CN107881183A - 鼠抗‑ny‑eso‑1 t细胞受体 - Google Patents

鼠抗‑ny‑eso‑1 t细胞受体 Download PDF

Info

Publication number
CN107881183A
CN107881183A CN201711136635.4A CN201711136635A CN107881183A CN 107881183 A CN107881183 A CN 107881183A CN 201711136635 A CN201711136635 A CN 201711136635A CN 107881183 A CN107881183 A CN 107881183A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tcr
cell
eso
seq
nucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711136635.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107881183B (zh
Inventor
玛丽亚·R·帕克赫斯特
理查德·A·摩根
史蒂文·A·罗森堡
香农·费丝·罗萨蒂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
US Department of Health and Human Services
Original Assignee
US Department of Health and Human Services
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by US Department of Health and Human Services filed Critical US Department of Health and Human Services
Publication of CN107881183A publication Critical patent/CN107881183A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107881183B publication Critical patent/CN107881183B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex

Abstract

本发明提供分离的或纯化的T细胞受体(TCR)，所述T细胞受体具有对NY‑ESO‑1的抗原特异性。还提供的是相关多肽,蛋白,核酸,重组表达载体,分离的宿主细胞,细胞群,抗体,或其抗原结合部分,和药物组合物。本发明还提供使用本发明的TCR或相关物质检测哺乳动物中癌症存在的方法和治疗或预防哺乳动物中癌症的方法。

