ES2718474T3 - Receptores murinos de células T anti-NY-ESO-1 - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores m urinos de células T anti-NY-ESO-1

Referencia cruzada a solicitud relacionada

Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Núm.

61/650.020, presentada el 22 de mayo de 2012.

Incorporación por referencia de m aterial presentado electrónicam ente

Se presenta una lista de secuencias de nucleótidos/aminoácidos legibles por ordenador junto con el presente documento y se identifica de la siguiente manera: un archivo ASCII (Texto) de 23.462 bytes denominado "713415ST25.TXT", con fecha 30 de abril de 2013.

Antecedentes de la invención

La terapia celular adoptiva puede representar un tratamiento eficaz para el cáncer en algunos pacientes. Sin embargo, todavía existen obstáculos para el éxito general de la terapia celular adoptiva. Por ejemplo, solo 50% de las muestras tumorales de melanoma pueden generar células T reactivas al tumor. La generación de células T reactivas al tumor a partir de cánceres distintos del melanoma también puede ser difícil. Además, muchos pacientes pueden no tener un tumor susceptible de resección quirúrgica. Por consiguiente, existe una necesidad de receptores de células T para su uso en el tratamiento de pacientes con cáncer.

Robbins et al. 2011 describen variantes del receptor de células T anti-NY-ESO-1 1G4 y muestran que la transferencia adoptiva de células T autólogas transducidas con un vector retroviral que codifica un TCR (una variante de 1 G4) contra NY-ESO-1aa157-165 media la regresión tumoral en pacientes con melanoma metastásico y sarcoma de células sinoviales.

Breve com pendio de la invención

La presente invención proporciona las siguientes realizaciones definidas en los apartados 1-14:

1. Un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de la cadena de CDR2 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 4, secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena beta de SEC ID NO: 8, y que tiene especificidad antigénica para NY-ESO-1 (SEQ ID NO: 1), preferiblemente en donde el TCR:

(a) tiene especificidad antigénica para NY-ESO-^1157-165 (SEQ ID NO: 2);

(b) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y 10; y/o

(c) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y 12.

2. Un polipéptido aislado o purificado que comprende una porción funcional del TCR según el apartado 1, en donde la porción funcional se une específicamente a NY-ESO-1 y comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de amino ácidos de CDR2 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena beta de SEQ ID NO: 8, preferiblemente en donde la porción comprende la secuencia de aminoácidos de:

(a) SEQ ID NO: 9 o 10, o ambas SEQ ID NO: 9 y 10; o

(b) SEQ ID NO: 11 o 12, o ambas SEQ ID NO: 11 y 12.

3. Una proteína aislada o purificada, que se une específicamente a NY-ESO-1 y comprende todas las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8 de acuerdo con el apartado 2, preferiblemente en donde la proteína comprende:

(a) una primera cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-5 y una segunda cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6-8;

(b) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; o (c) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

4. Una proteína de fusión que comprende la proteína aislada o purificada de acuerdo con el apartado 3.

5. Un anticuerpo recombinante que comprende la proteína aislada o purificada de acuerdo con el apartado 3 o 4.

6. Un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el TCR de acuerdo con el apartado 1, el polipéptido de acuerdo con el apartado 2, o la proteína de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 3-5, preferiblemente en donde la secuencia de nucleótidos

(a) tiene codones optimizados, y/o

(b) comprende SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, ambos SEQ ID NO: 15 y 16, o ambos SEQ ID NO: 19 y 20.

7. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de acuerdo con el apartado 6. 8. El vector de expresión recombinante de acuerdo con el apartado 7, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 5 se encuentra 5' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena beta de SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena beta de SEQ ID NO: 8, preferiblemente en donde el vector de expresión recombinante comprende SEQ ID NO: 17. 9. El vector de expresión recombinante de acuerdo con el apartado 7, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 5 se encuentra 3' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena beta de SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena beta de SEQ ID NO: 8, preferiblemente en donde el vector de expresión recombinante comprende SEQ ID NO: 18. 10. Una célula anfitriona aislada que comprende el vector de expresión recombinante de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 7-9, preferiblemente en donde la célula es humana.

11. Una población de células que comprende al menos una célula anfitriona de acuerdo con el apartado 10.

12. Una composición farmacéutica que comprende el TCR de acuerdo con el apartado 1, el polipéptido de acuerdo con el apartado 2, la proteína de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 3-5, el ácido nucleico de acuerdo con el apartado 6, el vector de expresión recombinante de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 7- 9, la célula anfitriona de acuerdo con el apartado 10, o la población de células de acuerdo con el apartado 11, y un portador farmacéuticamente aceptable.

13. Un método in vitro para detectar la presencia de cáncer en un mamífero, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra que comprende una o más células del mamífero con el TCR de acuerdo con el apartado 1, el polipéptido de acuerdo con el apartado 2, la proteína de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 3-5, el ácido nucleico de acuerdo con el apartado 6, vector de expresión recombinante de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 7-9, la célula anfitriona de acuerdo con el apartado 10, la población de células de acuerdo con el apartado 11, o la composición farmacéutica de acuerdo con el apartado 12, formando así un complejo, y

(b) detectar el complejo, en donde la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero,

preferiblemente, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de ovario o sarcoma de células sinoviales.

14. El TCR de acuerdo con el apartado 1, el polipéptido de acuerdo con el apartado 2, la proteína de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 3-5, el ácido nucleico del apartado 6, el vector de expresión recombinante de acuerdo con uno cualquiera de los apartados 7-9, la célula anfitriona de acuerdo con el apartado 10, la población de células de acuerdo con el apartado 11, o la composición farmacéutica de acuerdo con el apartado 12, para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero, preferiblemente en donde el cáncer es melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de ovario o sarcoma de células sinoviales.

En la presente memoria se describe un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que tiene especificidad antigénica para NY-ESO-1 y que comprende una región variable murina. La descripción también se refiere a polipéptidos y proteínas relacionados, así como a ácidos nucleicos relacionados, vectores de expresión recombinantes, células anfitrionas y poblaciones de células. La invención proporciona adicionalmente anticuerpos, o una porción de unión a antígeno de los mismos, y composiciones farmacéuticas relacionadas con los TCR de la invención.

Adicionalmente se describen en la presente memoria métodos para detectar la presencia de cáncer en un mamífero y métodos para el tratamiento o la prevención del cáncer en un mamífero. El método para detectar la presencia de cáncer en un mamífero comprende (i) poner en contacto una muestra que comprende células del cáncer con cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células anfitrionas, poblaciones de células anfitrionas, o anticuerpos, o partes de unión a antígeno de los mismos de la invención, descritos en la presente memoria, formando así un complejo, y (ii) detectar el complejo, en donde la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero.

El método para el tratamiento o la prevención del cáncer en un mamífero descrito en la presente memoria comprende administrar al mamífero cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria, cualquier ácido nucleico o vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas descritos en la presente memoria, o cualquier célula anfitriona o población de células anfitrionas que comprende un vector recombinante que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria, en una cantidad eficaz para tratar 0 prevenir el cáncer en el mamífero.

Breve descripción de las diversas vistas de los d ibujos

Las Figuras 1A y 1B son gráficas que muestran la secreción de interferón (IFN)-y por células T humanas CD8+ (Fig. 1A) o CD4+ (Fig. 1B) transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (círculos sombreados) o un TCR anti-NY-ESO-1 humano (círculos sin sombrear) después del cultivo simultáneo con células dendríticas pulsadas con diversas concentraciones de NY-ESO-I^157-165.

Las Figuras 2A y 2B son gráficas que muestran la secreción de IFN-y por células T humanas CD8+ (Fig. 2A) o CD4+ (Fig. 2B) transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (barras sombreadas) o un TCR anti-NY-ESO-1 humano (barras sin sombrear) cultivadas solas (medios) cultivadas simultáneamente con células T2 pulsadas con péptido de control, células T2 pulsadas con péptido NY-ESO^-1157-165, o una de varias líneas celulares de tumores 888mel (NY-ESO-1'), Sk23mel (NY-ESO-1'), COA-A2-CEA (NY-ESO-1'), A375mel (NY-ESO-1*), 1363mel (NY-ESO-1+), o COS-A2-ESO (NY-ESO-1+).

Descripción detallada de la invención

En la presente memoria se describe un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que tiene especificidad antigénica para NY-ESO-1 y que comprende una región variable murina. NY-ESO-1 es un antígeno de cáncer testicular (CTA), que se expresa solo en las células tumorales y en las células germinales que no expresan MHC de los testículos y la placenta. NY-ESO-1 se expresa en una variedad de cánceres humanos que incluyen, pero no se limitan a, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de ovario y sarcoma de células sinoviales. La proteína NY-ESO-1 puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en SEQ ID NO: 1.

El TCR puede tener especificidad antigénica para cualquier proteína, polipéptido o péptido NY-ESO-1. El TCR puede tener especificidad antigénica para una proteína NY-ESO-1 que comprende, que consiste en, o consiste esencialmente en, SEQ ID NO: 1.

El TCR puede tener especificidad antigénica para un péptido NY-ESO-1 157-165 que comprende, que consiste en, o consiste esencialmente en, SLLMWITQC (SEQ ID NO: 2).

La expresión "que tiene especificidad antigénica" como se emplea en la presente memoria significa que el TCR se puede unir específicamente y reconocer inmunológicamente a NY-ESO-1, de modo que la unión del TCR a NY-ESO-1 provoque una respuesta inmunitaria.

Los TCR descritos en la presente memoria son capaces de reconocer NY-ESO-1 de una manera dependiente de la clase I del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Por "manera dependiente de la clase I del MHC", como se emplea en la presente memoria, significa que el TCR provoca una respuesta inmunitaria al unirse a NY-ESO-1 dentro del contexto de una molécula de la clase I del MHC. La molécula de clase I del MHC puede ser cualquier molécula de clase I del MHC conocida en la técnica, p. ej., moléculas HLA-A.

La molécula de clase I del MHC puede ser una molécula HLA-A2.

Los TCR descritos en la presente memoria pueden comprender una región variable murina. Los TCR pueden comprender adicionalmente una región constante derivada de cualquier especie adecuada tal como, p. ej., humano o ratón. Preferiblemente, los TCR comprenden adicionalmente una región constante murina. En una realización especialmente preferida, los TCR de la invención son TCR murinos que comprenden tanto una región variable murina como una región constante murina.

Como se emplea en la presente memoria, el término "murino", cuando se refiere a un TCR o cualquier componente de un TCR descrito en la presente memoria (p. ej., región determinante de la complementariedad (CDR), región variable, región constante, cadena alfa y/o cadena beta), significa un TCR (o componente del mismo) que se obtiene de un ratón, es decir, un TCR (o componente del mismo) que se originó o fue expresado, de una vez, por una célula T de ratón. Deseablemente, el TCR (o componente del mismo) se expresa sobre la superficie de una célula anfitriona humana.

Los TCR descritos en la presente memoria proporcionan muchas ventajas, incluso cuando se utilizan para la transferencia de células adoptiva. Por ejemplo, sin estar limitado por una teoría o mecanismo particular, se cree que debido a que NY-ESO-1 es expresada por células de múltiples tipos de cáncer, los TCR de la invención proporcionan ventajosamente la capacidad de destruir células de múltiples tipos de cáncer y, por consiguiente, de tratar o prevenir múltiples tipos de cáncer. Además, sin estar limitado por una teoría o mecanismo particular, se cree que debido a que NY-ESO-1 es un antígeno de cáncer testicular que se expresa solamente en células tumorales y células germinales de los testículos y placenta que no expresan ^m H^c , los TCR descritos en la presente memoria se dirigen ventajosamente a la destrucción de células cancerosas mientras minimizan o eliminan la destrucción de células normales no cancerosas, reduciendo de ese modo, por ejemplo, minimizando o eliminando, la toxicidad. También se cree que los TCR murinos pueden proporcionar una mayor expresión (p. ej., un mayor número de TCR) sobre la superficie de una célula anfitriona humana y/o una mayor funcionalidad (según lo medido, por ejemplo, mediante la liberación de citocinas y la citotoxicidad) en comparación con un TCR humano. Sin estar limitados por una teoría particular del mecanismo, se cree que la mejora de la expresión y/o la funcionalidad es el resultado de una reducción en la mezcla de cadenas de t Cr endógenas y exógenas (transducidas) en la célula anfitriona. Por consiguiente, se cree que los TCR murinos pueden reemplazar a los TCR endógenos sobre la superficie de una célula anfitriona humana más eficazmente que un TCR humano exógeno. También se cree que los TCR murinos proporcionan un mejor emparejamiento de cadenas de TCR y/o mejores interacciones con el complejo CD3 de la célula anfitriona humana en comparación con los TCR humanos exógenos expresados por una célula anfitriona humana.

En la presente memoria se describe un TCR que comprende dos polipéptidos (es decir, cadenas polipeptídicas), tales como una cadena a de un TCR, una cadena p de un TCR, una cadena y de un TCR, una cadena 8 de un TCR, o una combinación de las mismas. Los polipéptidos del TCR de la invención pueden comprender cualquier secuencia de aminoácidos, siempre que el TCR tenga especificidad antigénica para NY-ESO-1 y comprenda una región variable murina.

