之協調表現，諸如同時表現TCR之α鏈及β鏈，使得其以約1:1之比率產生。在一些實施例中，本發明所涵蓋之結合蛋白之兩種或更多種取代基因產物，諸如TCR (例如，α鏈及β鏈)或CAR，表現為單獨分子且在轉譯後締合。在進一步實施例中，本發明所涵蓋之結合蛋白之兩種或更多種取代基因產物表現為單個肽，其部分由可裂解或可移除之區段分隔。例如，可用於表現由單個多核苷酸或載體編碼之可分離多肽的自裂解肽為所屬領域中已知，且包括例如豬鐵士古病毒-1 2A (P2A)肽、明脈扁刺蛾病毒(thoseaasigna virus) 2A (T2A)肽、馬鼻炎A病毒(ERAV) 2A (E2A)肽及口蹄疫病毒2A (F2A)肽。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之結合蛋白包含一或多種連接胺基酸。「連接胺基酸」或「連接胺基酸殘基」係指多肽之兩個相鄰模體、區域或域之間，諸如結合域與相鄰恆定域之間或TCR鏈與相鄰自裂解肽之間的一或多個(例如2至約10個)胺基酸殘基。連接胺基酸可由編碼融合蛋白之構築體之設計產生(例如，在構築編碼融合蛋白之核酸分子期間使用限制性酶位點產生之胺基酸殘基)，或由例如與本發明所涵蓋之編碼結合蛋白之一或多個域相鄰的自裂解肽裂解產生(例如，位於TCR a鏈與TCR β鏈之間的P2A肽，其自裂解可在a鏈、TCR β鏈或兩者中留下一或多個連接胺基酸)。
本發明所涵蓋之經工程改造之免疫細胞可作為例如以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之療法投與。在一些情況下，可能需要減少或停止與細胞免疫療法相關之活動。因此，在一些實施例中，本發明所涵蓋之經工程改造之免疫細胞包含編碼結合蛋白及輔助蛋白(諸如安全開關蛋白)之異源多核苷酸，其可使用同源藥物或其他化合物靶向以在需要時選擇性地調節此類細胞之活性(例如，減少或消融)。在此方面使用之安全開關蛋白包括例如截短EGF受體多肽(huEGFRt)，其缺乏細胞外N端配位體結合域及細胞內受體酪胺酸激酶活性，但保留天然胺基酸序列、I型跨膜細胞表面定位以及醫藥級抗EGFR單株抗體、西妥昔單抗(cetuximab，Erbitux) tEGF受體(tEGFr；Wang等人 (2011) Blood118:1255-1263)、半胱天冬酶多肽(例如，iCasp9； Straathof等人 (2005) Blood105: 4247-4254；Di Stasi等人 (2011) N. Engl. J. Med.365: 1673-1683；Zhou及Brenner (2016) Hematol.pii:S0301- 472X: 30513-30516)、RQR8 (Philip等人 (2014) Blood124: 1277-1287)及人類c-myc蛋白標籤(Kieback等人 (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA105:623-628)之構形完整結合抗原決定基。
對治療細胞有用之其他輔助組分包含標籤或選擇標記物(例如CD34富集標籤)，其允許鑑定、分選、分離、富集或追蹤細胞。例如，具有所需特徵之標記免疫細胞(例如，抗原特異性TCR及安全開關蛋白)可自樣品中之未標記細胞中分選出來，且更有效地活化及擴增以包括在所需純度之治療產品中。
如本文所用，術語「選擇標記物」包含賦予細胞可鑑定之變化之核酸構築體，其允許偵測及陽性選擇用包含選擇標記物之多核苷酸轉導的免疫細胞。例如，RQR係一種選擇標記物，其包含CD20之主要細胞外環及兩個最小CD34結合位點。在一些實施例中，編碼RQR之多核苷酸包含編碼16胺基酸之CD34最小抗原決定基 之多核苷酸。在一些實施例中，諸如本文實例中提供之某些實施例，CD34最小抗原決定基併入CD8莖域(Q8)之胺基末端位置。在進一步實施例中，CD34最小結合位點序列可與CD20之標靶抗原決定基組合以形成T細胞之緊湊標記物/自殺基因(RQR8) (Philip等人 2014)。此構築體允許用例如與磁珠結合之CD34特異性抗體(Miltenyi)選擇表現該構築體之免疫細胞，且利用臨床上接受之醫藥抗體利妥昔單抗，該抗體允許選擇性刪除表現轉殖基因之經工程改造之T細胞(例如，Philip等人 (2014) Blood124:1277-1287；美國專利公開案2015-0093401；及美國專利公開案2018-0051089)。
其他示例性選擇標記物包括若干種通常不在T細胞上表現之截短之I型跨膜蛋白：截短之低親和力神經生長因子、截短之CD19及截短之CD34 (例如，Di Stasi等人 (2011) N. Engl. J. Med.365:1673-1683；Mavilio等人 (1994) Blood83:1988-1997；及Fehse等人 (2000) Mol. Ther.7:448-456)。CD19及CD34之一個特別吸引人之特徵在於現成Miltenyi CliniMACs™選擇系統之可用性，該系統可靶向此等標記物進行臨床級分選。然而，CD19及CD34係相對較大之表面蛋白，可能會影響整合載體之載體包裝能力及轉錄效率。亦可採用含有細胞外非信號傳導域或各種蛋白質(例如CD19、CD34、LNGFR等)之表面標記物。可採用任何選擇標記物，且應為優良製造規範可接受的。在一些實施例中，選擇標記物與編碼所關注之基因產物(例如，本發明所涵蓋之結合蛋白，諸如TCR或CAR，或其抗原結合片段)之多核苷酸一起表現。選擇標記物之其他實例包括例如報導基因，諸如GFP、EGFP、β-gal或氯黴素乙醯轉移酶(CAT)。在一些實施例中，選擇標記物，諸如CD34由細胞表現，且CD34可用於選擇、富集或分離(例如，藉由免疫磁性選擇)轉導之所關注之細胞以用於本文所述之方法。如本文所用，CD34標記物區別於抗CD34抗體，或例如scFv、TCR或與CD34結合之其他抗原識別部分。
在一些實施例中，選擇標記物包含RQR多肽、截短之低親和力神經生長因子(tNGFR)、截短之CD19 (tCD19)、截短之CD34 (tCD34)或其任何組合。
作為背景，在免疫治療細胞產品中包括CD4 +T細胞可提供抗原誘導之IL-2分泌且增強轉移之細胞毒性CD8 +T細胞之持久性及功能(例如，Kennedy等人 (2008) Immunol. Rev.222:129及Nakanishi等人 Nature(2009) 52:510)。在一些實施例中，CD4 +T細胞中之I類限制性TCR可能需要轉移CD8共受體以增強TCR對I類HLA肽複合物之敏感性。CD4共受體在結構上與CD8不同，且不能有效替代CD8共受體(例如，Stone及Kranz (2013) Front. Immunol.4:244及Cole等人 (2012) Immunology737:139)。因此，用於本發明所涵蓋之組合物及方法之另一種輔助蛋白包含CD8共受體或其組分。在一些實施例中，包含編碼本發明所涵蓋之結合蛋白之異源多核苷酸的經工程改造之免疫細胞可進一步包含編碼CD8共受體蛋白或其β鏈或α鏈組分之異源多核苷酸。
宿主細胞可有效地經轉導以含有且可有效地表現編碼結合蛋白、安全開關蛋白、選擇標記物及CD8共受體蛋白之單一多核苷酸。
在一個實施例中，本發明所涵蓋之宿主細胞進一步包括編碼共刺激分子之核酸，使得經修飾之T細胞表現共刺激分子。在一些實施例中，共刺激域係選自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB、4-1BBL、PD1及PD1L。
在任何前述實施例中，表現本文所述之結合蛋白之宿主細胞可為通用免疫細胞。「通用免疫細胞」包含如下免疫細胞，其經修飾以減少或消除一或多種編碼選自PD-l、LAG-3、CTLA4、TIM3、TIGIT、HLA分子、TCR分子或其任何組合之多肽產物之內源基因的表現。不希望受理論束縛，某些內源性表現之免疫細胞蛋白可能下調經修飾之免疫細胞之免疫活性(例如，PD-1、LAG-3、CTLA4、TIGIT)，或可能干擾本發明所涵蓋之異源表現之結合蛋白(例如，結合非HPV16 E7 11-19抗原且干擾經修飾之免疫細胞與表現HPV16 E7 11-19抗原(諸如在MHC分子背景中之包含胺基酸序列YMLDLQPET之HPV16 E7 11-19免疫原性肽)之標靶細胞之結合的內源性TCR)的結合活性。此外，在供體免疫細胞上表現之內源蛋白(例如免疫細胞蛋白質，諸如HLA對偶基因)可能被同種異體宿主識別為外源蛋白，此可能導致經修飾之供體免疫細胞被同種異體宿主消除或抑制。
因此，降低或消除此類內源基因或蛋白質之表現或活性可提高經修飾之免疫細胞在自體同源或同種異體宿主環境中之活性、耐受性或持久性，且允許細胞之通用投與(例如，投與至任何接受者，無論HLA類型如何)。在一些實施例中，根據本發明之細胞係同基因型的，此意謂期在遺傳學上一致或足夠一致且免疫學上相容從而允許移植。在一些實施例中，通用免疫細胞為供體細胞(例如，同種異體)或自體同源細胞。在一些實施例中，本發明所涵蓋之經修飾之免疫細胞(例如通用免疫細胞)包含編碼以下之基因中之一或多者的染色體基因剔除：PD-l、LAG-3、CTLA4、TIM3、TIGIT、HLA組分(例如，編碼α1巨球蛋白、α2巨球蛋白、α3巨球蛋白、β1微球蛋白或β2微球蛋白之基因)或TCR組分(例如，編碼TCR可變區或TCR恆定區之基因) (參見例如Torikai等人(2016) Nature Sci. Rep.6:21757；Torikai等人 (2012) Blood179:5697；及Torikai等人 (2013) Blood722:1341，其亦提供根據本發明有用之代表性的示例性基因編輯技術、組合物及授受性細胞療法)。
如本文所用，術語「染色體基因剔除」係指在宿主細胞中防止(例如，減少、延遲、抑制或消除)宿主細胞產生功能活性之內源多肽產物的遺傳改變或引入之抑制劑。引起染色體基因剔除之改變可能包括例如引入之無義突變(包括過早終止密碼子之形成)、錯義突變、基因缺失及股斷裂，以及抑制宿主細胞中之內源基因表現的抑制性核酸分子之異源表現。
在一些實施例中，染色體基因剔除或基因嵌入可藉由宿主細胞之染色體編輯來進行。可使用例如核酸內切酶進行染色體編輯。如本文所用，「核酸內切酶」係指能夠催化多核苷酸鏈內磷酸二酯鍵裂解之酶。在一些實施例中，核酸內切酶能夠使標靶基因裂解，從而使標靶基因失活或「剔除」標靶基因。核酸內切酶可為天然存在、重組、遺傳修飾或融合之核酸內切酶。由核酸內切酶引起之核酸股斷裂通常經由同源重組或非同源末端接合(NHEJ)之不同機制進行修復。在同源重組過程中，供體核酸分子可用於供體基因「嵌入」，用於標靶基因「剔除」，且視情況經由供體基因嵌入或標靶基因剔除事件使標靶基因失活。NHEJ為一個容易出錯之修復過程，通常會導致裂解位點之DNA序列發生變化，例如至少一個核苷酸之取代、缺失或添加。NHEJ可用於「剔除」標靶基因。核酸內切酶之實例包括鋅指核酸酶、TALE-核酸酶、CRISPR-Cas核酸酶、大範圍核酸酶及megaTAL。
如本文所用，「鋅指核酸酶」(ZFN)係指一種融合蛋白，其包含與非特異性DNA裂解域，諸如Fokl核酸內切酶融合之鋅指DNA結合域。約30個胺基酸之各鋅指模體與約3個DNA鹼基對結合，且某些殘基上之胺基酸可發生變化以改變三聯體序列特異性(例如，Desjarlais等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.90:2256-2260及Wolfe等人 (1999) J . Mol. Biol.255:1917-1934)。多個鋅指模體可串聯連接以產生與所需DNA序列，諸如長度在約9個至約18個鹼基對範圍內之區域的結合特異性。作為背景，ZFN藉由催化基因組中位點特異性DNA雙股斷裂(DSB)之形成來介導基因組編輯，且同源定向修復促進在DSB位點靶向整合包含與基因組同源之側翼序列之轉殖基因。或者，由ZFN產生之DSB可經由非同源末端接合(NHEJ)修復引起標靶基因剔除，此係一種容易出錯之細胞修復途徑，導致裂解位點處核苷酸之插入或缺失。在一些實施例中，基因剔除包含使用ZFN分子進行之插入、缺失、突變或其組合。
如本文所用，「轉錄活化因子樣效應核酸酶」(TALEN)係指一種融合蛋白，其包含TALE DNA結合域及DNA裂解域，諸如Fokl核酸內切酶。「TALE DNA結合域」或「TALE」由一或多個TALE重複域/單元構成，各域/單元通常具有高度保守之33-35胺基酸序列，具有不同之第12及第13胺基酸。TALE重複域參與TALE與標靶DNA序列之結合。不同胺基酸殘基，稱為重複可變雙殘基(RVD)，與特定核苷酸識別相關。已確定此等TALE之DNA識別之自然(規範)密碼，使得TALE之12及13位之HD (組胺酸-天冬胺酸)序列引起TALE與胞嘧啶(C)結合，NG (天冬醯胺-甘胺酸)與T核苷酸結合，NI (天冬醯胺-異白胺酸)與A核苷酸結合，NN (天冬醯胺-天冬醯胺)與G或A核苷酸結合，且NG (天冬醯胺-甘胺酸)與T核苷酸結合。非規範(非典型) RVD亦為所屬領域中熟知(例如，美國專利公開案第US 2011/0301073號，其中非典型RVD之全部內容以引用之方式併入本文)。TALEN可用於指導T細胞基因組中之位點特異性雙股斷裂(DSB)。非同源末端接合(NHEJ)連接雙股斷裂兩側之DNA，其中退火時序列重疊很少或沒有，因此引入剔除基因表現之錯誤。或者，同源定向修復可在DSB位點引入轉殖基因，條件為轉殖基因中存在同源側翼序列。在一些實施例中，基因剔除包含使用TALEN分子進行之插入、缺失、突變或其組合。
如本文所用，「成簇之規則間隔之短回文重複序列/Cas」(CRISPR/Cas)核酸酶系統係指一種系統，其採用CRISPR RNA (crRNA)引導之Cas核酸酶，經由鹼基配對互補性來識別基因組內之標靶位點(稱為原型間隔子)，接著若短的保守原型間隔子相關模體(PAM)緊跟在互補標靶序列之3'之後，則使DNA裂解。CRISPR/Cas系統根據Cas核酸酶之序列及結構分為三種類型(亦即，I型、II型及III型)。I型及III型crRNA引導之監測複合物需要多個Cas次單元。研究最多之II型系統至少包含三個組分：RNA引導之Cas9核酸酶、crRNA及反式作用crRNA (tracrRNA)。tracrRNA包含雙股體形成區。crRNA與tracrRNA形成雙股體，其能夠與Cas9核酸酶相互作用，且經由crRNA上之間隔子及PAM上游之標靶DNA上之原型間隔子之間的華特生-克立克鹼基配對(Watson-Crick base-pairing)，將Cas9/crRNA:tracrRNA複合物引導至標靶DNA上之特定位點。Cas9核酸酶使由crRNA間隔子界定之區域內的雙股斷裂裂解。NHEJ修復導致插入及/或缺失，此破壞所靶向之基因座之表現。或者，可經由同源定向修復將具有同源側翼序列之轉殖基因引入DSB位點。crRNA及tracrRNA可經工程改造為單一引導RNA (sgRNA或gRNA) (例如，Jinek等人(2012) Science337:816-821)。此外，與標靶位點互補之引導RNA之區域可進行改變或程式化以靶向所需序列(Xie等人 (2014) PLOS One 9:el00448；美國專利公開案第US 2014/0068797號；美國專利公開案第US 2014/0186843號；美國專利第8,697,359號；及PCT公開案第WO 2015/071474號)。在一些實施例中，基因剔除包含使用CRISPR/Cas核酸酶系統進行之插入、缺失、突變或其組合。
示例性gRNA序列及使用其剔除編碼免疫細胞蛋白之內源基因之方法包括Ren等人 (2017) Clin. Cancer Res.23:2255-2266中所示之彼等gRNA序列及方法，該文獻提供代表性的示例性gRNA、CAS9 DNA、載體及基因剔除技術。
如本文所用，「大範圍核酸酶」，亦稱為「歸巢核酸內切酶」，係指以大識別位點(約12至約40個鹼基對之雙股DNA序列)為特徵之內切去氧核糖核酸酶。基於序列及結構模體，大範圍核酸酶可分為五個家族：LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys盒及PD-(D/E)XK。示例性大範圍核酸酶包括I-Scel、I-Ceul、PI-PspI、RI-Sce、I-ScelV、I-Csml、I-Panl、I-Scell、I-Ppol、I-SceIII、I-Crel、I-Tevl、I-TevII及I-TevIII，其識別序列為熟知的(例如，美國專利第5,420,032號及第6,833,252號；Belfort等人 (1997) Nucl. Acids Res.25:3379-3388；Dujon等人 (1989) Gene52:115-118；Perler等人 (1994) Nucl. Acids Res.22:1125-1127；Jasin (1996) Trends Genet.72:224-228；Gimble等人 (1996) J. Mol. Biol.263:163-180；及Argast等人 (1998) J. Mol. Biol.280:345-353)。
在一些實施例中，天然存在之大範圍核酸酶可用於促進所關注之標靶之位點特異性基因組修飾，諸如免疫檢查點、HLA編碼基因或TCR組分編碼基因。
在其他實施例中，對標靶基因具有新結合特異性之經工程改造之大範圍核酸酶用於位點特異性基因組修飾(參見例如Porteus等人 (2005) Nat. Biotechnol.23:967-73；Sussman等人 (2004) J. Mol. Biol.342:31-41；Epinat等人 (2003) Nucl. Acids Res.37:2952-2962；Chevalier等人 (2002) Mol. Cell70:895-905；Ashworth等人 (2006) Nature441:656-659；Paques等人 (2007) Curr. Gene Ther.7:49-66；及美國專利公開案第US 2007/0117128號、第US 2006/0206949號、第US 2006/0153826號、第US 2006/0078552號及第US 2004/0002092號)。在進一步之實施例中，染色體基因剔除係使用歸巢核酸內切酶產生，該核酸內切酶經TALEN之模組化DNA結合域修飾，製成稱為megaTAL之融合蛋白。MegaTAL不僅可用於剔除一或多種標靶基因，亦可在與編碼所關注之多肽之外源供體模板結合使用時引入(嵌入)異源或外源多核苷酸。
在一些實施例中，染色體基因剔除包含被引入宿主細胞(例如免疫細胞)之抑制性核酸分子，該抑制性核酸分子包含編碼與HPV16 E7 11-19抗原結合(例如特異性及/或選擇性地)之抗原特異性受體的異源多核苷酸，其中抑制性核酸分子編碼標靶特異性抑制劑，且其中編碼之標靶特異性抑制劑抑制宿主免疫細胞中之內源基因表現(亦即，免疫檢查點、HLA組分或TCR組分或其任何組合)。
在使用剔除程序或試劑後，可藉由宿主免疫細胞之DNA定序直接確認染色體基因剔除。
染色體基因剔除亦可自剔除後基因表現之缺乏(例如，由該基因編碼之mRNA或多肽產物之缺乏)推斷。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之宿主細胞能夠特異性及/或選擇性地殺傷50%或更多之標靶細胞，該等標靶細胞包括包含在MHC分子背景中之HPV16 E7 11-19免疫原性肽之肽-MHC (pMHC)複合物。
在一些實施例中，經修飾之免疫細胞在與標靶細胞接觸時能夠產生細胞介素，該等標靶細胞包括包含在MHC分子背景中之HPV16 E7 11-19免疫原性肽之肽-MHC (pMHC)複合物。
在一些實施例中，細胞介素包含IFN-γ或IL2。在一些實施例中，細胞介素包含TNF-α。
在一些實施例中，當與HPV16 E7 11-19表現水準小於或等於約1,000轉錄本/百萬轉錄本(TPM)、950 TPM、900 TPM、850 TPM、800 TPM、750 TPM、700 TPM、650 TPM、600 TPM、550 TPM、500 TPM、450 TPM、400 TPM、350 TPM、300 TPM、250 TPM、200 TPM、150 TPM、100 TPM、95 TPM、90 TPM、85 TPM、80 TPM、75 TPM、70 TPM、65 TPM、60 TPM、55 TPM、50 TPM、45 TPM、40 TPM、35 TPM、34 TPM、33 TPM、32 TPM、31 TPM、30 TPM、29 TPM、28 TPM、27 TPM、26 TPM、25 TPM、24 TPM、23 TPM、22 TPM、21 TPM、20 TPM、19 TPM、18 TPM、17 TPM、16 TPM、15 TPM、14 TPM、13 TPM、12 TPM、11 TPM、10 TPM、9 TPM、8 TPM、7 TPM、6 TPM、5 TPM、4 TPM、3 TPM、2 TPM及1 TPM，或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如小於或等於約1,000 TPM至小於或等於約35 TPM)的標靶細胞接觸時，宿主細胞能夠產生更高水準之細胞介素或細胞毒性分子。在一些實施例中，低HPV16 E7 11-19表現水準稱為「雜合表現」，意謂約1 TPM與約35 TPM之間，或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如1-32 TPM。舉例而言，宿主細胞能夠產生高出至少1.2倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1000倍或更多，或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如1.2倍至2倍之水準的細胞介素或細胞毒性分子。
在一些實施例中，宿主細胞能夠特異性及/或選擇性地殺傷表現HPV16 E7 11-19之標靶細胞(例如，表現HPV16 E7 11-19之過度增殖細胞)。在某些實施例中，標靶細胞表現：(i)包含胺基酸序列YMLDLQPET或由胺基酸序列YMLDLQPET組成之多肽；及(ii)匹配之MHC分子。
在一些實施例中，宿主細胞不表現HPV16 E7 11-19抗原，未被技術方案1至30中任一項之結合蛋白識別，不屬於血清型HLA-A*02，及/或不表現HLA-A*02對偶基因，諸如HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06或HLA-A*02:07對偶基因。例如，患者可接受來自HPV16 E7 11-19陰性或HLA-A*02:01陰性之健康供體的宿主細胞。自該供體(或經工程改造之自體同源細胞)分離之幹細胞，諸如造血幹細胞可用作移植材料之來源。平行地，自同一供體分離之T細胞可經基因工程改造以識別HPV16 E7 11-19，諸如藉由表現本文所述之HPV16 E7 11-19結合蛋白。供體幹細胞可用於將細胞群體，諸如重建免疫系統移植至患者體內，且可將宿主細胞注入患者體內，以激發高度特異性之抗腫瘤作用。經工程改造之供體T細胞可經設計以識別及消除表現HPV16 E7 11-19之細胞，諸如患者之所有HPV16 E7 11-19陽性天然血細胞，包括例如癌細胞，如殘留白血病細胞，從而防止複發且促進完全治癒。因為患者新的健康血細胞源自供體，因此為HPV16 E7 11-19陰性，HLA-A*02血清型陰性及/或或HLA-A*02:01陰性，所以本文所述之經工程改造之細胞可能具有最小之毒副作用。此類患者匹配之宿主細胞及治療方法可根據下文進一步描述之治療方法使用。
在一些實施例中，殺傷係藉由殺傷分析來測定。在一些實施例中，殺傷分析藉由將宿主細胞及標靶細胞以20:1至0.625:1，例如15:1至1.25:1、10:1至1.5:1、8:1至3:1、6:1至5:1、20:1至5:1、10:1至2.5:1等之比率共培養來進行。在一些實施例中，用1 µg/mL至50 pg/mL，例如1 ug/mL至10 ng/mL、500 ng/mL至0.5 ng/mL、10 ng/mL至10 pg/mL、250 ng/mL至1 ng/mL、50 ng/mL至5 ng/mL、20 ng/mL至10 ng/mL等HPV16 E7 11-19肽對標靶細胞進行脈衝輸送。
在一些實施例中，當與HPV16 E7 11-19水準小於或等於約1,000轉錄本/百萬轉錄本(TPM)、950 TPM、900 TPM、850 TPM、800 TPM、750 TPM、700 TPM、650 TPM、600 TPM、550 TPM、500 TPM、450 TPM、400 TPM、350 TPM、300 TPM、250 TPM、200 TPM、150 TPM、100 TPM、95 TPM、90 TPM、85 TPM、80 TPM、75 TPM、70 TPM、65 TPM、60 TPM、55 TPM、50 TPM、45 TPM、40 TPM、35 TPM、34 TPM、33 TPM、32 TPM、31 TPM、30 TPM、29 TPM、28 TPM、27 TPM、26 TPM、25 TPM、24 TPM、23 TPM、22 TPM、21 TPM、20 TPM、19 TPM、18 TPM、17 TPM、16 TPM、15 TPM、14 TPM、13 TPM、12 TPM、11 TPM、10 TPM、9 TPM、8 TPM、7 TPM、6 TPM、5 TPM、4 TPM、3 TPM、2 TPM及1 TPM，或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如小於或等於約1,000 TPM至小於或等於約35 TPM)之標靶細胞接觸時，宿主細胞能夠殺傷更高數目之標靶細胞。在一些實施例中，低HPV16 E7 11-19表現水準稱為「雜合表現」，意謂約1 TPM與約35 TPM之間，或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如1-32 TPM。舉例而言，宿主細胞能夠殺傷高出至少1.2倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1000倍或更多，或介於兩者之間的任何範圍(包括端點)，諸如1.2倍至2倍之數目的標靶細胞。
本發明進一步提供包含至少一種本文所述宿主細胞之細胞群體。細胞群體可為異質群體，其包含：包含任何所述之重組表現載體之宿主細胞；以及至少一種其他細胞，例如不包含任何重組表現載體之宿主細胞(例如，T細胞)，或T細胞以外之細胞，例如B細胞、巨噬細胞、嗜中性球、紅細胞、肝細胞、內皮細胞、上皮細胞、肌肉細胞、腦細胞等。或者，細胞群體可為實質上同質群體，其中該群體主要由包含重組表現載體之宿主細胞構成(例如，基本上由其組成)。群體亦可為細胞之純系群體，其中群體之所有細胞均為包含重組表現載體之單一宿主細胞之純系，使得群體之所有細胞均包含重組表現載體。在本發明所涵蓋之一個實施例中，細胞群體為包括包含如本文所述之重組表現載體之宿主細胞之純系群體。
在本發明所涵蓋之一個實施例中，群體中之細胞數目可迅速擴增。T細胞數目之擴增可藉由所屬領域熟知之多種方法中之任一種來實現(例如，美國專利第8,034,334號及第8,383,099號、美國專利公開案第2012/0244133號；Dudley等人 (2003) J. Immunother. 26:332-242；及Riddell等人 (1990) J. Immunol. Methods128:189-201)。例如，T細胞數目之擴增可藉由將T細胞與OKT3抗體、IL-2及飼養PBMC (例如，經輻照之同種異體PBMC)一起培養來進行。 V .醫藥組合物
在本發明所涵蓋之另一態樣中，本文提供醫藥組合物，其包含本文所述之組合物(例如，結合蛋白、核酸、細胞及其類似物)及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
術語「醫藥學上可接受」係指在合理醫學判斷範圍內，適合與人類及動物組織接觸而無過度毒性、刺激性、過敏反應或其他問題或併發症，與合理收益/風險比相稱之彼等藥劑、材料、組合物及/或劑型。
本發明所涵蓋之藥劑及其他組合物可經特別調配用於以固體或液體形式投與，包括經調適用於各種投與途徑之彼等形式，諸如(1)口服投與，例如灌服劑(水性或非水性溶液或懸浮液)、錠劑、大丸劑、散劑、顆粒、糊劑；(2)非經腸投與，例如呈例如無菌溶液或懸浮液形式藉由皮下、肌肉內或靜脈內註射；(3)局部塗覆，例如呈塗在皮膚上之乳膏、軟膏或噴霧劑；(4)陰道內或直腸內，例如呈子宮托、乳膏或泡沫形式；或(5)氣溶膠，例如呈水性氣溶膠、脂質體製劑或含有該化合物之固體顆粒形式。考慮本文所述之藥劑或組合物之任何合適形式因子，諸如但不限於錠劑、膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑及灌腸劑。
本發明所涵蓋之醫藥組合物可呈現為離散劑型，諸如膠囊、小袋或錠劑，或液體或氣溶膠噴霧劑，各含有預定量之活性成分，呈粉末或顆粒、在水性或非水性液體中之溶液或懸浮液、水包油乳液、油包水液體乳液、用於復原之散劑、口服散劑、瓶(包括瓶中之散劑或液體)、口服溶解薄膜、口含錠、糊劑、管、口香糖及包裝。此類劑型可藉由任何藥學方法製備。
合適賦形劑包括水、鹽水、葡萄糖、甘油或其類似物及其組合。在一些實施例中，包含如本文揭示之宿主細胞、結合蛋白或融合蛋白之組合物進一步包含合適輸注介質。合適輸注介質可為任何等滲介質調配物，通常可利用生理鹽水、Normosol™-R (Abbott)或Plasma-Lyte™ A (Baxter)、5%葡萄糖水溶液、乳酸林格氏液(Ringer's lactate)。輸注介質可補充人類血清白蛋白或其他人類血清組分。亦考慮包含有效量之宿主細胞或組合物之單位劑量。
本文亦提供包含有效量之宿主細胞或包含宿主細胞之組合物之單位劑量。如本文所述，宿主細胞包括免疫細胞、T細胞(CD4 +T細胞及/或CD8+ T細胞)、細胞毒性淋巴球(例如，細胞毒性T細胞及/或自然殺手(NK)細胞)及其類似物。舉例而言，在一些實施例中，單位劑量包含之組合物包含單獨或與其他細胞組合的至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%經工程改造之細胞，諸如包含至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%其他細胞。在一些實施例中，不需要之細胞以減少之量存在或實質上不存在，諸如小於約50%、小於約40%、小於約30%、小於約20%、小於約10%、小於約5%或小於約1%組合物中之細胞群體。