Description

鼠抗-NY-ESO-1 T细胞受体
本申请是于2013年5月22日提交的申请号为201380038884.3的发明专利申请的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本专利申请要求2012年5月22日提交的美国临时专利申请号61/650,020的权益,其通过引用以其整体并入本文。
通过引用并入电子提交的材料
通过引用以其整体并入本文的是与此同时提交的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表并且识别如下：命名为“713415ST25.TXT”一个23,462字节ASCII(Text)文件，日期为2013年4月30日。
发明背景
在一些患者中，过继性细胞治疗可以是对癌症的有效疗法。然而,对于过继性细胞治疗的整体成功的障碍仍然存在。例如,仅50％的黑素瘤样品可能产生肿瘤反应性T-细胞。非黑素瘤癌症产生肿瘤反应性T-细胞也可能是困难的。此外,很多患者可能不具有能用手术切除治疗的肿瘤。因此,存在对用于治疗患有癌症的患者的T-细胞受体的需求。
发明简述
本发明提供一种分离的或纯化的T-细胞受体(TCR)，所述T-细胞受体具有对NY-ESO-1的抗原特异性并且包含鼠可变区。本发明还提供相关多肽和蛋白,以及相关核酸,重组表达载体,宿主细胞,和细胞群。本发明还提供的是抗体,或其抗原结合部分,和与本发明的TCR相关的药物组合物。
本发明还提供检测哺乳动物中癌症存在的方法和治疗或预防哺乳动物中癌症的方法。本发明的检测哺乳动物中癌症存在的方法包括(i)将包含癌细胞的样品与本文描述的本发明的TCR,多肽,蛋白,核酸,重组表达载体,宿主细胞,宿主细胞群,或抗体,或其抗原结合部分中任一种接触,从而形成复合体,和(ii)检测所述复合体,其中复合体的检出表明在哺乳动物中存在癌症。
本发明的治疗或预防哺乳动物中癌症的方法包括以在哺乳动物中有效治疗或预防癌症的量向哺乳动物施用本文中描述的任意TCR,多肽,或蛋白,包含编码本文中描述的任意TCR,多肽,蛋白的核苷酸序列的任意核酸或重组表达载体,或包含编码本文中描述的任意TCR,多肽,或蛋白的重组载体的任意宿主细胞或宿主细胞群。
附图的一些场景的简述
图1A和1B是显示在与以不同浓度的NY-ESO-1157-165脉冲的树突细胞共培养时，转染有鼠抗-NY-ESO-1 TCR(阴影圆圈)或人抗-NY-ESO-1 TCR(无阴影圆圈)的人CD8+(图1A)或CD4+(图1B)T细胞的干扰素(IFN)-γ分泌的图表。
图2A和2B是显示单独培养(培养基)或与用对照肽脉冲的T2细胞,用NY-ESO-1157-165肽脉冲的T2细胞,或不同肿瘤细胞系888mel(NY-ESO-1-),Sk23mel(NY-ESO-1-),COA-A2-CEA(NY-ESO-1-),A375mel(NY-ESO-1+),1363mel(NY-ESO-1+),或COS-A2-ESO(NY-ESO-1+)之一共培养的转染有鼠抗-NY-ESO-1 TCR(阴影线条)或人抗-NY-ESO-1 TCR(无阴影线条)的人CD8+(图2A)或CD4+(图2B)T细胞的IFN-γ分泌的图表。
发明详述
本发明提供一种分离的或纯化的T-细胞受体(TCR)，所述T-细胞受体具有对NY-ESO-1的抗原特异性并且包含鼠可变区。NY-ESO-1是癌症睾丸抗原(CTA),其仅在肿瘤细胞和睾丸和胎盘的不表达MHC的生殖细胞中表达。NY-ESO-1在多种人癌症中表达，包括但不限于黑素瘤,乳腺癌,肺癌,前列腺癌,甲状腺癌,卵巢癌,和滑膜细胞肉瘤。NY-ESO-1蛋白可以包含SEQ ID NO：1,由或基本由SEQ ID NO：1组成。
所述TCR可以具有对任意NY-ESO-1蛋白、多肽或肽的抗原特异性。在本发明的实施方案中,所述TCR具有对包含SEQ ID NO：1,由或基本由SEQ ID NO：1组成的NY-ESO-1蛋白的抗原特异性。在本发明的优选的实施方案中,所述TCR具有对包含SLLMWITQC(SEQ ID NO：2),由或基本由SLLMWITQC(SEQ ID NO：2)组成的NY-ESO-1 157-165肽的抗原特异性。
本文中使用的表述“具有抗原特异性”意为所述TCR能够特意结合并免疫地识别NY-ESO-1,从而所述TCR对NY-ESO-1的结合引发免疫应答。
在本发明的一个实施方案中,本发明的TCR能够以I类主要组织相容性复合体(MHC)依赖的方式识别NY-ESO-1。本文中使用的“I类MHC依赖的方式”意为在I类MHC分子的情况下结合NY-ESO-1时，所述TCR引发免疫应答。所述I类MHC分子可以是本领域中已知的任意I类MHC分子,例如,HLA-A分子。在本发明的实施方案中,所述I类MHC分子是HLA-A2分子。
在本发明的实施方案中,本发明的TCR包含鼠可变区。本发明的TCR还可以包含源自任意合适物种诸如,例如,人或小鼠的恒定区。优选地,本发明的TCR还包含鼠恒定区。在特别优选的实施方案中,本发明的TCR是包含鼠可变区和鼠恒定区二者的鼠TCR。
如本文中使用的,术语“鼠,”当涉及本文中描述的TCR或TCR的任意组成部分(例如,互补决定区(CDR),可变区,恒定区,α链,和/或β链)时,意为源自小鼠的TCR(或其组成部分),即,源于或一度由小鼠T细胞表达的TCR(或其组成部分)。理想的是,所述TCR(或其组成部分)表达在人宿主细胞表面。
本发明的TCR提供很多优点,包括当用于过继性细胞转移时的优点。例如,不受限于特定理论或机制,人们相信，因为NY-ESO-1由多种癌症类型的细胞表达,本发明的TCR有利地提供破坏多种类型癌细胞的能力并且,因此,治疗或预防多种类型癌症。另外,不受限于特定理论或机制,人们相信，因为NY-ESO-1是仅在肿瘤细胞和睾丸和胎盘的不表达MHC的生殖细胞中表达的癌症睾丸抗原,本发明的TCR有利地靶向癌细胞的破坏，同时最小化或排出对正常、非癌细胞的破坏,从而降低,例如,最小化或排除毒性。人们还相信，与人TCR相比，鼠TCR可以提供人宿主细胞表面上增加的表达(例如,更大数量的TCR)和/或增加的功能性(如通过例如,细胞因子释放和细胞毒性测量)。不受限于特定理论和机制,人们相信，所述改善的表达和/或功能性由宿主细胞中内源性和外源性(转导的)TCR链混合的减少导致。因此,人们相信，鼠TCR可以比外源性人TCR更有效替代人宿主细胞表面上的内源性TCR。人们还相信，与人宿主细胞表达的外源性人TCR相比，鼠TCR提供改善的TCR链配对和/或改善的与人宿主细胞的CD3复合体的相互作用。
本发明的实施方案提供一种TCR，所述TCR包含两条多肽(即,多肽链),诸如TCR的α链,TCR的β链,TCR的γ链,TCR的δ链,或其组合。如果所述TCR具有对NY-ESO-1的抗原特异性并包含鼠可变区，本发明的TCR多肽可以包含任意氨基酸序列。
在本发明的优选的实施方案中,所述TCR包含两条多肽链,其各自包含可变区，所述可变区包含TCR的互补决定区(CDR)1,CDR2,和CDR3。优选地,所述第一多肽链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：3的CDR1(α链的CDR1),含有氨基酸序列SEQ ID NO：4的CDR2(α链的CDR2),和含有氨基酸序列SEQ ID NO：5的CDR3(α链的CDR3),并且所述第二多肽链包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：6的CDR1(β链的CDR1),含有氨基酸序列SEQ ID NO：7的CDR2(β链的CDR2),和含有氨基酸序列SEQID NO：8的CDR3(β链的CDR3)。在这个意义上,本发明的TCR可以包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NOs：3-5,6-8,和3-8。优选地，所述TCR包含SEQ ID NOs：3-8的氨基酸序列。
备选地或另外,所述TCR可以包含含有上文列出的CDRs的TCR的可变区的氨基酸序列。在这个意义上,所述TCR可以包含SEQ ID NO：9(α链的可变区)或10(β链的可变区),或SEQ ID NOs：9和10二者的氨基酸序列。优选地,本发明的TCR包含SEQ ID NOs：9和10的氨基酸序列。
备选地或另外,所述TCR可以包含TCR的α链和TCR的β链。本发明的TCR的α链和β链各自可以独立地包含任意氨基酸序列。优选地,所述α链包含上文列出的α链的可变区。在这个意义上,本发明的TCR可以包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。此种类型的发明TCR可以与TCR的任意β链配对。优选地,本发明的TCR的β链包含上文列出的β链的可变区。在这个意义上,本发明的TCR可以包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。因此，本发明的TCR可以包含SEQ IDNO：11或12,或SEQ ID NOs：11和12二者的氨基酸序列。优选地,本发明的TCR包含SEQ IDNOs：11和12的氨基酸序列。
本发明还提供的是一种分离的或纯化的多肽，所述多肽包含本文中描述的任意TCR的功能部分。本文中使用的术语“多肽”包括寡肽并且指通过一个或多个肽键连接的氨基酸单链。
就本发明的多肽而言,如果所述功能部分特异结合NY-ESO-1，所述功能部分可以是包含TCR(所述部分是其部分)的相邻氨基酸的任意部分。当用于涉及TCR时，术语“功能部分”指发明的TCR的任意部分或片段,所述部分或片段保留所述TCR(所述部分或片段是其部分)(亲本TCR)的生物学活性。功能部分包括,例如,保留特异结合NY-ESO-1,或检测,治疗,或预防癌症能力至与亲本TCR类似程度、相同程度或更高程度的那些TCR部分。关于亲本TCR,所述功能部分可以包含亲本TCR的例如,约10％,25％,30％,50％,68％,80％,90％,95％,或更多。
所述功能部分可以在所述部分的氨基或羧基末端,或在二者的末端都包含另外的氨基酸,所述另外的氨基酸未在亲本TCR的氨基酸序列中发现。理想的是,所述另外的氨基酸不干预所述功能部分的生物学功能,例如,特异结合NY-ESO-1,具有检测癌症,治疗或预防癌症的能力等。更理想的是,与亲本TCR的生物学活性相比所述另外的氨基酸增强生物学活性。
所述多肽可以包含本发明TCR的α和β链之一或二者的功能部分,诸如包含本发明TCR的α链和/或β链的可变区的CDR1,CDR2,和CDR3的一个或多个的功能部分。在这个意义上,所述多肽可以包含含有SEQ IDNO：3(α链的CDR1),4(α链的CDR2),5(α链的CDR3),6(β链的CDR1),7(β链的CDR2),8(β链的CDR3),或其组合的氨基酸序列的功能部分。优选地,本发明的多肽包含含有SEQ ID NOs：3-5,6-8,或SEQ ID NOs：3-8的全部的功能部分。更优选地,所述多肽包含含有SEQ ID NOs：3-8氨基酸序列的功能部分。
备选地或另外,本发明的多肽可以包含,例如,本发明TCR的可变区，所述可变区包含上文列出的CDR区的组合。在这个意义上,所述TCR可以包含SEQ ID NO：9(α链的可变区)或10(β链的可变区),或SEQ ID NOs：9和10二者的氨基酸序列。优选地,所述多肽包含SEQID NOs：9和10的氨基酸序列。
备选地或另外,本发明的多肽可以包含本文中描述的TCR之一的α或β链的全长。在这个意义上,本发明的多肽可以包含SEQ ID NO：11或12的氨基酸序列。备选地,本发明的多肽可以包含本文中描述的TCR的两条链。例如,本发明的多肽可以包含SEQ ID NOs：11和12两条氨基酸序列。
本发明还提供一种分离的或纯化的蛋白，所述蛋白包含本文中描述的多肽中的至少一种。“蛋白”意为包含一个或多个多肽链的分子。
本发明的蛋白可以包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：9的第一多肽链和含有氨基酸序列SEQ ID NO：10的第二多肽链。本发明的蛋白可以,例如,包含含有氨基酸序列SEQ IDNO：11的第一多肽链和含有氨基酸序列SEQ ID NO：12的第二多肽链。在此种情况下,本发明的蛋白可以是TCR。备选地,如果例如,所述蛋白包含含有SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的单个多肽链,或如果所述蛋白的第一和/或第二多肽链还包含其它氨基酸序列,例如,编码免疫球蛋白或其部分的氨基酸序列,那么本发明的蛋白可以是融合蛋白。在这个意义上,本发明还提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一种本文中描述的本发明的多肽以及至少一种其它多肽。所述其它多肽可以作为融合蛋白的分开的多肽存在,或可以作为与本文中描述的本发明的多肽之一在框内(串联)表达的多肽存在。所述其它多肽可以编码任意肽或蛋白分子,或其部分,包括,但不限于免疫球蛋白,CD3,CD4,CD8,MHC分子,CD1分子,例如,CD1a,CD1b,CD1c,CD1d,等。
所述融合蛋白可以包含一个或多个拷贝的本发明的多肽和/或一个或多个拷贝的所述其它多肽。例如,所述融合蛋白可以包含1,2,3,4,5,或更多个拷贝的本发明的多肽和/或其它多肽。制备融合蛋白的合适方法是本领域中已知的,并且包括,例如,重组方法。参见,例如,Choi等人,Mol.Biotechnol.31：193-202(2005)。
在本发明的一些实施方案中,本发明的TCR,多肽,和蛋白(包括功能部分和功能变体)可以表达为包含连接α链和β链的接头肽的单个蛋白。适于连接α链和β链的任意接头肽可以用于本发明的TCR,多肽,和蛋白(包括功能部分和功能变体)。在本发明的实施方案中,所述接头肽是小RNA病毒2A肽。在这个意义上,本发明的TCR,多肽,和蛋白(包括功能部分和功能变体)还可以包含接头肽，所述接头肽包含含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列。所述接头肽可以有利地促进重组TCR,多肽,和/或蛋白在宿主细胞中的表达。在通过宿主细胞表达包括所述接头肽的构建体时,所述接头肽可以被切下,产生分开的α和β链。
本发明的蛋白可以是包含至少一种本文中描述的本发明的多肽的重组抗体。本文中使用的“重组抗体”指重组的(例如,遗传改造的)蛋白，所述蛋白包含至少一种本发明的多肽和抗体、或其部分的多肽链。抗体、或其部分的多肽,可以是重链、轻链、重链或轻链的可变区或恒定区,单链可变片段(scFv)、或抗体的Fc、Fab、或F(ab)2'片段等。抗体,或其部分的多肽链,可以作为重组抗体的分开的多肽存在。备选地,抗体、或其部分的多肽链,可以作为与本发明的多肽在框内(串联)表达的多肽存在。抗体、或其部分的多肽,可以任意抗体或任意抗体片段的多肽,包括本文中描述的任意抗体和抗体片段的多肽。
本发明的范围内包括的是本文中描述的本发明的TCR,多肽,和蛋白的功能变体。本文中使用的术语“功能变体”指与亲本TCR,多肽,或蛋白具有相当程度或显著序列同一性或相似性的TCR,多肽,或蛋白,所述功能变体保留所述TCR,多肽,或蛋白(所述功能变体是其变体)的生物学活性。功能变体包括,例如,保留对NY-ESO-1的特异结合能力至与亲本TCR,多肽,或蛋白相似程度、相同程度、或更高程度的那些本文中描述的(亲本TCR,多肽,或蛋白)的TCR,多肽,或蛋白变体。关于亲本TCR,多肽,或蛋白,所述功能变体可以与亲本TCR,多肽,或蛋白在氨基酸序列上,例如,至少约30％,50％,75％,80％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或更多相同。
所述功能变体可以,例如,包含具有至少一个保守氨基酸置换的亲本TCR,多肽,或蛋白的氨基酸序列。保守氨基酸置换是本领域中已知的,并且包括这样的氨基酸置换，其中一个具有某物理和/或化学性质的氨基酸改变为另一个具有相同化学或物理性质的氨基酸。例如,所述保守氨基酸置换可以是酸性氨基酸置换为另一个酸性氨基酸(例如,Asp或Glu),具有非极性侧链的氨基酸置换为另一个具有非极性侧链的氨基酸(例如,Ala,Gly,Val,Ile,Leu,Met,Phe,Pro,Trp,Val,等),碱性氨基酸置换为另一个碱性氨基酸(Lys,Arg,等),具有极性侧链的氨基酸置换为另一个具有极性侧链的氨基酸(Asn,Cys,Gln,Ser,Thr,Tyr,等),等。
备选地或另外,所述功能变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸置换的亲本TCR,多肽,或蛋白氨基酸序列。在此种情况下,优选所述非保守氨基酸置换不干扰或抑制所述功能变体的生物学活性。优选地,所述非保守氨基酸置换增强所述功能变体的生物学活性,从而与亲本TCR,多肽,或蛋白相比，所述功能变体的生物学活性增加。
所述TCR,多肽,或蛋白可以基本上由本文中描述的一个或多个具体说明的氨基酸序列组成,从而所述功能变体的其它组分,例如,其它氨基酸,实质上不改变功能变体的生物学活性。在这个意义上,本发明的TCR,多肽,或蛋白可以,例如,基本上由SEQ ID NO：11或12,或SEQ ID NOs：11和12二者的氨基酸序列组成。同样,例如,本发明的TCR,多肽,或蛋白可以基本上由SEQ ID NO：9或10,或SEQ ID NOs：9和10二者的氨基酸序列组成。此外,本发明的TCR,多肽,或蛋白可以基本上由SEQ IDNO：3(α链的CDR1),4(α链的CDR2),5(α链的CDR3),6(β链的CDR1),7(β链的CDR2),8(β链的CDR3),或其任意组合,例如,SEQ ID NOs：3-5,6-8,或3-8的氨基酸序列组成。
本发明的TCR,多肽,和蛋白(包括功能部分和功能变体)可以是任意长度,即,可以包含任意数量的氨基酸,只要所述TCR,多肽,或蛋白(或其功能部分或功能变体)保留其生物学活性,例如,特异结合NY-ESO-1,检测哺乳动物中癌症,或治疗或预防哺乳动物中癌症等的能力。例如,所述多肽可以是50至5000个氨基酸长,诸如50,70,75,100,125,150,175,200,300,400,500,600,700,800,900,1000或更多个氨基酸长。在这个意义上,本发明的多肽还包括寡肽。
