ES2928051T3

ES2928051T3 - Receptores de linfocitos T anti-KRAS-G12D

Info

Publication number: ES2928051T3
Application number: ES17749580T
Authority: ES
Inventors: Eric Tran; Yong-Chen Lu; Paul F Robbins; Steven A Rosenberg; Zhili Zheng
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2016-08-02
Filing date: 2017-07-31
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2037-07-31
Also published as: SI3494133T1; US20210300988A1; HRP20221183T1; US20220089677A1; KR102527052B1; IL301894A; US11208456B2; WO2018026691A1; IL264425A; CN109790211B; US11897933B2; RS63615B1; IL264425B2; HUE060121T2; AU2017306038B2; CA3032870A1; PT3494133T; EP3494133A1; US20200247869A1; PL3494133T3

Abstract

Se describe un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que tiene especificidad antigénica para el homólogo del oncogén viral del sarcoma de rata Kirsten mutado (KRAS) presentado en el contexto de una molécula HLA-Cw*0802. También se proporcionan polipéptidos y proteínas relacionados, así como ácidos nucleicos relacionados, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células y composiciones farmacéuticas. También se describen métodos para detectar la presencia de cáncer en un mamífero y métodos para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de linfocitos T anti-KRAS-G12D

Referencia cruzada a solicitud relacionada

La presente solicitud de patente reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE . UU. n.° 62/369.883, presentada el 2 de agosto de 2016.

La presente invención se ha realizado con la financiación del Gobierno estadounidense con el número de proyecto ZIABC 010984 por los Institutos Nacionales de la Salud, Instituto Nacional del Cáncer. El Gobierno tiene determinados derechos en la invención.

Antecedentes de la invención

Algunos cánceres pueden tener opciones de tratamiento muy limitadas, en particular, cuando el cáncer se vuelve metastásico e irresecable. A pesar de los avances en los tratamientos, tales como, por ejemplo, cirugía, quimioterapia y radioterapia, el pronóstico para muchos cánceres, tales como, por ejemplo, cánceres de páncreas, colorrectal, de pulmón, de endometrio, de ovario y de próstata, puede ser malo. El documento WO 2016/085904 A1 divulga un receptor de linfocitos T (TCR) aislado o purificado que tiene especificidad antigénica para un epítopo restringido por HLA-A11 del homólogo del oncogén vírico de sarcoma de rata Kirsten (KRAS) mutado (KRAS^7-16), homólogo del oncogén vírico RAS (V-Ras) de neuroblastoma (NRAS) u homólogo del oncogén vírico de sarcoma de rata Harvey (HRAS). En consecuencia, existe una necesidad insatisfecha de obtener tratamientos adicionales para el cáncer.

Breve sumario de la invención

Un modo de realización de la invención proporciona un TCR específico para KRAS G12D aislado o purificado que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9-11 e (i) ^sE ^qID NO: 12-14 o (ii) SEQ ID NO: 20-22. En un modo de realización, el TCR comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 16 o (ii) SEQ ID NO: 24. En un modo de realización de este tipo, el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e (i) SEQ ID NO: 16 o (ii) SEQ ID NO: 24.

En un modo de realización, el TC R comprende además:

(A) una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, en la que:

(i) X en la posición 48 de SEQ ID NO: 46 es Thr o Cys;

(ii) X en la posición 112 de SEQ ID NO: 46 es Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp;

(iii) X en la posición 114 de SEQ ID NO: 46 es Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe o Trp; y

(iv) X en la posición 115 de SEQ ID NO: 46 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; y

(B) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, en la que X en la posición 57 de SEQ ID NO: 47 es Ser o Cys. En un modo de realización de este tipo, el TCR comprende además:

(A) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, en la que:

(i) X en la posición 48 de SEQ ID NO: 46 es Thr o Cys;

(iii) X en la posición 114 de SEQ ID NO: 46 es Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe o Trp; y (iv) X en la posición 115 de SEQ ID NO: 46 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; y (B) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, en la que X en la posición 57 de SEQ ID NO: 47 es Ser o Cys.

En un modo de realización, el TCR comprende secuencias de aminoácidos al menos un 99 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 50 y 51 o (ii) SEQ ID NO: 50 y 53. En un modo de realización de este tipo, el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 50 y 51 o (ii) SEQ ID NO: 50 y 53. Otro modo de realización de la invención proporciona un polipéptido específico para KRAS G12D aislado o purificado que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9-11 e (i) SEQ ID NO: 12-14 o ii) SEQ ID NO: 20-22. Opcionalmente, el polipéptido comprende además:

(i) X en la posición 48 de SEQ ID NO: 46 es Thr o Cys;

(B) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, en la que X en la posición 57 de SEQ ID NO: 47 es Ser o Cys. En un modo de realización de este tipo, el polipéptido comprende además:

(A) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, en la que:

(i) X en la posición 48 de SEQ ID NO: 46 es Thr o Cys;

(B) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, en la que X en la posición 57 de SEQ ID NO: 47 es Ser o Cys.

En un modo de realización, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 16 o (ii) SEQ ID NO: 24. En un modo de realización de este tipo, el polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e (i) SEQ ID NO: 16 o (ii) SEQ ID NO: 24.

En un modo de realización, el polipéptido comprende secuencias de aminoácidos al menos un 99 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 50 y 51 o (ii) SEQ ID NO: 50 y 53. En un modo de realización de este tipo, el polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 50 y 51 o (ii) SEQ ID NO: 50 y 53.

Otro modo de realización de la invención proporciona una proteína específica para KRAS G12D aislada o purificada que comprende (a) una primera cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9-11 y una segunda cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 14; o (b) una primera cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9-11 y una segunda cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20-22. Opcionalmente, la primera cadena polipeptídica comprende además:

(i) X en la posición 48 de SEQ ID NO: 46 es Thr o Cys;

(B) la segunda cadena polipeptídica comprende además la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, en la que X en la posición 57 de SEQ ID NO: 47 es Ser o Cys. En un modo de realización de este tipo, la primera cadena polipeptídica comprende además:

(A) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, en la que:

(i) X en la posición 48 de SEQ ID NO: 46 es Thr o Cys;

(B) la segunda cadena polipeptídica comprende además la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, en la que X en la posición 57 de SEQ ID NO: 47 es Ser o Cys.

En un modo de realización, la proteína comprende (i) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una segunda cadena polipeptídica que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o (ii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una segunda cadena polipeptídica que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. En un modo de realización de este tipo, la proteína comprende (i) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o (ii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

En un modo de realización, (1) la primera cadena polipeptídica comprende una cadena de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de ^sE ^qID NO: 50 y la segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; o (2) la primera cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y la segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53. En un modo de realización de este tipo, (1) la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; o (2) la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.

La invención proporciona además ácidos nucleicos relacionados, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células y composiciones farmacéuticas en relación con los TCR , polipéptidos y proteínas de la invención.

Mediante la invención se proporcionan además procedimientos de detección de la presencia de cáncer en un mamífero.

Breve descripción de varias vistas del/de los dibujo(s)

La figura 1A es un gráfico que muestra la producción de IFN-^y(manchas/células 2e4) como se determina por el ensayo ELISPO T de 24 cultivos de TIL individuales después del cocultivo con células dendríticas autólogas transfectadas con un ARN para minigén en tándem (TMG) irrelevante (círculos coloreados), o la construcción de TMG indicada que codifica las 61 mutaciones identificadas por secuenciación del exoma y transcriptoma completo (TMG-1 (estrellas), TMG-2 (A), TMG-3 (V), TMG-4 (rombo no coloreado), TMG-5 (rombo coloreado)).

La figura 1B es un gráfico que muestra la producción de IFN-^y(manchas/células 2e4) como se determina por el ensayo ELISPO T (eje izquierdo; barras no sombreadas) y análisis por citometría de flujo de la expresión de 4-1BB en linfocitos T CD8+ (%) (eje derecho; barras sombreadas) del cultivo de TIL n.° 6 después del cocultivo con células dendríticas (CD) transfectadas con un ARN para TMG irrelevante o TMG-1, o incubadas durante la noche con los péptidos largos mutados codificados por TMG-1.

La figura 1C es un gráfico que muestra la producción de IFN-^ycomo se determina por el ensayo ELISPO T (eje izquierdo; barras no sombreadas) y análisis por citometría de flujo de la expresión de 4-1BB en linfocitos T CD8+ (%) (eje derecho; barras sombreadas) del producto de infusión (cultivo de TIL n.° 6 después de que se someta a expansión rápida a escala clínica) después del cocultivo con CD transfectadas con el ^aR ⁿpara TMG indicado, o incubadas durante la noche con los péptidos KRAS natural (WT) o KRASG12D de 24 AA de longitud.

Las figuras 2A-2D son gráficos que muestran los resultados de un análisis de secuenciación profunda de TCR-Vp que cuantifica la frecuencia de cada uno de los cuatro clones de linfocitos T reactivos frente a KRASG12D identificados en el producto de infusión (Rx1, barra llena), tres muestras de pulmón metastásicas antes a la transferencia celular (Tu-1, rombo; Tu-2A, cuadrado; y Tu-2B, triángulo), la lesión que progresaba después de la transferencia celular (Tu-Pro, triángulo invertido) y la sangre periférica del paciente antes y en diversos tiempos después de la infusión celular (círculos). Los números entre paréntesis indican la clasificación de la secuencia de TCR en la muestra dada. ® y ND, no detectado (< 0,0002 %). A

(TRAV4/TRBV5-6(A)). B (TRAV12-2/TRBV10-2). C (TRAV4/TRBV5-6(B)). D (TRAV4/TRBV5-6 (C)).

Las figuras 3A-3D son gráficos que muestran la expresión del marcador de activación de linfocitos T 4-1BB en linfocitos T genomanipulados con el TCR que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y 51 (TRAV4/TRBV5-6 (A)) (fig. 3A), SEQ ID NO: 56 y 57 (TRAV12-2/TRBV10-2) (fig. 3B), SEQ ID NO: 54 y 55 (TRAV4/TRBV5-6 (B)) (fig. 3C), o SEQ ID NO: 52 y 53 (TRAV4/TRBV5-6 (C)) (fig. 3D) después del cocultivo durante la noche con PBMC autólogas incubadas con cantidades de valoración de péptido nanómero de KRAS natural (WT) (círculos no coloreados), nanómero de KRAS mutante con G12D (círculos coloreados), decámero de KRAS WT (triángulo no coloreado) o decámero de KRAS mutante KRAS G12D (triángulo coloreado).

Las figuras 4A y 4B son gráficos que muestran la producción de IFN-^y(manchas/células 2e4) (A) y la expresión de 4-1BB (B) de linfocitos T genomanipulados con el TCR indicado después del cocultivo durante la noche con dos líneas de células de cáncer de páncreas positivas para KRASG12D que no expresan (simulación) o expresan el alelo HLA-C*08:02. TCR con TRBV5-6(A) (barras no sombreadas); TCR con TRBV10-02 (barras sombreadas); TCR con TRBV5-6(B) (rayas horizontales); TCR con TRBV5-6(C) (rayas diagonales). MD, MDA-Panc48; HP, HPAC. Los datos de citometría de flujo se seleccionan en células TCR+ específicas para KRASG12D CD8+. ">" mayor que ~ 500 manchas no es exacto.

Las figuras 5A-5D son gráficos que muestran la expresión de 4-1BB (%) de linfocitos T genomanipulados con el TCR indicado después del cocultivo durante la noche con células COS diana transducidas con el gen KRAS natural (wt) (barras no sombreadas) o KRAS-G12D (barra sombreada) de longitud completa y el alelo HLA indicado. TCR con TRBV5-6(A) (fig. 5A); TCR con TRBV10-02 (fig. 5B); TCR con TRBV5-6(B) (fig.

5C); TC R con TRBV5-6(C) (fig. 5D).

Descripción detallada de la invención

El homólogo del oncogén vírico de sarcoma de rata Kirsten (KRAS), también denominado KRas GTPasa, oncogén vírico de sarcoma de rata Kirsten V-Ki-Ras2, o KRAS2, es un miembro de la pequeña superfamilia de GTPasa. Existen dos variantes de transcrito de KRAS: variante A de KRAS y variante B de KRAS. A continuación en el presente documento, las referencias a "KRAS" (mutado o no mutado) hacen referencia tanto a la variante A como a la variante B, a menos que se especifique de otro modo. Sin ceñirse a una teoría o mecanismo particular, se cree que, cuando muta, KRAS puede estar implicado en la transducción de señales de forma temprana en la oncogénesis de muchos cánceres humanos. Una única sustitución aminoacídica puede activar la proteína. Cuando se activa, el KRAS mutado se une a guanosín-5'-trifosfato (GTP) y convierte GTP en guanosín-5'-difosfato (GDP). El producto de proteína de KRAS mutado se puede activar constitutivamente. La proteína KRAS mutada se puede expresar en cualquiera de una variedad de cánceres humanos, tales como, por ejemplo, de páncreas (por ejemplo, carcinoma de páncreas), colorrectal, de pulmón (por ejemplo, adenocarcinoma de pulmón), de endometrio, de ovario (por ejemplo, cáncer de ovario epitelial) y cánceres de próstata.

Un modo de realización de la invención proporciona un TCR aislado o purificado que tiene especificidad antigénica para KRAS humano mutado (a continuación en el presente documento, "KRAS mutado"). A continuación en el presente documento, las referencias a un "TCR" también hacen referencia a porciones funcionales y variantes funcionales del TCR , a menos que se especifique de otro modo. El TCR según la invención puede tener especificidad antigénica para cualquier KRAS (proteína, polipéptido o péptido) con una mutación G12D.

En un modo de realización de la invención, el TCR tiene especificidad antigénica para una proteína KRAS con la mutación G12D, comprendiendo o consistiendo la proteína KRAS en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o 4. La secuencia de aminoácidos de la proteína variante A de KRAS mutada de SEQ ID NO: 3, en general, corresponde a las posiciones 1-189 de la secuencia de aminoácidos de la variante A de la proteína KRAS natural (WT) no mutada de SEQ ID NO: 1 con la excepción de que en SEQ ID NO: 3 la glicina en la posición 12 está sustituida con ácido aspártico. La secuencia de aminoácidos de la proteína variante B de KRAS mutada de SEQ ID NO: 4, en general, corresponde a las posiciones 1-188 de la secuencia de aminoácidos de la variante B de la proteína KRAS W T no mutada de SEQ ID NO: 2 con la excepción de que en SEQ ID NO: 4 la glicina en la posición 12 está sustituida con ácido aspártico.