El TCR descrito en la presente memoria puede comprender dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales comprende una región variable que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR) 1, una CDR2 y una CDR3 de un TCR. Preferiblemente, la primera cadena polipeptídica comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (CDR1 de la cadena a), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (CDR2 de la cadena a) y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (CDR3 de la cadena a), y la segunda cadena polipeptídica comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (CDR1 de la cadena p), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (CDR2 de la cadena p), y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (CDR3 de la cadena p). A este respecto, el TCR de la invención puede comprender las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3-5, 6-8 y 3-8. Preferiblemente, el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8.

De forma alternativa o adicional, el TCR puede comprender una secuencia de aminoácidos de una región variable de un TCR que comprende las CDR expuestas anteriormente. A este respecto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (la región variable de una cadena a) o 10 (la región variable de una cadena p), o ambos SEQ ID NO: 9 y 10. Preferiblemente, el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y 10.

De forma alternativa o adicional, el TCR puede comprender una cadena a de un TCR y una cadena p de un TCR. Cada una de la cadena a y la cadena p del TCR de la invención puede comprender independientemente cualquier secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, la cadena a comprende la región variable de una cadena a como se expuso anteriormente. A este respecto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Un TCR de este tipo se puede emparejar con cualquier cadena p de un TCR. Preferiblemente, la cadena p del TCR comprende la región variable de una cadena p como se expuso anteriormente. A este respecto, el ^t C^r puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. El TCR de la invención, por lo tanto, puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 12, o ambos SEQ ID NO: 11 y 12. Preferiblemente, el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y 12.

También se describe en la presente memoria un polipéptido aislado o purificado que comprende una porción funcional de cualquiera de los TCR descritos en la presente memoria. El término "polipéptido" como se emplea en la presente memoria incluye oligopéptidos y se refiere a una sola cadena de aminoácidos conectados por uno o más enlaces peptídicos.

Con respecto a los polipéptidos, la porción funcional puede ser cualquier porción que comprenda aminoácidos contiguos del TCR del que forma parte, siempre que la porción funcional se una específicamente a NY-ESO-1. El término "porción funcional" cuando se utiliza en referencia a un TCR se refiere a cualquier parte o fragmento del TCR descrito en la presente memoria, cuya parte o fragmento conserva la actividad biológica del TCR del cual forma parte (el TCR original). Las porciones funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas partes de un TCR que conservan la capacidad de unirse específicamente a NY-ESO-1, o de detectar, tratar o prevenir el cáncer, en una medida similar, en la misma medida o en una medida mayor, que el TCR original. En referencia al TCR original, la porción funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% o más del TCR original.

La porción funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxi de la porción, o en ambos extremos, cuyos aminoácidos adicionales no se encuentran en la secuencia de aminoácidos del TCR original. Deseablemente, los aminoácidos adicionales no interfieren en la función biológica de la porción funcional, p. ej., específicamente la unión a NY-ESO-1, que tiene la capacidad de detectar cáncer, tratar o prevenir el cáncer, etc. Más deseablemente, los aminoácidos adicionales potencian la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del TCR original.

El polipéptido puede comprender una porción funcional de una o ambas de las cadenas a y p de los TCR, tal como una porción funcional que comprende una o más de CDR1, CDR2 y CDR3 de las regiones variables de la cadena a y/o cadena p de un TCR. A este respecto, el polipéptido puede comprender una porción funcional que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (CDR1 de la cadena a), 4 (CDR2 de la cadena a), 5 (CDR3 de la cadena a), 6 (CDR1 de p cadena), 7 (CDR2 de la cadena p), 8 (CDR3 de la cadena p), o una combinación de los mismos. Preferiblemente, el polipéptido comprende una porción funcional que comprende SEQ ID NO: 3-5, 6-8, o la totalidad de SEQ ID NO: 3-8. Más preferiblemente, el polipéptido comprende una porción funcional que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8.

De manera alternativa o adicional, el polipéptido puede comprender, por ejemplo, la región variable del TCR de la invención que comprende una combinación de las regiones CDR expuestas anteriormente. A este respecto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (la región variable de una cadena a) o 10 (la región variable de una cadena p), o ambos SEQ ID NO: 9 y 10. Preferiblemente , el polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y 10.

De manera alternativa o adicional, el polipéptido puede comprender la longitud completa de una cadena a o p de uno de los TCR descritos en la presente memoria. A este respecto, el polipéptido de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 12. Alternativamente, el polipéptido puede comprender ambas cadenas de los TCR descritos en la presente memoria. Por ejemplo, el polipéptido de la invención puede comprender ambas secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y 12.

La descripción proporciona adicionalmente una proteína aislada o purificada que comprende al menos uno de los polipéptidos descritos en la presente memoria. Por "proteína" se entiende una molécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas.

La proteína descrita en la presente memoria puede comprender una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. La proteína descrita en la presente memoria puede comprender, por ejemplo, una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. En este caso, la proteína de la invención puede ser un TCR. Alternativamente, si, por ejemplo, la proteína comprende una sola cadena polipeptídica que comprende SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, o si la primera y/o segunda cadenas polipeptídicas de la proteína comprenden adicionalmente otras secuencias de aminoácidos, p. ej., una secuencia de aminoácidos que codifica una inmunoglobulina o una porción de la misma, en ese caso la proteína puede ser una proteína de fusión. A este respecto, la invención también proporciona una proteína de fusión que comprende al menos uno de los polipéptidos descritos en la presente memoria junto con al menos otro polipéptido. El otro polipéptido puede existir como un polipéptido separado de la proteína de fusión, o puede existir como un polipéptido, que se expresa en marco (en tándem) con uno de los polipéptidos descritos en la presente memoria. El otro polipéptido puede codificar cualquier molécula peptídica o proteica, o una porción de la misma, que incluya, pero no se limite a, una inmunoglobulina, CD3, CD4, c D8, una molécula de MhC, una molécula de CD1, p. ej., CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, etc. .

La proteína de fusión puede comprender una o más copias del: polipéptido y/o una o más copias del otro polipéptido. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o más, copias del polipéptido y/o del otro polipéptido. Los métodos adecuados para elaborar proteínas de fusión son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, métodos recombinantes. Véase, por ejemplo, Choi et al., Mol. Biotecnol. 31: 193-202 (2005).

En algunas realizaciones, los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención (que incluyen porciones funcionales y variantes funcionales) se pueden expresar como una proteína única que comprende un péptido conector que conecta la cadena a y la cadena p. Se puede utilizar cualquier péptido conector adecuado para conectar la cadena a y la cadena p en los TCR, polipéptidos y proteínas (que incluyen porciones funcionales y variantes funcionales) de la invención. En una realización, el péptido conector es un péptido 2A de picornavirus. A este respecto, los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención (que incluyen porciones funcionales y variantes funcionales) pueden comprender adicionalmente un péptido conector que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 13. El péptido conector puede facilitar ventajosamente la expresión de un TCR, polipéptido y/o proteína recombinantes en una célula anfitriona. Tras la expresión de la construcción que incluye el péptido conector por una célula anfitriona, el péptido conector se puede escindir, dando como resultado cadenas a y p separadas.

La proteína descrita en la presente memoria puede ser un anticuerpo recombinante que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención descritos en la presente memoria. Como se emplea la presente memoria, "anticuerpo recombinante" se refiere a una proteína recombinante (p. ej., modificada genéticamente) que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención y una cadena polipeptídica de un anticuerpo, o una porción de la misma. El polipéptido de un anticuerpo, o una porción del mismo, puede ser una cadena pesada, una cadena ligera, una región variable o constante de una cadena pesada o ligera, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv), o un fragmento Fc, Fab o F(ab)² ' de un anticuerpo, etc. La cadena polipeptídica de un anticuerpo, o una porción del mismo, puede existir como un polipéptido separado del anticuerpo recombinante. Alternativamente, la cadena polipeptídica de un anticuerpo, o una porción del mismo, puede existir como un polipéptido, que se expresa en marco (en tándem) con el polipéptido de la invención. El polipéptido de un anticuerpo, o una porción del mismo, puede ser un polipéptido de cualquier anticuerpo o cualquier fragmento de anticuerpo, incluyendo cualquiera de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo descritos en la presente memoria.

En la presente memoria se describen variantes funcionales de los TCR, polipéptidos y proteínas descritos en la presente memoria. El término "variante funcional", como se emplea en la presente memoria, se refiere a un TCR, polipéptido o proteína que tienen una identidad de secuencia sustancial o significativa o similitud con un TCR, polipéptido o proteína originales, cuya variante funcional conserva la actividad biológica del TCR, polipéptido o proteína de los cuales es una variante. Las variantes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas variantes del TCR, polipéptido o proteína descritos en la presente memoria (el TCR, polipéptido o proteína originales) que conservan la capacidad de unirse específicamente a NY-ESO-1 en un grado similar, el mismo grado, o en mayor grado, que el TCR, polipéptido o proteína originales. En referencia al TCR, polipéptido o proteína originales, la variante funcional puede tener una secuencia de aminoácidos, por ejemplo, idéntica en al menos aproximadamente 30%, 50%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más al TCR, polipéptido o proteína originales.

La variante funcional puede, por ejemplo, comprender la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína originales con al menos una sustitución de aminoácido conservativa. Las sustituciones conservativas de aminoácidos son conocidas en la técnica e incluyen sustituciones de aminoácidos en las que un aminoácido que tiene ciertas propiedades físicas y/o químicas se intercambia por otro aminoácido que tiene las mismas propiedades químicas o físicas. Por ejemplo, la sustitución de aminoácidos conservativa puede ser un aminoácido ácido sustituido por otro aminoácido ácido (p. ej., Asp o Glu), un aminoácido con una cadena lateral no polar sustituida por otro aminoácido con una cadena lateral no polar (p. ej., Ala), Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, etc.), un aminoácido alcalino sustituido por otro aminoácido alcalino (Lys, Arg, etc.), un aminoácido con una cadena lateral polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral polar (Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc.), etc.

De manera alternativa o adicional, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína originales con al menos una sustitución de aminoácido no conservativa. En este caso, es preferible que la sustitución de aminoácidos no conservativa no interfiera en o inhiba la actividad biológica de la variante funcional. Preferiblemente, la sustitución de aminoácidos no conservativa aumenta la actividad biológica de la variante funcional, de modo que la actividad biológica de la variante funcional aumenta en comparación con el TCR, polipéptido o proteína originales.

El TCR, el polipéptido o la proteína pueden consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos especificadas descritas en la presente memoria, de modo que otros componentes de la variante funcional, p. ej., otros aminoácidos, no cambien materialmente la actividad biológica de la variante funcional. A este respecto, el TCR, el polipéptido o la proteína pueden, por ejemplo, consistir esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 12, o ambos SEQ ID NO: 11 y 12. También, por ejemplo, los TCR, los polipéptidos o las proteínas pueden consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos de SEQ ID ⁿO: 9 o 10, o ambos SEQ ID NO: 9 y 10. Además, los TCR, polipéptidos o proteínas pueden consistir esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (CDR1 de cadena a), 4 (CDR2 de cadena a), 5 (CDR3 de cadena a), 6 (CDR1 de cadena p), 7 (CDR2 de cadena p), 8 (CDR3 de cadena p), o cualquier combinación de los mismos, p. ej., SEQ ID NO: 3-5, 6-8, o 3-8.

Los TCR, polipéptidos y proteínas (incluyendo las porciones funcionales y las variantes funcionales) pueden tener cualquier longitud, es decir, pueden comprender cualquier número de aminoácidos, siempre que los TCR, polipéptidos o proteínas (o las porciones funcionales o las variantes funcionales de los mismos) conserven su actividad biológica, p. ej., la capacidad de unirse específicamente a NY-ESO-1, detectar cáncer en un mamífero, o tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, etc. Por ejemplo, el polipéptido puede tener una longitud de 50 a 5.000 aminoácidos, tal como 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 o más aminoácidos de longitud. En este sentido, los polipéptidos también incluyen oligopéptidos.

Los TCR, polipéptidos y proteínas (incluyendo las porciones funcionales y las variantes funcionales) de la invención pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos de origen natural. Tales aminoácidos sintéticos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexano carboxílico, norleucina, ácido a-amino n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometil-cisteína, trans-3- y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, p-fenilserina-p-hidroxifenilalanina, fenilglicina, a-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolino-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolino-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamiduro de ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metillisina, N',N'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido a-aminociclopentano carboxílico, ácido a-aminociclohexano carboxílico, ácido a-aminocicloheptano carboxílico, ácido a-(2-amino-2-norbornano)-carboxílico, ácido a,Y-diaminobutírico, ácido a,p-diaminopropiónico, homofenilalanina, y a-terc-butilglicina.

Los TCR, polipéptidos y proteínas (incluyendo las porciones funcionales y las variantes funcionales) se pueden glicosilar, amidar, carboxilar, fosforilar, esterificar, N-acilar, ciclar, por ejemplo, a través de un puente disulfuro, o convertir en una sal de adición de ácido y/u opcionalmente dimerizar o polimerizar, o conjugar.