本发明的TCR,多肽,和蛋白(包括功能部分和功能变体)可以包含合成的氨基酸，所述合成的氨基酸代替一个或多个天然存在的氨基酸。此种合成的氨基酸是本领域中已知的,并且包括,例如,氨基环己烷羧酸,正亮氨酸,α-氨基正癸酸,高丝氨酸,S-乙酰氨甲基-半胱氨酸,反式-3-和反式-4-羟脯氨酸,4-氨基苯丙氨酸,4-硝基苯丙氨酸,4-氯苯丙氨酸,4-羧基苯丙氨酸,β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸,苯基甘氨酸,α-萘基丙氨酸,环己基丙氨酸,环己基甘氨酸,吲哚啉-2-羧酸,1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸,氨基丙二酸,氨基丙二酸单酰胺,N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸,N’,N’-二苄基-赖氨酸,6-羟基赖氨酸,鸟氨酸,α-氨基环丙烷羧酸,α-氨基环己烷羧酸,α-氨基环庚烷羧酸,α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸,α,γ-二氨基丁酸,α,β-二氨基丙酸,高苯丙氨酸,和α-叔丁基甘氨酸。
本发明的TCR,多肽,和蛋白(包括功能部分和功能变体)可以被糖基化,酰胺化,羧化,磷酸化,酯化,N-乙酰化,通过例如二硫化物桥环化,或转变为酸加成盐和/或任选地二聚化或多聚化,或缀合。
当本发明的TCR,多肽,和蛋白(包括功能部分和功能变体)为盐的形式时,优选地,所述多肽为药用盐的形式。合适药用酸加成盐包括源自无机酸的那些,诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、偏磷酸盐、硝酸和硫酸盐,以及有机酸的那些,诸如酒石酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、乳酸盐、富马酸盐、苯甲酸盐、乙醇酸盐、葡萄糖酸盐、琥珀酸盐、和芳基磺酸盐例如,对甲苯磺酸盐。
可以通过本领域中已知的方法获得本发明的TCR,多肽,和/或蛋白(包括其功能部分和功能变体)。从头合成多肽和蛋白的合适方法在参考文献中描述，所述参考文献诸如Chan等人,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2005；Peptide and Protein Drug Analysis,ed.Reid,R.,MarcelDekker,Inc.,2000；Epitope Mapping,ed.Westwoood等人,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2000；和美国专利5,449,752。同样,可以使用本文中描述的核酸使用标准重组方法重组成产多肽和蛋白。参见,例如,Sambrook等人,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY 2001；和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates和John Wiley&Sons,NY,1994。此外,本发明的一些TCR,多肽,和蛋白(包括其功能部分和功能变体)可以从来源诸如植物、细菌、昆虫、哺乳动物例如小鼠、人等分离和/或纯化。分离和纯化方法是本领域中公知的。备选地,本文中描述的TCR,多肽,和/或蛋白(包括其功能部分和功能变体)可以由公司诸如Synpep(Dublin,CA),Peptide TechnologiesCorp.(Gaithersburg,MD),和MultiplePeptide Systems(San Diego,CA)商业合成。在这方面,本发明的TCR,多肽,和蛋白可以是合成的,重组的,分离的,和/或纯化的。
本发明范围中包括的是缀合物,例如,生物缀合物,所述缀合物包含本发明的TCR,多肽,或蛋白(包括任意其功能部分或变体),核酸,重组表达载体,宿主细胞,宿主细胞群,或抗体、或其抗原结合部分的任一个。缀合物,以及通常合成缀合物的方法,是本领域中已知的(参见,例如,Hudecz,F.,Methods Mol.Biol.298：209-223(2005)和Kirin等人,InorgChem.44(15)：5405-5415(2005))。
本发明还提供的是包含编码本文中描述的任意TCR,多肽,或蛋白(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列的核酸。
本文中使用的“核酸”包括“多聚核苷酸”，“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常意为DNA或RNA的聚合物,其可以是单链或双链的,合成的或获得(例如,分离和/或纯化)自天然来源,其可以含有天然,非天然或改变的核苷酸,并且其可以含有天然,非天然或改变的核苷酸间连接,诸如磷酰胺酯(phosphoroamidate)连接或硫代磷酸酯连接,替代未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间建立的磷酸二酯。通常优选所述核酸不包含任何插入,删除,倒位,和/或置换。然而,如本文中讨论的，在一些情况中，对于核酸而言，包含一个或多个插入,删除,倒位,和/或置换可以是合适的。
优选地,本发明的核酸是重组的。本文中使用的术语“重组”指(i)在活细胞外通过将天然或合成的核酸片段连接于可以在活细胞中复制的核酸分子而构建的分子,或(ii)上述(i)中描述的那些复制产生的分子。为了本文中的目的,所述复制可以是体外复制或体内复制。
可以基于化学合成和/或酶连接反应使用本领域中已知的步骤构建所述核酸。参见,例如,Sambrook等人,在前,和Ausubel等人,在前。例如,可以使用天然存在的核苷酸或设计以增加分子的生物学稳定性或增加杂交时形成的双螺旋的物理稳定性的不同修饰的核苷酸(例如,硫代磷酸酯衍生物和吖啶置换的核苷酸)化学合成核酸。可以用于产生所述核酸的修饰的核苷酸的实例包括,但不限于,5-氟尿嘧啶,5-溴尿嘧啶,5-氯尿嘧啶,5-碘尿嘧啶,次黄嘌呤,黄嘌呤,4-乙酰胞嘧啶,5-(羧基羟甲基)尿嘧啶,5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷,5-羧甲基氨甲基尿嘧啶,二氢尿嘧啶,β-D-半乳糖基queosine,肌苷,N6-异戊烯基腺嘌呤,1-甲基鸟嘌呤,1-甲基肌苷,2,2-二甲基鸟嘌呤,2-甲基腺嘌呤,2-甲基鸟嘌呤,3-甲基胞嘧啶,5-甲基胞嘧啶,N6-取代的腺嘌呤,7-甲基鸟嘌呤,5-甲基氨甲基尿嘧啶,5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿嘧啶,β-D-甘露糖基queosine,5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶,5-甲氧基尿嘧啶,2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤,尿嘧啶-5-羟乙酸(v),wybutoxosine,假尿嘧啶,queosine,2-硫胞嘧啶,5-甲基-2-硫尿嘧啶,2-硫尿嘧啶,4-硫尿嘧啶,5-甲基尿嘧啶,尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯,3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶,和2,6-二氨基嘌呤。备选地,本发明的一种或多种核酸可以购自公司,诸如Macromolecular Resources(Fort Collins,CO)和Synthegen(Houston,TX)。
所述核酸可以包含编码本发明的任意TCR,多肽,或蛋白,或其功能部分或功能变体的任意核苷酸序列。例如,所述核酸可以包含含有以下各项,由以下各项组成,或基本上由以下各项组成的核苷酸序列：SEQ ID NO：19(野生型α链)或SEQ ID NO：20(野生型β链)或SEQ ID NOs：19和20二者。
在一些实施方案中,所述核苷酸序列可以被密码子优化。不受限于特定理论或机制,人们相信，核苷酸序列的密码子优化增加mRNA转录本的翻译效率。核苷酸序列的密码子优化可以包括将天然密码子置换为另一个编码相同氨基酸,但可以由在细胞中更容易获得的tRNA翻译的密码子,从而增加翻译效率。核苷酸序列的优化还可以减少干扰翻译的二级mRNA结构,从而增加翻译效率。在本发明的实施方案中,密码子优化的核苷酸序列可以包含以下各项,由以下各项组成,或基本上由以下各项组成：SEQ ID NO：15(密码子优化的α链),SEQ ID NO：16(密码子优化的β链),SEQ ID NO：21(密码子优化的α链可变区),SEQ ID NO：22(密码子优化的β链可变区),SEQ ID NOs：15和16二者,SEQ ID NOs：21和22二者,SEQ IDNOs：15和20二者,或SEQ ID NOs：16和19二者。
在本发明的实施方案中,就本发明的其它方面而言，编码本发明的TCR,多肽,和蛋白(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列还可以包含编码本文中描述的任意接头肽的核苷酸序列。在本发明的实施方案中,所述接头肽可以由包含SEQ ID NO：14的核苷酸序列编码。
本发明还提供包含与本文中描述的任意核酸至少约70％或更多,例如,约80％,约90％,约91％,约92％,约93％,约94％,约95％,约96％,约97％,约98％,或约99％相同的核苷酸序列的核酸。
所述核苷酸序列备选地可以包含与SEQ ID NO：15,SEQ ID NO：16,SEQ ID NO：19,SEQ ID NO：20,SEQ ID NO：21,SEQ ID NO：22,SEQ ID NOs：15和16二者,SEQ ID NOs：19和20二者,SEQ ID NOs：21和22二者,SEQ ID NOs：15和20二者,或SEQ ID NOs：16和19二者简并的核苷酸序列。优选地,所述核酸包含含有SEQ ID NO：15,16,19,20,21,或22,SEQ IDNOs：15和16,SEQ ID NOs：19和20,SEQ ID NOs：21和22,SEQ ID NOs：15和20,或SEQ IDNOs：16和19的核苷酸序列,或与其简并的核苷酸序列。
本发明还提供一种分离的或纯化的核酸，所述核酸包含与本文中描述的任意核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或在严格条件下与本文中描述的任意核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严格条件下杂交的核苷酸序列优选在高度严格条件下杂交。“高度严格条件”意为核苷酸序列以可检测地强于非特异杂交的量特异杂交于靶序列(本文中描述的任意核酸的核苷酸序列)。高度严格条件包括将具有精确互补序列的多核苷酸,或仅含有少数分散的错配的多核苷酸与偶尔具有少数小的匹配所述核苷酸序列的区域(例如,3-10个碱基)的随机序列相区分。此种小的互补区域比14-17或更多碱基的全长互补更容易解链,并且高度严格杂交使它们易于区分。相对高度严格条件将包括,例如,低盐和/或高温条件,诸如由约0.02-0.1M NaCl或等效的,在约50-70℃的温度提供的低盐和/或高温条件。此种高度严格条件容许核苷酸序列和模板或靶链之间很少的(如果有)错配,并尤其适于检测本发明的任意TCR的表达。一般理解，可以通过加入增加量的甲酰胺使条件更严格。
本发明的核酸可以被并入重组表达载体。在这个意义上,本发明提供重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的任意核酸。为了本文中的目的,术语“重组表达载体”意为遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当构建体包含编码mRNA,蛋白,多肽,或肽的核苷酸序列,并且在足以使mRNA,蛋白,多肽,或肽在细胞内表达的条件下将载体与细胞接触时，所述构建体允许通过宿主细胞表达mRNA,蛋白,多肽,或肽。本发明的载体作为整体不是天然存在的。然而,载体的部分可以是天然存在的。本发明的重组表达载体可以包含任意类型的核苷酸,包括,但不限于DNA和RNA,所述核苷酸可以是单链或双链的,合成的或部分获自天然来源,并且其可以含有天然,非天然或改变的核苷酸。所述重组表达载体可以包含天然存在的,非天然存在的核苷酸间连接,或两种类型的连接。优选地,所述非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间连接不妨碍载体的转录或复制。
本发明的重组表达载体可以是任意合适的重组表达载体,并且可以用于转化或转染任意合适的宿主细胞。合适的载体包括设计用于繁殖和扩大或用于表达或用于二者的那些载体,诸如质粒和病毒。所述载体可以选自由以下各项组成的组：pUC系列(FermentasLife Sciences),pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,CA),pET系列(Novagen,Madison,WI),pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden),和pEX系列(Clontech,Palo Alto,CA)。噬菌体载体,诸如λGT10,λGT11,λZapII(Stratagene),λEMBL4,和λNM1149,也可以被使用。植物表达载体的实例包括pBI01,pBI101.2,pBI101.3,pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括pEUK-Cl,pMAM和pMAMneo(Clontech)。优选地,所述重组表达载体是病毒载体,例如,逆转录病毒载体或慢病毒载体。
可以使用描述于例如,Sambrook等人,在前,和Ausubel等人,在前中的标准重组DNA技术制备本发明的重组表达载体。可以制备环形或线性的表达载体构建体以含有在原核或真核宿主细胞中行使功能的复制体系。复制体系可以源自,例如ColEl,2μ质粒,λ,SV40,牛乳头瘤病毒,等。
理想的是,所述重组表达载体包含调节序列,诸如转录和翻译起始和终止密码子,所述密码子特异于载体被引入的宿主细胞类型(例如,细菌,真菌,植物,或动物),酌情并考虑载体是否是基于DNA或基于RNA的。
所述重组表达载体可以包括一个以上标志物基因,所述标志物基因允许选择转化的或转染的宿主细胞。标志物基因包括生物杀灭剂抗性,例如,对抗生素、重金属等的抗性,补充于营养缺陷型宿主以提供原养型等。用于本发明的表达载体的合适的标志物基因包括,例如,新霉素/G418抗性基因,潮霉素抗性基因,组氨醇抗性基因,四环素抗性基因,和氨苄青霉素抗性基因。
所述重组表达载体可以包含可操作连接于编码所述TCR,多肽,或蛋白(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列,或连接于与编码所述TCR,多肽,或蛋白的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列的天然或非天然启动子。启动子的选择(例如强、弱、可诱导、组织特异和发育特异)在技术人员的普通技术内。类似地，将核苷酸序列与启动子结合也在技术人员的普通技术内。所述启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子,例如,巨细胞病毒(CMV)启动子,SV40启动子,RSV启动子,和在鼠干细胞病毒的长末端重复中发现的启动子。
本发明的重组表达载体可以被设计为瞬时表达,稳定表达,或设计为二者都有。另外,所述重组表达载体可以被制备为组成型表达或诱导型表达。此外,所述重组表达载体可以被制备为包括自杀基因。
本文中使用的,术语“自杀基因”指引起细胞表达自杀基因而死亡的基因。自杀基因可以是赋予细胞(基因在其中表达)对化学剂例如药物灵敏度，并当细胞与化学剂接触或暴露于化学剂时引起细胞死亡的基因。自杀基因是本领域中已知的(见,例如,Suicide Gene Therapy：Methods and Reviews,Springer,Caroline J.(Cancer Research UKCentre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research,Sutton,Surrey,UK),Humana Press,2004)，并且包括,例如,单纯疱疹病毒(Herpes SimplexVirus)(HSV)胸苷激酶(TK)基因,胞嘧啶脱氨酶(daminase),嘌呤核苷酸磷酸化酶,和硝基还原酶。
本发明的重组表达载体可以包含编码位于编码β链的全部或部分的核苷酸序列5’侧的α链的全部或部分的核苷酸序列。在这个意义上,本发明的实施方案提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码CDR 1α,CDR2α,CDR3α,CDR1β,CDR2β,和CDR3β的核苷酸序列,并且编码CDR1α,CDR2α,和CDR3α的核苷酸序列在编码CDR1β,CDR2β,和CDR3β的核苷酸序列的5’侧。同样,编码CDR1β,CDR2β,和CDR3β的核苷酸序列可以在编码CDR1α,CDR2α,和CDR3α的核苷酸序列的3’侧。在本发明的另一个实施方案中,所述重组表达载体包含编码α链的可变区和β链的可变区的核苷酸序列,并且编码α链可变区的核苷酸序列在编码β链可变区的核苷酸序列的5’侧。同样,编码β链可变区的核苷酸序列可以在编码α链可变区的核苷酸序列的3’侧。在本发明的另一个实施方案中,所述重组表达载体包含编码α链和β链的核苷酸序列,并且编码α链的核苷酸序列在编码β链的核苷酸序列的5’侧。同样,编码β链的核苷酸序列可以在编码α链的核苷酸序列的3’侧。包含编码位于编码β链的全部或部分的核苷酸序列的5’侧的α链的全部或部分的核苷酸序列的重组表达载体可以包含SEQ ID NO：17。