En un modo de realización de la invención, el TCR tiene especificidad antigénica para un péptido KRAS con la mutación G12D descrita anteriormente, teniendo el péptido KRAS cualquier longitud. Por ejemplo, el TCR puede tener especificidad antigénica para un péptido KRAS con la mutación G12^d, teniendo el péptido KRAS una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 24 residuos de aminoácido, preferentemente de aproximadamente 9 a aproximadamente 11 residuos de aminoácido. En un modo de realización de la invención, el TCR puede tener especificidad antigénica para un péptido KRAS con la mutación G12D, teniendo el péptido KRAS una longitud de aproximadamente 8 residuos de aminoácido, aproximadamente 9 residuos de aminoácido, aproximadamente 10 residuos de aminoácido, aproximadamente 11 residuos de aminoácido, aproximadamente 12 residuos de aminoácido o aproximadamente 24 residuos de aminoácido. Por ejemplo, el TCR puede tener especificidad antigénica para un péptido KRAS^10-18con la mutación G12D, comprendiendo o consistiendo el péptido en la secuencia de aminoácidos de GADGVGKSA (SEQ ID NO: 8). La secuencia de aminoácidos del péptido KRAS mutado de SEQ ID NO: 8 con la mutación G12D, en general, corresponde a las posiciones 1-9 de la secuencia de aminoácidos del péptido KRAS^10-18WT no mutado de SEQ ID NO: 7 con la excepción de que en SEQ ID NO: 8 la glicina en la posición 3 está sustituida con ácido aspártico.

Todavía en otro modo de realización de la invención, el TCR puede tener especificidad antigénica para un péptido KRAS con la mutación G12D, comprendiendo o consistiendo el péptido KRAS mutado en la secuencia de aminoácidos de GADGVGKSA (SEQ ID NO: 8 de KRAS ^10-18mutado) o GADGVGKSAL (KRAS ^10-19mutado; SEQ ID NO: 6). En un modo de realización ejemplar, el TCR tiene especificidad antigénica para un epítopo de KRAS mutado, comprendiendo o consistiendo el epítopo de KRAS mutado en la secuencia de aminoácidos de GADGVGKSA (KRAS ^10-18mutado; SEQ ID NO: 8) o GADGVGKSAL (KRAS ^10-19mutado; SEQ ID NO: 6).

En un modo de realización de la invención, los TCR según la invención pueden reconocer KRAS mutado dentro del contexto de una molécula HLA-Cw8. A este respecto, el TCR puede provocar una respuesta inmunitaria tras unirse a KRAS mutado en el contexto de una molécula HLA-Cw8. Los TCR según la invención pueden reconocer KRAS mutado que se presente por una molécula HLA-Cw8 y se pueden unir a la molécula HLA-Cw8 además de a KRAS mutado. Las moléculas HLA-Cw8 ejemplares, en el contexto de las que los TCR según la invención reconocen KRAS mutado, incluyen las codificadas por los alelos HLA-Cw*0801, HLA-Cw*0802, HLA-Cw*0803, HLA-Cw*0804, HLA-Cw*0805, HLA-Cw*0806, HLA-Cw*0807, HLA-Cw*0808 y HLA-Cw*0809. En un modo de realización preferente, los TCR reconocen KRAS mutado dentro del contexto de una molécula HLA-Cw*0802.

En un modo de realización de la divulgación, además de tener la capacidad de reconocer KRAS mutado dentro del contexto de una molécula HLA-Cw8, uno de los TCR divulgados (TRAV12-2/TRBV10-2 (tabla 5)) también puede reconocer KRAS mutado en el contexto de una molécula HLA-Cw5. A este respecto, el TCR puede provocar una respuesta inmunitaria tras unirse a KRAS mutado en el contexto de una molécula HLA-Cw5. El TCR divulgado puede reconocer KRAS mutado que se presente por una molécula HLA-Cw5 y se puede unir a la molécula HLA-Cw5 además de a KRAS mutado. Las moléculas HLA-Cw5 ejemplares, en el contexto de las que los TCR divulgados reconocen KRAS mutado, incluyen las codificadas por los alelos HLA-Cw*0501, HLA-Cw*0502, HLA-Cw*0503, HLA-Cw*0504, HLA-Cw*0505, HLA-Cw*0506, HLA- HLA-Cw*0508, HLA-Cw*0509 y HLA-Cw*0510. En un modo de realización preferente, el TCR reconoce KRAS mutado dentro del contexto de una molécula HLA-Cw*0501. Las secuencias de aminoácidos de HLA-Cw*0802 y HLA-Cw*0501 difieren entre sí en solo dos residuos de aminoácido. Sin ceñirse a una teoría o mecanismo particular, se cree que TCR con TRAV12-2/TRBV10-2 también puede reconocer KRAS mutado que se presente por otras moléculas HLA que sean similares a una o ambas de HLA-Cw*0802 y HLA-Cw*0501.

Los TCR de la invención proporcionan muchas ventajas, incluyendo cuando se expresan por células usadas para la transferencia celular adoptiva. Se expresa KRAS mutado por células cancerosas y no se expresa por células normales no cancerosas. Sin ceñirse a una teoría o mecanismo particular, se cree que los TCR según la invención de forma ventajosa seleccionan como diana la destrucción de células cancerosas mientras minimizan o eliminan la destrucción de células normales no cancerosas, reduciendo, de este modo, por ejemplo, minimizando o eliminando, la toxicidad. Además, de forma ventajosa, los TCR según la invención pueden tratar o prevenir con éxito cánceres positivos para KRAS mutado que no responden a otros tipos de tratamiento, tales como, por ejemplo, quimioterapia, cirugía o radiación. Además, los TCR según la invención pueden proporcionar un reconocimiento altamente ávido de KRAS mutado, lo que puede proporcionar la capacidad de reconocer células tumorales no manipuladas (por ejemplo, células tumorales que no se han tratado con interferón (IFN)-^y, transfectadas con un vector que codifica uno o ambos de KRAS mutado y HLA-Cw*0802, pulsadas con un péptido KRAS con la mutación G12D, o una combinación de los mismos). Además, el alelo HLA-Cw*0802 se expresa en hasta aproximadamente un 8 % y aproximadamente un 11 % de las etnias de raza blanca americanas y afroamericanas, respectivamente. En consecuencia, los TCR según la invención pueden incrementar el número de pacientes con cáncer aptos para recibir inmunoterapia para incluir aquellos pacientes que expresan el alelo HLA-Cw*0802 que pueden no ser aptos para recibir inmunoterapia usando TCR que reconocen el antígeno en el contexto de otras moléculas de MHC.

Por la frase "especificidad antigénica", como se usa en el presente documento, se entiende que el TCR se puede unir específicamente y reconocer inmunológicamente a KRAS mutado con alta avidez. Por ejemplo, se puede considerar que un TCR tiene "especificidad antigénica" para KRAS mutado si de aproximadamente 1 x 10⁴a aproximadamente 1 x 10⁵linfocitos T que expresan el TCR secretan al menos aproximadamente 200 pg/ml o más (por ejemplo, 200 pg/ml o más, 300 pg/ml o más, 400 pg/ml o más, 500 pg/ml o más, 600 pg/ml o más, 700 pg/ml o más, 1000 pg/ml o más, 5000 pg/ml o más, 7000 pg/ml o más, 10.000 pg/ml o más, 20.000 pg/ml o más o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores) de IFN-^ytras el cocultivo con (a) células diana HLA-Cw*0802⁺negativas para antígeno pulsadas con una concentración baja de péptido KRAS mutado (por ejemplo, de aproximadamente 0,5 ng/ml a aproximadamente 10 ng/ml, 1 ng/ml, 2 ng/ml, 5 ng/ml, 8 ng/ml, 10 ng/ml o un intervalo definido por dos cualquiera de los valores anteriores) o (b) células diana HLA-Cw*0802⁺negativas para antígeno en las que se ha introducido una secuencia de nucleótidos que codifica KRAS mutado de modo que la célula diana exprese KRAS mutado. Las células que expresan los TCR según la invención también pueden secretar IFN-y tras el cocultivo con células diana HLA-Cw*0802+ negativas para antígeno pulsadas con mayores concentraciones de péptido KRAS mutado.

De forma alternativa o adicionalmente, se puede considerar que un TCR tiene "especificidad antigénica" para KRAS mutado si los linfocitos T que expresan el TCR secretan al menos el doble de iFN-y tras el cocultivo con (a) células diana HLA-Cw*0802+ negativas para antígeno pulsadas con una concentración baja de péptido KRAS mutado o (b) células diana HLA-Cw*0802+ negativas para antígeno en las que se ha introducido una secuencia de nucleótidos que codifica KRAS mutado de modo que la célula diana exprese KRAS mutado en comparación con la cantidad de IFN-^yexpresado por un control negativo. El control negativo pueden ser, por ejemplo, (i) linfocitos T que expresan el TCR , cocultivados con (a) células diana HLA-Cw*0802+ negativas para antígeno pulsadas con la misma concentración de un péptido irrelevante (por ejemplo, algún otro péptido con una secuencia diferente del péptido KRAS mutado) o (b) células diana HLA-Cw*0802+ negativas para antígeno en las que se ha introducido una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido irrelevante de modo que la célula diana exprese el péptido irrelevante, o (ii) linfocitos T no transducidos (por ejemplo, derivados de PBMC, que no expresan el TCR) cocultivados con (a) células diana HLA-Cw*0802+ negativas para antígeno pulsadas con la misma concentración de péptido KRAS mutado o (b) células diana HLA-Cw*0802+ negativas para antígeno en las que se ha introducido una secuencia de nucleótidos que codifica KRAS mutado de modo que la célula diana exprese KRAS mutado. La secreción de IFN-^yse puede medir por procedimientos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA).

De forma alternativa o adicionalmente, se puede considerar que un TCR tiene "especificidad antigénica" para KRAS mutado si al menos el doble de los números de linfocitos T que expresan el TCR secretan IFN-^ytras el cocultivo con (a) células diana HLA-Cw*0802+ negativas para antígeno pulsadas con una concentración baja de péptido KRAS mutado o (b) células diana HLA-Cw*0802+ negativas para antígeno en las que se ha introducido una secuencia de nucleótidos que codifica KRAS mutado de modo que la célula diana exprese KRAS mutado en comparación con los números de linfocitos T de control negativo que secretan IFN-^y. La concentración de péptido y control negativo pueden ser como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. El número de células que secretan IFN-^yse puede medir por procedimientos conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, ELISPO T.

De forma alternativa o adicionalmente, se puede considerar que un TCR tiene "especificidad antigénica" para KRAS mutado si los linfocitos T que expresan el TCR regulan por incremento la expresión de uno o más marcadores de activación de linfocitos T como se mide, por ejemplo, por citometría de flujo después de la estimulación con células diana que expresan KRAS mutado. Los ejemplos de marcadores de activación de linfocitos T incluyen 4-1BB, OX40, CD107a, CD69 y citocinas que se regulan por incremento tras la estimulación antigénica (por ejemplo, factor de necrosis tumoral (TNF), interleucina (IL)-2, etc.).

La invención proporciona un TCR que comprende dos polipéptidos (es decir, cadenas polipeptídicas), tales como una cadena alfa (a) de un TCR , una cadena beta (p) de un TCR , una cadena gamma (y ) de un TCR , una cadena delta (5) de un TCR , o una combinación de los mismos. Los polipéptidos del TCR según la invención pueden comprender cualquier secuencia de aminoácidos, siempre que el TCR tenga especificidad antigénica para KRAS mutado.

En un modo de realización de la invención, el TCR comprende dos cadenas polipeptídicas, comprendiendo cada una una región variable que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR)1, una CDR2 y una CDR3 de un TCR . En un modo de realización de la invención, el TCR comprende una primera cadena polipeptídica que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (CDR1 de la cadena a), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (CDR2 de la cadena a), y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (CDR3 de la cadena a), y una segunda cadena polipeptídica que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (CDR1 de la cadena p), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 (CDR2 de la cadena p), y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 (CDR3 de la cadena p).

En otro modo de realización de la invención, el TCR comprende una primera cadena polipeptídica que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (CDR1 de la cadena a), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (CDR2 de la cadena a), y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (CDR3 de la cadena a), y una segunda cadena polipeptídica que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 (CDR1 de la cadena p), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 (CDR2 de la cadena p), y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (CDR3 de la cadena p).

En un modo de realización de la divulgación, el TCR comprende una primera cadena polipeptídica que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (CDR1 de la cadena a), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 (CDR2 de la cadena a), y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 (CDR3 de la cadena a), y una segunda cadena polipeptídica que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28 (CDR1 de la cadena p), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 (CDR2 de la cadena p), y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 (CDR3 de la cadena p).

En otro modo de realización de la divulgación, el TCR comprende una primera cadena polipeptídica que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 (CDR1 de la cadena a), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 (CDR2 de la cadena a), y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 (CDR3 de la cadena a), y una segunda cadena polipeptídica que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 (CDR1 de la cadena p), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 (CDR2 de la cadena p), y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 (CDR3 de la cadena p).

A este respecto, el TCR según la invención comprende las secuencias de aminoácidos de: (a) todas las SEQ ID NO: 9-14; o (b) todas las SEQ ID NO: 9-11 y SEQ ID NO: 20-22.

En un modo de realización de la invención, el TCR comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable de un TCR que comprende las CDR expuestas anteriormente. A este respecto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de: SEQ ID NO: 15 (región variable de la cadena a); SEQ ID NO: 16 (región variable de la cadena p); SEQ ID NO: 24 (región variable de la cadena p); ambas SEQ ID NO: 15 y 16; o ambas SEQ ID NO: 15 y 24. Preferentemente, el TCR según la invención comprende las secuencias de aminoácidos de (i) ambas SEQ ID NO: 15-16; o (ii) ambas SEQ ID NO: 15 y 24.

Los TCR según la invención pueden comprender además una región constante de la cadena a y una región constante de la cadena p. La región constante se puede derivar de cualquier especie adecuada, tal como, por ejemplo, ser humano o ratón. En un modo de realización de la invención, los TCR comprenden además una región constante de la cadena a y p murina o región constante de la cadena a y p humana. Como se usa en el presente documento, por el término "murino" o "humano", cuando se refiere a un TCR o cualquier componente de un TCR descrito en el presente documento (por ejemplo, región determinante de la complementariedad (CDR), región variable, región constante, cadena a y/o cadena p), se entiende un TCR (o un componente del mismo) que se deriva de un ratón o un ser humano, respectivamente, es decir, un TCR (o componente del mismo) que se originó a partir de o se expresó, en un momento, por un linfocito T de ratón o un linfocito T humano, respectivamente.