Cuando los TCR, los polipéptidos y las proteínas (incluyendo las porciones funcionales y las variantes funcionales) están en forma de una sal, preferiblemente, los polipéptidos están en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen aquellas derivadas de ácidos minerales, tales como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos tales como los ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico y arilsulfónico, por ejemplo, ácido p- toluensulfónico.

El TCR, polipéptido y/o proteína (incluyendo las porciones funcionales y sus variantes funcionales) se pueden obtener por métodos conocidos en la técnica. Los métodos adecuados de síntesis de polipéptidos y proteínas de novo se describe en referencias, tales como Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwoood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; y Patente de Estados Unidos 5.449.752. Asimismo, los polipéptidos y proteínas se pueden producir recombinantemente utilizando los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria utilizando métodos recombinantes convencionales. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994. Adicionalmente, algunos de los TCR, polipéptidos y proteínas (incluyendo las porciones funcionales y las variantes funcionales de los mismos) se pueden aislar y/o purificar de una fuente, tal como una planta, una bacteria, un insecto, un mamífero, p. ej., un ratón, un ser humano, etc. Los métodos de aislamiento y purificación son bien conocidos en la técnica. Alternativamente, los TCR, polipéptidos y/o proteínas descritos en la presente memoria (incluyendo las porciones funcionales y las variantes funcionales de los mismos) pueden ser sintetizados comercialmente por compañías, tales como Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD) y Multiple Pepetide Systems (San Diego, CA). A este respecto, los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden ser sintéticos, recombinantes, aislados y/o purificados.

Adicionalmente, en la presente memoria se describen productos conjugados, p. ej., productos bioconjugados, que comprenden cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas de la invención (incluyendo cualquiera de las porciones o variantes funcionales de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células anfitrionas, poblaciones de células anfitrionas o anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos. Los productos conjugados, así como los métodos para sintetizar productos conjugados en general, son conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Hudecz, F., Methods Mol. Biol. 298: 209-223 (2005) y Kirin y col., Inorg Chem. 44 (15): 5405­ 5415 (2005)).

Adicionalmente, se proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria (incluyendo las porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos).

"Ácido nucleico", como se emplea en la presente memoria, incluye "polinucleótido", "oligonucleótido" y "molécula de ácido nucleico", y generalmente significa un polímero de ADN o ARN, que puede ser de hebra sencilla o de doble hebra, sintetizado u obtenido (p. ej., aislado y/o purificado) de fuentes naturales, que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que pueden contener un enlace internucleótido natural, no natural o alterado, tal como un enlace de fosforamidato o un enlace de fosforotioato, en lugar del fosfodiéster encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. Generalmente se prefiere que el ácido nucleico no comprenda ninguna inserción, deleción, inversión y/o sustitución. Sin embargo, puede ser adecuado en algunos casos, como se comenta en la presente memoria, que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones.

Preferiblemente, los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria son recombinantes. Como se emplea en la presente memoria, el término "recombinante" se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de las células vivas al unir segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos a moléculas de ácido nucleico que pueden replicar en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de los descritos en el apartado (i) anterior. Para los fines de la presente memoria, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo.

Los ácidos nucleicos se pueden construir basándose en la síntesis química y/o reacciones de ligación enzimática utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., más arriba, y Ausubel et al. más arriba. Por ejemplo, un ácido nucleico se puede sintetizar químicamente utilizando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de diferentes maneras diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (p. ej., derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina sustituida en N6, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracilo-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, uno o más de los ácidos nucleicos de la invención se pueden adquirir de compañías, tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX).

El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que codifique cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas, o partes funcionales o variantes funcionales de los mismos. Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que comprende, consiste en o consiste esencialmente en SEQ ID NO: 19 (cadena a de tipo salvaje) o SEQ ID NO: 20 (cadena p de tipo salvaje) o en ambos SEQ ID NO: 19 y 20.

En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos puede tener codones optimizados. Sin estar limitado por una teoría o mecanismo particular, se cree que la optimización de codones de la secuencia de nucleótidos aumenta la eficiencia de traducción de los transcritos de ARNm. La optimización de codones de la secuencia de nucleótidos puede implicar la sustitución de un codón nativo por otro codón que codifica el mismo aminoácido, pero que puede ser traducido por el ARNt que está más fácilmente disponible dentro de una célula, lo que aumenta la eficiencia de la traducción. La optimización de la secuencia de nucleótidos también puede reducir las estructuras secundarias del ARNm que podrían interferir en la traducción, aumentando de ese modo la eficacia de traducción. En una realización, la secuencia de nucleótidos con codones optimizados puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en SEQ ID NO: 15 (cadena a con codones optimizados), SEQ ID NO: 16 (cadena p con codones optimizados), SEQ ID NO: 21 (región variable de la cadena a con codones optimizados), SEQ ID NO: 22 (región variable de la cadena p) con codones optimizados, ambos SEQ ID NO: 15 y 16, ambos SEQ ID NO: 21 y 22, ambos SEQ ID NO: 15 y 20, o ambos SEQ ID NO: 16 y 19.

En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica los TCR, polipéptidos y proteínas (incluyendo las porciones funcionales y las variantes funcionales de los mismos) puede comprender adicionalmente una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los péptidos conectores descritos en la presente memoria con respecto a otros aspectos de la invención. En una realización, el péptido conector puede ser codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 14.

Adicionalmente, en la presente memoria se describe un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos aproximadamente 70% o más, p. ej., aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, o aproximadamente 99% a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria.

La secuencia de nucleótidos puede comprender alternativamente una secuencia de nucleótidos que está degenerada con respecto a SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, ambos SEQ ID NO: 15 y 16, ambos SEQ ID NO: 19 y 20, ambos SEQ ID NO: 21 y 22, ambos SEQ ID NO: 15 y 20, o ambos SEQ ID NO: 16 y 19. Preferiblemente, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 15, 16, 19, 20, 21 o 22, SEQ ID NO: 15 y 16, SEQ ID NO: 19 y 20, SEQ ID NO: 21 y 22, SEQ ID NO: 15 y 20, o SEQ ID NO: 16 y 19, o una secuencia de nucleótidos que está degenerada con respecto a los mismos.

Adicionalmente, se describe en la presente memoria un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria o una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria. .

La secuencia de nucleótidos que híbrida en condiciones rigurosas híbrida preferiblemente en condiciones de alta rigurosidad. Por "condiciones de alta rigurosidad" se entiende que la secuencia de nucleótidos hibrida específicamente con una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria) en una cantidad que es de forma detectable más fuerte que la hibridación no específica. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen condiciones que distinguirían un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta, o una que contenga solo algunos emparejamientos erróneos dispersos de una secuencia aleatoria que tenía algunas regiones pequeñas (p. ej., 3-10 bases) que coincidían con la secuencia de nucleótidos. Tales pequeñas regiones de complementariedad se funden más fácilmente que un complemento de longitud completa de 14-17 o más bases, y la hibridación de alta rigurosidad las hace fácilmente distinguibles. Las condiciones de rigurosidad relativamente altas incluirían, por ejemplo, condiciones de baja concentración de sal y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por NaCl aproximadamente 0,02-0,1 M o su equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50-70°C. Tales condiciones de alta rigurosidad toleran poca o ninguna discrepancia entre la secuencia de nucleótidos y el molde o hebra diana, y son particularmente adecuadas para detectar la expresión de cualquiera de los TCR de la invención. En general, se aprecia que las condiciones pueden ser más estrictas si se agregan cantidades crecientes de formamida.

Los ácidos nucleicos se pueden incorporar a un vector de expresión recombinante. A este respecto, la descripción proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. Para los fines de la presente memoria, el término "vector de expresión recombinante" significa una construcción de oligonucleótido o polinucleótido modificada genéticamente que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido por una célula anfitriona, cuando la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para expresar el ARNm, proteína, polipéptido o péptido dentro de la célula. Los vectores de la invención no son naturales en su conjunto. Sin embargo, partes de los vectores pueden ser naturales. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluyendo, pero no limitados a, ADN y ARN, que pueden ser de hebra sencilla o de doble hebra, sintetizados u obtenidos en parte de fuentes naturales, y pueden contener nucleótidos naturales, no naturales, o alterados. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender enlaces internucleotídicos de origen natural, de origen no natural, o ambos tipos de enlaces. Preferiblemente, los nucleótidos o enlaces internucleótidos de origen no natural o alterados no obstaculizan la transcripción o replicación del vector.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y se puede utilizar para transformar o transfectar cualquier célula anfitriona adecuada. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para la propagación y expansión o para la expresión o ambas, tales como plásmidos y virus. El vector se puede seleccionar del grupo que consiste en la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También se pueden utilizar vectores de bacteriófagos, tales como AGT10, AGT11, AZaplI (Stratagene), AEMBE4 y ANM1149. Los ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión animal incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). Preferiblemente, el vector de expresión recombinante es un vector viral, p. ej., un vector retroviral o un vector lentiviral.

Los vectores de expresión recombinantes se pueden preparar utilizando técnicas de ADN recombinante convencionales descritas, por ejemplo, por Sambrook et al. más arriba, y Ausubel et al. más arriba. Las construcciones de vectores de expresión, que son circulares o lineales, se pueden preparar para que contengan un sistema de replicación funcional en una célula anfitriona procariota o eucariota. Los sistemas de replicación pueden derivar, por ejemplo, de ColEl, del plásmido de 2 p, de A, de SV40, del virus del papiloma bovino y similares.

Deseablemente, el vector de expresión recombinante comprende secuencias reguladoras, tales como los codones de iniciación y terminación de la transcripción y traducción, que son específicos para el tipo de célula anfitriona (p. ej., bacteria, hongo, planta o animal) en el que se introducirá el vector, según sea apropiado y teniendo en cuenta si el vector está basado en ADN o ARN.

El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de células anfitrionas transformadas o transfectadas. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, p. ej., resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un anfitrión auxótrofo para proporcionar prototrofia, y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión de la invención incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.

El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor nativo o normativo unido operablemente a la secuencia de nucleótidos que codifica el TCR, polipéptido o proteína (incluyendo las porciones funcionales y las variantes funcionales de los mismos), o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria o que hibrida con la secuencia de nucleótidos codifica el TCR, polipéptido o proteína. La selección de promotores, p. ej., fuerte, débil, inducible, específico de tejido y específico del desarrollo, está dentro del conocimiento práctico del profesional. De manera similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también está dentro del conocimiento práctico del profesional. El promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, p. ej., un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV y un promotor encontrado en la repetición terminal larga del virus de células madre murinas.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden diseñar para la expresión transitoria, para la expresión estable o para ambas. Además, se pueden elaborar vectores de expresión recombinantes para la expresión constitutiva o para la expresión inducible. Adicionalmente, se pueden elaborar vectores de expresión recombinantes para que incluyan un gen suicida.

Como se emplea en la presente memoria, el término "gen suicida" se refiere a un gen que hace que la célula que expresa el gen suicida muera. El gen suicida puede ser un gen que confiere sensibilidad a un agente, p. ej., un fármaco, a la célula en la que se expresa el gen, y hace que la célula muera cuando la célula se pone en contacto o se expone al agente. Los genes suicidas son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Center for Cancer Therapeutics en el Instituto de Investigación del Cáncer, Sutton, Surrey, Reino Unido), Humana Press, 2004) e incluyen, por ejemplo, el gen de la timidina quinasa (TK) del Virus del Herpes Simple (HSV), la citosina daminasa, la purina nucleósido fosforilasa y la nitrorreductasa.

Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena alfa posicionada en 5' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena beta. A este respecto, una realización proporciona un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una c Dr 1a, CDR2a, CDR3a, CDR1p, CDR2p y CDR3p, y la secuencia de nucleótidos que codifica la CDR1a, CDR2a y CDR3a se encuentra en 5' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica CDR1p, CDR2p y CDR3p. Del mismo modo, la secuencia de nucleótidos que codifica la CDR1p, CDR2p y CDR3p puede encontrarse en 3' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la CDR1a, CDR2a y CDR3a.

El vector de expresión recombinante puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de la cadena alfa y una región variable de la cadena beta, y la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena alfa se encuentra en 5' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena beta. Del mismo modo, la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena beta puede encontrarse en 3' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena alfa.

Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena alfa y una cadena beta, y la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa se encuentra en 5' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta. Del mismo modo, la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta puede encontrase en 3' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa. El vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena alfa posicionada en 5' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena beta puede comprender SEQ ID NO: 17.

Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena alfa posicionada en 3' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena beta. Sin estar limitado por una teoría o mecanismo particular, se cree que un TCR, polipéptido o proteína (o porción o variante funcional del mismo) codificada por un vector de expresión recombinante en el que la secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena alfa está posicionada en 3' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica toda o una parte de la cadena beta proporciona una funcionalidad y un reconocimiento del antígeno mejorados en comparación con un TCR, polipéptido o proteína (o porción funcional o variante funcional del mismo) codificado por un vector de expresión recombinante en el que La secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena alfa está posicionada en 5' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena beta. A este respecto, una realización proporciona un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una ^c D^r 1a, CDR2a, CDR3a, CDR1p, CDR2p y CDR3p, y la secuencia de nucleótidos que codifica la CDR1a, CDR2a y CDR3a se encuentra en 3' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica CDR1p, CDR2p y CDR3p. Del mismo modo, la secuencia de nucleótidos que codifica la CDR1 p, CDR2p y CDR3p se puede encontrar en 5' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la CDR1a, CDR2a y cDR3a. En otra realización, el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de la cadena alfa y una región variable de la cadena beta, y la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena alfa se encuentra en 3' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena beta. Del mismo modo, la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena beta puede encontrarse en 5' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena alfa. En otra realización más de la invención, el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena alfa y una cadena beta, y la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa se encuentra en 3' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta. Del mismo modo, la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta puede encontrarse en 5' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa. El vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena alfa posicionada en 3' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena beta puede comprender SEQ ID NO: 18.

El vector de expresión recombinante puede comprender una etiqueta de ADN. La etiqueta de ADN puede distinguir el vector de expresión recombinante de otro vector que codifica la misma secuencia de proteínas. La etiqueta de ADN puede no estar incluida dentro de la secuencia de nucleótidos que codifica el TCR (incluyendo las porciones funcionales y las variantes funcionales del mismo), el polipéptido o la proteína de la invención y, por lo tanto, puede no afectar a su expresión. Los vectores de expresión recombinantes que incluyen la etiqueta de ADN hacen posible colocar la misma secuencia de nucleótidos en varias poblaciones de células diferentes y, posteriormente, distinguir entre esas poblaciones en función del vector que contienen.

La descripción proporciona adicionalmente una célula anfitriona que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos en la presente memoria. Como se emplea en la presente memoria, el término "célula anfitriona" se refiere a cualquier tipo de célula que pueda contener el vector de expresión recombinante de la invención. La célula anfitriona puede ser una célula eucariótica, p. ej., de planta, animal, hongo o alga, o puede ser una célula procariótica, p. ej., bacteria o protozoo. La célula anfitriona puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, p. ej., un ser humano. La célula anfitriona puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. Las células anfitrionas adecuadas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, células DH5a de E. coli, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293 y similares. Para la amplificación o replicación del vector de expresión recombinante, la célula anfitriona es preferiblemente una célula procariótica, p. ej., una célula DH5a. Para la producción de un TCR, polipéptido o proteína recombinante, la célula anfitriona es preferiblemente una célula de mamífero. Muy preferiblemente, la célula anfitriona es una célula humana. Si bien la célula anfitriona puede ser de cualquier tipo celular, se puede originar a partir de cualquier tipo de tejido y puede estar en cualquier etapa de desarrollo, la célula anfitriona puede ser un linfocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). Preferiblemente, la célula anfitriona puede ser una célula T.

Para los fines de la presente memoria, la célula T puede ser cualquier célula T, tal como una célula T cultivada, p. ej., una célula T primaria, o una célula T de una línea de células T cultivada, p. ej., Jurkat, SupTI, etc., o una célula T obtenida de un mamífero. Si se obtiene de un mamífero, la célula T se puede obtener de numerosas fuentes, que incluyen, entre otras, sangre, médula ósea, ganglios linfáticos, timo u otros tejidos o fluidos. Las células T también se pueden enriquecer o purificar. La célula T puede ser una célula T humana. La célula T puede ser una célula T aislada de un ser humano. La célula T puede ser cualquier tipo de célula T y puede ser de cualquier etapa de desarrollo, incluyendo, pero no limitada a, células T doblemente positivas CD4+/CD8+, células T coadyuvantes CD4+, p. ej., células Thi y Th², células T CD8+, células T citotóxicas, linfocitos infiltrantes de tumores, células T de memoria, células T no sometidas a tratamiento previo y similares. Preferiblemente, la célula T puede ser una célula T CD8+ o una célula T CD4+.

En la presente memoria se describe adicionalmente una población de células que comprende al menos una célula anfitriona descrita en la presente memoria. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula anfitriona que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos, además de al menos otra célula, p. ej., una célula anfitriona (p. ej., una célula T), que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinantes, o ++una célula distinta de una célula T, por ejemplo, una célula B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula muscular, una célula cerebral, etc. Alternativamente, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células anfitrionas (por ejemplo, que consisten esencialmente en) que comprenden el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población clonal de células, en la que todas las células de la población son clones de una única célula anfitriona que comprende un vector de expresión recombinante, de manera que todas las células de la población comprenden el vector de expresión recombinante. En una realización, la población de células es una población clonal que comprende células anfitrionas que comprenden un vector de expresión recombinante como se describe en la presente memoria.

La descripción proporciona adicionalmente un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a una porción funcional de cualquiera de los TCR descritos en la presente memoria. Preferiblemente, la porción funcional se une específicamente a NY-ESO-1, p. ej., la porción funcional que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 (CDR1 de cadena a), 4 (CDR2 de cadena a), 5 (CDR3 de una cadena ), 6 (CDR1 de cadena p), 7 (CDR2 de cadena p), 8 (CDR3 de cadena p), SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, o una combinación de los mismos, p. ej., 3-5, 6 -8, 3-8 o 9-10. Más preferiblemente, la porción funcional comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8. En una realización preferida, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo que está formado por las 6 CDR (CDR1-3 de la cadena alfa y CDR1-3 de la cadena beta). El anticuerpo puede ser cualquier tipo de inmunoglobulina que sea conocido en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser de cualquier isotipo, p. ej., IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, etc. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo natural, p. ej., un anticuerpo aislado y/o purificado de un mamífero, p. ej., ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, hámster, ser humano, etc. Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo modificado por ingeniería genética, p. ej., un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. El anticuerpo puede estar en forma monomérica o polimérica. Además, el anticuerpo puede tener cualquier nivel de afinidad o avidez por la porción funcional del TCR de la invención. Deseablemente, el anticuerpo es específico para la porción funcional del TCR de la invención, de modo que haya una reacción cruzada mínima con otros péptidos o proteínas.

Los métodos para someter a ensayo la capacidad de los anticuerpos para unirse a cualquier porción funcional del TCR son conocidos en la técnica e incluyen cualquier ensayo de unión antígeno-anticuerpo, tal como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación y ensayos de inhibición competitiva (véase, p. ej., Janeway et al., más abajo).

Los métodos adecuados para elaborar anticuerpos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos de hibridoma convencionales son descritos, p. ej., por Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976), Harlow y Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), y C. A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5a Ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2001)). Alternativamente, se conocen en la técnica otros métodos, tales como los métodos de hibridoma-EBV (Haskard y Archer, J. Immunol. Methods, 74 (2), 361-67 (1984), y Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)), y los sistemas de expresión de vectores de bacteriófagos (véase, p. ej., Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)). Adicionalmente, los métodos para producir anticuerpos en animales no humanos se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 5.545.806, 5.569.825 y 5.714.352).

Además, se puede utilizar la presentación en fagos para generar el anticuerpo descrito en la presente memoria. A este respecto, se pueden generar bibliotecas de fagos que codifican los dominios de unión al antígeno (V) de los anticuerpos utilizando técnicas convencionales de biología molecular y de ADN recombinante (véase, p. ej., Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2001)). Los fagos que codifican una región variable con la especificidad deseada se seleccionan para la unión específica al antígeno deseado, y se reconstituye un anticuerpo completo o parcial que comprende el dominio variable seleccionado. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo reconstituido se introducen en una línea celular adecuada, tal como una célula de mieloma utilizada para la producción de hibridomas, de modo que los anticuerpos que tienen las características de los anticuerpos monoclonales son secretados por la célula (véanse, p. ej., Janeway et al. más arriba, Huse et al. más arriba, y Patente de Estados Unidos 6.265.150).

Los anticuerpos pueden ser producidos por ratones transgénicos que son transgénicos para genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera específicos. Tales métodos son conocidos en la técnica y son descritos, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 5.545.806 y 5.569.825, y por Janeway et al. más arriba.

Los métodos para generar anticuerpos humanizados son bien conocidos en la técnica y son descritos con detalle, por ejemplo, por Janeway et al. más arriba, las Patentes de Estados Unidos 5.225.539, 5.585.089 y 5.693.761, la Patente Europea Núm. 0239400 B1, y la Patente del Reino Unido Núm. 2188638. Los anticuerpos humanizados también se pueden generar utilizando la tecnología de reconstrucción superficial de anticuerpos descrita en la Patente de Estados Unidos 5.639641 y por Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994).

La descripción también proporciona porciones de unión a antígeno de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente memoria. La porción de unión a antígeno puede ser cualquier porción que tenga al menos un sitio de unión a antígeno, tal como Fab, F(ab')² , dsFv, sFv, diacuerpos y triacuerpos.

Se puede generar un fragmento de anticuerpo de fragmento de región variable de cadena sencilla (sFv), que consiste en un fragmento Fab truncado que comprende el dominio variable (V) de una cadena pesada de anticuerpo unida a un dominio V de una cadena ligera de anticuerpo a través de un péptido sintético, utilizando técnicas de tecnología de ADN recombinante de rutina (véase, p. ej., Janeway et al., más arriba). De manera similar, se pueden preparar fragmentos de región variable estabilizados con disulfuro (dsFv) mediante tecnología de ADN recombinante (véase, p. ej., Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)). Los fragmentos de anticuerpos de la descripción, sin embargo, no están limitados a estos tipos ilustrativos de fragmentos de anticuerpos.

Además, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, se pueden modificar para que comprendan una marca detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (p. ej., isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante), y partículas de elementos (p. ej., partículas de oro).

Los TCR, los polipéptidos, las proteínas (incluyendo las porciones funcionales y las variantes funcionales de los mismos), los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células anfitrionas (incluyendo las poblaciones de los mismos) y los anticuerpos (incluyendo las porciones de unión al antígeno de los mismos) se pueden aislar y/o purificar. El término "aislado" como se emplea en la presente memoria significa que se ha separado de su entorno natural. El término "purificado" como se emplea en la presente memoria significa que se ha incrementado su pureza, en donde "pureza" es un término relativo, y no se debe interpretar necesariamente como pureza absoluta. Por ejemplo, la pureza puede ser de al menos aproximadamente 50%, puede ser superior a 60%, 70% u 80%, o puede ser de 100%.

Los TCR, los polipéptidos, las proteínas (incluyendo las porciones y las variantes funcionales de los mismos), los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células anfitrionas (incluyendo las poblaciones de las mismas) y los anticuerpos (incluyendo las porciones de unión a antígeno de los mismos), todos los cuales son denominados colectivamente como "materiales de TCR" en lo sucesivo, se pueden formular en una composición, tal como una composición farmacéutica. A este respecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, porciones funcionales, variantes funcionales, ácidos nucleicos, vectores de expresión, células anfitrionas (incluyendo las poblaciones de las mismas), y anticuerpos (incluyendo sus porciones de unión a antígeno), y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria que contienen cualquiera de los materiales de TCR pueden comprender más de un material de TCR, p. ej., un polipéptido y un ácido nucleico, o dos o más TCR diferentes. Alternativamente, la composición farmacéutica puede comprender un material de TCR combinado con otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, tales como agentes quimioterapéuticos, p. ej., asparraginasa, busulfán, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc.

Preferiblemente, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Con respecto a las composiciones farmacéuticas, el portador puede ser cualquiera de los utilizados convencionalmente y está limitado solamente por consideraciones físico-físicas, tales como la solubilidad y la falta de reactividad con el compuesto o los compuestos activos, y por la vía de administración. Los portadores farmacéuticamente aceptables descritos en la presente memoria, por ejemplo, vehículos, coadyuvantes, excipientes y diluyentes, son bien conocidos por los expertos en la técnica y están fácilmente disponibles para el público. Se prefiere que el portador farmacéuticamente aceptable sea uno que sea químicamente inerte para el agente o los agentes activos y uno que no tenga efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.

La elección del portador se determinará en parte por el material de TCR concreto, así como por el método concreto utilizado para administrar el material de TCR. Por consiguiente, existe una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la invención. Las siguientes formulaciones para administración parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal e interperitoneal son ilustrativas y no son limitantes en modo alguno. Se puede utilizar más de una ruta para administrar los materiales de TCR, y en ciertos casos, una ruta particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra ruta.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles isotónicas, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor deseado, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes y conservantes. El material de TCR se puede administrar en un diluyente fisiológicamente aceptable en un portador farmacéutico, tal como un líquido estéril o una mezcla de líquidos, incluyendo agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas, un alcohol, tal como etanol o alcohol hexadecílico, un glicol, tal como propilenglicol o polietilenglicol, dimetilsulfóxido, glicerol, cetales tales como el 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol, éteres, poli(etilenglicol) 400, aceites, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos o glicéridos, o glicéridos de ácidos grasos acetilados con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, tal como un jabón o un detergente, un agente de suspensión, tal como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa, o agentes emulsionantes y otros coadyuvantes farmacéuticos.