組合物或單位劑量中之細胞量為至少一種細胞(例如，至少一種經工程改造之CD8 +T細胞、經工程改造之CD4 +T細胞及/或NK細胞)或更通常大於10 2個細胞，例如，多達10 6、多達10 7、多達10 8個細胞、多達10 9個細胞或超過10 10個細胞。在一些實施例中，細胞以約106至約10 10個細胞/m 2之範圍，諸如以約10 5至約10 9個細胞/m 2之範圍投與。細胞數目將視組合物之預期最終用途以及其中包括之細胞類型而定。例如，經修飾以含有對特定抗原具有特異性之結合蛋白的細胞將包含含有至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多此類細胞之細胞群體。對於本文提供之用途，細胞之體積通常為一公升或更小、500 ml或更小、250 ml或更小、或100 ml或更小。在實施例中，所需細胞之密度通常大於10 4個細胞/ml且通常大於10 7個細胞/ml，通常為10 8個細胞/ml或更大。細胞可作為單次輸注或在一段時間內以多次輸注之形式投與。臨床相關數目之免疫細胞可分配至多次輸注中，累積等於或超過10 6、10 7、10 8、10 9、10 10或10 11個細胞。在一些實施例中，單位劑量之經工程改造之免疫細胞可與來自同種異體供體之造血幹細胞共投與(例如同時或同時期)。
如醫學領域之技術人員所確定，醫藥組合物可以適合於待治療(或預防)之疾病或疾患之方式投與。投與組合物之適當劑量及合適持續時間及頻率將由諸如患者之健康狀況、患者體型(亦即體重、質量或身體面積)、患者疾患之類型及嚴重程度、活性成分之具體形式及投與方法之因素決定。一般而言，適當劑量及治療方案以足以提供治療及/或預防益處(諸如本文所述，包括改善之臨床結果，諸如更頻繁之完全或部分緩解，或更長之無病期及/或總存活期，或症狀嚴重程度之減輕)之量提供組合物。
醫藥組合物之有效量係指足以達到所需臨床結果或有益治療所需之劑量及時間段之量，如本文所述。可在一或多次投與中遞送有效量。若對已知或確認患有疾病或疾病病況之個體進行投與，則術語「治療有效量」可用於指代治療，而「預防有效量」可用於描述作為預防過程，向易感或有發展疾病或疾病病況(例如復發)風險之個體投與有效量。
本文所述之醫藥組合物可呈現於單位劑量或多劑量容器中，諸如密封安瓿或小瓶。此類容器可冷凍以保持調配物之穩定性，直至輸注至患者體內。在一些實施例中，單位劑量包含劑量為約10 7個細胞/m 2至約10 11個細胞/m 2的如本文所述之宿主細胞。開髮適用於在各種治療方案中使用本文所述之特定組合物之投與及治療方案，包括例如非經腸或靜脈內投與或調配物。
若主題組合物係非經腸投與，則該組合物亦可包括無菌水性或油性溶液或懸浮液。合適之無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑包括水、林格氏溶液、等滲鹽溶液、1,3-丁二醇、乙醇、丙二醇或聚乙二醇與水之混合物。水溶液或懸浮液可進一步包含一或多種緩沖劑，諸如乙酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉或酒石酸鈉。當然，用於製備任何劑量單位調配物之任何材料均應為醫藥學純的且在所採用之量下實質上無毒。此外，活性化合物可併入持續釋放之製劑及調配物中。如本文所用，單位劑型係指適合作為待治療個體之單位劑量之物理離散單位；各單位可含有經計算可產生所需之效果的預定量之經工程改造之免疫細胞或活性化合物，以及適當醫藥載劑。
在一些實施例中，所述之醫藥組合物在投與於個體時可引發針對表現HPV16 E7 11-19之所關注之細胞的免疫反應。此類醫藥組合物可用作用於預防性及/或治療性治療以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發的疫苗。
在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含生理學上可接受之佐劑。在一些實施例中，所用佐劑增加醫藥組合物之免疫原性。此類刺激進一步免疫反應之化合物或佐劑可(i)在肽復原且視情況用如上文所定義之油基佐劑乳化之後混合至根據本發明之醫藥組合物，(ii)可為上文所定義之本發明所涵蓋之復原組合物的一部分，(iii)可實體連接至待復原之肽，或(iv)可分開投與至待治療之個體、哺乳動物或人類。佐劑可為提供抗原之緩慢釋放之佐劑(例如，佐劑可為脂質體)，或其可為自身具免疫原性，藉此與抗原協同地起作用之佐劑。舉例而言，佐劑可為已知佐劑，或促進抗原攝取、將免疫系統細胞募集至投與部位或促進起反應之淋巴樣細胞之免疫活化的其他物質。佐劑包括但不限於免疫調節分子(例如，細胞介素)、油及水乳液、氫氧化鋁、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化鐵、褐藻酸鈉、bacto-adjuvant、合成聚合物(諸如聚胺基酸及胺基酸共聚物)、皂苷、石蠟油及胞壁醯二肽。在一些實施例中，佐劑為佐劑65、α-GalCer、磷酸鋁、氫氧化鋁、磷酸鈣、β-葡聚糖肽、CpG DNA、GM-CSF、GPI-0100、IFA、IFN-γ、IL-17、脂質A、脂多糖、Lipovant、Montanide™、N-乙醯基-胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸、pam3CSK4、quil A、海藻糖二黴菌酸酯或酵母聚糖。
在一些實施例中，佐劑為免疫調節分子。舉例而言，免疫調節分子可為經設計以增強免疫反應的重組蛋白細胞介素、趨化介素或免疫刺激劑或編碼細胞介素、趨化介素或免疫刺激劑之核酸。
免疫調節細胞介素之實例包括干擾素(例如，IFNα、IFNβ及IFNγ)、介白素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-17及IL-20)、腫瘤壞死因子(例如，TNFα及TNFβ)、紅血球生成素(EPO)、FLT-3配位體、gIp10、TCA-3、MCP-1、MIF、MIP-1.α.、MIP-1β、Rantes、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)及顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)，以及前述任一者之功能片段。
在一些實施例中，與趨化介素受體(亦即，CXC、CC、C或CX3C趨化介素受體)結合之免疫調節趨化介素亦可包括於此處提供之組合物中。趨化介素之實例包括但不限於Mip1α、Mip-1β、Mip-3α (Larc)、Mip-3β、Rantes、Hcc-1、Mpif-1、Mpif-2、Mcp-1、Mcp-2、Mcp-3、Mcp-4、Mcp-5、Eotaxin、Tarc、Elc、I309、IL-8、Gcp-2 Gro-α、Gro-β、Gro-γ、Nap-2、Ena-78、Gcp-2、Ip-10、Mig、I-Tac、Sdf-1及Bca-1 (Blc)，以及前述任一者之功能片段。
在一些實施例中，組合物包含本文所述之結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段、CAR或包含TCR及效應域之融合蛋白)、TCRα及/或TCRβ多肽。在一些實施例中，組合物包含編碼本文所述之結合蛋白、TCRα及/或TCRβ多肽之核酸，諸如編碼結合蛋白、TCRα及/或TCRβ多肽之DNA分子。在一些實施例中，組合物包含表現載體，該表現載體包含編碼結合蛋白、TCRα及/或TCRβ多肽之開讀框。
當由細胞(例如，T細胞、NK細胞等)吸收時，DNA分子可作為染色體外分子存在於細胞中及/或可整合至染色體中。DNA可呈質體形式引入至細胞中，其可保持作為獨立遺傳物質。替代地，可將可整合至染色體中之線性DNA引入至細胞中。視情況，當將DNA引入至細胞中時，可添加促進DNA整合至染色體中之試劑。 VI .用途及方法
本文所述之組合物可用於多種診斷、預後及治療應用。在本文所述之任何方法，諸如診斷方法、預後方法、治療方法或其組合中，方法之所有步驟均可由單個參與者或替代地由多於一個參與者進行。舉例而言，診斷可由提供治療性治療之參與者直接進行。或者，提供治療劑者可要求進行診斷分析。診斷師及/或治療干預師可解釋診斷分析結果以確定治療策略。類似地，此類替代過程可應用於其他分析，諸如預後分析。
在本發明所涵蓋之一些用途及方法中，利用個體或個體樣品。在一些實施例中，個體為動物。動物可為任何性別，且可處於任何發育階段。在一些實施例中，動物為脊椎動物，諸如哺乳動物。在一些實施例中，個體為非人類哺乳動物。在一些實施例中，個體為馴養動物，諸如狗、貓、牛、豬、馬、綿羊或山羊。在一些實施例中，個體為伴侶動物，諸如狗或貓。在一些實施例中，個體為家畜，諸如牛、豬、馬、綿羊或山羊。在一些實施例中，個體為動物園動物。在一些實施例中，個體為研究動物，諸如囓齒類動物(例如小鼠或大鼠)、狗、豬或非人類靈長類動物。在一些實施例中，動物為經基因工程改造之動物。在一些實施例中，動物為轉殖基因動物(例如，轉殖基因小鼠及轉殖基因豬)。在一些實施例中，個體為魚或爬行動物。
在一些實施例中，個體為嚙齒類動物，諸如小鼠。在一些此類實施例中，小鼠為轉殖基因小鼠，諸如表現人類MHC (亦即，HLA)分子之小鼠(例如，Nicholson等人 (2012) Adv. Hematol.2012:404081)。在一些實施例中，個體為表現人類TCR之轉殖基因小鼠或為抗原陰性小鼠(例如，Li等人 (2010) Nat. Med.16:1029-1034及Obenaus等人 (2015) Nat. Biotechnol.33:402-407)。在一些實施例中，個體為表現人類HLA分子及人類TCR之轉殖基因小鼠。在一些實施例中，諸如在個體為轉殖基因HLA小鼠之情況下，將經鑑定之TCR修飾為例如嵌合或人類化的。在一些實施例中，諸如類似於已知之結合蛋白人類化方法，修飾TCR支架。
在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，個體為以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症(例如以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發)之動物模型。例如，動物模型可為人類來源癌症之原位異種移植動物模型。
在一些實施例中，個體為人，諸如患有以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症之人類。
可使用本文所述之方法來治療任何有需要之個體。如本文所用，「有需要之個體」包括患有以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症、以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症復發及/或易患以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症之任何個體。如本文所述，以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症可為以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發。
在本發明所涵蓋之方法之一些實施例中，個體未針對以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症進行治療，諸如化學療法、放射療法、靶向療法及/或免疫療法。在一些實施例中，個體針對以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症進行治療，諸如化學療法、放射療法、靶向療法及/或免疫療法。
在一些實施例中，個體已進行手術以移除癌性或癌前組織。在一些實施例中，癌組織尚未被移除，例如，癌組織可能位於身體之不可手術區域，諸如在對生命至關重要之組織中，或在外科手術將對患者造成相當大之傷害風險的區域中。
在一些實施例中，個體或其細胞對相關療法具有抗性，諸如對標準護理療法、免疫檢查點抑制劑療法及其類似療法具有抗性。舉例而言，調節本發明所涵蓋之一或多種生物標記物可克服對免疫檢查點抑制劑療法之抗性。
在一些實施例中，個體需要根據本文所述之組合物及方法進行調節，諸如已被鑑定為具有不希望之HPV16 E7 11-19表現缺乏、存在或異常。 a .診斷方法
在本發明所涵蓋之一態樣中，本文提供用於偵測HPV16 E7 11-19抗原及/或表現HPV16 E7 11-19之所關注之細胞之存在或不存在的診斷方法，其包括藉由使用至少一種結合蛋白或至少一種本文所述之宿主細胞來偵測樣品中該HPV16 E7 11-19抗原之存在或不存在。在一些實施例中，方法進一步包括獲得樣品(例如，自個體)。在一些實施例中，至少一種結合蛋白或至少一種宿主細胞與在MHC分子背景中之HPV16 E7 11-19肽抗原決定基形成複合物，且以螢光活化細胞分選(FACS)、酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫化學、西方墨點法或細胞內流式分析之形式偵測複合物。
在本發明所涵蓋之一態樣中，本文提供用於偵測個體中之以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之程度的診斷方法，其包括：a)使自個體獲得之樣品與本文所述之至少一種結合蛋白、至少一種宿主細胞或宿主細胞之群體接觸；及b)偵測反應性水準，其中與對照水準相比更高水準之反應性指示個體中以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之程度。
在一些實施例中，反應性水準由T細胞活化或效應功能，諸如但不限於T細胞增殖、殺傷或細胞介素釋放指示。對照水準可為參考數字或未暴露於以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之健康個體的水準。
可自個體獲得生物樣品，用於確定對如本文所述之肽抗原(例如HPV16 E7 11-19抗原)之免疫反應的存在及水準。如本文所用，「生物樣品」可為血液樣品(可從中製備血清或血漿)、生檢標本、體液(例如血液、經分離之PBMC、經分離之T細胞、肺灌洗液、腹水、黏膜沖洗液、滑液等)、骨髓、淋巴結、組織外植體、器官培養物或來自個體或生物來源之任何其他組織或細胞製劑。亦可在接受任何醫藥組合物之前自個體獲得生物樣品，該生物樣品可用作建立基線資料之對照。
抗原特異性T細胞反應通常根據本文所述之任何T細胞功能參數(例如增殖、細胞介素釋放、CTL活性、改變之細胞表面標記物表型等)藉由比較觀測到之T細胞反應來確定，比較可在暴露於適當背景中之同源抗原之T細胞(例如，當由免疫相容之抗原呈現細胞呈現時，用於啟動或活化T細胞之抗原)與來自相同來源群體之代之以暴露於結構上不同或不相關之對照抗原的T細胞之間進行。對同源抗原之反應比對照抗原之反應大，具有統計學意義，表明抗原特異性。
免疫反應之水準，諸如細胞毒性T淋巴細胞(CTL)免疫反應，可藉由本文所述及所屬領域常規實踐之眾多免疫學方法中之任一種來確定。例如，CTL免疫反應之水準可在投與本文所述之任一種由例如T細胞表現之結合蛋白之前及之後測定。用於測定CTL活性之細胞毒性分析可使用所屬領域常規實踐之若干種技術及方法中之任一種來進行(例如，Henkart等人, 「Cytotoxic T-Lymphocytes」, Fundamental Immunology, Paul (編輯) (2003 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA), 第1127-50頁，以及其中引用之參考文獻)。
本發明部分提供用於準確分類生物樣品是否與所關注之輸出，諸如所關注之標靶，諸如HPV16 E7 11-19之表現相關之方法、系統及代碼。在一些實施例中，本發明可用於使用統計演算法及/或經驗資料將樣品(例如來自個體)分類為與以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症相關或處於對以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症之療法有反應或無反應之風險下。
用於偵測HPV16 E7 11-19之量或活性且因此可用於分類樣品是否可能或不可能對以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症之療法有反應之示例性方法涉及使生物樣品與能夠偵測生物樣品中HPV16 E7 11-19之量或活性的試劑，諸如本文所述之HPV16 E7 11-19免疫原性肽或結合劑接觸。在一些實施例中，方法進一步包括諸如自測試個體獲得生物樣品。在一些實施例中，使用至少一種試劑，其中兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或更多種此類試劑可組合使用(例如，在夾心ELISA中)或串聯使用。在某些情況下，統計演算法係單一學習統計分類器系統。例如，單一學習統計分類器系統可用於基於預測或概率值以及生物標記物之存在或水準對樣品進行分類。使用單一學習統計分類器系統通常以至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之靈敏度、特異性、陽性預測值、陰性預測值及/或總體準確度對樣品進行分類。
其他合適統計演算法為所屬領域技術人員熟知。例如，學習統計分類器系統包括一種機器學習演算法技術，其能夠適應複雜資料集(例如，所關注之標記物組)且根據此類資料集做出決策。在一些實施例中，使用單一學習統計分類器系統，諸如分類樹(例如，隨機森林)。在其他實施例中，使用2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個學習統計分類器系統之組合，較佳串聯使用。學習統計分類器系統之實例包括但不限於使用以下之彼等系統：歸納學習(例如，決策/分類樹，諸如隨機森林、分類及回歸樹(C&RT)、提升樹等)、概率近似正確(Probably Approximately Correct，PAC)學習、連接學習(例如，神經網路(NN)、人工神經網路(ANN)、神經模糊網路(NFN)、網路結構、感知器(諸如多層感知器)、多層前饋網路、神經網路之應用、信念網路中之貝氏學習(Bayesian learning)等)、強化學習(例如，已知環境中之被動學習(諸如樸素學習、自適應動態學習及時間差異學習)、未知環境中之被動學習、未知環境中之主動學習、學習動作-價值函數、強化學習之應用等)及遺傳演算法及進化程式化。其他學習統計分類器系統包括支持向量機(例如，核方法)、多變量自適應回歸樣條(MARS)、雷文伯格-馬誇特演算法(Levenberg-Marquardt algorithm)、高斯-牛頓演算法(Gauss-Newton algorithm)、混合高斯、梯度下降演算法及學習向量量化(LVQ)。在某些實施例中，本發明所涵蓋之方法進一步包括將樣品分類結果發送給臨床醫師，諸如腫瘤科醫生。
在一些實施例中，在個體之診斷(例如，包括HLA分型及/或雜合性丟失(LOH)以確定與所關注TCR與TCR-HLA複合物結合的相容性)之後向個體投與治療有效量的基於診斷之確定之治療。
在一些實施例中，方法進一步涉及獲得對照生物樣品(例如，來自未患以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症之個體、處於緩解中之個體、病症對療法敏感之個體、病症正在進展之個體或其他所關注之個體之生物樣品)。
在本文所述之分析方法之一些實施例中，將HPV16 E7 11-19表現(例如，在來自個體之樣品中)與預定對照(標準)樣品進行比較。來自個體之樣品通常來自患病組織，諸如癌細胞或組織。對照樣品可來自同一個體或來自不同個體。對照樣品通常為正常的未患病樣品。然而，在一些實施例中，諸如用於疾病分期或用於評估治療效果，對照樣品可來自患病組織。對照樣品可為來自若干個不同個體之樣品之組合。在一些實施例中，將來自個體之HPV16 E7 11-19表現量測值與預定水準進行比較。此預定水準通常自正常樣品中獲得。如本文所述，「預定」表述可用於(僅作為示例)評估可選擇進行治療之個體，評估對癌症之反應，及/或評估對組合癌症療法之反應。可在患有或未患以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症之患者群體中確定預定之生物標記物量及/或活性量測值。預定之生物標記物量及/或活性量測值可為單個數字，同樣適用於每個患者，或者預定之生物標記物量及/或活性量測值可根據特定患者亞群而變化。個體之年齡、體重、身高及其他因素可能影響個體之預定之生物標記物量及/或活性量測值。此外，可為各個體個別確定預定之生物標記物量及/或活性。在一個實施例中，在本文所述之方法中確定及/或比較之量係基於絕對量測值。
在另一實施例中，在本文描述之方法中確定及/或比較之量係基於相對量測值，諸如比率(例如，治療前與治療後之生物標記物複本數、水準及/或活性，此類生物標記物量測值相對於加標或人造對照，此類生物標記物量測值相對於管家基因之表現，及其類似物)。舉例而言，相對分析可基於治療前生物標記物量測值與治療後生物標記物量測值相比之比率。治療前生物標記物量測值可在治療開始之前的任何時間進行。治療後生物標記物量測值可在治療開始之後的任何時間進行。在一些實施例中，治療後生物標記物量測值在治療開始之後1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週、19週、20週或更長時間測定，且甚至更長時間至無限期，以持續監測。治療可包括單獨或與其他藥劑，諸如抗癌劑，如化學療法或免疫檢查點抑制劑組合的治療以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症之療法。
預定之HPV16 E7 11-19表現可為任何合適之標準。例如，預定之HPV16 E7 11-19表現可自正在評估個體選擇之相同或不同個體獲得。在一個實施例中，預定之生物標記物量及/或活性量測值可自同一患者之先前評估獲得。以此方式，可隨時間監測患者選擇之進展。此外，若個體為人類，則對照可自對另一個人或多人之評估獲得，諸如選定人類組。以此方式，正在評估選擇之人之選擇程度可與合適之其他人進行比較，諸如與所關注之人處於類似情況之其他人，諸如罹患相似或相同疾患及/或相同種族之人。
在一些實施例中，HPV16 E7 11-19表現自預定水準之變化為約0.1倍、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1.0倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍或5.0倍或更大，或介於兩者之間的任何範圍，包括端點。當量測係基於相對變化，諸如基於治療前生物標記物量測值與治療後生物標記物量測值之比率時，此類截止值同樣適用。
在一些實施例中，可藉由諸如使用本文所述之組合物偵測或定量HPV16 E7 11-19多肽或其抗原來偵測及/或定量HPV16 E7 11-19表現。可藉由所屬領域技術人員熟知之多種方法中之任一種來偵測及定量多肽，諸如藉由免疫擴散、免疫電泳、放射免疫分析(RIA)、酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)、免疫螢光分析、西方墨點法、結合物-配位體分析、免疫組織化學技術、凝集、補體分析、高效液相層析法(HPLC)、薄層層析法(TLC)、超擴散層析法及其類似方法(例如，Basic and Clinical Immunology, Sites及Terr編輯, Appleton and Lange, Norwalk, Conn. 第217-262頁, 1991)。 b .治療方法
在本發明所涵蓋之一態樣中，本文提供用於預防及/或治療以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發及/或用於誘導針對諸如藉由感染HPV病毒株，如HPV16而表現HPV16 E7 11-19抗原之所關注之細胞(諸如過度增殖細胞)之免疫反應的方法。在一些實施例中，方法包括向個體投與治療有效量之本文所述之組合物，該組合物包含表現至少一種結合蛋白之細胞。本發明所涵蓋之方法亦可用於確定個體中許多以HPV16 E7 11-19表現為特徵之不同病症，諸如本文所述之彼等病症對療法之反應性。
在一些實施例中，以MAGEA1表現為特徵之病症為癌症。術語「癌症」或「腫瘤」或「過度增殖」係指存在具有致癌細胞典型特徵，諸如不受控制之增殖、永生、侵襲或轉移潛能、快速生長及某些特徵性形態特徵之細胞。在一些實施例中，由於免疫檢查點蛋白，諸如PD-1、PD-L1、PD-L2及/或CTLA-4之表現及活性，此類細胞部分或全部表現出此類特徵。
癌細胞通常呈腫瘤形式，但此類細胞可能單獨存在於動物體內，或者可能為非致瘤性癌細胞，諸如血液癌症，如白血病中。如本文所用，術語「癌症」包括癌前癌及惡性癌。癌症包括但不限於多種癌症：癌瘤，包括膀胱癌(包括加速及轉移性膀胱癌)、乳癌、結腸癌(包括結直腸癌)、腎癌、肝癌、肺癌(包括小細胞肺癌及非小細胞肺癌及肺腺癌)、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、泌尿生殖道癌、淋巴系統癌、直腸癌、喉癌、胰臟癌(包括外分泌性胰臟癌)、食道癌、胃癌、膽囊癌、子宮頸癌、甲狀腺癌及皮膚癌(包括鱗狀細胞癌)；淋巴譜系之造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkins lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤、毛細胞淋巴瘤、組織細胞性淋巴瘤及伯克特氏淋巴瘤(Burketts lymphoma)；骨髓譜系造血腫瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病、骨髓增生異常症候群、髓性白血病及前髓細胞性白血病；中樞及周圍神經系統腫瘤，包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤及神經鞘瘤；間葉來源之腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；其他腫瘤，包括黑色素瘤、色素性異皮病、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌及畸胎癌；黑色素瘤、不可切除之III期或IV期惡性黑色素瘤、鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神經膠質瘤、胃腸道癌、腎癌、卵巢癌、肝癌、結直腸癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、胰臟癌、多形性膠質母細胞瘤、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝腫瘤、乳癌、結腸癌、頭頸癌、胃癌、生殖細胞腫瘤、骨癌、骨腫瘤、成人骨惡性纖維組織細胞瘤；兒童骨惡性纖維組織細胞瘤、肉瘤、小兒肉瘤、鼻竇自然殺手細胞、贅瘤、漿細胞贅瘤；骨髓增生異常症候群；神經母細胞瘤；睪丸生殖細胞腫瘤、眼內黑色素瘤、骨髓增生異常症候群；骨髓增生異常/骨髓增生性疾病、滑膜肉瘤、慢性髓性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、費城染色體陽性急性淋巴母細胞性白血病(Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia，Ph+ ALL)、多發性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、慢性淋巴球性白血病、肥大細胞增多症及任何與肥大細胞增多症相關之症狀及其任何轉移。此外，疾病包括色素性蕁麻疹、肥大細胞增多症(諸如瀰漫性皮膚肥大細胞增多症)、人類孤立性肥大細胞瘤以及狗肥大細胞瘤及一些罕見亞型，如大皰性、紅皮性及遠血管擴張性肥大細胞增多症、伴有血液病之肥大細胞增多症(諸如骨髓增生性或骨髓增生異常症候群)，或急性白血病、與肥大細胞增多症相關之骨髓增生性病症、肥大細胞白血病以及其他癌症。其他癌症亦包括在病症範圍內，包括但不限於以下：癌瘤，包括膀胱癌、尿路上皮癌、乳癌、結腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰臟癌、胃癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、睪丸癌(尤其是睪丸精原細胞瘤)及皮膚癌；包括鱗狀細胞癌；胃腸道間質瘤(「GIST」)；淋巴譜系造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴球性白血病、急性淋巴母細胞性白血病、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、毛細胞淋巴瘤及伯克特氏淋巴瘤；骨髓譜系造血腫瘤，包括急性及慢性骨髓性白血病及前髓細胞性白血病；間葉來源之腫瘤，包括纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤；其他腫瘤，包括黑色素瘤、精原細胞瘤、畸胎癌、神經母細胞瘤及神經膠質瘤；中樞及周圍神經系統腫瘤，包括星形細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤及神經鞘瘤；間葉來源之腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；以及其他腫瘤，包括黑色素瘤、色素性異皮病、角化棘皮瘤、精原細胞瘤、甲狀腺濾泡癌、畸胎癌、化學療法難治性非精原細胞瘤型生殖細胞瘤及卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)，以及其任何轉移瘤。適用於本發明所涵蓋之方法之癌症類型的其他非限制性實例包括人類肉瘤及癌瘤，例如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓質癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝腫瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威爾姆斯氏瘤(Wilms' tumor)、骨癌、腦瘤、肺癌(包括肺腺癌)、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤，聽神經瘤、寡樹突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤；白血病，諸如急性淋巴球性白血病及急性骨髓細胞性白血病(骨髓母細胞性、前髓細胞性、骨髓單核球性、單核球性及紅血球性)；慢性白血病(慢性骨髓細胞性(顆粒球性)白血病及慢性淋巴球性白血病)；及真性紅細胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病及非霍奇金氏病)、多發性骨髓瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)及重鏈病。在一些實施例中，癌症本質上為上皮的且包括但不限於膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、婦科癌症、腎癌、喉癌、肺癌、口腔癌、頭頸癌、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌或皮膚癌。在一些實施例中，上皮癌為非小細胞肺癌、非乳頭狀腎細胞癌、子宮頸癌、卵巢癌(例如漿液性卵巢癌)或乳癌。可以各種其他方式表徵上皮癌，包括但不限於漿液性、子宮內膜樣、黏液性、透明細胞、布倫納(Brenner)或未分化。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：(晚期)非小細胞肺癌、黑色素瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、(晚期)膀胱尿路上皮癌、(晚期)腎癌(RCC)、高微衛星不穩定性癌、經典霍奇金氏淋巴瘤、(晚期)胃癌、(晚期)子宮頸癌、原發性縱隔B細胞淋巴瘤、(晚期)肝細胞癌、侵襲性乳癌、膀胱尿路上皮癌及(晚期)默克爾細胞癌(merkel cell carcinoma)。