En un modo de realización de la invención, los TCR comprenden además regiones constantes de la cadena a y p humanas. A este respecto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, en la que X en la posición 1 es cualquier residuo de aminoácido natural (la región constante de una cadena a humana), SEQ ID NO: 42 (la región constante de una cadena p humana), SEQ ID NO: 43 (la región constante de una cadena p humana), ambas SEQ ID NO: 41 y 42, o ambas SEQ ID NO: 41 y 43. En un modo de realización de la invención, el TCR comprende cualquiera de las regiones constantes humanas descritas en el presente documento en combinación con cualquiera de las regiones CDR descritas en el presente documento. A este respecto, el TCR según la invención puede comprender las secuencias de aminoácidos de: (a) todas las SEQ ID NO: 9-14, 41 y 42; (b) todas las SEQ ID NO: 9-11, 20-22, 41 y 42; (c) todas las SEQ ID NO: 9-14, 41 y 43; o (d) todas las SEQ ID NO: 9-11, 20-22, 41 y 43. En un modo de realización de la invención, el TCR comprende cualquiera de las regiones constantes humanas descritas en el presente documento en combinación con cualquiera de las regiones variables descritas en el presente documento. A este respecto, el TCR puede comprender las secuencias de aminoácidos de: (i) todas las SEQ ID NO: 15-16, 41 y 42; (ii) todas las SEQ ID NO: 15, 24, 41 y 42; (iii) todas las SEQ ID NO: 15-16, 41 y 43; o (vi) todas las SEQ ID NO: 15, 24, 41 y 43.

Un modo de realización de la invención proporciona un TCR quimérico que comprende una región variable humana y una región constante murina, en el que el TCR tiene especificidad antigénica para KRAS mutado presentado en el contexto de una molécula HLA-Cw8. La región constante murina puede proporcionar una cualquiera o más ventajas. Por ejemplo, la región constante murina puede disminuir el emparejamiento erróneo del TCR según la invención con los TCR endógenos de la célula huésped en la que se introduce el TCR según la invención. De forma alternativa o adicionalmente, la región constante murina puede incrementar la expresión del TCR según la invención en comparación con el mismo TCR con una región constante humana. El TCR quimérico puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 (región constante de la cadena a murina natural (WT)), SEQ ID NO: 45 (región constante de la cadena p murina WT), o ambas SEQ ID NO: 44 y 45. Preferentemente, el TCR según la invención comprende las secuencias de aminoácidos de ambas SEQ ID NO: 44 y 45. El TCR quimérico puede comprender cualquiera de las regiones constantes murinas descritas en el presente documento en combinación con cualquiera de las regiones CDR descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. A este respecto, el TCR puede comprender las secuencias de aminoácidos de: (a) todas las SEQ ID NO: 9-14, 44 y 45; o (b) todas las SEQ Id NO: 9-14, 2022, 44 y 45. En otro modo de realización de la invención, el TCR quimérico puede comprender cualquiera de las regiones constantes murinas descritas en el presente documento en combinación con cualquiera de las regiones variables descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. A este respecto, el TCR puede comprender las secuencias de aminoácidos de: (i) SEQ ID NO: 15-16, 44 y 45; o (ii) SEQ ID NO: 15, 24, 44 y 45.

En un modo de realización de la invención, el TCR comprende una región constante sustituida. A este respecto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los TCR descritos en el presente documento con una, dos, tres o cuatro sustituciones aminoacídicas en la región constante de una o ambas de la cadena a y p. Preferentemente, el TCR comprende una región constante murina con una, dos, tres o cuatro sustituciones aminoacídicas en la región constante murina de una o ambas de las cadenas a y p. En un modo de realización especialmente preferente, el TCR comprende una región constante murina con una, dos, tres o cuatro sustituciones aminoacídicas en la región constante murina de la cadena a y una sustitución aminoacídica en la región constante murina de la cadena p. En algunos modos de realización, los TCR que comprenden la región constante sustituida proporcionan de forma ventajosa uno o más de reconocimiento incrementado de dianas de KRAS+ mutado, expresión incrementada por una célula huésped, emparejamiento erróneo disminuido con TCR endógenos y actividad antitumoral incrementada en comparación con el ^tC ^roriginal que comprende una región constante no sustituida (natural). En general, las secuencias de aminoácidos sustituidas de las regiones constantes murinas de las cadenas a y p de TCR , SEQ ID NO: 46 y 47, respectivamente, se corresponden con todas o porciones de las secuencias de aminoácidos de las regiones constantes murinas no sustituidas SEQ ID NO: 44 y 45, respectivamente, teniendo SEQ ID NO: 46 una, dos, tres o cuatro sustituciones aminoacídicas en comparación con SEQ ID NO: 44 y SEQ ID NO: 47, que tienen una sustitución aminoacídica en comparación con SEQ ID NO: 45. A este respecto, un modo de realización de la invención proporciona un TCR que comprende las secuencias de aminoácidos de (a) SEQ ID NO: 46 (región constante de la cadena a), en la que (i) X en la posición 48 es Thr o Cys; (ii) X en la posición 112 es Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; (iii) X en la posición 114 es Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe o Trp; e (iv) X en la posición 115 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; y (b) SEQ ID NO: 47 (región constante de la cadena p), en la que X en la posición 57 es Ser o Cys. En un modo de realización de la invención, el TCR que comprende SEQ ID NO: 46 no comprende SEQ ID NO: 44 (región constante murina no sustituida de la cadena a). En un modo de realización de la invención, el TCR que comprende SEQ ID NO: 47 no comprende SEQ ID NO: 45 (región constante murina no sustituida de la cadena p).

En un modo de realización de la invención, la región constante sustituida incluye sustituciones con cisteína en la región constante de una o ambas de las cadenas a y p para proporcionar un TCR sustituido con cisteína. Las cisteínas opuestas en las cadenas a y p proporcionan un enlace disulfuro que enlaza entre sí las regiones constantes de las cadenas a y p de TCR sustituido y que no está presente en un TCR que comprende las regiones constantes murinas no sustituidas. A este respecto, el TCR puede ser un TCR sustituido con cisteína en el que una o ambas de la Thr natural en la posición 48 (Thr48) de SEQ ID NO: 44 y la Ser natural en la posición 57 (Ser57) de SEQ ID NO: 45 se pueda sustituir con Cys. Preferentemente, tanto la Thr48 natural de SEQ ID NO: 44 como la Ser57 natural de SEQ ID NO: 45 están sustituidas con Cys. En un modo de realización, el TCR sustituido con cisteína comprende una región constante de la cadena a que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, en la que X en la posición 48 es Cys, X en la posición 112 es la Ser natural, X en la posición 114 es la Met natural y X en la posición 115 es la Gly natural, y una región constante de la cadena p que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, en la que X en la posición 57 es Cys. Los TCR sustituidos con cisteína de la invención pueden incluir la región constante sustituida además de cualquiera de las CDR o regiones variables descritas en el presente documento.

En un modo de realización de la invención, la secuencia de aminoácidos sustituida incluye sustituciones de uno, dos o tres aminoácidos en el dominio transmembranario (TM) de la región constante de una o ambas de las cadenas a y p con un aminoácido hidrófobo para proporcionar un TCR sustituido con aminoácido hidrófobo. La(s) sustitución/sustituciones aminoacídica(s) hidrófoba(s) en el dominio TM del TCR puede(n) incrementar la hidrofobia del dominio TM del TCR en comparación con un TCR que carezca de la(s) sustitución/sustituciones aminoacídica(s) hidrófoba(s) en el dominio TM. A este respecto, el TCR es un TCR sustituido con aminoácido hidrófobo en el que una, dos o tres de las Ser112, Met114 y Gly115 naturales de SEQ ID NO: 44 se pueden sustituir independientemente con Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; preferentemente con Leu, Ile o Val. Preferentemente, las tres Ser112, Met114 y Gly115 naturales de SEQ ID NO: 44 se pueden sustituir independientemente con Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; preferentemente con Leu, Ile o Val. En un modo de realización, el TCR sustituido con aminoácido hidrófobo comprende una región constante de la cadena a que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, en la que X en la posición 48 es la Thr natural, X en la posición 112 es Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, X en la posición 114 es Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe o Trp, y X en la posición 115 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, y una región constante de la cadena p que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, en la que X en la posición 57 es la Ser natural, en el que el TCR sustituido con aminoácido hidrófobo comprende la SEQ ID NO: 46 y no comprende la SEQ ID NO: 44 (región constante murina no sustituida de la cadena a). En un modo de realización preferente, el TCR sustituido con aminoácido hidrófobo comprende una región constante de la cadena a que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, en la que X en la posición 48 es la Thr natural, X en la posición 112 es Leu, X en la posición 114 es Ile, y X en la posición 115 es Val, y una región constante de la cadena p que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, en la que X en la posición 57 es la Ser natural. Los TCR sustituidos con aminoácido hidrófobo de la invención pueden incluir la región constante sustituida además de cualquiera de las CDR o regiones variables descritas en el presente documento.

En un modo de realización de la invención, la secuencia de aminoácidos sustituida incluye las sustituciones con cisteína en la región constante de una o ambas de las cadenas a y p en combinación con la(s) sustitución/sustituciones de uno, dos o tres aminoácidos en el dominio transmembranario (TM) de la región constante de una o ambas de las cadenas a y p con un aminoácido hidrófobo (también denominado en el presente documento "TCR sustituido con aminoácido hidrófobo y sustituido con cisteína"). A este respecto, el TCR es un TCR sustituido con aminoácido hidrófobo y sustituido con cisteína en el que la Thr48 natural de SEQ ID NO: 46 está sustituida con Cys; una, dos o tres de las Ser112, Met114 y Gly115 naturales de SEQ ID NO: 46 están sustituidas independientemente con Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; preferentemente con Leu, Ile o Val; y la Ser57 natural de SEQ ID NO: 47 está sustituida con Cys. Preferentemente, las tres Ser112, Met114 y Gly115 naturales de SEQ ID NO: 46 se pueden sustituir independientemente con Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; preferentemente con Leu, Ile o Val. En un modo de realización, el TCR sustituido con aminoácido hidrófobo y sustituido con cisteína comprende una cadena a que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, en la que X en la posición 48 es Cys, X en la posición 112 es Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, X en la posición 114 es Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe o Trp, y X en la posición 115 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, y una cadena p que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, en la que X en la posición 57 es Cys, en el que la SEQ ID NO: 46 no comprende la SEQ ID NO: 44 (cadena a no sustituida) y la SEQ ID NO: 47 no comprende la SEQ ID NO: 45 (cadena p no sustituida). Preferentemente, el TCR sustituido con aminoácido hidrófobo y sustituido con cisteína comprende una cadena a que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, en la que X en la posición 48 es Cys, X en la posición 112 es Leu, X en la posición 114 es Ile, X en la posición 115 es Val, y una cadena p que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, en la que X en la posición 57 es Cys. A este respecto, el TCR sustituido con aminoácido hidrófobo y sustituido con cisteína comprende una región constante de la cadena a que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 48 y una región constante de la cadena p que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49. Los TCR sustituidos con aminoácido hidrófobo y sustituidos con cisteína de la invención pueden incluir la región constante sustituida además de cualquiera de las CDR o regiones variables descritas en el presente documento.

En un modo de realización de la invención, el TCR sustituido con aminoácido hidrófobo y sustituido con cisteína según la invención puede comprender una cadena a de un TCR y una cadena p de un TCR . Cada una de la cadena a y cadena p de TCR según la invención puede comprender independientemente cualquier secuencia de aminoácidos. A este respecto, la cadena a de TCR según la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. Una cadena a de este tipo se puede emparejar con cualquier cadena p de un TCR . A este respecto, la cadena p de TCR según la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 o 53. El TCR según la invención, por lo tanto, puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, ambas SEQ ID NO: 50 y 51, o ambas SEQ ID NO: 51 y 53. Preferentemente, el TCR según la invención comprende las secuencias de aminoácidos de (1) ambas SEQ ID NO: 50-51; o (2) ambas SEQ ID NO: 51 y 53.

La divulgación también proporciona un polipéptido que comprende una porción funcional de cualquiera de los TCR descritos en el presente documento. El término "polipéptido", como se usa en el presente documento, incluye oligopéptidos y se refiere a una única cadena de aminoácidos conectados por uno o más enlaces peptídicos.

Con respecto a los polipéptidos divulgados, la porción funcional puede ser cualquier porción que comprenda aminoácidos contiguos del TCR del que es una parte, siempre que la porción funcional se una específicamente a KRAS mutado. El término "porción funcional" cuando se usa en referencia a un TCR se refiere a cualquier parte o fragmento del TCR de la invención, en la que dicha parte o fragmento retiene la actividad biológica del TCR del que es una parte (el TCR original). Las porciones funcionales engloban, por ejemplo, las partes de un TCR que retienen la capacidad de unirse específicamente a KRAS mutado (por ejemplo, dentro del contexto de una molécula HLA-Cw*0802), o detectar, tratar o prevenir el cáncer, en un grado similar, en el mismo grado, o en mayor grado, que el TCR original. En referencia al TCR original, la porción funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente un 10 %, 25 %, 30 %, 50 %, 68 %, 80 %, 90 %, 95 % o más del TCR original.

La porción funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amínico o carboxílico de la porción, o en ambos extremos, no encontrándose dichos aminoácidos adicionales en la secuencia de aminoácidos del TCR original. Deseablemente, los aminoácidos adicionales no interfieren en la función biológica de la porción funcional, por ejemplo, se unen específicamente a KRAS mutado; y/o tienen la capacidad de detectar el cáncer, tratar o prevenir el cáncer, etc. Más deseablemente, los aminoácidos adicionales potencian la actividad biológica en comparación con la actividad biológica del TCR original.