Los aceites que se pueden utilizar en formulaciones parenterales incluyen aceites de petróleo, animales, vegetales o sintéticos. Los ejemplos específicos de aceites incluyen cacahuete, soja, sésamo, semilla de algodón, maíz, oliva, vaselina y minerales. Los ácidos grasos adecuados para uso en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico y ácido isostárico. El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados.

Los jabones adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen sales de metales alcalinos grasos, amonio y trietanolamina, y detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetil dialquil amonio y haluros de alquil piridinio, (b) detergentes aniónicos tales como, por ejemplo, alquil, aril y olefino sulfonatos, alquil, olefino, éter y monoglicérido sulfatos, y sulfosuccinatos, (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de aminas grasas, alcanolamiduros de ácidos grasos y copolímeros de polioxietileno polipropileno, (d) detergentes anfóteros, tales como, por ejemplo, alquil-p-aminopropionatos, y sales de amonio cuaternario de 2-alquil-imidazolina, y (e) mezclas de los mismos.

Las formulaciones parenterales contendrán típicamente de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 25% en peso del material de TCR de la invención en solución. Se pueden utilizar conservantes y tampones. Con el fin de minimizar o eliminar la irritación en el lugar de la inyección, tales composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tienen un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de aproximadamente 12 a aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en tales formulaciones variará típicamente entre aproximadamente 5% y 15% en peso. Los tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos y polietilenglicol sorbitán, tales como monooleato de sorbitán y los aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrófoba, formados por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones parenterales se pueden presentar en recipientes sellados de dosis unitarias o de dosis múltiples, tales como ampollas y viales, y se pueden almacenar en condiciones de secado por congelación (liofilizados), lo que requiere solamente la adición del excipiente líquido estéril, por ejemplo, agua, para inyectables, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones para inyectables extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.

También se describen en el presente memoria formulaciones inyectables. Los requisitos para los portadores farmacéuticos eficaces para las composiciones inyectables son bien conocidos por los expertos en la técnica (véanse, p. ej., Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Filadelfia, PA, Banker y Chalmers, eds., páginas 238-250 (1982), y ASHP Hadbook on Injectable Drugs, Toissel, 4a ed., páginas 622-630 (1986)). Preferiblemente, cuando se administran células, p. ej., células dendríticas, las células se administran mediante inyección.

Un experto en la técnica apreciará que, además de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente, los materiales de TCR descritos en la presente memoria se pueden formular en forma de complejos de inclusión, tales como complejos de inclusión de ciclodextrina, o liposomas.

La cantidad o dosis del material de TCR administrado debe ser suficiente para efectuar, p. ej., una respuesta terapéutica o profiláctica, en el sujeto o animal durante un período de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material de TCR debe ser suficiente para unirse a NY-ESO-1, o detectar, tratar o prevenir el cáncer en un período de aproximadamente 2 horas o más, p. ej., de 12 a 24 horas o más, desde el momento de la administración. En ciertas realizaciones, el período de tiempo podría ser incluso más largo. La dosis se determinará por la eficacia del material de TCR concreto y la afección del animal (p. ej., ser humano), así como el peso corporal del animal (p. ej., ser humano) a tratar.

Se conocen en la técnica muchos ensayos para determinar una dosis administrada. Para los fines de la invención, se podría utilizar un ensayo que comprende comparar en qué medida se lisan las células diana o se secreta IFN-^y por las células T que expresan el TCR, el polipéptido o la proteína tras la administración de una dosis determinada de dichas células T a un mamífero entre un conjunto de mamíferos a los que se les administra una dosis diferente de células T, para determinar la dosis inicial que se administrará a un mamífero. La medida en que se lisan las células diana o se secreta el IFN-y tras la administración de una cierta dosis se puede analizar mediante métodos conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, los métodos descritos en la presente memoria como Ejemplo 3.

La dosis del material de TCR también estará determinada por la existencia, naturaleza y alcance de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un material de TCR concreto. Típicamente, el médico a cargo decidirá la dosificación del material de TCR con el cual tratar a cada paciente individual, teniendo en cuenta una variedad de factores, tales como la edad, el peso corporal, la salud general, la dieta, el sexo, el material de TCR que se va a administrar, la ruta de administración y la gravedad de la afección que se está tratando. A modo de ejemplo y sin pretender limitar la invención, la dosis del material de TCR puede ser de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1.000 mg/kg de peso corporal del sujeto que se está tratando/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal/día.

Un experto normal en la técnica apreciará fácilmente que los materiales de TCR se pueden modificar de varias formas, de modo que la eficacia terapéutica o profiláctica de los materiales de TCR se incremente a través de la modificación. Por ejemplo, los materiales de TCR se pueden conjugar directa o indirectamente a través de un puente a un grupo diana. La práctica de conjugar compuestos, p. ej., los materiales de TCR, a radicales de direccionamiento es conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995) y la Patente de Estados Unidos 5.087.616. El término "radical de direccionamiento", como se emplea en la presente memoria, se refiere a cualquier molécula o agente que reconozca específicamente y se una a un receptor de la superficie celular, de tal manera que el radical de direccionamiento dirija el suministro de los materiales de TCR a una población de células sobre cuya superficie se expresa el receptor. Los radicales de direccionamiento incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, o fragmentos de los mismos, péptidos, hormonas, factores de crecimiento, citocinas y cualquier otro ligando natural o no natural, que se unen a receptores de la superficie celular (p. ej., Receptor del Factor de Crecimiento Epitelial (EGFR), Receptor de células T (TCR), receptor de células B (BCR), CD28, Receptor del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF), receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR), etc.). El término "puente", como se emplea en la presente memoria, se refiere a cualquier agente o molécula que une los materiales de TCR con el radical de direccionamiento. Un experto en la técnica reconoce qué sitios en los materiales de TCR, que no son necesarios para la función de los materiales de TCR, son sitios ideales para el anclaje de un puente y/o un radical de direccionamiento, siempre que el puente y/o el radical de direccionamiento, una vez anclados a los materiales de TCR de la invención, no interfieran en la función de los materiales de TCR, es decir, la capacidad de unirse a NY-ESO-1, o de detectar, tratar o prevenir el cáncer.

Alternativamente, los materiales de TCR se pueden modificar en una forma de depósito, de modo que la manera en la que los materiales de TCR se liberan en el organismo al que se administran se controla con respecto al tiempo y la ubicación dentro del organismo (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 4.450.150). Las formas de depósito de los materiales de TCR pueden ser, por ejemplo, una composición implantable que comprende los materiales de TCR y un material poroso o no poroso, tal como un polímero, en donde los materiales de TCR están encapsulados o difundidos por todo el material y/o la degradación del material no poroso. A continuación, el depósito se implanta en la ubicación deseada dentro del organismo y los materiales de TCR se liberan del implante a una velocidad predeterminada.

Se contempla que las composiciones farmacéuticas de la invención, los TCR (que incluyen porciones o variantes funcionales de los mismos), polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células anfitrionas o poblaciones de células se pueden utilizar en métodos para el tratamiento o la prevención del cáncer. Sin estar limitados por una teoría o mecanismo particular, se cree que los TCR de la invención se unen específicamente a nY-ESO-1, de modo que el TCR (o polipéptido o proteína de la invención relacionado, o porción funcional o variante del mismo) cuando es expresado por una célula es capaz de mediar una respuesta inmunitaria contra la célula que expresa NY-ESO-1. A este respecto, la descripción se refiere a un método para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria, cualquier ácido nucleico o vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas descritos en la presente memoria, o cualquier célula anfitriona o población de células que comprenden un vector recombinante que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero.

Los términos "tratar" y "prevenir", así como las palabras derivadas de los mismos, como se emplean en la presente memoria, no implican necesariamente una tratamiento o prevención de 100% completos. Más bien, existen diversos grados de tratamiento o prevención, de los cuales un experto en la técnica reconoce que tienen un beneficio potencial o efecto terapéutico. A este respecto, los métodos pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero. Además, el tratamiento o la prevención proporcionados por el método pueden incluir el tratamiento o la prevención de una o más afecciones o síntomas de la enfermedad, p. ej., el cáncer, que se está tratando o previniendo. Además, para los fines de la presente memoria, "prevención" puede abarcar el retraso del inicio de la enfermedad, o de un síntoma o afección de la misma.

También se proporciona un método para detectar la presencia de cáncer en un mamífero. El método comprende (i) poner en contacto una muestra que comprende células del cáncer, cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células anfitrionas, poblaciones de células o anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención, descritos en la presente memoria, formando de este modo un complejo, y detectar el complejo, en donde la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero.

Con respecto al método para detectar cáncer en un mamífero, la muestra de células del cáncer puede ser una muestra que comprenda células completas, productos lisados de las mismas, o una fracción de los productos lisados celulares completos, p. ej., una fracción nuclear o citoplásmica, una fracción de proteína completa, o una fracción de ácido nucleico.

A los efectos del método de detección, el contacto puede tener lugar in vitro o en vivo con respecto al mamífero. Preferiblemente, el contacto es in vitro

Además, la detección del complejo puede ocurrir de varias formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células anfitrionas, poblaciones de células o anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, descritos en la presente memoria, se pueden marcar con una marca detectable tal como, por ejemplo, una radioisótopo, un fluoróforo (p. ej, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas de elementos (p. ej., partículas de oro).

Para los fines de los métodos descritos en la presente memoria, en donde se administran células anfitrionas o poblaciones de células, las células pueden ser células que son alogénicas o autólogas para el mamífero. Preferiblemente, las células son autólogas con respecto al mamífero.

Con respecto a los métodos descritos en la presente memoria, el cáncer puede ser cualquier tipo de cáncer, incluyendo cualquier tipo de cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de huesos, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer de ano, canal anal o anorrecto, cáncer del ojo, cáncer de los conductos biliares intrahepáticos, cáncer de las articulaciones, cáncer de cuello, vesícula biliar o pleura, cáncer de nariz, cavidad nasal u oído medio, cáncer de la cavidad oral, cáncer de la vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, tumor carcinoide gastrointestinal, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma no Hodgkin, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, peritoneo, omentum y cáncer mesentérico, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer renal (p. ej., carcinoma de células renales (CCR)), cáncer de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, cáncer de estómago, sarcoma de células sinoviales, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer de uréter y cáncer de vejiga urinaria. Preferiblemente, el cáncer es melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de ovario o sarcoma de células sinoviales.

El mamífero al que se hace referencia en la presente memoria puede ser cualquier mamífero. Como se emplea en la presente memoria, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo, pero no limitados a, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsters, y mamíferos del orden Lagomorpha, tales como conejos. Se prefiere que los mamíferos sean del orden Carnivora, incluyendo Félidos (gatos) y Cánidos (perros). Es más preferido que los mamíferos sean del orden Artiodactyla, incluyendo Bóvidos (vacas) y Súidos (cerdos) o del orden Perisodactyla, incluyendo Équidos (caballos). Lo más preferido es que los mamíferos sean del orden Primates, Cébidos o Símidos (monos) o del orden Antropoides (humanos y simios). Un mamífero especialmente preferido es el ser humano.

Ejem plos

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención pero, por supuesto, no se debe interpretar que limiten de ningún modo su alcance.

Líneas celulares

Las líneas de melanoma 1300mel (NY-ESO-1+, HLA-A2+), 624.38mel (NY-ESO-1+, HLA-A2+), A375mel (NY-ESO-1+, HLA-A2+), 938mel (NY-ESO-1+, HLA-A2-), 888mel (NY-ESO-1-, HLA-A2-), SK23mel (NY-ESO-1-, HLA-A2+), 1359mel (NY-ESO-1+, HLA-A2-), 1359-A2mel (NY-ESO-1+, HLA-A2+), 624mel (NY-ESO-1+, HLA-A2+), y 1390mel (NY-ESO-1+, HLA-A2+), se generaron a partir de lesiones tumorales resecadas y se cultivaron en medio R10 que consistía en RPMI 1640 con un suplemento de suero bovino fetal al 10%, 2 mmoles/L de L-glutamina, 50 unidades/ml de penicilina y HEPES de 50 pg/ml (Invitrogen) y 25 mmoles/L (GIBCO, Invitrogen). Otras líneas celulares utilizadas incluyeron: la línea celular de cáncer cervical Caski (NY-ESO-1+, HLA-A2+), (ATCC CRL-1550), la línea celular de osteosarcoma Saos2 (NY-ESO-1+, HLA-A2+), (ATCC HTB-85), y la línea celular de neuroblastoma SK NAS-A2 (NY-ESO-1+, HLA-A2+), (ATCC CRL-2137), la línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas H1299A2 (NY-ESO-1+, HLA-A2+), la línea celular de carcinoma de mama MDA-MB-435S-A2 (NY-ESO-1+, HLA-A2+), (ATCC® HTB-129), de las cuales las tres fueron transducidas con una construcción retroviral para expresar HLA-A* 0201 (Navuaux et al., J. Virol., 70: 5701-05 (1996), Parkhurst et al., Clin. Cancer Res., 15: 169-180 (2009), Robbins et al., J. Immunol., 180: 6116-31 (2008), Wargo et al., Cancer Immunol. Immunother., 58: 394 (2009)), COS-A2-ESO, que se transdujo con un vector retroviral que expresaba el gen NY-ESO-1, y COS-A2-CEA, que se transdujo con un vector retroviral que expresaba el gen CEA.