此外，本文所述之組合物亦可以組合療法投與以進一步調節所需活性。額外藥劑包括但不限於化學治療劑、激素、抗血管生成劑、放射性標記之化合物或手術、冷凍療法及/或放射療法。前述治療方法可與其他形式之習知療法(例如，所屬領域技術人員熟知之癌症標準護理療法)聯合投與，在習知療法之前或之後連續投與。例如，此等調節劑可與治療有效劑量之化學治療劑一起投與。在另一實施例中，此等調節劑與化學療法聯合投與以增強化學治療劑之活性及功效。Physicians' Desk Reference (PDR)揭示已用於治療各種癌症之化學治療劑之劑量。治療有效之此等上述化學治療藥物之給藥方案及劑量將視所治療之特定黑色素瘤、疾病程度及所屬領域之醫師熟悉之其他因素而定，且可由醫師決定。
單獨或與其他療法(諸如癌症療法)組合的使用本文所述之一或多種組合物之療法可用於接觸表現HPV16 E7 11-19之細胞及/或投與至所需個體，諸如指示為可能對療法有反應之個體。在另一實施例中，一旦個體指示為不可能對療法有反應(例如，根據本文所述之診斷或預後方法評估)，則可避免此類療法，且可推薦及/或投與替代治療方案(諸如靶向及/或非靶向癌症療法)。
術語「靶向療法」係指投與選擇性地與所選生物分子相互作用從而治療癌症之藥劑。例如，關於抑制免疫檢查點抑制劑之靶向療法可與本發明所涵蓋之方法組合使用。
術語「免疫療法(immunotherapy)」或「免疫療法(immunotherapies)」通常係指以有益方式調節免疫反應之任何策略，且涵蓋藉由包括誘導、增強、抑制或以其他方式改變免疫反應之方法治療罹患疾病或有感染疾病或疾病復發風險之個體，以及使用個體免疫系統之某些部分來對抗疾病(諸如癌症)之任何治療。在投與或未投與一或多種用於達成該目的之藥劑下，個體自身之免疫系統受到刺激(或抑制)。經設計以引發或放大免疫反應之免疫療法被稱為「活化免疫療法」。經設計以減少或抑制免疫反應之免疫療法被稱為「抑制免疫療法」。在一些實施例中，免疫療法對所關注之細胞，諸如癌細胞具有特異性。在一些實施例中，免疫療法可為「非靶向」的，係指投與不選擇性地與免疫系統細胞相互作用但調節免疫系統功能之藥劑。非靶向療法之代表性實例包括但不限於化學療法、基因療法及放射療法。
一些形式之免疫療法為靶向療法，其可包括例如使用癌症疫苗及/或致敏之抗原呈現細胞。舉例而言，溶瘤病毒係一種能夠感染及溶解癌細胞，同時不傷害正常細胞之病毒，此使得其在癌症療法中可能有用。溶瘤病毒之複制既促進腫瘤細胞之破壞，亦在腫瘤部位放大劑量。其亦可用作抗癌基因之載體，使該等基因能夠被特異性地遞送至腫瘤部位。免疫療法可涉及用於短期保護宿主之被動免疫，此藉由投與針對癌症抗原或疾病抗原之預先形成之抗體(例如，投與視情況與化學治療劑或毒素連接之針對腫瘤抗原之單株抗體)來實現。免疫療法亦可能側重於使用癌細胞株之細胞毒性淋巴球識別抗原決定基。或者，反義多核苷酸、核酶、RNA干擾分子、三螺旋多核苷酸及其類似物可用於選擇性地調節與腫瘤或癌症之起始、進展及/或病理學相關之生物分子。類似地，免疫療法可採取基於細胞之療法之形式。例如，授受性細胞免疫療法係一類使用免疫細胞(諸如T細胞)之免疫療法，該等免疫細胞對患者之癌症具有天然反應性或經基因工程改造之反應性，且接著再轉移回癌症患者體內。注射大量活化之腫瘤特異性T細胞可誘導癌症完全及持久之消退。
免疫療法可涉及用於短期保護宿主之被動免疫，此藉由投與針對癌症抗原或疾病抗原之預先形成之抗體(例如，投與視情況與化學治療劑或毒素連接之針對腫瘤抗原之單株抗體)來實現。免疫療法亦可能側重於使用癌細胞株之細胞毒性淋巴球識別抗原決定基。或者，反義多核苷酸、核酶、RNA干擾分子、三螺旋多核苷酸及其類似物可用於選擇性地調節與腫瘤或癌症之起始、進展及/或病理學相關之生物分子。
在一些實施例中，免疫治療劑為免疫刺激分子之促效劑；免疫抑制分子之拮抗劑；趨化介素之拮抗劑；刺激T細胞活化之細胞介素之促效劑；對抑制T細胞活化之細胞介素有拮抗或抑制作用之藥劑；及/或與B7家族之膜結合蛋白結合之藥劑。在一些實施例中，免疫治療劑為免疫抑制分子之拮抗劑。在一些實施例中，免疫治療劑可為針對細胞介素、趨化介素及生長因子之藥劑，例如中和腫瘤相關之細胞介素、趨化介素、生長因子及其他可溶性因子，包括IL-10、TGF-β及VEGF之抑制作用的中和抗體。
在一些實施例中，免疫療法包含一或多種免疫檢查點之抑制劑。術語「免疫檢查點」係指CD4+及/或CD8+ T細胞之細胞表面上之一組分子，其藉由調節抗癌免疫反應，諸如下調或抑制抗腫瘤免疫反應來微調免疫反應。免疫檢查點蛋白為所屬領域中熟知，且包括但不限於CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、ICOS、HVEM、PD-L2、CD200R、CD160、gp49B、PIR-B、KRLG-1、KIR家族受體、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3 (CD223)、IDO、GITR、4-IBB、OX-40、BTLA、SIRPα (CD47)、CD48、2B4 (CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、HHLA2、嗜乳脂蛋白及A2aR (參見例如WO 2012/177624)。該術語進一步涵蓋生物活性蛋白片段，以及編碼全長免疫檢查點蛋白之核酸。
一些免疫檢查點為「免疫抑制性免疫檢查點」，其涵蓋抑制、下調或遏制免疫系統功能(例如免疫反應)之分子(例如蛋白質)。例如，PD-L1 (計劃性死亡配位體1)，亦稱為CD274或B7-H1，係一種傳遞抑制信號，減少T細胞增殖以遏制免疫系統之蛋白質。CTLA-4 (細胞毒性T淋巴球相關蛋白4)，亦稱為CD152，係一種在抗原呈現細胞之表面上的蛋白質受體，其用作免疫檢查點(「關閉」開關)來下調免疫反應。TIM-3 (T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域-3)，亦稱為HAVCR2，係一種細胞表面蛋白，其用作免疫檢查點來調節巨噬細胞活化。VISTA (T細胞活化之V域Ig遏制因子)係一種I型跨膜蛋白，其可用作免疫檢查點來抑制T細胞效應功能且維持周圍耐受性。LAG-3 (淋巴球活化基因3)係一種免疫檢查點受體，其負向調控T細胞之增殖、活化及穩態。BTLA (B及T淋巴球衰減因子)係一種經由與腫瘤壞死家族受體(TNF-R)之相互作用來抑制T細胞之蛋白質。KIR (殺手細胞免疫球蛋白樣受體)係在NK細胞及少數T細胞上表現之蛋白質家族，其可遏制NK細胞之細胞毒活性。在一些實施例中，免疫治療劑可為對免疫抑制酶具有特異性之藥劑，諸如可阻斷精胺酸酶(ARG)及吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO) (一種遏制T細胞及NK細胞之免疫檢查點蛋白)活性之抑制劑，其改變免疫抑制腫瘤微環境中胺基酸精胺酸及色胺酸之分解代謝。抑制劑可包括但不限於靶向表現ARG之M2巨噬細胞之 N-羥基-L-Arg (NOHA)、硝基阿司匹林(nitroaspirin)或西地那非(sildenafil) (Viagra®)，可同時阻斷ARG及一氧化氮合酶(NOS)；及IDO抑制劑，諸如1-甲基-色胺酸。該術語進一步涵蓋生物活性蛋白片段，以及編碼全長免疫檢查點蛋白及其生物活性蛋白片段之核酸。在一些實施例中，該術語進一步涵蓋根據本文提供之同源描述之任何片段。
相比之下，其他免疫檢查點為「免疫刺激性」的，涵蓋活化、刺激或促進免疫系統功能(例如免疫反應)之分子(例如蛋白質)。在一些實施例中，免疫刺激分子為CD28、CD80 (B7.1)、CD86 (B7.2)、4-1BB (CD137)、4-1BBL (CD137L)、CD27、CD70、CD40、CD40L、CD122、CD226、CD30、CD30L、OX40、OX40L、HVEM、BTLA、GITR及其配位體GITRL、LIGHT、LTβR、LTαβ、ICOS (CD278)、ICOSL (B7-H2)及NKG2D。CD40 (分化簇40)係一種在抗原呈現細胞上發現之為細胞活化所必需的共刺激蛋白。OX40，亦稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員4 (TNFRSF4)或CD134，藉由防止T細胞死亡且隨後增加細胞介素之產生來參與活化後免疫反應之維持。CD137係腫瘤壞死因子受體(TNF-R)家族之成員，可共刺激活化T細胞以增強增殖及T細胞存活。CD122係介白素-2受體(IL-2)蛋白之次單元，其促進未成熟T細胞分化為調控、效應或記憶T細胞。CD27係腫瘤壞死因子受體超家族之成員，且用作共刺激免疫檢查點分子。CD28 (分化簇28)係一種在T細胞上表現之蛋白質，其提供T細胞活化及存活所需之共刺激信號。GITR (糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白)，亦稱為TNFRSF18及AITR，係一種在調控性T細胞維持之顯性免疫自體耐受性中起關鍵作用之蛋白質。ICOS (誘導型T細胞共刺激物)，亦稱為CD278，係一種CD28超家族共刺激分子，其在活化T細胞上表現且在T細胞信號傳導及免疫反應中發揮作用。
免疫檢查點及其序列為所屬領域中熟知，且代表性實施例在下面進一步描述。免疫檢查點通常與成對之抑制性受體及天然結合搭配物(例如，配位體)有關。例如，PD-1多肽係能夠將抑制信號傳遞至免疫細胞從而抑制免疫細胞效應功能之抑制性受體，或者例如當以可溶之單體形式存在時，能夠促進免疫細胞之共刺激(例如，藉由競爭性抑制)。較佳PD-1家族成員與PD-1共享序列一致性且結合一或多個B7家族成員，諸如B7-1、B7-2、PD-1配位體及/或抗原呈現細胞上之其他多肽。術語「PD-1活性」包括PD-1多肽例如藉由與抗原呈現細胞上之天然PD-1配位體嚙合而在活化免疫細胞中調節抑制信號之能力。免疫細胞中抑制信號之調節引起免疫細胞增殖及/或細胞介素分泌之調節。因此，術語「PD-1活性」包括PD-1多肽結合其天然配位體之能力、調節免疫細胞抑制信號之能力及調節免疫反應之能力。術語「PD-1配位體」係指PD-1受體之結合搭配物，且包括PD-L1 (Freeman等人(2000 ) J. Exp. Med.192:1027-1034)及PD-L2 (Latchman等人 (2001) Nat. Immunol.2:261)。術語「PD-1配位體活性」包括PD-1配位體多肽結合其天然受體(例如PD-1或B7-1)之能力、調節免疫細胞抑制信號之能力及調節免疫反應之能力。
如本文所用，術語「免疫檢查點療法」係指使用抑制免疫抑制性免疫檢查點，諸如抑制其核酸及/或蛋白質之藥劑。一或多種此類免疫檢查點之抑制可阻斷或以其他方式中和抑制性信號傳導，從而上調免疫反應，從而更有效地治療癌症。可用於抑制免疫檢查點之示例性藥劑包括可結合及/或滅活或抑制免疫檢查點蛋白或其片段之抗體、小分子、肽、肽模擬物、天然配位體及天然配位體之衍生物；以及可下調免疫檢查點核酸或其片段之表現及/或活性的RNA干擾、反義、核酸適體等。用於上調免疫反應之示例性藥劑包括針對一或多種免疫檢查點蛋白之抗體，其阻斷蛋白質與其天然受體之間的相互作用；一或多種免疫檢查點蛋白之非活化形式(例如，顯性陰性多肽)；阻斷一或多種免疫檢查點蛋白與其天然受體之間的相互作用之小分子或肽；結合其天然受體之融合蛋白(例如，與抗體或免疫球蛋白之Fc部分融合之免疫檢查點抑制蛋白之細胞外部分)；阻斷免疫檢查點核酸轉錄或轉譯之核酸分子；及其類似物。此類藥劑可直接阻斷一或多種免疫檢查點與其天然受體(例如抗體)之間的相互作用，以防止抑制性信號傳導且上調免疫反應。或者，藥劑可間接阻斷一或多種免疫檢查點蛋白與其天然受體之間的相互作用，以防止抑制性信號傳導且上調免疫反應。例如，免疫檢查點蛋白配位體之可溶形式，諸如穩定之細胞外域，可與其受體結合，以間接降低受體與合適配位體結合之有效濃度。在一個實施例中，單獨或組合使用抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及/或抗PD-L2抗體來抑制免疫檢查點。用於阻斷PD-1路徑之治療劑包括拮抗性抗體及可溶性PD-L1配位體。針對PD-1及PD-L1/2抑制路徑之拮抗劑可包括但不限於針對PD-1或PD-L1/2之拮抗性抗體(例如，17D8、2D3、4H1、5C4 (亦稱為納武單抗(nivolumab)或BMS-936558)、4A11、7D3及5F4，美國專利第8,008,449號中揭示；AMP-224、匹地利珠單抗(pidilizumab) (CT-011)、派姆單抗(pembrolizumab)及美國專利第8,779,105號、第8,552,154號、第8,217,149號、第8,168,757號、第8,008,449號、第7,488,802號、第7,943,743號、第7,635,757號及第6,808,710號中揭示之抗體。類似地，額外代表性檢查點抑制劑可為但不限於針對抑制性調節因子CTLA-4 (抗細胞毒性T淋巴球抗原4抗細胞毒性T淋巴球抗原4)之抗體，諸如伊匹單抗(ipilimumab)、曲美木單抗(tremelimumab) (完全人類化)、抗CD28抗體、抗CTLA-4黏附素、抗CTLA-4域抗體、單鏈抗CTLA-4抗體片段、重鏈抗CTLA-4片段、輕鏈抗CTLA-4片段及其他抗體，諸如以下中揭示之彼等抗體：美國專利第8,748,815號；第8,529,902號；第8,318,916號；第8,017,114號；第7,744,875號；第7,605,238號；第7,465,446號；第7,109,003號；第7,132,281號；第6,984,720號；第6,682,736號；第6,207,156號；及第5,977,318號，以及歐洲專利第1212422號、美國專利公開案第2002/0039581號及第2002/086014號，及Hurwitz等人(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.95:10067-10071。
以PD-1、PD-L1、PD-L2及CTLA-4為例之免疫檢查點活性、配位體、阻斷及其類似方面之代表性定義通常適用於其他免疫檢查點。
術語「非靶向療法」係指投與不選擇性地與所選生物分子相互作用但治療癌症之藥劑。非靶向療法之代表性實例包括但不限於化學療法、基因療法及放射療法。
在一個實施例中，使用化學療法。化學療法包括投與化學治療劑。此類化學治療劑可為但不限於選自以下化合物組之彼等化學治療劑：鉑化合物、細胞毒性抗生素、抗代謝物、抗有絲分裂劑、烷化劑、砷化合物、DNA拓撲異構酶抑制劑、紫杉烷類、核苷類似物、植物生物鹼及毒素；及其合成衍生物。示例性藥劑包括但不限於烷化劑：氮芥(例如環磷醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、曲磷醯胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、雌莫司汀(estramustine)及美法崙(melphalan))、亞硝基脲(例如卡莫司汀(carmustine，BCNU)及洛莫司汀(lomustine，CCNU))、烷基磺酸鹽(例如白消安(busulfan)及曲奧舒凡(treosulfan))、三氮烯(例如達卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide))、順鉑(cisplatin)、曲奧舒凡及曲磷醯胺；植物生物鹼：長春花鹼(vinblastine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxol)；DNA拓撲異構酶抑制劑：替尼泊苷(teniposide)、克立那托(crisnatol)及絲裂黴素(mitomycin)；抗葉酸劑：甲胺喋呤(methotrexate)、黴酚酸(mycophenolic acid)及羥基脲；嘧啶類似物：5-氟尿嘧啶、去氧氟尿苷(doxifluridine)及胞嘧啶阿拉伯醣；嘌呤類似物：巰基嘌呤及硫鳥嘌呤；DNA抗代謝物：2'-去氧-5-氟尿苷、甘胺酸阿非迪黴素(aphidicolin glycinate)及吡唑并咪唑；及抗有絲分裂劑：軟海綿素、秋水仙鹼及根瘤菌素。類似地，其他示例性藥劑包括含鉑化合物(例如，順鉑、卡鉑、奧沙利鉑)、長春花生物鹼(例如，長春新鹼(vincristine)、長春花鹼、長春地辛(vindesine)及長春瑞濱(vinorelbine))、紫杉醇(例如，太平洋紫杉醇或太平洋紫杉醇等效物，諸如奈米粒子白蛋白結合型太平洋紫杉醇(ABRAXANE)、二十二碳六烯酸結合型太平洋紫杉醇(DHA-太平洋紫杉醇、Taxoprexin)、聚麩胺酸結合型太平洋紫杉醇(PG-太平洋紫杉醇、聚麩太平洋紫杉醇(paclitaxel poliglumex)、CT-2103、XYOTAX)、腫瘤活化前藥(TAP) ANG1005 (Angiopep-2與三個太平洋紫杉醇分子結合)、太平洋紫杉醇-EC-1(太平洋紫杉醇與識別erbB2之肽EC-1結合)及葡萄糖結合之太平洋紫杉醇，例如2'-太平洋紫杉醇甲基2-吡喃葡萄糖基琥珀酸酯；多西紫杉醇、紫杉醇)、表鬼臼苦素(例如，依託泊苷(etoposide)、磷酸依託泊苷、替尼泊苷、拓撲替康(topotecan)、9-胺基喜樹鹼、喜樹鹼、伊立替康(irinotecan)、克立那托、絲裂黴素C (mytomycin C))、抗代謝物、DHFR抑制劑(例如，甲胺喋呤、二氯甲胺喋呤、三甲胺喋呤、依達曲沙(edatrexate))、IMP去氫酶抑制劑(例如黴酚酸、噻唑呋林(tiazofurin)、利巴韋林(ribavirin)及EICAR)、核糖核苷酸還原酶抑制劑(例如羥基脲及去鐵胺)、尿嘧啶類似物(例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷、去氧氟尿苷、瑞曲塞(ratitrexed)、替加氟-尿嘧啶(tegafur-uracil)、卡培他濱(capecitabine))、胞嘧啶類似物(例如，阿糖胞苷(ara C)、胞嘧啶阿拉伯醣及氟達拉濱(fludarabine))、嘌呤類似物(例如，巰基嘌呤及硫鳥嘌呤)、維生素D3類似物(例如，EB 1089、CB 1093及KH 1060)、異戊二烯化抑制劑(例如，洛伐他汀(lovastatin))、多巴胺能神經毒素(例如，1-甲基-4-苯基吡錠離子)、細胞週期抑制劑(例如，星形孢菌素)、放線菌素(actinomycin) (例如，放線菌素D (actinomycin D)、放線菌素D (dactinomycin))、博萊黴素(bleomycin) (例如，博萊黴素A2、博萊黴素B2、培洛黴素(peplomycin))、蒽環黴素(anthracycline) (例如，道諾黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、聚乙二醇化脂質體多柔比星、伊達比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone))、MDR抑制劑(例如，維拉帕米(verapamil))、Ca 2+ATP酶抑制劑(例如，毒胡蘿蔔素(thapsigargin))、伊馬替尼(imatinib)、沙利度胺(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide)、酪胺酸激酶抑制劑(例如，阿西替尼(axitinib) (AG013736)、波舒替尼(bosutinib) (SKI-606)、西地尼布(cediranib) (RECENTIN TM、AZD2171)、達沙替尼(dasatinib) (SPRYCEL®、BMS-354825)、厄洛替尼(erlotinib) (TARCEVA®)、吉非替尼(gefitinib) (IRESSA®)、伊馬替尼(imatinib) (Gleevec®、CGP57148B、STI-571)、拉帕替尼(lapatinib) (TYKERB®、TYVERB®)、來他替尼(lestaurtinib) (CEP-701)、來那替尼(neratinib) (HKI-272)、尼羅替尼(nilotinib) (TASIGNA®)、司馬尼布(semaxanib) (司馬尼布(semaxinib)、SU5416)、舒尼替尼(sunitinib) (SUTENT®、SU11248)、托西尼布(toceranib) (PALLADIA®)、凡德他尼(vandetanib) (ZACTIMA®、ZD6474)、瓦他拉尼(vatalanib) (PTK787、PTK/ZK)、曲妥珠單抗(trastuzumab) (HERCEPTIN®)、貝伐單抗(bevacizumab) (AVASTIN®)、利妥昔單抗(rituximab) (RITUXAN®)、西妥昔單抗(cetuximab) (ERBITUX®)、帕尼單抗(panitumumab) (VECTIBIX®)、蘭尼單抗(ranibizumab) (Lucentis®)、尼羅替尼(nilotinib) (TASIGNA®)、索拉非尼(sorafenib) (NEXAVAR®)、依維莫司(everolimus) (AFINITOR®)、阿崙單抗(alemtuzumab) (CAMPATH®)、吉妥單抗(gemtuzumab ozogamicin) (MYLOTARG®)、替西羅莫司(temsirolimus) (TORISEL®)、ENMD-2076、PCI-32765、AC220、乳酸多韋替尼(dovitinib lactate) (TKI258、CHIR-258)、BIBW 2992 (TOVOK TM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120 (VARGATEF®)、AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、替沃紮尼(tivozanib) (AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647及/或XL228)、蛋白酶體抑制劑(例如 、硼替佐米(bortezomib) (VELCADE®))、mTOR抑制劑(例如，雷帕黴素(rapamycin)、替西羅莫司(CCI-779)、依維莫司(RAD-001)、地磷莫司(ridaforolimus)、AP23573 (Ariad)、AZD8055 (AstraZeneca)、BEZ235 (Novartis)、BGT226 (Norvartis)、XL765 (Sanofi Aventis)、PF-4691502 (Pfizer)、GDC0980 (Genentech)、SF1126 (Semafoe)及OSI-027 (OSI))、奧利默森(oblimersen)、吉西他濱、洋紅黴素(carminomycin)、甲醯四氫葉酸(leucovorin)、培美曲塞(pemetrexed)、環磷醯胺、達卡巴嗪、丙卡比嗪(procarbizine)、潑尼松龍(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、喜樹鹼、普卡黴素(plicamycin)、天冬醯胺酶、胺基喋呤、甲胺喋呤、卟啉黴素(porfiromycin)、美法崙、異長春鹼(leurosidine)、長春羅新(leurosine)、苯丁酸氮芥、曲貝替定(trabectedin)、丙卡巴肼(procarbazine)、園皮海綿內酯(discodermolide)、洋紅黴素、胺基喋呤及六甲蜜胺(hexamethyl melamine)。亦可使用包含一或多種化學治療劑之組合物(例如，FLAG、CHOP)。FLAG包含氟達拉濱、胞嘧啶阿拉伯醣(Ara-C)及G-CSF。CHOP包含環磷醯胺、長春新鹼、多柔比星及潑尼松(prednisone)。在另一實施例中，使用PARP (例如，PARP-1及/或PARP-2)抑制劑，且此類抑制劑為所屬領域熟知(例如，奧拉帕利(Olaparib)、ABT-888、BSI-201、BGP-15 (N-Gene Research Laboratories公司)；INO-1001 (Inotek Pharmaceuticals公司)；PJ34 (Soriano等人, 2001；Pacher等人, 2002b)；3-胺基苯甲醯胺(Trevigen)；4-胺基-1,8-萘醯亞胺(Trevigen)；6(5H)-菲啶酮(Trevigen)；苯甲醯胺(美國專利Re. 36,397)；及NU1025 (Bowman等人)。作用機制通常與PARP抑制劑結合PARP且降低其活性之能力有關。PARP催化β-菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)轉化為菸鹼醯胺及聚-ADP-核糖(PAR)。聚(ADP-核糖)及PARP均與轉錄、細胞增殖、基因組穩定性及致癌作用之調控有關(Bouchard等人(2003) Exp. Hematol.31:446-454)；Herceg (2001) Mut. Res.477:97-110)。聚(ADP-核糖)聚合酶1 (PARP1)係修復DNA單股斷裂(SSB)之關鍵分子(de Murcia J.等人 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.94:7303-7307；Schreiber等人 (2006) Nat. Rev. Mol. Cell Biol.7:517-528；Wang等人 (1997) Genes Dev.11:2347-2358)。藉由抑制PARP1功能來剔除SSB修復可誘導DNA雙股斷裂(DSB)，此可能會在具有缺陷同源定向DSB修復之癌細胞中引發合成致死(Bryant等人(2005) Nature434:913-917；Farmer等人 (2005) Nature434:917-921)。前述化學治療劑之實例為說明性的而非限制性的。
在另一實施例中，使用放射療法。放射療法中使用之放射線可為電離輻射。放射療法亦可為γ射線、X射線或質子束。放射療法之實例包括但不限於外束放射療法、放射性同位素(I-125、鈀、銥)之間質植入、放射性同位素(諸如鍶-89)、胸部放射療法、腹膜內P-32放射療法及/或全腹部及盆腔放射療法。有關放射療法之一般概述，參見Hellman, 第16章: Principles of Cancer Management: Radiation Therapy, 第6版, 2001；DeVita等人編輯, J. B. Lippencott Company, Philadelphia。放射療法可作為外束放射或遠隔治療來投與，其中放射線自遠程源引導。放射治療亦可作為內部療法或近接治療來投與，其中將放射源置放在身體內部靠近癌細胞或腫瘤塊之位置。亦涵蓋光動力療法之用途，其包括投與光敏劑，諸如血卟啉及其衍生物、維托泊芬(BPD-MA)、酞菁、光敏劑Pc4、去甲氧基-竹紅菌素A (demethoxy-hypocrellin A)；及2BA-2-DMHA。
在另一實施例中，使用激素療法。激素治療性治療可包含例如激素促效劑、激素拮抗劑(例如氟他胺(flutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate，LUPRON)、LH-RH拮抗劑)、激素生物合成及加工抑制劑及類固醇(例如地塞米松、類視色素(retinoids)、三角肌(deltoid)、倍他米松(betamethasone)、皮質醇、可體松(cortisone)、潑尼松、去氫睾酮、糖皮質激素、鹽皮質激素、雌激素、睾酮、助孕素)、維生素A衍生物(例如，全反式維甲酸(ATRA))；維生素D3類似物；抗助孕素(例如米非司酮(mifepristone)、奧那司酮(onapristone))或抗雄激素(例如醋酸環丙孕酮(cyproterone acetate))。
在一態樣中，本文提供一種在個體中引發對表現HPV16 E7 11-19抗原之細胞之免疫反應的方法。在一些實施例中，該方法包括：向個體投與本文所述之醫藥組合物，其中當投與至個體時，該醫藥組合物引發對表現HPV16 E7 11-19抗原之細胞之免疫反應。
在一些實施例中，免疫反應可包括細胞介導之免疫反應。細胞免疫反應係涉及T細胞且可在活體外或活體內測定之反應。舉例而言，全身細胞免疫反應可測定為在投與醫藥組合物之後的合適時間自個體取樣之細胞(例如，周邊血液白血球(PBL))中的T細胞增殖活性。在將例如PBMC與刺激物一起培育適當時段之後，可測定[ 3H]胸苷併入。可使用流動式細胞測量術來測定正在增殖之T細胞子集。
在本發明所涵蓋之另一態樣中，本文提供之方法包括向人類及非人類哺乳動物投與如上所述。亦考慮獸醫應用。在一些實施例中，個體可為可在其中引發免疫反應之任何活生物體。