El polipéptido puede comprender una porción funcional de una o ambas de las cadenas a y p de los TCR de la invención, tal como una porción funcional que comprende una o más de las CDR1, CDR2 y CDR3 de la(s) región/regiones variable(s) de la cadena a y/o cadena p de un TCR de la invención. En un modo de realización de la invención, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (CDR1 de la cadena a), SEQ ID NO: 10 (CDR2 de la cadena a), SEQ ID NO: 11 (CDR3 de la cadena a), SEQ ID NO: 12 (CDR1 de la cadena p), SEQ ID NO: 13 (CDR2 de la cadena p) y SEQ ID NO: 14 (CDR3 de la cadena p). En otro modo de realización de la invención, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (CDR1 de la cadena a), SEQ ID NO: 10 (CDR2 de la cadena a), SEQ ID NO: 11 (CDR3 de la cadena a), SEQ ID NO: 20 (CDR1 de la cadena p), SEQ ID n O: 21 (CDR2 de la cadena p) y SEQ ID No : 22 (CDR3 de la cadena p). En un modo de realización de la divulgación, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 (CDR1 de la cadena a), SEQ ID NO: 26 (CDR2 de la cadena a), SEQ ID NO: 27 (CDR3 de la cadena a), SEQ ID NO: 28 (CDR1 de la cadena p), SEQ ID NO: 29 (CDR2 de la cadena p), SEQ ID NO: 30 (CDR3 de la cadena p) o una combinación de los mismos. En otro modo de realización de la divulgación, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 (CDR1 de la cadena a), SEQ ID NO: 34 (CDR2 de la cadena a), SEQ ID NO: 35 (CDR3 de la cadena a), SEQ ID NO: 36 (CDR1 de la cadena p), SEQ ID NO: 37 (CDR2 de la cadena p), SEQ ID NO: 38 (CDR3 de la cadena p) o una combinación de los mismos. El polipéptido según la invención comprende las secuencias de aminoácidos de (a) ambas SEQ ID NO: 9-14; o (b) ambas SEQ ID NO: 9 11 y 10-22.

En un modo de realización de la invención, el polipéptido según la invención puede comprender, por ejemplo, la región variable del TCR según la invención que comprende una combinación de las regiones CDR expuestas anteriormente. A este respecto, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 (región variable de la cadena a), SEQ ⁱD NO: 16 (región variable de la cadena p), ambas SEQ ID NO: 15 y 16, SEQ ID NO: 24 (región variable de la cadena p), o ambas SEQ ID NO: 15 y 24. Preferentemente, el polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos de (i) ambas SEQ ID NO: 15 y 16 o (ii) ambas SEQ ID NO: 15 y 24.

En un modo de realización de la invención, el polipéptido según la invención puede comprender además la región constante del TCR según la invención expuesta anteriormente. A este respecto, el polipéptido puede comprender además la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 (región constante humana de la cadena a), SEQ ID NO: 42 (región constante humana de la cadena p), SEQ ID NO: 43 (región constante humana de la cadena p), SEQ ID NO: 44 (región constante murina WT de la cadena a), SEQ ID NO: 45 (región constante murina WT de la cadena p), SEQ ID NO: 46 (región constante murina sustituida de la cadena a), SEQ ID NO: 47 (región constante murina sustituida de la cadena p), SEQ ID NO: 48 (región constante murina sustituida con aminoácido hidrófobo y sustituida con cisteína de la cadena a), SEQ ID NO: 49 (región constante murina sustituida con aminoácido hidrófobo y sustituida con cisteína de la cadena a), ambas SEQ ID NO: 44 y 45, ambas SEQ ID NO: 46 y 47, o ambas SEQ ID NO: 48 y 49, ambas SEQ ID NO: 41 y 42, o ambas SEQ ID NO: 41 y 43. Preferentemente, el polipéptido comprende además las secuencias de aminoácidos de (i) ambas SEQ ID NO: 44 y 45, (ii) ambas SEQ ID NO: 46 y 47, (iii) ambas SEQ ID NO: 48 y 49, (iv) ambas SEQ ID NO: 41 y 42 o (v) ambas SEQ ID NO: 41 y 43 en combinación con cualquiera de las regiones CDR o regiones variables descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención.

En un modo de realización de la invención, el polipéptido según la invención puede comprender la longitud completa de una cadena a o p de TCR descrito en el presente documento. A este respecto, el polipéptido según la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 53. De forma alternativa, el polipéptido de la invención puede comprender ambas cadenas de los TCR descritos en el presente documento. Por ejemplo, el polipéptido de la invención puede comprender ambas secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y 51, o ambas s E q ID NO: 50 y 53. Preferentemente, el polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos de (1) ambas SEQ ID NO: 50-51; o (2) ambas SEQ ID NO: 50 y 53.

La invención proporciona además una proteína que comprende al menos uno de los polipéptidos descritos en el presente documento. Por "proteína" se entiende una molécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas.

En un modo de realización, la proteína de la invención puede comprender (a) una primera cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9-11 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12-14; o (b) una primera cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9-11 y una segunda cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20-22.

En otro modo de realización de la invención, la proteína puede comprender (i) una primera cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una segunda cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; o (ii) una primera cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una segunda cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

La proteína según la invención puede comprender además cualquiera de las regiones constantes descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. A este respecto, en un modo de realización de la invención, la primera cadena polipeptídica puede comprender además la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, en la que: (i) X en la posición 48 de SEQ ID NO: 46 es Thr o Cys; (ii) X en la posición 112 de SEQ ID NO: 46 es Ser, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; (iii) X en la posición 114 de SEQ ID No : 46 es Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe o Trp; e (iv) X en la posición 115 de SEQ ID ⁿO: 46 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; y (B) la segunda cadena polipeptídica puede comprender además la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, en la que X en la posición 57 de SEQ ID NO: 47 es Ser o Cys. En otro modo de realización de la invención, la primera cadena polipeptídica puede comprender además la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 (región constante de la cadena a humana), SEQ ID NO: 44 (región constante WT de la cadena a murina) o SEQ ID NO: 48 (región constante murina sustituida con aminoácido hidrófobo y sustituida con cisteína de la cadena a), y la segunda cadena polipeptídica puede comprender además la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 (región constante de la cadena p humana), SEQ ID NO: 43 (región constante de la cadena p humana), SEQ ID NO: 45 (región constante WT de la cadena p murina) o SEQ ID NO: 49 (región constante murina sustituida con aminoácido hidrófobo y sustituida con cisteína de la cadena p).

De forma alternativa o adicionalmente, la proteína de la invención puede comprender (1) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; o (2) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53. En este caso, la proteína de la invención puede ser un t C r . De forma alternativa, si, por ejemplo, la proteína comprende una única cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de ambas SEQ ID NO: 50 y 51, o ambas SEQ ID NO: 5o y 53, o si la primera y/o segunda cadena(s) polipeptídica(s) de la proteína comprende(n) además otras secuencias de aminoácidos, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que codifica una inmunoglobulina o una porción de la misma, entonces la proteína según la invención puede ser una proteína de fusión. A este respecto, la invención también proporciona una proteína de fusión que comprende al menos uno de los polipéptidos según la invención descritos en el presente documento junto con al menos otro polipéptido. El otro polipéptido puede existir como un polipéptido separado de la proteína de fusión, o puede existir como un polipéptido que se expresa en marco (en tándem) con uno de los polipéptidos según la invención descritos en el presente documento. El otro polipéptido puede codificar cualquier molécula peptídica o proteínica, o una porción de la misma, incluyendo, pero sin limitarse a, una inmunoglobulina, CD3, CD4, C d 8, una molécula de Mh C, una molécula de CD1, por ejemplo, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, etc.

La proteína de fusión puede comprender una o más copias del polipéptido según la invención y/o una o más copias del otro polipéptido. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender 1,2, 3, 4, 5 o más copias del polipéptido según la invención y/o del otro polipéptido. Los procedimientos adecuados para producir proteínas de fusión son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, procedimientos recombinantes.

En algunos modos de realización de la invención, los TCR , polipéptidos y proteínas de la invención se pueden expresar como una única proteína que comprende un péptido conector que enlaza la cadena a y la cadena p. A este respecto, los TCR , polipéptidos y proteínas de la invención pueden comprender además un péptido conector. El péptido conector puede facilitar, de forma ventajosa, la expresión de un TCR , polipéptido y/o proteína recombinante en una célula huésped. El péptido conector puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos adecuada. Por ejemplo, el péptido conector puede comprender la SEQ ID NO: 58. Tras la expresión de la construcción que incluye el péptido conector por una célula huésped, el péptido conector se puede escindir, dando como resultado cadenas a y p separadas. En un modo de realización de la invención, el TCR, polipéptido o proteína puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende una cadena a de longitud completa, una cadena p de longitud completa y un péptido conector situado entre las cadenas a y p.

La proteína de la invención puede ser un anticuerpo recombinante, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprenda al menos uno de los polipéptidos según la invención descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, "anticuerpo recombinante" se refiere a una proteína recombinante (por ejemplo, genomanipulada) que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención y una cadena polipeptídica de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo. El polipéptido de un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, puede ser una cadena pesada, una cadena ligera, una región variable o constante de una cadena pesada o ligera, un fragmento variable monocatenario (scFv) o un fragmento Fc, Fab o F(ab)2' de un anticuerpo, etc. La cadena polipeptídica de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno de la misma, puede existir como un polipéptido separado del anticuerpo recombinante. De forma alternativa, la cadena polipeptídica de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede existir como un polipéptido que se exprese en marco (en tándem) con el polipéptido de la invención. El polipéptido de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede ser un polipéptido de cualquier anticuerpo o cualquier fragmento de anticuerpo, incluyendo cualquiera de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo descritos en el presente documento.

En el alcance de la invención están incluidas las variantes funcionales de los TCR , polipéptidos o proteínas según la invención descritos en el presente documento. El término "variante funcional", como se usa en el presente documento, se refiere a un TCR , polipéptido o proteína que tiene similitud o identidad de secuencia sustancial o significativa con un TCR , polipéptido o proteína original y comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9-11 e (i) SEQ ID NO: 12-14 o (ii) SEQ ID NO: 20-22, cuya variante funcional retiene la actividad biológica del TCR , polipéptido o proteína del que es una variante. Las variantes funcionales engloban, por ejemplo, las variantes del TCR , polipéptido o proteína descrito en el presente documento (el TCR , polipéptido o proteína original) que retienen la capacidad de unirse específicamente a KRAS mutado para el que el TCR original tiene especificidad antigénica o para el que el polipéptido o proteína original se une específicamente, en un grado similar, en el mismo grado, o en mayor grado, que el TCR , polipéptido o proteína original. En referencia al TCR , polipéptido o proteína original, la variante funcional, por ejemplo, puede ser al menos aproximadamente un 30 %, 50 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más idéntica en secuencia de aminoácidos al TCR, polipéptido o proteína original, respectivamente.

La variante funcional, por ejemplo, puede comprender la secuencia de aminoácidos del TCR , polipéptido o proteína original con al menos una sustitución aminoacídica conservadora. Las sustituciones aminoacídicas conservadoras son conocidas en la técnica e incluyen sustituciones aminoacídicas en las que un aminoácido que tiene determinadas propiedades físicas y/o químicas se intercambia por otro aminoácido que tenga las mismas propiedades químicas o físicas. Por ejemplo, la sustitución aminoacídica conservadora puede ser un aminoácido sustituido con otro aminoácido (por ejemplo, Asp o Glu), un aminoácido con una cadena lateral no polar sustituido con otro aminoácido con una cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, etc.), un aminoácido básico sustituido con otro aminoácido básico (Lys, Arg, etc.), un aminoácido con una cadena lateral polar sustituido con otro aminoácido con una cadena lateral polar (Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc.), etc.

De forma alternativa o adicionalmente, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del TCR , polipéptido o proteína original con al menos una sustitución aminoacídica no conservadora. En este caso, es preferente que la sustitución aminoacídica no conservadora no interfiera en o inhiba la actividad biológica de la variante funcional. Preferentemente, la sustitución aminoacídica no conservadora potencia la actividad biológica de la variante funcional, de modo que la actividad biológica de la variante funcional se incremente en comparación con el TCR , polipéptido o proteína original.

El TCR , polipéptido o proteína según la invención puede consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos especificada(s) descrita(s) en el presente documento, de modo que otros componentes del TCR , polipéptido o proteína, por ejemplo, otros aminoácidos, no cambien materialmente la actividad biológica del TCR, polipéptido o proteína. A este respecto, el TCR , polipéptido o proteína según la invención, por ejemplo, puede consistir esencialmente en la secuencia de aminoácidos de (1) ambas SEQ ID NO: 50-51; o (2) ambas SEQ ID NO: 50 y 53. Además, por ejemplo, los TCR, polipéptidos o proteínas según la invención pueden consistir esencialmente en la(s) secuencia(s) de aminoácidos de (i) ambas SEQ ID NO: 15-16; o (ii) ambas SEQ ID NO: 15 y 24. Además, los TCR , polipéptidos o proteínas según la invención pueden consistir esencialmente en las secuencias de aminoácidos de (a) todas las SEQ ID NO: 9-14; o (b) todas las SEQ ID NO: 9-11 y 20-22.

Los TCR , polipéptidos y proteínas de la invención pueden ser de cualquier longitud, es decir, pueden comprender cualquier número de aminoácidos, siempre que los TCR , polipéptidos o proteínas retengan su actividad biológica, por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente a k Ra S mutado; detectar el cáncer en un mamífero; o tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, etc. Por ejemplo, el polipéptido puede estar en un intervalo de desde aproximadamente 50 a aproximadamente 5000 aminoácidos de longitud, tal como de 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos de longitud. A este respecto, los polipéptidos de la invención también incluyen oligopéptidos.

Los TCR , polipéptidos y proteínas de la invención pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos naturales. Dichos aminoácidos sintéticos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexanocarboxílico, norleucina, ácido a-amino-n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometilcisteína, trans-3- y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, p-fenilserina, p-hidroxifenilalanina, fenilglicina, a-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolin-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida del ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metil-lisina, N',N'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido a-aminociclopentanocarboxílico, ácido a-aminociclohexanocarboxílico, ácido aaminocicloheptanocarboxílico, ácido a-(2-amino-2-norbornano)carboxílico, ácido a,Y-diaminobutírico, ácido a,pdiaminopropiónico, homofenilalanina y a-terc-butilglicina.

Los TCR , polipéptidos y proteínas de la invención se pueden glucosilarse, amidar, carboxilar, fosforilar, esterificar, N-acilar, ciclar, por ejemplo, por medio de un puente disulfuro, o convertir en una sal de adición de ácido y/u opcionalmente dimerizar o polimerizar, o conjugar.

El TCR , polipéptido y/o proteína de la invención se pueden obtener por procedimientos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, la síntesis de novo. Además, los polipéptidos y proteínas se pueden producir de forma recombinante usando los ácidos nucleicos descritos en el presente documento usando procedimientos recombinantes estándar. Véase, por ejemplo, Green y Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4.a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012). De forma alternativa, los TCR , polipéptidos y/o proteínas descritos en el presente documento se pueden sintetizar comercialmente por compañías, tales como Synpep (Dublín, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD) y Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). A este respecto, los TCR , polipéptidos y proteínas según la invención pueden ser sintéticos, recombinantes, aislados y/o purificados.