Ejem plo 1

Este ejemplo demuestra la identificación de clones de células T anti-NY-ESO-1 murinas.

Se inmunizaron ratones transgénicos HLA-A2 con 100 pg de péptido (NY-ESO^-1157-165) y 120 pg de péptido auxiliar (péptido central del virus de la hepatitis B (HBV):128-140) en 100 pl de adyuvante incompleto de Freund (IFA) por vía subcutánea (s.c.) en la base de la cola (50 pg de péptido NY-ESO^-1157-165 en cada uno de los dos lados de la cola), seguido de un refuerzo una semana más tarde con la misma inmunización.

Día 0: Una semana después de la segunda inmunización, los esplenocitos se recogieron y estimularon in vitro con uno de los siguientes: (i) esplenocitos HLA-A2+ activados por LPS (3.000 rad) ("blato LPS") pulsados con 1 pg/ml de péptido de cebado y 10 pg/ml de p2-microgobulina humana o (ii) células T2 (17.000 rad) pulsadas con 1, 0,1 o 0,01 pg/ml de péptido.

Día 7: Los cultivos en masa se evaluaron para determinar la reactividad específica a través de la secreción de IFNy en el cultivo conjunto con una de las líneas celulares tumorales expuestas en la Tabla 1. Los resultados se muestran en la Tabla 1 (IFN-y (pg/ml) después de la estimulación en masa 1; "nt" = no sometido a ensayo). Debido a que la liberación de citocinas a veces fue muy alta en respuesta a las células T2 cargadas con el péptido HBV, los valores subrayados para las dianas tumorales indican el doble del valor de fondo obtenido con el medio solo y los tumores negativos, y los valores subrayados para los péptidos indican el doble del fondo obtenido con T2 y el péptido del HBV.

Tabla 1

Día 11: Los cultivos en masa reactivos con péptido/tumor se clonaron a 10 células/pocillo en las siguientes condiciones (10 placas por condición): (i) células T2 irradiadas (18.000 rad) pulsadas con 1, 0,1 o 0,01 pg/ml péptido: 5x104 células/pocillo; (ii) Alimentadores de esplenocitos C57BL/6 irradiados (3.000 rad): 5x104 células/pocillo; y (iii) IL-2 de 10 CU/ml.

Días 25-30: Los pocillos con crecimiento positivo se seleccionaron y se reestimularon en placas de 48 pocillos en las siguientes condiciones: (i) células T2 irradiadas (18.000 rad) pulsadas con 1, 0,1 o 0,01 pg/ml de péptido: 2x105 células/pocillo; (ii) alimentadores de esplenocitos C57BL/6 irradiados (3.000 rad): 1x106 células/pocillo; y (iii) IL-2 de 10 CU/ml.

Días 37-44: Los clones se evaluaron para determinar la reactividad específica a través de la secreción de IFN^y en el cultivo conjunto con las líneas celulares tumorales expuestas en la Tabla 2. Las células tumorales se trataron con IFN^y (20 ng/ml) y factor de necrosis tumoral alfa (3 ng/ml) durante la noche antes de el ensayo.

Los esplenocitos estimulados con esplenocitos HLA-A2 activados por LPS (3.000 rad) pulsados con 1 pg/ml de péptido de cebado y 10 pg/ml de p2-microgobulina humana en el día 0 produjeron 8 de 960 pocillos con crecimiento positivo. Los datos para los dos clones más reactivos se muestran en la Tabla 2 (después de 1 estimulación masiva; IFN-y (pg/ml)).

Tabla 2

Días 46-49: Los clones de interés se reestimularon en placas de 24 pocilios en las siguientes condiciones: (i) células T2 irradiadas (18,000 rad) pulsadas con 1, 0,1 o 0,01 pg/ml de péptido: 5x105 células/pocillo; (ii) alimentadores de esplenocitos C57BL/6 irradiados (3.000 rad): 1x106 células/pocillo; y (iii) IL-2 de 10 CU/ml. Los clones reestimulados se congelaron instantáneamente para la preparación de ARN.

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra la identificación de clones de células T anti-NY-ESO-1 murinas.

Se inmunizaron ratones transgénicos HLA-A2 y los esplenocitos se recogieron, se estimularon y se evaluaron para determinar la reactividad específica como se describe en el Ejemplo 1.

Día 11: Los cultivos en masa se reestimularon en placas de 24 pocillos en las siguientes condiciones: (i) células T2 irradiadas (18.000 rad) pulsadas con 1, 0,1 o 0,01 pg/ml de péptido: 4x105 células/pocillo; (ii) alimentadores de esplenocitos C57BL/6 irradiados (3.000 rad): 1x106 células/pocillo; y (iii) IL-2 de 10 CU/ml.

Día 19: Los cultivos en masa (después de dos estimulaciones) se evaluaron para determinar la reactividad específica a través de la secreción de IFN-y después del cultivo conjunto con las líneas celulares tumorales expuestas en la Tabla 3. Las células tumorales se trataron con IFNy (20 ng/ml) y factor de necrosis tumoral alfa (3 ng/ml) durante la noche antes del ensayo. Los resultados se muestran en la Tabla 3 (IFN-^y (pg/ml)).

Tabla 3

Día 21: Los cultivos en masa se reestimularon en placas de 24 pocilios en las siguientes condiciones: (i) células T2 irradiadas (18.000 rad) pulsadas con 1, 0,1 o 0,01 ug/ml de péptido: 5x105 células/pocillo; (ii) Alimentadores de esplenocitos C57BL/6 irradiados (3.000 rad): 1x106 células/pocillo; y (iii) IL-2 de 10 CU/ml.

Día 30: Los cultivos en masa (después de tres estimulaciones) se evaluaron para determinar la reactividad específica a través de la secreción de IFN-^y después del cultivo conjunto con las líneas celulares tumorales expuestas en la Tabla 4. Las células tumorales se trataron con IFNy (20 ng/ml) y factor de necrosis tumoral alfa (3 ng/ml) durante la noche antes del ensayo. Los resultados se muestran en la Tabla 4 (IFN-y (pg/ml); *indica los cultivos en masa que se clonaron después de tres estimulaciones en masa).

Tabla 4

Día 33: Los cultivos en masa reactivos con péptidos/tumores seleccionados (después de tres estimulaciones) se clonaron a 10 células/pocillo como se describe para el Día 11 del Ejemplo 1.

Días 45-48: Los pocillos con crecimiento positivo se examinaron para determinar la reactividad del péptido a través de la secreción de IFN-^y en el cultivo conjunto con las líneas celulares tumorales expuestas en la Tabla 5. Las células tumorales se trataron con IFN^y (20 ng/ml) y factor de necrosis tumoral alfa (3 ng/ml) durante la noche antes del ensayo.

Los esplenocitos estimulados con esplenocitos HLA-A2+ activados por LPS (3.000 rad) pulsados con 1 pg/ml de péptido de cebado y 10 pg/ml de p2-microgobulina humana el día 0 produjeron 33 de 960 pocillos de crecimiento positivo. Los datos para los cuatro clones más reactivos (números 2, 5, 6 y 8) se muestran en la Tabla 5 (después de 3 estimulaciones en masa; IFN-y (pg/ml)). Los esplenocitos estimulados con células T2 (17.000 rad) pulsados con 1 pg/ml de péptido produjeron 104 de 960 pocillos de crecimiento positivo. Los datos de los cuatro clones más reactivos (números 1, 50, 51 y 63) se muestran en la Tabla 5.

Días 46-49: Los clones reactivos de péptidos se reestimularon en placas de 24 pocilios como se describe para el Día 21 de este ejemplo. Los clones reestimulados se congelaron instantáneamente para la preparación de ARN.

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra el aislamiento de un TCR anti-NY-ESO-1 murino y la reactividad específica del TCR aislado contra NY-ESO-1.

Se aislaron los TCR de cinco clones (a saber, los clones B, H, 5, 6, 1, 50 y 63). La secuencia de nucleótidos (ARN) que codifica el TCR de cada clon se aisló, secuenció y transfectó a células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas de los pacientes 1 y 2. Las células transfectadas se estimularon con OKT3 e IL-2 y se cultivaron solas (medio ) o cultivaron conjuntamente con células T2 pulsadas con péptido de control (HBV), células T2 pulsadas con péptido NY-ESO-W ¹⁶⁵ , COA-A2-CEA (NY-ESO-1"), COS-A2-ESO (NY-ESO-1+), o una de varias líneas celulares de tumor de melanoma 888mel (NY-ESO-1-), Sk23mel (NY-ESO-1-), A375mel (NY-ESO-1+), 1363mel (NY-ESO-1+), 1390 (NY-ESO-1+), o 624 (NY-ESO-1+). Se midió la secreción de IFNy. Los resultados se muestran en la Tabla 6 (IFNy (pg/ml)).

Como se muestra en la Tabla 6, el TCR TRAV6D/TRBV26 (SEQ ID NO: 11 y 12) proporcionó la reactividad anti-NY-ESO-1 específica más alta y se eligió para un estudio adicional.

La secuencia de nucleótidos (ARN) que codifica el TCR TRAV6D/TRBV26 (SEQ ID NO: 11 y 12) se transfectó en PBMC humanas de los pacientes 3 y 4. Las células transfectadas se seleccionaron positivamente para las células CD8+ y CD4+, se estimularon con OKT3 e IL 2, y cultivadas solas (medios) o co-cultivadas con células T2 pulsadas con péptido de control (HBV), células T2 pulsadas con diversas concentraciones de péptido NY-ESO-¹¹⁵⁷-¹⁶⁵, COS-A2-ESO (NY-ESO-1+), COA-A2-CEA (NY-ESO-1-), o una de varias líneas celulares de tumor de melanoma 888mel (NY-ESO-1-), Sk23mel (NY-ESO-1-), A375mel (NY-ESO-1+), 1363mel (NY-ESO-1+), o 624 (NY-ESO-1+). Se midió la secreción de IFN^y y los resultados se muestran en la Tabla 7 (IFN^y (pg/ml)).

Como se muestra en la Tabla 7, las células transfectadas con TCR TRAV6D/TRBV26 (SEQ ID NO: 11 y 12) reconocieron específicamente células de tumor de melanoma NY-ESO-1+, según se midió mediante la secreción de IFNy.

Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra la reactividad de las células T CD8+ y CD4+ humanas transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 murinotras el cultivo conjunto con células dendríticas pulsadas con el péptido NY-ESO-1.

Las células T humanas CD8+ (Figura 1A) o CD4+ (Figura 1B) se transfectaron con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26 (SEQ ID NO: 11 y 12)) o un anti-NY-ESO humano 1 TCR. Las células transfectadas se cultivaron conjuntamente con células dendríticas pulsadas con diversas concentraciones de péptido NY-ESO^-1157-165, y se midió la secreción de IFN^y.

Como se muestra en las Figuras 1A y 1B, las células T humanas CD8+ y CD4+ transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26 (SEQ ID NO: 11 y 12)) fueron reactivas contra células dendríticas pulsadas con péptido NY-ESO-1^{157 -165}, medido por la secreción de IFNy. Las células T humanas CD8+ transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26 (SEQ ID NO: 11 y 12)) fueron más reactivas contra las células dendríticas pulsadas con péptido NY-ESO^-1157-165, medido por la secreción de IFNy, en comparación con las células CD8+ transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 humano.

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra la reactividad de las células T CD8+ y CD4+ humanas transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 murino después del cultivo conjunto con células de tumor de melanoma.

Las células T humanas CD8+ (Figura 2A) o CD4+ (Figura 2B) se transfectaron con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26 (SEQ ID NO: 11 y 12)) o un TCR anti-NY-ESO humano 1. Las células transfectadas se cultivaron solas (medios) o se cultivaron conjuntamente con células T2 pulsadas con péptido de control, células T2 pulsadas con péptido NY-ESO^-1157-165, COA-A2-CEA (NY-ESO-1'), COS-A2-ESO (NY-ESO-1+), o una de varias líneas celulares de tumor de melanoma 888mel (NY-ESO-1-), Sk23mel (NY-ESO-1-), A375mel (NY-ESO-1+), o 1363mel (NY-ESO-1+). Se midió la secreción de IFNy.

Como se muestra en las Figuras 2A y 2B, las células T humanas CD8+ y CD4+ transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26 (SEQ ID NO: 11 y 12)) reconocieron específicamente las células de tumor de melanoma NY-ESO-1+, según se midió mediante la secreción de IFNy. Las células T humanas CD8+ y CD4+ transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26 (s Eq ID NO: 11 y 12)) fueron más reactivas contra las líneas de células tumorales NY-ESO-1+, según se midió mediante la secreción de IFNy, en comparación con las células CD8+ y CD4+ transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 humano.

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra la reactividad de las células T CD8+ y CD4+ humanas transfectadas con una secuencia de nucleótidos con codones optimizados o de tipo salvaje que codifica un TCR anti-NY-ESO-1 murino después del cultivo conjunto con células de tumor de melanoma.