本发明的重组表达载体可以包含编码位于编码β链的全部或部分的核苷酸序列的3’侧的α链的全部或部分的核苷酸序列。不受特定理论或机制限制,人们相信，与由重组表达载体(其中编码α链的全部或部分的核苷酸序列位于编码β链的全部或部分的核苷酸序列的5’侧)编码的TCR,多肽,或蛋白(或其功能部分或功能变体)相比，由重组表达载体(其中编码α链的全部或部分的核苷酸序列位于编码β链的全部或部分的核苷酸序列的3’侧)编码的TCR,多肽,或蛋白(或其功能部分或变体)提供改善的功能性和抗原识别。在这个意义上,本发明的实施方案提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码CDR 1α,CDR2α,CDR3α,CDR1β,CDR2β,和CDR3β的核苷酸序列,并且编码CDR1α,CDR2α,和CDR3α的核苷酸序列在编码CDR1β,CDR2β,和CDR3β的核苷酸序列的3’侧。同样,编码CDR1β,CDR2β,和CDR3β的核苷酸序列可以在编码CDR1α,CDR2α,和CDR3α的核苷酸序列的5’侧。在本发明的另一个实施方案中,所述重组表达载体包含编码α链可变区和β链可变区的核苷酸序列,并且编码α链可变区的核苷酸序列在编码β链可变区的核苷酸序列的3’侧。同样,编码β链可变区的核苷酸序列可以在编码α链可变区的核苷酸序列的5’侧。在本发明的另一个实施方案中,所述重组表达载体包含编码α链和β链的核苷酸序列,并且编码α链的核苷酸序列在编码β链的核苷酸序列的3’侧。同样,编码β链的核苷酸序列可以在编码α链的核苷酸序列的5’侧。所述重组表达载体包含编码位于编码β链的全部或部分的核苷酸序列的3’侧的α链的全部或部分的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO：18。
在本发明的实施方案中,所述重组表达载体可以包含DNA标签。所述DNA标签可以将重组表达载体区别于另一种编码相同蛋白序列的载体。所述DNA标签可以不包括在编码本发明的TCR(包括其功能部分和功能变体),多肽,或蛋白的核苷酸序列内，并且因此可以不影响其表达。包括所述DNA标签的重组表达载体使得可能将相同的核苷酸序列置于一些不同的细胞群体中，并随后基于它们含有哪种载体区分这些群体。
本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本文中描述的任意重组表达载体。本文中使用的术语“宿主细胞”指可以含有本发明的重组表达载体的任意类型的细胞。所述宿主细胞可以是真核细胞,例如植物、动物、真菌或藻类,或可以是原核细胞,例如细菌或原生动物。所述宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞(即,直接分离自生物例如人)。所述宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞(即,在悬浮液中生长的细胞)。合适宿主细胞是本领域中已知的并且包括,例如,DH5α大肠杆菌细胞,中国仓鼠卵巢细胞,猴VERO细胞,COS细胞,HEK293细胞,等。为了扩增或复制所述重组表达载体的目的,所述宿主细胞优选为原核细胞，例如,DH5α细胞。为了生产重组TCR,多肽,或蛋白,所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞。最优选地,所述宿主细胞是人细胞。同时所述宿主细胞可以是任意细胞类型,可以源自任意类型组织,并且可以是任意发育阶段的,所述宿主细胞可以是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。优选地,所述宿主细胞可以是T细胞。
为了本文中的目的,所述T细胞可以是任意T细胞,诸如培养的T细胞,例如,原代T细胞,或来自培养的T细胞系,例如,Jurkat,SupT1等的T细胞,或获自哺乳动物的T细胞。如果获自哺乳动物,所述T细胞可以获自很多来源,包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺、或其他组织或体液。T细胞还可以是富集的或纯化的。所述T细胞可以是人T细胞。所述T细胞可以是分离自人的T细胞。所述T细胞可以是任意类型的T细胞并且可以是任意发育阶段的,包括但不限于,CD4+/CD8+双阳性T细胞,CD4+辅助T细胞,例如,Th1和Th2细胞,CD8+T细胞,细胞毒性T细胞,肿瘤浸润淋巴细胞,记忆T细胞,幼稚T细胞,等.优选地,所述T细胞可以是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
本发明还提供的是包含本文中描述的至少一种宿主细胞的细胞群。所述细胞群可以是除了至少一种其它细胞,例如不包含任何重组表达载体的宿主细胞(例如,T细胞),或不同于T细胞的细胞(例如,B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等)之外的，包含含有描述的任意重组表达载体的宿主细胞的异质群体。备选地,所述细胞群可以基本上是同质群体,其中所述群体主要包含(例如,基本上由包含重组表达载体的宿主细胞组成)包含重组表达载体的宿主细胞。所述群体还可以是克隆细胞群,其中所述群体的所有细胞是包含重组表达载体的单个宿主细胞克隆,从而所述群体的所有细胞包含所述重组表达载体。在本发明的一个实施方案中,所述细胞群是包含含有本文中描述的重组表达载体的宿主细胞的克隆群体。
本发明还提供一种抗体,或其抗原结合部分,所述抗体,或其抗原结合部分特异结合本文中描述的任意TCR的功能部分。优选地,所述功能部分特异结合NY-ESO-1,例如,所述功能部分包含氨基酸序列SEQ ID NO：3(α链的CDR1),4(α链的CDR2),5(α链的CDR3),6(β链的CDR1),7(β链的CDR2),8(β链的CDR3),SEQ ID NO：9,SEQ ID NO：10,或其组合,例如,3-5,6-8,3-8,或9-10。更优选地,所述功能部分包含SEQ ID NOs：3-8的氨基酸序列。在优选的实施方案中,所述抗体,或其抗原结合部分结合由所有6个CDRs(α链的CDR1-3和β链的CDR1-3)形成的表位。所述抗体可以是本领域中已知的任意类型的免疫球蛋白。例如,所述抗体可以是任意同种型,例如,IgA,IgD,IgE,IgG,IgM,等。所述抗体可以是单克隆或多克隆的。所述抗体可以是天然存在的抗体,例如,分离和/或纯化自哺乳动物,例如,小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等的抗体。备选地,所述抗体可以是遗传改造的抗体,例如,人源化抗体或嵌合抗体。所述抗体可以是单体或多聚形式。同样,所述抗体可以具有对本发明TCR的功能部分的任意水平的亲和力(affinity)或亲合力(avidity)。理想的是,所述抗体对本发明TCR的功能部分特异,从而存在与其它肽或蛋白最小的交叉反应。
测试抗体结合本发明TCR的任意功能部分的能力的方法是本领域中已知的并且包括任意抗体-抗原结合测定,诸如,例如,放射性免疫测定(RIA),ELISA,蛋白质印迹,免疫沉淀,和竞争性抑制测定(参见,例如,Janeway等人,在下)。
制备抗体的合适方法是本领域中已知的。例如,标准杂交瘤方法描述于,例如,和Milstein,Eur.J.Immunol.,5,511-519(1976),Harlow和Lane(编辑),Antibodies：A Laboratory Manual,CSH Press(1988),和C.A.Janeway等人(编辑),Immunobiology,第5版,Garland Publishing,New York,NY(2001))中。备选地,其它方法,诸如EBV-杂交瘤方法(Haskard和Archer,J.Immunol.Methods,74(2),361-67(1984),和Roder等人,Methods Enzymol.,121,140-67(1986)),和噬菌体载体表达系统(参见,例如,Huse等人,Science,246,1275-81(1989))是本领域中已知的。此外,在非人动物中生产抗体的方法描述于,例如,美国专利5,545,806,5,569,825,和5,714,352中)。
此外噬菌体展示可以用于产生本发明的抗体。关于这一点,可以使用标准分子生物学和重组DNA技术产生编码抗体的抗原结合可变(V)区的噬菌体文库(参见,例如,Sambrook等人(编辑),Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York(2001))。针对对所需抗原的特异结合，选择编码具有所需特异性的可变区的噬菌体,并且重建完全或部分抗体，其包含选择的可变结构域。将编码所述重建的抗体的核酸序列引入合适的细胞系,诸如用于杂交瘤产生的骨髓瘤细胞,从而由所述细胞分泌具有单克隆抗体特性的抗体(参见,例如,Janeway等人,在前,Huse等人,在前,和美国专利6,265,150)。
抗体可以由对特定重链和轻链免疫球蛋白基因转基因的转基因小鼠生产。此种方法是本领域中已知的并且描述于,例如美国专利5,545,806和5,569,825,以及Janeway等人,在前中。
用于产生人源化抗体的方法是本领域中公知的并且详细描述于,例如,Janeway等人,在前,美国专利5,225,539,5,585,089和5,693,761,欧洲专利号0239400B1,和英国专利号2188638中。还可以使用描述于美国专利5,639,641和Pedersen等人,J.Mol.Biol.,235,959-973(1994)中的抗体表面重建(resurfacing)技术产生人源化抗体。
本发明还提供本文中描述的任意抗体的抗原结合部分。所述抗原结合部分可以是具有至少一个抗原结合位点的任意部分,诸如Fab,F(ab’)2,dsFv,sFv,双抗体(diabodies),和三抗体(triabodies)。
可以使用常规重组DNA技术产生单链可变区片段(sFv)抗体片段(其由包含通过合成的肽连接于轻抗体链V结构域的抗体重链可变(V)结构域的截短的Fab片段组成)(参见,例如,Janeway等人,在前)。类似地,二硫化物稳定的可变区片段(dsFv)可以通过重组DNA技术制备(参见,例如,Reiter等人,Protein Engineering,7,697-704(1994))。然而,本发明的抗体片段不限于这些示例性类型的抗体片段。
同样,所述抗体,或其抗原结合部分,可以被修饰以包含可检测标记,诸如,例如,放射性同位素,荧光团(例如,异硫氰酸荧光素(FITC),藻红蛋白(PE)),酶(例如,碱性磷酸酶,辣根过氧化物酶),和元素颗粒(例如,金颗粒)。
本发明的TCR,多肽,蛋白,(包括其功能部分和功能变体),核酸,重组表达载体,宿主细胞(包括其群体),和抗体(包括其抗原结合部分),可以是分离的和/或纯化的。本文中使用的术语“分离的”意为已经从其天然环境移出。本文中使用的术语“纯化的”意为纯度已经被增加,其中“纯度”是相对术语,并且不必须被理解为绝对纯度。例如,所述纯度可以是至少约50％,可以大于60％,70％或80％,或可以是100％。
本发明的TCR,多肽,蛋白(包括其功能部分和变体),核酸,重组表达载体,宿主细胞(包括其群体),和抗体(包括其抗原结合部分)(其所有在下文共同被称为“发明的TCR物质”),可以配制为组合物,诸如药物组合物。在这点上,本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含TCR,多肽,蛋白,功能部分,功能变体,核酸,表达载体,宿主细胞(包括其群体),和抗体(包括其抗原结合部分),以及药用载体的任一种。本发明的含有任意本发明的TCR物质的药物组合物可以包含多于一种本发明的TCR物质,例如,多肽和核酸,或两种或多种不同TCR。备选地,所述药物组合物可以包含与另一种药学活性剂或药物联合的发明的TCR物质,所述另一种药学活性剂或药物诸如化疗剂,例如,天冬酰胺酶(asparaginase),白消安(busulfan),卡铂(carboplatin),顺铂(cisplatin),正定霉素(daunorubicin),阿霉素(doxorubicin),氟尿嘧啶,吉西他滨(gemcitabine),羟基脲(hydroxyurea),甲氨蝶呤(methotrexate),紫杉醇(paclitaxel),利妥昔单抗(rituximab),长春碱(vinblastine),长春新碱(vincristine)等。
优选地,所述载体是药用载体。就药物组合物而言,所述载体可以是常规使用的那些中的任一个并且仅受化学物理考量(诸如溶解性和缺乏与活性化合物的反应性)和受施用途径限制。本文中描述的药用载体,例如,载体(vehicles),佐剂,赋形剂,和稀释剂,是本领域技术人员公知的并且公众容易获得。优选所述药用载体是对于活性剂是化学惰性的药用载体和在使用条件下不具有有害副作用或毒性的药用载体。
载体的选择将部分由特定的发明的TCR物质,以及由用于施用本发明的TCR物质的特定方法确定。因此,存在多种本发明药物组合物的适当制剂。以下用于肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内和腹膜内施用的制剂是示例性的并不以任何方式限制。多于一种途径可以用于施用本发明的TCR物质,并且在某些情况下，特定途径可以比另一种途径提供更直接和更有效的应答。
适于肠胃外施用的制剂包括水性的和非水性的,等渗无菌注射液(所述注射液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述制剂与意在的接受者的血液等渗的溶质),和水性的和非水性无菌悬浮液(所述悬浮液可以包括悬浮剂、稳定剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。本发明的TCR物质可以以药学载体中的生理学可接受的稀释剂施用,诸如无菌液体或液体混合物，包括水,盐水,含水葡萄糖和相关糖溶液，醇诸如乙醇或十六醇,二醇诸如丙二醇或聚乙二醇,二甲基亚砜,甘油,羧酮诸如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇,醚,聚(乙二醇)400,油,脂肪酸,脂肪酸酯或甘油酯,或加或不加药用表面活性剂(诸如皂或去污剂)的乙酰化的脂肪酸甘油酯,悬浮剂,诸如果胶,卡波姆,甲基纤维素,羟丙基甲基纤维素,或羧甲基纤维素,或乳化剂和其它药学佐剂。
可以用于肠胃外制剂的油包括石油,动物、植物或合成的油。油的特定实例包括花生,大豆,芝麻,棉籽,玉米,橄榄,凡士林,和矿物油。用于肠胃外制剂的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。
用于肠胃外制剂的合适的皂包括脂肪碱金属,铵,和三乙醇胺盐,并且合适的去污剂包括(a)阳离子去污剂诸如,例如,二甲基二烷基卤化铵,和卤化烷基吡啶,(b)阴离子去污剂诸如,例如,烷基、芳基、和烯烃磺酸酯,烷基、烯烃、醚、和单酸甘油脂硫酸酯,和磺基琥珀酸酯,(c)非离子去污剂诸如,例如,脂肪胺氧化物,脂肪酸烷醇酰胺,和聚氧乙烯聚丙烯共聚物,(d)两性去污剂诸如,例如,烷基-β-氨基丙酸酯,和2-烷基-咪唑啉季铵盐,和(e)其混合物。
所述肠胃外制剂将典型地在溶液中含有以重量计约0.5％至约25％的本发明的TCR物质。可以使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或排除在注射位点的刺激作用,此种组合物可以含有一种以上具有从约12至约17的亲水亲油平衡(HLB)的非离子型表面活性剂。此种制剂中表面活性剂的量将典型地范围以重量计从约5％至约15％。合适表面活性剂包括聚乙二醇山梨聚糖脂肪酸酯,诸如山梨聚糖单油酸酯和通过环氧丙烷与丙二醇的缩合形成的环氧乙烷与疏水性基质的高分子量加成物。所述肠胃外制剂可以以单位剂量或多剂量密封的容器,诸如安瓿瓶或小瓶提供,并且可以储存在冷冻干燥的(冻干的)条件，在使用前仅需要直接加入用于注射的无菌液体赋形剂,例如水。可以从之前描述的类型的无菌粉末、颗粒、和片剂制备临时的注射溶液和悬浮液。
可注射制剂依照本发明。对用于可注射组合物的有效药学载体的需求是本领域普通技术人员公知的(参见,例如,Pharmaceutics and Pharmacy Practice,J.B.LippincottCompany,Philadelphia,PA,Banker和Chalmers,编辑,第238-250页(1982),和ASHPHandbook on Injectable Drugs,Toissel,第4版,第622-630页(1986))。优选地,当施用细胞,例如,树突细胞时,所述细胞通过注射施用。
本领域技术人员将理解,除了上文描述的药物组合物之外,本发明的TCR物质可以被配制为包涵复合体,诸如环糊精包涵复合体,或脂质体。
为了本发明,施用的本发明的TCR物质的量或剂量应该足以在受试者或动物内在合理的时间范围内实现,例如,治疗或预防应答。例如,本发明的TCR物质的剂量应该从施用时间开始约2小时或更长,例如,12至24或更多小时的时期内足以结合NY-ESO-1,或检测、治疗或预防癌症。在某些实施方案中,所述时期甚至可以更长。所述剂量将由特定的发明的TCR物质的效力和动物(例如人)的状况,以及要治疗的动物(例如人)的体重决定。
很多用于确定施用剂量的测定是本领域中已知的。为了本发明,包括在给一组各自给予不同剂量的所述T细胞的哺乳动物中的哺乳动物施用给定剂量的此种T细胞时,比较靶细胞被溶解或IFN-γ由表达本发明的TCR,多肽,或蛋白的T细胞分泌的程度的测定可以用于确定要施用于哺乳动物的起始剂量。在施用某剂量时靶细胞被溶解或IFN-γ分泌的程度可以通过本领域中已知的方法(包括例如本文中实施例3所描述的方法)测定。
本发明的TCR物质的剂量也将由可能伴随特定的发明的TCR物质的施用的任何不良副作用的存在、性质和程度确定。典型地,主治医师将考虑多种因素,诸如年龄、体重、一般健康状况、饮食、性别、要施用的发明的TCR物质、施用途径,以及治疗的疾病的严重度，从而决定用以治疗各个个体患者的本发明的TCR物质剂量。通过实例的方式但不意在限制本发明,本发明的TCR物质的剂量可以为约0.001至约1000mg/kg治疗的受试者的体重/天,从约0.01至约10mg/kg体重/天,约0.01mg至约1mg/kg体重/天。
本领域普通技术人员将容易理解，本发明的TCR物质可以以很多方式修饰,从而本发明的TCR物质治疗或预防效力通过所述修饰被增加。例如,本发明的TCR物质可以通过桥直接或间接缀合于靶向部分。将化合物(例如,发明的TCR物质)缀合于靶向部分的实践是本领域中已知的。参见,例如,Wadwa等人,J.Drug Targeting 3：111(1995)和美国专利5,087,616。本文中使用的术语“靶向部分”,指特异识别和结合细胞表面受体,从而所述靶向部分指导本发明的TCR物质递送至细胞群(受体在其表面表达)的任意分子或化学剂。靶向部分包括,但不限于,抗体,或其片段,肽,激素,生长因子,细胞因子,和任何其它天然或非天然配体,其结合细胞表面受体(例如,上皮生长因子受体(EGFR),T-细胞受体(TCR),B-细胞受体(BCR),CD28,血小板源性生长因子受体(PDGF),烟碱乙酰胆碱受体(nAChR),等)。本文中使用的术语“桥”,指将本发明的TCR物质桥接于靶向部分的任意化学剂或分子。本领域普通技术人员认可，如果桥和/或靶向部分在连接于本发明的TCR物质时,不干扰本发明的TCR物质的功能(即结合NY-ESO-1,或检测,治疗,或预防癌症的能力),本发明的TCR物质上对于本发明的TCR物质的功能不必需的位点,是用于连接桥和/或靶向部分的理想位点。