En el alcance de la invención están incluidos conjugados, por ejemplo, bioconjugados, que comprenden cualquiera de los TCR , polipéptidos o proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células huésped o anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos según la invención. Los conjugados, así como los procedimientos de síntesis de conjugados en general, son conocidos en la técnica.

Un modo de realización de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los TCR , polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento. "Ácido nucleico", como se usa en el presente documento, incluye "polinucleótido", "oligonucleótido" y "molécula de ácido nucleico", y, en general, por él se entiende un polímero de ADN o ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que puede contener un enlace internucleotídico natural, no natural o alterado, tal como un enlace fosforoamidato o un enlace fosforotioato, en lugar del fosfodiéster que encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. En un modo de realización, el ácido nucleico comprende ADN complementario (ADNc). En general, es preferente que el ácido nucleico no comprenda ninguna inserción, deleción, inversión y/o sustitución. Sin embargo, puede ser adecuado en algunos casos, como se analiza en el presente documento, que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones.

Preferentemente, los ácidos nucleicos de la invención son recombinantes. Como se usa en el presente documento, el término "recombinante" se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de las células vivas uniendo segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos a moléculas de ácido nucleico que se pueden replicar en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de las descritas (i) anteriormente. Para los propósitos en el presente documento, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo.

Los ácidos nucleicos se pueden construir en base a síntesis química y/o reacciones de fijación enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Green y Sambrook etal., supra. Por ejemplo, un ácido nucleico se puede sintetizar químicamente usando nucleótidos naturales o nucleótidos diversamente modificados diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina N6-sustituida, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo y 2,6-diaminopurina. De forma alternativa, uno o más de los ácidos nucleicos de la invención se pueden adquirir de compañías tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, Tx ).

El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que codifique cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento. En un modo de realización de la invención, el ácido nucleico puede comprender las secuencias de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 63-64 y 66 (tabla 1). En un modo de realización de la invención, el ácido nucleico comprende las secuencias de nucleótidos de ambas SEQ ID NO: 63-64 o ambas SEQ ID NO: 63 y 66.

TABLA 1

En un modo de realización de la invención, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos optimizada respecto a codones que codifica cualquiera de los TCR , polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento. Sin ceñirse a una teoría o mecanismo particular, se cree que la optimización respecto a codones de la secuencia de nucleótidos incrementa la eficiencia de traducción de los transcritos de ARNm. La optimización respecto a codones de la secuencia de nucleótidos puede implicar la sustitución de un codón natural con otro codón que codifique el mismo aminoácido, pero que se pueda traducir por ARNt que esté más fácilmente disponible dentro de una célula, incrementando, por tanto, la eficacia de la traducción. La optimización de la secuencia de nucleótidos también puede reducir las estructuras de ARNm secundarias que interferirían en la traducción, incrementando, por tanto, la eficacia de la traducción.

La divulgación también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento o una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones restrictivas a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.

La secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones restrictivas se hibrida preferentemente en condiciones de restricción alta. Por "condiciones de restricción alta" se entiende que la secuencia de nucleótidos hibrida específicamente a una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento) en una cantidad que es detectablemente más fuerte que la hibridación no específica. Las condiciones de restricción alta incluyen condiciones que distinguirían un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta, o una que contenga solo unos pocos emparejamientos erróneos dispersos de una secuencia aleatoria que tenga algunas pequeñas regiones (por ejemplo, 3-10 bases) que se emparejan con la secuencia de nucleótidos. Dichas pequeñas regiones de complementariedad se funden más fácilmente que un complemento de longitud completa de 14-17 o más bases, y la hibridación con restricción alta las hace fácilmente distinguibles. Las condiciones de restricción relativamente alta incluirían, por ejemplo, condiciones de bajo contenido en sal y/o de temperatura alta, tales como se proporciona aproximadamente por NaCl 0,02-0,1 M o el equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50-70 °C. Dichas condiciones de restricción alta toleran poco, o ningún, emparejamiento erróneo entre la secuencia de nucleótidos y la hebra molde o diana, y son, en particular, adecuadas para detectar la expresión de cualquiera de los TCR según la invención. En general, se aprecia que las condiciones se pueden volver más restrictivas por la adición de cantidades crecientes de formamida.

La divulgación también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente un 70 % o más, por ejemplo, aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente un 97 %, aproximadamente un 98 % o aproximadamente un 99 % idéntica a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento. A este respecto, el ácido nucleico puede consistir esencialmente en cualquiera de las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden incorporar en un vector de expresión recombinante. A este respecto, la invención proporciona un vector de expresión recombinante que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. En un modo de realización de la invención, el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena a, la cadena p y el péptido conector.

Para los propósitos en el presente documento, por el término "vector de expresión recombinante" se entiende una construcción de oligonucleótidos o polinucleótidos genomanipulados que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido por una célula huésped, cuando la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para que exprese el ARNm, proteína, polipéptido o péptido dentro de la célula. Los vectores de la invención no son naturales en conjunto. Sin embargo, partes de los vectores pueden ser naturales. Los vectores de expresión recombinante según la invención pueden comprender cualquier tipo de nucleótido, incluyendo, pero sin limitarse a, ADN y ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido, en parte, de fuentes naturales, y que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores de expresión recombinante pueden comprender enlaces internucleotídicos naturales, no naturales, o ambos tipos de enlaces. Preferentemente, los nucleótidos o enlaces internucleotídicos no naturales o alterados no dificultan la transcripción o replicación del vector.

El vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y se puede usar para transformar o transfectar cualquier célula huésped adecuada. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para la propagación y expansión o para la expresión o ambas, tales como plásmidos y virus. El vector se puede seleccionar del grupo que consiste en la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También se pueden usar vectores bacteriófagos, tales como AGT10, AGT11, AZapII (Stratagene), AEMBL4 y ANM1149. Los ejemplos de vectores de expresión vegetales incluyen pBI01, pB1101.2, pBl 101.3, pB1121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión animales incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). Preferentemente, el vector de expresión recombinante es un vector vírico, por ejemplo, un vector retrovírico. En un modo de realización especialmente preferente, el vector de expresión recombinante es un vector MSGV1.

Los vectores de expresión recombinante de la invención se pueden preparar usando técnicas de ADN recombinante estándar descritas, por ejemplo, en Green y Sambrook et al., supra. Las construcciones de vectores de expresión, que son circulares o lineales, se pueden preparar para que contengan un sistema de replicación funcional en una célula huésped procariota o eucariota. Los sistemas de replicación se pueden derivar, por ejemplo, de ColEl, plásmido 2 |j, A, SV40, papilomavirus bovino y similares.

Deseablemente, el vector de expresión recombinante comprende secuencias reguladoras, tales como codones de iniciación y terminación de la transcripción y traducción, que son específicos para el tipo de célula huésped (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en el que se va a introducir el vector, según sea apropiado, y teniendo en consideración si el vector está basado en ADN o ARN.

El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de células huésped transformadas o transfectadas. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en una célula huésped auxótrofa para proporcionar prototrofia, y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión según la invención incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.

El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor natural o no natural enlazado de forma funcional a la secuencia de nucleótidos que codifica el TCR , polipéptido o proteína, o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria a o que se hibrida a la secuencia de nucleótidos que codifica el TCR , polipéptido o proteína. La selección de promotores, por ejemplo, fuertes, débiles, inducibles, específicos de tejido y específicos de desarrollo, está dentro de las habilidades comunes del experto. De forma similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también está dentro de las habilidades del experto. El promotor puede ser un promotor no vírico o un promotor vírico, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV y un promotor encontrado en la repetición terminal larga del virus de células madre murinas.

Los vectores de expresión recombinante según la invención se pueden diseñar para la expresión transitoria, para expresión estable o para ambas. Además, los vectores de expresión recombinante se pueden preparar para la expresión constitutiva o para la expresión inducible.

Además, se pueden preparar los vectores de expresión recombinante para que incluyan un gen suicida. Como se usa en el presente documento, el término "gen suicida" se refiere a un gen que provoca que la célula que expresa el gen suicida muera. El gen suicida puede ser un gen que confiere sensibilidad a un agente, por ejemplo, un fármaco, a la célula en la que se expresa el gen, y provoca que la célula muera cuando la célula se pone en contacto con o se expone al agente. Los genes suicidas son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, el gen de timidina cinasa (TK) del virus del herpes simple (HSV), citosina desaminasa, purina nucleósido fosforilasa, nitrorreductasa y el sistema génico de caspasa 9 inducible.

Otro modo de realización de la invención proporciona además una célula huésped que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinante descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" se refiere a cualquier tipo de célula que pueda contener el vector de expresión recombinante según la invención. La célula huésped puede ser una célula eucariota, por ejemplo, planta, animal, hongo o alga, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, bacterias o protozoos. La célula huésped puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, por ejemplo, un ser humano. La célula huésped puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. Las células huésped adecuadas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, células de E. coli DH5a, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293 y similares. Para los propósitos de amplificación o replicación del vector de expresión recombinante, la célula huésped es preferentemente una célula procariota, por ejemplo, una célula DH5a. Para los propósitos de producción de un TCR , polipéptido o proteína recombinantes, la célula huésped es preferentemente una célula de mamífero. Lo más preferentemente, la célula huésped es una célula humana. Aunque la célula huésped puede ser de cualquier tipo celular, se puede originar de cualquier tipo de tejido y puede ser de cualquier fase de desarrollo, la célula huésped es preferentemente un linfocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). Más preferentemente, la célula huésped es un linfocito T.

Para los propósitos en el presente documento, el linfocito T puede ser cualquier linfocito T, tal como un linfocito T cultivado, por ejemplo, un linfocito T primario, o un linfocito T de una línea de linfocitos T cultivados, por ejemplo, Jurkat, SupTI, etc., o un linfocito T obtenido de un mamífero. Si se obtiene de un mamífero, el linfocito T se puede obtener de numerosas fuentes incluyendo, pero sin limitarse a, sangre, médula ósea, nódulos linfáticos, el timo u otros tejidos o fluidos. Los linfocitos T también se pueden enriquecer o purificar. Preferentemente, el linfocito T es un linfocito T humano. El linfocito T puede ser cualquier tipo de linfocito T y puede estar en cualquier fase de desarrollo, incluyendo, pero sin limitarse a, linfocitos T doblemente positivos CD4+/CD8+, linfocitos T cooperadores CD4+, por ejemplo, linfocitos Thi y Th2, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ (por ejemplo, linfocitos T citotóxicos), linfocitos infiltrantes de tumor (TIL), linfocitos T de memoria (por ejemplo, linfocitos T de memoria centrales y linfocitos T de memoria efectores), linfocitos T indiferenciados y similares.

La invención también proporciona una población de células que comprende al menos una célula huésped descrita en el presente documento. La población de células puede ser una población heterogénea que comprenda la célula huésped que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinante descritos, además de al menos otra célula, por ejemplo, una célula huésped (por ejemplo, un linfocito T), que no comprenda ninguno de los vectores de expresión recombinante, o una célula distinta de un linfocito T, por ejemplo, un linfocito B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula muscular, una célula cerebral, etc. De forma alternativa, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células huésped que comprenden (por ejemplo, que consisten esencialmente en) el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población clonal de células, en la que todas las células de la población sean clones de una única célula huésped que comprenda un vector de expresión recombinante, de modo que todas las células de la población comprendan el vector de expresión recombinante. En un modo de realización de la invención, la población de células es una población clonal que comprende células huésped que comprenden un vector de expresión recombinante como se describe en el presente documento.

En un modo de realización de la invención, el número de células en la población se puede ampliar rápidamente. La expansión de los números de linfocitos T se puede lograr por cualquiera de una serie de procedimientos conocidos en la técnica como se describe, por ejemplo, en la patente de E e . UU. 8.034.334; patente de EE . UU.

8.383.099; publicación de solicitud de patente de EE . UU. n.° 2012/0244133; Dudley et al., J . Immunother., 26:332-42 (2003); y Riddell et al., J . Immunol. Methods, 128:189-201 (1990). En un modo de realización, la expansión de los números de linfocitos T se lleva a cabo cultivando los linfocitos T con anticuerpo frente a OKT3, IL-2 y PBMC de alimentación (por ejemplo, PBMC alogénicas irradiadas).

Los TCR , polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante y células huésped (incluyendo las poblaciones de las mismas) según la invención están aisladas y/o purificadas. Por el término "aislado" como se usa en el presente documento se entiende que se ha retirado de su entorno natural. Por el término "purificado" como se usa en el presente documento se entiende que se ha incrementado en pureza, en el que "pureza" es un término relativo y no se debe interpretar necesariamente como pureza absoluta. Por ejemplo, la pureza puede ser de al menos aproximadamente un 50 %, puede ser mayor de un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o puede ser un 100 %.

Los TCR , polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante y células huésped (incluyendo las poblaciones de las mismas) según la invención, denominándose todos conjuntamente "materiales de TCR según la invención", a continuación en el presente documento, se pueden formular en una composición, tal como una composición farmacéutica. A este respecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los TCR , polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión y células huésped (incluyendo poblaciones de las mismas) descritos en el presente documento, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas según la invención que contienen cualquiera de los materiales de TC R según la invención pueden comprender más de un material de TC R según la invención, por ejemplo, un polipéptido y un ácido nucleico, o dos o más TCR diferentes. De forma alternativa, la composición farmacéutica puede comprender un material de TCR según la invención en combinación con otro(s) agente(s) o fármaco(s) farmacéuticamente activo(s), tales como agentes quimioterápicos, por ejemplo, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc.

Preferentemente, el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable. Con respecto a las composiciones farmacéuticas, el vehículo puede ser cualquiera de los usados convencionalmente para el material de TCR según la invención particular en consideración. Los procedimientos para preparar composiciones administrables son conocidos o evidentes para los expertos en la técnica y se describen con más detalle, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22.a ed., Pharmaceutical Press (2012). Es preferente que el vehículo farmacéuticamente aceptable sea uno que no tenga efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.

La elección del vehículo estará determinada, en parte, por el material de TCR según la invención particular, así como por el procedimiento particular usado para administrar el material de TCR según la invención. En consecuencia, existe una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la invención. Las formulaciones adecuadas pueden incluir cualquiera de aquellas para administración parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intrarterial, intratecal, intratumoral o interperitoneal. Se puede usar más de una vía para administrar los materiales de TCR según la invención, y, en determinados casos, una vía particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra vía.