Se transfectó una secuencia de nucleótidos (ARN) de tipo salvaje (SEQ ID NO: 19 y 20) o con codones optimizados (SEQ ID NO: 15 y 16) que codifica el TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26) en PBMC humanas CD8+ o CD4+ de los pacientes 5 y 6. Las células transfectadas se seleccionaron positivamente para las células CD8+ y CD4+, se estimularon con OKT3 e IL-2 y se cultivaron solas (medios) o se cultivaron conjuntamente con células t2 pulsadas con péptido de control (HBVc), células T2 pulsadas con diversas concentraciones de péptido NY-ESO-¹¹⁵⁷-¹⁶⁵, COA-A2-CEA (NY-ESO-1-), COS-A2-ESO (NY-ESO-1+), o una de varias líneas celulares de tumor de melanoma 888mel (NY-ESO-1-), Sk23mel (NY-ESO-1-), A375mel (NY-ESO-1+), 1363mel (NY-ESO-1+), A375 (NY-ESO-1+), o 624mel (NY-ESO-1+). Se midió la secreción de IFNy. Los resultados se muestran en la Tabla 8 (IFNy (pg/ml)).

Como se muestra en la Tabla 8, las células T humanas CD8+ y CD4+ transfectadas con una secuencia de nucleótidos con codones optimizados o de tipo salvaje que codifica un TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26) reconocieron específicamente las células de tumor de melanoma NY-ESO-1+, según se midió mediante la secreción de IFN^y.

Ejemplo 7

Este ejemplo demuestra la reactividad de las células T CD8+ humanas transfectadas con una secuencia de nucleótidos de tipo salvaje que codifica un TCR anti-NY-ESO-1 murino después del cultivo conjunto con células de tumor de melanoma y no melanoma.

Una secuencia de nucleótidos (ARN) (SEQ ID NO: 19 y 20) que codifica el TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26) se introdujo mediante electroporación en células T humanas CD8+ de los pacientes 7 y 8. Las células no transfectadas (simulacro) o las células transfectadas se seleccionaron positivamente para las células T CD8+, se estimularon con OKT3 e IL-2 y se cultivaron solas (medios) o se cultivaron conjuntamente con células T2 pulsadas con el péptido de control (HBVc); las células T2 pulsadas con varias concentraciones de péptido NY-ESO-1¹⁵⁷-¹⁶⁵; COA-A2-CEA (NY-ESO-1-); COS-A2-ESO (NY-ESO-1+); una de varias líneas celulares de tumor de melanoma 888mel (NY-ESO-1-), Sk23mel (NY-ESO-1-), A375mel (NY-ESO-1+), 1363mel (NY-ESO-1+), A375 (NY-ESO-1+); línea celular de sarcoma osteogénico Saos2 (NY-ESO-1+); línea celular de glioma LN-18 (NY-ESO-1+); línea celular de sarcoma de Ewing TC-71 (NY-ESO-1+); líneas celulares de neuroblastoma SKN AS (NY-ESO-1+) o SKN AS-A2 (NY-ESO-1+); o líneas celulares de cáncer de mama MDA 453S (NY-ESO-1+) o MDA 453S-A2 (NY-ESO-1+). Se midió la secreción de IFNy. Los resultados se muestran en la Tabla 9 (IFNy (pg/ml)).

Tabla 9

Como se muestra en la Tabla 9, las células T humanas CD8+ transfectadas con una secuencia de nucleótidos que codifica un TCR murino anti-NY-ESO-1 (TRAV6D/TRBV26) reconocieron específicamente el melanoma NY-ESO-1+, el sarcoma osteogénico, el sarcoma de Ewing, el neuroblastoma y células tumorales de cáncer de mama, según se midió por la secreción de IFNy.

Ejemplo 8

Este ejemplo demuestra la preparación de vectores de expresión recombinantes que codifican un TCR anti-NY-ESO-1 murino.

Un vector retroviral que comprendía ADN que codifica TCR anti-NY-ESO-1 humano de tipo salvaje (1G4), TCR 1G4 que tiene una doble sustitución dentro de la cadena CDR3a en la que la leucina y la tirosina se sustituyen por treonina en la posición 95 (1G4-LY) (Robbins et al., J. Clin. Oncol., 29: 917-924 (2011); Robbins et al., J. Immunol., 180: 6116-6131 (2008)), o TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26) (SEQ ID NO: 11 y 12) se clonó en un esqueleto retroviral MSGVI y se transformó en células TOP10. Un péptido 2A de picornavirus (SEQ ID NO: 13) conectaba las cadenas alfa y beta. Se prepararon dos vectores que codifican el TRAV6D/TRBV26 TCR murino: uno contenía la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa localizada 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta (mESOap) (s Eq ID NO: 17), y uno contenía la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta localizada 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa (mESOpa) (SEQ ID NO: 18). La presencia de los insertos que codifican las cadenas alfa y beta del TCR se confirmó mediante digestión con enzimas de restricción Nco I y Not I. El ADN se generó a partir de un clon para cada uno de los TCR humanos y murinos mediante maxiprep.

El ADN de los vectores 1G4 TCR y 1G4-LY se transfectó a células 293GP para recoger el sobrenadante y transducir PBL en experimentos de transducción posteriores. Se utilizó un vector que codifica GFP como control.

Ejemplo 9

Este ejemplo demuestra la eficacia de transducción de un TCR anti-NY-ESO-1 murino.

Los linfocitos de la sangre periférica (PBL) se estimularon con OKT3 en el día 0 (S1). Los PBL se transdujeron con el vector TCR 1G4, 1G4-LY, mESOap o mESOpa del Ejemplo 8 en los días 3 y 4. Los días 7-11, se evaluó la eficacia de la transducción mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Se utilizaron un anticuerpo que reconoce la región variable del TCR murino (VB13.1) y un anticuerpo que reconoce la región constante del ^t C^r murino (mB) para la FACS. La FACS se realizó de 7 a 11 días después de la primera estimulación (S1D7-S1D11). Los resultados se resumen en la Tabla 10 a continuación.

Tabla 10

Como se muestra en la Tabla 10, los PBL transducidos con el vector de TCR mESOap o mESOpa se transdujeron con una eficacia similar en comparación con los vectores que codifican los TCR 1G4 y 1G4-LY.

Ejemplo 10

Este ejemplo demuestra la reactividad de las células transducidas con un vector que codifica un TCR anti-NY-ESO-1 murino.

Los PBL de cinco donantes se estimularon y o bien no se transdujeron o bien se transdujeron con vectores que codifican GFP o el TCR 1G4-LY, mESOap o mESOpa como se describe en el Ejemplo 9. Los PBL transducidos se cultivaron conjuntamente con una de las diversas líneas de células tumorales enumeradas en la Tabla 11A o 11B debajo o con células T2 pulsadas con péptido SSX, sin péptido (T2), o una de las diversas concentraciones de péptido NY-ESO-1 sn la Tabla 12 a continuación. La secreción de IFN^y se midió mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de sobrenadante de 24 horas a partir de cultivo conjuntos. El ELISA se realizó 6, 7 o 10 días después de la primera estimulación (S1D6, S1D7 y S1D10). Los resultados se muestran en las Tablas 11A, 11B y 12 (IFN^y pg/ml). La eficacia de la transducción (Td) se basó en el análisis FACS de células Vp13.1 mp .

Tabla 11A

Tabla 11B

Tabla 12

Las células transducidas con los vectores mESOap o mESOpa TCR reconocieron específicamente las líneas celulares tumorales diana NY-ESO-1+/HLA-A*0201+ pero no las líneas celulares HLA-A*0201"/NY-ESO-1+ o HLA-A*0201+/NY-ESO-1" según se midió mediante la secreción de IFN^y (Tablas 11Ay 11B). Las células transducidas con los vectores de TCR mESOap o mESOpa reconocieron específicamente las células T2 pulsadas con el péptido NY-ESO-1 según se midió mediante la secreción de IFN^y (Tabla 12). El reconocimiento específico de NY-ESO-1 fue uniforme entre las células de cinco donantes diferentes. La funcionalidad de las células transducidas con el TCR anti-NY-ESO-1 murino fue comparable con la de las células transducidas con el TCR anti-NY-ESO-1 humano. La funcionalidad de las células transducidas con el vector de TCR mESOpa fue ligeramente superior en comparación con la de las células transducidas con el vector de TCR mESOap. Los PBL transducidos con los vectores de TCR mESOap o mESOpa reconocieron las células T2 pulsadas con tan poco como 1 ng/mL, lo que indica que ambos mTCR son receptores de avidez relativamente alta. El cultivo conjunto de PBL que expresan los vectores de TCR mESOap o mESOpa con células T2 de control que no se pulsaron con ningún péptido produjo niveles de fondo de IFN-^y. Las células del paciente 1 transducidas con TCR mESOpa tenían niveles más altos de secreción de IFN-^y en comparación con las células transducidas con TCR mESOap para el mismo nivel de péptido. Las células del paciente 2 transducidas con TCR mESOpa tuvieron niveles más altos de secreción de IFN-^y en comparación con las células transducidas con TCR mESOap para el mismo nivel de péptido para concentraciones de péptidos de 1 |jg/ml, 100 ng/ml y 0,1 ng/ml.

Ejemplo 11

Este ejemplo demuestra que las células transducidas con un vector que codifica un TCR anti-NY-ESO-1 murino mantienen la expresión del TCR anti-NY-ESO-1 murino después de la expansión del número de células.

Los PBL de dos donantes fueron estimulados y o bien no transducidos o bien transducidos con vectores que codifican GFP o los TCR 1G4, 1G4-LY, mESOap o mESOpa como se describe en el Ejemplo 9. El número de PBL se expandió como describen en Riddell et al., en Science, 257: 238-241 (1992) y Dudley et al., en Cancer J. Sci. Am., 6: 69-77 (2000). En general, el número de PBL se expandió hasta 3 registros utilizando OKT3 soluble, células alimentadoras irradiadas e IL-2 de dosis alta. La expresión de TCR anti-NY-ESO-1 murino mediante el número expandido (expandido una vez) de células se midió mediante FACS dos veces (los días 10 y 20). Los resultados se resumen en la Tabla 13 (% de células VB13.1, mB+ después de la expansión).

Tabla 13

Como se muestra en la Tabla 13, la PBL transducida con el vector de TCR mESOap o mESOpa mantuvo la expresión del TCR anti-NY-ESO-1 murino después de la expansión del número de células.

Ejemplo 12

Este ejemplo demuestra que las células transducidas con un vector que codifica un TCR anti-NY-ESO-1 murino mantienen la funcionalidad después de la expansión del número de células transducidas.

Los PBL de dos donantes fueron estimulados y o bien no transducidos o bien transducidos con vectores que codifican GFP o el TCR 1G4-LY, mESOap o mESOpa como se describe en el Ejemplo 9. El número de células transducidas se expandieron como se describe en el Ejemplo 11. Se cultivaron PBL expandidos transducidos solo (medio) o co-cultivados con una de las diversas líneas de células tumorales enumeradas en la Tabla 14 a continuación o con células T2 pulsadas con péptido SSX, sin péptido (T2), o una de las diversas concentraciones de péptido NY-ESO-1^157-165 enumerado en la Tabla 15 a continuación. La secreción de IFNy se midió mediante ELISA nueve días después de la segunda estimulación (S2D9). Los resultados se muestran en las Tablas 14 y 15 (IFNy pg/ml; Dilución 1:10).

Tabla 14

Tabla 15

La funcionalidad de las células transducidas expandidas también se evaluó mediante un ensayo de liberación de cromo. Las células transducidas expandidas (células efectoras) se cultivaron conjuntamente con células de melanoma diana células 624.38 (Tabla 16A) o células A375 (Tabla 16B) a varias razones de células efectoras:diana (E:T), y se midió el porcentaje de células diana lisadas. Los resultados se muestran en las Tablas 16A y 16B (porcentaje de células diana lisadas).

Tabla 16A

Tabla 16B

Como se muestra en las Tablas 14, 15, 16A y 16B, las células transducidas con un vector que codifica un TCR anti-NY-ESO-1 murino mantuvieron la funcionalidad después de la expansión del número de células transducidas.

Ejemplo 13

Este ejemplo demuestra un método para producir clones de células empaquetadoras para la producción de mESOpa TCR para una posible aplicación clínica.

