CN113454110A - Ny-eso-1 t细胞受体和其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供与HLA展示的纽约食管鳞状细胞癌‑1(NY‑ESO‑1)肽特异性结合的分离的T细胞受体(TCR)以及使用那些分离的TCR的治疗和诊断方法。

Description

NY-ESO-1 T细胞受体和其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年10月23日提交的美国临时申请第62/749,194号的优先权的权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。

序列表

本申请含有已经以ASCII格式电子提交并且特此通过引用以其整体并入的序列表。创建于2019年10月21日的所述ASCII副本命名为118003_10420_SL.txt，并且大小为74,556字节。

技术领域

本公开涉及与HLA展示的纽约食管鳞状细胞癌1(NY-ESO-1)肽特异性结合的抗原结合蛋白以及使用那些结合蛋白的治疗和诊断方法。

背景技术

T细胞受体(TCR)是包括类似于免疫球蛋白可变(V)和恒定(C)区的α和β链的膜结合异二聚体。TCRα链包含共价连接的V-α和C-α链，而β链包含与C-β链共价连接的V-β链。V-α链和V-β链形成可以在主要组织相容性复合物(MHC)(在人类中被称为HLA复合物)的上下文中结合抗原的口袋或裂口。(Davis Ann.《免疫学年度评论(Rev.of Immunology)》3:537(1985)；《基础免疫学(Fundamental Immunology)》第3版,W.Paul编辑吕森出版有限责任公司(Rsen Press LTD)纽约(1993))。

TCR是免疫系统的原代效应子，所述原代效应子具有作为用于开发治疗剂的平台的独特优势。虽然抗体治疗仅限于识别血液和细胞外空间中的病原体，或限于细胞表面上的蛋白质靶标，但T细胞受体可以识别细胞表面上MHC分子展示的抗原，包含源自细胞内蛋白的抗原。根据识别展示的抗原并被活化的T细胞的亚型，TCR可以参与控制各种免疫应答。例如，T细胞通过诱导B细胞分化成抗体产生细胞而涉及体液免疫应答的调节。另外，活化的T细胞用于启动细胞介导的免疫应答。因此，TCR可以识别抗体无法获得的另外的靶标。另外，据报道，TCR介导细胞杀伤，增加B细胞增殖并且影响包含癌症、过敏、病毒感染和自身免疫性病症的各种病症的发展和严重度。

鉴于TCR的功能，已经评估了抗原特异性TCR的其在免疫疗法中用于将T细胞重定向到表达抗原的肿瘤的能力。TCR将与长度仅为8到12个氨基酸的小肽结合，所述TCR通过主要组织相容性复合物(MHC)在靶细胞的表面上结合。因此，TCR可以识别源自癌症或病毒蛋白的细胞内抗原，因为这些抗原在表面MHC的上下文中被加工并且展示为肽。因此，TCR可以识别无法穿透细胞的抗体或疗法无法获得的另外的内部细胞靶标。

然而，工业上的挑战是工程化当向患者施用时缺乏免疫原性并且对所关注特定肽抗原具有优良特异性而又不与MHC上的其它肽或天然蛋白质库中发现的类似表位发生交叉反应的TCR。

NY-ESO-1或纽约食管鳞状细胞癌1是在多种癌症类型中均会重新表达的众所周知的癌-睾丸抗原(CTA)。其引出自发的体液和细胞免疫应答的能力，以及其受限制的表达模式，使其成为癌症免疫疗法的良好候选靶标。

尽管已经开发了若干种针对NY-ESO-1的疫苗，但几乎没有获得完整的体液和细胞免疫应答。已经开发了若干种患者来源的NY-ESO-1TCR，但已发现当将其向患者施用并且与MHC上的其它肽或天然蛋白质库中发现的类似表位发生交叉反应时具有免疫原性。另外，由于针对大多数肿瘤抗原的患者来源的TCR是自身抗原，所以主要由于免疫耐受性，靶向这些抗原的TCR常常缺失或具有次优的亲和力。

因此，在本领域中未满足对基于与NY-ESO-1抗原特异性结合的T细胞受体的新靶向剂以及用于在治疗和诊断环境中生产和使用此类靶向剂的方法的需求。

发明内容

本发明提供了在MHC(HLA-A2)的上下文中针对NY-ESO-1肽抗原产生的T细胞受体(TCR)。经鉴定的独特TCR序列已经示出了与HLA分子沟槽中呈递的小肽NY-ESO-1的特异性结合并且在报告基因测定中表现出T细胞的活化。此外，如用于针对预测的交叉反应性肽测试TCR的预测算法和随后的交叉反应性(特异性)测定所示出的，未发现与其它“类似”肽具有交叉反应性。

因此，一方面，本发明提供了分离的T细胞受体(TCR)，所述分离的TCR与包括SLLMWITQC(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列(NY-ESO-1(157-165))的HLA-A2呈递的癌睾丸抗原纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)肽特异性结合，其中所述TCR具有选自由以下组成的组的性质：(a)如通过发光测定确定的，不与对预测的脱靶肽但不是包括SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HLA-A2呈递的NY-ESO-1肽进行表达的细胞特异性结合；以及(b)活化比患者来源的NY-ESO-1特异性TCR大两倍的T细胞应答。

在一些实施例中，所述TCR活化如通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物测定确定的比患者来源的NY-ESO-1特异性TCR大约两倍、或大约三倍或大约四倍的T细胞应答。

所述TCR可以包含至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域。在一些实施例中，所述TCR包括TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。

在一些实施例中，所述α链可变结构域包括互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3区包括式I的氨基酸序列(SEQ ID NO:118)：

Cys-N₁-N₂-N₃-N₄-N₅-N₆-N₇-N₈-N₉-N₁₀-N₁₁-N₁₂-N₁₃-N₁₄-N₁₅-Phe(式I)，其中

N₁是非极性氨基酸；

N₂是Leu、Tyr、Val或Ala；

N₃是Arg、Asn、Thr或Ser；

N₄是Pro、Ser、Glu、Ile、Gly、Met、Lys或Thr；

N₅是Lys，所述N₅可以存在或可以不存在；

N₆是Asp、Ala、Gly、Leu或Asn，所述N₆可以存在或可以不存在；

N₇是Ser、Asn、Ala、Tyr或Thr；

N₈是Ser或Gly，所述N₈可以存在或可以不存在；

N₉是Gly，所述N₉可以存在或可以不存在；

N₁₀是Gly或Ser，所述N₁₀可以存在或可以不存在；

N₁₁是Trp、Gly、Ser、Gln、Ala或Pro，所述N₁₁可以存在或可以不存在；

N₁₂是Gly、Tyr、Asn、Gln或Ser；

N₁₃是Lys、Ala、Asp、Ile或Asn；

N₁₄是非极性氨基酸；并且

N₁₅是Gln、Asn、Arg、Thr、Val、Ile或Ser。

在一些实施例中，N₁是Ala或Ile。在一些实施例中，N₁₄是Phe、Leu、Met或Pro。

在一些实施例中，所述β链可变结构域包括互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3区包括式II的氨基酸序列(SEQ ID NO:119)：

Cys-N₁-N₂-N₃-N₄-N₅-N₆-N₇-N₈-N₉-N₁₀-N₁₁-N₁₂-N₁₃-N₁₄-Phe(式II)，其中

N₁和N₂各自独立地是Ala或Ser；

N₃是Ser、Met或Lys；

N₄是Tyr、Trp、His、Leu、Thr、Glu或Gln；

N₅是Ser、Ala、Thr、Gly、Val或Arg；

N₆是Gly、His、Asp、Thr、Pro、Met或Ser，所述N₆可以存在或可以不存在；

N₇是Gly、Tyr、Asn或Pro，所述N₇可以存在或可以不存在；

N₈是Y，所述N₈可以存在或可以不存在；

N₉是N，所述N₉可以存在或可以不存在；

N₁₀是极性氨基酸，所述N₁₀可以存在或可以不存在；

N₁₁是Pro、Glu、Gly或Asp；

N₁₂是Glu，所述N₁₂可以存在或可以不存在；

N₁₃是Leu、Ala、Gln或Tyr；并且

N₁₄是His、Phe或Thr。

在一些实施例中，N₁₀是Ser、Thr、Gln或Tyr。

在一些实施例中，所述α链可变结构域的所述CDR1包括表1中所示的CDR1氨基酸序列中的任一个，并且所述α链可变结构域的所述CDR2独立地包括表1中所示的CDR2氨基酸序列中的任一个。

在一些实施例中，所述β链可变结构域的所述CDR1包括表1中所示的CDR1氨基酸序列中的任一个，并且所述β链可变结构域的所述CDR2独立地包括表1中所示的CDR2氨基酸序列中的任一个。

在一些实施例中，所述分离的TCR包括α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述α链可变结构域序列中的任一个内；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述β链可变结构域序列中的任一个内。

在一些实施例中，所述分离的TCR包括α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

在一些实施例中，所述分离的TCR包括β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

在一些实施例中，所述分离的TCR包括：(a)α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性；以及(b)β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

在一些实施例中，所述分离的TCR包括

(a)α链可变结构域CDR1结构域，所述α链可变结构域CDR1结构域具有选自由SEQID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94和104组成的组的氨基酸序列；

(b)α链可变结构域CDR2结构域，所述α链可变结构域CDR2结构域具有选自由SEQID NO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95和105组成的组的氨基酸序列；

(c)α链可变结构域CDR3结构域，所述α链可变结构域CDR3结构域具有选自由SEQID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96和106组成的组的氨基酸序列；

(d)β链可变结构域CDR1，所述β链可变结构域CDR1具有选自由SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91和101组成的组的氨基酸序列；

(e)β链可变结构域CDR2，所述β链可变结构域CDR2具有选自由SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92和102组成的组的氨基酸序列；以及

(f)β链可变结构域CDR3，所述β链可变结构域CDR3具有选自由SEQ ID NO:3、13、23、33、43、54、63、73、83、93和103组成的组的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述分离的TCR包括α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对，所述α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对选自由以下组成的组：SEQ ID NO:9/7；19/17；29/27；39/37；49/47；59；57；69/67；79/77；89/87；99/97；和109/107。

本发明还提供了分离的TCR，其竞争与本文所公开的所述分离的TCR中的任何分离的TCR结合。

在一些实施例中，本发明的所述分离的TCR进一步包括可检测的部分。

本发明进一步提供了药物组合物，其包括本发明的所述分离的TCR和药学上可接受的载剂或稀释剂；以及呈递本发明的所述TCR的分离的细胞。

在一些实施例中，本发明提供了一种分离的多核苷酸分子，其包括对本发明的所述分离的TCR的α链可变结构域进行编码的多核苷酸序列。

在另一个实施例中，本发明提供了一种分离的多核苷酸分子，其包括对本发明的所述分离的TCR的β链可变结构域进行编码的多核苷酸序列。

本发明还提供了载体，其包括本发明的所述多核苷酸分子；以及细胞，所述细胞表达本发明的所述载体。

一方面，本发明提供了一种治疗患有NY-ESO-1相关疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明的所述分离的TCR、本发明的所述药物组合物或多种本发明的所述细胞，从而治疗所述受试者。

在一些实施例中，所述NY-ESO-1相关疾病或病症是NY-ESO-1相关癌症，如脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、卵巢上皮癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、滑膜肉瘤、转移性实体瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、晚期黏液型病(advancedmyxoid)、圆细胞脂肪肉瘤、转移性黑色素瘤或复发性非小细胞肺癌。在一些实施例中，所述NY-ESO-1相关癌症是脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌或乳腺癌。

在一些实施例中，将所述分离的TCR、所述药物组合物或所述多种细胞与第二治疗剂组合向所述受试者施用。

在一些实施例中，将所述分离的TCR、所述药物组合物或所述多种细胞经皮下、静脉内、皮内、腹膜内、口服、肌内或颅内向所述受试者施用。

一方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码T细胞受体(TCR)，其中所述TCR与包括SLLMWITQC(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列(NY-ESO-1(157-165))的HLA-A2呈递的癌睾丸抗原纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)肽特异性结合，其中所述TCR具有选自由以下组成的组的性质：(a)如通过发光测定确定的，不与对预测的脱靶肽但不是包括SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HLA-A2呈递的NY-ESO-1肽进行表达的细胞特异性结合；以及(b)活化比患者来源的NY-ESO-1特异性TCR大约两倍的T细胞应答。

在一些实施例中，所述TCR活化如通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物测定确定的比患者来源的NY-ESO-1特异性TCR大约两倍、或大约三倍或大约四倍的T细胞应答。

在一些实施例中，所述分离的核酸分子编码至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域。

在一些实施例中，所述TCR包括α链可变结构域互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，所述α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述α链可变结构域中的任一个内；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述β链可变结构域序列中的任一个内。

在一些实施例中，所述分离的TCR包括α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

在一些实施例中，所述分离的TCR包括β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

在一些实施例中，所述分离的TCR包括：(a)α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性；以及(b)β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

在一些实施例中，所述分离的抗原结合蛋白包括

(a)α链可变结构域CDR1，所述α链可变结构域CDR1具有选自由SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94和104组成的组的氨基酸序列；

(b)α链可变结构域CDR2，所述α链可变结构域CDR2具有选自由SEQ ID NO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95和105组成的组的氨基酸序列；

(c)α链可变结构域CDR3，所述α链可变结构域CDR3具有选自由SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96和106组成的组的氨基酸序列；

(d)β链可变结构域CDR1，所述β链可变结构域CDR1具有选自由SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91和101组成的组的氨基酸序列；

(e)β链可变结构域CDR2，所述β链可变结构域CDR2具有选自由SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92和102组成的组的氨基酸序列；以及

(f)β链可变结构域CDR3，所述β链可变结构域CDR3具有选自由SEQ ID NO:3、13、23、33、43、54、63、73、83、93和103组成的组的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述分离的TCR包括α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对，所述α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对选自由以下组成的组：SEQ ID NO:9/7；19/17；29/27；39/37；49/47；59；57；69/67；79/77；89/87；99/97；和109/107。

本发明还提供了载体，所述载体包括本发明的所述分离的核酸分子；以及分离的细胞，所述分离的细胞包括本发明的所述载体。

一方面，本发明提供了一种治疗患有NY-ESO-1相关疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括本发明的所述载体的多种细胞，从而治疗所述受试者。

在一些实施例中，所述NY-ESO-1相关疾病或病症是NY-ESO相关癌症。

在一些实施例中，所述NY-ESO-1相关癌症是脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、卵巢上皮癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、滑膜肉瘤、转移性实体瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、晚期黏液型病、圆细胞脂肪肉瘤、转移性黑色素瘤或复发性非小细胞肺癌。在一些实施例中，所述NY-ESO-1相关癌症是脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌或乳腺癌。

在一些实施例中，所述多种细胞与第二治疗剂组合向所述受试者施用。

本发明提供了一种分离的T细胞受体(TCR)，其与包括SLLMWITQC(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列(NY-ESO-1(157-165))的HLA-A2呈递的癌睾丸抗原纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)肽特异性结合，其中所述TCR具有选自由以下组成的组的性质：(a)如通过发光测定确定的，不与对预测的脱靶肽但不是包括SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HLA-A2呈递的NY-ESO-1肽进行表达的细胞特异性结合；以及(b)活化如通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物测定确定的信噪比大于或等于患者来源的NY-ESO-1特异性TCR的T细胞应答。

在一些实施例中，所述TCR活化如通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物测定确定的比患者来源的NY-ESO-1特异性TCR大约两倍、或大约三倍或大约四倍的T细胞应答。在一些实施例中，所述TCR包括至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域。在一些实施例中，所述TCR包括TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。在一些实施例中，所述α链可变结构域包括互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3区包括式I的氨基酸序列：

Cys-N₁-N₂-N₃-N₄-N₅-N₆-N₇-N₈-N₉-N₁₀-N₁₁-N₁₂-N₁₃-N₁₄-N₁₅-Phe(式I)，其中

N₁是非极性氨基酸；

N₂是Leu、Tyr、Val或Ala；

N₃是Arg、Asn、Thr或Ser；

N₄是Pro、Ser、Glu、Ile、Gly、Met、Lys或Thr；

N₅是Lys，所述N₅可以存在或可以不存在；

N₆是Asp、Ala、Gly、Leu或Asn，所述N₆可以存在或可以不存在；

N₇是Ser、Asn、Ala、Tyr或Thr；

N₈是Ser或Gly，所述N₈可以存在或可以不存在；

N₉是Gly，所述N₉可以存在或可以不存在；

N₁₀是Gly或Ser，所述N₁₀可以存在或可以不存在；

N₁₁是Trp、Gly、Ser、Gln、Ala或Pro，所述N₁₁可以存在或可以不存在；

N₁₂是Gly、Tyr、Asn、Gln或Ser；

N₁₃是Lys、Ala、Asp、Ile或Asn；

N₁₄是非极性氨基酸；并且

N₁₅是Gln、Asn、Arg、Thr、Val、Ile或Ser。

在一些实施例中，N₁是Ala或Ile。在一些实施例中，N₁₄是Phe、Leu、Met或Pro。在一些实施例中，所述β链可变结构域包括互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3区包括式II的氨基酸序列：