Preferentemente, el material de TCR según la invención se administra por inyección, por ejemplo, por vía intravenosa. Cuando el material de TCR según la invención es una célula huésped que expresa el ^tC ^rsegún la invención, el vehículo farmacéuticamente aceptable para inyección en las células puede incluir cualquier vehículo isotónico, tal como, por ejemplo, solución salina normal (aproximadamente un 0,90 % p/v de NaCl en agua, aproximadamente 300 mOsm/l de NaCl en agua, o aproximadamente 9,0 g de NaCl por litro de agua), solución electrolítica NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL), P ^lA^sMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), aproximadamente un 5 % de dextrosa en agua, o lactato de Ringer. En un modo de realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable se complementa con seroalbúmina humana.

Para los propósitos de la divulgación, la cantidad o dosis (por ejemplo, números de células cuando el material de TCR según la invención es una o más células) del material de TCR según la invención administrado debe ser suficiente para efectuar, por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica en el sujeto o animal durante un periodo de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material de TCR según la invención debe ser suficiente para unirse a un antígeno canceroso (por ejemplo, KRAS mutado) o detectar, tratar o prevenir el cáncer en un periodo de desde aproximadamente 2 horas o más largo, por ejemplo, de 12 a 24 o más horas, desde el momento de administración. En determinados modos de realización de la divulgación, el periodo de tiempo podría ser incluso mayor. La dosis estará determinada por la eficacia del material de TCR según la invención particular y la afección del animal (por ejemplo, ser humano), así como el peso corporal del animal (por ejemplo, ser humano) que se va a tratar.

En la técnica son conocidos muchos ensayos para determinar una dosis administrada. Para los propósitos de la divulgación, se podría usar un ensayo, que comprenda comparar el grado en que las células diana se lisan o IFN-Y se secreta por los linfocitos T que expresan el TCR , polipéptido o proteína según la invención tras la administración de una dosis dada de dichos linfocitos T a un mamífero entre un conjunto de mamíferos entre los que cada uno recibe una dosis diferente de los linfocitos T, para determinar una dosis inicial que se vaya a administrar a un mamífero. El grado en que las células diana se lisan o se secreta IFN-y tras la administración de una determinada dosis se puede someter a ensayo por procedimientos conocidos en la técnica.

La dosis del material de TCR según la invención también estará determinada por la existencia, naturaleza y grado de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un material de TCR según la invención particular. Típicamente, el médico especialista decidirá la dosificación del material de TCR según la invención con la que tratar a cada paciente individual, teniendo en consideración una variedad de factores, tales como la edad, el peso corporal, la salud general, la dieta, el sexo, el material de TCR según la invención que se va a administrar, la vía de administración y la gravedad del cáncer que se está tratando. En un modo de realización de la divulgación en el que el material de TCR según la invención es una población de células, el número de células administradas por infusión puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1012 células o más. En determinados modos de realización de la divulgación, se pueden administrar menos de 1 x 106 células.

Un experto en la técnica apreciará fácilmente que los materiales de TCR según la invención se pueden modificar de cualquier serie de maneras, de modo que la eficacia terapéutica o profiláctica de los materiales de TCR según la invención se incremente a través de la modificación. Por ejemplo, los materiales de TCR según la invención se pueden conjugar directa o bien indirectamente a través de un puente con un agente quimioterápico. La práctica de conjugar compuestos a un agente quimioterápico es conocida en la técnica. Un experto en la técnica reconoce que los sitios en los materiales de TCR según la invención, que no son necesarios para la función de los materiales de TCR según la invención, son sitios ideales para fijar un puente y/o un agente quimioterápico, siempre que el puente y/o agente quimioterápico, una vez fijado a los materiales de t C r según la invención, no interfiera(n) con la función de los materiales de TCR según la invención, es decir, la capacidad de unirse a KRAS mutado o detectar, tratar o prevenir el cáncer.

Se contempla que las composiciones farmacéuticas, TCR , polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped y poblaciones de células según la invención se puedan usar en procedimientos de tratamiento o prevención del cáncer. Sin ceñirse a una teoría o mecanismo particular, se cree que los TCR según la invención se unen específicamente a KRAS mutado, de modo que el TCR (o polipéptido o proteína según la invención relacionado), cuando se expresa por una célula, pueda mediar en una respuesta inmunitaria frente a una célula diana expresando KRAS mutado. A este respecto, la divulgación proporciona un procedimiento para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero cualquiera de las composiciones farmacéuticas, TCR , polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento, cualquier ácido nucleico o vector de expresión recombinante que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique cualquiera de los TCR , polipéptidos, proteínas descritos en el presente documento, o cualquier célula huésped o población de células que comprenda un vector recombinante que codifique cualquiera de los TCR , polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero.

Un modo de realización de la invención proporciona cualquiera de las composiciones farmacéuticas, TCR, polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento, cualquier ácido nucleico o vector de expresión recombinante que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique cualquiera de los TCR , polipéptidos, proteínas descritos en el presente documento, o cualquier célula huésped o población de células que comprenda un vector recombinante que codifique cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento, para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero.

Los términos "tratar" y "prevenir", así como las palabras derivadas de los mismos, como se usa en el presente documento, no necesariamente implican un 100 % de tratamiento o prevención completos. En su lugar, existen grados variables de tratamiento o prevención que un experto en la técnica reconoce como que tienen un beneficio potencial o efecto terapéutico. A este respecto, los procedimientos divulgados pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero. Además, el tratamiento o prevención proporcionados por el procedimiento divulgado pueden incluir el tratamiento o prevención de una o más afecciones o síntomas del cáncer que se está tratando o previniendo. Por ejemplo, el tratamiento o prevención pueden incluir promover la regresión de un tumor. Además, para los propósitos en el presente documento, "prevención" puede englobar retrasar la aparición del cáncer, o un síntoma o afección del mismo. De forma alternativa o adicionalmente, "prevención" puede englobar prevenir o retrasar la recidiva del cáncer, o un síntoma o afección del mismo.

También se proporciona un procedimiento para detectar la presencia de cáncer en un mamífero. El procedimiento comprende (i) poner en contacto una muestra que comprende una o más células del mamífero con cualquiera de los TCR , polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células o composiciones farmacéuticas según la invención descritos en el presente documento, formando, de este modo, un complejo, y detectando el complejo, en el que la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero.

Con respecto al procedimiento de detección según la invención en un mamífero, la muestra de células puede ser una muestra que comprenda células completas, lisados de las mismas, o una fracción de los lisados de células completas, por ejemplo, una fracción nuclear o citoplásmica, una fracción de proteína completa, o una fracción de ácido nucleico.

Para los propósitos del procedimiento de detección según la invención, el contacto es in vitro con respecto al mamífero.

Además, la detección del complejo se puede producir a través de cualquier serie de maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped o poblaciones de células según la invención, descritos en el presente documento, se pueden marcar con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas de elemento (por ejemplo, partículas de oro).

Para los propósitos de los procedimientos divulgados, en los que se administran células huésped o poblaciones de células, las células pueden ser células que sean alogénicas o autólogas al mamífero. Preferentemente, las células son autólogas al mamífero.

Con respecto a los procedimientos según la invención, el cáncer puede ser cualquier cáncer, incluyendo cualquiera de cáncer linfocítico agudo, leucemia mielógena aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de huesos, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer de ano, del conducto anal o anorrectal, cáncer de ojo, cáncer del conductillo biliar intrahepático, cáncer de articulaciones, cáncer de cuello, vesícula biliar o pleura, cáncer de nariz, cavidad nasal u oído medio, cáncer de la cavidad oral, cáncer de vagina, cáncer de vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mielógeno crónico, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, tumor carcinoide gastrointestinal, glioma, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma no hodgkiniano, cáncer de orofaringe, cáncer de ovario, cáncer de pene, cáncer de páncreas, cáncer de peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer del recto, cáncer renal, cáncer de piel, cáncer del intestino delgado, cáncer de partes blandas, cáncer de estómago, cáncer de testículos, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer de uréter y cáncer de vejiga urinaria. Un cáncer preferente es cáncer de páncreas, colorrectal, de pulmón, de endometrio, de ovario o de próstata. Preferentemente, el cáncer de pulmón es adenocarcinoma de pulmón, el cáncer de ovario es cáncer de ovario epitelial y el cáncer de páncreas es adenocarcinoma de páncreas. En otro modo de realización preferente, el cáncer es un cáncer que expresa la secuencia de aminoácidos de KRAS mutado con la mutación G12D.

El mamífero al que se hace referencia en los procedimientos según la invención puede ser cualquier mamífero. Como se usa en el presente documento, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden Logomorpha, tales como conejos. Es preferente que los mamíferos sean del orden Carnivora, incluyendo felinos (gatos) y caninos (perros). Es más preferente que los mamíferos sean del orden Artiodactyla, que incluye bovinos (vacas) y cerdos o del orden Perssodactyla, que incluye equinos (caballos). Lo más preferente es que los mamíferos sean del orden Primates, Ceboids o Simoids (monos) o del orden Anthropoids (seres humanos y simios superiores). Un mamífero especialmente preferente es el ser humano.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención, pero, por supuesto, no se deben interpretar de ninguna manera como limitantes de su alcance.

Ejemplos

Secuenciación de nueva generación

Se purificaron ADN genómico (ADNg) y ARN de diversos tumores y se emparejaron con muestras de aféresis normales usando el kit A LLPR EP DNA/RNA de QIAGEN (Qiagen, Venlo, Países Bajos) siguiendo las sugerencias del fabricante. Una muestra (Tu-Pri) se fijó con formol, se incluyó en parafina (FFP E ) y se extrajo ADNg usando el kit TRUXTRACTM FFP E DNA de Covaris, según las indicaciones del fabricante (Covaris, Woburn, MA). Se prepararon la construcción de colecciones del exoma completo y la captura de exones de aproximadamente 20.000 genes codificantes usando el sistema de enriquecimiento de dianas S U R ES ELEC T X T de Agilent Technologies para colecciones de extremos emparejados con cebo de ARN ALL EXON V6 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE . UU.). Se secuenciaron posteriormente colecciones de secuenciación del exoma completo (W ES) en un secuenciador de mesa N EXTSEQ 500 (Illumina, San Diego, CA, EE . UU.). Se preparó la colección usando 3 |jg de ADNg de muestras de tejido tumoral recién obtenidas y 200 ng de ADNg de la muestra tumoral FFP E siguiendo el protocolo del fabricante. Se realizó la secuenciación de extremos emparejados con un kit con cubetas de lectura de alto rendimiento ILLUMINA (300 ciclos) usando inicialmente v i del reactivo/kit con cubetas de lectura, seguido de una tanda posterior de la misma preparación de colecciones en v2 del reactivo/kit con cubetas de lectura. Se prepararon colecciones de secuenciación de ARN usando 2 jg de ARN total con el kit de preparación de colecciones de ARN en hebra ILLUMINA TRU SEQ siguiendo el protocolo del fabricante. Las colecciones de secuenciación de ARN se sometieron a secuenciación de extremos emparejados en un secuenciador de mesa N EXTSEQ 500 (Illumina, San Diego, CA, EE . UU.).

Alineación, procesamiento y búsqueda de variantes

Para la W ES, se realizaron alineaciones usando el programa NOVOALIGN MPI de Novocraft (Selangor, Malasia) (novocraft.com/) con respecto al ensamblado de genoma humano hg19. Los duplicados se marcaron usando la herramienta M ARKDUPLICATES de Picard. Se llevaron a cabo la realineación por inserción/deleción y la recalibración de base de acuerdo con el flujo de trabajo de prácticas óptimas de GATk (broadinstitute.org/gatk/). Después de la limpieza de datos, se usó el servicio SAMTOOLS (samtools.sourceforge.net) para crear archivos pileup y se usó el buscador de mutaciones independiente de plataforma VARSCAN2 (varscan.sourceforge.net) para buscar las variantes somáticas usando los siguientes criterios: recuentos de lectura normal y tumoral de 10 o más, frecuencia de alelo variante de un 10 % o más y lecturas de variante tumoral de 4 o más. A continuación, estas variantes se anotaron usando la herramienta de programa informático ANNOVAR (annovar.openbioinformatics.org).

Para la secuenciación de ARN, las alineaciones se realizaron usando el procedimiento de dos pasos STAR (github.com/alexdobin/STAR) con respecto al ensamblado de genoma humano hg19. Los duplicados se marcaron usando la herramienta M ARKDUPLICATES de Picard. Las lecturas se dividieron y recortaron con la herramienta GATK SPLITNTRIM . Después de ello, se realizaron la realineación por inserción/deleción y la recalibración de base usando la caja de herramientas de GATK. Se creó un archivo pileup usando el archivo bam recalibrado final y la herramienta SAMTOOLS MPILEUP. Finalmente, se buscaron las variantes usando el buscador de mutaciones independiente de plataforma VARSCAN2.

Se llevaron a cabo W ES y secuenciación de ARN en tres muestras tumorales metastásicas recién obtenidas (Tu-1, Tu-2A y Tu-2B). Las variantes con una frecuencia de exoma mínima de un 7 % y un mínimo de tres lecturas alternativas se seleccionaron manualmente usando la herramienta Integrated Genomics Viewer (IGV) (Broad Institute, Cambridge, MA) para retirar las búsquedas de positivos falsos que parecían ser el resultado de errores de secuenciación o cartografiado. En un intento de centrarse en las mutaciones que probablemente fueran clonales o estuvieran representadas en poblaciones clonales dominantes, se eligieron 61 mutaciones para su análisis adicional en base a su detección en más de dos o más muestras tumorales. Una de estas 61 mutaciones fue KRAS (tabla 2). Estas incluyeron 29 que se identificaron en un mínimo de una colección de W ES y una de secuenciación de ARN, y 32 que se identificaron en colecciones de W ES de dos o más de las lesiones metastásicas.

TABLA 2

Generación de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL), TIL de infusión y células dendríticas (CD) presentadoras de antígeno

Se generaron TIL, T IL de infusión y células dendríticas como se describe en Tran et al., Science, 350: 1387-90 (2015). En resumen, para generar TIL, los tumores resecados quirúrgicamente se seccionaron en veinticuatro fragmentos de aproximadamente 1-2 mm de tamaño y cada fragmento se colocó en un pocillo separado de una placa de 24 pocillos que contenía 2 ml de medios completos (MC) que contenía IL-2 en dosis alta (6000 UI/ml, Chiron, Emeryville, CA). Los MC contenían medios RPMI complementados con suero humano interno al 10 %, L-glutamina 2 mM, H EPES 25 mM y 10 |jg/ml de gentamicina. Se seleccionó el cultivo de fragmentos de TIL n.° 6 para el tratamiento y, por tanto, se sometió a un procedimiento de expansión rápida en frascos G-REX100 permeables a gas usando PBMC irradiadas en una proporción de 1 a 100 en 400 ml de medio 50/50, complementado con suero AB humano al 5 %, 3000 UI/ml de IL-2 y 30 ng/ml de anticuerpo frente a OKT3 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Los medios 50/50 contenían una mezcla 1 a 1 de MC con medios AIM-V. Todas las células se cultivaron a 37 °C con un 5 % de CO².