在一些實施例中，可在任何適當時間投與該醫藥組合物。舉例而言，可在治療患有以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之個體之前或期間進行投與，且在以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發變得臨床上不可偵測之後繼續投與。亦可在顯示復發徵象之個體中繼續投與。
在一些實施例中，可以治療或預防有效量投與醫藥組合物。可使用已知之程序且以足以實現所需作用之劑量及時段向個體投與醫藥組合物。
在一些實施例中，可在任何合適部位向個體投與醫藥組合物。可使用所屬領域公知之方法實現投與。可藉由直接注射或藉由所屬領域中使用之任何其他方式，包括但不限於血管內、腦內、非經腸、腹膜內、靜脈內、硬膜外、脊椎內、胸骨內、關節內、滑膜內、鞘內、動脈內、心內或肌肉內投與，將包括細胞之藥劑引入所需部位。例如，所關注之個體可藉由各種途徑植入移植之細胞。此類途徑包括但不限於靜脈內投與、皮下投與、向特定組織投與(例如，局灶性移植)、股骨骨髓腔內註射、脾臟內註射、胎肝腎囊下投與及其類似途徑。在某些實施例中，本發明所涵蓋之癌症疫苗藉由瘤內或皮下注射至個體。細胞可在一次輸注中投與，或經由在足以產生所需作用之限定時段內連續輸注來投與。關於移植之細胞之移植、植入評估及標記物表型分析之示例性方法為所屬領域中熟知(參見例如Pearson等人 (2008) Curr. Protoc. Immunol.81:15.21.1-15.21.21；Ito等人 (2002) Blood100:3175-3182；Traggiai等人 (2004) Science304:104-107；Ishikawa等人 Blood(2005) 106:1565-1573；Shultz等人 (2005) J. Immunol.174:6477-6489；及Holyoake等人 (1999) Exp. Hematol.27:1418-1427)。
在一些實施例中，將以有效產生所需反應(引發免疫反應抑或預防性或治療性治療以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發及/或相關症狀)之量及時段投與劑量。
醫藥組合物可在其他療法之後、之前或同時給與，該等其他療法包括亦引發個體之免疫反應之療法。舉例而言，個體可預先或同時由其他形式之免疫調節劑治療，此類其他療法可以不干擾本文所述之組合物之免疫原性的方式提供。
投與可由護理人員(例如，醫師、獸醫)適當地計時，且可視個體之臨床疾患、投與目標及/或亦考慮或投與之其他療法而定。在一些實施例中，可投與初始劑量，且監測個體之免疫學及/或臨床反應。免疫監測之合適手段包括使用患者之周圍血液淋巴球(PBL)作為反應物且使用本文所述之免疫原性肽或肽-MHC複合物作為刺激物。亦可藉由在投與部位處之延遲發炎反應來確定免疫反應。適當時可在初始劑量之後給與一或多個劑量，通常每月、每半月或每週一次，直至實現所需作用。此後，可根據需要給與額外加強劑量或維持劑量，尤其當免疫學或臨床益處顯示減弱時。
通常，適當劑量及治療方案以足以提供益處之量提供活性分子或細胞。可藉由在經治療之個體中建立與未治療之個體相比改善之臨床結果(例如，更頻繁之完全或部分緩解，或更長之無病存活期)來監測此類反應。對病毒蛋白之預先存在之免疫反應的增加通常與臨床結果之改善相關。通常可使用常規之標準增殖、細胞毒性或細胞介素分析來評估此類免疫反應。
對於預防性使用，劑量應足以預防與疾病或病症相關之疾病、延緩其發作或減輕其嚴重程度。根據本文所述之方法投與之免疫原性組合物之預防益處可藉由進行臨床前(包括活體外、離體及活體內動物研究)及臨床研究，且藉由適當統計學、生物學分析及臨床方法及技術對由此獲得之資料進行分析來確定，所有此等均可由普通技術人員輕鬆實踐。
如本文所用，組合物之投與係指將其遞送至個體，與遞送途徑或方式無關。投與可連續或間歇進行，且可非經腸投與。投與可用於治療已確認患有公認疾患、疾病或疾病病況之個體，或用於治療易患或有風險發展此類疾患、疾病或疾病病況之個體。與輔助療法之共同投與可包括以任何順序及任何給藥方案同時及/或依序遞送多種藥劑(例如，具有一或多種細胞介素之經工程改造之免疫細胞；免疫抑制療法，諸如鈣調神經磷酸酶抑制劑、皮質類固醇、微管抑制劑、低劑量之黴酚酸前藥或其任何組合)。
在一些實施例中，將複數劑本文所述之宿主細胞(例如，經工程改造之免疫細胞)投與至個體，其可以投與之間約2至約4週之間隔投與。
本發明所涵蓋之治療或預防方法可作為治療過程或方案之一部分投與至個體，該治療過程或方案可包含在投與本發明揭示之單位劑量、細胞或組合物之前或之後進行額外治療。例如，在一些實施例中，接受單位劑量宿主細胞(例如，經工程改造之免疫細胞)之個體正在接受或以前接受過造血細胞移植(HCT；包括清髓性及非清髓性HCT)。在任何前述實施例中，用於HCT之造血細胞可為「通用供體」細胞，其經修飾以減少或消除編碼選自MHC、抗原及結合蛋白之多肽產物之一或多種內源基因的表現(例如，根據本文所述之方法藉由染色體基因剔除)。
用於進行細胞移植之技術及方案為所屬領域中已知且可包含移植任何合適之供體細胞，諸如源自臍帶血、骨髓或周邊血液之細胞、造血幹細胞、動員幹細胞或來自羊水之細胞。因此，在一些實施例中，本發明所涵蓋之宿主細胞(例如，經工程改造之免疫細胞)可與乾細胞療法一起或在幹細胞療法之後不久投與。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之方法可進一步包括投與一或多種額外藥劑以在組合療法中治療疾病或病症(例如，以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發)。例如，在一些實施例中，組合療法包括將本發明所涵蓋之宿主細胞或結合蛋白與抗病毒劑(並行、同時或依次)投與。在一些實施例中，組合療法包括將本發明所涵蓋之宿主細胞或結合蛋白與洛匹那韋(lopinavir)/利托那韋(ritonavir)、氯喹(chloroquine)、利巴韋林、類固醇藥物、羥氯喹及/或乾擾素α一起投與。在一些實施例中，組合療法包括將本發明所涵蓋之宿主細胞、組合物或單位劑量之宿主細胞與二次療法，諸如手術、抗體、疫苗或其任何組合一起投與。
在一些實施例中，個體為人類，諸如患有以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發的人類。在一些實施例中，個體為嚙齒類動物，諸如小鼠。在一些此類實施例中，小鼠為轉殖基因小鼠，諸如表現人類MHC (亦即，HLA)分子，諸如HLA-A2之小鼠(例如，Nicholson等人 (2012) Adv. Hematol.2012:404081)。
在一些實施例中，個體為表現人類TCR之轉殖基因小鼠或為抗原陰性小鼠(例如，Li等人 (2010) Nat Med.16:1029-1034及Obenaus等人 (2015) Nat. Biotechnol.33:402-407)。在一些實施例中，個體為表現人類HLA分子及人類TCR之轉殖基因小鼠。
在一些實施例中，諸如在個體為轉殖基因HLA小鼠之情況下，將經鑑定之TCR修飾為例如嵌合或人類化的。在一些實施例中，諸如類似於已知之結合蛋白人類化方法，修飾TCR支架。 c. 篩選方法
本發明所涵蓋之另一態樣涵蓋篩選分析。
本發明涵蓋對與HPV16 E7 11-19或其抗原結合或調節HPV16 E7 11-19或其抗原活性之試劑，諸如測試蛋白進行篩選之分析。此類試劑包括但不限於抗體、蛋白質、融合蛋白、小分子及核酸。在一些實施例中，用於鑑定調節免疫反應之試劑之方法需要測定候選試劑調節HPV16 E7 11-19活性及進一步調節所關注之免疫反應的能力，諸如調節細胞毒性T細胞活化及/或活性、癌細胞對免疫檢查點療法之敏感性及其類似方面。
在一些實施例中，分析為無細胞或基於細胞之分析，其包括將標靶與測試劑接觸，且諸如藉由量測如下所述之直接或間接參數，測定測試劑調節(例如，上調或下調)標靶之量及/或活性的能力。
在一些實施例中，分析為基於細胞之分析，諸如包括以下之分析：使(a)所關注之細胞與測試劑接觸且測定測試劑調節標靶之量及/或活性的能力，諸如結合特性。測定多肽相互結合或相互作用之能力可藉由例如量測直接結合或藉由量測免疫細胞活化或功能之參數來實現。
在另一實施例中，分析為基於細胞之分析，其包括使細胞(諸如癌細胞)與免疫細胞(例如，細胞毒性T細胞)及測試劑接觸，且諸如藉由量測如下所述之直接或間接參數，測定測試劑調節標靶之量及/或活性，及/或調節免疫反應的能力。
上文及本文描述之方法亦可適用於測試一或多種已知調節本文描述之一或多種生物標記物之量及/或活性的試劑，以確認該一或多種生物標記物之調節及/或確認試劑對所需表型讀數之影響，諸如調節之免疫反應、對免疫檢查點阻斷之敏感性及其類似方面。
在一些實施例中，測定測試劑(例如抗體、融合蛋白、肽或小分子)調節一組給定多肽之間的相互作用之能力可藉由測定該組多肽之一或多個成員之活性來實現。例如，蛋白質及/或一或多種結合搭配物之活性可藉由偵測細胞第二信使(例如細胞內信號傳導)之誘導、偵測適當受質之催化/酶活性、偵測報導基因(包含與編碼可偵測標記物之核酸可操作性連接之標靶響應性調控元件，例如氯黴素乙醯轉移酶)之誘導或偵測由蛋白質及/或一或多種結合搭配物調節之細胞反應來測定。例如，可藉由在增殖分析中量測化合物調節免疫細胞共刺激或抑制之能力，或藉由乾擾該多肽與識別其一部分之抗體結合之能力來測定測試劑與該多肽結合或相互作用之能力。
當添加至活體外分析時，調節標靶量及/或活性，諸如與一或多種結合搭配物之相互作用之試劑可藉由其抑制免疫細胞增殖及/或效應功能，或誘導無能、純系缺失及/或耗竭之能力來鑑定。例如，可在經由活化受體刺激信號轉導之試劑存在下培養細胞。許多公認之細胞活化讀數可用於量測在試劑存在之情況下的細胞增殖或效應功能(例如，抗體產生、細胞介素產生、吞噬作用)。使用所屬領域已知之技術，藉由量測試劑實現所量測之增殖或效應功能降低的能力，可容易地確定測試劑阻斷此活化之能力。
例如，如Freeman等人 (2000) J. Exp. Med.192:1027及Latchman等人 (2001) Nat. Immunol.2:261所述，可在T細胞分析中測試本發明所涵蓋之試劑抑制或增強共刺激之能力。可自人類PBMC中分離CD4+ T細胞且用活化抗CD3抗體進行刺激。T細胞之增殖可藉由 3H胸苷併入來量測。可在分析中有或無CD28共刺激下進行分析。可用Jurkat T細胞及來自PBMC之PHA-胚細胞進行類似分析。
或者，可測試本發明所涵蓋之試劑調節細胞之細胞介素產生之能力，該等細胞介素由免疫細胞產生或其產生在免疫細胞中響應於一或多種生物標記物之調節而增強或抑制。所關注之免疫細胞釋放之指示性細胞介素可藉由ELISA或藉由阻斷細胞介素之抗體抑制免疫細胞增殖或由細胞介素誘導之其他細胞類型增殖之能力來鑑定，諸如在實例部分中描述之彼等。活體外免疫細胞共刺激分析亦可用於鑑定可藉由調節一或多種生物標記物來調節之細胞介素的方法中。例如，若在共刺激時誘導之特定活性，諸如免疫細胞增殖，無法藉由添加已知細胞介素之阻斷抗體來抑制，則該活性可能由未知細胞介素之作用引起。在共刺激之後，可藉由習知方法自培養基中純化此細胞介素，且藉由其誘導免疫細胞增殖之能力量測其活性。為鑑定可能在誘導耐受性中起作用之細胞介素，可使用如上所述之活體外T細胞共刺激分析。在此情況下，將給與T細胞初級活化信號且與選定之細胞介素接觸，但不會給與共刺激信號。在洗滌免疫細胞及靜息後，細胞將再次受到初級活化信號及共刺激信號之攻擊。若免疫細胞無反應(例如，增殖或產生細胞介素)，則其已變得耐受且細胞介素未阻止耐受性之誘導。然而，若免疫細胞有反應，則細胞介素阻止耐受性之誘導。彼等能夠阻止耐受性之誘導之細胞介素可與阻斷B淋巴球抗原之試劑一起在活體內靶向阻斷，作為在移植接受者或患有自體免疫性疾病之個體中誘導耐受性之更有效手段。
在一些實施例中，本發明所涵蓋之分析為一種無細胞分析法，用於篩選調節生物標記物及/或一或多種結合搭配物之間的相互作用之試劑，其包括使多肽及一或多種天然結合搭配物或其生物活性部分與測試劑接觸且測定測試化合物調節多肽與一或多種天然結合搭配物或其生物活性部分之間的相互作用之能力。可如上所述直接或間接測定測試化合物之結合。在一個實施例中，分析包括將多肽或其生物活性部分與其結合搭配物接觸以形成分析混合物，使該分析混合物與測試化合物接觸，且測定測試劑與分析混合物中之多肽相互作用的能力，其中測定測試劑與多肽相互作用之能力包括測定測試劑與結合搭配物相比優先結合多肽或其生物活性部分之能力。
在一些實施例中，無論基於細胞之分析抑或無細胞之分析，均可進一步分析測試劑以確定其是否影響多肽與一或多種結合搭配物以及其他結合搭配物之間的相互作用之結合及/或活性。其他有用之結合分析方法包括使用即時生物分子相互作用分析(BIA) (Sjolander及Urbaniczky (1991) Anal. Chem.63:2338-2345及Szabo等人 (1995) Curr. Opin. Struct. Biol.5:699-705)。如本文所用，「BIA」係一種用於即時研究生物特異性相互作用之技術，無需標記任何相互作用物(例如，Biacore®)。表面電漿子共振(SPR)之光學現象之變化可用作生物多肽之間即時反應之指示。所關注之多肽可固定在Biacore®晶片上，且可測試多種試劑(阻斷抗體、融合蛋白、肽或小分子)與所關注之多肽之結合。Fitz等人(1997) Oncogene15:613描述使用BIA技術之一個實例。
本發明所涵蓋之無細胞分析適用於使用可溶性及/或膜結合形式之蛋白質。在使用膜結合形式蛋白質之無細胞分析之情況下，可能需要利用增溶劑以使蛋白質之膜結合形式保持在溶解狀態。此類增溶劑之實例包括非離子型去汙劑，諸如正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麥芽糖苷、辛醯基-N-甲基葡糖醯胺、癸醯基-N-甲基葡糖醯胺、Triton ®X-100、Triton ®X-114、Thesit ®、異十三聚(乙二醇醚) n、3-[(3-膽醯胺丙基)二甲基胺基]-1-丙磺酸酯(CHAPS)、3-[(3-膽醯胺丙基)二甲基胺基]-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CHAPSO)或N-十二烷基=N,N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸酯。
在上述分析方法之一或多個實施例中，可能需要固定任一多肽以促進一種或兩種蛋白質之複合形式與未復合形式之分離，以及適應分析之自動化。可在任何適合容納反應物之容器中實現測試劑與多肽之結合。此類容器之實例包括微量滴定盤、試管及微量離心管。在一個實施例中，可提供一種融合蛋白，其添加一個域，該域允許一種或兩種蛋白質與基質結合。例如，基於麩胱甘肽-S-轉移酶之多肽融合蛋白，或麩胱甘肽-S-轉移酶/標靶融合蛋白，可吸附至麩胱甘肽瓊脂糖珠(Sigma Chemical, St. Louis, MO)或麩胱甘肽衍生之微量滴定盤上，接著與測試化合物組合，且將混合物在有助於形成複合物之條件下(例如，在鹽及pH之生理條件下)培育。培育後，洗滌珠粒或微量滴定盤孔以移除任何未結合之組分，在珠粒之情況下固定基質，例如如上所述，直接或間接測定複合物。或者，複合物可自基質中解離，且使用標準技術測定多肽結合或活性之水準。
本發明進一步關於藉由上述篩選分析鑑定之新穎試劑。因此，在適當模型系統中進一步使用如本文所述鑑定之試劑在本發明之範疇內。例如，如本文所述鑑定之試劑可用於模型系統中以確定用此類試劑治療之功效、毒性或副作用。或者，如本文所述鑑定之試劑可用於模型系統中以確定此類試劑之作用機制。此外，本發明係關於藉由上述篩選分析鑑定之新穎試劑用於本文所述之治療的用途。 d. 臨床試驗期間之作用監測
監測以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之療法(例如化合物、藥物、疫苗、細胞療法及其類似物)對免疫反應，諸如T細胞反應性(例如，結合之存在及/或T細胞活化及/或效應功能)之影響，不僅可應用於基礎候選HPV16 E7 11-19抗原結合分子篩選，亦可應用於臨床試驗中。例如，可在罹患以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之個體的臨床試驗中監測本文所述之結合分子及相關組合物，諸如核酸、宿主細胞、醫藥組合物及其類似物增加針對所關注之細胞，諸如表現HPV16 E7 11-19抗原之過度增殖細胞之免疫反應(例如，T細胞免疫反應)的有效性。在此類臨床試驗中，結合之存在及/或T細胞活化及/或效應功能(例如，T細胞增殖、殺傷及/或細胞介素釋放)可用作特定細胞、組織或系統之表型之「讀出」或標記物。類似地，可在患有以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之個體的臨床試驗中監測如本文所述之利用經工程改造以表現結合蛋白(例如，TCR、TCR之抗原結合片段、CAR或包含TCR及效應域之融合蛋白)之T細胞的適應性T細胞療法增加對表現HPV16 E7 11-19抗原之所關注之細胞(諸如過度增殖細胞)之免疫反應的有效性。在此類臨床試驗中，結合之存在及/或T細胞活化及/或效應功能(例如，T細胞增殖、殺傷及/或細胞介素釋放)可用作特定細胞、組織或系統之表型之「讀出」或標記物。
舉例而言，可能希望增加以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之療法的投與以增加自個體獲得之樣品與一或多種結合蛋白或相關組合物之間的反應性之存在或水準，諸如增加以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之療法的有效性。根據此類實施例，自個體獲得之樣品與一或多種結合蛋白或相關組合物之間的反應性之存在或水準可用作以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之療法的有效性的指標，即使缺乏可觀測到表型反應。類似地，亦可使用對自個體獲得之樣品與一或多種結合蛋白或相關組合物之間的反應性之存在或水準的分析，諸如藉由直接結合分析、螢光活化細胞分選(FACS)、酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫化學、西方墨點法或細胞內流式分析來選擇將接受以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之療法的患者。
例如，在直接結合分析中，免疫原性肽或抗原肽-MHC (pMHC)複合物可與放射性同位素或酶標記偶合，以便可藉由偵測標記之免疫原性肽或pMHC複合物來確定結合。舉例而言，免疫原性肽或pMHC複合物可直接或間接地用 125I、 35S、 14C或 3H標記，且藉由對放射性發射直接計數或藉由閃爍計數來偵測放射性同位素。或者，可用例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶或螢光素酶以酶法標記免疫原性肽或pMHC複合物，且藉由測定適當受質至產物之轉化來偵測酶標記。亦可使用標準結合或酶分析分析法來測定免疫原性肽或pMHC複合物與免疫細胞，諸如T細胞及/或NK細胞之間的相互作用。在上述分析方法之一或多個實施例中，可能需要固定免疫原性肽或pMHC複合物以適應分析之自動化。
在不標記任何相互作用物之情況下測定試劑調節所關注之參數之能力亦在本發明之範疇內。例如，可使用微生理計來偵測多肽之間的相互作用，而無需標記將監測之多肽(McConnell等人 (1992) Science257:1906-1912)。如本文所用，「微生理計」(例如，Cytosensor®)為一種分析儀器，其使用光定址電位感測器(LAPS)量測細胞酸化其環境之速率。此酸化速率之變化可用作化合物與受體之間的相互作用之指標。
可在任何適合容納反應物之容器中實現免疫原性肽或pMHC複合物與免疫細胞，諸如T細胞及/或NK細胞之結合。此類容器之非限制性實例包括微量滴定盤、試管及微量離心管。免疫原性肽或pMHC複合物之經固定形式亦可包括與固相結合之免疫原性肽或pMHC複合物，該固相如多孔、微孔(具有小於約一微米之平均孔徑)或大孔(具有超過約10微米之平均孔徑)材料，諸如膜、纖維素、硝基纖維素或玻璃纖維；珠粒，諸如由瓊脂糖或聚丙烯醯胺或乳膠製成之珠粒；或器皿、盤或孔之表面，諸如由聚苯乙烯製成之器皿、盤或孔之表面。
在一些實施例中，自個體獲得之樣品對本文所述之一或多種結合蛋白或對本文所述之一或多種宿主細胞的反應性可藉由偵測結合之存在及/或T細胞活化及/或效應功能來量測。術語「T細胞活化」係指選自增殖、分化、細胞介素分泌、釋放細胞毒性效應分子、細胞毒活性及表現活化標記物之T淋巴球，尤其係指細胞毒性T淋巴球之一或多種細胞反應。
細胞介素之產生及/或釋放可藉由此項技術中熟知之方法，例如ELISA、酶聯免疫吸附點樣(ELISPOT)、Luminex®分析、細胞內細胞介素染色及流動式細胞測量術及其組合(例如細胞內細胞介素染色及流動式細胞測量術)量測。其可根據所執行之方法測定。
如本文所用，術語「細胞介素」係指介導及/或調節生物或細胞功能或過程(例如免疫性、炎症及造血)之分子。如本文所用，術語「細胞介素」包括「淋巴激素」、「趨化介素」、「單核因子」及「介白素」。有用細胞介素之實例為GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β、TGF-β、TNF-α及TNF-β。
由抗原特異性誘導或刺激免疫反應產生之T細胞增殖及純系擴增可例如經由併入非放射性分析，諸如氚化胸腺嘧啶分析或MTT分析來測定。
可使用此項技術中通常實行之若干種技術及方法中之任一者進行測定CTL活性之細胞毒性分析(例如Henkart等人 (2003) Fund. Immunol.1127-1150)。用於量測抗原特異性T細胞反應性之方法的額外描述可見於例如美國專利第10,208,086號及美國專利公開案第2017/0209573號中。 e. 預測醫學
本發明亦關於預測醫學領域，其中診斷分析、預後分析及監測臨床試驗用於達成預後(預測)目的，從而預防性地治療個體。因此，本發明所涵蓋之一個態樣涵蓋診斷分析，用於確定(例如，偵測)生物樣品(例如，血液、血清、細胞或組織)中HPV16 E7 11-19之存在、不存在、量及/或活性水準或對HPV16 E7 11-19之反應性，從而確定患有以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症之個體是否可能對療法有反應，無論在原始狀態下抑或在複發時。此類分析可用於達成預後或預測目的，從而在以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症發作之前或複發之後預防性治療個體。
此外，本文所述之診斷方法可用於鑑定患有與HPV16 E7 11-19表現或缺乏相關之病症或有患上該病症之風險之個體。如本文所用，術語「異常」包括HPV16 E7 11-19相對於正常水準上調或下調。異常表現或活性包括表現或活性增加或減少，以及不遵循表現之正常發展模式或表現之亞細胞模式的表現或活性。例如，異常水準意欲包括生物標記物基因或調控序列中之突變，或染色體基因之擴增，導致所關注之生物標記物上調或下調之情況。如本文所用，術語「不想要」包括涉及生物反應，諸如免疫細胞活性之不想要之現象。
本文所述之分析，諸如前述診斷分析或以下分析，可用於鑑定患有與HPV16 E7 11-19失調相關之病症或有發展該病症之風險之個體。因此，本發明提供一種用於鑑定與異常或不想要之HPV16 E7 11-19調控相關之病症之方法，其中自個體獲得測試樣品且偵測HPV16 E7 11-19表現，其中HPV16 E7 11-19表現之存在將患者診斷為患有與異常或不想要之HPV16 E7 11-19表現相關之病症或有發展該病症之風險。如本文所用，「測試樣品」係指自所關注之個體獲得之生物樣品。例如，測試樣品可為生物流體(例如，腦脊髓液或血清)、細胞樣品或組織，諸如腫瘤微環境、瘤週區域及/或瘤內區域之組織病理學切片。
此外，本文所述之預後分析可用於確定個體是否可投與本文所述之藥劑以治療與異常或不想要之HPV16 E7 11-19表現相關之此類病症。例如，此類方法可用於確定個體是否可用一種藥劑或藥劑之組合有效治療。因此，本發明提供用於確定個體是否可用本文所述之一或多種藥劑有效治療以治療與異常或不想要之HPV16 E7 11-19表現相關之病症的方法。
本文所述之方法可例如藉由利用包含至少一種本文所述之抗體試劑的預包裝之診斷套組來進行，該等套組可方便地用於例如臨床環境中以診斷展現出涉及所關注之生物標記物之疾病或病症之症狀或家族史的患者。
此外，表現所關注之生物標記物之任何細胞類型或組織均可用於本文所述之預後分析中。
此外，本文所述之預後方法可用於確定是否可向個體投與治療劑以治療以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症。 f. 臨床功效
臨床功效可藉由所屬領域已知之任何方法量測。例如，對療法之反應涉及以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症(例如腫瘤)對療法之任何反應，較佳地涉及諸如在開始新輔助或輔助化學療法後癌細胞數目、腫瘤塊及/或腫瘤體積之變化。可在新輔助或輔助情況下評估腫瘤反應，其中全身介入後腫瘤之大小可與藉由CT、PET、乳房X光攝影、超音波或觸診量測之初始大小及尺寸進行比較，且可在組織學上估計腫瘤之細胞結構，且與開始治療前進行之腫瘤生檢之細胞結構進行比較。反應亦可藉由卡尺量測或生檢或手術切除後之腫瘤病理學檢查來評估。反應可以定量方式記錄，諸如腫瘤體積或細胞結構之變化百分比，或藉由使用半定量評分系統，諸如殘餘癌負荷(Symmans等人(2007) J. Clin. Oncol.25:4414-4422)或米勒-佩恩評分(Miller-Payne score) (Ogston等人(2003) Breast (Edinburgh, Scotland) 12:320-327)，以定性方式記錄，如「病理完全反應」(pCR)、「臨床完全緩解」(cCR)、「臨床部分緩解」(cPR)、「臨床穩定疾病」(cSD)、「臨床進展性疾病」(cPD)或其他定性標準。腫瘤反應之評估可在新輔助或輔助療法開始後早期進行(例如，幾小時、幾天、幾週或較佳幾個月之後)。反應評估之典型終點為新輔助化學療法終止或手術切除殘留腫瘤細胞及/或腫瘤床時。提供在以上章節I中列出之術語定義方面的額外指導 VII .細胞療法
在本發明所涵蓋之另一態樣中，該等方法包括授受性細胞療法，其中向個體投與表現靶向MHC限制性抗原決定基之所提供分子的經基因工程改造之細胞(例如，表現結合蛋白(例如，TCR或CAR)或其抗原結合片段之細胞)。此類投與可以抗原靶向方式促進免疫細胞活化(例如，T細胞活化)，以便靶向表現HPV16 E7 11-19抗原之所關注之細胞(諸如過度增殖細胞)進行破壞。
因此，所提供之方法及用途包括用於授受性細胞療法之方法及用途。在一些實施例中，該等方法包括將細胞或含有細胞之組合物投與至個體、組織或細胞，諸如患有疾病、疾患或病症、有患上疾病、疾患或病症之風險或疑似患有疾病、疾患或病症之個體、組織或細胞。在一些實施例中，將細胞、群體及組合物投與至患有待治療之特定疾病或疾患之個體(例如，經由授受性細胞療法，諸如授受性T細胞療法)。在一些實施例中，將細胞或組合物投與至個體，諸如患有疾病或疾患或有患上疾病或疾患之風險之個體。在一些實施例中，該等方法由此治療(例如，改善)疾病或疾患之一或多種症狀。
用於授受性細胞療法之細胞投與方法為已知且可與所提供之方法及組合物聯合使用(例如，美國專利公開案第2003/0170238號；美國專利第4,690,915號；Rosenberg (2011) Nat. Rev. Clin. Oncol.8:577-585；Themeli等人 (2013) Nat. Biotechnol.31:928-933；Tsukahara等人 (2013) Biochem. Biophys. Res. Commun.438:84-89；及Davila等人 (2013) PLoS ONE8:e61338)。
在一些實施例中，藉由自體移植進行細胞療法(例如授受性細胞療法，諸如授受性T細胞療法)，其中自欲接受細胞療法之個體或自源自此類個體之樣品分離及/或以其他方式製備細胞。因此，在一些實施例中，細胞源自需要治療之個體，例如患者，且在分離及加工之後將細胞投與至同一個體。
在一些實施例中，藉由同種異體移植進行細胞療法(例如，授受性細胞療法，諸如授受性T細胞療法)，其中自除欲接受或最終接受細胞療法之個體以外之個體(例如，第一個體)分離及/或以其他方式製備細胞。在此類實施例中，接著將細胞投與至相同物種之不同個體(例如，第二個體)。在一些實施例中，第一個體及第二個體在遺傳學上一致(同基因型)。在一些實施例中，第一及第二個體在遺傳學上相似。在一些實施例中，第二個體表現與第一個體相同之HLA類別或超類型。
在一些實施例中，投與細胞、細胞群體或組合物之個體為靈長類動物，諸如人類。在一些實施例中，靈長類動物為猴或猿。個體可為雄性或雌性且可為任何合適之年齡，包括嬰兒、少年、青少年、成人及老年個體。在一些實施例中，個體為非靈長類哺乳動物，諸如嚙齒類動物。在一些實例中，患者或個體係經驗證用於疾病、授受性細胞療法及/或用於評估諸如細胞介素釋放症候群(CRS)之毒性結果的動物模型。
可藉由任何合適方式，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射、眼內注射、眼周注射、視網膜下注射、玻璃體內注射、經中隔注射、鞏膜下注射、脈絡膜內注射、前房內注射、結膜下注射(subconjectval injection)、結膜下注射(subconjuntival injection)、眼球筋膜下注射(sub-Tenon's injection)、眼球後注射、球周注射或後鞏膜旁遞送來投與結合分子，諸如TCR、TCR之抗原結合片段(例如，scTCR)及含有TCR之嵌合受體(例如，CAR)及表現其之細胞。在一些實施例中，藉由非經腸、肺內及鼻內投與結合分子，且若需要局部治療，則藉由病變內投與進行投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。給藥及投與可部分地視投與為短暫還是長期而定。各種給藥方案包括但不限於在多個時間點單次或多次投與、推注投與及脈衝輸注。
對於疾病之預防或治療，結合分子或細胞之適當劑量可視有待治療之疾病之類型、結合分子之類型、疾病之嚴重程度及病程、投與結合分子係出於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對結合分子之反應而定，且由主治醫師決定。在一些實施例中，組合物及分子以及細胞適合一次性或經一系列治療投與至患者。