Cys-N₁-N₂-N₃-N₄-N₅-N₆-N₇-N₈-N₉-N₁₀-N₁₁-N₁₂-N₁₃-N₁₄-Phe(式II)，其中

N₁和N₂各自独立地是Ala或Ser；

N₃是Ser、Met或Lys；

N₄是Tyr、Trp、His、Leu、Thr、Glu或Gln；

N₅是Ser、Ala、Thr、Gly、Val或Arg；

N₆是Gly、His、Asp、Thr、Pro、Met或Ser，所述N₆可以存在或可以不存在；

N₇是Gly、Tyr、Asn或Pro，所述N₇可以存在或可以不存在；

N₈是Y，所述N₈可以存在或可以不存在；

N₉是N，所述N₉可以存在或可以不存在；

N₁₀是极性氨基酸，所述N₁₀可以存在或可以不存在；

N₁₁是Pro、Glu、Gly或Asp；

N₁₂是Glu，所述N₁₂可以存在或可以不存在；

N₁₃是Leu、Ala、Gln或Tyr；并且

N₁₄是His、Phe或Thr。

在一些实施例中，N₁₀是Ser、Thr、Gln或Tyr。在一些实施例中，所述α链可变结构域的所述CDR1包括表1中所示的CDR1氨基酸序列中的任一个，并且所述α链可变结构域的所述CDR2独立地包括表1中所示的CDR2氨基酸序列中的任一个。在一些实施例中，所述β链可变结构域的所述CDR1包括表1中所示的CDR1氨基酸序列中的任一个，并且所述β链可变结构域的所述CDR2独立地包括表1中所示的CDR2氨基酸序列中的任一个。在一些实施例中，所述分离的TCR包括α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述α链可变结构域序列中的任一个内；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述β链可变结构域序列中的任一个内。在一些实施例中，所述分离的TCR包括α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。在一些实施例中，所述分离的TCR包括β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。在一些实施例中，所述分离的TCR包括：(a)α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性；以及(b)β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。在一些实施例中，所述分离的TCR包括：

(a)α链可变结构域CDR1结构域，所述α链可变结构域CDR1结构域具有选自由SEQID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94和104组成的组的氨基酸序列；

(b)α链可变结构域CDR2结构域，所述α链可变结构域CDR2结构域具有选自由SEQID NO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95和105组成的组的氨基酸序列；

(c)α链可变结构域CDR3结构域，所述α链可变结构域CDR3结构域具有选自由SEQID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96和106组成的组的氨基酸序列；

(d)β链可变结构域CDR1，所述β链可变结构域CDR1具有选自由SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91和101组成的组的氨基酸序列；

(e)β链可变结构域CDR2，所述β链可变结构域CDR2具有选自由SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92和102组成的组的氨基酸序列；以及

(f)β链可变结构域CDR3，所述β链可变结构域CDR3具有选自由SEQ ID NO:3、13、23、33、43、54、63、73、83、93和103组成的组的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述分离的TCR包括α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对，所述α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对选自由以下组成的组：SEQ ID NO:9/7；19/17；29/27；39/37；49/47；59；57；69/67；79/77；89/87；99/97；和109/107。

在一些实施例中，本公开提供了一种分离的TCR，其竞争与上文所描述的分离的TCR结合。在一些实施例中，本公开提供了一种分离的TCR，其进一步包括可检测的部分。

本发明提供了一种药物组合物，其包括上文所描述的分离的TCR和药学上可接受的载剂或稀释剂。本发明提供了一种分离的细胞，其呈递上文所描述的TCR。本发明提供了一种多核苷酸分子，其包括对如上文所描述的分离的TCR的α链可变结构域进行编码的多核苷酸序列。本发明提供了一种多核苷酸分子，其包括对如上文所描述的分离的TCR的β链可变结构域进行编码的多核苷酸序列。本发明提供了一种载体，其包括所述多核苷酸分子。本发明提供了一种细胞，其表达所述载体。

本发明提供了一种治疗患有NY-ESO-1相关疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如上文所描述的分离的TCR、药物组合物或多种细胞，从而治疗所述受试者。

在一些实施例中，所述NY-ESO-1相关疾病或病症是NY-ESO-1相关癌症。在一些实施例中，所述NY-ESO-1相关癌症是脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、卵巢上皮癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、滑膜肉瘤、转移性实体瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、晚期黏液型病、圆细胞脂肪肉瘤、转移性黑色素瘤或复发性非小细胞肺癌。在一些实施例中，将所述分离的TCR、所述药物组合物或所述多种细胞与第二治疗剂组合向所述受试者施用。在一些实施例中，将所述分离的TCR、所述药物组合物或所述多种细胞经皮下、静脉内、皮内、腹膜内、口服、肌内或颅内向所述受试者施用。

本发明提供了一种多核苷酸分子，其编码T细胞受体(TCR)，其中所述TCR与包括SLLMWITQC(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列(NY-ESO-1(157-165))的HLA-A2呈递的癌睾丸抗原纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)肽特异性结合，其中所述TCR具有选自由以下组成的组的性质：(a)如通过发光测定确定的，不与对预测的脱靶肽但不是包括SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HLA-A2呈递的NY-ESO-1肽进行表达的细胞特异性结合；以及(b)活化如通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物测定确定的比患者来源的NY-ESO-1特异性TCR大约两倍的T细胞应答。

在一些实施例中，所述多核苷酸分子编码至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域。在一些实施例中，所述TCR包括α链可变结构域互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，所述α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述α链可变结构域中的任一个内；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述β链可变结构域序列中的任一个内。在一些实施例中，所述分离的TCR包括α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。在一些实施例中，所述分离的TCR包括β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。在一些实施例中，所述分离的TCR包括：(a)α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性；以及(b)β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。在一些实施例中，所述分离的抗原结合蛋白包括

(a)α链可变结构域CDR1，所述α链可变结构域CDR1具有选自由SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94和104组成的组的氨基酸序列；

(b)α链可变结构域CDR2，所述α链可变结构域CDR2具有选自由SEQ ID NO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95和105组成的组的氨基酸序列；

(c)α链可变结构域CDR3，所述α链可变结构域CDR3具有选自由SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96和106组成的组的氨基酸序列；

(d)β链可变结构域CDR1，所述β链可变结构域CDR1具有选自由SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91和101组成的组的氨基酸序列；

(e)β链可变结构域CDR2，所述β链可变结构域CDR2具有选自由SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92和102组成的组的氨基酸序列；以及

(f)β链可变结构域CDR3，所述β链可变结构域CDR3具有选自由SEQ ID NO:3、13、23、33、43、54、63、73、83、93和103组成的组的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述分离的TCR包括α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对，所述α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对选自由以下组成的组：SEQ ID NO:9/7；19/17；29/27；39/37；49/47；59；57；69/67；79/77；89/87；99/97；和109/107。

本发明提供了一种载体，其包括如上文所描述的所述多核苷酸分子。本发明提供了一种分离的细胞，其包括所述载体。本发明提供了一种治疗患有NY-ESO-1相关疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用多种那些细胞，从而治疗所述受试者。在一些实施例中，所述NY-ESO-1相关疾病或病症是NY-ESO相关癌症。在一些实施例中，所述NY-ESO相关癌症是脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、卵巢上皮癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、滑膜肉瘤、转移性实体瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、晚期黏液型病、圆细胞脂肪肉瘤、转移性黑色素瘤或复发性非小细胞肺癌。在一些实施例中，所述多种细胞与第二治疗剂组合向所述受试者施用。

本发明提供了一种T细胞受体(TCR)，其与包括SLLMWITQC(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列(NY-ESO-1(157-165))的HLA-A2呈递的癌睾丸抗原纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)肽特异性结合，其中所述TCR包括互补决定区3(CDR3)，所述CDR3含有SEQ ID NO:9、19、29、39、49、59、69、79、89、99和109中任一个的α链可变结构域。

本发明提供了一种T细胞受体(TCR)，其与包括SLLMWITQC(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列(NY-ESO-1(157-165))的HLA-A2呈递的癌睾丸抗原纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)肽特异性结合，其中所述TCR包括互补决定区3(CDR3)，所述CDR3包含在SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97和107中任一个的β链可变结构域内。

在一些实施例中，所述α链可变结构域进一步包括CDR1和CDR2，其中所述CDR1包括表1中所示的α链可变结构域CDR1氨基酸序列中的任一个，并且所述CDR2独立地包括表1中所示的α链可变结构域CDR2氨基酸序列中的任一个。在一些实施例中，所述β链可变结构域进一步包括CDR1和CDR2，其中所述CDR1包括表1中所示的所述β链可变CDR1氨基酸序列中的任一个，并且所述CDR2独立地包括表1中所示的β链可变结构域CDR2氨基酸序列中的任一个。在一些实施例中，所述TCR包括至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域。在一些实施例中，所述TCR包括TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。在一些实施例中，所述TCR包括α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列中的任一个内；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列中的任一个内。

在一些实施例中，所述TCR包括α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。在一些实施例中，所述TCR包括β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。在一些实施例中，所述TCR包括：(a)α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性；以及(b)β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。在一些实施例中，所述TCR包括：

(a)α链可变结构域CDR1结构域，所述α链可变结构域CDR1结构域具有选自由SEQID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94和104组成的组的氨基酸序列；

(b)α链可变结构域CDR2结构域，所述α链可变结构域CDR2结构域具有选自由SEQID NO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95和105组成的组的氨基酸序列；

(c)α链可变结构域CDR3结构域，所述α链可变结构域CDR3结构域具有选自由SEQID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96和106组成的组的氨基酸序列；

(d)β链可变结构域CDR1，所述β链可变结构域CDR1具有选自由SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91和101组成的组的氨基酸序列；

(e)β链可变结构域CDR2，所述β链可变结构域CDR2具有选自由SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92和102组成的组的氨基酸序列；以及

(f)β链可变结构域CDR3，所述β链可变结构域CDR3具有选自由SEQ ID NO:3、13、23、33、43、53、63、73、83、93和103组成的组的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述TCR包括α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对，所述α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对选自由SEQ ID NO:9/7、19/17、29/27、39/37、49/47、59/57、69/67、79/77、89/87、99/97和109/107组成的组。在一些实施例中，所述TCR进一步包括可检测的部分。

在一些实施例中，所述TCR的中靶结合/脱靶结合值大于5、大于10、大于15、大于20、大于50、大于100、大于200、大于300、大于400、大于500、大于600、大于700、大于800、大于900或大于1000。在一些实施例中，所述TCR的中靶结合/脱靶结合值大于10。在一些实施例中，所述TCR的中靶结合/脱靶结合值大于500。

本发明提供了一种TCR，其竞争与如上文所描述的TCR结合。

本发明提供了一种药物组合物，其包括如本文所描述的TCR和药学上可接受的载剂或稀释剂。本发明提供了一种分离的细胞，其呈递如本文所描述的TCR。本发明提供了一种多核苷酸分子，其包括对本文所描述的TCR的α链可变结构域进行编码的多核苷酸序列。本发明提供了一种多核苷酸分子，其包括对如本文所描述的TCR的β链可变结构域进行编码的多核苷酸序列。本发明提供了一种载体，其包括α链或β链多核苷酸序列。本发明提供了一种分离的细胞，其表达所述载体。

本发明提供了一种治疗患有NY-ESO-1相关疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所描述的TCR、如本文所描述的药物组合物或如本文所描述的分离的细胞，从而治疗所述受试者。

在一些实施例中，所述NY-ESO-1相关疾病或病症是NY-ESO-1相关癌症。在一些实施例中，所述NY-ESO-1相关癌症是脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、卵巢上皮癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、滑膜肉瘤、转移性实体瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、晚期黏液型病、圆细胞脂肪肉瘤、转移性黑色素瘤或复发性非小细胞肺癌。在一些实施例中，将所述TCR、所述药物组合物或所述细胞与第二治疗剂组合向所述受试者施用。在一些实施例中，所述施用是肠胃外施用。

本发明提供了一种多核苷酸分子，其编码T细胞受体(TCR)，其中所述TCR与包括SLLMWITQC(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列(NY-ESO-1(157-165))的HLA-A2呈递的癌睾丸抗原NY-ESO-1肽特异性结合，其中所述TCR具有选自由以下组成的组的性质：(a)如通过发光测定确定的，不与对预测的脱靶肽但不是包括SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HLA-A2呈递的NY-ESO-1肽进行表达的细胞特异性结合；(b)如通过流式细胞术测定确定的，不与表达预测的脱靶肽的细胞结合；(c)活化如通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物测定确定的比患者来源的NY-ESO-1特异性TCR大约两倍的T细胞应答；以及(d)活化如通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物测定确定的比亲和力成熟的(例如，通过噬菌体展示)的NY-ESO-1特异性TCR大约两倍的T细胞应答。在一些实施例中，所述多核苷酸分子编码至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域。在一些实施例中，所述TCR包括α链可变结构域互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，所述α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述α链可变结构域中的任一个内；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述β链可变结构域序列中的任一个内。在一些实施例中，所述TCR包括α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。在一些实施例中，所述TCR包括β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。在一些实施例中，所述TCR包括：(a)α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性；以及(b)β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。在一些实施例中，所述TCR包括

(a)α链可变结构域CDR1结构域，所述α链可变结构域CDR1结构域具有选自由SEQID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94和104组成的组的氨基酸序列；

(b)α链可变结构域CDR2结构域，所述α链可变结构域CDR2结构域具有选自由SEQID NO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95和105组成的组的氨基酸序列；

(c)α链可变结构域CDR3结构域，所述α链可变结构域CDR3结构域具有选自由SEQID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96和106组成的组的氨基酸序列；

(d)β链可变结构域CDR1，所述β链可变结构域CDR1具有选自由SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91和101组成的组的氨基酸序列；

(e)β链可变结构域CDR2，所述β链可变结构域CDR2具有选自由SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92和102组成的组的氨基酸序列；以及

(f)β链可变结构域CDR3，所述β链可变结构域CDR3具有选自由SEQ ID NO:3、13、23、33、43、53、63、73、83、93和103组成的组的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述TCR包括α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对，所述α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对选自由SEQ ID NO:9/7、19/17、29/27、39/37、49/47、59/57、69/67、79/77、89/87、99/97和109/107组成的组。

在一些实施例中，所述TCR包括

(a)α链可变结构域CDR1，所述α链可变结构域CDR1由选自由SEQ ID NO:124、130、137、145和156组成的组的核酸序列编码；

(b)α链可变结构域CDR2，所述α链可变结构域CDR2由选自由SEQ ID NO:125、131、138、146和157组成的组的核酸序列编码；

(c)α链可变结构域CDR3，所述α链可变结构域CDR3由选自由SEQ ID NO:126、132、135、139、147、149、158、160和161组成的组的核酸序列编码；

(d)β链可变结构域CDR1，所述β链可变结构域CDR1由选自由SEQ ID NO:121、127、133、140、142、150和153组成的组的核酸序列编码；

(e)β链可变结构域CDR2，所述β链可变结构域CDR2由选自由SEQ ID NO:122、128、143、151和154组成的组的核酸序列编码；以及

(f)β链可变结构域CDR3，所述β链可变结构域CDR3由选自由SEQ ID NO:123、129、134、136、141、144、148、152、155、159组成的组的核酸序列编码。

在一些实施例中，所述TCR包括α链可变结构域/β链可变结构域核酸序列对，所述α链可变结构域/β链可变结构域核酸序列对选自由SEQ ID NO:10/8、20/18、30/28、40/38、50/48、60/58、70/68、80/78、90/88、100/98和110/108组成的组。

本发明提供了一种载体，其包括本文所描述的多核苷酸分子的多核苷酸序列。本发明提供了一种分离的细胞，其包括所述载体。本发明提供了一种治疗患有NY-ESO-1相关疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用所述细胞。在一些实施例中，所述NY-ESO-1相关疾病或病症是NY-ESO-1相关癌症。在一些实施例中，所述NY-ESO-1相关癌症是脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、卵巢上皮癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、滑膜肉瘤、转移性实体瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、晚期黏液型病、圆细胞脂肪肉瘤、转移性黑色素瘤或复发性非小细胞肺癌。在一些实施例中，所述细胞与第二治疗剂组合向所述受试者施用。

在一些实施例中，如本文所描述的细胞是原代细胞，如原代淋巴细胞(例如，原代T淋巴细胞)。

通过以下详细描述和附图进一步展示本发明。

附图说明

图1描绘了如通过发光测定确定的所示TCR的活性。将表达HLA-A2/NY-ESO-1(157-165)特异性TCR的报告基因T细胞与呈递NY-ESO-1肽的HLA-A2+APC共培养。VelociT^TM来源的TCR活化的T细胞比患者来源的NY-ESO特异性1G4对照TCR更强。

图2A、图2B、图2C、图2D和图2E描绘了如通过发光测定确定的所示TCR的特异性。图2A示出了对于EARS2:306-313脱靶肽的特异性。图2B示出了对于MAGEH1:90-98脱靶肽的特异性。图2C示出了对于FBXL22:4-12脱靶肽的特异性。图2D示出了对于URB1:1853-1861脱靶肽的特异性。图2E示出了对于LV9-5粘蛋白脱靶肽的特异性。图2A-2E按出现顺序分别公开了SEQ ID NO:111、114、111、115、111、116、111、117、111和120。