Se generaron CD inmaduras a partir de monocitos de sangre periférica usando el procedimiento de adherencia plástica. En resumen, la aféresis del paciente se descongeló, lavó, ajustó a 7,5-10e6 células/ml con medios AIM-V (Life Technologies, Carlsbad, CA) y, a continuación, se incubó a aproximadamente le6 células/cm²en frascos de cultivo tisular (162 cm²de área superficial) y se incubó a 37 °C, 5 % de CO². Después de 90 minutos (min), se obtuvieron las células no adherentes y las células adherentes en los frascos se lavaron enérgicamente con medios AIM-V y, a continuación, se incubaron adicionalmente con medios AIM-V durante 60 min. Los medios y las células no adherentes se retiraron y las células adherentes en los frascos se lavaron de nuevo enérgicamente, a continuación, con medios AIM-V y, a continuación, se incubaron con medios de CD. Los medios de CD contenían RPMI que contenía suero humano al 5 %, 100 U/ml de penicilina y 100 jg/ml de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, 800 UI/ml de GM-CSF (LEUKINE (sargramostim)) y 200 U/ml de IL-4 (Peprotech, Rocky Hill, NJ). El día 2-3, se añadieron medios de CD recién obtenidos a los cultivos. Las CD se crioconservaron el día 4 o 5 después del inicio del cultivo. Se usaron CD en experimentos entre el día 4 y el día 6 después del inicio de los cultivos.

Identificación de linfocitos T reactivos frente a mutación y experimentos de cocultivo

Los procedimientos detallados se describen en Tran et al., Science, 350: 1387-90 (2015). En resumen, se identificaron sesenta y una mutaciones por secuenciación del exoma y transcriptoma completo. Una de estas 61 mutaciones fue KRAS (tabla 2). Para cada mutación, se generó y sintetizó en tándem un minigén que codificaba la mutación flanqueada por 12 aminoácidos a cada lado con la proteína original para crear construcciones de minigenes en tándem (TMG). Se prepararon cinco TMG (TMG 1-5) que codificaban las 61 mutaciones, se transcribieron in vitro en ARN y, a continuación, se sometieron a electroporación en CD presentadoras de antígeno autólogas, lo que permitió el procesamiento y la presentación de todas las mutaciones en el contexto de las moléculas HLA-I y HLA del propio paciente (tabla 4). Los TMG para KRAS natural y mutado se muestran en la tabla 3. Los datos de HLA mostrados en la tabla 4 se determinaron a partir de datos de secuenciación de nueva generación usando el algoritmo PHLAT como se describe en Bai et al., BMC Genomics, 15: 325 (2014). A continuación, se cocultivaron veinticuatro cultivos de TIL individuales del paciente con estas CD que expresaban TMG, y se determinó la reactividad de los linfocitos T por el ensayo de inmunotransferencia por puntos enzimática (ELISPO T) para IFN-^y(fig. 1A) y análisis por citometría de flujo de los marcadores de activación de linfocitos T 4-1BB y OX40. Se identificaron múltiples cultivos de TIL que eran reactivos frente a TMG-1. Para identificar qué antígeno mutado en TMG-1 se reconocía por el cultivo de T IL n.° 6, se sintetizaron los péptidos que estaban codificados en TMG-1 (ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) y GenScript Inc. (Piscataway Township, NJ)) y, a continuación, se pulsaron individualmente en CD durante la noche seguido de cocultivo con cultivo de T IL n.° 6 (fig. 1B).

TABLA 3

TABLA 4

Los siguientes péptidos purificados por HPLC (GenScript Inc.) se usaron en experimentos de valoración de péptidos: nanómero natural (WT): Ga G g VGKSA (s EQ ID NO: 7); nanómero mutado (G12D): GADGVGKSA (SEQ ID NO: 8); decámero WT: GAGGVGKSAL (SEQ ID NO: 5); decámero con G12D: GADGVGKSAL (SEQ ID NO: 6).

Se usó tinción con citocinas intracelulares (ICS) y citometría de flujo para determinar la expresión de las citocinas IFN-y , TNF e IL-2, y el marcador de desgranulación CD107a como se describe en Tran et al., Science, 344: 641-5 (2014). En resumen, las células diana y efectoras se combinaron en los pocillos de una placa de 96 pocillos y se añadieron al cultivo ambos inhibidores del transporte de proteínas GOLGISTOP como GOLGIPLUG (ambos a ^ de las concentraciones recomendadas) (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). En t = 6 h después de la estimulación, las células se procesaron usando el kit CYTOFIX/CYTOPERM (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se adquirieron en un citómetro de flujo FACSCANTOII y los datos se analizaron usando el programa informático FLOWJO (TreeStar Inc., Ashland, ^oR). Se usó el análisis de selección booleana para determinar el porcentaje de células que expresan el número indicado de funciones efectoras (citocinas y marcador de desgranulación).

Identificación de clones de linfocitos T reactivos frente a KRASG12D

Se identificaron cuatro TCR reactivos frente a KRASG12D usando diversos procedimientos. El clon TRBV5-6 (Vp5.2) dominante en la bolsa de infusión se aisló del cultivo de fragmentos de TIL n.° 6 antes de la expansión rápida. En resumen, el cultivo de TIL n.° 6 se tiñó con el anticuerpo anti-Vp5.2-PE (ficoeritrina) (Beckman Coulter, Schaumburg, IL) y las células Vp5.2+ se enriquecieron usando anticuerpos anti-PE específicos conjugados a microesferas magnéticas según las indicaciones del fabricante (Miltenyi Biotec). El ARN total se aisló de los linfocitos T Vp5.2+ (kit RNEASY MINI, Qiagen) y, a continuación, se sometió a 5'RACE según las indicaciones del fabricante (kit de amplificación de ADNc SM ARTER RACE, Clontech) usando cebadores constantes de cadena alfa y beta de TCR . Las secuencias de los cebadores constantes de cadena alfa y beta fueron: TCR-alfa, 5'- GCC ACA GCA CTG TTG CTC TTG AAG TCC -3' (SEQ ID NO: 59); TCR-beta, 5'- CAG GCA GTA TCT GGA GTC ATT GAG -3 (SEQ ID NO: 60). Para la PCR se usó el programa 1 del kit, con una modificación con respecto al tiempo de extensión (2 min en lugar de 3 min). A continuación, los productos de PCR para TCR se aislaron por electroforesis en gel de agarosa estándar y extracción en gel (zimógeno) y, a continuación, se secuenciaron los productos (Macrogen, Seúl, Corea).

Los TCR clasificados en segundo y tercer puesto en la bolsa de infusión también eran reactivos frente a KRASG12D y se aislaron estimulando, en primer lugar, la muestra de aféresis de transferencia poscelular del día 40 con CD pulsadas durante la noche con péptidos largos KRASG12D Los linfocitos T CD8+ positivos y negativos para Vp5.2 que regularon por incremento el marcador de activación de linfocitos T4-1BB después de la estimulación durante la noche se clasificaron, a continuación, por separado por FACS. Las células Vp5.2+ se ampliaron además antes de someterse a 5'RACE como se describe anteriormente, seguido de clonación TOPO-TA de los productos de PCR para TCR y secuenciación de colonias individuales para identificar las cadenas alfa y beta de TCR . Las células negativas para Vp5.2 se sometieron a PCR para TCR múltiple unicelular para identificar las cadenas alfa y beta de TCR como se describe en Pasetto et al., Cancer Immunol. Res., (2016).

El cuarto TCR reactivo frente a KRASG12D (clasificado en el puesto 45.° en la bolsa de infusión) se identificó a partir de un fragmento de TIL diferente (fragmento de T IL n.° 5) usando otro enfoque de tecnología unicelular. En resumen, el cultivo de TIL n.° 5 se cocultivó con CD transfectadas con TMG-1 (que codifica KRASG12D) y, después de 4 horas (h), se recogieron los T IL y se sometieron al sistema FLUIDIGM C1 (Fluidigm, San Francisco, CA) para preparar muestras de secuenciación de ARN unicelular de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuación, se secuenciaron las muestras de secuenciación de ARN unicelular por el sistema ILLUMINA MISEQ y se analizaron los datos por un programa de bioinformática interno. Las secuencias alfa y beta de TCR se extrajeron de muestras que demostraron una regulación por incremento de los transcritos de IFN-y tras la estimulación.

Seguimiento in vivo de linfocitos T reactivos frente a KRASG12D

Para determinar las frecuencias de los linfocitos T reactivos frente a KRASG12D en las muestras, en primer lugar, se identificaron las secuencias de TCR de los clones de linfocitos T reactivos frente a KRASG12D y estas secuencias se examinaron frente a los datos de secuenciación profunda de TCR-Vp de las muestras indicadas. El número de lecturas de TCR productivas en marco en las muestras osciló entre 522.499 a 1.990.345.

Anticuerpos de citometría de flujo

En este informe se usaron los siguientes anticuerpos antihumanos de citometría de flujo: CD3-AF700 (clon: UCHT1, BioLegend), CD8-PE-Cy7 (clon: SK1, BD Biosciences), CD4-APC-Cy7 (clon: SK3, BioLegend), OX40-FITC (clon: Ber-ACT35, BD Biosciences), 4-1BB-APC (clon: 4B4-1, BioLegend) y Vp5.2-PE (Beckman Coulter). Se usó anticuerpo anti región constante beta de TCR de ratón conjugado con fluorocromo (H57-597, eBioscience) para evaluar la eficacia de transducción de los TCR . Se usó el kit IO T E S T Beta Mark TCR V para evaluar el repertorio de TCR-Vp (Beckman Coulter).

Identificación de linfocitos T reactivos frente a mutación y generación de producto de infusión

Se usó un procedimiento descrito previamente (Lu et al., Clin. Cancer Res., 20: 3401-10 (2014); Tran et al., Science, 344: 641-5 (2014); Tran et al., Science, 350: 1387-90 (2015)) para someter a prueba si los T IL del paciente 4095 reconocían mutaciones somáticas expresadas por sus tumores pulmonares metastásicos. El cultivo de TIL n.° 6 contenía la frecuencia más alta de linfocitos T CD8+ reactivos frente a KRASG12D y, por tanto, se sometió a un procedimiento de expansión rápida de dos semanas antes de la infusión celular como se describe en Tran et al., Science, 344: 641-5 (2014).

Seguimiento in vivo de clones de linfocitos T específicos para KRASG12D

Se realizó la secuenciación profunda del receptor de linfocitos T (TCR)-Vp en ADNg aislado del producto de infusión del paciente, 3 nódulos pulmonares separados antes del tratamiento, la lesión que progresaba (lesión 3) y en sangre periférica antes de y en diversos momentos después de la infusión celular (Adaptive Biotechnologies, Seattle WA) para examinar la frecuencia de secuencias de TCR reactivo frente a KRASG12D

Evaluación de la reactividad de TCR específicos para KRASG12D

Se identificaron cuatro TCR reactivos frente a KRASG12D, y las secuencias de cadena alfa y beta de TCR se sintetizaron y, a continuación, clonaron en el vector retrovírico MSGV1 (GenScript Inc.). Se generaron sobrenadantes retrovíricos que codificaban los TCR y se usaron para transducir linfocitos T autólogos de sangre periférica como se describe en Tran et al., Science, 344: 641-5 (2014). A continuación, los linfocitos T transducidos para TCR se cocultivaron con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) autólogas cargadas con dosis de valoración de diversos péptidos KRAS, o líneas celulares de cáncer de páncreas positivas para KRASG12D que expresaban o no expresaban de forma estable el alelo HLA-C*08:02 restrictivo (Tran et al., Science, 350: 1387-90 (2015)). La reactividad de los linfocitos T se determinó al día siguiente por el ensayo ELISPO T para IFN-y y análisis por citometría de flujo de los marcadores de activación de linfocitos T 4-1BB y OX40 (Tran et al., Science, 350: 1387-90 (2015)).

Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra la frecuencia in vivo de linfocitos T CD8+ reactivos frente a la mutación KRASG12D

La paciente era una mujer de 49 años con adenocarcinoma colorrectal y múltiples metástasis pulmonares bilaterales. Previamente recibió 12 ciclos de quimioterapia con FOLFOX después de una colectomía sigmoidea y una cistectomía parcial, seguido de radiación a 4182 cGy en la línea de sutura de la vejiga. Poco tiempo después, experimentó un incremento del número y tamaño de los nódulos pulmonares bilaterales ávidos por FDG. La biopsia de un nódulo en el lóbulo inferior derecho fue consistente con adenocarcinoma colorrectal metastásico.