在一些實施例中，細胞之投與量可為每公斤個體體重0.1×10 6個、0.2×10 6個、0.3×10 6個、0.4×10 6個、0.5×10 6個、0.6×10 6個、0.7×10 6個、0.8×10 6個、0.9×10 6個、1.0×10 6個、5.0×10 6個、1.0×10 7個、5.0×10 7個、1.0×10 8個、5.0×10 8個或更多個細胞，或介於兩者之間的任何範圍或介於兩者之間的任何值。移植之細胞數目可根據在給定時間量內所需之移植水準進行調整。通常，根據需要，可移植1×10 5至約1×10 9個細胞/公斤體重、約1×10 6至約1×10 8個細胞/公斤體重或約1×10 7個細胞/公斤體重或更多個細胞。在一些實施例中，相對於平均大小之小鼠，移植至少約0.1×10 6個、0.5×10 6個、1.0×10 6個、2.0×10 6個、3.0×10 6個、4.0×10 6個或5.0×10 6個總細胞係有效的。舉例而言，在一些實施例中，可將細胞或細胞亞型之個別群體以約一百萬至約一千億個細胞之範圍及/或以下細胞量/公斤體重投與至個體：諸如100萬至約500億個細胞(例如，約500萬個細胞、約2500萬個細胞、約5億個細胞、約10億個細胞、約50億個細胞、約200億個細胞、約300億個細胞、約400億個細胞，或由前述值中之任兩者限定之範圍)，諸如約1000萬至約1000億個細胞(例如，約2000萬個細胞、約3000萬個細胞、約4000萬個細胞、約6000萬個細胞、約7000萬個細胞、約8000萬個細胞、約9000萬個細胞、約100億個細胞、約250億個細胞、約500億個細胞、約750億個細胞、約900億個細胞或由前述值中之任兩者限定之範圍)，及在一些情況下，約1億個細胞至約500億個細胞(例如，約1.2億個細胞、約2.5億個細胞、約3.5億個細胞、約4.5億個細胞、約6.5億個細胞、約8億個細胞、約9億個細胞、約30億個細胞、約300億個細胞、約450億個細胞)或此等範圍之間及/或每公斤體重的任何值。劑量可視疾病或病症及/或患者及/或其他治療所特有之屬性而變化。
移植之細胞之植入可藉由多種方法中之任一種來評估，諸如但不限於腫瘤體積、細胞介素水準、投與時間、在移植後之一或多個時間點自個體獲得之所關注細胞之流動式細胞測量術分析及其類似方法。例如，基於時間之分析，等待1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天或可能標誌收穫腫瘤之時間。任何此類量度均為可根據熟知之參數進行調整之變數，以確定變數對針對抗癌免疫療法之反應之影響。此外，移植之細胞可與其他試劑共同移植，諸如細胞介素、細胞外基質、細胞培養支持物及其類似物。
細胞亦可在其他抗癌劑之前、同時或之後投與。
可組合及投與兩種或更多種細胞類型，諸如基於細胞之療法及幹細胞之授受性細胞轉移、癌症疫苗及基於細胞之療法及其類似物。例如，授受性基於細胞之免疫療法可與本發明所涵蓋之基於細胞之療法組合。在一些實施例中，基於細胞之藥劑可單獨使用或與額外的基於細胞之藥劑，諸如免疫療法，如授受性T細胞療法(ACT)組合使用。例如，經基因工程改造以識別CD19之T細胞用於治療濾泡性B細胞淋巴瘤。用於ACT之免疫細胞可為樹突狀細胞、T細胞(諸如CD8 +T細胞及CD4 +T細胞)、自然殺手(NK)細胞、NK T細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、淋巴因子活化殺手(LAK)細胞、記憶T細胞、調控T細胞(Treg)、輔助T細胞、細胞介素誘導之殺手(CIK)細胞及其任何組合。熟知之授受性基於細胞之免疫治療方式包括但不限於輻照之自體同源或同種異體腫瘤細胞、腫瘤溶解物或凋亡腫瘤細胞、基於抗原呈現細胞之免疫療法、基於樹突狀細胞之免疫療法、授受性T細胞轉移、授受性CAR T細胞療法、自體同源免疫增強療法(AIET)、癌症疫苗及/或抗原呈現細胞。此類基於細胞之免疫療法可經進一步修飾以表現一或多種基因產物，從而進一步調節免疫反應，諸如表現細胞介素，如GM-CSF，及/或表現腫瘤相關抗原(TAA)抗原，諸如Mage-1、gp-100及其類似物。本發明所涵蓋之藥劑(諸如癌細胞)與本發明所涵蓋之另一藥劑或其他組合物之比率可為相對於彼此1:1 (例如，等量之2種藥劑、3種藥劑、4種藥劑等)，但可以任何所需之量進行調節(例如，1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、4.5:1、5:1、5.5:1、6:1、6.5:1、7:1、7.5:1、8:1、8.5:1、9:1、9.5:1、10:1或更高)。
在一些實施例中，例如在個體為人類之情況下，劑量包括少於約1×10 8總結合蛋白(例如，表現TCR或CAR之細胞、T細胞或周邊血液單核細胞(PBMC)，例如在約1×10 6至1×10 8此類細胞範圍內，諸如2×10 6、5×10 6、1×10 7、5×10 7或1×10 8或全部此類細胞，或在前述值中之任兩者之間的範圍。
在一些實施例中，本文所述之細胞或相關組合物，諸如核酸、宿主細胞、醫藥調配物及其類似物可作為組合治療之一部分投與，諸如與另一治療介入(諸如另一抗體或經工程改造之細胞或受體或藥劑，諸如細胞毒性或治療劑)同時或以任何次序依序投與。
在一些實施例中，細胞或相關組合物可與一或多種額外治療劑共投與，或與另一治療介入聯合，同時或以任何次序依序投與。在一些情況下，細胞或相關組合物與另一療法共投與，其時間上足夠接近，使得細胞群體增強一或多種額外治療劑之作用，反之亦然。在一些實施例中，細胞或相關組合物在一或多種額外治療劑之前投與。在一些實施例中，細胞或相關組合物在一或多種額外治療劑之後投與。
在一些實施例中，一旦將細胞或相關組合物投與至個體(例如，人類)，即可藉由多種已知方法中之任一種量測細胞或相關組合物之生物活性。欲評估之參數包括活體內例如藉由成像或者活體外/離體例如藉由ELISA或流動式細胞測量術量測的經工程改造或天然T細胞或其他免疫細胞與抗原之特異性結合。在一些實施例中，可使用所屬領域中已知之任何合適分析或方法(例如，Kochenderfer等人 (2009) J. Immunother.32: 689-702及Herman等人 (2004) J. Immunol. Meth.285:25-40)來量測細胞破壞標靶細胞之能力。在一些實施例中，亦可藉由分析諸如CD107a、IFNγ、IL-2及TNFα之某些細胞介素之表現及/或分泌來量測細胞之生物活性。在一些實施例中，藉由評估諸如病毒負荷或負載減少之臨床結果來量測生物活性。
在一些實施例中，細胞以多種方式進行修飾，使得其治療或預防功效增加。舉例而言，由群體表現之結合蛋白(例如，經工程改造之TCR、CAR或其抗原結合片段)可直接或經由連接子間接與靶向部分結合。使化合物與靶向部分結合之實踐係所屬領域中已知(例如，Wadwa等人 (1995) J. Drug Targeting3:111及美國專利第5,087,616號)。
諸如細胞毒性淋巴球之免疫細胞可獲自任何合適來源，諸如周邊血液、脾臟及淋巴結。免疫細胞可呈粗製劑或呈經部分純化或實質上經純化之製劑形式使用，該等製劑可藉由標準技術獲得，該等技術包括但不限於涉及使用抗體之免疫磁性或流動式細胞測量術技術之方法。
在本發明所涵蓋之另一態樣中，本文提供一種用於引發對表現HPV16 E7 11-19抗原之細胞之免疫反應的方法，該方法包括以足以引發免疫反應之有效量向個體投與本文所述之表現結合蛋白(例如，經工程改造之TCR、CAR或其抗原結合片段)之細胞。在一些實施例中，本文提供一種治療或預防以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之方法，該方法包括向個體投與有效量的本文所述之表現結合蛋白(例如，經工程改造之TCR、CAR或其抗原結合片段)之細胞。在一個實施例中，細胞係全身投與，諸如藉由注射投與。或者，可例如經由直接注射至組織中來進行局部而非全身投與，諸如在儲槽或持續釋放調配物中。
在一些實施例中，本文所述之表現結合蛋白(例如，經工程改造之TCR、CAR或其抗原結合片段)之細胞可用作免疫調節組合物中之活性化合物，用於預防性或治療性治療以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發。在一些實施例中，HPV16 E7 11-19引發之抗原呈現細胞可用於產生淋巴球(例如，CD8 +T淋巴球、CD4 +T淋巴球及/或B淋巴球)，以進一步用於授受性轉移至具有本文所述之表現結合蛋白(例如，經工程改造之TCR、CAR或其抗原結合片段)之細胞的個體。
在一些實施例中，可將本文所述之表現結合蛋白(例如，經工程改造之TCR、CAR或其抗原結合片段)之細胞單獨或與淋巴球組合投與至個體以引發免疫反應，尤其引發對表現HPV16 E7 11-19抗原之細胞之免疫反應。
如上所述，可單次或多次投與單獨或與淋巴球組合的本文所述之表現結合蛋白(例如，經工程改造之TCR、CAR或其抗原結合片段)之細胞，其中細胞數目及治療由照護提供者(例如，醫師)選擇。類似地，單獨或與淋巴球組合之細胞可在醫藥學上可接受之載劑中投與。合適載劑可為細胞在其中生長之生長培養基，或任何合適緩衝培養基，諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水。細胞可單獨或作為與其他治療劑聯合之輔助療法投與。 VIII .套組及裝置
本發明亦涵蓋套組及裝置。舉例而言，套組或裝置可包含封裝於合適容器中之結合蛋白、包含編碼結合蛋白之序列之核酸或載體、包含核酸或載體及/或表現如本文所述之結合蛋白之宿主細胞、穩定MHC-肽複合物、佐劑、偵測試劑及其組合，且可進一步包含使用此類試劑之說明書。套組或裝置亦可含有其他組件，諸如封裝於單獨容器中之投與工具。套組或裝置可作為用於執行本發明所涵蓋之方法之單元來推銷、分售或銷售。
藉由以下實例進一步說明本揭示案，該等實例不應解釋為限制性的。 實例 實例 1 ：實例 2 之材料及方法a. 慢病毒包裝及慢病毒力價之定量
使用Lenti-X™ GoStix™ Plus (Takara Bio USA, Mountain View, CA)來包裝及定量HPV16-E7 11-19病毒構築體。簡言之，將HPV16-E7 11-19病毒構築體用PBS 1:100稀釋。將二十(20) ul之HPV16-E7 11-19病毒上清液施加至Lenti-X™ GoStix™ Plus盒樣品孔，且接著施加80 ul追加緩衝液。進行橫向流動測試10分鐘，且測試帶(T)將在5分鐘內出現，且若樣品含有充足慢病毒，則在10分鐘時達到最大強度。當測試正常運作時對照帶(C)將一直出現。在10分鐘之後，藉由在掃描窗中使用盒之輪廓，實現適當對準及成像焦距。樣品名稱出現在盒之輪廓的下方。一旦實現適當對準，輪廓即變綠，且盒將自動掃描。為計算未知儲液之實際IFU/ml，使用具有藉由CD8表現量測之已知力價的參考病毒(已知IFU/ml之病毒儲液)且經測試，獲得感染單位值以及GoStix™值GV。計算參考病毒之IFU/GV比率。使用Lenti-X™ GoStix™ Plus分析未知樣品以獲得GV (ng/ml p24)且進行以下計算[式：GV (未知) × (IFU/ml)/GV (參考) = IFU/ml (未知)]以確定IFU/ml。 b.    評估HPV16-E7 11-19TCR功能 (i) 對 T 細胞進行工程改造以表現 HPV16-E7 11-19 特異性 TCR
使用EasySep人類T細胞分離套組(StemCell Technologies)，根據製造商說明書自HLA-A*02:01陽性健康供體PBMC分離全T細胞。將經分離之T細胞用ImmunoCult CD3/CD28/CD2 T細胞活化劑混合物(StemCell Technologies)活化且在完全T細胞培養基(X-VIVO 15 [Lonza, Morristown, NJ]中培養隔夜，該培養基補充有5%人類血清[Sigma Aldrich]、1%青黴素(penicillin)-鏈黴素(streptomycin) [Thermo Fisher Scientific]、1X GlutaMax™補充劑[Thermo Fisher Scientific]、5 ng/mL IL-7 [R&D Systems]及50 IU/mL IL-2 [Sigma Aldrich])。活化24小時後，用HPV16-E7 11-19TCR病毒上清液轉導T細胞。轉導24小時後，將T細胞洗滌且轉移至G-Rex盤(Wilson Wolf, New Brighton, MN)或VECELL 96孔盤(Cosmo Bio, Carlsbad, CA)，且在活化後擴增總共7-11天。每2-3天T細胞培養物補充新鮮IL-2 (50 IU/mL)及IL-7 (5 ng/mL)及/或分開，以維持最適宜細胞密度。 (ii) 經工程改造之HPV16-E7 11-19 TCR 轉導之全 T 細胞的流動式細胞測量術
根據製造商說明書，將經工程改造之全T細胞用HLA-A*02:01 HPV16-E7 11-19(YMLDLQPET)  (Immudex) dextramer、TCR α/β PE-Cy7 (IP26，BioLegend)、CD8 PerCP-Cy5.5 (HIT8a，BioLegend)、CD4 APC-Cy7 (OKT4，Biolegend)及CD34 Alex Fluor 488 (QBEND/10，R&D Systems)及DAPI染色。接著在CytoFLEX流式細胞儀(Beckman Coulter)上操作細胞且使用FlowJo軟體(10版，TreeStar)分析。 (iii) 細胞株
T淋巴母細胞細胞株T2 (ATCC CRL-1992)、腺癌細胞株NCI-H1792 (ATCC CRL-5895)、表皮樣癌細胞株Ca Ski (ATCC CRL-1550)及鱗狀細胞癌細胞株SCC152 (ATCC CRL-3240)、SCC090 (ATCC CRL-3239)及SiHa (ATCC HTB-35)購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。T2細胞在含有20%熱失活FBS、1%青黴素-鏈黴素[Thermo Fisher Scientific]之IMDM中培養。Ca Ski及NCI-H1792細胞在含有10%熱失活FBS及1%青黴素-鏈黴素[Thermo Fisher Scientific]之RPMI 1640中培養。SCC152、SCC090及SiHa維持在含有10%熱失活FBS、1%青黴素-鏈黴素[Thermo Fisher Scientific]及1X GlutaMax補充劑[Thermo Fisher Scientific]之EMEM中。 (iv) 表現 Incucyte® Nuclight Red 之穩定細胞株的產生
將T2、NCI-H1792、Ca Ski、SiHa、SCC090及SCC152細胞在無血清之培養基中用IncuCyte® NucLight Red慢病毒試劑(EF-1α啟動子、嘌呤黴素(puromycin)選擇) (Sartorius)以MOI 5轉導。轉導24小時後，將細胞洗滌且使其再懸浮於其相應細胞株培養基中，且在37℃、5% CO 2下培養。轉導3天後，將嘌呤黴素(Gibco, Waltham, MA)以預定濃度(在0.5 ug/mL至1 ug/mL範圍內)添加至培養物以選擇經轉導之細胞。培養物在嘌呤黴素選擇下進行擴增，直至如藉由流動式細胞測量術分析，其至少98% Incucyte® NucLight Red陽性。 (v) 活體外細胞毒性分析
在室溫(RT)下在用聚-L-鳥胺酸(Sigma Aldrich)塗佈之96孔平底組織培養盤中進行針對T2細胞之活體外細胞毒性分析30分鐘，此後移除塗佈溶液，且使培養盤在室溫下再乾燥30分鐘。在未用聚-L-鳥胺酸塗佈之96孔平底組織培養盤中進行針對附著細胞株之活體外細胞毒性分析，其中塗鋪附著細胞且使之附著，一天後添加T細胞。在指示的情況下，將T細胞與表現Incucyte® NucLight™ Red之NCI-H1792、Ca Ski、SiHa、SCC090、SCC152或經肽脈衝輸送之T2細胞(1 ng/ml HPV16-E7 11-19肽[YMLDLQPET，Genscript])以20:1至1.25:1範圍內之E:T比率共培養。在Incucyte® S3儀器(Sartorius)上獲得資料，且在Incucyte S3上定量標靶細胞生長，作為T細胞細胞毒性之讀出資料。 (vi) 細胞介素產生分析
將T細胞與表現Incucyte® NucLight™ Red之NCI-H1792、Ca Ski、SiHa、SCC090及SCC152細胞或經肽脈衝輸送之T2細胞(1 ng/ml HPV16-E7 11-19肽[YMLDLQPET，Genscript])以1:1之E:T共培養。24小時後收穫上清液且冷凍在-80℃下。將上清液解凍且裝載在multiAnalyte濾筒(ProteinSimple, San Jose, CA)上以使用Ella儀器(ProteinSimple)評估IFN-γ、TNF-α、IL-2及顆粒酶B之水準。 (vii) 增殖分析
根據製造商說明書，將T細胞用2.5 μM CellTrace™ Violet (Thermo Fisher Scientific)標記。將T細胞與表現Incucyte® NucLight™ Red之CaSki、SCC152、SCC090、SiHa及NCI-H1792共培養。在96小時之後，收穫細胞且用Fixable活力染料eFluor® 660 (Thermo Fisher Scientific)、TCR α/β PE-Cy7 (IP26，BioLegend)、CD4 APC-Cy7 (OKT4，BioLegend)及CD8 PerCP-Cy5.5 (HIT8a，BioLegend)抗體染色。將細胞用EasySep™緩衝液洗滌且用BD Cytofix™固定緩衝液(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)固定。將CountBright™絕對計數珠粒(Thermo Fisher Scientific)在EasySep™緩衝液中稀釋且添加至樣品中，然後在CytoFLEX流式細胞儀上獲得，以評定CellTrace™ Violet之稀釋度，作為T細胞增殖之指標。使用FlowJo軟體(10版，TreeStar)分析資料，且使用下式確定分裂CD8及CD4 T細胞之絕對計數： 樣品中之CD8或CD4 T細胞數目 = (閘中之CD8或CD4 T細胞事件數目/閘中之珠粒事件數目) × 批次特異的分配之珠粒計數。 c.    同種異體反應性及安全性篩選 (i) 用於同種異體反應性篩選之基於 96 孔的表現 MHC 之陣列的產生
使用CRISPR-Cas工程改造在HEK293T細胞中敲除內源HLA-A/B/C。使用multicrispr.net工具針對跨越HLA-A、HLA-B及HLA-C基因座保守之序列設計嚮導RNA (gRNA) ( Prykhozhij 等人 , Plos One, 2015)。選擇以下嚮導：CRISPR-ALL-1：CGGCTACTACAACCAGAGCG；CRISPR-ALL-2：AGATCACACTGACCTGGCAG；CRISPR-ALL-3：AGGTCAGTGTGATCTCCGCA。使用BsmBI位點將gRNA選殖至LentiCRISPR V2載體中。使用Mirus TransIT (Mirus Bio, Madison, WI)用質體嚮導構築體轉染HEK293T細胞。7天之後，使用泛MHC抗體(BioLegend)將MHC敲除(MHC-KO)細胞分選。擴增單細胞純系，且藉由流動式細胞測量術驗證MHC之缺乏。B2M敲除(B2M-KO)細胞用作完全缺乏表面MHC表現之陽性對照物。在HEK293T細胞中藉由使用以下嚮導RNA將靶向B2M之CRISPR RNP電穿孔來敲除B2M：GGCCACGGAGCGAGACATCT。
無MHC之HEK293T細胞經IncuCyte® NucLight™ Red病毒(Essen BioScience)轉導。使用Sony SH800分選器針對NucLight™ Red表現對經轉導之細胞進行分選。為產生表現MHC之陣列，在96孔盤中的個別孔中將無MHC之表現NucLight™ Red之HEK293T細胞用最常見的110種MHC (pHAGE-EF1a-MHC-UBC-NAT)轉導。用諾爾絲菌素(nourseothricin) (400 μg/ml)選擇經轉導之細胞，歷時一週。表現最常見的110種MHC之細胞進行繼代且呈陣列儲存在96孔盤中。藉由使用泛MHC抗體(BioLegend)染色來證實個別MHC對偶基因之表現。
為產生用於分析之陽性對照物，將無MHC之HEK293T細胞用IncuCyte® NucLight™ Red病毒(Essen BioScience)轉導且使用Sony SH800分選器針對NucLight™ Red表現進行分選。接著使用慢病毒轉導將HLA-A*02:01 (pHAGE-EF1a-MHC-UBC-NAT)引入細胞中。用諾爾絲菌素(400 μg/ml)選擇經轉導之細胞，歷時一週。接著將此等細胞用表現HPV16-E7之片段的90聚體構築體(pHAGE-CMV-FHA-HPV16-E7.1-EFS-AmCyan)轉導，該片段含有HPV16-E7 11-19抗原決定基(YMLDLQPET)。接著使用Bigfoot Spectral細胞分選器(Thermo Fisher Scientific)針對AmCyan表現對經轉導之細胞進行分選。 (ii) 慢病毒包裝及轉導
為包裝110種MHC表現構築體(pHAGE-EF1a-MHC-UBC-NAT)之慢病毒，將無MHC之HEK293T細胞在75%匯合下塗鋪在96孔中且使用jetPRIME®轉染試劑(Polyplus, Illkirch, France)轉染。將個別MHC表現構築體與封裝質體(pREV/pTAT/pVSVG/pGAGPOL)混合且根據製造商方案與jetPRIME®試劑一起培育，且在轉染後24小時添加DMEM培養基。在轉染之後48小時收穫病毒上清液且用於以基於96孔之陣列格式轉導110種MHC。為封裝其他構築體之慢病毒，將Lenti-X®細胞(Takara Bio USA, Mountain View, CA)在75%匯合下塗鋪且使用jetPRIME®轉染試劑(Polyplus, Illkirch, France)轉染。將表現構築體與封裝質體(pREV/pTAT/pVSVG/pGAGPOL)混合且根據製造商方案與jetPRIME®試劑一起培育，且在轉染後24小時添加OptiPRO™ SFM培養基。在轉染之後48小時收穫病毒上清液且使用Vivaspin® 20離心濃縮器或Vivaflow® 50盒(Sartorius, Bohemia, NY)濃縮。
所有涉及來源於HEK293T細胞之細胞株的病毒轉導均用聚凝胺(4 μg/ml)進行。 (iii) 共培養以進行同種異體反應性剖析
全T細胞如上所述進行工程改造且冷凍。在第0天，T細胞在直立T25燒瓶中用1.0E+6 T細胞、20.0E+6經輻照之PBMC、重組人類IL-2及CD3單株抗體(OKT3) [0.1 ug/mL，eBioscience]再刺激。在第2天、第4天、第5天及第6天將一半體積之培養基更換為RPMI 1640，其補充有10%熱失活胎牛血清[FBS]、100 IU/mL青黴素、100 μg/mL鏈黴素及重組人類IL-2 [50 U/mL；PeproTech, Cranbury, NJ]。第7天收穫細胞用於分析。
分析一式三份進行。在第5天，呈96孔陣列之標靶細胞進行繼代且接種在384孔盤中。在第6天，將經工程改造之表現重組E7-11-28 TCR (亦稱為「TCR 28」或「28」或「TCR-200-A02」)之CD8+ T細胞或未經轉導之對照T細胞以5:1之效應物:標靶物(E:T)比率添加且與標靶細胞一起培育48小時。隨著時間推移，使用IncuCyte®，藉由量測NucLight™ Red陽性細胞之數目來量測標靶細胞數目。分析中在48小時各MHC上所關注之重組TCR對細胞之抑制計算為1-(細胞倍增[與表現E7-11-28之T細胞培育]/細胞倍增[與未經轉導之對照T細胞培育])。 (iv) 用於安全性篩選的表現 TCR E7-11-28 之 CD8 T 細胞之產生
使用StraightFrom® Leukopak® CD8微珠套組(Miltenyi Biotec)根據製造商方案自A*02:01陰性供體分離初級CD8+ T細胞。將經分離之細胞冷凍在CryoStor® CS10 (Stem Cell Technologies)中且儲存在液氮中直至使用。在第-1天，將CD8+ T細胞解凍，用完全T細胞培養基(RPMI 1640，補充有10%熱滅活胎牛血清(FBS)、100 IU/mL青黴素、100 μg/mL鏈黴素、重組人類IL-2 [50U/mL；PeproTech, Cranbury, NJ]、重組人類IL-15 [5 ng/mL，R&D Systems]及重組人類IL-7 [5 ng/mL，R&D Systems])洗滌。在第0天，將CD8+ T細胞洗滌且再懸浮於新鮮T細胞培養基且使用ImmunoCult TM人類CD3/CD28/CD2 T細胞活化劑(5 μL/1×10 6CD8+ T細胞，Stem Cell Technologies)活化。在第1天，將細胞洗滌且再懸浮於新鮮完全T細胞培養基中，且以MOI 10用慢病毒粒子轉導以表現TCR E7-11-28。在第2天，將細胞洗滌且再懸浮於新鮮完全T細胞培養基中且在G-Rex® 24孔盤(Wilson Wolf)中擴增直至第5天。在第5天，收穫細胞且再懸浮於EasySep™緩衝液(Stem Cell)且在室溫下以1:25稀釋度添加HLA-A*02:01 HPV16 11-19dextramer-APC (Immudex)。抗CD34-Alexa Fluor®488 (純系：QBEnd10，R&D Systems)以1:50稀釋度添加且在室溫下培育10分鐘。將細胞用EasySep™緩衝液洗滌且以1:200稀釋度再懸浮於含有7-AAD之EasySep™緩衝液。藉由細胞分選(Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ)來分離活的結合dextramer之細胞(DAPI- Dextramer+ CD34+)。將經分選之細胞洗滌且再懸浮於新鮮完全T細胞培養基中且在G-Rex ®10燒瓶(Wilson Wolf)中擴增，直至第12天，此刻將細胞冷凍在CryoStor® CS10中且儲存在液氮中，直至使用。
將表現E7-11-28之CD8+ T細胞解凍，且藉由在GRex ®100燒瓶(Wilson Wolf)中將T細胞與經輻照(60戈雷)之同種異體HLA-A*02:01 PBMC在新鮮T細胞培養基(RPMI 1640，補充有10%熱滅活胎牛血清(FBS)、100 IU/mL青黴素、100 μg/mL鏈黴素、重組人類IL-2 [50U/mL，PeproTech])中在0.1  ug/mL抗CD3 (OKT3，eBioscience)及50 U/mL重組IL-2 (Peprotech)存在下共培養而再刺激(進一步擴增)。每隔一天將50 U/mL重組IL-2添加至擴增細胞直至第6天。在第6天，將一半培養基替換為含有50 U/mL重組IL-2之新鮮T細胞培養基。第7天使用細胞進行篩選。 (v)   T 細胞中靶殺死之品質控制 (QC)
在再刺激第5天，在室溫下將報導細胞(表現多肽組文庫)用CellTrace™ Violet (Thermo Fisher)標記10分鐘。將標記反應用5X過量的完全DMEM培養基(1X DMEM，補充有10% FBS、100 IU/mL青黴素、100 ug/mL鏈黴素)淬滅。離心之後，接種細胞以供後續分析。對於脫靶篩選，將400×10 6個經標記之報導細胞接種在CellSTACK®燒瓶中。對於T細胞中靶殺死之QC，96孔平底盤每孔接種25,000個報導細胞。
在TCR E7-11-28再刺激第6天，測試T細胞針對HPV16 11-19肽之活性。作為陽性對照物，將一小部分報導細胞用100 ng/mL HPV16 11-19肽(Genscript)進行脈衝輸送一小時。將T細胞以四種效應物:標靶物(E:T)比率(2:1、1:1、1:2、1:4)一式三份添加至報導細胞。在37℃下培育四小時之後，藉由上下吸移使細胞再懸浮，接著在CytoFLEX流式細胞儀(Beckman Coulter)上採集資料。 (vi) 篩選共培養物、標靶細胞富集及分選
在TCR E7-11-28擴增第7天，將T細胞添加至經文庫轉導之報導細胞且在37℃下培育四小時。在培育之後，藉由胰蛋白酶消化及離心收穫所有細胞，使細胞再懸浮於1X膜聯蛋白V結合緩衝液(Miltenyi Biotec)且離心。使細胞在膜聯蛋白V磁性微珠(Miltenyi Biotec)下再懸浮於1X膜聯蛋白V結合緩衝液(每1×10 9總細胞，9 mL膜聯蛋白V結合緩衝液中1 mL微珠)中且在室溫下培育15分鐘。將細胞用5X體積之膜聯蛋白V結合緩衝液洗滌且離心。使細胞再懸浮於膜聯蛋白V結合緩衝液中，且接著經2次「megarep」分裂且使用70 uM細胞過濾器(Corning)過濾。使用autoMACS® Pro (Miltenyi Biotec)對膜聯蛋白V標記之細胞進行陽性選擇。各「megarep」之溶析進一步經四次「重複實驗」分開，每次篩選總共8次技術重複實驗。使用MoFlo® Astrios EQ 細胞分選器(Beckman Coulter)對IFP +細胞進行分選。 (vii) 下一代定序
使用GeneJET™基因組DNA純化套組(Thermo Fisher Scientific)自分選之細胞提取基因組DNA (gDNA)。藉由PCR，自提取之gDNA擴增抗原盒，接著在第二PCR反應中附加定序銜接子及樣品特異性索引序列。在Illumina NextSeq™機上使用標準Illumina定序引子對擴增子進行定序。 (viii) 資料分析
核苷酸序列映射至個別核苷酸瓦塊。針對各篩選重複實驗(n = 8)且針對經轉導之報導細胞之各池的輸入，計算各瓦塊之讀段計數的比例，且藉由篩選重複實驗中之瓦塊之比例除以輸入文庫中之瓦塊之比例來計算各瓦塊之富集。跨越8個篩選重複實驗，一致瓦塊之富集之修正幾何平均值用於鑑定可再現之篩選命中。使用NetMHC4.0預測各瓦塊超過1.5倍富集之閾值的特異性MHC結合抗原決定基。藉由跨越篩選中富集的重疊相鄰瓦塊及冗餘瓦塊，鑑定預測之強烈結合之抗原決定基來選擇各瓦塊之候選抗原決定基。 d.    TCR E7-11-28之安全性評估 (i) 表現 TCR E7-11-28 之推定脫靶之癌細胞株