图3描绘了用于在原代T细胞中表达TCR001构建体的TCR构建体设计。HV表示每个相应TCR链的人可变结构域，并且MC表示小鼠恒定结构域。EF1a启动子如箭头所示，并且弗林蛋白酶切割位点由实心黑框表示。

图4描绘了用靶向TRAC基因座和TRBC1/2基因座的sgRNA电穿孔后内源性TCR表达的丧失。用抗人CD3将T细胞染色以评估细胞表面TCR表达。

图5A和图5B描绘了用于检测识别由HLA-A2呈递的NY-ESO-1157-165肽的抗原特异性T细胞的右旋体染色数据。图5A示出了在分选前和紧接分选后扩增第9天的数据。图5B示出了在分选后扩增12天后的数据。

图6描绘了细胞毒性数据，所述细胞毒性数据示出了表达TCR001的T细胞裂解了表达内源性水平的NY-ESO-1(IM9)或过表达带有NY-ESO-1(157-165)肽的单链HLA-A2的靶细胞(IM9⁺⁺)。使用缺乏NY-ESO-1表达的K562细胞来确保TCR介导的杀伤是抗原依赖性的。未经转导和未经扩增的T细胞无法杀伤任何靶细胞，这表明TCR001的表达对于靶细胞裂解是必需的。

具体实施方式

本发明提供了在MHC(HLA-A2)的上下文中针对NY-ESO-1肽抗原产生的T细胞受体(TCR)。经鉴定的独特TCR序列已经示出了与HLA分子沟槽中呈递的小肽NY-ESO-1的特异性结合并且在报告基因测定中表现出T细胞的活化。此外，如针对预测的交叉反应性肽评估TCR的预测算法和随后的交叉反应性(特异性)测定所示出的，未发现与其它“类似”肽具有交叉反应性。

I.定义

为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。此外，应该注意的是，每当引用参数的值或值的范围时，意图是所引用的值中间的值和范围也是本发明的一部分。

在以下描述中，出于解释的目的，阐述了具体的数字、材料和配置，以便提供对本发明的透彻理解。然而，对于本领域普通技术人员来说，很明显，本发明可以在没有这些具体细节的情况下实践。在一些情况下，众所周知的特征可以省去或简化，以免模糊本发明。此外，说明书中对如“一个实施例”或“实施例”等短语的提及意指结合实施例描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施例中。说明书中各个地方出现的如“在一个实施例中”等短语不一定全都指同一实施例。

本文使用冠词“一个(a)”和“一种(an)”来指代所述冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法宾语。举例来说，“要素”是指一个要素或多于一个要素。

术语“包括(comprising或comprises)”是参考对于本公开来说关键但可能包含未指定要素(无论是否关键)的组合物、方法和其一个或多个相应组分而在本文使用的。

术语“由…组成”是指如本文所描述的组合物、方法和其相应组分，所述组合物、方法和其相应组分不包括在对所述实施例的描述中未列举的任何要素。

如本文所使用的，术语“T细胞受体”(TCR)是指能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽的具有可变结合结构域、恒定结构域、跨膜区和短细胞质尾的免疫球蛋白超家族成员；参见例如Janeway等人,《免疫生物学：健康与疾病的免疫系统(Immunobiology:TheImmune System in Health and Disease)》,第3版,当前生物学出版物(Current BiologyPublications),4:33页,1997)。TCR可以在细胞表面上发现，并且通常包含具有α和β链(分别被称为TCRα和TCRβ)或γ和δ链(分别被称为TCRγ和TCRδ)的异二聚体。像免疫球蛋白一样，TCR链的细胞外部分(例如，α链、β链)含有两个免疫球蛋白区、可变区(例如，TCR可变α区或Vα和TCR可变β区或Vβ；在N端的通常基于Kabat编号的氨基酸1到116)和与细胞膜相邻的一个恒定区(例如，TCR恒定结构域α或Cα，并且通常为基于Kabat的氨基酸117到259，TCR恒定结构域β或Cβ，通常为基于Kabat的氨基酸117到295)。也像免疫球蛋白一样，可变结构域含有被框架区(FR)隔开的互补决定区(CDR)。在某些实施例中，TCR在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现并且与CD3复合物缔合。本公开的TCR的来源可以来自各种动物物种，如人、小鼠、大鼠、兔或其它哺乳动物。在优选的实施例中，本发明的TCR的来源是经基因工程化以产生包括人α和β链的TCR的小鼠(参见，例如，PCT公开号WO 2016/164492，所述公开的全部内容通过引用并入本文)。

如本文所使用的，术语“可变区”(α链的可变区(Vα)、β链的可变区(Vβ))表示直接涉及将TCR与抗原结合的α链和β链中的每个链。

α链和β链的“恒定区”不直接涉及TCR与抗原的结合，但是表现出各种效应功能。

如本文所使用的，术语“抗原”是指使免疫系统产生抗体或针对所述免疫系统的特异性细胞介导的免疫响应的任何物质。疾病相关抗原是与导致免疫系统产生抗体或针对所述免疫系统的特异性细胞介导的响应的任何疾病相关的任何物质。

术语“NY-ESO-1”或“纽约食管鳞状细胞癌1”是指在多种癌症类型中均会重新表达的众所周知的癌-睾丸抗原(CTA)。

全长NY-ESO-1的核苷酸和氨基酸序列在GenBank中以登录号NM_001327.2提供(分别为SEQ ID NO:112和113)。特定NY-ESO-1核苷酸碱基和氨基酸的编号分别相对于SEQ IDNO:112或113，或相对于另一个NY-ESO-1序列(例如，与SEQ ID NO:112或113比对的序列)中的对应位置。如本文所使用的，编号可以用括号(例如，NY-ESO-1(157-165))、下标(例如，NY-ESO-1_157-165)或表示编号的其它格式表示。术语“NY-ESO-1”包含重组NY-ESO-1或其片段。术语还涵盖与例如组氨酸标签、小鼠或人Fc或信号序列(如ROR1)偶联的NY-ESO-1或其片段。在某些实施例中，术语在HLA-A2的上下文中包括与HLA-A2连接或如HLA-A2所展示的NY-ESO-1或其片段。

术语“HLA”是指人白细胞抗原(HLA)系统或复合物，所述HLA系统或复合物是编码人的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的基因复合物。这些细胞表面蛋白负责调节人的免疫系统。对应于I类MHC(A、B和C)的HLA从细胞内部呈递肽。

术语“HLA-A”是指由HLA-A基因座编码的人白细胞抗原(HLA)的组。HLA-A是I类人MHC细胞表面受体的三种主要类型之一。受体是异二聚体，并且由重α链和较小β链构成。α链由变体HLA-A基因编码，并且β链(β2-微球蛋白)是不变的β2微球蛋白分子。

术语“HLA-A2”(其也可以被称为HLA-A^*0201或HLA-A^*02:01)是HLA-A基因座处的一个特定的I类主要组织相容性复合物(MHC)等位基因组；α链由HLA-A^*02基因编码，并且β链由β2-微球蛋白或B2M基因座编码。

术语“特异性结合”或“与...特异性结合”等意指TCR与在生理条件下相对稳定的抗原形成复合物。特异性结合由平衡解离常数为至少约1×10^-6M或更小，例如1×10^-8M或更小(例如，较小的K_D表示更紧密的结合)表征。用于确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域众所周知的，并且包含例如平衡透析、表面等离子体共振等。如本文所描述的，本发明的TCR与HLA-A2呈递的癌睾丸抗原纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)肽，例如包括NY-ESO-1的氨基酸残基157-165的肽特异性结合。

术语“脱靶肽”是指与靶肽(例如，NY-ESO-1(157-165)肽)相差1、2、3、4、5个或更多个氨基酸的肽。在某些实施例中，术语包含与靶肽相差小于或等于3个氨基酸的肽。例如，对于9聚体肽，如果1、2或3个氨基酸与靶肽不同，则将其视为“脱靶”肽。在某些实施例中，氨基酸同一性以“类似性程度”(DoS)表达。如果9聚体肽内的6个或更多个氨基酸相同，则DoS为6。在某些实施例中，DoS≤6的肽被视为“脱靶”肽。术语“脱靶”肽还指基于序列同源性与靶肽类似，预测与HLA-A2结合并且包括在必需的正常组织中表达的蛋白质中的肽。因此，在一些实施例中，本公开的TCR可以以对应于K_D值比其与脱靶肽结合的亲和力低至少十倍的亲和力与HLA-A2呈递的NY-ESO-1肽(例如，包括NY-ESO-1的氨基酸残基157-165的肽)结合。

术语“分离的”是指由人的手从天然状态改变的成分、化合物、物质或分子。例如，如果天然存在的组合物或物质已被更改或从其原始环境中移除或者两者，则其是分离的。例如，天然存在于活体动物中的多核苷酸或多肽不是分离的，但是与其天然状态的共存材料分开的相同多核苷酸或多肽是分离的，正如本文所用的术语。

如本文所使用的，术语“重组”是指通过本领域已知为重组DNA技术的技术或方法产生、表达、分离或获得的本发明的TCR，所述技术或方法包含例如DNA剪接和转基因表达。术语是指在非人哺乳动物(包含转基因非人哺乳动物，例如，转基因小鼠)或细胞(例如，CHO细胞)表达系统中表达或从重组组合人抗体文库分离的TCR。

如本文所使用的，术语“多核苷酸”和“核酸分子”可互换使用，以指任何长度的核苷酸的聚合形式。多核苷酸可以含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。核甘酸可以具有任何三维结构并且可以执行任何已知或未知的功能。术语“多核苷酸”包含例如单链、双链和三螺旋分子、基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、反义分子、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、适体、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸分子还可以包括经修饰的核酸分子(例如，包括经修饰的碱基、糖和/或核苷酸间接头)。

术语“多肽”旨在是指优选地基本上由20种天然氨基酸中的任何一种组成的任何聚合物(无论其大小如何)。虽然术语“蛋白质”经常用于指相对大的蛋白质，而“肽”经常用于指小的多肽，但是这些术语在本领域中的使用经常重叠。除非另有说明，否则术语“多肽”通常指蛋白质、多肽和肽。如通过标准分子大小测定技术(如离心或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)所判断的，根据本公开内容有用的肽通常为约0.1到100kDa或更大多达约1000kDa之间，优选地介于约0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30与50kDa之间。

术语“载体”是能够在宿主细胞中自主复制并且可以接受外源DNA的核酸分子。载体承载有其自身的复制起点、可以用于插入外源DNA的限制性核酸内切酶的一个或多个独特识别位点、以及通常可选择标志物(例如，针对抗生素抗性进行编码的基因)以及常常用于表达插入的DNA的识别序列(例如，启动子)。常见的载体包含质粒载体和噬菌体载体。

在一些实施例中，本发明的TCR可以与如配体、可检测部分或治疗性部分(“免疫缀合物”)(如细胞毒素、抗癌药物或用于治疗包含NY-ESO-1相关疾病或病症(如NY-ESO-1相关癌症)的疾病或病状的任何其它治疗性部分)等部分缀合。

如本文所使用的，术语“表面等离子体共振”是指允许通过例如使用BIACORE^TM系统(法玛西亚生物传感器AB(Pharmacia Biosensor AB)，瑞典乌普萨拉和新泽西州皮斯卡塔韦)检测生物传感器基质内蛋白质浓度的变化来分析实时生物分子相互作用的光学现象。

术语“KD”，也被称为K_D或K_d，旨在是指特定生物分子和其结合配偶体的平衡解离常数。KD测量结果对于评估蛋白质间相互作用(例如在抗原结合蛋白-抗原相互作用中)特别有用。KD值越小，抗原结合蛋白与抗原(例如靶标)之间的结合相互作用或亲和力越大(或例如越强)。KD值越大，抗原结合蛋白与抗原之间的结合相互作用或亲和力越弱。

当提及核酸或其片段时，术语“基本同一性”或“基本上相同”指示当通过适当的核苷酸插入或缺失与另一种核酸(或其互补链)进行最佳比对时，核苷酸序列同一性为核苷酸碱基的至少约90％，并且更优选地至少约95％、96％、97％、98％或99％，如通过任何熟知的序列同一性算法所测量，如以下所讨论的。在某些情况下，与参考核酸分子具有基本同一性的核酸分子可以编码具有与由参考核酸分子编码的多肽相同或基本上类似的氨基酸序列的多肽。

序列同一性可以使用例如用于整体比对的Needleman Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》.48:443-453)或用于局部比对的SmithWaterman算法(Smith和Waterman 1981,《分子生物学杂志》.147:195-197)。另一种优选算法由Dufresne等人在2002年在《自然生物技术(Nature Biotechnology)》(第20卷,第1269-1271页)中进行了描述并且用于软件GenePAST(GQ生命科学公司,麻萨诸塞州波士顿)。

当应用于多肽时，术语“基本类似性”或“基本上类似”意指如通过程序GAP或BESTFIT使用默认间隙权重进行最佳比对时，两个肽序列共享至少90％的序列同一性，甚至更优选地至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守性氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是一个氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有化学特性(例如，电荷或疏水性)类似的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代。总体而言，保守氨基酸取代将不会实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，百分比或类似性程度可以向上调整以校正取代的保守性质。用于作出此调整的方法是本领域技术人员所熟知的。参见例如，Pearson(1994)《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》24:307-331，所述文献通过引用并入本文。具有化学性质类似的侧链的氨基酸基团的实例包含1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替代是在以下文献中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化：Gonnet等人(1992)《科学(Science)》256:1443 45，所述文献通过引用并入本文。“适度保守”替代是PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。

通常使用序列分析软件来测量多肽的序列类似性。蛋白质分析软件使用分配给包含保守氨基酸取代在内的各种取代、缺失和其它修饰的类似性措施来匹配类似的序列。例如，GCG软件含有如GAP和BESTFIT等程序，所述程序可以在默认参数下使用以测定紧密相关的多肽(如来自不同生物体物种的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变体之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，6.1版GCG。还可以使用FASTA(使用默认或推荐参数)——6.1版GCG中的程序来比较多肽序列。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供了询问序列与搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)同上文)。序列也可以使用Smith-Waterman同源性搜索算法进行比较，所述算法使用的仿射缺口搜索的缺口开放罚分为12，并且缺口延伸罚分为2，BLOSUM矩阵为62。当将本发明的序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库进行比较时，另一个优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见例如，Altschul等人(1990)《分子生物学杂志》215:403-410和(1997)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402，所述文献中的每个文献通过引用并入本文。

“患者来源的TCR”是通过分离从介导患有NY-ESO-1相关癌症的受试者的肿瘤体内消退的T淋巴细胞中分离的NY-ESO-1反应性TCR的α链和β链产生的TCR。示例性患者来源的NY-ESO-1TCR被称为1G4(参见例如，美国专利第8,143,376号，所述美国专利的全部内容通过引用并入本文)。

术语“活化信噪比强于或等于患者来源的NY-ESO-1特异性TCR的T细胞应答”旨在是指如通过例如如实例2中所描述的发光生物测定测量的增加(即约2倍或更多)、扩增(即约2倍)、增大(即约2倍)或增强生理活性(即约2倍)即T细胞信号传导。关于较大的T细胞应答，或较强的T细胞应答或活化信号，可以互换使用。T细胞应答或T细胞活化的各种测量结果和测定是技术人员熟知的。

短语“治疗有效量”意指施用以产生期望效果的量。精确量将取决于治疗的目的，并且将可由本领域的技术人员使用已知的技术确定(参见例如，Lloyd(1999)《药物复合的艺术、科学和技术(The Art,Science and Technology of PharmaceuticalCompounding)》)。术语“有效量”旨在涵盖上下文，如药学有效量或治疗有效量。例如，在某些实施例中，有效量能够实现有益状态、有益结果、筛选测定中的功能活性或临床病状的改善。

如本文所使用的，术语“受试者”是指需要改善、预防和/或治疗NY-ESO-1相关疾病或病症(如NY-ESO-1相关癌症(例如，NY-ESO-1阳性癌症)的动物，优选地哺乳动物。术语包含患有NY-ESO-1相关疾病或病症(如n NY-ESO-1相关癌症)或有患所述疾病或病症风险的人类受试者。

如本文所使用的，“抗癌药物”意指可用于治疗或改善或抑制癌症的任何药剂，包含但不限于细胞毒素和药剂，如抗代谢物、烷化剂、蒽环类药物、抗生素、抗有丝分裂剂、丙卡巴肼、羟基脲、天冬酰胺酶、皮质类固醇、环磷酰胺、米托坦(O,P′-(DDD))、生物制剂(例如，抗体和干扰素)和放射性药剂。如本文所使用的，“细胞毒素或细胞毒性剂”也指化学治疗剂，并且意指对细胞有害的任何药剂。实例包含

(紫杉醇(paclitaxel))、替莫唑胺(temozolamide)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、顺铂、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素以及其类似物或同源物。

术语“防止(prevent)”、“防止(preventing)”、“防止(prevention)”、“预防性治疗(prophylactic treatment)”等旨在是指降低未患有病症或病状但有患病症或病状的风险或易于患病症或病状的受试者患病症或病状的可能性。防止等并不意味着防止受试者患上特定的疾病或病症。防止可能需要施用多个剂量。防止可以包含防止已消除所有疾病症状的受试者的疾病的复发，或防止复发缓解型疾病的复发。