备选地,本发明的TCR物质可以被修饰为储存形式,从而本发明的TCR物质释放于其所施用的体内的方式随在体内的时间和位置而受控制(参见,例如,美国专利4,450,150)。发明的TCR物质的储存形式可以是,例如,包含本发明的TCR物质和多孔或无孔材料(诸如聚合物)的可植入组合物,其中本发明的TCR物质由所述材料和/或无孔材料的降解包裹或通过所述材料和/或无孔材料的降解扩散。随后将储存物植入体内所需位置并且本发明的TCR物质以预定速率从植入物释放。
考虑的是，本发明的药物组合物,TCR(包括其功能部分或变体),多肽,蛋白,核酸,重组表达载体,宿主细胞,或细胞群可以用于治疗或预防癌症的方法。不受限于特定理论或机制,相信本发明的TCR特异结合NY-ESO-1,从而TCR(或相关的发明的多肽或蛋白,或其功能部分或变体)当由细胞表达时，能够介导针对表达NY-ESO-1的细胞的免疫应答。在这点上,本发明提供治疗或预防哺乳动物中癌症的方法,所述方法包括以有效治疗或预防哺乳动物中癌症的量向哺乳动物施用本文中描述的任意TCR,多肽,或蛋白,包含编码本文中描述的任意TCR,多肽,蛋白的核苷酸序列的任意核酸或重组表达载体,或包含编码本文中描述的任意TCR,多肽,或蛋白的重组载体的任意宿主细胞或细胞群。
本文中使用的术语“治疗”和“预防”以及源于其的词,不必需表示100％或完全治疗或预防。而是，存在不同程度的治疗或预防，其中本领域技术人员认可为具有潜在的益处或疗效。在这方面,本发明的方法可以提供对哺乳动物中癌症任意量的任意水平的治疗或预防。此外,本发明的方法提供的治疗或预防可以包括治疗或预防正在治疗或预防的疾病例如癌症中的一种以上病状或症状。同样,为了本文中的目的,“预防”可以包括延迟疾病、或其症状或病状的发作。
还提供的是检测哺乳动物中癌症存在的方法。所述方法包括(i)包含癌细胞的样品与本文中描述的任意本发明的TCR,多肽,蛋白,核酸,重组表达载体,宿主细胞,细胞群,或抗体、或其抗原结合部分接触,从而形成复合体,并且检测所述复合体,其中复合体的检出表示哺乳动物存在癌症。
就本发明检测哺乳动物中癌症的方法而言,癌细胞样品可以是包含全细胞,其溶解产物,或全细胞溶解产物的级分,例如,核或胞质级分,全蛋白级分,或核酸级分的样品。
为了本发明的检测方法,就哺乳动物而言，接触可以在体外或在体内发生。优选地,所述接触是在体外的。
同样,复合体的检出可以通过很多本领域中已知的方式发生。例如,本文中描述的本发明的TCR,多肽,蛋白,核酸,重组表达载体,宿主细胞,细胞群,或抗体、或其抗原结合部分,可以标记以可检测标记诸如,例如,放射性同位素,荧光团(例如,异硫氰酸荧光素(FITC),藻红蛋白(PE)),酶(例如,碱性磷酸酶,辣根过氧化物酶),和元素颗粒(例如,金颗粒)。
为了本发明的方法(其中施用宿主细胞或细胞群),所述细胞可以是与哺乳动物同种异体的或自体同源的细胞。优选地,所述细胞是与哺乳动物自体同源的。
就本发明的方法而言,所述癌症可以是任意癌症,包括下述的任何一种：急性淋巴细胞癌,急性骨髓性白血病,腺泡状横纹肌肉瘤(alveolar rhabdomyosarcoma),骨癌,脑癌,乳腺癌,肛门、肛管、或肛门直肠部癌症,眼癌,肝内胆管癌,关节癌,颈部、胆囊、或胸膜癌症,鼻、鼻腔、或中耳癌症,口腔癌,外阴癌,慢性淋巴细胞白血病,慢性骨髓癌,结肠癌,食管癌,宫颈癌,胃肠道类癌瘤(gastrointestinal carcinoid tumor),霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma),下咽癌,肾癌,喉癌,肝癌,肺癌,恶性间皮瘤(malignantmesothelioma),黑素瘤,多发性骨髓瘤(multiple myeloma),鼻咽癌,非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma),卵巢癌,胰腺癌,腹膜、网膜和肠系膜癌,咽癌,前列腺癌,直肠癌,肾癌(例如,肾细胞癌(RCC)),小肠癌,软组织癌,胃癌,滑膜细胞肉瘤,睾丸癌,甲状腺癌,输尿管癌,和膀胱癌。优选地,所述癌症是黑素瘤,乳腺癌,肺癌,前列腺癌,甲状腺癌,卵巢癌,或滑膜细胞肉瘤。
本发明的方法中涉及的哺乳动物可以是任意哺乳动物。本文中使用的,术语“哺乳动物”指任意哺乳动物,包括,但不限于,啮齿目的哺乳动物诸如小鼠和仓鼠,和兔形目的哺乳动物诸如兔。优选所述哺乳动物来自食肉目,包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。更优选所述哺乳动物来自偶蹄目,包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)或奇蹄目,包括马科动物(马)。最优选所述哺乳动物为灵长目,新世界猴(Ceboids),或Simoids(猴)或类人目的(人和猿)。特别优选的哺乳动物是人。
实施例
以下实施例进一步说明本发明，但当然应该不被认为以任何方式限制其范围。
细胞系
黑素瘤系1300mel(NY-ESO-1+,HLA-A2+),624.38mel(NY-ESO-1+,HLA-A2+),A375mel(NY-ESO-1+,HLA-A2+),938mel(NY-ESO-1+,HLA-A2-),888mel(NY-ESO-1-,HLA-A2-),SK23mel(NY-ESO-1-,HLA-A2+),1359mel(NY-ESO-1+,HLA-A2-),1359-A2mel(NY-ESO-1+,HLA-A2+),624mel(NY-ESO-1+,HLA-A2+),和1390mel(NY-ESO-1+,HLA-A2+),从切除的肿瘤病变产生并培养于由补充以10％胎牛血清的RPMI 1640,2mmol/L L-谷氨酰胺,50单位/mL青霉素,和50μg/mL(Invitrogen)和25mmol/L HEPES(GIBCO,Invitrogen)组成的R10培养基。使用的其它细胞系包括：宫颈癌细胞系Caski(NY-ESO-1+,HLA-A2+),(ATCC CRL-1550)骨肉瘤细胞系Saos2(NY-ESO-1+,HLA-A2+),(ATCC HTB-85),和成神经细胞瘤细胞系SK NAS-A2(NY-ESO-1+,HLA-A2+),(ATCC CRL-2137),非小细胞肺癌细胞系H1299A2(NY-ESO-1+,HLA-A2+),乳腺癌细胞系MDA-MB-435S-A2(NY-ESO-1+,HLA-A2+),(HTB-129),其所有三种都转导有逆转录病毒构建体以表达HLA-A*0201(Navuaux等人,J.Virol.,70：5701-05(1996),Parkhurst等人,Clin.Cancer Res.,15：169-180(2009),Robbins等人,J.Immunol.,180：6116-31(2008),Wargo等人,Cancer Immunol.Immunother.,58：394(2009)),COS-A2-ESO(其用表达NY-ESO-1基因的逆转录病毒载体转导),和COS-A2-CEA(其用表达CEA基因的逆转录病毒载体转导)。
实施例1
该实施例说明鼠抗-NY-ESO-1 T细胞克隆的鉴定。
将HLA-A2转基因小鼠用100μl不完全弗氏佐剂(IFA)中的100μg的肽(NY-ESO-1157-165)和120μg的辅助肽(乙型肝炎病毒核心肽(HBVc)：128-140)在尾根部皮下(s.c.)免疫(在尾的两侧各50μg NY-ESO-1157-165肽),接着在一周后以相同的免疫加强。
第0天：第二次免疫后一周,收获脾细胞并且在体外以以下之一刺激：(i)用1μg/ml引发(priming)肽和10μg/ml人β2-微球蛋白(microgobulin)脉冲的LPS-活化的HLA-A2+脾细胞(3,000rads)(“LPS冲击(blast)”)或(ii)用1,0.1或0.01μg/ml肽脉冲的T2细胞(17,000rads)。
第7天：通过在与表1中列出的肿瘤细胞系之一共培养时的IFNγ分泌评价主体(bulk)培养物的特定反应性。结果显示于表1(1次主体(bulk)刺激后的IFN-γ(pg/ml)；“nt”＝未测试)。因为响应加载以HBV肽的T2细胞的细胞因子释放有时非常高,对于肿瘤靶标的下划线值表示以单独培养基和阴性肿瘤获得的背景值的两倍,并且对于肽的下划线值表示以T2和HBV肽获得的背景值的两倍。
表1
第11天：将肽/肿瘤反应性主体培养物在以下条件下以10个细胞/孔克隆(10块板/条件)：(i)用1,0.1,或0.01μg/ml肽脉冲的照射的T2细胞(18,000rads)：5x104细胞/孔；(ii)照射的C57BL/6脾细胞饲养细胞(3,000rads)：5x104细胞/孔；和(iii)10CU/ml IL-2。
第25-30天：选择生长阳性的细胞并在以下条件下在48-孔板中再刺激：(i)用1,0.1,或0.01μg/ml肽脉冲的照射的T2细胞(18,000rads)：2x105细胞/孔；(ii)照射的C57BL/6脾细胞饲养细胞(3,000rads)：1x106细胞/孔；和(iii)10CU/ml IL-2。
第37-44天：通过在与表2中列出的肿瘤细胞系共培养时的IFNγ分泌评价克隆的特异反应性。在测定前，将肿瘤细胞用IFNγ(20ng/ml)和肿瘤坏死因子α(3ng/ml)处理过夜。
以用1μg/ml引发肽和10μg/ml人β2-微球蛋白在第0天脉冲的LPS-活化的HLA-A2+脾细胞(3,000rads)刺激的脾细胞在960个孔中产生8个生长阳性孔。对于两个最具反应性的克隆的数据显示于表2(1个主体刺激后；IFN-γ(pg/ml))。
表2
第46-49天：在以下条件下将研究的克隆在24-孔板中再刺激：(i)用1,0.1,或0.01μg/ml肽脉冲的照射的T2细胞(18,000rads)：5x105细胞/孔；(ii)照射的C57BL/6脾细胞feeders(3,000rads)：1x106细胞/孔；和(iii)10CU/ml IL-2。将再刺激的克隆快速冷冻用于RNA制备。
实施例2
该实施例说明鼠抗-NY-ESO-1 T细胞克隆的鉴定。
将HLA-A2转基因小鼠免疫并收获脾细胞,刺激,并评价实施例1中描述的特异反应性。
第11天：在以下条件下将主体培养物在24-孔板中再刺激：(i)用1,0.1,或0.01μg/ml肽脉冲的照射的T2细胞(18,000rads)：4x105细胞/孔；(ii)照射的C57BL/6脾细胞饲养细胞(3,000rads)：1x106细胞/孔；和(iii)10CU/ml IL-2。
第19天：通过在与表3中列出的肿瘤细胞系共培养时的IFN-γ分泌评价主体培养物(两次刺激后)的特异反应性。在测定前，用IFNγ(20ng/ml)和肿瘤坏死因子α(3ng/ml)将肿瘤细胞处理过夜。结果显示于表3中(IFN-γ(pg/ml))。
表3
第21天：在以下条件下将主体培养物在24-孔板中再刺激：(i)用1,0.1,或0.01μg/ml肽脉冲的照射的T2细胞(18,000rads)：5x105细胞/孔；(ii)照射的C57BL/6脾细胞饲养细胞(3,000rads)：1x106细胞/孔；和(iii)10CU/ml IL-2。
第30天：通过在与列于表4的肿瘤细胞系共培养时的IFN-γ分泌评价主体培养物(三次刺激后)的特异反应性。在测定前，将肿瘤细胞用IFNγ(20ng/ml)和肿瘤坏死因子α(3ng/ml)处理过夜。结果显示于表4(IFN-γ(pg/ml)；*表示三次主体刺激后克隆的主体培养物)。
表4
第33天：如对于实施例1的第11天所描述的，将选择的肽/肿瘤反应性主体培养物(三次刺激后)以10细胞/孔克隆。
第45-48天：通过在与表5中列出的肿瘤细胞系共培养时的IFN-γ分泌筛选生长阳性孔的肽反应性。在测定前，将肿瘤细胞用IFNγ(20ng/ml)和肿瘤坏死因子α(3ng/ml)处理过夜。
以用1μg/ml引发肽和10μg/ml人β2-微球蛋白在第0天脉冲的LPS-活化的HLA-A2+脾细胞(3,000rads)刺激的脾细胞在960个孔中产生33个生长阳性孔。对于四个最具反应性的克隆(编号2,5,6,和8)的数据显示于表5(3次主体刺激后；IFN-γ(pg/ml))。以用1μg/ml肽脉冲的T2细胞(17,000rads)刺激的脾细胞在960个孔中产生104个生长阳性孔。对于四个最具反应性的克隆(编号1,50,51,和63)的数据显示于表5。
第46-49天：如对于该实施例的第21天所描述的，将肽反应性克隆在24-孔板中再刺激。将再刺激的克隆快速冷冻用于RNA制备。
实施例3
该实施例说明鼠抗-NY-ESO-1 TCR的分离和分离的TCR针对NY-ESO-1的特异反应性。
分离来自五个克隆(即,克隆B,H,5,6,1,50,和63)的TCR。将编码各个克隆的TCR的核苷酸序列(RNA)分离,测序,并转染入来自患者1和2的人外周血单核细胞(PBMC)。将转染的细胞用OKT3和IL-2刺激并单独培养(培养基)或与用对照(HBV)肽脉冲的T2细胞,用NY-ESO-1157-165肽脉冲的T2细胞,COA-A2-CEA(NY-ESO-1-),COS-A2-ESO(NY-ESO-1+),或不同黑素瘤肿瘤细胞系888mel(NY-ESO-1-),Sk23mel(NY-ESO-1-),A375mel(NY-ESO-1+),1363mel(NY-ESO-1+),1390(NY-ESO-1+),或624(NY-ESO-1+)之一共培养。测量IFNγ分泌。结果显示于表6(IFNγ(pg/ml))。
表6
1TRAV7D-4/TRBV19：克隆ESO(1次刺激LPS)B(上文表2)
2TRAV13D-2/TRBV14：克隆ESO(1次刺激LPS)H(上文表2)
3TRAV7D-3/TRBV14：克隆ESO(3次刺激LPS)5(上文表5)
4TRAV6D/TRBV26：克隆ESO(3次刺激LPS)6；ESO(3次刺激T2)1；ESO(3次刺激T2)63(上文表5)
5TRAV7D-3/TRBV26：克隆ESO(3次刺激T2)50(上文表5)
如表6中显示的,TRAV6D/TRBV26(SEQ ID NOs：11和12)TCR提供最高特异性的抗-NY-ESO-1反应性并且被选择用于进一步研究。
编码TRAV6D/TRBV26(SEQ ID NOs：11和12)TCR的核苷酸序列(RNA)转染入来自患者3和4的人PBMC。将转染的细胞阳性选择CD8+和CD4+细胞,用OKT3和IL-2刺激,并单独培养(培养基)或与用对照(HBV)肽脉冲的T2细胞,用不同浓度的NY-ESO-1157-165肽脉冲的T2细胞,COS-A2-ESO(NY-ESO-1+),COA-A2-CEA(NY-ESO-1-),或不同黑素瘤肿瘤细胞系888mel(NY-ESO-1-),Sk23mel(NY-ESO-1-),A375mel(NY-ESO-1+),1363mel(NY-ESO-1+),或624(NY-ESO-1+)之一共培养。测量IFNγ分泌并且结果显示于表7(IFNγ(pg/ml))。
如表7中所示,用TRAV6D/TRBV26(SEQ ID NOs：11和12)TCR转染的细胞特异识别NY-ESO-1+黑素瘤肿瘤细胞,如通过IFNγ分泌测量的。
实施例4
该实施例说明用鼠抗-NY-ESO-1 TCR转染的人CD8+和CD4+T细胞在与用NY-ESO-1肽脉冲的树突细胞共培养时的反应性。
将CD8+(图1A)或CD4+(图1B)人T细胞用鼠抗-NY-ESO-1 TCR(TRAV6D/TRBV26(SEQID NOs：11和12))或人抗-NY-ESO-1 TCR转染。将转染的细胞与用不同浓度的NY-ESO-1157-165肽脉冲的树突细胞共培养,并测量IFNγ分泌。
如图1A和1B中所示,用鼠抗-NY-ESO-1 TCR(TRAV6D/TRBV26(SEQ ID NOs：11和12))转染的CD8+和CD4+人T细胞对用NY-ESO-1157-165肽脉冲的树突细胞有反应,如通过IFNγ分泌测量的。与用人抗-NY-ESO-1 TCR转染的CD8+细胞相比，用鼠抗-NY-ESO-1 TCR(TRAV6D/TRBV26(SEQ ID NOs：11和12))转染的CD8+人T细胞对用NY-ESO-1157-165肽脉冲的树突细胞更具反应性,如通过IFNγ分泌测量的。
实施例5
本实施例说明用鼠抗-NY-ESO-1 TCR转染的人CD8+和CD4+T细胞在与黑素瘤肿瘤细胞共培养时的反应性。
将CD8+(图2A)或CD4+(图2B)人T细胞用鼠抗-NY-ESO-1 TCR(TRAV6D/TRBV26(SEQID NOs：11和12))或人抗-NY-ESO-1 TCR转染。将转染的细胞单独培养(培养基)或与用对照肽脉冲的T2细胞,用NY-ESO-1157-165肽脉冲的T2细胞,COA-A2-CEA(NY-ESO-1-),COS-A2-ESO(NY-ESO-1+),或不同黑素瘤肿瘤细胞系888mel(NY-ESO-1-),Sk23mel(NY-ESO-1-),A375mel(NY-ESO-1+),或1363mel(NY-ESO-1+)之一共培养。测量IFNγ分泌。
如图2A和2B中所示,用鼠抗-NY-ESO-1 TCR(TRAV6D/TRBV26(SEQ ID NOs：11和12))转染的CD8+和CD4+人T细胞特异识别NY-ESO-1+黑素瘤肿瘤细胞,如通过IFNγ分泌测量的。与用人抗-NY-ESO-1 TCR转染的CD8+和CD4+细胞相比，用鼠抗-NY-ESO-1 TCR(TRAV6D/TRBV26(SEQ ID NOs：11和12))转染的CD8+和CD4+人T细胞对NY-ESO-1+肿瘤细胞系更具反应性,如通过IFNγ分泌测量的。
实施例6
该实施例说明用编码鼠抗-NY-ESO-1 TCR的野生型或密码子优化的核苷酸序列转染的人CD8+和CD4+T细胞在与黑素瘤肿瘤细胞共培养时的反应性。