在下表4中描述之培養基中培養癌細胞株： 表4：癌細胞株及其培養基
癌細胞株 培養基
CAL-12T DMEM + 10% HIFBS + 1X Pen/Strep
THP-1 RPMI-1640 + 10% HIFBS + 1X Pen/Strep + 2-巰基乙醇(0.05 mM)
4.1TF-1 RPMI-1640 + 10% HIFBS + 1X Pen/Strep + GM-CSF (2 ng/mL)
OVCAR-3 RPMI-1640 + 10% HIFBS + 1X Pen/Strep + 牛胰島素(0.01 mg/mL)
SNU-475 RPMI-1640 + 10% HIFBS + 1X Pen/Strep
NCI-H1792 RPMI-1640 + 10% HIFBS + 1X Pen/Strep
ChaGo-K-1 RPMI-1640 + 10% HIFBS + 1X Pen/Strep
JVM-2 RPMI-1640 + 10% HIFBS + 1X Pen/Strep
L363 RPMI-1640 + 10% HIFBS + 1X Pen/Strep
SET-2 RPMI-1640 + 20% HIFBS + 1X Pen/Strep
CMK RPMI-1640 + 20% HIFBS + 1X Pen/Strep
OCI-M1 IMDM + 20% HIFBS + 1X Pen/Strep
OCI-M2 IMDM + 20% HIFBS + 1X Pen/Strep
HEK-293 DMEM + 10% HIFBS + 1X Pen/Strep
(ii) 表現 TCR E7-11-28 之推定脫靶之健康人類初級 /iPS 來源細胞
使來自健康供體之初級細胞或iPS來源細胞解凍，且根據製造商說明書，在下表5中描述之培養基中培養。皮下人類白色前脂肪細胞(HWP)在前脂肪細胞生長培養基(備用)中培養，直至80-90%匯合，且藉由培養基變成前脂肪細胞分化培養基(備用)，分化成脂肪細胞，歷時72小時。將其在脂肪細胞營養培養基中進一步培養14天以完成分化過程。 表5：健康人類初級/ iPS來源細胞及其培養基
細胞 細胞批號 培養基
人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC) 466Z026、0000246083 內皮細胞生長培養基(備用)
人類肺纖維母細胞(HPF) 474Z024.2、446Z03、1474Z031.2、1081503.2 纖維母細胞生長培養基(備用)
人類小氣道上皮細胞(HSAEpC) 467Z033、467Z025.2 氣道上皮細胞生長培養基(備用)
皮下人類白色前脂肪細胞(HWP) 454Z006、467Z014 前脂肪細胞生長培養基(備用)
人類主動脈平滑肌細胞(HAoSMC) 453Z011.6、470Z011.2 平滑肌細胞生長培養基2 (備用)
人類心肌細胞(HCM) 463Z016.2、470Z011.9、472Z002.3 肌細胞生長培養基(備用)
iCell星形細胞 01434 DMEM培養基/F-12、HEPES + 2% FBS + 1X N-2補充劑
正常人類星形細胞(NHA) 0000672445 AGM™星形細胞生長培養基BulletKit™
人類肝臟星狀細胞(HHSteC) C212011、C212641 SuperCult®星狀細胞培養基
人類肝臟星狀細胞(HHSteC) 25914 星狀細胞培養基
正常人類皮膚纖維母細胞(NHDF) 472Z001.3、471Z018.2、477Z023.2 纖維母細胞生長培養基(備用)
人類心臟纖維母細胞(HCF) 472Z002.2、475Z017.1 纖維母細胞生長培養基3 (備用)
正常人類表皮角化細胞(NHEK) 451Z014.1 角化細胞生長培養基2 (備用)
肝細胞 HH1052、HH1165、HH1186 UPCM-通用初級細胞塗鋪培養基
人類小腸上皮細胞(HSIEpC) 201457 上皮細胞生長培養基
人類子宮頸上皮細胞(HCerEpC) 202099 上皮細胞生長培養基
人類子宮頸上皮細胞 (HCerEpC) 70029809 子宮頸上皮細胞基礎培養基+子宮頸上皮細胞生長套組
人類乳腺上皮細胞(HMEpC) 70043304 乳腺上皮細胞基礎培養基+乳腺上皮細胞生長套組
骨骼肌細胞(SkMC) 81202212 脂肪、臍帶及骨髓來源MSC之間質幹細胞基礎培養基+初級骨骼肌生長套組
人類骨髓單核細胞(HBMMNC) 2208422001、2208412006、2208412008 RPMI-1640 + 10% HIFBS + 1X Pen/Strep
(iii) 定量 RT-PCR
使用Qiagen RNeasy®微型套組(Qiagen, Valencia, CA)根據製造商說明書自癌細胞株或健康人類初級細胞提取總RNA。使用NanoDrop™ One C機(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)測定樣品中RNA之品質及濃度。使用來自不同樣品之等量RNA (2 μg)進行cDNA合成，該cDNA合成使用SuperScript™ IV VILO™合成套組(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)，根據製造商說明書，使用T100™熱循環儀(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)進行，循環條件如下：在25℃下黏接引子10分鐘，在50℃下將RNA逆轉錄10分鐘，及在85℃下使酶失活5分鐘。
所有qPCR分析使用QuantStudio™ 7 Pro PCR系統(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)在20 μL反應體積中一式三份進行，該反應體積含有10 μL TaqMan® Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)、5 μL稀cDNA (50 ng)、4 μL無RNA酶/DNA酶之水及1 μL各基因特異性TaqMan®分析探頭(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)：TATA盒結合蛋白(Hs00427620_m1)、INTS4 (Hs00369250_m1)、CPAMD8 (Hs00610855_m1)、HERC1 (Hs01032486_m1)、MPL (Hs00180489_m1)、SPTA1 (Hs00162179_m1)及NUTM1 (Hs01395191_m1)。以下標準PCR反應條件用於所有轉錄本：50℃ 2分鐘、95℃ 2分鐘；40個95℃1秒、60℃ 20秒循環。使用QuantStudio™設計及分析管理軟體(2.6版)分析資料，用於量測定量循環(Cq)。應用2 -ΔC T方法，使用持家基因TATA盒結合蛋白之幾何平均數，進行內部正規化。 (iv) 用於 TCR E7-11-28 之安全性評價的細胞介素分析
在共培養分析前的二十四(24)小時，使用Gibco TrypLE™試劑將癌細胞株自其培養瓶分開，用培養基洗滌且以50,000個細胞/孔之密度接種於96孔平底培養盤中且允許附著隔夜。將細胞用1 ng/mL或100 ng/mL E7 11-19肽進行脈衝輸送2小時或在其相應培養基中未進行脈衝。在脈衝輸送後，將孔用培養基輕輕洗滌三次。接著將E7-11-28或NTD細胞以50,000個細胞/孔之密度添加在完全T細胞培養基中。共培養後24小時，收集上清液且冷凍在-80℃下。使上清液解凍且藉由負載在單重人類IFN-γ (第3代)濾筒(ProteinSimple, San Jose, CA)使用Ella™儀器分析IFN-γ水準。在共培養分析前24小時，使用DetachKit™ (PromoCell, Germany)將HUVEC、HPF、HSAEpC、HAoSMC、NHA及HHSteC自其培養瓶或培養盤分開，洗滌且在其相應培養基中以25,000個細胞/孔之密度塗鋪。第二天，將其用肽進行脈衝輸送或不進行脈衝輸送，洗滌且與50,000個細胞/孔之E7-11-28或NTD細胞共培養。在解凍之後，皮下HWP以供應商推薦之密度直接塗鋪在96孔平底培養盤中且分化成成熟脂肪細胞，不進行分開。在解凍之後，HCM亦以供應商推薦之密度直接塗鋪在96孔平底培養盤中且培養40天以使其成熟。接著，將脂肪細胞及HCM用肽進行脈衝輸送或不進行脈衝輸送，且與50,000個細胞/孔之E7-11-28或NTD共培養。將iCell星形細胞解凍且根據製造商說明書塗鋪在24孔培養盤中7天。第二天，將其用肽進行脈衝輸送或不進行脈衝輸送，洗滌且與250,000個細胞/孔之E7-11-28或NTD細胞共培養。在所有初級/iPS來源細胞與T細胞共培養後24小時收集上清液，且在Ella™儀器上分析IFN-γ水準。 e. 小鼠異種移植研究
藉由將CaSki及SCC152細胞皮下注射細胞至7-9週齡雌性NCG小鼠(NOD- Prkdc em26Cd52Il2rg em26Cd22 /NjuCrl，Charles River)中，在兩種異種移植模型中評估TCR E7-11-28之活體內抗腫瘤功效。Explora BioLabs之動物護理及使用程序經國際實驗動物評估與認可委員會(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International，AAALAC)認可，此確保遵守實驗動物護理與使用之通用標準。CaSki及SCC152細胞分別在含有10%胎牛血清之RPMI-1640及EMEM培養基中生長成附著培養物。將由50% PBS及50% Matrigel®組成之100 μL體積中1×10 6CaSki或SCC152腫瘤細胞皮下注射至右側腹中。在注射後十天或十四天，基於根據下式之腫瘤體積(用卡尺量測)將動物隨機化至實驗組：體積 = 1/2(腫瘤長度×垂直腫瘤寬度 2)。
在給藥當日，將T細胞在完全T細胞培養基中解凍，洗滌且以2×10 7個活細胞/0.2 mL之密度再懸浮於無菌PBS中。將媒劑(PBS)、2×10 7活NTD或TCR E7-11-28 T細胞在0.2 mL固定體積中靜脈內注射至各測試動物之尾靜脈中
藉由每兩週量測生長評估對腫瘤生長之作用。 f.    對HPV16 E7-11-28及DN-TGFβRII雙陽性T細胞之工程改造及DN-TGFβRII功能之評估
除T細胞經編碼(1) TCR E7-11-28及Q標記之CD8α及(2) DN-TGFβRII之兩種慢病毒共同轉導以外，用慢病毒對T細胞進行工程改造如章節『對T細胞進行工程改造以表現HPV16 E7 11-19特異性TCR』中所述進行(參見上文章節b (i)。藉由流動式細胞測量術證實TCR E7-11-28、Q標記之CD8及DN-TGFβRII之表現。隨後， 將細胞用TGFβRII之抗體(W17055，BioLegend)染色且經FACS分選成DN-TGFβRII陽性(TGFβRII亮)及DN-TGFβRII陰性(TGFβRII暗)部分。T細胞在補充有50 IU/mL IL-2 (Sigma Aldrich)及5 ng/mL IL-7 (R&D Systems)之T細胞培養基中靜置隔夜，且接著在含有0或5 ng/mL TGFβ1 (R&D Systems)之T細胞培養基中塗鋪在12孔盤中。在TGFβ1存在對比不存在下培育24小時之後，建立與經肽脈衝輸送之T2細胞的共培養分析。為此，將T2細胞用E7 11-19肽(YMLDLQPET，Genscript)以多種濃度(0.7 pg/mL、7.4 pg/mL、22 pg/mL、67 pg/mL、200 pg/mL及2,000 pg/mL)脈衝輸送，且在50% T細胞培養基及50%標靶細胞培養基(RPMI 1640，含有10%熱失活FBS及1%青黴素/鏈黴素(Thermo Fisher Scientific))中在E:T 1:1下與T細胞一起塗鋪；將TGFβ1添加至0或5 ng/mL之最終濃度。在20小時之後，將GolgiPlug™ (BD Biosciences)添加至共培養物中。將細胞再培育4小時，且接著針對細胞內IFNγ進行染色。藉由將細胞與Fc阻斷(Thermo Fisher Scientific)一起培育15分鐘來抑制與Fc受體之非特異性結合。隨後，將細胞用生物素標記之抗人類CD34 (QBEND10，Thermo Fisher Scientific)染色，接著用Brilliant Violet™ 421結合之鏈黴親和素(streptavidin) (BD Biosciences)、抗人類CD3 FITC (HIT3a，BioLegend)及可固定之近紅外LIVE/DEAD™染料(Thermo Fisher Scientific)染色。將細胞用Cytofix™ (BD Biosciences)固定，用Perm/Wash™緩衝液(BD Biosciences)透化，且用抗人類IFNγ-PE (B27，BioLegend)染色。在CytoFLEX流式樣品儀(Beckman Coulter)上獲得樣品且使用FlowJo軟體(10版，TreeStar)分析。確定Q標記之活T細胞群體(LIVE/DEAD™-CD3+CD34+)內IFNγ+細胞百分比。
如下進一步描述，術語「TSC-200-A02」係指除包括CD8α、CD8β、 CD34富集標籤(例如 Q標籤)及DN-TGF βRII之其他組分之外表現E7-11-28 (亦即，上文在表1中描述之TCR-200-A02序列)的經工程改造之全T細胞群體，包括CD8+ T細胞及CD4+ T細胞。 g.    ReceptorScan篩選 (i)   DC 培養
在第-4天，使用自HLA-A*02:01陽性健康供體分離之PBMC，利用EasySep™人類CD14陽性選擇套組II (StemCell Technologies)根據製造商說明書進行單核球分離。使用對CD14 (M5E2；BioLegend, Dedham, MA)、HLA-A2 (BB7.2，BioLegend)、CD80 (2D10，BioLegend)、CD83 (HB15e，BioLegend)及CD86 (IT2.2，BioLegend)具有特異性之螢光標記之抗體評定純度及共刺激分子表現。CD14表現＞90%。CD14 +單核球再懸浮於補充有重組人類GM-CSF及IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN)，最終濃度分別為800 IU/mL及1000 IU/mL之AIM-V™培養基(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)。在第-2天，將重組人類TNF-α (10 ng/mL)、IL-6 (1000 IU/mL)及IL-1β (2 ng/mL) (R&D Systems)以及PGE2 (1 μg/mL，StemCell Technologies)添加至培養之單核球中。 (ii)  CD8 未處理 T 細胞分離
在第-1天，使用EasySep™人類未處理CD8+ T細胞分離套組II (StemCell Technologies)根據製造商說明書，自來自表現HLA-A*02:01之健康供體之PBMC分離自體同源CD8未處理T細胞。使用對CD8α (HIT8a，BioLegend)、CD45RO (UCHL1，BioLegend)、CD45RA (HI100，BioLegend)、CD56 (5.1H11，BioLegend)、CD57 (HCD57，BioLegend)及CCR7 (G043H7，BioLegend)具有特異性之螢光標記之抗體評定純度。未處理CD8α +T細胞之純度＞90%。將細胞在37℃、5% CO 2下在T細胞培養基(X-VIVO™ 15無血清培養基[Lonza, Rockland, MD]或LymphoONE™ [LymphoONE T細胞擴增Xeno-Free培養基, Takara, WK552]，含有10%人類血清[Sigma Aldrich, St. Louis, MO]、1%青黴素-鏈黴素[Thermo Fisher Scientific]、1% GlutaMAX [Thermo Fisher])中靜置隔夜，且補充有10 ng/ml重組人類IL-7 (R&D Systems)。 (iii) 共培養
在第0天，使用與第-1天一致之抗體組再評估CD8 T細胞純度，且藉由HLA-A2、CD80、CD83及CD86之上調及CD14之下調確認DC成熟。在37℃、5% CO 2下將DC用1 μM HPV16 E7 11-19肽(YMLDLQPET，GenScript [Piscataway, NJ])以及具有多種抗原特異性之另外肽進行脈衝輸送(亦即，多路篩選)，歷時3小時。將經脈衝輸送之DC與靜置之CD8未處理T細胞在補充有重組人類IL-12 (10 ng/mL)及IL-21 (60 ng/mL) (R&D Systems)之T細胞培養基中共培養。在第3天與第10天之間，共培養物補充重組人類IL-7及IL-15 (R&D Systems)。在第10天或第11天，使用A*02:01 HPV16 E7 11-19(YMLDLQPET) dCODE dextramer® (Immudex, Copenhagen, Denmark, WB3823-PfBC0621)、CD8α及TCRα/β (IP26, BioLegend)及DAPI (Thermo Fisher Scientific)根據製造商說明書對HPV16 E7 11-19特異性細胞進行Dextramer染色。 (iv) 抗原特異性細胞分選
在第12天，收集細胞且根據製造商說明書用A*02:01 HPV16 E7 11-19(YMLDLQPET) dCODE dextramer® (Immudex)連同對多種其他抗原具有特異性之dCODE dextramers® (Immudex)染色。洗滌細胞，且接著用對CD8α及TCRα/β具有特異性之抗體染色，且在第10-11天用DAPI染色，且使用Sony SH800S細胞分選儀(Sony Biotechnology, San Jose, CA)、BigFoot細胞分選儀(ThermoFisher Scientific)或MoFlo® Astrios細胞分選儀(Beckman Coulter, Brea, CA)對dextramer陽性細胞(CD8α +、DAPI -、TCRα/β +、dextramer +)進行分選。使用10x Genomics平台(Pleasanton, CA)使經分選之細胞進行單細胞TCRα/β定序。 (v) 使用 10x 基因組平台之多路 NGS 及分析
根據10x Chromium Next GEM單細胞5'試劑套組v2 (Dual Index)，利用特徵條碼技術進行細胞表面蛋白與免疫受體定位(10x Genomics，方案CG000330 Rev A)製備單細胞文庫。高達15,000個細胞被捕捉在液滴(GEM)中且根據製造商說明書進行加工，以獲得得到VDJ及細胞表面蛋白資訊之文庫。在Illumina NextSeq™ 2000儀器(Illumina)上對完全組裝之文庫進行定序。
分別使用Cell Ranger 6.0.0 VDJ及COUNT管線(10x Genomics)加工經定序之VDJ及細胞表面蛋白文庫。利用量測dCODE dextramers® (Immudex)之細胞表面蛋白資料集將VDJ資料多路分解，以確定哪個抗原決定基由各TCR識別。若對於既定細胞條碼，總dextramer計數超過10且一種dextramer佔總計數＞90%，則將標靶抗原決定基分配至細胞條碼。利用VDJ與細胞表面蛋白文庫之間的共享細胞條型允許鑑定各定序TCR之標靶。 h.    對T細胞進行工程改造以表現HPV16-E7 11-19特異性TCR (圖15)
使用自動化細胞加工系統自HLA-A*02:01陽性健康供體leukopak分離PBMCS。將分離、洗滌及濃縮之PBMC電穿孔，以遞送編碼轉座酶之mRNA及轉座子奈米質體載體。在電穿孔之後，允許細胞在基礎培養基中靜置隔夜。電穿孔後24小時，將細胞用CD3/CD28/CD2 T細胞活化劑及刺激生長之細胞介素活化。在培養擴增期期間，經由在小分子存在下之選擇性生長優勢，對經工程改造之細胞進行富集。在第15天收穫擴增之細胞且再調配成冷凍保存培養基。使用自動化控制速率冷凍程序冷凍保存細胞。資料展示於圖15中。 i.     材料 細胞株●    Lenti-X：Takara Bio USA，632180 ●    HEK293T細胞：ATCC，CRL-3216 ●    T2：ATCC，CRL-1992 ●    CaSki：ATCC，CRL-1550 ●    NCI-H1792：ATCC，5895 ●    SCC090：ATCC，CRL-3239 ●    SCC152：ATCC，CRL-3240 ●    SiHa：ATCC，HTB-35 ●    CAL-12T：DSMZ，ACC 443 ●    THP-1：ATCC，TIB202 ●    TF-1：ATCC，CRL-2003 ●    OVCAR-3：ATCC，HTB-161 ●    SNU-475：ATCC，CRL-2236 ●    ChaGo-K-1：ATCC，HTB-168 ●    JVM2：ATCC，CRL-3002 ●    L363：DSMZ，ACC 49 ●    SET-2：DSMZ，ACC 608 ●    CMK：DSMZ，ACC 392 ●    OCI-M1：DSMZ，ACC529 ●    OCI-M2：DSMZ，ACC619 健康人類初級 /iPS 來源細胞●    人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)：PromoCell，C-12200 (批號466Z026) ●    HUVEC-人類臍靜脈內皮細胞，單個供體，EGM™：Lonza，CC-2517 (批號0000246083) ●    人類肺纖維母細胞(HPF)：PromoCell，C-12360 (批號474Z024.2、446Z03、1474Z031.2、1081503.2) ●    人類小氣道上皮細胞(HSAEpC)：PromoCell，C-12642 (批號467Z033、467Z025.2) ●    皮下人類白色前脂肪細胞(HWP)：PromoCell，C-12735 (批號454Z006、467Z014) ●    人類主動脈平滑肌細胞(HAoSMC)：PromoCell，C-12533 (批號453Z011.6、470Z011.2) ●    人類心肌細胞(HCM)：PromoCell，C-12810 (批號463Z016.2、470Z011.9、472Z002.3) ●    iCell星形細胞套組，01434：Fujifilm Cellular Dynamics ●    正常人類星形細胞(NHA)：Lonza，CC-2656 (批號0000672445) ●    人類肝臟星狀細胞(HHSteC)：Creative Bioarray，CSC-C1496 (批號C212011，C212641) ●    人類肝臟星狀細胞(HHSteC)：ScienCell Research Laboratories，5300 (批號25914) ●    正常人類表皮細胞(NHDF)：PromoCell，C-12300 (批號471Z018.2)、C-12302 (批號472Z001.3、477Z023.2) ●    人類心臟纖維母細胞(HCF)：PromoCell，C-12360 (批號472Z002.2、475Z017.1) ●    正常人類表皮角化細胞(NHEK)：PromoCell，C-12003 (批號451Z014.1) ●    肝細胞：In Vitro ADMET Laboratories，82006 (批號HH1052、HH1165、HH1186) ●    人類子宮頸上皮細胞(HCerEpC)：iXCells Biotechnologies，10HU-237 (批號202099) ●    人類小腸上皮細胞(HSIEpC)：iXCells Biotechnologies，10HU-237 (批號201457) ●    人類子宮頸上皮細胞(HCerEpC)：ATCC，PCS-480-011 (批號70029809) ●    人類乳腺上皮細胞(HMEpC)：ATCC，PCS-600-010 (批號70043304) ●    骨骼肌細胞(SkMC)：ATCC，PCS-950-010 (批號81202212) ●    人類骨髓單核細胞(HBMMNC)：StemCell Technologies，70001.2 (批號2208422001、2208412006、2208412008) 動物●    NCG小鼠(NOD- Prkdc em26Cd52Il2rg em26Cd22 /NjuCrl)：Charles River Laboratories 培養基及補充劑●    X-VIVO 15無血清造血細胞培養基，具有L-麩醯胺酸、慶大黴素(gentamycin)及酚紅：Lonza，04-418Q ●    人類男性AB血清(熱失活)：Sigma Aldrich，H3667-100ML ●    青黴素鏈黴素：Gibco，15149-122 ●    GlutaMAX™補充劑：Fisher Scientific，35050061 ●    RPMI-1640培養基：ATCC，30-2001 ●    胎牛血清(FBS)，熱失活：Gibco，A3840102 ●    IMDM：ATCC，30-2005 ●    RPMI培養基1640 (1x) [+] 4.5 g/L D-葡萄糖、[+] 2.383 g/L HEPES緩衝液、[+] L-麩醯胺酸、[+] 1.5 g/L碳酸氫鈉、[+] 110 mg/L丙酮酸鈉：Gibco，A10491-01 ●    DMEM培養基(1X) [+] 4.5 g/L D-葡萄糖、[+] L-麩醯胺酸、[+] 3.7 g/L碳酸氫鈉：Thermo Fisher Scientific，11965084 ●    DMEM (1x) [+] 4.5 g/L D-葡萄糖、[+] L-麩醯胺酸、[-]丙酮酸鈉：Gibco，11965 ●    OptiPRO™ SFM培養基：Thermo Fisher Scientific，12309019 ●    EMEM培養基：ATCC，30-2003 ●    內皮細胞生長培養基(備用)：PromoCell，C-22010 ●    纖維母細胞生長培養基(備用)：PromoCell，C-23010 ●    氣道上皮細胞生長培養基(備用)：PromoCell，C-21060 ●    前脂肪細胞生長培養基(備用)：PromoCell，C-27410 ●    前脂肪細胞分化培養基(備用)：PromoCell，C-27436 ●    脂肪細胞營養培養基(備用)：PromoCell，C-27438 ●    平滑肌細胞生長培養基2 (備用)：PromoCell，C-22062 ●    肌細胞生長培養基(備用)：PromoCell，CC-22070 ●    DMEM培養基/F-12、HEPES：Thermo Fisher Scientific，11330 ●    N-2補充劑：Thermo Fisher Scientific，17502048 ●    AGM™星形細胞生長培養基BulletKit™：Lonza，CC-3186 ●    SuperCult®星狀細胞培養基：Creative Bioarray，CM-1193W ●    星狀細胞培養基：ScienCell Research Laboratories，5301 ●    DetachKit™：PromoCell，C-41220 ●    TrypLE™ Express：Thermo Fisher Scientific，12605-010 ●    纖維母細胞生長培養基3 (備用)：PromoCell，C-23025 ●    UCRM™ - 通用冷凍保存回收培養基，50 mL：In Vitro ADMET Laboratories，81015 ●    UPCM™ - 通用初級細胞塗鋪培養基，50 mL：In Vitro ADMET Laboratories，81016 ●    角化細胞生長培養基2 (備用)：PromoCell，C-20011 ●    上皮細胞生長培養基：iXCells Biotechnologies，MD-0041 ●    乳腺上皮細胞基礎培養基：ATCC，PCS-600-030 ●    乳腺上皮細胞生長套組：ATCC，PCS-600-040 ●    脂肪、臍帶及骨髓來源MSC之間質幹細胞基礎培養基 ：ATCC，PCS-500-030 ●    初級骨骼肌生長套組：ATCC，PCS-950-040 緩衝液●    EasySep緩衝液：StemCell Technologies，20144 ●    DPBS (無Ca2+/Mg2+)：Gibco，14190-122 細胞介素●    重組人類IL-2：Sigma Aldrich，11147528001 ●    重組人類IL-2：PeproTech，200-02 ●    重組人類IL-7：R&D Systems，219-IL-025 ●    重組人類IL-15：R&D Systems，247-ILB-005 ●    重組人類TGFβ1：R&D Systems，7754-BH-025/CF 套組●    EasySep™人類T細胞分離套組：StemCell Technologies：17951 ●    用於32個樣品之Ella™單重套組：ProteinSimple：SPCKB-PS-003027 ●    StraightFrom ®Leukopak ®CD8微珠套組：Miltenyi Biotech，130-117-019 ●    膜聯蛋白V MicroBead套組：Miltenyi Biotech，130-090-201 ●    單重人類IFN-γ (第三代)濾筒：ProteinSimple，SPCKB-PS-002574 抗體及染色試劑●    CD3單株抗體(OKT)，功能等級：eBioscience 16-0037-81 ●    抗人類CD8α PerCp-Cy5.5 (純系：HIT8a)：BioLegend：300924 ●    抗人類CD4 APC-Cy7 (純系：OKT4)：BioLegend：317418 ●    抗人類CD56 PE (純系：5.1H11)：BioLegend：362508 ●    抗人類CD57 PE (純系：HCD57)：BioLegend：322312 ●    抗人類CD34 Alexa Fluor 488：(純系：QBEND/10)：R&D Systems，FAB7227G ●    抗人類HLA-A2 PE (純系：BB7.2)：BioLegend，343306 ●    抗人類TCRα/β PE-Cy7 (純系：IP26)：BioLegend：306720 ●    抗人類HLA-A,B,C APC抗體：BioLegend，311410 ●    可固定活力染料eFluor 660 (APC Channel) Thermo Fisher Scientific：65-0864-14 ●    DAPI：Thermo Scientific：Thermo Scientific，62248 ●    Cytofix：BD Biosciences，554655 ●    抗人類CD3 FITC：(純系HIT3a)：Biolegend：300306 ●    抗人類CD34生物素標記：(純系QBEND/10)：Thermo Fisher Scientific：MA5-16924 ●    抗人類TGFβRII PE：(純系W17055) Biolegend：399704 ●    抗IFNγ PE：(純系B27)：Biolegend：506507 ●    抗人類Fc受體結合抑制劑：Thermo Fisher Scientific：16-9161-73 ●    LIVE/DEAD™可固定近紅外染料：Thermo Fisher Scientific：L10119 ●    鏈黴親和素Brilliant Violet™ 41：BD Biosciences：563259 ●    GolgiPlug™：BD Biosciences：555029 ●    Perm/Wash™緩衝液：BD Biosciences：554723 ●    CellTrace™ Violet (CTV)：Thermofisher，C34557 ●    可固定活力染料eFluor® 660：Thermo Fisher Scientific：65-0864-14 ●    CountBright™絕對計數珠粒：Fisher Scientific：C36950 ●    7-AAD活力染色溶液：BioLegend，420404 肽●    HPV16-E7 11-19(YMLDLQPET)：Genscript Dextramer●    HLA-A*02:01 YMLDLQPET HPV16-E7 11-19dextramer：Immundex CRISPR-Cas9 及電穿孔試劑●    Alt-R® S.p. Cas9核酸酶V3 (批號0000417827)：IDT，1081059 ●    Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA (批號0000415438)：IDT，1072534 ●    4D-Nucleofector TM核心單元：Lonza，AAF-1002B ●    4D-Nucleofector TMX單元：Lonza，AAF-1002X ●    SE細胞株4D-Nucleofector TMX套組L：Lonza V4XC-1012 組織培養盤●    G-Rex® 24孔盤：Wilson Wolf，80192M ●    G-Rex® 6孔盤：Wilson Wolf，80240M ●    G-Rex ®100：WilsonWolf，800400 ●    VECELL 96孔盤：Cosmo Bio Co.