II.NY-ESO-1T细胞受体(TCR)和包括NY-ESO-1TCR的组合物

T细胞是细胞的亚组，其与其它免疫细胞类型(多形核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、B细胞、NK细胞)一起构成免疫系统的细胞组分。在生理条件下，T细胞用于免疫监视和消除外源抗原。然而，在病理条件下，有令人信服的证据表明T细胞在疾病的病因和传播中起主要作用。在这些病症中，中枢或外周T细胞免疫耐受性的破坏是导致自身免疫疾病的基本过程。

T细胞结合与主要组织相容性复合物(MHC；在小鼠中)或人白细胞抗原(HLA；在人中)复合物缔合的抗原呈递细胞表面的小抗原决定簇上的表位。T细胞通过T细胞表面上的T细胞受体(TCR)复合物结合这些表位。T细胞受体是由两种类型的链构成的异二聚体结构：α(alpha)和β(beta)链，或γ(gamma)和δ(delta)链。α链由位于(人或小鼠14号染色体上的)α基因座(其也涵盖整个δ基因座)内的核酸序列编码，并且β链由位于(小鼠6号染色体或人7号染色体上的)β基因座内的核酸序列编码。大多数T细胞具有αβTCR；而少数T细胞带有γδTCR。

T细胞受体α和β多肽(以及类似的γ和δ多肽)通过二硫键彼此连接。构成TCR的两个多肽中的每个多肽均含有包括恒定区和可变区的细胞外结构域、跨膜结构域和胞质尾区(跨膜结构域和胞质尾区也是恒定区的一部分)。TCR的可变区决定了其抗原特异性，并且类似于免疫球蛋白，包括三个互补决定区(CDR)。TCR在体内大多数T细胞上表达，并且已知涉及MHC限制性抗原的识别。TCRα链包含共价连接的Vα和Cα区，而β链包含与Cβ区共价连接的Vβ区。在主要组织相容性复合物(MHC)(或人的HLA)的上下文中，Vα区和Vβ区形成可以结合抗原的口袋或裂口。TCR是具有出色特异性的检测分子，并且像抗体一样表现出巨大的多样性。

已经公开了TCR分子的一般结构以及制备和使用的方法，包含与肽：主要组织相容性复合物的结合。参见例如PCT/US98/04274；PCT/US98/20263；WO99/60120。

可以对非人动物(例如，啮齿动物，例如小鼠或大鼠)进行基因工程化，以表达人或人源化T细胞受体(TCR)，所述TCR包括由至少一个人TCR可变区基因区段编码的可变结构域，如例如PCT公开号WO 2016/164492中描述的，所述公开的全部内容通过引用并入本文。例如，

小鼠技术(再生元公司(Regeneron))，允许产生针对肿瘤和/或病毒抗原的完全人用治疗性TCR的经基因修饰的小鼠，可以用于产生本发明的TCR。本领域技术人员通过标准诱变技术，结合本文所描述的测定，可以获得改变的TCR序列并且测试其特定结合亲和力和/或特异性。本领域已知的有用诱变技术包含但不限于从头基因合成、寡核苷酸定向诱变、区域特异性诱变、接头扫描诱变和通过PCR的定点诱变(参见例如，Sambrook等人(1989)和Ausubel等人(1999))。

简而言之，在一些实施例中，用于产生针对NY-ESO-1(157-165)肽的TCR的方法可以包含免疫非人动物(例如，啮齿类动物，例如小鼠或大鼠)，如其基因组中包括未重排的人TCR可变基因座并带有NY-ESO-1(157-165)肽的经基因工程化的非人动物；允许动物对肽产生免疫应答；从动物中分离对肽具有反应性的T细胞；确定由T细胞表达的人TCR可变区的核酸序列；将人TCR可变区克隆到包括人TCR恒定区的核酸序列的核苷酸构建体中，使得人TCR可变区可操作地连接到人TCR恒定区；以及从构建体表达对NY-ESO-1(157-165)肽具有特异性的人T细胞受体。在一些实施例中，分离T细胞、确定由T细胞表达的人TCR可变区的核酸序列、将人TCR可变区克隆到包括人TCR恒定区的核酸序列的核苷酸构建体中以及表达人T细胞受体的步骤使用本领域技术人员已知的标准技术执行。

在一些实施例中，编码对所关注抗原具有特异性的T细胞受体的核苷酸序列在细胞中表达。在一些实施例中，表达TCR的细胞选自CHO、COS、293、海拉(HeLa)、PERC.6^TM细胞等。

在获得变体TCR编码序列时，本领域普通技术人员将认识到，可以通过某些氨基酸取代、添加、缺失和翻译后修饰来修饰TCR来源的蛋白质，而不会丧失或降低生物活性。具体地，众所周知的是，保守氨基酸取代，即用一个氨基酸取代具有类似大小、电荷、极性和构象的另一个氨基酸，不可能显著改变蛋白质功能。构成蛋白质的20种标准氨基酸可以大致分类为如下四个保守氨基酸组：非极性(疏水)组包含丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸；极性(不带电的中性)组包含天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；带正电的(碱性)组包含精氨酸、组氨酸和赖氨酸；并且带负电的(酸性)组包含天冬氨酸和谷氨酸。用蛋白质中的一个氨基酸取代同一组中的另一个氨基酸不太可能对蛋白质的生物活性产生不利影响。

在一些实施例中，本公开的TCR可以包括与表6的CDR序列(例如，CDR3序列，如VαCDR3或VβCDR3)相比具有1种或多种取代的CDR序列(例如，CDR3序列，如VαCDR3或VβCDR3)。例如，与表6的CDR序列相比，本公开的TCR可以包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种取代的CDR序列。通常，本发明的TCR通过与HLA-A2呈递的NY-ESO-1(157-165)肽结合而起作用。如本文所使用的，HLA呈递的肽(如HLA-A2呈递的肽)可以指与人白细胞抗原(HLA)蛋白，例如在细胞的表面上表达的HLA蛋白结合的肽。因此，与HLA呈递的肽结合的TCR与由HLA结合的肽结合，并且任选地还与HLA本身结合。与HLA的相互作用可以赋予与特定HLA呈递的肽结合的特异性。在一些实施例中，TCR与分离的HLA呈递的肽结合。在一些实施例中，TCR在细胞的表面上与HLA呈递的肽结合。

通常，本发明的TCR可以通过与HLA-A2呈递的NY-ESO-1(157-165)肽结合而起作用。

本发明包含在HLA-A2的上下文中以高特异性结合NY-ESO-1(157-165)肽的NY-ESO-1TCR。在一些实施例中，在不存在HLA-A2的情况下，NY-ESO-1TCR不与NY-ESO-1(157-165)肽结合，或者此类结合是最小的。进一步，在一些实施例中，在HLA-A2的上下文中，NY-ESO-1TCR不与脱靶肽结合，或者此类结合是最小的。如本文所使用的，脱靶肽可以指与靶肽相差1、2、3、4、5个或更多个氨基酸的肽。在一些实施例中，可以通过以下方式确定结合特异性：a)测量中靶结合(例如，与HLA-A2呈递的NY-ESO-1(157-165)肽结合)，b)测量脱靶结合以及c)例如通过计算比率来量化两者之间的差异。可以例如通过将在a)和b)中获得的值相除来计算比率。例如，中靶和脱靶结合的测量可以通过测量与肽/HLA四聚体试剂(例如，NY-ESO-1/HLA四聚体试剂或MAGE-H1 90-98/HLA四聚体试剂)结合的百分比，或通过本领域已知的其它技术来实现。在一些实施例中，本公开的TCR的中靶结合/脱靶结合值(例如，通过除以在上文所描述的a)和b)中获得的值而获得的值)可以大于5、大于6、大于7、大于8、大于9、大于10、大于11、大于12、大于13、大于14、大于15、大于16、大于17、大于18、大于19、大于20、大于21、大于22、大于23、大于24、大于25、大于26、大于27、大于28、大于29、大于30、大于35、大于40、大于45、大于50、大于55、大于60、大于65、大于70、大于75、大于80、大于85、大于90、大于95、大于100、大于110、大于120、大于130、大于140、大于150、大于160、大于170、大于180、大于190、大于200、大于225、大于250、大于275、大于300、大于325、大于350、大于375、大于400、大于425、大于450、大于475、大于500、大于550、大于600、大于650、大于700、大于750、大于800、大于850、大于900、大于950、大于1000、大于1100、大于1200、大于1300、大于1400、大于1500、大于1600、大于1700、大于1800、大于1900或大于2000。在一些实施例中，中靶结合/脱靶结合值(例如，通过除以在上文所描述的a)和b)中获得的值而获得的值)可以为约5到约20、约10到约30、约20到约80、约30到约70、约40到约60、约50到约250、约100到约200、约100到约1000、约300到约700、约500到约1500、约800到约1200、约900到约1100、约800到约1500、约1000到约1400或约1100到约1300。

在一些实施例中，本发明提供了重组抗原结合蛋白(例如，分离的抗原结合蛋白)，所述重组抗原结合蛋白与HLA-A2呈递的人NY-ESO-1(157-165)肽的构象表位特异性结合，其中抗原结合蛋白具有选自由以下组成的组的性质：(a)结合单体HLA-A2：NY-ESO-1(157-165)肽，其结合解离平衡常数(K_D)小于约20nM，如在25℃下在表面等离子体共振测定中测得的；(b)结合单体HLA-A2：NY-ESO-1(157-165)肽，其结合解离平衡常数(K_D)小于约25nM，如在25℃下在表面等离子体共振测定中测得的；(c)结合HLA-A2：表达NY-ESO-1(157-165)肽的细胞(EC₅₀小于约6nM)并且如通过发光测定确定的，不与对预测的脱靶肽但不是包括SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HLA-A2呈递的NY-ESO-1肽进行表达的细胞特异性结合；(d)结合HLA-A2：表达NY-ESO-1(157-165)肽的细胞(EC₅₀小于约1nM)并且如通过发光测定确定的，不与对预测的脱靶肽进行表达的细胞基本上结合；(e)结合HLA-A2：表达NY-ESO-1(157-165)肽的细胞(EC₅₀小于约30nM)，如通过流式细胞术测定确定的；(f)结合HLA-A2：表达NY-ESO-1(157-165)肽的细胞(EC₅₀小于约75nM)，如通过流式细胞术测定确定的；以及(g)构象表位包括SEQ ID NO:111的一个或多个氨基酸。

在一些实施例中，本公开的NY-ESO-1TCR对NY-ESO-1(157-165)具有特异性活性或亲和力，如通过体外测定所测量的。例如，可以用NY-ESO-1(157-165)多肽或脱靶多肽对表达HLA的细胞(如T2细胞)进行脉冲化，从而诱导所述细胞呈递与HLA结合的多肽。可替代地或除了使用脱靶多肽作为对照之外，可以使用脱靶HLA(除所关注的TCR所识别的HLA以外的HLA)。例如，脱靶HLA可以用于呈递NY-ESO-1肽，以测试与HLA-A2呈递的NY-ESO-1 1肽结合的特异性。另外，对照可以是既不表达NY-ESO-1也不表达靶标HLA(例如，HLA-A2)的细胞系。可以将细胞与表达所关注的TCR的T细胞群体共培养，并且根据细胞产生的细胞因子(如干扰素γ)的量来测量活性。在某些实施例中，测定可以包括将表达TCR的T细胞群体与10^-10M装载肽的T2细胞在效应细胞:靶细胞比率为1:1(1×10⁵个效应细胞/96孔)下进行体外共培养并且共培养24小时后(例如，通过Meso Scale Discovery

Sector Imager)进行干扰素γ测量。在某些实施例中，测定可以包括将表达TCR的T细胞群体与效应细胞在效应细胞:靶细胞比率为5:1(2.5×10⁵个效应细胞:5×10⁴个靶细胞)下进行体外共培养并且共培养24小时后(例如，通过Meso Scale Discovery

Sector Imager)进行干扰素γ测量。

检测到的细胞因子的增加量可以用作活性的指标。与对照(脱靶)多肽相比，所关注TCR对其靶肽的活性或特异性，或与脱靶HLA结合的靶肽相比，所关注TCR对其中靶HLA结合的靶肽的活性或特异性可以是2倍或更大、3倍或更大、4倍或更大、5倍或更大、6倍或更大、7倍或更大、8倍或更大、9倍或更大、10倍或更大、15倍或更大、20倍或更大、30倍或更大、40倍或更大、50倍或更大、100倍或更大、200倍或更大、300倍或更大、400倍或更大、500倍或更大、600倍或更大、700倍或更大、800倍或更大、900倍或更大、1,000倍或更大、1,500倍或更大、2,000倍或更大、2,500倍或更大、3,000倍或更大、4,000倍或更大、5,000倍或更大、10,000倍或更大、20,000倍或更大、30,000倍或更大、40,000倍或更大、50,000倍或更大、60,000倍或更大、70,000倍或更大、80,000倍或更大、90,000倍或更大或100,000倍或更大。

在某些实施例中，本发明的NY-ESO-1TCR在向有需要的受试者预防性施用时可用于抑制肿瘤的生长或延迟癌症的进展，并且可以增加受试者的存活期。例如，本发明的NY-ESO-1TCR的施用可以导致原发性肿瘤缩小并且可以防止继发性肿瘤的转移或发展。在某些实施例中，本发明的NY-ESO-1TCR在向有需要的受试者治疗性施用时可用于抑制肿瘤的生长，并且可以增加受试者的存活期。例如，向受试者施用治疗有效量的本发明的NY-ESO-1TCR可以导致受试者的已证实的肿瘤缩小和消失。

在一些实施例中，本发明提供了一种分离的TCR，所述分离的TCR与HLA-A2呈递的NY-ESO-1(157-165)肽特异性结合，其中抗原结合蛋白表现出以下特性中的一个或多个特性：(i)包括α链可变结构域，所述α链可变结构域包括互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3区包括式I的氨基酸序列(SEQ ID NO:118)：

Cys-N₁-N₂-N₃-N₄-N₅-N₆-N₇-N₈-N₉-N₁₀-N₁₁-N₁₂-N₁₃-N₁₄-N₁₅-Phe(式I)，其中

N₁是非极性氨基酸；

N₂是Leu、Tyr、Val或Ala；

N₃是Arg、Asn、Thr或Ser；

N₄是Pro、Ser、Glu、Ile、Gly、Met、Lys或Thr；

N₅是Lys，所述N₅可以存在或可以不存在；

N₆是Asp、Ala、Gly、Leu或Asn，所述N₆可以存在或可以不存在；

N₇是Ser、Asn、Ala、Tyr或Thr；

N₈是Ser或Gly，所述N₈可以存在或可以不存在；

N₉是Gly，所述N₉可以存在或可以不存在；

N₁₀是Gly或Ser，所述N₁₀可以存在或可以不存在；

N₁₁是Trp、Gly、Ser、Gln、Ala或Pro，所述N₁₁可以存在或可以不存在；

N₁₂是Gly、Tyr、Asn、Gln或Ser；

N₁₃是Lys、Ala、Asp、Ile或Asn；

N₁₄是非极性氨基酸；并且

N₁₅是Gln、Asn、Arg、Thr、Val、Ile或Ser；任选地其中N₁是Ala或Ile；和/或其中N₁₄是Phe、Leu、Met或Pro；(ii)包括β链可变结构域，所述β链可变结构域包括互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3区包括式II的氨基酸序列(SEQ ID NO:119)：