将编码鼠抗-NY-ESO-1 TCR(TRAV6D/TRBV26)的野生型(SEQ ID NOs：19和20)或密码子优化的(SEQ ID NOs：15和16)核苷酸序列(RNA)转染入来自患者5和6的CD8+或CD4+人PBMC。将转染的细胞阳性选择CD8+和CD4+细胞,用OKT3和IL-2刺激,并单独培养(培养基)或用对照(HBVc)肽脉冲的T2细胞,用不同浓度的NY-ESO-1157-165肽脉冲的T2细胞,COA-A2-CEA(NY-ESO-1-),COS-A2-ESO(NY-ESO-1+),或不同黑素瘤肿瘤细胞系888mel(NY-ESO-1-),Sk23mel(NY-ESO-1-),A375mel(NY-ESO-1+),1363mel(NY-ESO-1+),A375(NY-ESO-1+),或624mel(NY-ESO-1+)之一共培养。测量IFNγ分泌。结果显示于表8(IFNγ(pg/ml))。
如表8中,用编码鼠抗-NY-ESO-1 TCR(TRAV6D/TRBV26)的野生型或密码子优化的核苷酸序列转染的CD8+和CD4+人T细胞特异识别NY-ESO-1+黑素瘤肿瘤细胞,如通过IFNγ分泌测量的。
实施例7
该实施例说明用编码鼠抗-NY-ESO-1 TCR的野生型核苷酸序列转染的人CD8+T细胞在与黑素瘤和非黑素瘤肿瘤细胞共培养时的反应性。
将编码鼠抗-NY-ESO-1 TCR(TRAV6D/TRBV26)的核苷酸序列(RNA)(SEQ ID NO：19和20)电穿孔入来自患者7和8的CD8+人T细胞。将未转染的细胞(模拟)或转染的细胞阳性选择CD8+T细胞,用OKT3和IL-2刺激,并单独培养(培养基)或与用对照(HBVc)肽脉冲的T2细胞；用不同浓度的NY-ESO-1157-165肽脉冲的T2细胞；COA-A2-CEA(NY-ESO-1-)；COS-A2-ESO(NY-ESO-1+)；不同黑素瘤肿瘤细胞系888mel(NY-ESO-1-),Sk23mel(NY-ESO-1-),A375mel(NY-ESO-1+),1363mel(NY-ESO-1+),A375(NY-ESO-1+)之一；骨源性肉瘤(osteogenicsarcoma)细胞系Saos2(NY-ESO-1+)；神经胶质瘤细胞系LN-18(NY-ESO-1+)；尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)细胞系TC-71(NY-ESO-1+)；成神经细胞瘤细胞系SKN AS(NY-ESO-1+)或SKN AS-A2(NY-ESO-1+)；或乳腺癌细胞系MDA 453S(NY-ESO-1+)或MDA 453S-A2(NY-ESO-1+)共培养。测量IFNγ分泌。结果显示于表9(IFNγ(pg/ml))。
表9
如表9中所示,用编码鼠抗-NY-ESO-1 TCR(TRAV6D/TRBV26)的核苷酸序列转染的CD8+人T细胞特异识别NY-ESO-1+黑素瘤,骨原性肉瘤,尤因肉瘤,成神经细胞瘤,和乳腺癌肿瘤细胞,如通过IFNγ分泌测量的。
实施例8
该实施例说明编码鼠抗-NY-ESO-1 TCR的重组表达载体的制备。
将包含编码野生型人抗-NY-ESO-1 TCR(1G4)(1G4 TCR在CDR3α链内具有双重置换(其中在位置95(1G4-LY)亮氨酸和酪氨酸被置换为苏氨酸)(Robbins等人,J.Clin.Oncol.,29：917-924(2011)；Robbins等人,J.Immunol.,180：6116–6131(2008))),或鼠抗-NY-ESO-1TCR(TRAV6D/TRBV26)(SEQ ID NOs：11和12)的DNA的逆转录病毒载体克隆在MSGVI逆转录病毒骨架中并转化入TOP10细胞。小RNA病毒2A肽(SEQ ID NO：13)连接α和β链。制备了两个编码鼠TRAV6D/TRBV26TCR的载体：一个含有为编码位于编码β链(mESOαβ)(SEQ ID NO：17)的核苷酸序列5’侧的α链的核苷酸序列,并且一个含有编码位于编码α链(mESOβα)(SEQ IDNO：18)的核苷酸序列5’侧的β链的核苷酸序列。通过Nco I和Not I限制性酶消化确认编码所述TCR的α和β链的插入物的存在。通过微量制备(maxiprep)从人和鼠TCR中每个的一个克隆产生DNA。
将来自1G4 TCR和1G4-LY载体的DNA转染入293GP细胞以收集上清并在随后的转导实验中将PBL转入。编码GFP的载体用作对照。
实施例9
该实施例说明鼠抗-NY-ESO-1 TCR的转导效率。
将外周血淋巴细胞(PBL)在第0天用OKT3刺激(S1)。在第3和4天将PBL用实施例8中的1G4,1G4-LY,mESOαβ,或mESOβαTCR载体转导。在第7-11天,通过荧光-激活细胞分选(FACS)评价转导效率。识别鼠TCR(VB13.1)可变区的抗体和识别鼠TCR(mB)恒定区的抗体用于FACS。在第一次刺激后7-11天(S1D7-S1D11)进行FACS。结果总结于下表10中。
表10
如表10中所示,将用mESOαβ或mESOβαTCR载体转导的PBL以与编码1G4和1G4-LYTCR的载体相比类似的效率转导。
实施例10
该实施例说明用编码鼠抗-NY-ESO-1 TCR的载体转导的细胞的反应性。
刺激来自五个供体的PBL，其未被转导或用编码GFP或实施例9中描述的1G4-LY,mESOαβ,或mESOβαTCR的载体转导。将转导的PBL与下表11A或11B中列出的不同肿瘤细胞系之一或与用SSX肽、无肽(T2),或下表12列出的不同浓度的NY-ESO-1157-165肽之一脉冲的T2细胞共培养。通过来自共培养的24小时上清的酶联免疫吸附测定(ELISA)测量IFNγ分泌。在第一次刺激后6,7,或10天(S1D6,S1D7,和S1D10)进行ELISA。结果显示于表11A,11B,和12(IFNγpg/ml)。转导(Td)效率基于Vβ13.1+mβ+细胞的FACS分析。
用mESOαβ或mESOβαTCR载体转导的细胞特异识别NY-ESO-1+/HLA-A*0201+靶肿瘤细胞系，但不识别HLA-A*0201-/NY-ESO-1+或HLA-A*0201+/NY-ESO-1-细胞系，如通过IFNγ分泌测量的(表11A和11B)。用mESOαβ或mESOβαTCR载体转导的细胞特异识别用NY-ESO-1肽脉冲的T2细胞，如通过IFNγ分泌测量的(表12)。NY-ESO-1特异识别在来自五个不同供体的细胞间一致。用鼠抗-NY-ESO-1 TCR转导的细胞的功能性与用人抗-NY-ESO-1 TCR转导的细胞的功能性相当。与用mESOαβTCR载体转导的细胞相比，用mESOβαTCR载体转导的细胞的功能性稍高。用mESOαβ或mESOβαTCR载体之一转导的PBL识别只要1ng/mL脉冲的T2细胞,表明两种mTCR都是相对高亲合力受体。表达mESOαβ或mESOβαTCR载体的PBL与未用任何肽脉冲的对照T2细胞共培养产生背景水平的IFN-γ。当与用mESOαβTCR转导的细胞比较时，对于相同水平的肽，用mESOβαTCR转导的患者1的细胞具有更高水平的IFN-γ分泌。当与用mESOαβTCR转导的细胞相比时，对于肽浓度为1μg/ml,100ng/ml,和0.1ng/ml的相同水平的肽，用mESOβαTCR转导的患者2的细胞具有更高水平的IFN-γ分泌。
实施例11
该实施例说明，编码鼠抗-NY-ESO-1 TCR的载体转导的细胞在扩大细胞数量之后维持鼠抗-NY-ESO-1 TCR的表达。
刺激来自两个供体的PBL，其未被转导或用编码GFP或实施例9中描述的1G4,1G4-LY,mESOαβ,或mESOβαTCR的载体转导。如在Riddell等人,Science,257：238–241(1992)和Dudley等人,Cancer J.Sci.Am.,6：69–77(2000)中描述的扩大PBL数量。通常,使用可溶OKT3,照射的饲养细胞,和高剂量IL-2扩大PBL的数量高达3logs。通过FACS测量通过扩大数量(扩大一次)的细胞的鼠抗-NY-ESO-1 TCR表达两次(在第10和20天)。结果总结于表13(％VB13.1,扩大之后的mB+细胞)。
表13
如表13所示,用mESOαβ或mESOβαTCR载体转导的PBL在扩大细胞数量之后维持鼠抗-NY-ESO-1 TCR的表达。
实施例12
该实施例说明，用编码鼠抗-NY-ESO-1 TCR的载体转导的细胞在扩大转导的细胞的数量之后维持功能性。
刺激来自两个供体的PBL，其未被转导或用编码GFP或实施例9中描述的1G4-LY,mESOαβ,或mESOβαTCR的载体转导。如实施例11中描述的扩大转导的细胞数量。将转导的扩大的PBL单独培养(培养基)或与下表14中列出的不同肿瘤细胞系之一或用SSX肽、无肽(T2)、或列于下表15的不同浓度的NY-ESO-1157-165肽之一脉冲的T2细胞共培养。在第二次刺激后九天(S2D9)通过ELISA测量IFNγ分泌。结果显示于表14和15(IFNγpg/ml；稀释度1：10)。
还通过铬释放测定评价扩张的转导的细胞的功能性。将扩张的转导的细胞(效应细胞)与靶黑素瘤细胞624.38细胞(表16A)或A375细胞(表16B)以不同的效应器：靶(E：T)细胞比共培养,并测量溶解的靶细胞的百分比。结果显示于表16A和16B(溶解的靶细胞的百分比)。
表16A
表16B
如在表14,15,16A,和16B中显示的,用编码鼠抗-NY-ESO-1 TCR的载体转导的细胞在扩大转导的细胞量之后维持功能性。
实施例13
该实施例说明生产用于生产用于可能的临床应用的mESOβαTCR的包装(packaging)细胞克隆的方法。
mESOβαTCR载体的DNA用于在可能的临床应用所需的条件下生产逆转录病毒载体包装细胞克隆。使用来自六个PG13生产细胞克隆的上清转导PBL。使用抗-小鼠TCR-β链抗体对转导的PBL的FACS分析揭示，各个克隆产生介导阳性TCR转导的病毒(表17)。为了评估肿瘤细胞的特异识别,将来自各个PG13生产细胞克隆的mTCR改造的PBL与一组源自HLA-A*0201+和HLA-A*0201-黑素瘤和肺肿瘤的细胞系共培养(表17)。通过ELISA测量IFN-γ。六个mTCR PG13生产克隆的比较表明，用克隆C1转导的T细胞应答HLA-A*0201+/NY-ESO-1+肿瘤细胞靶H1299-A2释放高水平的IFN-γ并且说明最高的转导效率(表17)。这些应答是特异的，因为由各个克隆应答NY-ESO-1+/HLA-A*0201-细胞系和NY-ESO-1-/HLA-A*0201+细胞系释放IFN-γ背景水平(图2)。基于该分析,选择克隆C1用于产生主细胞库(master cell bank)，用于之后良好制造规范(GMP)逆转录病毒上清的生产。
表17
实施例14
该实施例说明使用来自实施例13的包装细胞克隆的逆转录病毒上清转导以mESOβαTCR的细胞的转导效率。
为了比较各自的NY-ESO-1 TCR(鼠、或mTCR,相对人、或hTCR(1G4-LY TCR)),在一次OKT3刺激之后和接着使用快速扩大方案(REP)的第二次大规模扩大，使用抗-小鼠TCR-Vβ链和抗-Vβ13.1抗体进行用来自包装细胞克隆的逆转录病毒上清转导的PBL的FACS分析(表18)。结果说明，在刺激之后，mTCR和hTCR二者都具有相当的转导百分比,mTCR在REP之后就有相等或更高水平的转导(表18)。
表18
实施例15
该实施例说明使用来自实施例13的包装细胞克隆的逆转录病毒上清转导以mESOβαTCR的细胞的反应性。
通过将mTCR和hTCR转导的T细胞进行与NY-ESO-1肽-脉冲的T2细胞共培养评价各个TCR的识别。在一次OKT3刺激之后和REP之后，mTCR和hTCR在遇到抗原肽时，二者都以剂量依赖的方式特异分泌IFN-γ(表19)。一次刺激之后,mTCR和hTCR识别用低至0.1ng/mL脉冲的T2细胞，表明mTCR二者都是相对高亲合力受体。在扩大细胞数量之后,与hTCR载体转导的T细胞相比，在各个肽浓度，mTCR释放更高水平的IFN-γ(表19)。表达NY-ESO-1mTCR或NY-ESO-1hTCR的PBL与不用任何肽脉冲的对照T2细胞共培养产生背景水平的IFN-γ。
表19
为了评价肿瘤细胞的特异识别,将mTCR改造的PBL与一组源自HLA-A*0201+和HLA-A*0201-黑素瘤和肺肿瘤的细胞系共培养。当mTCR改造的PBL和hTCR与HLA-A*0201+/NY-ESO-1+细胞系而不与HLA-A*0201-/NY-ESO-1+或HLA-A*0201+/NY-ESO-1-细胞系共培养时，观察IFN-γ的特异释放(表20(显示代表性实验))。
实施例16
该实施例说明使用来自实施例13的包装细胞克隆的逆转录病毒上清，转导以mESOβαTCR的细胞的黑素瘤细胞的特异溶解。
还比较通过mTCR和hTCR的黑素瘤细胞系特异溶解。使用CYTOTOX-GLO生物发光测定(Promega,Madison,WI)测量转导的PBL溶解HLA-A*0201+/NY-ESO-1+肿瘤细胞的能力。该测定使用发光(luminogenic)肽底物,AAF-GLO底物,以测量死细胞蛋白酶活性,所述死细胞蛋白酶从已经失去膜完整性的细胞释放,导致产生“灰光型(glow-type)”发光信号，所述信号与样品中死细胞数量呈比例。所述AAF-GLO底物不能穿过活细胞的完整膜并且不从活细胞群体产生任何可感知的信号。在这些测定中,将TCR改造的PBL与增加比例的靶细胞(E：T)在96-孔U-底板中的AIM-V培养基中在37℃共孵育4小时(hr.)。通过培养基中的生物发光释放测量细胞溶解：特定细胞溶解百分比＝[特定释放–(自发效应器释放+自发靶释放)]/总靶释放–自发靶释放x 100％,一式四份样品的平均。作为阴性对照，测量到很少的或测量不到细胞溶解。
如表21中所示,mTCR和hTCR转导的PBL二者都说明针对黑素瘤NY-ESO-1+/HLA-A*0201+肿瘤细胞系624.38mel类似的溶解活性。对HLA-A*0201-细胞系938mel有很少或无细胞溶解,并且GFP转导的PBL针对任意靶细胞不显示反应性(表21)。
表21
实施例17
该实施例说明使用来自实施例13的包装细胞克隆的逆转录病毒上清用mESOβαTCR或人TCR转导的细胞的抗-肿瘤活性。
还研究用mTCR和hTCR转导的CD4+T淋巴细胞的抗-肿瘤活性。用CD4+磁珠富集NY-ESO-1 hTCR和NY-ESO-1 mTCR转导的PBL,随后与一组源自HLA-A*0201+和HLA-A*0201-黑素瘤和肺肿瘤的细胞系共培养16小时。当与HLA-A*0201+/NY-ESO-1+细胞系而不与HLA-A*0201-/NY-ESO-1+细胞系共培养时，用mTCR和hTCR二者转导的CD4+T淋巴细胞具有IFN-γ的特定释放(表22)。
表22
实施例18
该实施例说明通过使用来自实施例13的包装细胞克隆的逆转录病毒上清转导以mESOβαTCR的细胞的不同肿瘤组织学的特异识别。
为了评价不同肿瘤组织学的特异识别,将NY-ESO-1 mTCR转导的PBL与源自黑素瘤(A375),非小细胞肺癌(H1299-A2),成神经细胞瘤(SKN AS-A2),乳腺癌(MDA-435S-A2),和骨肉瘤(Saos2)的不同HLA-A*0201+/NY-ESO-1+细胞系共培养。观察IFN-γ的特异释放(表23)。
表23
实施例19
该实施例说明由用mESOβαTCR转导的PBL对DAC-处理的肿瘤细胞的识别.
增加浓度的DNA-去甲基化剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(地西他滨(decitabine)；DAC)诱导肺癌细胞中不同癌症睾丸抗原的表达(Rao等人,Ther.Tar.and Chem.Bio.,71：4192-4204(2011))。不受限于特定理论或机制,人们相信DAC可以潜在上调癌症细胞中NY-ESO-1表达,其可以增强TCR识别NY-ESO-1的能力。
将NY-ESO-1mTCR转导的或未转导的PBL与不同组织学的肿瘤靶细胞系共培养16小时(显示于表24A-24B)，所述不同组织学的肿瘤靶细胞系已经被暴露于在表24A-24B显示的浓度的DAC达72小时。测量干扰素-γ水平。结果显示于表24A-24B。
表24A
表24B
如表24A和24B中所示,与未处理的靶细胞相比，用mESOβαTCR转导的PBL表现出分别针对DAC-处理的靶前列腺癌和结直肠癌的更高的反应性。
实施例20
该实施例说明由用mESOβαTCR或人TCR转导的PBL对用丙氨酸-置换的NY-ESO-1肽脉冲的T2细胞的识别。
将未转导的人PBL或转导有mTCR(来自克隆C1的mESOβα),hTCR(1G4-LY TCR),或绿色荧光蛋白(GFP)的人PBL与未处理T2细胞或之前用在表25A和25B中显示的不同浓度的肽脉冲的T2细胞共培养16小时。测量干扰素γ。结果显示于表25A和25B。如表25A和25B中所示,mTCR识别SEQ ID NO：24而hTCR不识别。此外,hTCR识别SEQ ID NO：27而mTCR不识别。
表25A(供体K)
表25B(供体L)
本文中引用的所有参考文献(包括出版物,专利申请,和专利)在此像各个参考文献单独和具体被表明通过引用并入并且在本文中以其整体陈述那样的程度通过引用并入。
在描述发明的范围内(尤其在以下权利要求的范围内)使用术语“一个(a)”和“一个(an)”和“那个(the)”以及类似指示物要被理解为覆盖单数和复数,除非本文中另有说明或明显与上下文矛盾。术语“包含,”“具有,”“包括,”和“含有”要被理解为开放式术语(即,意为“包括,但不限于”),除非另有说明。本文中数值范围的陈述仅意在用作独立地指落在所述范围内的各个分开的值的简写方法,除非本文中另有说明,并且各个分开的值像其在本文中分别被陈述被并入说明书。所有本文中描述的方法可以以任意合适的顺序进行，除非本文中另有说明或明显与上下文矛盾。本文中提供的任意和所有实施例,或示例性的语言(例如,“诸如”)的使用,仅意在更好阐明本发明并且不构成对本发明范围的限制，除非另有申明。说明书中没有语言应该被理解为表明任何对本发明的实践基本的未要求的要素。
本发明的优选的实施方案是本文中描述的,包括对于发明人而言进行本发明的最佳方式。在阅读之前的描述时，那些优选的实施方案的改变对于本领域普通技术人员而言可以是显而易见的。本发明人期望熟练技术人员酌情使用此种改变,并且本发明人希望本发明在除本文中具体描述的之外被实践。因此,本发明包括被适用的法律所允许的附于此的权利要求中所陈述的主题的所有修饰和对等物。此外,本发明包括上文描述的要素以其所有可能的改变的任意组合，除非本文中另有说明或另外明显与上下文矛盾。