，VCL-V96WGPB-10-EX ●    經TC處理之6孔盤：Corning Costar，3506 ●    經TC處理之24孔盤：Corning Costar，3524 ●    96孔平底盤：Corning Costar，3595 ●    384孔平底盤：Corning Costar，3764 ●    HYPERflask® M：Corning，10020 ●    CellSTACK®，5室，具有排氣帽，Corning，3313 ●    70uM Nylon細胞過濾器，Corning，431751 ●    CellAdhereᵀᴹ膠原蛋白I塗佈之96孔平底盤：StemCell Technologies，100-0366 ●    PureCol™塗佈之6孔盤：MilliporeSigma，CC302 包裝及慢病毒產生試劑●    Lenti-X™ GoStix™ Plus：Takara，631281 ●    jetPRIME ®轉染試劑：Polyplus-transfection，114-75 ●    Vivaspin ®20：Sartorius，VS2041 ●    Vivaflow ®50盒：Sartorius，VF05P4 定量 RT-PCR 試劑●    RNeasy®微型套組：Qiagen，74104 ●    TaqMan® Fast Advanced Master Mix：Thermo Fisher Scientific，4444557 ●    SuperScript™ IV VILO™：Thermo Fisher Scientific，11756050 ●    RT-PCR級水：Thermo Fisher Scientific，AM9935 Leukopak 加工試劑：●    Multi-24 Column Block：Miltenyi，130-095-692 ●    淋巴球分離介質：Corning，25-072-CV 其他試劑●    ImmunoCult™人類CD3/CD28/CD2 T細胞活化劑：StemCell Technologies，10970 ●    聚L-鳥胺酸溶液0.01%：Millipore-Sigma，P4957-50ML ●    CryoStor CS10：StemCell Technologies，07930 ●    PBS中之ViaStain AO/PI染色溶液：Nexcelom Bioscience，CS2-0106-5mL ●    諾爾絲菌素：GoldBio，N-500-1 ●    嘌呤黴素：Gibco，A11138-03 ●    Mirus TransIT，Mirus Bio MIR 2704 ●    聚凝胺：EMD Millipore，TR-1003-G ●    Incucyte® NucLight Red慢病毒試劑(EF-1α啟動子、嘌呤黴素選擇)，Sartorius，4476 ●    層黏連蛋白：Millipore-Sigma，L2020 ●    聚-L-離胺酸10 mg/mL：ScienCell Research Laboratories，0413 ●    Corning® Matrigel®基底膜基質高濃度(HC)，無LDEV，10 mL，產品編號354248 實例 2 ：對 HPV16-E7 11-19(YMLDLQPET) 具有特異性之 TCR 的發現
開發一種高通量TCR發現平台，其能夠自初級人類未處理CD8 T細胞快速選殖抗原特異性TCR，且用於鑑定對HPV16-E7 11-19(YMLDLQPET)具有特異性之TCR (圖1)。發現總共459種TCR。分別自兩種單獨的專有VAYG篩選鑑定59/293種及15/161種HPV16-E7 11-19特異性TCR (圖2及圖6)。使用多種細胞株(參見表6)，鑑定TCR子集為具有所需細胞表面表現及效應功能，諸如細胞毒性或細胞介素產生(圖3、圖4及圖7)。圖8提供證實TCR-28展示相對於比較TCR可比之細胞毒性及優良效應功能的總結結果。 表 6 ：細胞株表現之參考
另外，在同種異體反應性分析中篩選HPV16-E7 11-19特異性TCR E7-11-28。TCR28展現最小同種異體反應性，一般定義為標靶細胞抑制超過20% (例如對測試的110種不同HLA類型中之108種，無可偵測之同種異體反應性) (圖5)，誘發抗原特異性T細胞增殖(圖9)，未與表現推定脫靶之癌細胞株(圖11)或健康人類初級細胞(圖12)反應，且有效控制活體內腫瘤生長(圖13)。此外，證實諸如藉由使用DN-TGFβRII遏制TGFβ信號傳導使TSC-200-A02 T細胞對TGFβ介導之遏制具有抗性(圖14)。實際上，在代表性pNVVD154及pNVVD160載體中TCR E7-11-28之表現及評估進一步證實功能TCR活性(圖15A-15C)。
因此，本文已鑑定且描述具有所希望特徵(例如識別標靶、細胞表面表現、細胞毒性功能、低同種異體反應性等)之多種HPV16-E7 11-19特異性TCR。 以引用之方式併入
本文所提及之所有出版物、專利及專利申請案均以引用之方式整體併入本文中，如同各個別出版物、專利或專利申請案特定且個別地經指示以引用之方式併入一般。在發生衝突之情況下，將以本申請案(包括本文中之任何定義)為準。
提及與登錄公共資料庫相關之寄存編號之任何多核苷酸及多肽序列亦以引用之方式整體併入，資料庫諸如由美國基因組研究院(The Institute for Genomic Research，TIGR)在全球資訊網tigr.org及/或美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)在全球資訊網ncbi.nlm.nih.gov維護之彼等資料庫。 等效物及範疇
本發明所涵蓋之一或多個實施例之細節在以上描述中闡述。儘管上面已描述代表性的示例性材料及方法，但與本文描述之材料及方法相似或等效之任何材料及方法均可用於本發明所涵蓋之實施例之實踐或測試。與本發明相關之其他特徵、目標及優點自描述中可顯而易見。除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之普通技術人員通常理解之含義相同的含義。在發生衝突之情況下，以上面提供之本發明之描述為準。
所屬領域之技術人員將認識到或能夠僅使用常規實驗即可確定本文所述之本發明所涵蓋之特定實施例的多種等效物。本發明所涵蓋之範疇不意欲限於本文提供之描述，且意欲隨附申請專利範圍涵蓋此類等效物。
亦應注意，術語「包含」意欲為開放性的且允許但不要求包括額外要素或步驟。當本文使用術語「包含」時，因此亦涵蓋及揭示術語「由……組成」。
在給出範圍之地方，包括端點。此外，應當理解，除非另有指示或自上下文及所屬領域普通技術人員之理解中明顯看出，否則在本發明所涵蓋之不同實施例中表示為範圍之值可假定所陳述範圍內之任何特定值或子範圍，除非上下文另有明確規定，否則為範圍下限單位之十分之一。
此外，應當理解，本發明所涵蓋之屬於先前技術的任何特定實施例可明確地自任何一項或多項申請專利範圍中排除。因為此類實施例被視為係所屬領域普通技術人員已知的，所以即使在此未明確闡述排除的情況下，其亦可被排除。本發明所涵蓋之組合物之任何特定實施例(例如，任何抗生素、治療劑或活性成分；任何生產方法；任何使用方法等)可出於任何原因自任何一項或多項申請專利範圍中排除，無論是否與先前技術之存在相關。
應當理解，已使用之詞語為描述性詞語而非限制性詞語，且在不背離本發明在其更廣泛之態樣中所涵蓋之真實範疇及精神下，可在所附申請專利範圍之範圍內進行改變。
儘管本發明已針對若干個描述之實施例進行一定長度及一些特殊性之描述，但不意欲將本發明限制於任何此類細節或實施例或任何特定實施例，而應參考所附申請專利範圍來解釋，以便根據先前技術提供對此等申請專利範圍之最廣泛可能之解釋，且因此有效地涵蓋本發明所涵蓋之預期範疇。
除非下文另外描述，否則TCR之MGTM修飾型式(例如E7-11-28 MGTM)用於產生圖中所示且實施例中例示之資料。
圖 1展示HPV16 E7 11-19肽序列。 圖 2展示對識別HPV16 E7 11-19之多種TCR之選擇。使用專有ReceptorScan平台鑑定四百五十九(459)種HPV16 E7 11-19(YMLDLQPET)特異性TCR。簡言之，在第-4天自HLA-A*02:01健康供體之PBMC分離CD14 +單核球且分化成成熟DC。在第-1天，自自體同源PBMC分離未處理CD8 T細胞且靜置隔夜。作為多路ReceptorScan篩選之一部分，在用1 μg/mL HPV16 E7 11-19肽對DC進行3小時脈衝輸送之後，將未處理CD8 T細胞與DC共培養，接著為11天細胞擴增期。用HLA-A*02:01特異性HPV16 E7 11-19(YMLDLQPET) dextramer進行dextramer染色以鑑定純系。DNA條碼化dextramer用於分離HPV16 E7 11-19特異性細胞。藉由10X genomics平台鑑定TCRαβ對。 將全T細胞轉導以個別表現293種HPV特異性TCR。藉由HPV16 E7 11-19dextramer染色評定TCR之表面表現。將經工程改造之T細胞與Incucyte® NucLight Red標記之標靶細胞，諸如裝載1 ng/mL HPV16 E7 11-19肽之T2細胞及CaSki細胞共培養。藉由時間依賴性成像作為T細胞細胞毒性之讀出資料，定量標靶細胞之存活。未經轉導之細胞(NTD)用作對照物。選擇圖2中列出之293種TCR中的五十九(59)種用於進一步評估表面表現及針對HPV16及HLA-A*02:01陽性及陰性細胞株之細胞毒性潛力。 圖 3A- 圖 3D展示基於表現及細胞毒性功能選擇HPV16 E7 11-19TCR之結果。將來自HLA-A*02:01陽性健康供體之全T細胞轉導以表現選自以上圖2中所述之VAYG篩選的59種HPV16 E7 11-19TCR。基於HPV16 E7 11-19(YMLDLQPET) dextramer之高表面結合，選擇59種TCR中之二十四(24)種，且在活體外細胞毒性分析中進一步評估，在分析中，與『比較TCR』進行比較。圖3A展示如藉由A*02:01特異性HPV16 E7 11-19(YMLDLQPET) dextramer染色評定，24種TCR之表面表現的點圖。展示此等TCR對HLA-A*02:01 +HPV16 +標靶細胞株CaSki (圖3B)、SCC152 (圖3C)及SCC090 (圖3D)之細胞毒性反應。將經工程改造之T細胞與Incucyte®NucLight Red標記之標靶細胞株以所指示之效應細胞與標靶細胞(E:T)比率共培養，且在IncuCyte®上定量其存活率，作為T細胞細胞毒性之讀出資料。 圖 4A- 圖 4K展示HPV16 E7 11-19TCR之功能評估結果。將自三種HLA-A*02:01陽性健康供體PBMC分離之全T細胞轉導以表現HPV16 E7 11-19特異性TCR E7-11-194、E7-11-176及E7-11-28及『比較TCR』，且評定對HPV16及HLA-A*02:01陽性及陰性之標靶細胞的功能反應。圖4A展示顯示如藉由A*02:01特異性HPV16 E711-19 (YMLDLQPET) dextramer染色評定，E7 11-19特異性TCR之表現的點圖結果。展示E7 11-19特異性TCR對HLA-A*02:01 +HPV16 +標靶細胞株CaSki (圖4B及圖4C)、SCC152 (圖4D及圖4E)、SCC090 (圖4F及圖4G)、HLA-A*02:01- HPV16 +陰性對照細胞株SiHa (圖4H及圖4I)及HLA-A*02:01 +HPV16 -細胞株NCI-H1792 (圖4J及圖4K)之功能反應。將經工程改造之T細胞與IncuCyte® NucLight Red標記之標靶細胞株以所指示之E:T比率共培養，且在IncuCyte®上定量其存活率，作為T細胞細胞毒性之讀出資料。分析在24小時(E:T 1:1)共培養上清液中IFN-γ、IL-2、TNF-α及顆粒酶B之產生且展示。使用僅T細胞條件來測定細胞介素產生之背景水準。點線表示僅T細胞條件中之細胞介素最高水準(亦即，T細胞之細胞介素產生或增殖的背景水準)。對於細胞毒性分析，使用單向ANOVA，接著鄧尼特多重比較檢驗(Dunnett’s multiple comparisons test)比較平均值，其中TCR與『比較TCR』進行比較。對於CaSki、SCC152及SCC090細胞株，僅展示不顯著之差異。其餘差異為顯著的，P＜0.05。SiHa及NCI-H1792細胞株中無一者之差異顯著。 圖 5展示TCR E7-11-28對110種HLA型中之108種未顯示同種異體反應性。將表現TCR E7-11-28之全T細胞或未經轉導之對照T細胞與無MHC之HEK293T細胞共培養48小時，該等HEK293T細胞再表現110種在美國群體中最頻繁遇到之MHC I類之一。篩選中包括陽性對照物，其由表現含有E7 11-19抗原決定基(YMLDLQPET)之HPV16-E7之片段與HLA-A*02:01兩者的HEK293T細胞組成。在48小時共培養之後，量測相對於未經轉導之對照T細胞，表現TCR E7-11-28之全T細胞對標靶細胞之抑制，作為TCR E7-11-28對同種異體MHC分子之反應性的讀出資料。指示陽性對照物及同種異體反應性對偶基因(標靶細胞抑制 ＞ 20%)。 圖 6A及 圖 6B展示對識別HPV16 E7 11-19之多種TCR之額外選擇。將自HLA-A*02:01陽性健康供體PBMC分離之全T細胞轉導以個別地表現161種HPV16 E7 11-19特異性TCR及『比較TCR』。圖6A展示如藉由HPV16 E7 11-19dextramer染色評定之TCR表面表現及對用200 pg/ml HPV16 E7 11-19肽及HLA-A*02:01 +HPV16 +標靶細胞株SCC152進行脈衝輸送之T2細胞之細胞毒性反應的代表性資料。圖6B展示選擇161種TCR中之15種用於進一步評估表面表現及針對HPV16及HLA-A*02:01陽性及陰性細胞株之細胞毒性潛力。 圖 7展示基於表現及細胞毒性功能選擇HPV16 E7 11-19TCR之結果。將自HLA-A*02:01陽性健康供體PBMC分離之全T細胞轉導以表現HPV16 E7 11-19特異性TCR E7-11-28及E7-11-455及『比較TCR』，且評定對HPV16及HLA-A*02:01陽性及陰性之標靶細胞的細胞毒性反應。展示E7 11-19特異性TCR對HLA-A*02:01 +HPV16 +標靶細胞株CaSki、SCC152、SCC090、HLA-A*02:01 -HPV16 +陰性對照細胞株SiHa及HLA-A*02:01 +HPV16 -細胞株NCI-H1792之功能反應。將經工程改造之T細胞與IncuCyte® NucLight™ Red標記之標靶細胞株以所指示之E:T比率共培養，且在IncuCyte®上定量其存活率，作為T細胞細胞毒性之讀出資料。對於細胞毒性分析，使用單向ANOVA，接著鄧尼特多重比較檢驗比較平均值，其中TCR與『比較TCR』進行比較。*指示p＜0.05。 圖 8提供證實TCR-28展示相對於比較TCR可比之細胞毒性及優良效應功能的總結結果。 圖 9A- 圖 9E展示由HPV16 E7 11-19TCR產生之T細胞增殖反應。將自三種HLA-A*02:01陽性健康供體PBMC分離之全T細胞轉導以表現HPV16 E7 11-19特異性TCR E7-11-194、E7-11-176及E7-11-28及『比較TCR』，且評定對HPV16及HLA-A*02:01陽性及陰性之標靶細胞的功能反應。為測定表現HPV16 E7 11-19特異性TCR之T細胞的增殖，將經工程改造之T細胞用增殖染料標記且與標靶細胞株(CaSki，圖9A；SCC152，圖9B；SCC090，圖9C；SiHa，圖9D；及NCI-H1792，圖9E)共培養96小時(E:T 1:1)。此等細胞株具有以下性質：CaSki、SCC152及SCC090為HLA-A*02:01+HPV16+；SiHa為HLA-A*02:01-HPV16+；且NCI-H1792為HLA-A*02:01+HPV16-。使用染料稀釋來評定CD8+及CD4+ T細胞之增殖。在藉由流動式細胞測量術分析前將計數珠粒添加至樣品中且計數分裂CD8+及CD4+ T細胞之絕對數目。僅T細胞條件用於測定增殖之背景水準；點線表示僅T細胞條件中增殖之最高水準。使用單向ANOVA，接著鄧尼特多重比較檢驗比較平均值，其中TCR與『比較TCR』進行比較。對於CaSki (圖9A)、SCC152 (圖9B)及SCC090 (圖9C)細胞株，僅展示不顯著(ns)之差異。其餘差異為顯著的，P＜0.05。 圖 10A 及圖 10B展示全基因組 SafetyScan篩選鑑定TCR E7-11-28之推定脫靶的結果。圖10A提供代表性的非限制性全基因組 SafetyScan篩選的概述。圖10B展示TCR E7-11-28之 SafetyScan篩選資料，其在跨越每種野生型(w.t.)人類蛋白質之＞600,000個蛋白質片段之篩選中鑑定七個潛在脫靶。該篩選經設計以藉由過度表現90 aa蛋白質片段來過度預測脫靶，該等蛋白質片段比全長蛋白質更有效地加工。藉由基因名稱鑑定推定脫靶。XM_0017722256映射至染色體20之異染色質著絲粒區且已自RefSeq注釋中移除，表明缺乏其表現之證據。使用51個樣品，包括正常組織樣品、癌細胞株及腫瘤樣品之RNA-seq分析未偵測到此基因之表現。 圖 11A- 圖 11J展示TCR E7-11-28未顯示與表現推定脫靶之癌細胞株之反應性。測試表現TCR E7-11-28之全T細胞或NTD細胞與天然表現全基因組安全性篩選中鑑定之脫靶的HLA-A*02:01+癌細胞株的反應性。圖11A、11C、11E、11G及11I展示用E7 11-19肽進行脈衝輸送或未經脈衝且與TCR E7-11-28或NTD細胞共培養之標靶細胞的結果。培養上清液中之IFNγ分泌用作TCR E7-11-28對標靶細胞之反應性的讀出資料。經肽脈衝輸送之T2細胞用作陽性對照物。在指示的情況下，HLA-A*02:01+HPV16+ SCC152細胞用作額外陽性對照物。對於表現多種脫靶之細胞株，僅共培養一次，但在多個圖中展示。圖11B、11D、11F、11H及11J分別展示 HERC1 、 INTS4 、 CPAMD8 、 MPL 及 SPTA1之表現，如標靶細胞中相對於對照基因TBP所確定。 圖 12A- 圖 12I展示TCR E7-11-28未顯示與健康人類初級細胞之反應性。測試表現TCR E7-11-28之全T細胞或NTD細胞與來自健康HLA-A*02:01+人類供體之初級細胞或iPS來源細胞組的反應性，該等細胞包括天然表現全基因組安全性篩選中鑑定之推定脫靶的細胞。圖12A至圖12O展示用E7 11-19肽進行脈衝輸送或未經脈衝且與TCR E7-11-28或NTD細胞共培養之標靶細胞的結果。培養上清液中之IFNγ分泌用作TCR E7-11-28對標靶細胞之反應性的讀出資料。HLA-A*02:01+HPV16+ SCC152細胞用作陽性對照物，且HLA-A*02:01+ HPV16- NCI-H1792細胞或未經脈衝之T2或OVCAR-3用作陰性對照物。圖12P及圖12Q分別展示 HERC1及 INTS4之表現，如標靶細胞中相對於對照基因TBP所確定。RT = 逆轉錄酶。 圖 13A- 圖 13D展示TCR E7-11-28有效控制活體內腫瘤生長。NCG小鼠皮下注射每只小鼠1×10 6個Caski或1×10 6個SCC152細胞(每組n=8只小鼠)。當在第10天腫瘤達到95 ± 15 mm 3時，將小鼠隨機化且在第11天用20×10 6個細胞之TCR E7-11-28、NTD或媒劑處理。圖13A及圖13C展示用20×10 6個細胞之TCR E7-11-28處理的結果，其顯示對活體內腫瘤生長之強烈抑制作用。圖13B及圖13D展示隨著時間推移每組的個別小鼠腫瘤生長結果。*p＜0.05，單向ANOVA，活體內多重比較檢驗之霍爾姆-斯達克校正(Holms-Šidák correction for multiple comparisons test)。圖13A及13C中展示資料線標記。 圖 14展示顯性負性TGFβ受體II (DN-TGFβRII)提供表現DN-TGFbRII之細胞對TGFβ信號傳導之抑制作用的抗性(例如，DN-TGFβRII使TCR E7-11-28對TGFβ介導之抑制具有抗性)。T細胞分別與編碼TCR E7-11-28及DN-TGFβRII之慢病毒共轉導，且經FACS分選為DN-TGFβRII陽性及DN-TGFβRII陰性部分。在與經肽脈衝輸送之T2細胞+/- 5 ng/mL TGFβ共培養24小時之後，定量表現TCR之T細胞內的細胞內IFNγ。 圖 15A- 圖 15C展示TCR E7-11-28及DN-TGFβRII在代表性pNVVD154及pNVVD160載體中之表現及功能評估結果。使用pNVVD154及pNVVD160載體轉染來自HLA-A*02:01陽性健康供體之PBMC以表現HPV16 TCR E7-11-28。來自相同供體之未經轉染之(UTF) PBMC用作對照物。圖15A展示如藉由A*02:01特異性HPV16 E7 11-19(YMLDLQPET) dextramer染色評定，TGFbRII、CD34及TCR E7-11-28之表面表現的點圖。圖15B展示經TCR E7-11-28工程改造之T細胞對HLA-A*02:01 +HPV16 +標靶細胞株CaSki及SCC152以及HLA-A*02:01 +HPV16 -標靶細胞株NCI-H1792之細胞毒性反應。圖15A之頂圖展示經工程改造之T細胞與IncuCyte® NucLight™ Red標記之標靶細胞株CaSki及NCI-H1792 (E:T比率10:1)及SCC-152 (E:T比率5:1)共培養之結果，且在IncuCyte®上定量其存活率作為T細胞細胞毒性之讀出資料。圖15B之底圖展示CaSki、SCC-152及NCI-H1792細胞株在96小時之標靶細胞存活率。圖15C展示測試T細胞親合力之分析的結果。舉例而言，將表現HPV16 TCR E7-11-28之T細胞與經E7 11-19肽(0-1,000 pg/ml E7-肽)進行脈衝輸送之表現IncuCyte® NucLight™之T2細胞以5:1之E:T比率共培養。圖展示在共培養0小時與96小時之間T2細胞生長之曲線下面積(AUC)。實驗一式兩份。進行曼-惠特尼t檢驗(Mann-Whitney t-test)。
除非另外指示，否則對於顯示條柱狀圖、曲線或與圖例相關之其他資料的任何圖，每個指示自左至右呈現之條柱、曲線或其他資料直接且按順序對應於圖例中自上至下或自左至右之框。

Claims (149)

  1. 一種結合蛋白，其包含： a)      與選自由表1中所列之TCR α鏈CDR序列組成之群的TCR α鏈CDR序列具有至少約80%一致性的T細胞受體(TCR) α鏈CDR序列；及/或 b)      與選自由表1中所列之TCR β鏈CDR序列組成之群的TCR β鏈CDR序列具有至少約80%一致性的TCR β鏈CDR序列，其中該結合蛋白能夠與HPV16 E7 11-19免疫原性肽-MHC (pMHC)複合物結合，視情況其中結合親和力之K d小於或等於約5×10 -4M。
  2. 一種結合蛋白，其包含： a)      與選自由表1中所列之TCR V α域序列組成之群的TCR V α域序列具有至少約80%一致性的TCR α鏈可變(V α)域序列；及/或 b)      與選自由表1中所列之TCR V β域序列組成之群的TCR V β域序列具有至少約80%一致性的TCR β鏈可變(V β)域序列，其中該結合蛋白能夠與HPV16 E7 11-19免疫原性肽-MHC (pMHC)複合物結合，視情況其中結合親和力之K d小於或等於約5×10 -4M。
  3. 一種結合蛋白，其包含： a)      與選自由表1中所列之TCR α鏈序列組成之群的TCR α鏈序列具有至少約80%一致性的TCR α鏈序列；及/或 b)      與選自由表1中所列之TCR β鏈序列組成之群的TCR β鏈序列具有至少約80%一致性的TCR β鏈序列，其中該結合蛋白能夠與HPV16 E7 11-19免疫原性肽-MHC (pMHC)複合物結合，視情況其中結合親和力之K d小於或等於約5×10 -4M。
  4. 一種結合蛋白，其包含： a)      選自由表1中所列之TCR α鏈CDR序列組成之群的TCR α鏈CDR序列；及/或 b)      選自由表1中所列之TCR β鏈CDR序列組成之群的TCR β鏈CDR序列，其中該結合蛋白能夠與HPV16 E7 11-19免疫原性肽-MHC (pMHC)複合物結合，視情況其中結合親和力之K d小於或等於約5×10 -4M。
  5. 一種結合蛋白，其包含： a)      選自由表1中所列之TCR V α域序列組成之群的TCR α鏈可變(V α)域序列；及/或 b)      選自由表1中所列之TCR V β域序列組成之群的TCR β鏈可變(V β)域序列，其中該結合蛋白能夠與HPV16 E7 11-19免疫原性肽-MHC (pMHC)複合物結合，視情況其中結合親和力之K d小於或等於約5×10 -4M。
  6. 一種結合蛋白，其包含： a)      選自由表1中所列之TCR α鏈序列組成之群的TCR α鏈序列；及/或 b)      選自由表1中所列之TCR β鏈序列組成之群的TCR β鏈序列，其中該結合蛋白能夠與HPV16 E7 11-19免疫原性肽-MHC (pMHC)複合物結合，視情況其中結合親和力之K d小於或等於約5×10 -4M。
  7. 如請求項1至6中任一項之結合蛋白，其中1)該TCR α鏈CDR、該TCR V α域及/或該TCR α鏈由選自表1中所列之TRAV、TRAJ及TRAC基因之群的TRAV、TRAJ及/或TRAC基因或其片段編碼，及/或2)該TCR β鏈CDR、該TCR V β域及/或該TCR β鏈由選自表1中所列之TRBV、TRBJ及TRBC基因之群的TRBV、TRBJ及/或TRBC基因或其片段編碼，及/或3)與表1中所列之同源參考CDR序列相比，該結合蛋白之各CDR具有至多五個胺基酸取代、插入、缺失或其組合。
  8. 如請求項1至7中任一項之結合蛋白，其中該HPV16 E7 11-19免疫原性肽包含胺基酸序列YMLDLQPET。
  9. 如請求項1至8中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白為嵌合、人類化或人類的。
  10. 如請求項1至9中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白為TCR、TCR之抗原結合片段、單鏈TCR (scTCR)、嵌合抗原受體(CAR)或包含TCR及效應域之融合蛋白，視情況其中結合域包含跨膜域及細胞內效應域。