Cys-N₁-N₂-N₃-N₄-N₅-N₆-N₇-N₈-N₉-N₁₀-N₁₁-N₁₂-N₁₃-N₁₄-Phe(式II)，其中

N₁和N₂各自独立地是Ala或Ser；

N₃是Ser、Met或Lys；

N₄是Tyr、Trp、His、Leu、Thr、Glu或Gln；

N₅是Ser、Ala、Thr、Gly、Val或Arg；

N₆是Gly、His、Asp、Thr、Pro、Met或Ser，所述N₆可以存在或可以不存在；

N₇是Gly、Tyr、Asn或Pro，所述N₇可以存在或可以不存在；

N₈是Y，所述N₈可以存在或可以不存在；

N₉是N，所述N₉可以存在或可以不存在；

N₁₀是极性氨基酸，所述N₁₀可以存在或可以不存在；

N₁₁是Pro、Glu、Gly或Asp；

N₁₂是Glu，所述N₁₂可以存在或可以不存在；

N₁₃是Leu、Ala、Gln或Tyr；并且

N₁₄是His、Phe或Thr；任选地其中N₁₀是Ser、Thr、Gln或Tyr；(iii)包括所述α链可变结构域的CDR1，所述CDR1包括表1中所示的所述CDR1氨基酸序列中的任一个或其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列；以及所述α链可变结构域的CDR2，所述CDR2独立地包括表1中所示的所述CDR2氨基酸序列中的任一个或其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列；(iv)包括β链可变结构域的CDR1，所述CDR1包括表1中所示的所述CDR1氨基酸序列中的任一个或其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列；以及β链可变结构域的CDR2，所述CDR2独立地包括表1中所示的所述CDR2氨基酸序列中的任一个或其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列；(v)包括α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的α链可变结构域序列中的任一个或其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列内；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的β链可变结构域序列中的任一个或其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的基本上类似序列内；(vi)包括α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％氨基酸同一性；(vii)包括β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％氨基酸同一性；(viii)包括(a)α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％氨基酸同一性；以及(b)β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％氨基酸同一性；(ix)包括(a)α链可变结构域CDR1结构域，所述α链可变结构域CDR1结构域具有选自由SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94和104组成的组的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的基本上类似序列；(b)α链可变结构域CDR2结构域，所述α链可变结构域CDR2结构域具有选自由SEQ ID NO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95和105组成的组的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的基本上类似序列；(c)α链可变结构域CDR3结构域，所述α链可变结构域CDR3结构域具有选自由SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96和106组成的组的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的基本上类似序列；(d)β链可变结构域CDR1结构域，所述β链可变结构域CDR1结构域具有选自由SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91和101组成的组的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的基本上类似序列；(e)β链可变结构域CDR2结构域，所述β链可变结构域CDR2结构域具有选自由SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92和102组成的组的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的基本上类似序列；以及(f)β链可变结构域CDR3结构域，所述β链可变结构域CDR3结构域具有选自由SEQ ID NO:3、13、23、33、43、54、63、73、83、93和103组成的组的氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的基本上类似序列；(x)包括α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对，所述α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对选自由以下组成的组：SEQ ID NO:9/7；19/17；29/27；39/37；49/47；59；57；69/67；79/77；89/87；99/97；以及109/107；或其具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的基本上类似序列；(xi)如通过发光测定确定的，不与对预测的脱靶肽但不是包括SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HLA-A2呈递的NY-ESO-1肽进行表达的细胞特异性结合；和/或(xii)活化如通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物测定确定的比患者来源的NY-ESO-1特异性TCR大约两倍的T细胞应答，例如，活化比患者来源的NY-ESO-1特异性TCR大约两倍、或大约三倍或大约四倍的T细胞应答。

本发明的TCR可以具有前述生物学特性或其任何组合中的一种或多种。通过阅读本公开，包含本文的工作实例，本发明的抗原结合蛋白的其它生物学特性对于本领域普通技术人员而言将是显而易见的。

在某些实施例中，将编码本文所描述的NY-ESO-1TCR的多核苷酸插入载体中。如本文所使用的，术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸共价插入其中以便引起所述蛋白质的表达和/或多核苷酸的克隆的媒剂。此类载体也可以被称为“表达载体”。可以使用本领域已知的任何合适方法将分离的多核苷酸插入载体中，例如但不限于，可以使用适当的限制酶消化载体，并且然后可以将其与具有匹配的限制性末端的分离的多核苷酸连接。表达载体具有掺入并表达编码能够在细胞中转录的基因产物的至少一部分的异源或经修饰的核酸序列的能力。在大多数情况下，RNA分子然后被翻译成蛋白质。表达载体可以含有多种控制序列，其是指特定宿主生物体中的可操作连接的编码序列的转录和可能翻译所必需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列外，载体和表达载体还可以含有具有其它功能的核酸序列，并且在下文中进行讨论。表达载体可以包括另外的元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而使其在两种生物体中维持，例如在人类细胞中进行表达并在原核宿主中进行克隆和扩增。

表达载体可以具有必需的5'上游和3'下游调节元件，如启动子序列(如CMV、PGK和EF1α启动子)、核糖体识别和结合TATA盒以及3'UTR AAUAAA转录终止序列，以在其相应的宿主细胞中进行高效的基因转录和翻译。其它合适的启动子包含猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、HIV LTR启动子，MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EBV立即早期启动子和劳斯肉瘤病毒启动子的组成型启动子。也可以使用人基因启动子，包含但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。在某些实施例中，诱导型启动子也被认为是表达嵌合抗原受体的载体的一部分。这提供了能够开启所关注的多核苷酸序列的表达或关闭表达的分子开关。诱导型启动子的实例包含但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子或四环素启动子。

表达载体可以具有另外的序列，如掺入表达的TCR中的6x-组氨酸(SEQ ID NO:165)、c-Myc和FLAG标签。因此，表达载体可以被工程化以含有5'和3'未翻译调节序列，所述序列有时可以充当可以促进或增强表达载体上携带的所关注的一个或多个核酸的高效转录的增强子序列、启动子区和/或终止子序列。表达载体也可以被工程化用于在特定细胞类型、细胞位置或组织类型中的复制和/或表达功能(例如，转录和翻译)。表达载体可以包含用于在宿主或受体细胞中维持载体的可选择标志物。

载体的实例是质粒、自主复制序列和转座元件。另外的示例性载体包含但不限于：质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)、如λ噬菌体或M13噬菌体等噬菌体以及动物病毒。可用作载体的动物病毒的类别的实例包含但不限于：逆转录病毒(包含慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒以及乳多空病毒(例如，SV40)。表达载体的实例是用于在哺乳动物细胞中表达的Lenti-X^TM双顺反子表达系统(Neo)载体(Clontrch公司)、pClneo载体(普洛麦格公司(Promega))；用于慢病毒介导的基因转移和在哺乳动物细胞中表达的pLenti4/V5-DEST.^TM、pLenti6/V5-DEST.TM.和pLenti6.2N5-GW/lacZ(英杰公司(Invitrogen))。可以将本文公开的TCR的编码序列连接到此类表达载体中，以在哺乳动物细胞中表达嵌合蛋白。

在某些实施例中，在病毒载体中提供了编码本发明TCR的核酸。病毒载体可以是源自逆转录病毒、慢病毒或泡沫病毒的那些病毒载体。如本文所使用的，术语“病毒载体”是指核酸载体构建体，其包含至少一种病毒来源的元件并且具有被包装到病毒载体颗粒中的能力。病毒载体可以含有代替非必需病毒基因的本文所描述的各种蛋白质的编码序列。载体和/或颗粒可以用于在体外或体内将DNA、RNA或其它核酸转移到细胞中的目的。多种形式的病毒载体是本领域已知的。

在某些实施例中，含有本文所描述的TCR的编码序列的病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。术语“逆转录病毒载体”是指含有主要源自逆转录病毒的结构和功能遗传元件的载体。术语“慢病毒载体”是指LTR外部的含有主要源自慢病毒的结构和功能遗传元件的载体。

供本文使用的逆转录病毒载体可以源自任何已知的逆转录病毒(例如，c型逆转录病毒，如莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗兰德病毒(Friend)、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))。本发明的“逆转录病毒”还包含人T细胞白血病病毒、HTLV-1和HTLV-2以及逆转录病毒的慢病毒家族，如人免疫缺陷病毒、HIV-1、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马免疫缺陷病毒(EIV)和其它类别的逆转录病毒。

供本文使用的慢病毒载体是指源自慢病毒，引起缓慢发展的疾病的逆转录病毒组(或属)的载体。包含在此组内的病毒包含HIV(人类免疫缺陷病毒；包含HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi)；山羊关节炎-脑炎病毒；马感染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。重组慢病毒的制备可以使用根据Dull等人和Zufferey等人(Dull等人,《病毒学杂志(J.Virol.)》,1998；72:8463-8471和Zufferey等人,《病毒学杂志》1998；72:9873-9880)的方法实现。

供本发明中使用的逆转录病毒载体(即，慢病毒和非慢病毒两者)都可以使用标准克隆技术，通过按本文所描述的顺序和朝向组合期望的DNA序列来形成(《当代分子生物学实验手册(Current Protocols in Molecular Biology)》,Ausubel,F.M.等人(编辑)格林出版协会(Greene Publishing Associates),(1989),第9.10-9.14节和其它标准实验室手册；Eglitis等人,(1985)《科学》230:1395-1398；Danos和Mulligan(1988)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:6460-6464；Wilson等人(1988)《美国国家科学院院刊》85:3014-3018；Armentano等人(1990)《美国国家科学院院刊》87:6141-6145；Huber等人(1991)《美国国家科学院院刊》88:8039-8043；Ferry等人(1991)《美国国家科学院院刊》88:8377-8381；Chowdhury等人(1991)《科学》254:1802-1805；van Beusechem等人(1992)《美国国家科学院院刊》89:7640-7644；Kay等人(1992)《人类基因疗法(Human GeneTherapy)》3:641-647；Dai等人(1992)《美国国家科学院院刊》89:10892-10895；Hwu等人(1993)《免疫学杂志(J.Immunol)》150:4104-4115；美国专利第4,868,116号；美国专利第4,980,286号；PCT公开WO 89/07136；PCT公开WO 89/02468；PCT申请WO 89/05345和PCT申请WO 92/07573)。

用于获得用于形成载体的逆转录病毒(即慢病毒和非慢病毒)序列的合适来源包含例如可从可商购获得的来源(包含美国典型培养物保藏中心(ATCC),马里兰州罗克维尔)获得的基因组RNA和cDNA。序列也可以化学合成。

为了表达NY-ESO-1TCR，可以将载体引入到宿主细胞中以允许多肽在宿主细胞内表达。表达载体可以含有用于控制表达的各种元件，包含但不限于启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择标志物和信号序列。如上文所描述的，这些元件可以由本领域普通技术人员适当地选择。例如，可以选择启动子序列以促进载体中多核苷酸的转录。合适的启动子序列包含但不限于T7启动子、T3启动子、SP6启动子、β-肌动蛋白启动子、EF1a启动子、CMV启动子和SV40启动子。可以选择增强子序列以增强多核苷酸的转录。可以选择可选择标志物以允许从没有插入载体的宿主细胞中选择宿主细胞来插入载体，例如，可选择标志物可以是赋予抗生素抗性的基因。可以选择信号序列以允许经表达的多肽被转运到宿主细胞之外。

为了克隆多核苷酸，可以将载体引入到宿主细胞(分离的宿主细胞)中以允许复制载体自身，并且从而扩增其中所含有的多核苷酸的拷贝。克隆载体可以含有序列组分，所述序列组分通常包含但不限于复制起点、启动子序列、转录起始序列、增强子序列和可选择标志物。这些元件可以由本领域普通技术人员适当地选择。例如，可以选择复制起点以促进载体在宿主细胞中的自主复制。

在某些实施例中，本公开提供了含有本文提供的载体的分离的宿主细胞。含有载体的宿主细胞可用于表达或克隆载体中所含有的多核苷酸。合适的宿主细胞可以包含但不限于原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或更高等的真核细胞，如哺乳动物细胞。用于此目的的合适的原核细胞包含但不限于真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌(E.coli))、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans))和志贺氏菌属(Shigella)；以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和链霉菌属(Streptomyces)。

使用本领域已知的转染和/或转导技术将本发明的TCR引入到宿主细胞中。如本文所使用的，术语“转染”和“转导”是指将外源性核酸序列引入到宿主细胞中的过程。核酸可以整合到宿主细胞DNA中或可以在染色体外维持。核酸可以瞬时维持或可以是稳定的引入。转染可以通过本领域已知的各种方法来完成，包含但不限于磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和基因枪法。转导是指使用病毒或逆转录病毒载体通过病毒感染而不是通过转染来递送一个或多个基因。在某些实施例中，逆转录病毒载体是通过在与细胞接触之前将载体包装到病毒体中来转导的。例如，逆转录病毒载体携带的编码本发明的NY-ESO-1TCR的核酸可以通过感染和前病毒整合被转导到细胞中。

如本文所使用的，术语“基因工程化”或“基因修饰”是指将额外的遗传物质以DNA或RNA的形式添加到细胞中的总遗传物质中。术语“经基因修饰的细胞”、“经修饰的细胞”和“重定向细胞”可互换使用。

具体地，本发明的TCR被引入并且在免疫效应细胞中表达，以便将其特异性重定向到所关注的靶抗原，例如HLA-A2展示的NY-ESO-1肽，例如氨基酸残基157-165。

本发明提供了用于制作表达如本文所描述的TCR的免疫效应细胞的方法。在一些实施例中，所述方法包括转染或转导免疫效应细胞(例如，从受试者(如患有NY-ESO-1相关疾病或病症的受试者)分离的免疫效应细胞)使得免疫效应细胞表达如本文所描述的一种或多种TCR。在某些实施例中，免疫效应细胞从个体分离并经基因修饰而无需在体外进一步操纵。然后，可以将这种细胞直接再次施用到个体。在另外的实施例中，免疫效应细胞在基因修饰以表达TCR之前首先在体外被活化和刺激以增殖。在这方面，免疫效应细胞可以在被基因修饰(即，如本文所描述被转导或转染以表达TCR)之前或之后培养。

在本文所述的免疫效应细胞的体外操纵或基因修饰之前，可以从受试者获得细胞来源。具体地，与本文所描述的TCR一起使用的免疫效应细胞包括T细胞。

可以从多个来源获得T细胞，包含外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在某些实施例中，可以使用技术人员已知的任何数量的技术(如FICOLL分离)从采集自受试者的单位血液中获得T细胞。在一些实施例中，通过单采血液成分术获得来自个体的循环血液的细胞。单采血液成分术产物通常含有淋巴细胞，包含T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施例中，可以洗涤通过单采血液成分术采集的细胞以移除血浆级分并且将细胞置于适合的缓冲液或培养基中以供后续处理。在本发明的一些实施例中，用PBS洗涤细胞。在替代性实施例中，洗涤溶液缺乏钙并且可能缺乏镁或可能缺乏许多(如果不是全部的话)二价阳离子。如本领域普通技术人员应了解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法来完成，如通过使用半自动流通离心机。洗涤之后，可以将细胞重新悬浮于各种生物相容性缓冲液或者具有或不具有缓冲液的其它盐溶液中。在某些实施例中，可以在细胞直接重悬的培养基中移除单采血液成分术样本的不期望组分。

在某些实施例中，通过裂解红细胞并消耗单核细胞(例如，通过用PERCOLL^TM梯度离心)从外周血单核细胞(PBMC)中分离T细胞。可以通过阳性选择技术或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，如CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，可以通过针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合来完成通过阴性选择富集T细胞群。供本文使用的一种方法是通过使用单克隆抗体的混合物的负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或细胞选择，所述单克隆抗体针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。流式细胞术和细胞分选也可以用于分离所关注的细胞群以供本发明中使用。

使用本文所描述的方法，PBMC可以直接用于用TCR进行基因修饰。在某些实施例中，在PBMC的分离之后，进一步分离T淋巴细胞，并且在某些实施例中，可以在基因修饰和/或扩增之前或之后将细胞毒性和辅助T淋巴细胞分类为原初、记忆和效应T细胞亚群。

可以在分离之后使用已知方法对如T细胞等免疫效应细胞进行基因修饰，或者可以在进行基因修饰之前对免疫效应细胞进行体外活化和扩增(或在祖细胞的情况下分化)。在另一个实施例中，将如T细胞等免疫效应细胞用本文所描述的嵌合抗原受体进行基因修饰(例如，用包括编码TCR的核酸的病毒载体进行转导)并且然后在体外活化和扩增。用于活化和扩增T细胞的方法在本领域中是已知的并且在例如美国专利第6,905,874号；美国专利第6,867,041号；美国专利第6,797,514号；WO 2012079000、US 2016/0175358中进行了描述。

本发明提供了用于治疗NY-ESO-1相关疾病或病症例如癌症的经修饰的免疫效应细胞群体，所述经修饰的免疫效应细胞包括如本文所公开的NY-ESO-1TCR。

如本文所描述制备的表达TCR的免疫效应细胞可以用于根据已知技术的过继性免疫疗法的方法和组合物，或基于本公开对本领域技术人员显而易见的其变体。参见例如，Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；还参见Rosenberg的美国专利第4,690,915号。

III.药物组合物

本发明提供了包括本发明的NY-ESO-1TCR的治疗组合物或包括本发明的NY-ESO-1TCR的免疫效应细胞。根据本发明的治疗组合物将与适合的载剂、赋形剂和并入到调配物中以提供改进的转移、递送、耐受性等的其它药剂一起施用。在所有药物化学家已知的处方集中可以找到许多适当的调配物：《雷明顿氏药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)》，(马克出版公司(Mack Publishing Company)，伊斯顿，宾夕法尼亚州。这些调配物包含例如粉末、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含有囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(如LIPOFECTIN^TM)、DNA缀合物、无水吸收膏、水包油和油包水乳剂、碳蜡乳剂(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等人“用于肠胃外调配物的赋形剂的汇编(Compendium of excipients for parenteral formulations)”PDA(1998)《药物科学与技术杂志(J Pharm Sci Technol)》52:238-311。

根据病状的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。

在某些实施例中，可以在初始剂量之后施用第二或多次后续剂量的本发明的NY-ESO-1TCR或包括本发明的NY-ESO-1TCR的免疫效应细胞，其量可以大约等于或小于初始剂量。

在某些情况下，药物组合物可以在受控释放系统中递送。在一些实施例中，可以使用泵。

可注射制剂可以包含用于静脉内、皮下、皮内、颅内、腹膜内和肌内注射、滴注等剂型。可以通过已知的方法制备这些可注射制剂。例如，可注射制剂可以通过例如将上述抗原结合蛋白或其盐溶解、悬浮或乳化在无菌水性介质或常规用于注射的油性介质中来制备。作为用于注射的水性介质，存在例如生理盐水、含有葡萄糖的等渗溶液以及其它助剂等，其可以与适当的增溶剂(如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇))、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。作为油性介质，可以采用例如芝麻油、大豆油等，其可以与如苯甲酸苄酯、苯甲醇等增溶剂组合使用。如此制备的注射剂优选地填充在适当的安瓿中。