La paciente se incluyó en el ensayo clínico de fase II aprobado por la junta de revisión institucional (número en ClinicalTrials.gov NCT01174121) diseñado para someter a prueba si la transferencia adoptiva de linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) ampliados ex vivo que contienen linfocitos T que seleccionan como diana mutaciones cancerosas puede mediar en la regresión de cánceres sólidos metastásicos. Las TAC de referencia revelaron que la enfermedad pulmonar era la única fuente de progresión del cáncer. Se resecaron tres lesiones pulmonares por cirugía toracoscópica asistida por video (VATS) y se generaron 24 cultivos de TIL individuales a partir de múltiples fragmentos tumorales. Las 3 lesiones también se sometieron a secuenciación del exoma y transcriptoma completo para identificar mutaciones expresadas por los tumores (tabla 2). Cada cultivo de T IL se evaluó en cuanto a su reactividad frente a estas mutaciones. Se descubrió que los TIL de la paciente contenían linfocitos T CD8+ que reconocían específicamente la mutación KRASG12D (fig. 1A y B). Se seleccionó el cultivo de TIL que presentó la frecuencia más alta de linfocitos T CD8+ reactivos frente a KRASG12D. Los números de células seleccionadas se ampliaron para el tratamiento (fig. 1B y C). Antes de la infusión celular, la paciente se sometió a una pauta de quimioterapia no mieloablativa linfodepletora que incluía 60 mg/kg de ciclofosfamida durante 2 días, seguido de 25 mg/m2 de fludarabina durante 5 días (Dudley et al., J . Clin. Oncol., 23: 2346-57 (2005)). La paciente recibió una única infusión de 1,48 x 1011 TIL, seguido de 5 dosis de interleucina-2 (IL-2) a 720.000 UI/kg, que se interrumpió por fatiga. El tratamiento se toleró bien y la paciente se mandó a casa dos semanas después de la infusión celular. Aproximadamente un 75 % del producto de la infusión contenía linfocitos T CD8+ que reconocían específicamente la mutación KRASG12D, y la mayoría de estos linfocitos T producían múltiples citocinas efectoras (IFN-^y, TNF e IL-2) y presentaban potencial citolítico. Todas las 7 lesiones pulmonares metastásicas experimentaron una regresión en el primer seguimiento 40 días después de la transferencia celular, y 6/7 lesiones continuaron experimentando una regresión o respondiendo completamente hasta que una lesión (lesión 3) progresó aproximadamente 9 meses después del tratamiento. Se realizó una resección por VATS del pulmón inferior izquierdo aproximadamente 9 meses después de la transferencia celular para retirar la única lesión que progresaba (lesión 3) así como una lesión que respondía (lesión 2) que era negativa con PET y completamente necrótica sin células tumorales vivas en el análisis patológico. La paciente permanece clínicamente libre de enfermedad 3 meses después de la resección pulmonar.

El producto de infusión T IL contenía al menos cuatro clonotipos de linfocitos T reactivos frente a KRASG12D de frecuencias variables. Los tres TCR de frecuencia más alta en el producto de infusión eran reactivos frente a KRASG12D, comprendiendo un 49,5 %, 19,1 % y 6,9 % de la bolsa de infusión, mientras que un cuarto TCR reactivo frente a KRASG12D fue el 45.° más frecuente y estuvo presente solo en un 0,04 % de la bolsa de infusión (figs. 2A-2D y tabla 5). Ninguno de estos TCR reactivos frente a KRASG12D se detectó (frecuencia < 0,0002 %) en la sangre periférica de la paciente una semana antes de la infusión (figs. 2A-2D). Después de la transferencia celular, se observaron drásticas dramáticas en el injerto de TCR reactivos frente a KRASG12D El clonotipo de linfocitos T infundido más dominante (~7,3 x 1010 células) no se detectó en la sangre 40 días después de la transferencia celular, mientras que los clones de linfocitos T reactivos frente a KRASG12D restantes se detectaron en este punto de tiempo (figs. 2A-2D). Los clones de linfocitos T reactivos frente a KRASG12D que persisten en la sangre periférica representaron un 10,4 %, 4,5 % y 0,005 % de todos los linfocitos T de sangre periférica aproximadamente 9 meses después de la transferencia celular, y el clon de linfocitos T más dominante en la sangre periférica en ese momento era el TCR reactivo frente a KRASG12D mutante TRBV10-02 (figs. 2A-2D y tabla 5). No parecía haber un enriquecimiento de los clones de linfocitos T reactivos frente a KRASG12D en el tumor que progresaba en relación con la sangre periférica (figs. 2A-2D).

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra la especificidad y sensibilidad de los TCR reactivos frente a KRASG12D.

La secuencia de nucleótidos que codifica el TCR se clonó a partir de cada uno de los cuatro clonotipos de linfocitos T reactivos frente a KRASG12D del ejemplo 1. Cada TCR se clonó en un vector retrovírico MSGV1. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas alfa y beta de cada uno de los cuatro TCR se muestran en la tabla 6.

TABLA 6

La secuencia de nucleótidos clonada en el vector retrovírico MSGV1 codificaba la región variable de la cadena alfa de TCR (mostrada en la tabla 6) y la región constante de la cadena alfa de TCR murina, seguido de una secuencia conectora P2A (SEQ ID NO: 58) y una secuencia de nucleótidos que codificaba la región variable de la cadena beta de TCR (mostrada en la tabla 6) y la región constante de la cadena beta de TCR murina. El TCR se modificó además para que incluyera sustituciones con cisteína en la región constante murina de ambas de las cadenas a y p en combinación con una sustitución/sustituciones de tres aminoácidos en el dominio TM de la región constante murina de la cadena alfa con un aminoácido hidrófobo. La secuencia de aminoácidos de longitud completa de cada uno de los cuatro TCR se muestra en la tabla 7. Sin ceñirse a una teoría o mecanismo particular, se cree que las cadenas constantes alfa y beta de TCR murina pueden disminuir el emparejamiento erróneo con los TCR endógenos y pueden promover la expresión de los TCR introducidos por las células huésped. También se cree que la expresión y el emparejamiento potenciados de las cadenas alfa y beta de TCR introducidas se pueden lograr incorporando aminoácidos hidrófobos en la cadena constante alfa de TCR e introduciendo un segundo enlace disulfuro entre las regiones constantes de las cadena alfa y beta.

TABLA 7

Los linfocitos T autólogos de sangre periférica se genomanipularon para expresar uno de estos cuatro TCR . La expresión en la superficie celular de los TCR introducidos se evaluó el día l0 después de la modificación del gen TCR por análisis por citometría de flujo para la región constante de TCR-p murina (mTCR-p), puesto que los TCR se diseñaron con las regiones constantes alfa y beta de TCR murinas. Las células transducidas con vector sirvieron como control negativo. Los datos se seleccionaron en linfocitos T CD8+. El porcentaje de células que expresan la región constante p de TCR murina se muestra en la tabla 8.

TABLA 8

Los linfocitos T genomanipulados con TCR se cocultivaron durante la noche con PBMC autólogas incubadas con cantidades de valoración de péptidos nanómero o decámero de KRAS natural (WT) o mutante con G12D. Se midió el porcentaje de células que expresaban el marcador de activación de linfocitos T 4-1BB. Los resultados se muestran en las figuras 3A-3D. Tres de los cuatro TCR fueron preferentemente reactivos frente al péptido KRASG12D de 9 aminoácidos de longitud GADGVGKSA (SEQ ID NO: 8), mientras que un TCR solo fue reactivo frente al péptido KRASG12D de 10 aminoácidos de longitud GADGVGKSAL (SEQ ID NO: 6) (figs. 3A-3D). Todos los TCR fueron específicos para la mutación y no reconocieron los péptidos KRAS naturales (figs. 3A-3D). Los experimentos de valoración de péptidos demostraron que los TCR podían reconocer péptidos a concentraciones entre 1 y 10 nM cuando se pulsaban sobre PBMC autólogas (figs. 3A-3D).

Los linfocitos T genomanipulados con TCR se cocultivaron durante la noche con una de las dos líneas de células de cáncer de páncreas positivas para KRASG12D (MDA-Panc48 o HPAC) que no expresaban o expresaban el alelo HLA-C*08:02. La secreción de IFN-y se midió por el ensayo ELISPO T y la expresión de 4-1BB se midió por citometría de flujo. Los resultados se muestran en las figuras 4A-4B. Los TCR reconocieron específicamente las líneas de células de cáncer de páncreas solo cuando expresaron tanto la mutación KRASG12D como el alelo HLA-C*08:02 (figs. 4A-4B).

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra que las células transducidas para expresar el TCR con TRAV12-2/TRBV10-2 (SEQ ID NO: 56 y 57) reconocen KRAS mutado en el contexto del alelo HLA C*08:02 o C*05:01.

Se genomanipularon linfocitos T autólogos de sangre periférica para expresar uno de los cuatro TCR como se describe en el ejemplo 2. Las células COS7 se cotransfectaron con genes KRAS natural (wt) o KRAS-G12D de longitud completa y el alelo HLA C*07:01, C*08:02 o C*05:01, seguido de cocultivo con las células transducidas con TCR reactivo frente a KRASG12D indicadas. Al día siguiente, se analizaron las células en cuanto a la expresión de 4-1BB por citometría de flujo. Los resultados se muestran en las figuras 5A-5D. Los datos se seleccionaron en linfocitos T CD8+ transducidos para TCR (TCRp+ de ratón). HLA-C*07:01 sirvió como alelo HLA de control negativo.

El uso de los términos "uno" y "una" y "el/la" y "al menos uno" y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se debe interpretar de modo que cubra tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otro modo en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. El uso del término "al menos uno" seguido de una lista de uno o más elementos (por ejemplo, "al menos uno de A y B") se debe interpretar para que se entienda como un elemento seleccionado de los elementos enumerados (A o B) o cualquier combinación de dos o más de los elementos enumerados (A y B), a menos que se indique de otro modo en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" se deben interpretar como términos abiertos (es decir, que signifiquen "incluyendo, pero sin limitarse a") a menos que se advierta de otro modo. Se pretende que la enumeración de intervalos de valores en el presente documento sirva meramente como un procedimiento abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique de otro modo en el presente documento, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se enumerara individualmente en el presente documento. Todos los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otro modo en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Se pretende que el uso de todos y cada uno de los ejemplos o terminología ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en el presente documento sea meramente para iluminar mejor la invención y no plantea una limitación sobre el alcance de la invención a menos que se reivindique de otro modo. Ninguna terminología en la memoria descriptiva se debe interpretar como que indica que cualquier elemento no reivindicado es esencial para la práctica de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un TCR específico para KRAS G12D aislado o purificado que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9-11 e (i) SEQ ID NO: 12-14 o (ii) SEQ ID NO: 20-22.

2. El TCR aislado o purificado de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 16 o (ii) SEQ ID NO: 24.

3. El TCR aislado o purificado de la reivindicación 2, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e (i) SEQ ID NO: 16 o (ii) SEQ ID NO: 24.

4. El TCR aislado o purificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende además:

(i) X en la posición 48 de SEQ ID NO: 46 es Thr o Cys;

(iv) X en la posición 115 de SEQ ID NO: 46 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp;

y

5. El TCR aislado o purificado de la reivindicación 4, que comprende:

(A) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, en la que:

(i) X en la posición 48 de SEQ ID NO: 46 es Thr o Cys;

y

6. El TCR aislado o purificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende secuencias de aminoácidos al menos un 99 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 50 y 51 o (ii) SEQ ID NO: 50 y 53.

7. El TCR aislado o purificado de la reivindicación 6, que comprende las secuencias de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 50 y 51 o (ii) SEQ ID NO: 50 y 53.

8. Un polipéptido específico para KRAS G12D aislado o purificado que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9-11 e (i) SEQ ID NO: 12-14 o (ii) SEQ ID NO: 20-22

opcionalmente en el que el polipéptido comprende además:

(i) X en la posición 48 de SEQ ID NO: 46 es Thr o Cys;

y

9. El polipéptido específico para KRAS G12D aislado o purificado de la reivindicación 8, en el que el polipéptido comprende:

(A) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, en la que:

(i) X en la posición 48 de SEQ ID NO: 46 es Thr o Cys;

y

10. El polipéptido aislado o purificado de la reivindicación 8 o 9, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 16 o (ii) SEQ ID NO: 24.

11. El polipéptido aislado o purificado de la reivindicación 10, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e (i) SEQ ID NO: 16 o (ii) SEQ ID NO: 24.

12. El polipéptido aislado o purificado de una cualquiera de la reivindicación 8-11, que comprende secuencias de aminoácidos al menos un 99 % idénticas a las secuencias de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 50 y 51 o (ii) SEQ ID NO: 50 y 53.

13. El polipéptido aislado o purificado de la reivindicación 12, que comprende las secuencias de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 50 y 51 o (ii) SEQ ID NO: 50 y 53.

14. Una proteína específica para KRAS G12D aislada o purificada que comprende (a) una primera cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9-11 y una segunda cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12-14; o (b) una primera cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9-11 y una segunda cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 20-22 opcionalmente en la que:

(A) la primera cadena polipeptídica comprende además una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, en la que:

(i) X en la posición 48 de SEQ ID NO: 46 es Thr o Cys;

y

15. La proteína específica para KRAS G12D aislada o purificada de la reivindicación 14, en la que:

(A) la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, en la que:

(i) X en la posición 48 de SEQ ID NO: 46 es Thr o Cys;

(iii) X en la posición 114 de SEQ ID NO: 46 es Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe o Trp; y (iv) X en la posición 115 de SEQ ID NO: 46 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp;

y

(B) la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, en la que X en la posición 57 de SEQ ID NO: 47 es Ser o Cys.

16. La proteína aislada o purificada de la reivindicación 14 o 15 que comprende (i) una primera cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una segunda cadena polipeptídica que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; o

(ii) una primera cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una segunda cadena polipeptídica que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

17. La proteína aislada o purificada de la reivindicación 16 que comprende (i) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; o

(ii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

18. La proteína aislada o purificada de una cualquiera de las reivindicaciones 14-17, en la que: (1) la primera cadena polipeptídica comprende una cadena de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y la segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; o

(2) la primera cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y la segunda cadena polipeptídica comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.

19. La proteína aislada o purificada de la reivindicación 18, en la que: (1) la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51; o (2)

la primera cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 y la segunda cadena polipeptídica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.

20. Un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13, la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 14-19 o un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico.

21. Una célula huésped aislada o purificada que comprende el vector de expresión recombinante de la reivindicación 20 o una población de células huésped que comprende al menos una de las células huésped aisladas o purificadas.

22. Una composición farmacéutica que comprende el TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13, la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 14-19, el ácido nucleico de la reivindicación 20, el vector de expresión recombinante de la reivindicación 20, la célula huésped de la reivindicación 21, o la población de células huésped de la reivindicación 21, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23. Un procedimiento de detección de la presencia de cáncer en un mamífero, comprendiendo el procedimiento:

(a) poner en contacto una muestra que comprende células de cáncer con el TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13, la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 14-19, el ácido nucleico de la reivindicación 20, el vector de expresión recombinante de la reivindicación 20, la célula huésped de la reivindicación 21, la población de células huésped de la reivindicación 21, o la composición farmacéutica de la reivindicación 22, formando, de este modo, un complejo; y

(b) detectar el complejo,

en el que la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero, opcionalmente en el que el cáncer es cáncer de páncreas, colorrectal, de pulmón, de endometrio, de ovario o de próstata.

24. El TCR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13, la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 14-19, el ácido nucleico de la reivindicación 20, el vector de expresión recombinante de la reivindicación 20, la célula huésped de la reivindicación 21, la población de células huésped de la reivindicación 21, o la composición farmacéutica de la reivindicación 22 para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero, opcionalmente en el que el cáncer es cáncer de páncreas, colorrectal, de pulmón, de endometrio, de ovario o de próstata.