  11. 如請求項1至10中任一項之結合蛋白，其中該TCR α鏈及該TCR β鏈經共價連接，視情況其中該TCR α鏈及該TCR β鏈經由連接子肽共價連接。
  12. 如請求項1至11中任一項之結合蛋白，其中該TCR α鏈及/或該TCR β鏈共價連接至部分，視情況其中該共價連接之部分包含親和力標籤或標記。
  13. 如請求項12之結合蛋白，其中該親和力標籤係選自由以下組成之群：CD34富集標籤、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、鈣調蛋白結合蛋白(CBP)、蛋白C標籤、Myc標籤、HaloTag、HA標籤、Flag標籤、His標籤、生物素標籤及V5標籤，及/或其中該標記為螢光蛋白。
  14. 如請求項1至13中任一項之結合蛋白，其中該共價連接之部分係選自由以下組成之群：致炎因子、細胞介素、毒素、細胞毒性分子、放射性同位素或抗體或其抗原結合片段。
  15. 如請求項1至14中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白與細胞表面上之該pMHC複合物結合。
  16. 如請求項1至15中任一項之結合蛋白，其中該MHC為MHC多聚體，視情況其中該MHC多聚體為四聚體。
  17. 如請求項1至16中任一項之結合蛋白，其中該MHC為MHC I類分子。
  18. 如請求項1至17中任一項之結合蛋白，其中該MHC包含MHC α鏈，該鏈為HLA血清型HLA-A*02。
  19. 如請求項1至18中任一項之結合蛋白，其中該HLA對偶基因係選自由以下組成之群：HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0205、HLA-A*0206及HLA-A*0207對偶基因。
  20. 如請求項1至19中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白與該HPV16 E7 11-19肽-MHC (pMHC)複合物之結合引發免疫反應，視情況其中該免疫反應係T細胞反應。
  21. 如請求項1至20中任一項之結合蛋白，其中該T細胞反應係選自由T細胞擴增、細胞介素釋放及/或細胞毒性殺傷組成之群。
  22. 如請求項1至21中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白能夠以小於或等於約1×10 -4M、小於或等於約5×10 -5M、小於或等於約1×10 -5M、小於或等於約5×10 -6M、小於或等於約1×10 -6M、小於或等於約5×10 -7M、小於或等於約1×10 -7M、小於或等於約5×10 -8M、小於或等於約1×10 -8M、小於或等於約5×10 -9M、小於或等於約1×10 -9M、小於或等於約5×10 -10M、小於或等於約1×10 -10M、小於或等於約5×10 -11M、小於或等於約1×10 -11M、小於或等於約5×10 -12M或小於或等於約1×10 -12M之K d與該HPV16 E7 11-19免疫原性肽-MHC (pMHC)複合物特異性及/或選擇性地結合。
  23. 如請求項1至22中任一項之結合蛋白，其中與已知之T細胞受體相比，該結合蛋白對該肽-MHC (pMHC)具有更高結合親和力。
  24. 如請求項1至23中任一項之結合蛋白，其中與已知之T細胞受體相比，該結合蛋白對該肽-MHC (pMHC)之結合親和力至少高出1.05倍。
  25. 如請求項1至24中任一項之結合蛋白，其中當與表現HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之標靶細胞接觸時，與已知之T細胞受體相比，該結合蛋白誘導更高T細胞擴增、細胞介素釋放及/或細胞毒性殺傷。
  26. 如請求項1至25中任一項之結合蛋白，其中當與表現HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之標靶細胞接觸時，與已知之T細胞受體相比，該結合蛋白誘導的T細胞擴增、細胞介素釋放及/或細胞毒性殺傷至少增加1.05倍。
  27. 如請求項25或26之結合蛋白，其中該標靶細胞為CaSki、SCC152或SCC090細胞株。
  28. 如請求項25或26之結合蛋白，其中該標靶細胞為癌細胞，視情況其中該癌細胞為頭頸癌細胞、口咽癌細胞、子宮頸癌細胞、肛門癌細胞、陰道癌細胞、陰門癌細胞或陰莖癌細胞。
  29. 如請求項22至28中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白不與肽-MHC (pMHC)複合物結合，視情況其中該肽來源於SPTA1、MPL、HERC1、CPAMD8、INTS4、NUTM1或XM_00172256。
  30. 如請求項22至29中任一項之結合蛋白，其中該結合蛋白不與SPTA1-、MPL-、HERC1-、CPAMD8-、INTS4-、NUTM1-及/或XM_00172256-肽-MHC (pMHC)複合物結合。
  31. 一種TCR α鏈及/或β鏈，其選自由表1中所列之TCR α鏈及β鏈序列組成之群。
  32. 一種經分離之核酸分子，其在嚴格條件下與編碼選自由表1中所列之多肽序列組成之群的多肽的核酸之補體，或與編碼選自由表1中所列之多肽序列組成之群的多肽的核酸具有至少約80%同源性的序列雜交，視情況其中該經分離之核酸分子包含1)選自表1中所列之TRAV、TRAJ及TRAC基因之群的TRAV、TRAJ及/或TRAC基因或其片段及/或2)選自表1中所列之TRBV、TRBJ及TRBC基因之群的TRBV、TRBJ及/或TRBC基因或其片段。
  33. 如請求項32之經分離之核酸，其中該核酸經密碼子最佳化以在宿主細胞中表現。
  34. 一種載體，其包含如請求項32或33之經分離之核酸。
  35. 如請求項34之載體，其中該載體為選殖載體、表現載體或病毒載體。
  36. 如請求項34或35之載體，其中該載體進一步包含編碼CD8α、CD8β、顯性負性TGFβ受體II (DN-TGFβRII)、可選擇蛋白質標記物之核酸序列，視情況其中該可選擇蛋白質標記物為二氫葉酸還原酶(DHFR)。
  37. 如請求項34至36中任一項之載體，其中編碼CD8α、CD8β、該DN-TGFβRII及/或該可選擇蛋白質標記物之該核酸序列可操作地連接至編碼標籤之核酸。
  38. 如請求項34至37中任一項之載體，其中該編碼標籤之核酸處於編碼CD8α、CD8β、該DN-TGFβRII及/或該可選擇蛋白質標記物之該核酸序列上游之5’，使得該標籤與CD8α、CD8β、該DN-TGFβRII及/或該可選擇蛋白質標記物之N端融合。
  39. 如請求項34至38中任一項之載體，其中該標籤為CD34富集標籤。
  40. 如請求項32至39中任一項之核酸或載體，其中如請求項23或24之經分離之核酸及/或編碼TCR8α、TCR8β、CD8α、CD8β、該DN-TGFβRII及/或該可選擇蛋白質標記物之該核酸序列與內部核糖體進入位點或編碼自裂解肽之核酸序列相互連接。
  41. 如請求項32至40中任一項之核酸或載體，其中該自裂解肽為P2A、E2A、F2A或T2A。
  42. 一種宿主細胞，其包含如請求項32或33之經分離之核酸，包含如請求項34至41中任一項之載體，及/或表現如請求項1至30中任一項之結合蛋白，視情況其中該細胞經基因工程改造。
  43. 如請求項42之宿主細胞，其中該宿主細胞包含TCR基因、HLA基因或兩者之染色體基因剔除。
  44. 如請求項42或43之宿主細胞，其中該宿主細胞包含選自以下之HLA基因之剔除：α1巨球蛋白基因、α2巨球蛋白基因、α3巨球蛋白基因、β1微球蛋白基因、β2微球蛋白基因及其組合。
  45. 如請求項42至44中任一項之宿主細胞，其中該宿主細胞包含選自以下之TCR基因之剔除：TCR α可變區基因、TCR β可變區基因、TCR恆定區基因及其組合。
  46. 如請求項42至45中任一項之宿主細胞，其中該宿主細胞表現CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物，視情況其中該可選擇蛋白質標記物為DHFR。
  47. 如請求項46之宿主細胞，其中該CD8α、CD8β、該DN-TGFβRII及/或該可選擇蛋白質標記物與CD34富集標籤融合。
  48. 如請求項47之宿主細胞，其中宿主細胞使用該CD34富集標籤進行富集。
  49. 如請求項42至48中任一項之宿主細胞，其中該宿主細胞為免疫細胞。
  50. 如請求項42至49中任一項之宿主細胞，其中該免疫細胞為細胞毒性淋巴球、細胞毒性淋巴球前驅細胞、細胞毒性淋巴球先驅細胞、細胞毒性淋巴球幹細胞、CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4/CD8雙陰性T細胞、γδ (gamma delta) T細胞、自然殺手(NK)細胞、NK-T細胞、樹突狀細胞或其組合。
  51. 如請求項42至50中任一項之宿主細胞，其中該T細胞為初始T細胞、中央記憶T細胞、效應記憶T細胞或其組合。
  52. 如請求項42至51中任一項之宿主細胞，其中該T細胞為初級T細胞或T細胞株之細胞。
  53. 如請求項42至52中任一項之宿主細胞，其中該T細胞不表現內源性TCR或具有內源性TCR之較低表面表現。
  54. 如請求項42至53中任一項之宿主細胞，其中該宿主細胞在與標靶細胞接觸時能夠產生細胞介素或細胞毒性分子，該標靶細胞包括包含在MHC分子背景中之HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之肽-MHC (pMHC)複合物。
  55. 如請求項54之宿主細胞，其中該宿主細胞在 活體外、 離體或 活體內與該標靶細胞接觸。
  56. 如請求項54或55之宿主細胞，其中該細胞介素為TNF-α、IL-2及/或IFN-γ。
  57. 如請求項54至56中任一項之宿主細胞，其中該細胞毒性分子為穿孔蛋白及/或顆粒酶，視情況其中該細胞毒性分子為顆粒酶B。
  58. 如請求項54至57中任一項之宿主細胞，其中該宿主細胞在與表現HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之標靶細胞接觸時能夠產生更高水準之細胞介素或細胞毒性分子。
  59. 如請求項58之宿主細胞，其中該宿主細胞能夠產生至少高出1.05倍水準之細胞介素或細胞毒性分子。
  60. 如請求項54至59中任一項之宿主細胞，其中該宿主細胞能夠殺傷包括包含在MHC分子背景中之該HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之肽-MHC (pMHC)複合物的標靶細胞。
  61. 如請求項61之宿主細胞，其中該殺傷係藉由殺傷分析來測定。
  62. 如請求項60或61之宿主細胞，其中該殺傷分析中該宿主細胞與該標靶細胞之比率為20:1至0.625:1。
  63. 如請求項60至62中任一項之宿主細胞，其中標靶細胞為用1 µg/mL至50 pg/mL HPV16 E7 11-19肽進行脈衝輸送之T2細胞。
  64. 如請求項60至62中任一項之宿主細胞，其中該宿主細胞在與表現HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之標靶細胞接觸時能夠殺傷更高數目之標靶細胞。
  65. 如請求項64之宿主細胞，其中該宿主細胞能夠殺傷至少高出1.05倍之數目的標靶細胞。
  66. 如請求項60、61、64及65中任一項之宿主細胞，其中該標靶細胞為CaSki、SCC152或SCC090細胞株。
  67. 如請求項54至66中任一項之宿主細胞，其中該HPV16 E7 11-19免疫原性肽包含胺基酸序列YMLDLQPET。
  68. 如請求項54至67中任一項之宿主細胞，其中該MHC分子為MHC I類分子。
  69. 如請求項54至68中任一項之宿主細胞，其中該MHC分子包含MHC α鏈，該鏈為HLA血清型HLA-A*02。
  70. 如請求項54至69中任一項之宿主細胞，其中該HLA對偶基因係選自由以下組成之群：HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06及HLA-A*02:07對偶基因。
  71. 如請求項54至70中任一項之宿主細胞，其中該標靶細胞為選自由CaSki、SCC152及SCC090細胞株組成之群的細胞株，為表現HPV16 E7 11-19免疫原性肽之癌細胞，或不為SiHa細胞株及/或不為NCI-H1792細胞株。
  72. 如請求項71之宿主細胞，其中該癌細胞係選自由以下組成之群：頭頸癌細胞、口咽癌細胞、子宮頸癌細胞、肛門癌細胞、陰道癌細胞、陰門癌細胞及陰莖癌細胞。
  73. 如請求項54至72中任一項之宿主細胞，其中a)該宿主細胞在與包括包含在MHC分子背景中之SPTA1、MPL、HERC1、CPAMD8、INTS4、NUTM1或XM_00172256肽抗原決定基之肽-MHC (pMHC)複合物的標靶細胞接觸時不誘導T細胞擴增、細胞介素釋放或細胞毒性殺傷，及/或b)該宿主細胞不表現HPV16 E7 11-19抗原，未被如請求項1至30中任一項之結合蛋白識別，不屬於血清型HLA-A*02，及/或不表現HLA-A*02對偶基因，視情況其中該HLA-A*02對偶基因為HLA-A*02:01及/或HLA-A*02:06。
  74. 一種如請求項42至73中任一項之宿主細胞之群體。
  75. 一種組合物，其包含：a)如請求項1至30中任一項之結合蛋白，b)如請求項32或33之經分離之核酸，c)如請求項34至41中任一項之載體，d)如請求項42至73中任一項之宿主細胞，及/或e)如請求項74之宿主細胞之群體，及載劑。
  76. 一種裝置或套組，其包含：a)如請求項1至30中任一項之結合蛋白，b)如請求項32或33之經分離之核酸，c)如請求項34至41中任一項之載體，d)如請求項42至73中任一項之宿主細胞，及/或e)如請求項74之宿主細胞之群體，該裝置或套組視情況包含偵測a)、d)及/或e)與pMHC複合物之結合之試劑。
  77. 一種產生如請求項1至30中任一項之結合蛋白的方法，其中該方法包括以下步驟：(i)在適合允許該結合蛋白表現之條件下培養經轉型之宿主細胞，該宿主細胞已藉由包含編碼如請求項1至30中任一項之結合蛋白之序列的核酸轉型；及(ii)回收該表現之結合蛋白。
  78. 一種產生表現如請求項1至30中任一項之結合蛋白之宿主細胞的方法，其中該方法包括以下步驟：(i)將包含編碼如請求項1至30中任一項之結合蛋白之序列的核酸引入該宿主細胞中；(ii)在適合允許該結合蛋白表現之條件下培養該經轉型之宿主細胞。
  79. 一種偵測HPV16 E7 11-19抗原及/或表現HPV16 E7 11-19之細胞之存在或不存在的方法，視情況其中該細胞為過度增殖細胞，該方法包括藉由使用至少一種如請求項1至30中任一項之結合蛋白或至少一種如請求項42至73中任一項之宿主細胞來偵測樣品中該HPV16 E7 11-19抗原之存在或不存在，其中偵測到該HPV16 E7 11-19抗原表明存在HPV16 E7 11-19抗原及/或表現HPV16 E7 11-19之細胞。
  80. 如請求項79之方法，其中該至少一種結合蛋白或該至少一種宿主細胞與在MHC分子背景中之該HPV16 E7 11-19肽形成複合物，且以螢光活化細胞分選(FACS)、酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫化學、西方墨點法或細胞內流式分析之形式偵測該複合物。
  81. 如請求項79或80之方法，其進一步包括自個體獲得該樣品。
  82. 如請求項79至81中任一項之方法，其進一步包括藉由骨髓生檢來確認表現HPV16 E7 11-19之細胞。
  83. 一種偵測個體中以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之程度的方法，其包括： a)      使自該個體獲得之樣品與至少一種如請求項1至30中任一項之結合蛋白、至少一種如請求項42至73中任一項之宿主細胞或如請求項74之宿主細胞之群體接觸；及 b)      偵測反應性水準， 其中與對照水準相比反應性水準更高表明該個體中以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之程度。
  84. 如請求項83之方法，其中該對照水準為參考數字。
  85. 如請求項83之方法，其中該對照水準為未患該以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之個體的水準。
  86. 一種用於監測個體中以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之進展的方法，該方法包括： a)      根據請求項79至85中之任一項，在第一時間點偵測個體樣品中該HPV16 E7 11-19抗原水準或表現HPV16 E7 11-19之所關注細胞； b)      在後續時間點重複步驟a)；及 c)      比較在步驟a)及b)中偵測到之HPV16 E7 11-19抗原水準或表現HPV16 E7 11-19之所關注細胞以監測該個體中以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之進展，其中與步驟a)相比，步驟b)中偵測到之該HPV16 E7 11-19抗原水準或該表現HPV16 E7 11-19之所關注細胞的不存在或降低表明該個體中以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之該非惡性病症、該過度增生性病症或該過度增生性病症復發的進展受到抑制。
  87. 如請求項86之方法，其中在第一時間點與該後續時間點之間，該個體已進行治療以治療以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之該非惡性病症、該過度增生性病症或該過度增生性病症復發。
  88. 一種評估療法對以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發之功效的方法，其包括： a)      在針對以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之該非惡性病症、該過度增生性病症或該過度增生性病症復發向個體提供該療法之至少一部分之前自該個體獲得之第一樣品中，測定自該個體獲得之樣品與至少一種如請求項1至30中任一項之結合蛋白、至少一種如請求項42至73中任一項之宿主細胞或如請求項74之宿主細胞之群體之間的反應性之存在或水準，及 b)      在針對以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之該非惡性病症、該過度增生性病症或該過度增生性病症復發提供該療法之該部分後自該個體獲得之第二樣品中，測定自該個體獲得之樣品與至少一種如請求項1至30中任一項之結合蛋白、至少一種如請求項42至73中任一項之宿主細胞或如請求項74之宿主細胞之群體之間的反應性之存在或水準， 其中相對於該第一樣品，該第二樣品中不存在反應性或反應性水準降低表明該療法有效治療該個體之以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之該非惡性病症、該過度增生性病症或該過度增生性病症復發。
  89. 如請求項83至89中任一項之方法，其中該反應性水準由a)結合之存在及/或b) T細胞活化及/或效應功能指示。
  90. 如請求項89之方法，其中該T細胞活化或效應功能為T細胞增殖、殺傷或細胞介素釋放。
  91. 如請求項83至90中任一項之方法，其中該T細胞結合、活化及/或效應功能係使用螢光活化細胞分選(FACS)、酶聯免疫吸附劑分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、免疫化學、西方墨點法或細胞內流式分析來偵測。
  92. 一種預防及/或治療個體中以HPV16 E7 11-19抗原表現為特徵之非惡性病症、過度增生性病症或過度增生性病症復發的方法，其包括向該個體投與治療有效量的包含表現至少一種如請求項1至30中任一項之結合蛋白之細胞的組合物。
  93. 如請求項92之方法，其中該細胞為同種異體細胞、同基因型細胞或自體同源細胞。
  94. 如請求項92或93之方法，其中該細胞經基因修飾。
  95. 如請求項92至94中任一項之方法，其中該細胞包含TCR基因、HLA基因或TCR基因與HLA基因之染色體基因剔除。
  96. 如請求項92至95中任一項之方法，其中該細胞包含選自以下之HLA基因之剔除：α1巨球蛋白基因、α2巨球蛋白基因、α3巨球蛋白基因、β1微球蛋白基因、β2微球蛋白基因及其組合。
  97. 如請求項92至96中任一項之方法，其中該細胞包含選自以下之TCR基因之剔除：TCR α可變區基因、TCR β可變區基因、TCR恆定區基因及其組合。
  98. 如請求項92至97中任一項之方法，其中該細胞表現CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物，視情況其中該可選擇蛋白質標記物為DHFR，且進一步視情況其中該CD8α、CD8β、該DN-TGFβRII及/或該可選擇蛋白質標記物與CD34富集標籤融合。
  99. 如請求項98之方法，其中細胞使用該CD34富集標籤進行富集。
  100. 如請求項923至99中任一項之方法，其中該細胞為免疫細胞。
  101. 如請求項92至100中任一項之方法，其中該免疫細胞為細胞毒性淋巴球、細胞毒性淋巴球前驅細胞、細胞毒性淋巴球先驅細胞、細胞毒性淋巴球幹細胞、CD4 +T細胞、CD8 +T細胞、CD4/CD8雙陰性T細胞、γδ (gamma delta) T細胞、自然殺手(NK)細胞、NK-T細胞、樹突狀細胞或其組合。
  102. 如請求項92至101中任一項之方法，其中該T細胞為初始T細胞、中央記憶T細胞、效應記憶T細胞或其組合。
  103. 如請求項92至102中任一項之方法，其中該T細胞為初級T細胞或T細胞株之細胞。
  104. 如請求項92至103中任一項之方法，其中該T細胞不表現內源性TCR或具有內源性TCR之較低表面表現。
  105. 如請求項92至104中任一項之方法，其中該細胞在與標靶細胞接觸時能夠產生細胞介素或細胞毒性分子，該標靶細胞包括包含在MHC分子背景中之HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之肽-MHC (pMHC)複合物。
  106. 如請求項92至105中任一項之方法，其中該細胞介素為TNF-α、IL-2及/或IFN-γ。
  107. 如請求項92至106中任一項之方法，其中該細胞毒性分子為穿孔蛋白及/或顆粒酶，視情況其中該細胞毒性分子為顆粒酶B。
  108. 如請求項92至107中任一項之方法，其中該細胞在與表現HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之標靶細胞接觸時能夠產生更高水準之細胞介素或細胞毒性分子。
  109. 如請求項108之方法，其中該細胞能夠產生至少高出1.05倍水準之細胞介素或細胞毒性分子。
  110. 如請求項92至109中任一項之方法，其中該宿主細胞能夠殺傷包括包含在MHC分子背景中之HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之肽-MHC (pMHC)複合物的標靶細胞。
  111. 如請求項92至110中任一項之方法，其中該宿主細胞在與表現HPV16 E7 11-19肽抗原決定基之標靶細胞接觸時能夠殺傷更高數目之標靶細胞。
  112. 如請求項111之方法，其中該宿主細胞能夠殺傷高出至少1.05倍數目之標靶細胞。
  113. 如請求項92至112中任一項之方法，其中該HPV16 E7 11-19免疫原性肽包含胺基酸序列YMLDLQPET。
  114. 如請求項92至113中任一項之方法，其中該MHC分子為MHC I類分子。
  115. 如請求項92至114中任一項之方法，其中該MHC分子包含MHC α鏈，該鏈為HLA血清型HLA-A*02。
  116. 如請求項92至115中任一項之宿主細胞，其中該HLA對偶基因係選自由以下組成之群：HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06及HLA-A*02:07對偶基因。
  117. 如請求項92至116中任一項之方法，其中該標靶細胞為該個體中表現該HPV16 E7 11-19抗原之非惡性細胞或過度增生性細胞。
  118. 如請求項92至117中任一項之方法，其中該組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
  119. 如請求項92至118中任一項之方法，其中該組合物在該個體中誘導針對表現該HPV16 E7 11-19抗原之該非惡性細胞或該過度增生性細胞的免疫反應。
  120. 如請求項92至119中任一項之方法，其中該組合物在該個體中誘導針對表現該HPV16 E7 11-19抗原之該非惡性細胞或該過度增生性細胞之抗原特異性T細胞免疫反應。
  121. 如請求項92至120中任一項之方法，其中該抗原特異性T細胞免疫反應包含CD4 +輔助T淋巴球(Th)反應及CD8+細胞毒性T淋巴球(CTL)反應中之至少一者。
  122. 如請求項83至121中任一項之方法，其中該病症與HPV感染相關。
  123. 如請求項83至122中任一項之方法，其中該HPV感染為HPV16感染。
  124. 如請求項83至123中任一項之方法，其中該癌症為頭頸癌。
  125. 如請求項83至124中任一項之方法，其中該癌症為頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)。
  126. 如請求項83至124中任一項之方法，其中該癌症為口咽癌。
  127. 如請求項83至124中任一項之方法，其中該癌症為子宮頸癌。
  128. 如請求項83至124中任一項之方法，其中該癌症為肛門癌。
  129. 如請求項83至124中任一項之方法，其中該癌症為陰道癌。
  130. 如請求項83至124中任一項之方法，其中該癌症為陰門癌。
  131. 如請求項83至124中任一項之方法，其中該癌症為陰莖癌。
  132. 如請求項92至131中任一項之方法，其中該個體正接受或先前接受過造血細胞移植(HCT)，視情況其中該HCT包含不表現HPV16 E7 11-19抗原，未被如請求項1至30中任一項之結合蛋白識別，不屬於血清型HLA-A*02，及/或不表現HLA-A*02:01對偶基因的細胞。
  133. 如請求項133之方法，其中該HCT包括包含編碼HLA組分之基因之染色體剔除、編碼TCR組分之基因之染色體剔除或兩者的供體造血細胞。
  134. 如請求項92至133中任一項之方法，其中該個體先前曾接受過清除淋巴細胞化學療法。
  135. 如請求項134之方法，其中該清除淋巴細胞化學療法包含環磷醯胺(cyclophosphamide)、氟達拉濱(fludarabine)、抗胸腺細胞球蛋白或其組合。
  136. 如請求項92至135中任一項之方法，其進一步包括向該個體投與至少一種針對該非惡性病症、該過度增生性病症或該過度增生性病症復發的額外治療。
  137. 如請求項92至136中任一項之方法，其中該至少一種針對該非惡性病症、該過度增生性病症或該過度增生性病症復發的額外治療係與該組合物同時或依次投與。
  138. 如請求項81至137中任一項之方法，其中該個體為以HPV16 E7 11-19表現為特徵之病症的動物模型及/或哺乳動物，視情況其中該哺乳動物為人類、靈長類動物或嚙齒類動物。
  139. 一種表現載體，其包含與編碼CD8α、CD8β、DN-TGFβRII及/或可選擇蛋白質標記物之核酸序列可操作地連接的啟動子，視情況其中該可選擇蛋白質標記物為DHFR。
  140. 如請求項139之載體，其中編碼CD8α、CD8β、該DN-TGFβRII及/或該可選擇蛋白質標記物之該核酸序列可操作地連接至編碼標籤之核酸，以使得該標籤與該CD8α、CD8β、該DN-TGFβRII及/或該可選擇蛋白質標記物融合。
  141. 如請求項139或140之載體，其中該編碼標籤之核酸處於編碼CD8α、CD8β、該DN-TGFβRII及/或該可選擇蛋白質標記物之該核酸序列上游之5’，使得該標籤與CD8α、CD8β、該DN-TGFβRII及/或該可選擇蛋白質標記物之N端融合。
  142. 如請求項139至141中任一項之載體，其中該標籤為CD34富集標籤。
  143. 如請求項139至142中任一項之載體，其中該載體進一步包含編碼TCRα及/或TCRβ之核酸序列。
  144. 如請求項139至143中任一項之載體，其中該TCRα、TCRβ及/或該DN-TGFβRII包含突變跨膜域及/或突變恆定域。
  145. 如請求項139至144中任一項之載體，其中該突變跨膜域及/或突變恆定域增強TCRα、TCRβ及/或該DN-TGFβRII之細胞表面表現，同時減少內源性TCRα、TCRβ及/或TGFβRII之表現。
  146. 如請求項139至145中任一項之載體，其中編碼CD8α、CD8β、該DN-TGFβRII、該可選擇蛋白質標記物、該TCRα及/或該TCRβ之該核酸序列與內部核糖體進入位點或編碼自裂解肽之核酸序列相互連接。
  147. 如請求項139至146中任一項之載體，其中該自裂解肽為P2A、E2A、F2A或T2A。
  148. 如請求項139至147中任一項之載體，其中該載體進一步包含編碼選自由表1中所列之多肽序列組成之群的多肽的核酸序列，或與編碼選自由表1中所列之該等多肽序列組成之群的多肽的核酸具有至少約80%同源性的序列，視情況其中經分離之核酸分子包含1)選自表1中所列之TRAV、TRAJ及TRAC基因之群的TRAV、TRAJ及/或TRAC基因或其片段及/或2)選自表1中所列之TRBV、TRBJ及TRBC基因之群的TRBV、TRBJ及/或TRBC基因或其片段。
  149. 如請求項139至148中任一項之載體，其中該載體具有或包含表3中所示之核酸序列或其片段，視情況其中該片段編碼DN-TGFβRII。
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