在一些实施例中，通过首先从其培养基中收获表达TCR的免疫效应细胞，并且然后在适合于以治疗有效量施用的介质和容器系统(“药学上可接受的”载剂)中洗涤并且浓缩细胞来调配表达TCR的免疫效应细胞。合适的输注介质可以是任何等渗介质调配物，通常是生理盐水，Normosol R(雅培公司(Abbott))或血浆-裂解物A(百特公司(Baxter))，但是也可以使用在水中或林格氏乳酸中的5％葡萄糖。输注介质可以用人血清白蛋白补充。

组合物中治疗有效量的细胞通常大于10²个细胞，并且多达10⁶个，多达并且包含10⁸或10⁹个细胞，并且可以超过10¹⁰个细胞。细胞的数目将取决于组合物的期望最终用途，其中包含的细胞的类型也是如此。

细胞对于经历疗法的患者可以是自体的或异源的。如果需要，治疗还可以包含施用如本文所描述的有丝分裂原(例如，PHA)或淋巴因子、细胞因子和/或趋化因子(例如，IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-α、IL-18和TNF-β、GM-CSF、IL-4、IL-13、Flt3-L、RANTES、MIP1α等)以增强免疫应答的诱导。

本发明的表达TCR的免疫效应细胞群体可以单独施用，或者作为药物组合物与稀释剂和/或与其它组分如IL-2或其它细胞因子或细胞群体组合施用。简而言之，本发明的药物组合物可以包括如本文所描述的表达TCR的免疫效应细胞群体，如T细胞，其与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂组合。此类组合物可以包括缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。本发明的组合物优选地被调配成用于静脉内施用。

IV.NY-ESO-1TCR或包括NY-ESO-1TCR的免疫效应细胞的治疗用途

通过使用本文所描述的方法或本领域已知的其它方法施用本文所描述的表达TCR的T细胞在受试者中诱导的抗肿瘤免疫应答可以包含由能够杀伤感染细胞的细胞毒性T细胞、调节性T细胞和辅助性T细胞应答介导的细胞免疫应答。还可以诱导主要由能够活化B细胞从而导致抗体产生的辅助性T细胞介导的体液免疫应答。可以使用在本领域中详细描述的多种技术来分析由本发明的组合物诱导的免疫应答的类型；例如，《当代免疫学手册(Current Protocols in Immunology)》，由：纽约州纽约市约翰威立父子公司(JohnWiley&Sons)的John E.Coligan、Ada M.Kruisbeek、David H.Margulies、EthanM.Shevach、Warren Strober(2001年)编辑。

因此，本发明的NY-ESO-1TCR尤其可用于治疗、防止和/或改善与NY-ESO-1相关或由其介导的任何疾病或病症。例如，本发明提供了用于通过向需要此类治疗的患者施用如本文所描述的NY-ESO-1TCR(或包括NY-ESO-1TCR的药物组合物或包括NY-ESO-1TCR的多个细胞)来治疗NY-ESO-1相关疾病或病症(如NY-ESO-1相关癌症(例如，NY-ESO-1阳性癌症))(肿瘤生长抑制)的方法以及用于治疗NY-ESO-1相关癌症的NY-ESO-1TCR(或包括NY-ESO-1TCR的药物组合物)。本发明的抗原结合蛋白可用于治疗、防止和/或改善疾病或病症或病状(如NY-ESO-1相关癌症)和/或用于改善与此类疾病、病症或病状相关的至少一种症状。在本文所描述的治疗方法的上下文中，NY-ESO-1TCR(或药物组合物或多个细胞)可以作为单一疗法(即，作为唯一的治疗剂)或与一种或多种另外的治疗剂(其实例在本文其它地方描述)组合施用。

因此，本发明提供了治疗被诊断患有或怀疑患有NY-ESO-1相关疾病或病症(例如，NY-ESO-1相关癌症)或处于发展为NY-ESO-1相关疾病或病症风险的个体的方法，所述方法包括向个体施用治疗有效量的如本文所描述的表达TCR的免疫效应细胞。

在一些实施例中，本发明提供了一种治疗被诊断患有NY-ESO-1阳性癌症的受试者的方法，所述方法包括从被诊断患有NY-ESO-1阳性癌症的受试者中去除免疫效应细胞，用包括对本发明的TCR进行编码的核酸的载体对所述免疫效应细胞进行基因修饰，从而产生经修饰的免疫效应细胞群体，并且向同一受试者施用经修饰的免疫效应细胞群体。在一些实施例中，免疫效应细胞包括T细胞。

用于施用本文所描述的细胞组合物的方法包含任何有效导致重新引入直接表达受试者中的本发明的TCR的经过离体基因修饰的免疫效应细胞或重新引入免疫效应细胞的经过基因修饰的祖细胞的方法，所述免疫效应细胞在引入受试者时分化为表达TCR的成熟免疫效应细胞。一种方法包括用根据本发明的核酸构建体离体转导外周血T细胞，并且将转导的细胞返回到受试者中。

在本发明的一些实施例中，本文所描述的组合物可用于治疗患有原发性或复发性癌症的受试者，所述原发性或复发性癌症包含但不限于NY-ESO-1相关癌症，例如，NY-ESO-1相关癌症是脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、卵巢上皮癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、滑膜肉瘤、转移性实体瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、晚期黏液型病、圆细胞脂肪肉瘤、转移性黑色素瘤或复发性非小细胞肺癌。在一些实施例中，所述NY-ESO-1相关癌症是脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌或乳腺癌。

TCR可以用于治疗NY-ESO-1相关癌症的早期或晚期症状。在一些实施例中，本发明的TCR可以用于治疗晚期或转移性癌症。TCR可用于减少或抑制或缩小肿瘤生长。在某些实施例中，用本发明的TCR治疗导致受试者的肿瘤大于40％的消退、大于50％的消退、大于60％的消退、大于70％的消退、大于80％的消退或大于90％的消退。在某些实施例中，TCR可以用于防止肿瘤复发。在某些实施例中，TCR可用于延长患有NY-ESO-1相关癌症的受试者的无进展生存期或总体生存期。在一些实施例中，TCR可用于减少由于化学疗法或放射疗法引起的毒性，同时在患有NY-ESO-1相关癌症的患者中维持长期存活期。

可以施用本发明的一种或多种TCR以减轻或防止或降低疾病或病症的一种或多种症状或病状的严重性。

在本文中还设想了将本发明的一种或多种TCR预防性地用于有患疾病或病症如NY-ESO-1相关疾病或病症(如NY-ESO-1相关癌症)的风险的患者。

在本发明的另外的实施例中，本发明的TCR用于制备药物组合物，所述药物组合物用于治疗患有NY-ESO-1相关疾病或病症如NY-ESO-1相关癌症的患者。在本发明的另一个实施例中，本发明的TCR用作采用任何其它药剂的辅助疗法或本领域技术人员已知的可用于治疗NY-ESO-1相关癌症的任何其它疗法。

组合疗法可以包含本发明的NY-ESO-1TCR，如包括本发明的TCR的免疫效应细胞，或本发明的药物组合物，以及可以有利地与本发明的TCR组合的任何另外的治疗剂。本发明的TCR可以与用于治疗或抑制与NY-ESO-1相关疾病或病症(如NY-ESO-1阳性癌症)的一种或多种抗癌药物或疗法协同组合，所述与NY-ESO-1相关疾病或病症例如是脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、卵巢上皮癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、滑膜肉瘤、转移性实体瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、晚期黏液型病、圆细胞脂肪肉瘤、转移性黑色素瘤或复发性非小细胞肺癌。

本文设想了将本发明的TCR与免疫刺激和/或免疫支持疗法组合使用以抑制肿瘤生长和/或增加癌症患者的存活期。免疫刺激疗法包含直接免疫刺激疗法，其通过对抑制的免疫细胞“释放制动(releasing the brake)”或“踩油门(stepping on the gas)”以活化免疫应答来增强免疫细胞活性。实例包含靶向其它检查点受体、疫苗接种和佐剂。免疫支持模式可以通过促进免疫原性细胞死亡、炎症或具有其它促进抗肿瘤免疫应答的间接作用来增加肿瘤的抗原性。实例包含放射、化学疗法、抗血管生成剂和手术。

在各个实施例中，本发明的一种或多种TCR可以与以下组合使用：PD-1抑制剂(例如，抗PD-1抗体，如纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、皮地利珠单抗(pidilizumab)、BGB-A317或REGN2810)、PD-L1抑制剂(例如，抗PD-L1抗体，如阿维鲁单抗(avelumab)、阿特朱单抗(atezolizumab)、度伐鲁单抗(durvalumab)、MDX-1105或REGN3504)、CTLA-4抑制剂(例如，伊匹单抗(ipilimumab))、TIM3抑制剂、BTLA抑制剂、TIGIT抑制剂、CD47抑制剂、GITR抑制剂、另一种T细胞共抑制剂或配体的拮抗剂(例如，CD-28、2B4、LY108、LAIR1、ICOS、CD160或VISTA的抗体)、吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)抑制剂、血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂[例如，“VEGF-Trap”，如阿柏西普(aflibercept)或US 7,087,411中所示的其它VEGF抑制融合蛋白，或抗VEGF抗体或其抗原结合片段(例如，贝伐单抗(bevacizumab)或兰尼单抗(ranibizumab))或VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼(sunitinib)、索拉菲尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))]、Ang2抑制剂(例如，奈斯瓦单抗(nesvacumab))、转化生长因子β(TGFβ)抑制剂、表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂(例如，埃罗替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab))、CD20抑制剂(例如，抗CD20抗体，如利妥昔单抗(rituximab))、肿瘤特异性抗原的抗体[例如，CA9、CA125、黑色素瘤相关抗原3(MAGE3)、癌胚抗原(CEA)、波形蛋白、肿瘤-M2-PK、前列腺特异性抗原(PSA)、粘蛋白-1、MART-1和CA19-9]、疫苗(例如，卡介苗、癌症疫苗)、增加抗原呈递的佐剂(例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、双特异性抗体(例如，CD3xCD20双特异性抗体或PSMAxCD3双特异性抗体)、细胞毒素、化学治疗剂(例如，达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、多西他赛(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、吉西他滨(gemcitabine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)和长春新碱(vincristine))、环磷酰胺、放射疗法、手术、IL-6R抑制剂(例如，萨瑞鲁单抗(sarilumab))、IL-4R抑制剂(例如，度匹鲁单抗(dupilumab))、IL-10抑制剂、细胞因子如IL-2、IL-7、IL-21和IL-15、抗体-药物缀合物(ADC)(例如，抗CD19-DM4 ADC和抗DS6-DM4 ADC)、抗炎药物(例如，皮质类固醇和非甾体抗炎药物)、膳食补充剂如抗氧化剂或用于治疗癌症的任何其它疗法护理。在某些实施例中，本发明的TCR可以与包含树突状细胞疫苗、溶瘤病毒、肿瘤细胞疫苗等的癌症疫苗组合使用以增强抗肿瘤应答。

可以与本发明的TCR组合使用的癌症疫苗的实例包含用于黑色素瘤和膀胱癌的MAGE3疫苗、用于乳腺癌的MUC1疫苗、用于脑癌(包含多形性成胶质细胞瘤)的EGFRv3(例如Rindopepimut)或ALVAC-CEA(用于CEA+癌症)。

在某些实施例中，本发明的NY-ESO-1TCR可以以用于产生长期持久的抗肿瘤应答和/或增加癌症患者的存活期的方法与放射疗法组合施用。在一些实施例中，本发明的NY-ESO-1TCR可以在向癌症患者施用放射疗法之前、同时或之后施用。例如，可以以一种或多种剂量对肿瘤病变施用放射疗法，然后施用一种或多种剂量的本发明的NY-ESO-1TCR。在一些实施例中，可以对肿瘤病变局部施用放射疗法以增强患者肿瘤的局部免疫原性(辅助放射)和/或杀伤肿瘤细胞(消融放射)，然后系统性施用本发明的NY-ESO-1TCR。

可以在施用本发明的NY-ESO-1TCR之前、同时或之后施用一种或多种另外的治疗活性剂/组分。出于本公开的目的，此类施用方案被视为是NY-ESO-1TCR与第二治疗活性组分“组合”施用。

可以在施用本发明的NY-ESO-1TCR之前向受试者施用一种或多种另外的治疗活性组分。在其它实施例中，可以在施用本发明的NY-ESO-1TCR之后向受试者施用一种或多种另外的治疗活性组分。在又其它实施例中，可以在施用本发明的NY-ESO-1TCR的同时向受试者施用一种或多种另外的治疗活性组分。出于本发明的目的，“同时”施用包含例如以单一剂型(例如，共同调配)或以在约30分钟或更少时间内向受试者施用的彼此单独的剂型向受试者施用NY-ESO-1TCR和另外的治疗活性组分。如果以单独的剂型施用，则每种剂型可以通过相同的途径施用；可替代地，每种剂型可以通过不同途径施用。在任何情况下，出于本公开的目的，以单一剂型、通过相同途径以单独的剂型或通过不同途径以单独的剂型施用组分均被视为是“同时施用”。出于本公开的目的，在施用另外的治疗活性组分的“之前”、“同时”或“之后”(如以上在本文中所定义的那些术语)施用NY-ESO-1TCR被视为是与另外的治疗活性组分“组合”施用NY-ESO-1TCR)。

本发明通过以下实例进一步说明，所述实例不以任何方式进行限制。在本申请中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的全部内容以及附图特此通过引用并入本文。

实例

实例1.NY-ESO-1特异性T细胞受体的分离

将针对细胞免疫系统组分而人源化的小鼠VelociT^TM小鼠(参见例如，PCT公开号WO2016/164492，所述公开的全部内容通过引用并入本文)用由人HLA-A2特异性呈递的NY-ESO-1(157-165)肽(SLLMWITQC，SEQ ID NO:111)进行免疫，在PBS中稀释并且与佐剂混合，例如与完全弗氏佐剂(CFA；Chondrex公司)的体积相等。获得并且解离来自免疫小鼠的脾悬浮液。将红细胞在ACK裂解缓冲液(生命技术公司(Life Technologies))中裂解，并且将脾细胞悬浮在RPMI完全培养基中。对分离的脾细胞进行分选，并且通过荧光活化细胞分选(FACS)分离在MHC上下文中结合NY-ESO-1(157-165)肽的单个T细胞。将分离的T细胞单孔铺板，并且与TCRα和β可变区特异性PCR引物混合。通过逆转录酶(RT)反应合成每个单个T细胞的cDNA。然后将每种所得的RT产物分开并且转移到两个对应的孔中，以用于后续的TCRβ和αPCR。首先通过使用对TCRβ可变区前导序列具有特异性的5'简并引物或对TCRα链可变区前导序列具有特异性的5'简并引物和对TCR恒定区具有特异性的3'引物的PCR扩增一组所得的RT产物以形成扩增子。然后再次通过使用对TCRβ可变区框架1具有特异性的5'简并引物或对TCRα链可变区框架1具有特异性的5'简并引物和对TCR恒定区具有特异性的3'引物的PCR扩增扩增子以产生用于克隆的扩增子。将TCRβ和α来源的PCR产物克隆到分别含有β恒定区和α恒定区的表达载体中。将表达全长β和α链对的表达载体克隆到CHO细胞中，并且测试与商品NY-ESO-1/HLA四聚体试剂(HLA-A02:01NY-ESO-1四聚体；MBL国际公司)的结合特异性。

表1提供了分离的TCR的α和β链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的详细列表，表2提供了对应的多核酸序列，并且表3提供了分离的TCR的α和β链可变区的氨基酸和核苷酸序列。

尽管从CD8阳性的VelociT^TM小鼠T细胞克隆了VelociT^TMTCR，但在不存在任何CD8的情况下，TCR在CHO细胞中表达，并且仍然展示了结合NY-ESO肽四聚体。不受任何理论的束缚，在没有CD8的情况下，VelociT^TM来源的TCR可以与例如双阴性(CD4-CD8-)T细胞结合。

表1.氨基酸CDR序列

表2.多核酸CDR序列

表3：对NY-ESO-1(157-165)/HLA-A2具有特异性的VelociT^TMTCR的氨基酸和核酸序列

实例2.用于测量和评估T细胞受体比活性的报告基因T细胞/APC荧光素酶测定

T细胞活化是通过刺激T细胞受体(TCR)来实现的，所述受体识别抗原呈递细胞(APC)上主要组织相容性复合物I或II类蛋白所呈递的特异性肽。活化的TCR进而启动一系列信号传导事件，所述信号传导事件可以由报告基因监测，由转录因子(如活化蛋白1(AP-1)、活化的T细胞的核因子(NFAT)或活化的B细胞的核因子κ轻链增强子(NFκb))驱动。

开发了一种生物测定，用于测量由WT人HLA-A2/NY-ESO-1(157-165)特异性TCR与呈递NY-ESO-1肽的HLA-A2+APC之间的相互作用诱导的TCR介导的T细胞信号传导。缺乏自身内源性TCR的Jurkat克隆J.RT3.T3.5(ATCC#TIB-153)通过编码人CD8A/B基因的慢病毒、Cignal Lenti AP-1荧光素酶报告基因(凯杰公司-SA生物科学公司，#CLS-011L)和源自VelociT^TM小鼠免疫(WO 2016/164492)或源自已发表的比较物NY-ESO-1TCR(1G4和克隆113:Li,Y.等人《自然生物技术(Nat Biotechnol)》2005；23:349-354)的NY-ESO-1特异性TCR进行转导。

在基于荧光素酶的生物测定中，将补充有10％FBS和青霉素/链霉素/谷氨酰胺的RPMI1640用作测定培养基，以制备细胞悬浮液和稀释液。HLA-A2+293T细胞的系列稀释是在圆底96孔板上进行的，从3.0×10⁵个细胞开始，其中向下稀释2倍。然后将APC转移到40μL的96孔平底白板(Nunc#136102)中，并且用100uM的NY-ESO-1肽脉冲2小时。在1.25×10⁶个细胞/毫升的悬浮液中制备报告基因T细胞，并且每孔添加40μL(5×10⁴个细胞/孔)。将含有共同培养物的板在37℃/5％CO₂下温育5小时。然后在添加ONE-Glo^TM(普洛麦格公司，#E6110)试剂后检测荧光素酶活性，并且在SpectraMax M5酶标仪上测量相对光单位(RLU)。

尽管无关的VelociT^TM来源的TCR#229对NY-ESO-1肽没有活性，但所有四个HLA-A2/NY-ESO-1限制性TCR都以浓度依赖性方式与靶细胞反应，如通过AP-1荧光素酶活性所测量的(图1)。这些TCR的比活性定义为RLU与肽脉冲APC的比率除以RLU与非脉冲APC的比率。这四个VelociT^TM来源的TCR的比活性明显高于患者来源的1G4比较物TCR以及其体外成熟衍生物113的比活性。(表4).