Claims (20)

1.一种分离的或纯化的核酸，所述核酸包含编码T-细胞受体(TCR)的核苷酸序列，其中所述TCR具有对NY-ESO-1(SEQ ID NO：1)的抗原特异性并且包含鼠可变区。
2.根据权利要求1所述的分离的或纯化的核酸，其中所述TCR具有对NY-ESO-1157-165(SEQID NO：2)的抗原特异性。
3.根据权利要求1所述的分离的或纯化的核酸，其中所述TCR包含SEQ ID NOs：9和10的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的分离的或纯化的核酸，其中所述TCR包含SEQ ID NOs：11和12的氨基酸序列。
5.一种分离的或纯化的核酸，所述核酸包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含SEQ ID NOs：3-8的氨基酸序列。
6.权利要求5所述的分离的或纯化的核酸，其中所述多肽包含SEQ ID NO：9或10，或SEQID NOs：9和10二者的氨基酸序列。
7.权利要求5所述的分离的或纯化的核酸，其中所述多肽包含SEQ ID NO：11或12，或SEQ ID NOs：11和12二者的氨基酸序列。
8.一种分离的或纯化的核酸，所述核酸包含编码蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白包含含有氨基酸序列SEQ ID NOs：3-5的第一多肽链和含有氨基酸序列SEQ ID NOs：6-8的第二多肽链。
9.根据权利要求8所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述蛋白包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：9的第一多肽链和含有氨基酸序列SEQ ID NO：10的第二多肽链。
10.根据权利要求8所述的分离的或纯化的核酸序列，其中所述蛋白包含含有氨基酸序列SEQ ID NO：11的第一多肽链和含有氨基酸序列SEQ ID NO：12的第二多肽链。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的分离的或纯化的核酸，其中所述核苷酸序列是密码子优化的。
12.一种重组表达载体，所述重组表达载体包含根据权利要求1-11中任一项所述的核酸。
13.根据权利要求12所述的重组表达载体，其中所述核苷酸序列包含编码互补决定区(CDR)1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β和CDR3β的核苷酸序列，并且编码CDR1α、CDR2α和CDR3α的核苷酸序列在编码CDR1β、CDR2β和CDR3β的核苷酸序列的5’侧。
14.根据权利要求12所述的重组表达载体，其中所述核苷酸序列包含编码CDR 1α、CDR2α、CDR3α、CDR1β、CDR2β和CDR3β的核苷酸序列，并且编码CDR1α、CDR2α和CDR3α的核苷酸序列在编码CDR1β、CDR2β和CDR3β的核苷酸序列的3’侧。
15.一种分离的宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求12-14中任一项所述的重组表达载体。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其中所述细胞是人的。
17.一种细胞群，所述细胞群包含至少一种权利要求15或16所述的宿主细胞。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含(a)根据权利要求1-11中任一项所述的核酸、根据权利要求12-14中任一项所述的重组表达载体、权利要求15或16所述的宿主细胞或权利要求17所述的细胞群，和(b)药用载体。
19.根据权利要求1-11中任一项所述的核酸、根据权利要求12-14中任一项所述的重组表达载体、权利要求15或16所述的宿主细胞、权利要求17所述的细胞群或权利要求18所述的药物组合物在制造用于检测、治疗或预防哺乳动物癌症的药物中的用途。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述癌症是黑素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、卵巢癌或滑膜细胞肉瘤。
CN201711136635.4A 2012-05-22 2013-05-22 鼠抗-ny-eso-1 t细胞受体 Active CN107881183B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261650020P 2012-05-22 2012-05-22
US61/650,020 2012-05-22
CN201380038884.3A CN104507963B (zh) 2012-05-22 2013-05-22 鼠抗‑ny‑eso‑1 t细胞受体