El ADN para el vector de TCR mESOpa se usó para producir clones de células de empaquetamiento de vectores retrovirales en las condiciones requeridas para una posible aplicación clínica. Se utilizó el sobrenadante de seis clones de células productoras de PG13 para transducir PBL. El análisis FACS de PBL transducidos utilizando el anticuerpo anti-cadena p de TCR de ratón reveló que cada clon producía un virus que medía la transducción positiva de TCR (Tabla 17). Para evaluar el reconocimiento específico de las células tumorales, los PBL modificados mediante mTCR de cada clon de células productoras de PG13 se cultivaron conjuntamente con un panel de líneas celulares HLA-A*0201 y HLA-A*0201" derivadas de melanoma y tumor de pulmón (Tabla 17). El IFN-gamma se midió mediante ELISA. Una comparación de los seis clones productores de mTCR PG13 mostró que las células T transducidas con el Clon C1 liberaron altos niveles de IFN-^y en respuesta a la diana de células tumorales HLA-A*0201+/NY-ESC)-1 H1299-A2 y demostraron la mayor eficacia de transducción (Tabla 17). Estas respuestas fueron específicas ya que los niveles de fondo de IFN-y se liberaron en respuesta a las líneas celulares NY-ESO-1+/HLA-A*0201- y las líneas celulares NY-ESO-1'/HLA-A*0201+ por cada clon (Figura 2). Sobre la base de este análisis, se seleccionó el Clon C1 para la producción de un banco de células maestro para la producción posterior de sobrenadante retroviral de buenas prácticas de fabricación (GMP).

Tabla 17

Ejemplo 14

Este ejemplo demuestra la eficacia de transducción de las células transducidas con un TCR mESOpa utilizando un sobrenadante retroviral del clon de células empaquetadoras del Ejemplo 13.

Para comparar los respectivos TCR NY-ESO-1 (murinos o mTCR, frente a los humanos, o hTCR (1G4-LY TCR)), el análisis de FACS de PBL transducidos con sobrenadante retroviral de clones de células de empaquetamiento utilizando los anticuerpos anti-cadena Vp de TCR de ratón y anti-Vp13.1 se realizaron después de una estimulación con OKT3 y después de una segunda expansión a gran escala utilizando el protocolo de expansión rápida (REP) (Tabla 18). Los resultados demostraron que tanto el mTCR como el hTCR tenían porcentajes equivalentes de transducción después de la estimulación, teniendo el mTCR niveles iguales o mayores de transducción después de REP (Tabla 18).

Tabla 18

Ejemplo 15

Este ejemplo demuestra la reactividad de las células transducidas con un TCR mESOpa utilizando un sobrenadante retroviral del clon de células empaquetadoras del Ejemplo 13.

El reconocimiento de cada TCR se evaluó sometiendo las células T transducidas con mTCR y hTCR a un cultivo conjunto con células T2 pulsadas con el péptido NY-ESO-1. Tanto el mTCR como el hTCR secretaron específicamente IFN-y al encontrarse con el péptido antigénico de una manera dependiente de la dosis después de una estimulación con OKT3 y después REP (Tabla 19). Después de una estimulación, tanto el mTCR como el hTCR reconocieron las células T2 pulsadas con tan solo 0,1 ng/ml, lo que indica que ambos mTCR son receptores de avidez relativamente alta. Tras la expansión del número de células, el mTCR liberó niveles más altos de IFN-y en comparación con el vector hTCR de las células T transducidas en cada concentración de péptido (Tabla 19). El cultivo conjunto de PBL que expresaba mTCR NY-ESO-1 o hTCR NY-ESO-1 con células T2 de control que no se pulsaron con ningún péptido produjo niveles de fondo de IFN-^y.

Tabla 19

Para evaluar el reconocimiento específico de las células tumorales, los PBL diseñados mediante mTCR se cultivaron conjuntamente con un panel de líneas celulares HLA-A*0201 y HLA-A*0201" derivadas de melanoma y tumor de pulmón. La liberación específica de IFN-^y se observó cuando tanto los PBL modificados mediante mTCR y el hTCR se cultivaron conjuntamente con líneas celulares HLA-A*0201+/NY-ESO-1 pero no con líneas celulares HLA-A*0201'/NY-ESO-1 o HLA-A*0201+/NY-ESO-1- (Tabla 20 (se muestran los experimentos representativos)).

Tabla 20

Ejemplo 16

Este ejemplo demuestra la lisis específica de células de melanoma por células transducidas con un TCR mESOpa utilizando un sobrenadante retroviral del clon de células empaquetadoras del Ejemplo 13.

También se comparó la lisis específica de líneas celulares de melanoma por el mTCR y el hTCR. La capacidad de los PBL transducidos para lisar células tumorales HLA-A*0201+/NY-ESO-1+ se midieron utilizando un ensayo de bioluminiscencia CYTOTOX-GLO (Promega, Madison, WI). Este ensayo utiliza un sustrato peptídico luminogénico, el sustrato AAF-GLO, para medir la actividad proteasa de células muertas, que se libera de las células que han perdido la integridad de la membrana, lo que da como resultado la generación de una señal luminiscente de "tipo incandescente" que es proporcional al número de células muertas en la muestra. El sustrato AAF-GLO no puede atravesar la membrana intacta de las células vivas y no genera ninguna señal apreciable de la población de células vivas. En estos ensayos, los PBL diseñados por t Cr se incubaron conjuntamente con proporciones crecientes de células diana (E:T) en medio AIM-V en placas de 96 pocillos con fondo en U a 37°C durante 4 horas (hr). La lisis se midió mediante liberación de bioluminiscencia en el medio: porcentaje de lisis específica = [liberación específica -(liberación efectora espontánea liberación espontánea de la diana)]/liberación total de la diana- liberación espontánea de la diana x 100%, promedio de muestras por cuadruplicado. Poca o ninguna lisis celular se mide como un valor negativo.

Como se muestra en la Tabla 21, los PBL transducidos tanto con mTCR como con hTCR demostraron una actividad lítica similar contra la línea celular NY-ESO-1+/HLA-A*0201+ de tumor de melanoma 624.38mel. Hubo poca o ninguna lisis de la línea celular HLA-A*0201- 938 mel, y los PBL transducidos con GFP no mostraron reactividad contra ninguna de las células diana (Tabla 21).

Tabla 21

Ejemplo 17

Este ejemplo demuestra la actividad antitumoral de las células transducidas con un TCR mESOpa o TCR humano utilizando un sobrenadante retroviral del clon de células empaquetadoras del Ejemplo 13.

También se investigó la actividad antitumoral de los linfocitos T CD4+ transducidos con el mTCR y el hTCR. Los PBL transducidos con hTCR NY-ESO-1 y mTCR NY-ESO-1 se enriquecieron con esferas magnéticas CD4+, a continuación se cultivaron conjuntamente durante 16 horas con un panel de líneas celulares HLA-A*0201+ y HLA-A*0201- derivadas de melanoma y tumor de pulmón. Los linfocitos T CD4+ transducidos con mTCR y hTCR tuvieron una liberación específica de IFN-y cuando se cultivaron conjuntamente con líneas celulares HLA-A*0201+/NY-ESO-1+ pero no con líneas celulares ^h L^a -A *02017 NY-ESO-1+ (Tabla 22).

Tabla 22

Ejemplo 18

Este ejemplo demuestra el reconocimiento específico de diferentes histologías de tumores por células transducidas con un TCR mESOpa utilizando un sobrenadante retroviral del clon de células empaquetadoras del Ejemplo 13. Para evaluar el reconocimiento específico de diversas histologías de tumores, los PBL transducidos con mTCR NY-ESO-1 se cultivaron conjuntamente con diferentes líneas celulares HLA-A *0201+NY-ESO-1+ derivadas de melanoma (A375), cáncer de pulmón de células no pequeñas (H1299-A2), neuroblastoma (SKN AS-A2), cáncer de mama (MDA-435S-A2) y osteosarcoma (Saos2). Se observó liberación específica de IFN-^y (Tabla 23).

Tabla 23

Ejemplo 19

Este ejemplo demuestra el reconocimiento de células tumorales tratadas con DAC por PBL transducidos con un TCR mESOpa.

Concentraciones crecientes del agente de desmetilación del ADN 5-aza-2'-desoxicitidina (decitabina; DAC) inducen la expresión de varios antígenos de testículos de cáncer en células de cáncer de pulmón (Rao et al., Ther. Tar. and Chem. Bio., 71: 4192-4204 (2011)). Sin desear estar limitado por una teoría o mecanismo concretos, se cree que el DAC puede, potencialmente, regular la expresión de NY-ESO-1 en las células cancerosas, lo que puede aumentar la capacidad de los TCR para reconocer NY-ESO-1.

Se cultivaron conjuntamente PBL transducido con mTCR NY-ESO-1 o no transducido durante 16 horas con las líneas celulares diana tumorales de diferentes histologías (mostradas en las Tablas 24A-24B) que se habían expuesto a DAC a las concentraciones mostradas en las Tablas 24A-24B durante 72 horas. Se midieron los niveles de interferón-gamma. Los resultados se muestran en la Tabla 24A-24B.

Tabla 24a

Tabla 24b

Como se muestra en las Tablas 24A y 24B, los PBL transducidos con TCR mESOpa demostraron una mayor reactividad hacia el cáncer de próstata y el cáncer colorrectal dianas tratados con DAC, respectivamente, en comparación con las células diana no tratadas.

Ejemplo 20

Este ejemplo demuestra el reconocimiento de células T2 pulsadas con péptidos NY-ESO-1 sustituidos con alanina por PBL transducidos con el TCR mESOpa o TCR humano.

Se cultivaron conjuntamente PBL humanos no transducidos o PBL humanos transducidos con mTCR (mESOpa del clon C1), hTCR (TCR 1G4-LY) o proteína verde fluorescente (GFP) durante 16 horas con células T2 no tratadas o células T2 que se pulsaron previamente con diferentes concentraciones de péptido como se muestra en las Tablas 25A y 25B. Se midió el interferón gamma. Los resultados se muestran en la Tabla 25A y 25B. Como se muestra en las Tablas 25A y 25B, el mTCR reconoce SEQ ID NO: 24, mientras que el hTCR no lo hace. Además, el hTCR reconoce SEQ iD NO: 27, pero el mTCR no lo hace.

Tabla 25A Donante K

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad (CDR) 1 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena beta de SEQ ID NO: 8, y que tiene especificidad antigénica para NY-ESO-1 (SEQ ID NO: 1), preferiblemente en donde el TCR:

(a) tiene especificidad antigénica para NY-ESO-^1157-165 (SEQ ID NO: 2);

(b) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y 10; y/o

(c) comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y 12.

2. Un polipéptido aislado o purificado que comprende una porción funcional del TCR según la reivindicación 1, en donde la porción funcional se une específicamente a NY-ESO-1 y comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena beta de SEQ ID NO: 8, preferiblemente en donde la porción comprende la secuencia de aminoácidos de:

(a) SEQ ID NO: 9 o 10, o ambos SEQ ID NO: 9 y 10; o

(b) SEQ ID NO: 11 o 12, o ambos SEQ ID NO: 11 y 12.

3. Una proteína aislada o purificada que se une específicamente a NY-ESO-1 y comprende todas las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8 según la reivindicación 2, preferiblemente en donde la proteína comprende:

(a) una primera cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-5 y una segunda cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6-8;

(b) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; o

(c) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

4. Una proteína de fusión que comprende la proteína aislada o purificada según la reivindicación 3.

5. Un anticuerpo recombinante que comprende la proteína aislada o purificada según la reivindicación 3 o 4.

6. Un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el TCR según la reivindicación 1, el polipéptido según la reivindicación 2, o la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, preferiblemente en donde la secuencia de nucleótidos

(a) tiene codones optimizados, y/o

(b) comprende SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, amnos SEQ ID NO: 15 y 16, o ambos SEQ ID NO: 19 y 20.

7. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 6.

8. El vector de expresión recombinante según la reivindicación 7, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 5 se encuentra 5' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena beta de SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena beta de SEQ ID NO: 8, preferiblemente en donde el vector de expresión recombinante comprende SEQ ID NO: 17.

9. El vector de expresión recombinante según la reivindicación 7, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 5 se encuentra 3' con respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena beta de SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena beta de SEQ ID NO: 8, preferiblemente en donde el vector de expresión recombinante comprende SEQ ID NO: 18.

10. Una célula anfitriona aislada que comprende el vector de expresión recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, preferiblemente en donde la célula es humana.

11. Una población de células que comprende al menos una célula anfitriona según la reivindicación 10.

12. Una composición farmacéutica que comprende el TCR según la reivindicación 1, el polipéptido según la reivindicación 2, la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, el ácido nucleico según la reivindicación 6, el vector de expresión recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, la célula anfitriona según la reivindicación 10, o la población de células según la reivindicación 11, y un portador farmacéuticamente aceptable.

13. Un método in vitro para detectar la presencia de cáncer en un mamífero, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra que comprende una o más células del mamífero con el TCR según la reivindicación 1, el polipéptido según la reivindicación 2, la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, el ácido nucleico según la reivindicación 6, el vector de expresión recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, la célula anfitriona según la reivindicación 10, la población de células según la reivindicación 11, o la composición farmacéutica según la reivindicación 12, formando así un complejo, y

(b) detectar el complejo, en donde la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero,

preferiblemente, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de ovario o sarcoma de células sinoviales.

14. El TCR según la reivindicación 1, el polipéptido según la reivindicación 2, la proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, el ácido nucleico de la reivindicación 6, el vector de expresión recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, la célula anfitriona según la reivindicación 10, la población de células según la reivindicación 11, o la composición farmacéutica según la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero, preferiblemente en donde el cáncer es melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de ovario o sarcoma de células sinoviales.