表4.

TCR ID	信噪(S/N)比
		TCR#229	1
比较物克隆113	2.3
		TCR#188	5.1
比较物1G4	6.3
		TCR#063	11.2
TCR#050	15.5
		TCR#001	25.4

实例3.潜在脱靶肽的预测

考虑到靶标9聚体肽-HLA-A2复合物，基于两个标准定义了相关的潜在脱靶肽：A)肽是9聚体并且被预测结合HLA-A2，以及B)肽基于序列同源性与靶肽类似。因此，为了预测与SLLMWITQC(NY-ESO-1；SEQ ID NO:111)缔合的潜在脱靶肽，使用以下方法。

作为第一步，从UniprotKB数据库(2014年9月版)(Magrae、Michele和UniProtConsortium.数据库2011(2011):条目009)下载规范的人蛋白质序列并且提取所有9聚体。这产生了来自20,014个蛋白质序列的11,118,076个肽。

接下来，使用NetMHCstab网页服务器(1.0版)计算肽与HLA-A2的结合亲和力(

Kasper W.等人,(2014)《免疫学(Immunology)》141(1):18-26)。预测亲和力值<500nM的肽会结合HLA-A2，并且其余的将被丢弃，从而产生剩余338,452个肽。

然后评估肽序列与靶肽的序列同源性。对于每个肽，计算其与靶肽的类似性程度(DoS)。DoS值表示两个肽之间相同位置处的相同氨基酸数量。DoS值>＝5的肽被视为潜在的脱靶靶标。这产生1个DoS＝6的脱靶肽和25个DoS＝5的脱靶肽。

选择DoS＝6的肽、从DoS＝5的肽中随机选择的三个肽和基于文献证据的肽进行实验验证，并且在下表5中列出。

表5：类似于HLA-A2/NY-ESO-1:(157-165)(SLLMWITQC；SEQ ID NO:111)的预测的脱靶肽

为了测定TCR对HLA-A2/NY-ESO-1的靶标特异性，将类似于NY-ESO-1(157-165)的潜在脱靶肽脉冲到HLA-A2+293T细胞上，并且还在上文实例2中描述的T细胞报告基因测定中测量脱靶反应性。不相关的肽、LV9-5、粘蛋白肽也包含在此测定中作为阴性对照。

如图2A-2E中描绘的，患者来源的比较物1G4和两个VelociT^TM来源的TCR没有脱靶活性。相比之下，体外成熟的TCR比较物克隆113与HLA-A2+293T细胞发生非特异性反应，表明尽管这种亲和力成熟的TCR对HLA-A2/NY-ESO-1复合物具有高结合亲和力(26pM，如Zhao等人,《免疫学杂志》2007年11月1日；179(9):5845–5854中报告的)，但其也通过与HLA-A2结合的其它肽被非特异性活化。如果将其作为人类疗法进行施用，则重组TCR对人T细胞的非特异性活化可能导致毒性。

实例4.细胞毒性活性

如上文所描述的，使用VelociT平台产生针对装载到HLA-A2中的NY-ESO-1157-165肽(SLLMWITC(SEQ ID NO:164))的T细胞受体。为了测定细胞毒性活性，将TCR001重新格式化为复合TCR结构，其中将TCRα或TCRβ链的人恒定结构域用鼠对应物取代以增加测定的TCR稳定性。人可变结构域保持完整。对于TCRβ链，使用了小鼠TRBC1基因。在产生VSV假型慢病毒之前，使用具有EF1a启动子和通过2A肽接头连接的TCR链的pLVX慢病毒载体，在单个ORF中将TCR克隆到双顺反子构建体中(图3)。在2A序列3'末端的mRNA翻译期间跳过肽键产生了两种蛋白质：TCRα链-2A融合蛋白和TCRβ链。为了蛋白水解去除2A蛋白序列，在2A元件之前是编码弗林蛋白酶切割位点的序列，其在图3中表示为黑框。

为避免外源性TCR链与内源性TCR链之间潜在的错配，使用CRISPR/Cas9对内源性TRAC和TRBC1/2进行了基因编辑，以防止其表达。设计了结合在TRAC基因和两个TRBC1/2基因的第一外显子的5'末端附近的经TrueGuide修饰的合成引导RNA(sgRNA)，并且在下表6中进行描绘。预测没有sgRNA序列与TCR001序列结合。

表6：sgRNA序列

靶等位基因	sgRNA序列	SEQ ID NO.
			TRAC	TCTCTCAGCTGGTACACGGC	162
TRBC1/2	CAAACACAGCGACCTCGGGT	163

从正常健康供体PBMC中分离出原代人T细胞，并且在CTS OptMizer^TM培养基中用CD3/CD28微珠加100IU/mL重组人IL-2刺激48小时。在初始活化期后，将3×10⁶个T细胞在1×10⁶个细胞/毫升下以3:1的摩尔比重悬于补充有sgRNA和TrueCut Cas9v2蛋白(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))的P2电穿孔缓冲液(龙沙公司(Lonza))中。使用龙沙穿梭核转染仪(Lonza Shuttle Nucleofector)和程序EH100P3进行电穿孔。电穿孔后，当通过评估细胞表面CD3表达的下降来表征内源性TCR表达的丧失时，在cRPMI培养基中将T细胞等分试样与IL-2(100U/mL)一起培养72小时(图4)。将T细胞的第二等分试样立即重悬于cRPMI培养基中，并且用慢病毒(MOI＝5)旋转感染，所述慢病毒编码在由HLA-A2携带时对NY-ESO-1(157-165)具有特异性的TCR001。经转导的T细胞用CD3/CD28微珠和重组人IL-2(100IU/mL)扩增9天。然后通过右旋体染色评估外源性TCR001表达，并且通过分选至>99％纯度高度富集表达复合TCR的CD8+T细胞(图5A)。然后将经分选的细胞与经辐照的HLA不匹配的PBMC(从两个正常健康供体中分离并且按1:1比率混合)以及HLA不匹配的B-LCL细胞系进行共培养。HLA不匹配和经照射的PBMC和B-LCL刺激细胞分别以5:1的比率组合。培养物补充有抗CD3(克隆OKT3)和人IL-2(50IU/mL)，并且在分选后在补充有10％人Ab血清的cRPMI培养基中扩增最少12天。每隔36-48小时就会补充人IL-2。扩增后，表达外源性复合物TCR001的CD8+T细胞保持高度富集(图5B)。对照右旋体用于定义背景染色并且带有非特异性对照肽。

分选后扩增10天后，收集等分试样的扩增T细胞，洗涤并且重悬于cRPMI培养基中。使用两种靶细胞系来测量TCR001的抗原依赖性细胞溶解：表达内源性NY-ESO-1蛋白的IM9靶细胞系，以及经工程化以过表达呈递NY-ESO-1(157-165)肽的单链HLA-A2的IM9细胞系(指定为IM9⁺⁺)。包含最大抗原密度的IM9⁺⁺靶细胞系，作为针对IM9细胞上装载有NY-ESO-1(157-165)的HLA-A2的内源性水平不足以触发TCR介导的细胞溶解活性的可能性的预防措施。建立了两个阴性对照来研究抗原特异性TCR介导的杀伤：不表达NY-ESO-1蛋白的K562细胞系，以及在100IU/mL人IL-2存在下用抗CD3/CD28磁珠扩增的并且用作效应T细胞的未经转导的T细胞。收获每个靶标和对照细胞系，并且装载钙黄绿素-AM染料。钙黄绿素标记后，将靶细胞洗涤两次以去除残留的钙黄绿素。随后，将T细胞和靶细胞以各种比率在96孔圆底板上共培养，并且在收获培养上清液时在37℃下培养2.5小时。为了确定钙黄绿素是否自靶细胞系自发释放，在不存在效应T细胞的情况下培养每个细胞系。为了确定钙黄绿素的最大可能释放，使用补充以含有1％Triton^TM X-114去污剂的cRPMI培养基培养并裂解靶细胞系。在上清液内，使用Viktor X4读板器测量相对钙黄绿素水平，并且以((钙蛋白信号-自发钙黄绿素释放)/(钙黄绿素最大释放-自发钙黄素释放))*100计算细胞毒性百分比。

如图6以及表7和8所示，表达TCR001的经富集和经扩增的T细胞诱导IM9细胞(灰色空心圆圈)和IM9⁺⁺细胞(空心黑色圆圈)两者但没有缺乏NY-ESO-1表达的K562细胞(实心黑色圆圈)的强力细胞溶解。类似地，缺乏来自同一正常健康供体的复合TCR001表达的未经转导和经扩增的T细胞未能杀伤IM9(黑色正方形)、IM9⁺⁺(深灰色正方形)和K562(浅灰色正方形)靶细胞，从而揭示了IM9和IM9⁺⁺靶细胞的细胞溶解依赖于TCR001。虽然IM9细胞中过表达HLA-A2/NY-ESO-1(157-165)(如IM9++细胞所观察到的)并没有相对于IM9细胞而增强最大细胞毒性水平，但由于T细胞数量在较低的T细胞与靶细胞比率时受到限制，观察到细胞溶解的增加。这些数据共同证明了针对HLA-A2呈递的NY-ESO-1的TCR功能和特异性。

表7：通过TCR001+T细胞对NY-ESO-1+肿瘤细胞系的细胞溶解进行测量。

SD：标准偏差；ND：未确定(与其它比率相比，T细胞:靶细胞比率为50将具有最大背景杀伤)

表8：通过未经转导和经扩增的多克隆T细胞对NY-ESO-1+肿瘤细胞系的细胞溶解进行测量。

SD：标准偏差

等效物

本领域的技术人员将认识到或者仅使用常规实验能够确定，本文描述的本发明的具体实施例的许多等效物。此类等效物旨在由以下权利要求涵盖。贯穿本申请引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容通过引用并入本文。

Claims (91)

1.一种分离的T细胞受体(TCR)，其与包括SLLMWITQC(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列(NY-ESO-1(157-165))的HLA-A2呈递的癌睾丸抗原纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)肽特异性结合，其中所述TCR具有选自由以下组成的组的性质：

(a)如通过发光测定确定的，不与对预测的脱靶肽但不是包括SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HLA-A2呈递的NY-ESO-1肽进行表达的细胞特异性结合；以及

(b)活化如通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物测定确定的信噪比大于或等于患者来源的NY-ESO-1特异性TCR的T细胞应答。

2.根据权利要求1所述的分离的TCR，其中所述TCR活化如通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物测定确定的比患者来源的NY-ESO-1特异性TCR大约两倍、或大约三倍或大约四倍的T细胞应答。

3.根据权利要求1或2所述的分离的TCR，其中所述TCR包括至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域。

4.根据权利要求3所述的分离的TCR，其中所述TCR包括TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。

5.根据权利要求3或4所述的分离的TCR，其中所述α链可变结构域包括互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3区包括式I的氨基酸序列(SEQ ID NO:118)：

Cys-N₁-N₂-N₃-N₄-N₅-N₆-N₇-N₈-N₉-N₁₀-N₁₁-N₁₂-N₁₃-N₁₄-N₁₅-Phe(式I)，其中

N₁是非极性氨基酸；

N₂是Leu、Tyr、Val或Ala；

N₃是Arg、Asn、Thr或Ser；

N₄是Pro、Ser、Glu、Ile、Gly、Met、Lys或Thr；

N₅是Lys，所述N₅可以存在或可以不存在；

N₆是Asp、Ala、Gly、Leu或Asn，所述N₆可以存在或可以不存在；

N₇是Ser、Asn、Ala、Tyr或Thr；

N₈是Ser或Gly，所述N₈可以存在或可以不存在；

N₉是Gly，所述N₉可以存在或可以不存在；

N₁₀是Gly或Ser，所述N₁₀可以存在或可以不存在；

N₁₁是Trp、Gly、Ser、Gln、Ala或Pro，所述N₁₁可以存在或可以不存在；

N₁₂是Gly、Tyr、Asn、Gln或Ser；

N₁₃是Lys、Ala、Asp、Ile或Asn；

N₁₄是非极性氨基酸；并且

N₁₅是Gln、Asn、Arg、Thr、Val、Ile或Ser。

6.根据权利要求5所述的分离的TCR，其中N₁是Ala或Ile。

7.根据权利要求5所述的分离的TCR，其中N₁₄是Phe、Leu、Met或Pro。

8.根据权利要求3到7中任一项所述的分离的TCR，其中所述β链可变结构域包括互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，其中所述CDR3区包括式II的氨基酸序列(SEQ ID NO:119)：

Cys-N₁-N₂-N₃-N₄-N₅-N₆-N₇-N₈-N₉-N₁₀-N₁₁-N₁₂-N₁₃-N₁₄-Phe(式II)，其中

N₁和N₂各自独立地是Ala或Ser；

N₃是Ser、Met或Lys；

N₄是Tyr、Trp、His、Leu、Thr、Glu或Gln；

N₅是Ser、Ala、Thr、Gly、Val或Arg；

N₆是Gly、His、Asp、Thr、Pro、Met或Ser，所述N₆可以存在或可以不存在；

N₇是Gly、Tyr、Asn或Pro，所述N₇可以存在或可以不存在；

N₈是Y，所述N₈可以存在或可以不存在；

N₉是N，所述N₉可以存在或可以不存在；

N₁₀是极性氨基酸，所述N₁₀可以存在或可以不存在；

N₁₁是Pro、Glu、Gly或Asp；

N₁₂是Glu，所述N₁₂可以存在或可以不存在；

N₁₃是Leu、Ala、Gln或Tyr；并且

N₁₄是His、Phe或Thr。

9.根据权利要求8所述的分离的TCR，其中N₁₀是Ser、Thr、Gln或Tyr。

10.根据权利要求5到9中任一项所述的分离的TCR，其中所述α链可变结构域的所述CDR1包括表1中所示的CDR1氨基酸序列中的任一个，并且所述α链可变结构域的所述CDR2独立地包括表1中所示的CDR2氨基酸序列中的任一个。

11.根据权利要求5到10中任一项所述的分离的TCR，其中所述β链可变结构域的所述CDR1包括表1中所示的CDR1氨基酸序列中的任一个，并且所述β链可变结构域的所述CDR2独立地包括表1中所示的CDR2氨基酸序列中的任一个。

12.根据权利要求5到11中任一项所述的分离的TCR，其包括α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述α链可变结构域序列中的任一个内；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述β链可变结构域序列中的任一个内。

13.根据权利要求3到12中任一项所述的分离的TCR，其包括α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

14.根据权利要求3到13中任一项所述的分离的TCR，其包括β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

15.根据权利要求3到14中任一项所述的分离的TCR，其包括：(a)α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性；以及(b)β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

16.根据权利要求5到15中任一项所述的分离的TCR，其包括：

(a)α链可变结构域CDR1结构域，所述α链可变结构域CDR1结构域具有选自由SEQ IDNO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94和104组成的组的氨基酸序列；

(b)α链可变结构域CDR2结构域，所述α链可变结构域CDR2结构域具有选自由SEQ IDNO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95和105组成的组的氨基酸序列；

(c)α链可变结构域CDR3结构域，所述α链可变结构域CDR3结构域具有选自由SEQ IDNO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96和106组成的组的氨基酸序列；

(d)β链可变结构域CDR1，所述β链可变结构域CDR1具有选自由SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91和101组成的组的氨基酸序列；

(e)β链可变结构域CDR2，所述β链可变结构域CDR2具有选自由SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92和102组成的组的氨基酸序列；以及

(f)β链可变结构域CDR3，所述β链可变结构域CDR3具有选自由SEQ ID NO:3、13、23、33、43、54、63、73、83、93和103组成的组的氨基酸序列。

17.根据权利要求16所述的分离的TCR，其包括α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对，所述α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对选自由以下组成的组：SEQ IDNO:9/7；19/17；29/27；39/37；49/47；59；57；69/67；79/77；89/87；99/97；和109/107。

18.一种分离的TCR，其竞争与根据权利要求1到17中任一项所述的分离的TCR结合。

19.根据权利要求1到18中任一项所述的分离的TCR，其进一步包括可检测的部分。

20.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到19中任一项所述的分离的TCR以及药学上可接受的载剂或稀释剂。

21.一种分离的细胞，其呈递根据权利要求1到19中任一项所述的TCR。

22.一种多核苷酸分子，其包括对如权利要求1到19中任一项所示的分离的TCR的α链可变结构域进行编码的多核苷酸序列。

23.一种多核苷酸分子，其包括对如权利要求1到19中任一项所示的分离的TCR的β链可变结构域进行编码的多核苷酸序列。

24.一种载体，其包括根据权利要求22或23所述的多核苷酸分子。

25.一种细胞，其表达根据权利要求24所述的载体。

26.一种治疗患有NY-ESO-1相关疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1到19中任一项所示的分离的TCR、根据权利要求20所述的药物组合物或多种根据权利要求21所述的细胞，从而治疗所述受试者。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述NY-ESO-1相关疾病或病症是NY-ESO-1相关癌症。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述NY-ESO-1相关癌症是脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、卵巢上皮癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、滑膜肉瘤、转移性实体瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、晚期黏液型病(advanced myxoid)、圆细胞脂肪肉瘤、转移性黑色素瘤或复发性非小细胞肺癌。

29.根据权利要求26到28中任一项所述的方法，其中将所述分离的TCR、所述药物组合物或所述多种细胞与第二治疗剂组合向所述受试者施用。

30.根据权利要求26到29中任一项所述的方法，其中将所述分离的TCR、所述药物组合物或所述多种细胞经皮下、静脉内、皮内、腹膜内、口服、肌内或颅内向所述受试者施用。

31.一种多核苷酸分子，其编码T细胞受体(TCR)，其中所述TCR与包括SLLMWITQC(SEQID NO:111)的氨基酸序列(NY-ESO-1(157-165))的HLA-A2呈递的癌睾丸抗原纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)肽特异性结合，其中所述TCR具有选自由以下组成的组的性质：(a)如通过发光测定确定的，不与对预测的脱靶肽但不是包括SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HLA-A2呈递的NY-ESO-1肽进行表达的细胞特异性结合；以及(b)活化如通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物测定确定的比患者来源的NY-ESO-1特异性TCR大约两倍的T细胞应答。

32.根据权利要求31所述的多核苷酸分子，其编码至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域。

33.根据权利要求32所述的多核苷酸分子，其中所述TCR包括α链可变结构域互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，所述α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述α链可变结构域中的任一个内；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述β链可变结构域序列中的任一个内。

34.根据权利要求32或33所述的多核苷酸分子，其中所述分离的TCR包括α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

35.根据权利要求31到34中任一项所述的多核苷酸分子，其中所述分离的TCR包括β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

36.根据权利要求31到35中任一项所述的多核苷酸分子，其中所述分离的TCR包括：(a)α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性；以及(b)β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

37.根据权利要求31到36中任一项所述的多核苷酸分子，其中所述分离的抗原结合蛋白包括

(a)α链可变结构域CDR1，所述α链可变结构域CDR1具有选自由SEQ ID NO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94和104组成的组的氨基酸序列；

(b)α链可变结构域CDR2，所述α链可变结构域CDR2具有选自由SEQ ID NO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95和105组成的组的氨基酸序列；

(c)α链可变结构域CDR3，所述α链可变结构域CDR3具有选自由SEQ ID NO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96和106组成的组的氨基酸序列；

(d)β链可变结构域CDR1，所述β链可变结构域CDR1具有选自由SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91和101组成的组的氨基酸序列；

(e)β链可变结构域CDR2，所述β链可变结构域CDR2具有选自由SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92和102组成的组的氨基酸序列；以及

(f)β链可变结构域CDR3，所述β链可变结构域CDR3具有选自由SEQ ID NO:3、13、23、33、43、54、63、73、83、93和103组成的组的氨基酸序列。

38.根据权利要求37所述的多核苷酸分子，其中所述分离的TCR包括α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对，所述α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对选自由以下组成的组：SEQ ID NO:9/7；19/17；29/27；39/37；49/47；59；57；69/67；79/77；89/87；99/97；和109/107。

39.一种载体，其包括根据权利要求31到38中任一项所述的多核苷酸分子。

40.一种分离的细胞，其包括根据权利要求39所述的载体。

41.一种治疗患有NY-ESO-1相关疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用多种根据权利要求40所述的细胞，从而治疗所述受试者。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述NY-ESO-1相关疾病或病症是NY-ESO相关癌症。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述NY-ESO相关癌症是脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、卵巢上皮癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、滑膜肉瘤、转移性实体瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、晚期黏液型病、圆细胞脂肪肉瘤、转移性黑色素瘤或复发性非小细胞肺癌。

44.根据权利要求41到43中任一项所述的方法，其中所述多种细胞与第二治疗剂组合向所述受试者施用。

45.一种T细胞受体(TCR)，其与包括SLLMWITQC(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列(NY-ESO-1(157-165))的HLA-A2呈递的癌睾丸抗原纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)肽特异性结合，其中所述TCR包括互补决定区3(CDR3)，所述CDR3含有SEQ ID NO:9、19、29、39、49、59、69、79、89、99和109中任一个的α链可变结构域。

46.一种T细胞受体(TCR)，其与包括SLLMWITQC(SEQ ID NO:111)的氨基酸序列(NY-ESO-1(157-165))的HLA-A2呈递的癌睾丸抗原纽约食管鳞状细胞癌-1(NY-ESO-1)肽特异性结合，其中所述TCR包括互补决定区3(CDR3)，所述CDR3包含在SEQ ID NO:7、17、27、37、47、57、67、77、87、97和107中任一个的β链可变结构域内。

47.根据权利要求45所述的TCR，其中所述α链可变结构域进一步包括CDR1和CDR2，其中所述CDR1包括表1中所示的α链可变结构域CDR1氨基酸序列中的任一个，并且所述CDR2独立地包括表1中所示的α链可变结构域CDR2氨基酸序列中的任一个。

48.根据权利要求46所述的TCR，其中所述β链可变结构域进一步包括CDR1和CDR2，其中所述CDR1包括表1中所示的所述β链可变CDR1氨基酸序列中的任一个，并且所述CDR2独立地包括表1中所示的β链可变结构域CDR2氨基酸序列中的任一个。

49.根据权利要求45到48中任一项所述的TCR，其中所述TCR包括至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域。

50.根据权利要求49所述的TCR，其中所述TCR包括TCRα链可变结构域和TCRβ链可变结构域。

51.根据权利要求46到50中任一项所述的TCR，其包括α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列中的任一个内；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列中的任一个内。

52.根据权利要求45到51中任一项所述的TCR，其包括α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

53.根据权利要求45到52中任一项所述的TCR，其包括β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

54.根据权利要求45到53中任一项所述的TCR，其包括：(a)α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性；以及(b)β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

55.根据权利要求46到54中任一项所述的TCR，其包括：

(a)α链可变结构域CDR1结构域，所述α链可变结构域CDR1结构域具有选自由SEQ IDNO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94和104组成的组的氨基酸序列；

(b)α链可变结构域CDR2结构域，所述α链可变结构域CDR2结构域具有选自由SEQ IDNO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95和105组成的组的氨基酸序列；

(c)α链可变结构域CDR3结构域，所述α链可变结构域CDR3结构域具有选自由SEQ IDNO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96和106组成的组的氨基酸序列；

(d)β链可变结构域CDR1，所述β链可变结构域CDR1具有选自由SEQ ID NO:

1、11、21、31、41、51、61、71、81、91和101组成的组的氨基酸序列；

(e)β链可变结构域CDR2，所述β链可变结构域CDR2具有选自由SEQ ID NO:

2、12、22、32、42、52、62、72、82、92和102组成的组的氨基酸序列；以及

(f)β链可变结构域CDR3，所述β链可变结构域CDR3具有选自由SEQ ID NO:

3、13、23、33、43、53、63、73、83、93和103组成的组的氨基酸序列。

56.根据权利要求55所述的TCR，其包括α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对，所述α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对选自由SEQ ID NO:9/7、19/17、29/27、39/37、49/47、59/57、69/67、79/77、89/87、99/97和109/107组成的组。

57.根据权利要求46到56中任一项所述的TCR，其进一步包括可检测的部分。

58.根据权利要求45到57中任一项所述的TCR，其中所述分离的TCR的中靶结合/脱靶结合值大于5、大于10、大于15、大于20、大于50、大于100、大于200、大于300、大于400、大于500、大于600、大于700、大于800、大于900或大于1000。

59.根据权利要求58所述的TCR，其中所述分离的TCR的中靶结合/脱靶结合值大于10。

60.根据权利要求59所述的TCR，其中所述分离的TCR的中靶结合/脱靶结合值大于500。

61.一种TCR，其竞争与根据权利要求45到60中任一项所述的分离的TCR结合。

62.一种药物组合物，其包括根据权利要求45到60中任一项所述的TCR以及药学上可接受的载剂或稀释剂。

63.一种分离的细胞，其呈递根据权利要求45到60中任一项所述的TCR。

64.一种多核苷酸分子，其包括对如权利要求45、47和49到61中任一项所示的TCR的α链可变结构域进行编码的多核苷酸序列。

65.一种多核苷酸分子，其包括对如权利要求46、48和49到61中任一项所示的TCR的β链可变结构域进行编码的多核苷酸序列。

66.一种载体，其包括根据权利要求64或65所述的多核苷酸序列。

67.一种分离的细胞，其表达根据权利要求66所述的载体。

68.一种治疗患有NY-ESO-1相关疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求45到61中任一项所述的TCR、根据权利要求62所述的药物组合物或根据权利要求63所述的分离的细胞，从而治疗所述受试者。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述NY-ESO-1相关疾病或病症是NY-ESO-1相关癌症。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所述NY-ESO-1相关癌症是脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、卵巢上皮癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、滑膜肉瘤、转移性实体瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、晚期黏液型病、圆细胞脂肪肉瘤、转移性黑色素瘤或复发性非小细胞肺癌。

71.根据权利要求68到70中任一项所述的方法，其中将所述TCR、所述药物组合物或所述细胞与第二治疗剂组合向所述受试者施用。

72.根据权利要求68到70中任一项所述的方法，其中所述施用是肠胃外施用。

73.一种多核苷酸分子，其编码T细胞受体(TCR)，其中所述TCR与包括SLLMWITQC(SEQID NO:111)的氨基酸序列(NY-ESO-1(157-165))的HLA-A2呈递的癌睾丸抗原NY-ESO-1肽特异性结合，其中所述TCR具有选自由以下组成的组的性质：(a)如通过发光测定确定的，不与对预测的脱靶肽但不是包括SEQ ID NO:111的氨基酸序列的HLA-A2呈递的NY-ESO-1肽进行表达的细胞特异性结合；(b)如通过流式细胞术测定确定的，不与表达预测的脱靶肽的细胞结合；(c)活化如通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物测定确定的比患者来源的NY-ESO-1特异性TCR大约两倍的T细胞应答；以及(d)活化如通过TCR介导的T细胞信号传导发光生物测定确定的比亲和力成熟的(例如，通过噬菌体展示)的NY-ESO-1特异性TCR大约两倍的T细胞应答。

74.根据权利要求73所述的多核苷酸分子，其编码至少一个TCRα链可变结构域和/或至少一个β链可变结构域。

75.根据权利要求73所述的多核苷酸分子，其中所述TCR包括α链可变结构域互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，所述α链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述α链可变结构域中的任一个内；以及β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3，所述β链可变结构域CDR1、CDR2和CDR3包含在表3中列出的所述β链可变结构域序列中的任一个内。

76.根据权利要求74或75所述的多核苷酸分子，其中所述TCR包括α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

77.根据权利要求73到76中任一项所述的多核苷酸分子，其中所述TCR包括β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

78.根据权利要求73到77中任一项所述的多核苷酸分子，其中所述TCR包括：(a)α链可变结构域，所述α链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述α链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性；以及(b)β链可变结构域，所述β链可变结构域的氨基酸序列与表3中列出的所述β链可变结构域氨基酸序列的所述氨基酸序列中的任一个的整个氨基酸序列具有至少85％氨基酸同一性。

79.根据权利要求73到78中任一项所述的多核苷酸分子，其中所述TCR包括

(a)α链可变结构域CDR1结构域，所述α链可变结构域CDR1结构域具有选自由SEQ IDNO:4、14、24、34、44、54、64、74、84、94和104组成的组的氨基酸序列；

(b)α链可变结构域CDR2结构域，所述α链可变结构域CDR2结构域具有选自由SEQ IDNO:5、15、25、35、45、55、65、75、85、95和105组成的组的氨基酸序列；

(c)α链可变结构域CDR3结构域，所述α链可变结构域CDR3结构域具有选自由SEQ IDNO:6、16、26、36、46、56、66、76、86、96和106组成的组的氨基酸序列；

(d)β链可变结构域CDR1，所述β链可变结构域CDR1具有选自由SEQ ID NO:1、11、21、31、41、51、61、71、81、91和101组成的组的氨基酸序列；

(e)β链可变结构域CDR2，所述β链可变结构域CDR2具有选自由SEQ ID NO:2、12、22、32、42、52、62、72、82、92和102组成的组的氨基酸序列；以及

(f)β链可变结构域CDR3，所述β链可变结构域CDR3具有选自由SEQ ID NO:3、13、23、33、43、53、63、73、83、93和103组成的组的氨基酸序列。

80.根据权利要求79所述的多核苷酸分子，其中所述TCR包括α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对，所述α链可变结构域/β链可变结构域氨基酸序列对选自由SEQ IDNO:9/7、19/17、29/27、39/37、49/47、59/57、69/67、79/77、89/87、99/97和109/107组成的组。

81.根据权利要求31所述的多核苷酸分子，其中所述TCR包括

(a)α链可变结构域CDR1，所述α链可变结构域CDR1由选自由SEQ ID NO:124、130、137、145和156组成的组的核酸序列编码；

(b)α链可变结构域CDR2，所述α链可变结构域CDR2由选自由SEQ ID NO:125、131、138、146和157组成的组的核酸序列编码；

(c)α链可变结构域CDR3，所述α链可变结构域CDR3由选自由SEQ ID NO:126、132、135、139、147、149、158、160和161组成的组的核酸序列编码；

(d)β链可变结构域CDR1，所述β链可变结构域CDR1由选自由SEQ ID NO:121、127、133、140、142、150和153组成的组的核酸序列编码；

(e)β链可变结构域CDR2，所述β链可变结构域CDR2由选自由SEQ ID NO:122、128、143、151和154组成的组的核酸序列编码；以及

(f)β链可变结构域CDR3，所述β链可变结构域CDR3由选自由SEQ ID NO:123、129、134、136、141、144、148、152、155、159组成的组的核酸序列编码。

82.根据权利要求81所述的多核苷酸分子，其中所述TCR包括α链可变结构域/β链可变结构域核酸序列对，所述α链可变结构域/β链可变结构域核酸序列对选自由SEQ ID NO:10/8、20/18、30/28、40/38、50/48、60/58、70/68、80/78、90/88、100/98和110/108组成的组。

83.一种载体，其包括根据权利要求73到82中任一项所述的多核苷酸分子的多核苷酸序列。

84.一种分离的细胞，其包括根据权利要求83所述的载体。

85.一种治疗患有NY-ESO-1相关疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求84所述的细胞，从而治疗所述受试者。

86.根据权利要求85所述的方法，其中所述NY-ESO-1相关疾病或病症是NY-ESO-1相关癌症。

87.根据权利要求86所述的方法，其中所述NY-ESO-1相关癌症是脂肪肉瘤、成神经细胞瘤、骨髓瘤、转移性黑色素瘤、滑膜肉瘤、膀胱癌、食管癌、肝细胞癌、头颈癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、间变性星形细胞瘤、脑肿瘤、输卵管癌、卵巢上皮癌、原发性腹膜腔癌、晚期实体瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、肉瘤、骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、多发性骨髓瘤、滑膜肉瘤、转移性实体瘤、食管癌、横纹肌肉瘤、晚期黏液型病、圆细胞脂肪肉瘤、转移性黑色素瘤或复发性非小细胞肺癌。

88.根据权利要求85到87中任一项所述的方法，其中所述细胞与第二治疗剂组合向所述受试者施用。

89.根据权利要求21、25、40、67和84中任一项所述的细胞，其中所述细胞是原代细胞。

90.根据权利要求89所述的细胞，其中所述原代细胞是原代淋巴细胞。

91.根据权利要求90所述的细胞，其中所述原代淋巴细胞是原代T淋巴细胞。

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