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380038884.3A Division CN104507963B (zh) 2012-05-22 2013-05-22 鼠抗‑ny‑eso‑1 t细胞受体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107881183A true CN107881183A (zh) 2018-04-06
CN107881183B CN107881183B (zh) 2021-04-02

Family

ID=48539439

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380038884.3A Active CN104507963B (zh) 2012-05-22 2013-05-22 鼠抗‑ny‑eso‑1 t细胞受体
CN201711136635.4A Active CN107881183B (zh) 2012-05-22 2013-05-22 鼠抗-ny-eso-1 t细胞受体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380038884.3A Active CN104507963B (zh) 2012-05-22 2013-05-22 鼠抗‑ny‑eso‑1 t细胞受体

Country Status (11)

Country Link
US (3) US9487573B2 (zh)
EP (3) EP2852613B1 (zh)
JP (2) JP6378172B2 (zh)
CN (2) CN104507963B (zh)
AU (1) AU2013266421B2 (zh)
CA (1) CA2874486C (zh)
ES (2) ES2835200T3 (zh)
HK (1) HK1251874A1 (zh)
IL (1) IL235720A0 (zh)
PT (2) PT3527584T (zh)
WO (1) WO2013177247A1 (zh)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3099708B1 (en) 2014-01-29 2019-09-04 University Health Network Methods and compositions for producing a cell expressing a t cell receptor
EA201790953A1 (ru) 2014-10-31 2017-10-31 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Изменение экспрессии гена в cart-клетках и их применения
EP3067366A1 (en) * 2015-03-13 2016-09-14 Max-Delbrück-Centrum Für Molekulare Medizin Combined T cell receptor gene therapy of cancer against MHC I and MHC II-restricted epitopes of the tumor antigen NY-ESO-1
US20190382504A1 (en) * 2015-06-24 2019-12-19 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting ny-eso-1 peptide/mhc complexes and uses thereof
EP3328399B1 (en) 2015-07-31 2023-12-27 Regents of the University of Minnesota Modified cells and methods of therapy
WO2017070042A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing t cell populations using akt inhibitors
WO2017076308A1 (zh) * 2015-11-04 2017-05-11 广州市香雪制药股份有限公司 识别ny-eso-1抗原短肽的tcr
GB201522592D0 (en) * 2015-12-22 2016-02-03 Immunocore Ltd T cell receptors
WO2017139199A1 (en) 2016-02-10 2017-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Inducible arginase
GB2605540B (en) 2016-10-18 2022-12-21 Univ Minnesota Tumor infiltrating lymphocytes and methods of therapy
EA201991696A1 (ru) * 2017-01-13 2020-02-05 Эйдженус Инк. Т-клеточные рецепторы, связывающиеся с ny-eso-1, и способы их применения
WO2018148224A1 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Phospholipid ether (ple) car t cell tumor targeting (ctct) agents
WO2018148454A1 (en) * 2017-02-09 2018-08-16 The Regents Of The University Of California Chimeric t cell antigen receptors and methods of use thereof
WO2018160622A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Endocyte, Inc. Compositions and methods for car t cell therapy
US10386882B2 (en) * 2017-04-14 2019-08-20 Allegro Microsystems, Llc Control circuit
EP3645021A4 (en) 2017-06-30 2021-04-21 Intima Bioscience, Inc. ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTORS FOR GENE THERAPY
AU2018326805B2 (en) 2017-09-01 2023-11-30 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Immunogenic peptides specific to BCMA and TACI antigens for treatment of cancer
SG11202003112QA (en) 2017-10-05 2020-05-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Methods for selectively expanding cells expressing a tcr with a murine constant region
WO2019069125A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Oslo Universitetssykehus Hf CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS
US20200316122A1 (en) 2017-10-11 2020-10-08 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Methods of producing t cell populations using p38 mapk inhibitors
WO2019144095A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Methods of use for car t cells
CN111868246A (zh) 2018-02-09 2020-10-30 美国卫生和人力服务部 拴系白细胞介素-15和白细胞介素-21
JP7068459B2 (ja) * 2018-02-26 2022-05-16 メディジーン イミュノテラピーズ ゲーエムベーハー Ｎｙｅｓｏ ｔｃｒ
US20210071141A1 (en) 2018-04-24 2021-03-11 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Methods of producing t cell populations using hydroxycitric acid and/or a salt thereof
CN110856751A (zh) * 2018-08-24 2020-03-03 合成免疫股份有限公司 包含核酸及tcr修饰的免疫细胞的治疗剂及其应用
US20210340524A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying chimeric antigen receptor-targeting ligands and uses thereof
AU2021341969A1 (en) 2020-09-08 2023-03-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services T cell phenotypes associated with response to adoptive cell therapy
CN112375136B (zh) * 2020-11-03 2022-06-07 中国科学院微生物研究所 Ny-eso-1特异性t细胞受体筛选及其抗肿瘤用途
US20240018210A1 (en) 2020-11-13 2024-01-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Servic Enhanced antigen reactivity of immune cells expressing a mutant non-signaling cd3 zeta chain
WO2023130040A2 (en) 2021-12-31 2023-07-06 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services T cell therapy with vaccination as a combination immunotherapy against cancer

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1269412A (zh) * 2000-03-17 2000-10-11 国家人类基因组南方研究中心 一种新的人t细胞受体相关蛋白及其编码序列
CN1279690A (zh) * 1997-10-02 2001-01-10 苏诺尔分子公司 可溶性单链t细胞受体蛋白
WO2009042570A2 (en) * 2007-09-25 2009-04-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Modified t cell receptors and related materials and methods
CN101652388A (zh) * 2007-03-13 2010-02-17 苏黎世大学 单克隆人肿瘤特异性抗体

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4450150A (en) 1973-05-17 1984-05-22 Arthur D. Little, Inc. Biodegradable, implantable drug delivery depots, and method for preparing and using the same
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
IN165717B (zh) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
JP3266311B2 (ja) 1991-05-02 2002-03-18 生化学工業株式会社 新規ポリペプチドおよびこれを用いる抗ｈｉｖ剤
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5595756A (en) * 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
WO2003008537A2 (en) 2001-04-06 2003-01-30 Mannkind Corporation Epitope sequences
ES2239246T3 (es) 2001-08-31 2005-09-16 Avidex Limited Receptor soluble de celulas t.
CA2566363C (en) 2004-05-19 2014-12-16 Avidex Ltd High affinity ny-eso t cell receptor
CA2580412A1 (en) 2004-09-13 2006-03-23 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary , Department Of Health And Human Services Compositions comprising t cell receptors and methods of use thereof
JP2006345852A (ja) * 2005-06-16 2006-12-28 Virxsys Corp 抗体複合体
ES2382777T3 (es) 2006-05-03 2012-06-13 Government Of The United States Of America,As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Receptor de células T quimérico y materiales relacionados y métodos de uso
US8088379B2 (en) 2006-09-26 2012-01-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Modified T cell receptors and related materials and methods
ME02810B (me) 2010-09-20 2018-01-20 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Antigen-specifični t ćelijski receptori i t ćelijski epitopi

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1279690A (zh) * 1997-10-02 2001-01-10 苏诺尔分子公司 可溶性单链t细胞受体蛋白
CN1269412A (zh) * 2000-03-17 2000-10-11 国家人类基因组南方研究中心 一种新的人t细胞受体相关蛋白及其编码序列
CN101652388A (zh) * 2007-03-13 2010-02-17 苏黎世大学 单克隆人肿瘤特异性抗体
WO2009042570A2 (en) * 2007-09-25 2009-04-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Modified t cell receptors and related materials and methods

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LAURENT DERRE ET AL.: "Distinct sets of αβ TCRs confer similar recognition of tumor antigen NY-ESO-1 157–165 by interacting with its central Met/Trp residues", 《PNAS》 *
徐珩等: "pCDNA3.1/NY-ESO-1真核表达质粒的构建及在肝癌细胞系HepG2中稳定高表达", 《安徽医科大学学报》 *

Also Published As

Publication number Publication date
US10087230B2 (en) 2018-10-02
CA2874486C (en) 2021-08-24
CN104507963B (zh) 2017-12-15
EP3527584A1 (en) 2019-08-21
ES2835200T3 (es) 2021-06-22
EP2852613B1 (en) 2019-01-23
EP3527584B1 (en) 2020-10-14
EP2852613A1 (en) 2015-04-01
PT2852613T (pt) 2019-05-20
IL235720A0 (en) 2015-01-29
EP3527584B8 (en) 2020-12-16
PT3527584T (pt) 2021-01-04
US20170029483A1 (en) 2017-02-02
US20150141347A1 (en) 2015-05-21
US10407485B2 (en) 2019-09-10
CA2874486A1 (en) 2013-11-28
JP2015525208A (ja) 2015-09-03
US9487573B2 (en) 2016-11-08
US20180371050A1 (en) 2018-12-27
ES2718474T3 (es) 2019-07-02
CN107881183B (zh) 2021-04-02
WO2013177247A1 (en) 2013-11-28
JP6378172B2 (ja) 2018-08-22
AU2013266421B2 (en) 2017-06-01
JP2018196384A (ja) 2018-12-13
EP3828197A1 (en) 2021-06-02
CN104507963A (zh) 2015-04-08
HK1251874A1 (zh) 2019-04-26
AU2013266421A1 (en) 2014-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104507963B (zh) 鼠抗‑ny‑eso‑1 t细胞受体
JP7297807B2 (ja) 抗突然変異ｋｒａｓ ｔ細胞受容体
US11434272B2 (en) Anti-human papillomavirus 16 E7 T cell receptors
CN105452288B (zh) 抗人乳头瘤病毒16 e6 t细胞受体
CN103596981B (zh) 抗‑表皮生长因子受体变体iii嵌合抗原受体及其用于治疗癌症的用途
CN104822705B (zh) M971嵌合抗原受体
ES2834070T3 (es) Receptores de células T que reconocen MAGE restringido por HLA-A1 o HLA-Cw7
CN108137703A (zh) 抗cd30嵌合抗原受体
CN109485730A (zh) 抗cd22嵌合抗原受体
CN105899531A (zh) 胸腺基质淋巴细胞生成素受体特异性的嵌合抗原受体及其使用方法
CN110709424A (zh) 细胞免疫治疗的组合物和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1251874

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant