CN105899531A - 胸腺基质淋巴细胞生成素受体特异性的嵌合抗原受体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含对TSLPR特异性的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内T细胞信号传递结构域。公开了与CAR有关的核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体、或其抗原结合部分和药物组合物。还公开了检测增生性病症(例如，癌症)在哺乳动物中的存在的方法和治疗或预防哺乳动物中的增生性病症(例如，癌症)的方法。

Description

胸腺基质淋巴细胞生成素受体特异性的嵌合抗原受体及其使用方法

对相关申请的交叉引用

本专利申请要求2013年12月6日提交的美国临时专利申请号61/912,948和2014年5月12日提交的美国临时专利申请号61/991,697的权益，它们中的每一篇通过引用整体并入本文。

通过引用并入电子递交的材料

与本文同时提交并如下识别的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表通过引用整体并入本文：一个58,011字节的ASCII(文本)文件，名称为“718601ST25”，于2014年9月11日创建。

背景技术

癌症是一个公共卫生问题。尽管在治疗诸如化学疗法方面有进步，但许多癌症的预后继续是差的。因此，存在未满足的对癌症的另外治疗的需求。

发明内容

本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含对胸腺基质淋巴细胞生成素受体(TSLPR)特异性的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内T细胞信号传递结构域。所述CAR还可以包含4-1BB细胞内结构域、间隔区或二者。

本发明的其它实施方案提供了与本发明的CAR有关的相关核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群、抗体或其抗原结合部分和药物组合物。

本发明的另外实施方案提供了检测哺乳动物中增生性病症(例如，癌症)的存在的方法以及治疗或预防哺乳动物中增生性病症(例如，癌症)的方法。

附图说明

图1呈现的流式细胞计量术图显示了3G11抗-TSLPR抗体和商购可得的抗-TSLPR抗体与过表达TSLPR的前体-B细胞急性成淋巴细胞性白血病的结合。y-轴是计数，x-轴是平均荧光强度。使用藻红蛋白(phycoerytherin)-缀合的山羊抗-小鼠抗体检测结合。

图2呈现的流式细胞计量术图显示了CD19、CD22和TSLPR在稳定的白血病细胞系和JH331上的表面表达，所述JH331源自患者白血病胚细胞，天然地过表达TSLPR，且不可在体外培养。y-轴是计数，x-轴是平均荧光强度。

图3呈现了根据本发明的某些实施方案的短和长CAR的图解表示。

图4呈现了根据本发明的某些实施方案编码CAR的载体的构建的图解表示。

图5A和5B显示的流式细胞计量术图显示了使用根据本发明的某些实施方案的CAR转导人T细胞。图5A显示了使用蛋白L检测CAR。图5B显示了使用CD22蛋白Fc构建体检测CAR。

图6的条形图显示了根据本发明的某些实施方案TSLPR CAR转导的T细胞对细胞裂解性细胞因子的释放。

图7A-7H和8A-8E的条形图显示了根据本发明的某些实施方案具有TSLPR CAR的T细胞在有TSLPR转导的和天然地过表达ALL的细胞两者存在下生产宽范围的炎症性细胞因子。

图9A-D的线图显示了根据本发明的某些实施方案TSLPR CAR介导的肿瘤细胞裂解。

图10显示了根据本发明的某些实施方案具有短TSLPR CAR的白血病体内减少的图像。第0天：5E5细胞REH-TSLPR，第4天：15E6细胞CART。在第23天和第30天在短CAR列中的第四种动物没有显示，因为所述动物由于消耗综合征而死亡，这与异种移植物抗宿主病相一致。

图11的点图显示了根据本发明的某些实施方案用不同类型的构建体转导的T细胞治疗时血液中的ALL的对比。在ADT(过继转移)以后第27天的周围ALL负荷。

图12A的点图显示了根据本发明的某些实施方案过继转移后CAR T细胞在体内的百分比和持久性。对于第27天的短CAR以及第16和27天的长CAR，p＝0.0008。有证据表明在第16天增加的短CAR T细胞的数目，尽管这不是显著的。

图12B的流分析点图显示了根据本发明的某些实施方案在血液中的CAR T细胞的典型量。

图13呈现的图像表明，根据本发明的某些实施方案用TSLPR CAR体内减少白血病是靶标特异性的。在第0天：1E6肿瘤细胞；在第16天：用10E6细胞短CAR治疗。

图14的条形图显示了根据本发明的某些实施方案TSLPR CAR转导的T细胞在ADT后(在第50天)向CD8倾斜。在输注前由CD3/CD28珠子介导的繁殖以后CD4+CAR T细胞的稍微增加的相对数目转化成注射以后在第50天CD8+/TSLPR CAR+的优势(通过TSLPR Fc测量)。

图15的点图显示了根据本发明的某些实施方案的TSLPR CAR的物理分布。CD45RA+CCR7+是原初的，CD45RA-CCR7+是中央记忆的，且CD45RA+CCR7-是T细胞的效应物记忆表型。

图16A呈现的生物发光图像跟踪根据本发明的某些实施方案的不同体内治疗的白血病进展。

图16B的线图显示了根据本发明的某些实施方案的白血病进展的定量。

图16C的线图显示了根据本发明的某些实施方案的TSLPR CAR治疗的存活图。

图17呈现的图像显示了根据本发明的某些实施方案使用TSLPR短CAR减少患者TSLPRhi异种移植物中的高负荷。

图18A的点图显示了根据本发明的某些实施方案肿瘤攻击以后22天患者TSLPRhi异种移植物的血液分析。用NSG小鼠中的15E6细胞TSLPR-短CAR T细胞或Lenti-GFP T细胞治疗的JH352或NH362的1E6细胞。

图18B的点图显示了根据本发明的某些实施方案肿瘤攻击以后22天患者TSLPRhi异种移植物的骨髓分析。用NSG小鼠中的15E6TSLPR-短CAR T细胞或Lenti-GFP T细胞治疗的JH352或NH362的1E6。

图19呈现的图像显示了根据本发明的某些实施方案用1.2E6短TSLPRCAR治疗患者JH331-Luc，其中所述短TSLPR CAR可以用低至120万个CAR T细胞减少患者异种移植物中的ALL。

图20的点图显示了根据本发明的某些实施方案在小鼠血液样品中呈现的CAR T细胞的百分比。

图21的条形图显示了根据本发明的某些实施方案体内注射以后CART细胞的CD4至CD8的转移。

图22是根据本发明的某些实施方案在白血病注射以后在第35天的代表性点图。

图23的线图显示了根据本发明的某些实施方案在第18天将侵袭性TSLPRhi ALL(2x 10⁶/小鼠)注射进有和没有TSLPR CAT治疗的NSG小鼠(n＝5/组)中以后的存活。

图24呈现的图像显示了根据本发明的某些实施方案基于将TSLPR、CD19和CD22的CAR+T细胞(3E6)注射进植入了患者异种移植物细胞系JH331-LUC的NSG小鼠中29天的结果。用GFP转导的T细胞用作阴性对照。

图25A-C的线图显示了根据本发明的某些实施方案使用CAR的肿瘤细胞裂解百分比。

图26呈现的图像显示了根据本发明的某些实施方案不同的CAR构建体在体内的治疗功能。

具体实施方式

急性成淋巴细胞性白血病(ALL)代表在儿童中的一种常见肿瘤学诊断。已经在儿科ALL的前沿(upfront)化学疗法中取得了实质进展，使得大多数患者将被治愈。尽管如此，由于对细胞毒性的化学疗法不再做出应答的疾病的复发或由于对前沿治疗的不应性，ALL仍然是儿童死于癌症的一个常见原因。此外，长期疗法诱导的发病率仍然是一个主要问题，特别是在被认为具有复发高危且因而在当前风险适应的方案下用更强烈的方案治疗的那些患者中。在成年人中，ALL发生的频率低于在儿童中，但是成年ALL的预后比在接受标准细胞毒性的化学疗法的儿童中更差。用儿科型方案治疗年轻的成年人具有改善的结果，但是没有达到在儿童中实现的水平。

被遗传修饰成表达在淋巴样细胞上表达的嵌合抗原受体(CAR)靶向抗原的T细胞的过继性细胞转移(ADT或ACT)已经在B细胞恶性肿瘤(包括ALL)中表现出有效活性，从而在化学疗法难治的患者中导致减轻。在这些试验的大多数中被靶向的表面蛋白是在恶性的和非恶性的B细胞上都表达的CD19抗原。但是，并非所有的患者都做出应答，并且在某些情况下由于CD19表达的缺失而发生复发。在用基于双特异性抗体的靶向CD19和CD3的试剂治疗以后，也已经观察到CD19的缺失。

基因组学的实质进展已经导致在ALL中失调的基因和途径的鉴别。一个这样的类别是与细胞因子信号传递有关的那些，包括IL-7，且具体地包括CD127(IL-7Rα)。胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)是一种细胞因子，其具有CD127，但是利用第二受体链TSLPR(基因名称CRLF2)作为异源二聚体信号传递复合物的组成部分。已经在5-10％的儿科和成年人ALL中鉴别出TSLPR的过表达，主要是由于导致替代启动子的易位或缺失。TSLPR的过表达似乎与具有ALL的儿童和成年人中的预后不良有关，并且TSLPR途径的活化似乎对于ALL胚细胞而言是生物学上重要的。并且，在大约50％的病例中，增加的TSLPR表达与IKZF基因中的突变有关，即特别高危的患者亚组。TSLPR似乎具有受限的正常组织表达。

本发明的一个实施方案提供了嵌合抗原受体(CAR)，其包含对TSLPR特异性的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内T细胞信号传递结构域。所述CAR还可以包含4-1BB细胞内结构域、间隔区或二者。

嵌合抗原受体(CAR)是一种人工构建的杂合蛋白或多肽，其含有与T-细胞信号传递结构域连接的抗体的抗原结合结构域(例如，单链可变片段(scFv))。CAR的特征包括它们的利用单克隆抗体的抗原结合性质以非MHC限制的方式向选定靶标重定向T细胞特异性和反应性的能力。非MHC限制的抗原识别会给表达CAR的T细胞赋予独立于抗原加工而识别抗原的能力，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CAR有利地不与内源性T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。

本文中使用的短语“具有抗原特异性”和“引起抗原特异性的应答”是指，CAR可以特异性地结合和在免疫学上识别抗原，使得CAR与抗原的结合引起免疫应答。

本发明的CAR对胸腺基质淋巴细胞生成素受体(TSLPR)具有抗原特异性。TSLPR在大约10％的成年人和儿科B细胞前体急性成淋巴细胞性白血病(BCP-ALL)的表面上过表达。正常的、非肿瘤或非癌细胞对TSLPR的表达不像肿瘤或癌细胞的表达那么稳健。在这点上，与正常的、非肿瘤或非癌细胞对TSLPR的表达相比，肿瘤或癌细胞可以过表达TSLPR或在显著更高的水平表达TSLPR。

不受限于特定理论或机制，据信，通过引起针对TSLPR的抗原特异性的应答，本发明的CAR会提供以下的一项或多项：靶向和破坏表达TSLPR的癌细胞，减少或消除癌细胞，促进免疫细胞向肿瘤部位的渗透，和增强/延长抗癌应答。

本发明提供了一种包含对TSLPR特异性的抗原结合结构域的CAR，其基于抗体，例如，如在Lu等,J.Exp.Med.,2009,206:2111-9中所述的3G11或如在Rochman等,J.Immunol.,2007,178:6720-6724中所述的2D10(每篇通过引用整体并入本文)。这些抗体的scFv包含轻链可变区和重链可变区。在本发明的实施方案中，所述轻链和重链可以包含轻链和重链序列的任意合适的组合，例如，如在下面的表1中所列出的。

在一个实施方案中，所述抗原结合结构域包含接头。所述接头连接抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。适合用于连接重链可变区和轻链可变区的任何接头可以用在本发明的抗原结合结构域中。在一个实施方案中，所述接头包含甘氨酸-丝氨酸接头结构域、由其组成或基本上由其组成。优选地，所述抗原结合结构域包含含有重链可变区、轻链可变区和接头的scFv。在本发明的实施方案中，所述轻链、重链和接头可以包含如在下面表1中所列出的轻链、重链和接头序列的任意合适的组合。

在本发明的一个实施方案中，所述抗原结合结构域包含含有以下序列、由以下序列组成或基本上由以下序列组成的scFv：

QVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADTATYYCSRRPRGTMDAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAASSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIRNLEQEDIATYFCQQVYTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1)或

QVTLKESGPGILKPSQTLSLTCSFSGFSLNTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKYYNPSLKSQLTISKDTSRNQVFLKITSVDTADSATYYCARRASHVSTVDSFDFWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWFQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGYTLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:2)。

编码本文描述的氨基酸序列的载体可以包含编码AS、AT或二者的核酸序列，诸如在起始密码子前面紧邻的ASAT(SEQ ID NO:3)。这些序列没有被翻译成CAR的组成部分。

在一个实施方案中，所述抗原结合结构域包含前导序列/信号序列。所述前导序列可以位于重链可变区的氨基端。所述前导序列可以包含任意合适的前导序列。在本发明的实施方案中，所述前导序列/信号序列可以包含如在下面表1中列出的序列。在T细胞的成熟形式中，所述前导序列可以不存在。

在本发明的一个实施方案中，所述CAR包含跨膜结构域。在本发明的一个实施方案中，所述跨膜结构域包含CD8。所述CD8可以包含CD8α(CD8α)铰链和跨膜结构域。在一个优选的实施方案中，所述CD8是人CD8。所述CD8可以包含非完整的CD8。在本发明的实施方案中，所述CD8可以包含如在下面表1中列出的序列。

在本发明的一个实施方案中，所述CAR包含含有4-1BB(CD137)、CD3zeta(ζ)或二者的细胞内T细胞信号传递结构域。在一个优选的实施方案中，所述CD3ζ、4-1BB或二者是人的。4-1BB将有效的共刺激信号传送至T细胞，从而促进T淋巴细胞的分化和增强T淋巴细胞的长期存活。CD3ζ与TCR结合以产生信号，且含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。在一个实施方案中，所述CAR缺少4-1BB结构域。在另一个实施方案中，所述CAR包含CD28结构域。CD28是一种在T细胞共刺激中重要的T细胞标志物。4-1BB、CD28、CD3ζ或这些中的任一种可以分别包含非完整的4-1BB或CD3ζ。在本发明的实施方案中，所述4-1BB可以包含如在下面表1中列出的序列。在本发明的实施方案中，所述CD3ζ可以包含如在下面表1中列出的序列。

在本发明的一个实施方案中，所述CAR包含间隔区。所述间隔区可以是在任何前述的结构域之间。在一个实施方案中，所述CAR包含IgG重链恒定结构域(CH2CH3)间隔区。在另一个实施方案中，所述间隔区可以是在scFv和跨膜结构域之间。在一个优选的实施方案中，所述间隔区(例如，CH2CH3)的序列是人的。在本发明的实施方案中，所述间隔区可以包含如在下面表1中列出的序列。

本发明的实施方案包含如在下面表1中提供的序列。

表1

本发明的实施方案包括以下表2中的序列，其包含在上面表1中呈现的序列。

表2

本发明的实施方案包括以下表3中的序列，其包含在上面表1中呈现的序列，其中信号肽不存在。

表3

在本发明的范围内包括本文描述的本发明的CAR的功能部分。当提到CAR使用时，术语“功能部分”表示本发明的CAR的任何部分或片段，所述部分或片段保留其来源CAR(亲本CAR)的生物学活性。功能部分包括，例如，这样的CAR部分：其保留识别靶细胞或者检测、治疗或预防疾病的能力，达到与亲本CAR相似的程度、相同的程度或更高的程度。关于亲本CAR，功能部分可以包含，例如，亲本CAR的约10％、25％、30％、50％、68％、80％、90％、95％或更多。

所述功能部分可以包含位于所述部分的氨基或羧基端或者两端的额外的氨基酸，所述额外的氨基酸未在亲本CAR的氨基酸序列中发现。理想地，所述额外的氨基酸不干扰功能部分的生物学功能，例如，识别靶细胞、检测癌症、治疗或预防癌症等。更理想的是，与亲本CAR的生物学活性相比，所述额外的氨基酸增强生物学活性。

在本发明的范围内包括本文所述的本发明的CAR的功能变体。本文中使用的术语“功能变体”表示与亲本CAR具有基本或显著序列同一性或者相似性的CAR、多肽或蛋白，所述功能变体保持所述功能变体作为变体的CAR的生物学活性。功能变体包括，例如，这样的本文所述的CAR(亲本CAR)的变体：所述变体保留识别靶细胞的能力，达到与亲本CAR相似的程度、相同的程度或更高的程度。关于亲本CAR，功能变体可以，例如，在氨基酸序列上与亲本CAR具有至少约30％、50％、75％、80％、90％、98％或更多的同一性。

功能变体可以，例如，包含具有至少一个保守氨基酸置换的亲本CAR的氨基酸序列。可替换地或额外地，功能变体可以包含具有至少一个非保守氨基酸置换的亲本CAR的氨基酸序列。在该情况下，优选的是，所述非保守氨基酸置换不会干扰或抑制功能变体的生物学活性。所述非保守氨基酸置换可能增强功能变体的生物学活性，使得所述功能变体的生物学活性与亲本CAR相比增加。

本发明的CAR的氨基酸置换优选地是保守氨基酸置换。保守氨基酸置换是本领域已知的，并且包括这样的氨基酸置换：其中一个具有特定物理和/或化学性质的氨基酸被交换为另一个具有相同或类似化学或物理性质的氨基酸。例如，保守氨基酸置换可以是一个酸性的/带负电荷的极性氨基酸置换另一个酸性的/带负电荷的极性氨基酸(例如，Asp或Glu)，一个具有非极性侧链的氨基酸置换另一个具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)，一个碱性/带正电荷的极性氨基酸置换另一个碱性/带正电荷的极性氨基酸(例如Lys、His、Arg等)，一个具有极性侧链的不带电荷的氨基酸置换另一个具有极性侧链的不带电荷的氨基酸(例如，Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)，一个具有β-分支的侧链的氨基酸置换另一个具有β-分支的侧链的氨基酸(例如，Ile、Thr和Val)，一个具有芳族侧链的氨基酸置换另一个具有芳族侧链的氨基酸(例如，His、Phe、Trp和Tyr)等。

还可以基于载体设计从所述序列添加或除去氨基酸。例如，SEQ ID NO:34(由于载体设计在载体的BspEI位点处添加氨基酸)可以从如本文中所述的CAR除去，例如，从表2、表3或二者中的序列除去。

所述CAR可以基本上由本文所述的一个或多个特定氨基酸序列组成，以致其它组分(例如，其它氨基酸)不实质改变功能变体的生物学活性。

本发明的实施方案的CAR(包括功能部分和功能变体)可以具有任何长度，即，可以包含任何数量的氨基酸，条件是，所述CAR(或其功能部分或功能变体)保持其生物学活性，例如，以下能力：特异性结合抗原，检测哺乳动物中的患病细胞，或者治疗或预防哺乳动物的疾病等。例如，所述CAR的长度可以是50至5000个氨基酸，诸如50、70、75、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个氨基酸的长度。

本发明的实施方案的CAR(包括本发明的功能部分和功能变体)可以包含代替一个或多个天然存在的氨基酸的合成氨基酸。这样的合成氨基酸在本领域中是已知的，并且包括，例如，氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸、反-3-和反-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’,N’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸，和α-叔丁基甘氨酸。

本发明的实施方案的CAR(包括功能部分和功能变体)可以被糖基化、酰胺化、羧基化、磷酸化、酯化、N-酰化、经由例如二硫键环化，或者转化为酸加成盐和/或任选地二聚或多聚，或者缀合。

本发明的实施方案的CAR(包括其功能部分和功能变体)可以通过本领域已知的方法得到。所述CAR可以通过任意合适的制备多肽或蛋白的方法来制备。从头合成多肽和蛋白的合适方法描述于文献中，如Chan等,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis(Fmoc固相肽合成),Oxford UniversityPress,Oxford,United Kingdom,2000；Peptide and Protein Drug Analysis(肽和蛋白药物分析),Reid,R.编,Marcel Dekker,Inc.,2000；Epitope Mapping(表位定位),Westwood等编,Oxford University Press,Oxford,UnitedKingdom,2001；和美国专利5,449,752。并且，可以使用本文所述的核酸使用标准重组方法重组地生产多肽和蛋白。见，例如，Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册),第3版,Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor,NY 2001；和Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(当前的分子生物学实验方案),Greene Publishing Associates&John Wiley&Sons，NY，1994。此外，本发明的一些CAR(包括其功能部分和功能变体)可以从如以下的来源分离和/或纯化：植物、细菌、昆虫、哺乳动物例如大鼠、人等。分离和纯化的方法是本领域中已知的。可替换地，本文中描述的CAR(包括其功能部分和功能变体)可以由公司商业合成。在这点上，本发明的CAR可以是合成的、重组的、分离的和/或纯化的。

本发明的一个实施方案进一步提供了特异性地结合本发明的CAR的表位的抗体或其抗原结合部分。所述抗体可以是本领域已知的任意类型的免疫球蛋白。例如，所述抗体抗体可以是任何同种型，例如，IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等。抗体可以是单克隆的或多克隆的。抗体可以是天然抗体，例如，分离和/或纯化自哺乳动物，例如小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等的抗体。可替换地，抗体可以是遗传改造的抗体，例如，人源化抗体或者嵌合抗体。抗体可以是以单体或多聚体形式。并且，抗体可以具有针对本发明的CAR的功能部分的任何水平的亲和力或亲合力。

检测抗体结合本发明的CAR的任何功能部分的能力的方法是本领域中已知的并且包括任何抗体-抗原结合测定，如，例如，放射免疫测定(RIA)、ELISA、蛋白印迹法、免疫沉淀和竞争性抑制测定(参见，例如，Janeway等，下文，美国专利申请公开号2002/0197266A1，和美国专利号7,338,929)。

制备抗体的合适的方法是本领域中已知的。例如，标准杂交瘤方法被描述于，例如，和Milstein，Eur.J.Immunol.，5，511-519(1976)，Harlow和Lane(编)，Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验手册),CSH Press(1988)，和C.A.Janeway等(编),Immunobiology,第5版,Garland Publishing,New York,NY(2001))。可替换地，其它方法，如EBV-杂交瘤法(Haskard和Archer，J.Immunol.Methods，74(2)，361-67(1984),和Roder等,MethodsEnzymol.,121，140-67(1986))，和噬菌体载体表达系统(参见，例如，Huse等，Science，246,1275-81(1989))是本领域中已知的。此外，在非人动物中制备抗体的方法被描述于，例如，美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352、美国专利申请公开号2002/0197266A1和美国专利号7,338,929)。

此外，噬菌体展示可以用于生产抗体。在这点上，可以使用标准分子生物学和重组DNA技术(参见，例如，Sambrook等,出处同上，和Ausubel等,出处同上)，生产编码抗体的抗原结合可变(V)结构域的噬菌体文库。选择编码具有所需特异性的可变区的噬菌体用于与所需抗原的特异性结合，并且重建包含所选的可变结构域的完全或部分抗体。将编码重建的抗体的核酸序列引入合适的细胞系中，如用于杂交瘤制备的骨髓瘤细胞，以致由所述细胞分泌具有单克隆抗体特性的抗体(参见，例如，Janeway等,出处同上，Huse等,出处同上，和美国专利6,265,150)。

抗体可以由转有特定的重链和轻链免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备。所述方法是本领域中熟知的并且描述于，例如美国专利5,545,806和5,569,825，以及Janeway等,出处同上。

制备人源化抗体的方法是本领域中已知的，并且详细描述于，例如，Janeway等,出处同上，美国专利5,225,539、5,585,089和5,693,761，欧洲专利号0239400B1，和英国专利号2188638。也可以使用描述于美国专利5,639,641和Pedersen等，J.Mol.Biol.，235，959-973(1994)中的抗体表面重建(resurfacing)技术制备人源化抗体。

本发明的一个实施方案还提供本文所述任何抗体的抗原结合部分。抗原结合部分可以是具有至少一个抗原结合位点的任何部分，如Fab、F(ab’)₂、dsFv、sFv、双抗体(diabodies)和三抗体(triabodies)。

可以使用常规重组DNA技术(参见，例如，Janeway等,出处同上)制备单链可变区片段(sFv)抗体片段。类似地，可以通过重组DNA技术(参见，例如，Reiter等，Protein Engineering，7，697-704(1994))制备二硫键稳定的可变区片段(dsFv)。然而，本发明的抗体片段不限于这些示例类型的抗体片段。

并且，抗体或其抗原结合部分可以被修饰成包含可检测的标记，如，例如，放射性同位素、荧光团(例如，荧光素异硫氰酸酯(FITC)，藻红蛋白(PE))，酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化酶)，和元素颗粒(例如，金颗粒)。

本发明的一个实施方案进一步提供了核酸，其包含编码本文中描述的任意CAR(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列。本发明的核酸可以包含编码本文描述的前导序列、抗原结合结构域、跨膜结构域和/或细胞内T细胞信号传递结构域中的任一种的核苷酸序列。

在某些实施方案中，所述核苷酸序列可以经过密码子优化。不受限于特定理论，据信，核苷酸序列的密码子优化会增加mRNA转录物的翻译效率。核苷酸序列的密码子优化可能包含用另一个密码子置换天然密码子，所述另一个密码子编码相同的氨基酸，但是可以被细胞内更容易得到的tRNA翻译，从而增加翻译效率。核苷酸序列的优化还可以减少会干扰翻译的二级mRNA结构，从而增加翻译效率。

在本发明的一个实施方案中，所述核酸可以包含经过密码子优化的核苷酸序列，其编码本发明的CAR的抗原结合结构域。在本发明的另一个实施方案中，所述核酸可以包含经过密码子优化的核苷酸序列，其编码本文描述的任意CAR(包括其功能部分和功能变体)。

本文中使用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”、和“核酸分子”，并且通常表示DNA或RNA的聚合物，其可以是单链的或双链的、合成的或从天然源获得的(例如，分离的和/或纯化的)，其可以包含天然、非天然或改变的核苷酸，并且其可以包含天然、非天然或改变的核苷酸间键合，如氨基磷酸酯键合或硫代磷酸酯键合，而不是在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯。在某些实施方案中，所述核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或置换。然而，如本文所述，在某些情况下，对于核酸可能合适的是包含一个或多个插入、缺失、倒位和/或置换。

本发明的一个实施方案的核酸可以是重组体。本文中使用的术语“重组体”表示：(i)在活细胞外通过将天然或合成的核酸片段与可以在活细胞中复制的核酸分子连接构建的分子，或者(ii)由以上(i)中所述的那些分子的复制产生的分子。就本文的目的而言，复制可以是体外复制或体内复制。

重组核酸可以是这样的核酸：其具有非天然存在的序列，或者具有通过2个否则分开的序列区段的人工组合而制备的序列。该人工组合经常通过化学合成来实现，或者更常见地，通过分离的核酸区段的人工操作来实现，例如，通过基因工程技术，诸如在Sambrook等(出处同上)中描述的那些。可以基于化学合成和/或酶连反应使用本领域中已知的方法构建核酸。见，例如，Sambrook等，出处同上，和Ausubel等，出处同上。例如，可以使用被设计用来增加分子的生物学稳定性或增加杂交后形成的双链体的物理稳定性的天然核苷酸或不同修饰的核苷酸(例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)来化学合成核酸。可以用于生产核酸的修饰的核苷酸的例子包括、但不限于：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N⁶-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N⁶-取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N⁶-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、和2,6-二氨基嘌呤。可替换地，本发明的一种或多种核酸可以购买自公司，如Integrated DNA Technologies(Coralville,IA,USA)。

核酸可以包含编码任何CAR或其功能部分或功能变体的任何分离的或纯化的核苷酸序列。可替换地，核苷酸序列可以包含简并为任意序列或简并序列的组合的核苷酸序列。

本发明的一个实施方案还提供分离或纯化的核酸，所述核酸包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或者在严格条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在严格条件下杂交的核苷酸序列可以在高严格性条件下杂交。“高严格性条件”表示核苷酸序列以相比于非特异性杂交的可检测地更强的量与靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性地杂交。高严格性条件包括将区别具有正确互补序列的多核苷酸的条件，或者仅包含少量分散错配的条件，所述错配来自正好具有少量匹配所述核苷酸序列的小区域(例如，3-10个碱基)的随机序列。这样的互补性小区域比14-17个以上碱基的全长补体更容易解链，并且高严格性杂交使得它们可以容易地区分。相对的高严格性条件包括，例如，低盐和/或高温条件，如由约0.02-0.1M NaCl或等价物，在约50-70℃的温度提供的。这样的高严格性条件几乎不允许(即使有)核苷酸序列与模板或靶链之间的错配，并且尤其适于检测任何本发明的CAR的表达。通常被理解的是，可以通过添加增加量的甲酰胺使得条件更严格。

本发明还提供了一种核酸，其包含与本文中描述的任意核酸具有至少约70％或更多(例如，约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％)同一性的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明的核酸可以并入重组表达载体中。在这点上，本发明的一个实施方案提供了包含本发明的任何核酸的重组表达载体。就本文的目的而言，术语”重组表达载体”表示遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当所述构建体包含编码mRNA、蛋白、多肽或肽的核苷酸序列，并且将载体在足以使mRNA、蛋白、多肽或肽在细胞内表达的条件下与细胞接触时，所述遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体允许宿主细胞表达mRNA、蛋白、多肽或肽。本发明的载体整体上不是天然存在的。然而，所述载体的部分可以是天然存在的。本发明的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括、但不限于DNA和RNA，其可以是单链的或双链的，合成的或部分从天然来源获得的，并且其可以包含天然存在、非天然存在或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在或非天然存在的核苷酸间键合，或上述两种类型的键合。优选地，非天然或改变的核苷酸或核苷酸间键合不妨碍载体的转录或复制。

在一个实施方案中，本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括那些载体，所述载体被设计成用于增殖和扩大或表达或两者，如质粒和病毒。载体可以选自由以下组成的组：pUC系列(Fermentas Life Sciences,GlenBurnie,MD)，pBluescript系列(Stratagene，LaJolla，CA)，pET系列(Novagen，Madison，WI)，pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)和pEX系列(Clontech，Palo Alto，CA)。也可以使用噬菌体载体，如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。植物表达载体的例子包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的例子包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。优选地，重组表达载体是病毒载体，例如，逆转录病毒载体或慢病毒载体。

许多转染技术通常是本领域已知的(参见，例如，Graham等,Virology，52:456-467(1973)；Sambrook等,出处同上；Davis等,Basic Methods inMolecular Biology,Elsevier(1986)；和Chu等,Gene,13:97(1981)。转染方法包括磷酸钙共沉淀(参见，例如，Graham等,出处同上)、直接显微注射进培养的细胞中(参见，例如，Capecchi,Cell,22:479-488(1980))、电穿孔(参见，例如，Shigekawa等，BioTechniques，6:742-751(1988))、脂质体介导的基因转移(参见，例如，Mannino等，BioTechniques，6:682-690(1988))、脂质介导的转导(参见，例如，Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84:7413-7417(1987))和使用高速微射弹的核酸递送(参见，例如，Klein等，Nature，327:70-73(1987))。

在一个实施方案中，可以使用标准重组DNA技术制备本发明的重组表达载体，所述技术描述于例如，Sambrook等，出处同上，和Ausubel等，出处同上。环形或线形的表达载体的构建体可被制备成包含在原核或真核宿主细胞中起作用的复制系统。复制系统可以来源自，例如，ColEl、2μ质粒、λ、SV40病毒、牛乳头瘤病毒等。

重组表达载体可以包含调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其对其中将要引入所述载体的宿主细胞(例如，细菌、真菌、植物或动物)是特异的，适当地并且考虑载体是基于DNA的还是基于RNA的。重组表达载体可以包含限制位点以促进克隆。

重组表达载体可以包括一种或多种标记物基因，这允许选择转化的或转染的宿主细胞。标记物基因包括杀菌剂抗性，例如，对抗生素、重金属等的的抗性，在营养缺陷型宿主中的互补以提供原营养，等。适用于本发明的表达载体的标记物基因包括，例如，新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组胺醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。

重组表达载体可以包含天然或者非天然启动子，所述启动子可操作地连接至编码CAR(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列、或连接至这样的核苷酸序列：其与编码CAR的核苷酸序列互补或杂交。选择例如强的、弱的、可诱导的、组织特异性的和发育特异性的启动子属于技术人员的常规技术。类似地，将核苷酸序列与启动子结合也在技术人员的技术内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如，巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子或发现于鼠干细胞病毒的长末端重复中的启动子。

本发明的重组表达载体可以被设计成用于瞬时表达、稳定表达或两者。并且，重组表达载体可以被制成用于组成型表达或可诱导表达。

此外，重组表达载体可以被制成包括自杀基因。本文中使用的术语”自杀基因”表示导致表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是这样的基因，其给表达该基因的细胞赋予对药剂例如药物的敏感性，并且当细胞与所述药剂接触或暴露于所述药剂时导致所述细胞死亡。自杀基因是本领域中已知的(参见，例如，Suicide Gene Therapy:Methods and Reviews(自杀基因疗法：方法和综述),Springer,Caroline J.(Cancer Research UKCentre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research,Sutton,Surrey，UK),Humana Press,2004)，并且包括，例如，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因，胞嘧啶脱氨酶(daminase)，嘌呤核苷磷酸化酶，和硝基还原酶。

在本发明的范围内包括缀合物，例如，生物缀合物，其包含任何本发明的CAR(包括其任何功能部分或变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞、宿主细胞群或抗体或其抗原结合部分。缀合物，以及通常用于合成缀合物的方法在本领域中是已知的(参见，例如，Hudecz，F.，Methods Mol.Biol.298:209-223(2005)和Kirin等，Inorg Chem.44(15):5405-5415(2005))。

本发明的一个实施方案还提供包含本文所述的任何重组表达载体的宿主细胞。本文中使用的术语”宿主细胞”表示可以包含本发明的重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如，植物、动物、真菌或藻类，或者可以是原核细胞，例如，细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即，直接分离自生物例如人的细胞。宿主细胞可以是贴壁(adherent)细胞或悬浮细胞，即，在悬浮液中生长的细胞。合适的宿主细胞是本领域中已知的并且包括，例如，DH5α大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体，宿主细胞可以是原核细胞，例如，DH5α细胞。为了制备重组CAR，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是人细胞。虽然宿主细胞可以是任何细胞类型，可以来源于任何类型的组织，并且可以处于任何发育阶段，但是宿主细胞可以是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。宿主细胞可以是T细胞。

就本文的目的而言，T细胞可以是任何T细胞，如培养的T细胞，例如，原代T细胞，或者来自培养的T细胞系例如Jurkat、SupT1等的T细胞，或获得自哺乳动物的T细胞。如果获得自哺乳动物，T细胞可以获得自多个来源，包括、但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或流体。T细胞也可以被富集或纯化。T细胞可以是人T细胞。T细胞可以是分离自人的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以处于任何发育阶段，包括、但不限于，CD4⁺/CD8⁺双阳性T细胞，CD4⁺辅助T细胞，例如，Th₁和Th₂细胞，CD8⁺T细胞(例如，细胞毒性T细胞)，肿瘤浸润细胞，记忆T细胞，原初T细胞等。T细胞可以是CD8⁺T细胞或CD4⁺T细胞。

在一个实施方案中，如本文中所述的CAR可以用在合适的非-T细胞中。这样的细胞是具有免疫效应子功能的那些，例如，NK细胞和从多能干细胞产生的T-样细胞。

本发明的一个实施方案还提供包含至少一种本文所述的宿主细胞的细胞群。细胞群可以是异种群，其包含含有所述任何重组表达载体的宿主细胞，此外还包含至少一种其它细胞，例如，不含有任何重组表达载体的宿主细胞(例如，T细胞)，或者除T细胞以外的细胞，例如，B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞、脑细胞等。可替换地，细胞群可以是基本同种的群，其中该群主要包含含有重组表达载体的宿主细胞(例如，基本尤其组成)。所述群也可以是克隆的细胞群，其中该群的所有细胞都是含有重组表达载体的单个宿主细胞的克隆，以致该群的所有细胞都含有重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，细胞群是克隆的群，其包含宿主细胞，所述宿主细胞包含如本文所述的重组表达载体。

CAR(包括其功能部分和变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)(它们在下文中被统称为“本发明的CAR材料”)可以是分离的和/或纯化的。本文中使用的术语“分离的”表示已经从其天然环境中取出。本文中使用的术语“纯化的”或“分离的”不要求绝对纯度或分离；相反，它是指相对术语。因而，例如，纯化的(或分离的)宿主细胞制品是这样的：其中宿主细胞比处于体内天然环境中的细胞更纯。这样的宿主细胞可以通过例如标准纯化技术来生产。在某些实施方案中，纯化宿主细胞制品，使得宿主细胞占所述制品的总细胞含量的至少约50％，例如至少约70％。例如，所述纯度可以是至少约50％，可以是大于约60％、约70％或约80％，或可以是约100％。

本发明的CAR材料可以被制成组合物，如药物组合物。在这点上，本发明的一个实施方案提供了一种药物组合物，其包含任意的CAR、功能部分、功能变体、核酸、表达载体、宿主细胞(包括其群体)和抗体(包括其抗原结合部分)和药学上可接受的载体。含有任何本发明的CAR材料的本发明的药物组合物可以包含超过一种本发明的CAR材料，例如，CAR和核酸，或者2种或更多种不同的CAR。可替换地，药物组合物可以包含与下述物质相组合的本发明的CAR材料：其它药物活性试剂或药物，如化疗剂，例如，门冬酰胺酶(asparaginase)、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲(hydroxyurea)、甲氨蝶呤(methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、利妥昔单抗(rituximab)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)等。在一个优选的实施方案中，所述药物组合物包含本发明的宿主细胞或其群体。

本发明的CAR材料可以以盐(例如，药学上可接受的盐)的形式提供。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸)和有机酸(诸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、羟乙酸、葡糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如，对甲苯磺酸)的那些盐。

关于药物组合物，药学上可接受的载体可以是任何常规使用的那些载体，并且仅受化学物理考虑因素(如溶解性和缺少与活性剂的反应性)和给药路径限制。本文所述的药学上可接受的载体，例如，媒介物、辅剂、赋形剂和稀释剂对于本领域中的技术人员是已知的，并且公众可以容易地获得。优选地，药学上可接受的载体是在化学上对活性试剂为惰性的载体和在使用条件下没有有害副作用或毒性的载体。

载体的选择将部分地取决于特定的本发明的CAR材料以及用于施用本发明的CAR材料的特定方法。因此，存在本发明的药物组合物的多种合适制剂。可以使用防腐剂。合适的防腐剂可以包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。可以任选地使用2种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物的约0.0001重量％至约2重量％的量存在。

合适的缓冲剂可以包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾、和各种其它酸和盐。可以任选地使用2种或更多种缓冲剂的混合物。所述缓冲剂或其混合物通常以总组合物的约0.001重量％至约4重量％的量存在。

本发明的CAR材料在药物制剂中的浓度可以变化，例如，按重量计，从小于约1％(通常在或至少约10％)到多达约20％至约50％或更多，且可以主要根据选择的特定给药模式通过流体体积和粘度来选择。

用于制备可施用的(例如，可胃肠外施用的)组合物的方法是本领域技术人员已知的或显而易见的，且更详细地描述在，例如，Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)。

以下用于口服给药、气溶胶给药、肠胃外给药(例如，皮下、静脉内、动脉内、肌肉内、真皮内、腹膜间和鞘内)和局部给药的制剂仅仅是示例性的并且决不是限制性的。超过一种路径可以用于施用本发明的CAR材料，并且在某些情况下，特定途径可以提供比另一种途径更快速和更有效的应答。

适于口服给药的制剂可以包含以下或者由以下组成：(a)液体溶液，如溶解在稀释剂如水、盐水或橙汁中的有效量的本发明的CAR材料；(b)胶囊、囊剂、片剂、锭剂(lozenge)和糖锭(troche)，其各自含有预定量的为固体或颗粒的活性成分；(c)粉剂；(d)在合适液体中的混悬剂；和(e)合适的乳剂。液体制剂可以包括稀释剂，如水和醇，例如，乙醇、苄醇和聚乙烯醇，同时添加或不添加药用表面活性剂。胶囊形式可以是常规的硬壳明胶类型或软壳明胶类型，其含有，例如，表面活性剂、润滑剂和惰性填料，如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。片剂形式可以包括以下各项中的一种更多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、微晶纤维素、阿拉伯树胶、明胶、瓜尔胶、胶体二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂和其它药用赋形剂。锭剂(lozenge)形式可以包含在调味剂(通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶)中的本发明的CAR材料，以及包含在惰性基质中的本发明的CAR材料的软锭剂(pastille)，所述惰性基质如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶，包含除此之外的赋形剂的乳剂，凝胶等，其是本领域中已知的。

适用于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性的、等渗无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与目标受体的血液等渗的溶质，以及水性和非水性的无菌混悬剂，其可以包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。本发明的CAR材料可以在药物载体中在生理用稀释剂中被施用，所述稀释剂如无菌液体或液体的混合物，包括水、盐水、葡萄糖水溶液和相关糖溶液，醇，如乙醇或十六醇，二醇，如丙二醇或聚乙二醇，二甲亚砜，甘油，缩酮如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇，醚，聚(乙二醇)400，油剂，脂肪酸，脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化脂肪酸甘油酯(在添加或不添加药用表面活性剂的情况下，所述药用表面活性剂如脂肪酸盐(soap)或去垢剂)，助悬剂，如果胶，卡波姆，甲基纤维素，羟基丙基甲基纤维素，或羧基甲基纤维素，或乳化剂和其它药物辅剂。

可以用于肠胃外制剂中的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生、大豆、芝麻、棉籽、玉米、橄榄、矿脂和矿物油。适用于肠胃外制剂的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的例子。

适用于肠胃外制剂中的脂肪酸盐(soap)包括脂肪碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，而合适的去垢剂包括(a)阳离子去垢剂如，例如，二甲基二烷基卤化铵和烷基卤化吡啶(b)阴离子去垢剂如，例如，烷基，芳基，和烯烃磺酸酯(或盐)，烷基，烯烃，醚，和单甘油酯硫酸酯，和磺基琥珀酸酯(或盐)，(c)非离子去垢剂如，例如，脂肪胺氧化物，脂肪酸链烷醇酰胺，和聚乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性去垢剂如，例如，烷基-β-氨基丙酸酯(或盐)，和2-烷基-咪唑啉季铵盐，和(e)它们的混合物。

肠胃外制剂将典型地包含例如约0.5重量％至约25重量％的溶液中的本发明的CAR材料。可以使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射位点处的刺激，所述组合物可以包含一种或多种非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂具有例如约12至约17的亲水亲油平衡值(HLB)。表面活性剂在所述制剂中的量典型地为例如约5重量％至约15重量％。合适的表面活性剂包括聚乙二醇脱水山梨醇脂肪酸酯，如单油酸脱水山梨醇酯和环氧乙烷与通过缩合环氧丙烷和丙二醇形成的疏水基质的高分子量加合物。肠胃外制剂可以被提供在单位剂量或多剂量的密封容器如安瓿和小药瓶中，并且可以存储在冷冻干燥(冻干)条件中，其仅需要在使用前的即刻添加注射用无菌液体赋形剂，例如，水。临时注射溶液和混悬剂可以制备自之前所述类型的无菌粉剂、粒剂和片剂。

可注射制剂是根据本发明的一个实施方案。对用于可注射组合物的有效药物载体的需要是本领域技术人员已知的(见，例如，Pharmaceutics andPharmacy Practice(药物和药学实践),J.B.Lippincott Company,Philadelphia,PA,Banker和Chalmers编辑,第238-250页(1982),以及ASHP Handbook onInjectable Drugs(关于可注射药物的ASHP手册),Toissel,第4版,第622-630页(1986))。

局部制剂(包括可用于透皮药物释放的那些)是本领域技术人员众所周知的，且在本发明的实施方案的背景下适合施用于皮肤。本发明的CAR材料(单独地或者与其它合适的组分组合地)可以被制成经由吸入给药的气溶胶制剂。这些气溶胶制剂可以被置于加压可用的推进剂(诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等)中。它们也可以被制成用于非加压制剂的药物，如在喷雾器或雾化器中。所述喷雾制剂也可以用于对粘膜喷雾。

“有效量”或“有效地治疗……的量”表示，足以预防或治疗个体中的癌症的剂量。对于治疗或预防用途而言有效的量将取决于，例如，要治疗的疾病或障碍的阶段和严重程度，患者的年龄、重量和一般健康情况，以及处方医师的判断。剂量的大小也将取决于：选择的活性剂，施用方法，施用时机和频率，可能伴随特定活性剂的施用的任何不利副作用的存在、性质和程度，以及期望的生理效应。本领域技术人员会明白，不同的疾病或障碍可能需要包括多次施用的长期治疗，可能在每轮或不同轮施用中使用本发明的CAR材料。作为示例且无意限制本发明，本发明的CAR材料的剂量可以是约0.001至约1000mg/kg要治疗的受试者的体重/天，约0.01至约10mg/kg体重/天，约0.01mg至约1mg/kg体重/天。在本发明的一个实施方案中，所述剂量可以是约1x 10⁴至约1x 10⁸个表达本发明的CAR材料的细胞/千克体重。当本发明的CAR材料是宿主细胞时，宿主细胞的一种示例性剂量可以是100万个细胞(1mg细胞/剂)的最小值。当本发明的CAR材料是被包装在病毒中的核酸时，病毒的一种示例性剂量可以是1ng/剂。

就本发明的目的而言，施用的本发明的CAR材料的量或剂量应当足以在合理的时间范围内在受试者或动物中产生治疗或预防应答。例如，本发明的CAR材料的剂量应当足以在自给药起的约2小时或更长(例如，约12至约24小时或更多小时)的时段内结合抗原，或检测、治疗或预防疾病。在某些实施方案中，时间段可以更长。剂量将取决于特定本发明的CAR材料的效力和动物(例如，人)的状态，以及待治疗的动物(例如，人)的体重。

就本发明的目的而言，这样的测定可以用于确定向哺乳动物施用的起始剂量：所述测定包含例如，在各自被施用不同剂量的T细胞的一组哺乳动物之间，比较在向所述哺乳动物施用给定剂量的所述T细胞后，靶细胞被裂解的程度和/或表达本发明的CAR的T细胞分泌IFN-γ的程度。施用特定剂量后靶细胞裂解的程度和/或IFN-γ分泌的程度可以通过本领域中已知的方法测定。

除了前述药物组合物以外，本发明的CAR材料可以被配制为包合络合物，诸如环糊精包合络合物或脂质体。脂质体可以用于将本发明的CAR材料靶向特定组织。脂质体也可以用于增加本发明的CAR材料的半衰期。许多方法可用于制备脂质体，如在例如下述文献中所述：Szoka等,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9,467(1980)和美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369。

在本发明的实施方案的背景下有用的递送系统可以包括限时释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得本发明的组合物的递送提前发生，且具有足够的时间以造成要治疗的部位的致敏。本发明的组合物可以与其它治疗剂或疗法结合使用。这样的系统可以避免本发明的组合物的重复施用，由此增加受试者和医师的便利，且可以特别适合用于本发明的某些组合物实施方案。

许多类型的释放递送系统是本领域普通技术人员可利用的和已知的。它们包括基于聚合物的系统，诸如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酸酐。含有药物的前述聚合物的微胶囊描述于，例如，美国专利5,075,109。递送系统也包括非聚合物系统，其为：脂质，包括甾醇诸如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或者中性脂肪例如甘油一酯、甘油二脂和甘油三酯；水凝胶释放系统；硅橡胶(sylastic)系统；基于肽的系统；蜡包被物；使用常规粘合剂和赋形剂的压制片剂；局部融合的植入物；等。具体例子包括但不限于：(a)侵蚀系统，其中活性组合物以在基质内的形式被包含，诸如在美国专利4,452,775、4,667,014、4,748,034和5,239,660中描述的那些，以及(b)扩散系统，其中活性组分以受控速率从聚合物渗透，例如在美国专利3,832,253和3,854,480中描述的那些。另外，可以使用基于泵的硬件递送系统，其中的一些适合用于植入。

本领域技术人员将容易理解，本发明的CAR材料可以以任何数量的方式修饰，以致本发明的CAR材料的治疗或预防效力通过所述修饰而增加。例如，本发明的CAR材料可以通过连接部分直接或间接与靶向部分缀合。将化合物(例如本发明的CAR材料)缀合到靶向部分的实践是本领域中已知的。见，例如，Wadwa等，J.Drug Targeting 3:111(1995)和美国专利5,087,616。

可替换地，本发明的CAR材料可以被改变成贮库(depot)形式，以致本发明的CAR材料释放到其被给药于的身体中的方式关于时间和体内的位置被控制(见，例如，美国专利4,450,150)。本发明的CAR材料的贮库形式可以是，例如，可植入组合物，所述可植入组合物包含本发明的CAR材料和多孔或非多孔材料，如聚合物，其中本发明的CAR材料被所述材料包封或通过所述材料和/或非多孔材料的分解扩散。然后贮库被植入到所需的体内位置中，并且本发明的CAR材料以预定的速率从所述植入物释放。

当本发明的CAR材料与一种或多种其它治疗剂一起施用时，可以将一种或多种其它治疗剂共同施用给哺乳动物。“共同施用”是指，在时间上足够靠近地施用一种或多种其它治疗剂和本发明的CAR材料，使得本发明的CAR材料可以增强一种或多种其它治疗剂的作用，或反之亦然。在这点上，可以首先施用本发明的CAR材料，并可以然后施用一种或多种其它治疗剂，或反之亦然。可替换地，可以同时地施用本发明的CAR材料和一种或多种其它治疗剂。

可以与CAR材料共同施用的一种示例性的治疗剂是T细胞活性的细胞因子，诸如IL-2。据信，IL-2会增强本发明的CAR材料的治疗效果。不受限于特定理论或机制，据信，IL-2会通过增强表达本发明的CAR的细胞的数目和/或效应子功能的体内扩增而增强治疗。其它示例性的细胞因子包括IL-7和IL-15。为了本发明的方法(其中将宿主细胞或细胞群体施用给宿主)的目的，所述细胞可以是哺乳动物同种异体的细胞或哺乳动物自体的细胞。

预见到，本发明的CAR材料可以用在治疗或预防哺乳动物中的疾病的方法中。不受限于特定理论或机制，本发明的CAR具有生物活性，例如，识别抗原(例如，TSLPR)的能力，使得当CAR被细胞表达时，所述CAR能够介导针对表达所述CAR对其具有特异性的抗原(例如，TSLPR)的细胞的免疫应答。在这点上，本发明的一个实施方案提供了一种治疗或预防哺乳动物的癌症的方法，所述方法包括：以有效地治疗或预防哺乳动物的癌症的量，给所述哺乳动物施用CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体和/或其抗原结合部分和/或本发明的药物组合物。

本发明的一个实施方案进一步包括，在施用本发明的CAR材料之前，使宿主淋巴细胞耗竭。淋巴细胞耗竭的例子包括、但是可以不限于：非骨髓根除的淋巴细胞耗竭化学疗法、骨髓根除的淋巴细胞耗竭化学疗法、全身辐照等。

为了本发明的方法(其中施用宿主细胞或细胞群体)的目的，所述细胞可以是哺乳动物同种异体细胞或哺乳动物自体细胞。优选地，所述细胞是哺乳动物自体细胞。

在本文中提及的哺乳动物可以是任何哺乳动物。本文中使用的术语“哺乳动物”表示任何哺乳动物，包括、但不限于，啮齿目(order Rodentia)的哺乳动物，如小鼠和仓鼠，和兔形目(order Logomorpha)的哺乳动物，如兔子。所述哺乳动物可以来自食肉目(order Carnivora)，包括猫科(猫)和犬科(狗)。所述哺乳动物可以来自偶蹄目(order Artiodactyla)，包括牛科(牛)和猪科(猪)，或奇蹄目(order Perssodactyla)，包括马科(马)。最优选的是，所述哺乳动物可以是灵长目(order Primates)、Ceboids或Simoids(猴)，或类人目(order Anthropoids)(人和猿)。优选地，所述哺乳动物是人。

关于本发明的方法，所述癌症可以是任何癌症，包括下述的任一种：急性淋巴细胞癌，急性髓性白血病，小泡型横纹肌肉瘤，膀胱癌(例如，膀胱癌)，骨癌，脑癌(例如，髓母细胞瘤)，乳腺癌，肛门、肛管或肛门直肠的癌症，眼睛的癌症，肝内胆管的癌症，关节的癌症，颈、胆囊或胸膜的癌症，鼻、鼻腔或中耳的癌症，口腔的癌症，外阴的癌症，慢性淋巴细胞白血病，慢性骨髓癌，结肠癌，食管癌，宫颈癌，纤维肉瘤，胃肠类癌瘤，头颈癌(例如，头颈鳞状细胞癌)，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，肾癌，喉癌，白血病，液体肿瘤，肝癌，肺癌(例如，非小细胞肺癌和肺腺癌)，淋巴瘤，间皮瘤，肥大细胞瘤，黑素瘤，多发性骨髓瘤，鼻咽癌，非霍奇金淋巴瘤，B-慢性淋巴细胞白血病，毛细胞白血病，急性淋巴细胞白血病(ALL)，和伯基特淋巴瘤，卵巢癌，胰腺癌，腹膜，网膜，和肠系膜癌，咽癌，前列腺癌，直肠癌，肾癌，皮肤癌，小肠癌，软组织癌，实体瘤，滑膜肉瘤，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，和输尿管癌。优选地，所述癌症的特征在于TSLPR的表达。

本文中使用的术语“治疗”和“预防”以及从其衍生的词语不一定意味100％或完全的治疗或预防。而是，有不同程度的治疗或预防，本领域技术人员承认其具有潜在的有利或治疗效果。在这点上，本发明的方法可以提供任何量或任何水平的对哺乳动物癌症的治疗或预防。此外，本发明的方法提供的治疗或预防可以包括治疗或预防被治疗或预防的疾病(例如癌症)的一种或多种病症或征状。并且，就本文的目的而言，“预防”可以包括延迟疾病或其征状或病症的发作。

本发明的另一个实施方案提供了一种检测癌症在哺乳动物中的存在的方法，所述方法包括：(a)使包含一个或多个得自哺乳动物的细胞的样品与本发明的CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体、和/或其抗原结合部分或本发明的药物组合物接触，由此形成复合物，(b)和检测所述复合物，其中所述复合物的检测指示癌症在哺乳动物中的存在。

本发明的另一个实施方案包括一种确定具有增生性病症的受试者是否是使用包含对TSLPR特异性的抗原结合结构域的嵌合抗原受体进行治疗的候选对象的方法，所述方法包括：测量得自所述受试者的生物样品中的TSLPR表达水平；和确定所述生物样品的TSLPR表达水平与得自没有增生性病症的对照受试者的样品相比是否增加。

所述样品可以通过任意合适的方法得到，例如，活组织检查或尸检。活组织检查是从个体取出组织和/或细胞。这样的取出可以是从个体收集组织和/或细胞，以便对取出的组织和/或细胞进行实验。该实验可以包括确定个体是否具有和/或正在遭受某种病症或疾病状态的实验。所述病症或疾病可以是例如癌症。

关于本发明的检测增生性病症(例如，癌症)在哺乳动物中的存在的方法的一个实施方案，所述包含哺乳动物细胞的样品可以是含有全细胞、其裂解物或全细胞裂解物的级分(例如，细胞核或细胞质级分、全蛋白级分、或核酸级分)的样品。如果样品包含整个细胞，所述细胞可以是哺乳动物的任意细胞，例如，任意器官或组织的细胞，包括血细胞或内皮细胞。

所述接触可以发生在相对于哺乳动物的体外或体内。优选地，接触是在体外。

并且，对复合物的检测可以通过本领域中已知的任何数量的方式发生。例如，本文所述的本发明的CAR、多肽、蛋白、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群或抗体或其抗原结合部分，可以被可检测的标记物标记，例如，放射性同位素，荧光团(例如，荧光素异硫氰酸酯(FITC)，藻红蛋白(PE))，酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化酶)，和元素颗粒(例如，金颗粒)。

针对识别靶细胞的能力和抗原特异性来试验CAR的方法是本领域已知的。例如，Clay等,J.Immunol.,163:507-513(1999)教导了测量细胞因子(例如，干扰素-γ、粒细胞/单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)或白介素2(IL-2))的释放的方法。另外，如在Zhao等,J.Immunol.,174:4415-4423(2005)中所述，可以通过测量细胞的细胞毒性来评价CAR功能。

本发明的另一个实施方案提供了本发明的CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体或其抗原结合部分和/或药物组合物用于治疗或预防哺乳动物中的增生性病症(例如，癌症)的用途。所述癌症可以是本文描述的任何癌症。优选地，所述癌症是BCP-ALL。

下述实施例进一步举例说明本发明，但是，当然不应该解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

本实施例例证了3G11TSLPR CAR-短3G11(SEQ ID NO:39和43)和长3G11(SEQ ID NO:40和44)的制备和试验。前导序列最先被编码，并增强向细胞表面的运输。它可能在成熟形式中被切掉。

使用以下B细胞急性成淋巴细胞性白血病(ALL)细胞系：MUTZ-5(DSMZ ACC 490)、REH-TSLPR(用人TSLPR转导)和REH，作为TSLPR阴性对照。给培养基中的细胞系培养物补充10％热灭活的FBS(GeminiBioproducts,West Sacramento,CA,USA)、10mM HEPES、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素、2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。在DMEM(Invitrogen)中培养293T逆转录病毒载体包装细胞系(Clonetech,Mountain View,CA,USA)。另外，天然地过表达TSLPR的前-B细胞ALL异种移植物JH331、JH352、NH362用作体内模型。这些是患者同意以后在IRB批准的方案上建立的患者衍生的ALL异种移植物。根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki.)在知情同意以后在NIH IRB批准的方案下，从NIH临床中心(NIH Clinical Center)的输血医学部(Department ofTransfusion Medicine)得到来自健康供体的人PBMC。在含有5％FBS的AIMV中培养人PBMC。

TSLPR嵌合抗原受体的构建。从生产抗-TSLPR的杂交瘤3G11(Lu等,J.Exp.Med.,2009,206:2111-2119,通过引用并入本文)确定结合TSLPR的单链片段可变(scFv)序列。在含有丙酮酸钠(1mM)、青霉素链霉素(青霉素/链霉素)和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养3G11。当所述细胞准备好分裂时，将培养基换成RPMI培养基+丙酮酸钠、青霉素/链霉素和5％的得自GIBCO的超低IgG FBS(Grand Island,NY,USA；目录号16250)，用于抗体生产或收获细胞用于总RNA提取。用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Valencia,CA,USA)提取3G11总RNA，然后用SuperScript III(Invitrogen)逆转录成cDNA。随后将cDNA与以下物质的组合一起用于PCR扩增：来自重链可变区的退火引物和重链可变区(V_H)的恒定γ链，和类似地，来自κ可变区的退火引物和来自κ轻链(V_L)的κ链恒定区的特异性引物(Kettleborough等，Eur.J.Immunol.，1993，23:206-211，通过引用整体并入本文)。所述PCR试剂购自Roche Diagnostics(PCR Buffer Set，Indianapolis，IN，USA)或New England BioLabs(One Taq DNA Polymerase，Ipswich，MA，USA)。将以下PCR条件用于扩增：95℃保持1min，35个(95℃保持15秒、50℃保持30秒、68℃保持45秒)循环，最后在68℃延伸5min。将得到的PCR产物进行凝胶纯化，并克隆进TOPO载体(用于测序的TOPO TA克隆试剂盒，Invitrogen)中，然后转化进OneTOP10化学感受态的大肠杆菌(Invitrogen)中。挑选单个克隆用于微量制备，并将得到的质粒用于测序分析。为了克服在重链可变区的开始处的二级结构，设计了一种新的抗体亚型特异性的反向引物，其更接近5’的开始以与在5’末端处的退火引物组合用于扩增V_H的5’区域。以1M使用PCR促进剂Betaine来促进PCR反应。为了构建长CAR构建体，包括来自IGHG1的CH2CH3结构域(gb|AAC82527.1氨基酸98-329)。包括编码T-细胞表面糖蛋白CD8α链的scFv的前导序列以促进膜运输。将编码CAR的氨基酸序列逆翻译，密码子优化，并合成为单个构建体(DNA2.0，Menlo Park，CA，USA)。然后将这些构建体亚克隆进含有CD8跨膜结构域、41BB(CD137)信号传递结构域和CD3zeta结构域的第三代慢病毒质粒(pELNS-19BBzeta)(以前描述在Hudecek等，“The non-signaling extracellular spacer domain of chimericantigen receptors is decisive for in vivo antitumor activity,”Cancer Immunol.Res.,2014和Milone等,Molecular Therapy,2009,17(8):1453-1464，它们中的每一篇通过引用并入本文)中。

慢病毒载体生产和T细胞转导。如以前在Hudecek等(出处同上)和Milone等(出处同上)中所述，通过293T细胞系的瞬时转染来生产编码TSLPR CAR的慢病毒载体。简而言之，将293T细胞铺板在聚-D赖氨酸包被的15cm平板(BD Bioscience,San Jose,CA,USA)上。次日，使用lipofectamine 2000(Invitrogen)用编码TSLPR CAR的质粒与由R.Morgan博士(Surgery Branch,Center for Cancer Research,NCI,NIH)友情提供的包装和外壳载体pMDLg/pRRE、pMD-G和pRSV-Rev一起转染293T细胞。在转染后48-72小时收集慢病毒上清液，在3000RPM离心10分钟以除去细胞碎片，然后在-80℃储存。将来自正常供体的人PBMC用在含有40IU/mL重组IL-2(替西白介素,rhIL-2；Roche，Indianapolis,IN,USA)的AIM-V培养基中的1:1比例的CD3/CD28微珠(Invitrogen)活化24小时。将活化的T细胞以200万细胞/(3ml慢病毒上清液+1ml含有10μg/ml硫酸鱼精蛋白和40IU/ml IL2的新鲜AIM-V培养基)再悬浮，并在6-孔平板中培养。将平板在32℃在1000g离心2小时，然后在37℃温育过夜。次日进行第二次转导。在转导以后第三天，除去CD3/CD28珠子，并将细胞在含有100IU/mL IL-2的AIM-V中以300,000个细胞/mL培养，每2-3天添加新鲜的含有IL2的培养基，直到第8或9天收获。

流式细胞计量术分析。使用TSLPR-Fc(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)通过流式细胞计量术确定CAR转导的T细胞的表面表达，随后与对人IgG-Fc特异性的PE-F(ab)₂或APC-F(ab)₂(Jackson ImmunoResearchLaboratories,West Grove,PA,USA)一起温育。可替换地，使用生物素缀合的蛋白L(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)检测与抗生蛋白链菌素-缀合的PE(BD Bioscience)一起温育以后的CAR表达。使用下述抗-人抗体检测CD19、CD22和TSLPR在白血病系上的表达：CD45-PerCP-Cy5.5(eBioscience,San Diego,CA,USA)、CD19-Pac-Blue、CD19-APC-Cy7、CD10_PE-Cy7和CD22-PE、TSLPR-APC(BioLegend，San Diego，CA，USA)，并用下述抗体表征T细胞：CD3-APC-Cy7、CCR7-FITC(CD197)、CD45RA-APC、CD4-PacBlue(BioLegend)、CD45-PerCP-Cy5.5(eBioscience)、CD8-V500(BD，Franklin Lakes，NJ，USA)。用山羊-抗-小鼠-PE(BD BioScience)检测3G11杂交瘤上清液与TSLPR表达ALL系的结合。通过用Fixable Viability Dye506(eBioscience)染色，排除死细胞。

细胞的细胞毒性和细胞因子测定。REH-TSLPR和MUTZ5细胞系都表达高水平的TSLPR。使用REH作为TSLPR表达的阴性对照。将靶细胞用100uCi⁵¹Cr(Perkin Elmer，Waltham，MA，USA)标记1小时。洗涤以后，将5，000个靶标/孔与珠子纯化的Pan T Cell II分离试剂盒(Miltenyi Biotec，SanDiego，CA，USA)转导的T细胞一起以不同的效应物:靶标(E:T)比率共温育4-6小时。使用LumaPlates(Perkin Elmer)和Top Count Reader(Packard，Meriden,CT)，将测定上清液针对⁵¹Cr释放进行计数。如下计算特异性裂解：％裂解＝(实验性裂解-自发裂解)/(最大裂解-自发裂解)X 100。在24-小时以后使用多路测定(Meso Scale Discovery,Rockville,MD,USA)确定上清液中的细胞因子水平。对于包括K562细胞的研究，K562细胞是永生化的人骨髓内产生的(myelogenous)红白血病。它们不在细胞表面上表达TSLPR，且通常用于检测NK活性。使用K562和REH作为阴性靶对照，使用REH-TSLPR和MUTZ5作为阳性靶对照。CAR转导的T细胞是用Pan-T分离试剂盒NK耗竭的，并然后与不同的靶细胞一起温育。对于细胞因子生产，使用以下方案：计数靶细胞并洗涤3次和以1E6/ml再悬浮在RPMI中，并将100ul放入96-孔板的每个孔中(最终1E5/孔)；计数转导的T细胞并洗涤3次和以1E6/ml再悬浮在RPMI中，并将100ul放入96-孔板的每个孔中(最终1E5/孔)；建立单独的T细胞和单独的肿瘤细胞；在37℃温育24小时，并收获100ul上清液用于试验细胞因子生产。所有样品一式三份。

体内研究。在NCI Bethesda Animal Care&Use Committee批准的方案下进行动物研究。将前B细胞ALL细胞系和异种移植物静脉内注射进NSG小鼠(NOD scidγ,NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ JAX,JacksonImmunoResearch Laboratories)中。对于表达萤光素酶的系，使用XenogenIVIS Lumina(Caliper Life Sciences)检测白血病。给NSG小鼠腹膜内地注射3mg D-萤光素(Caliper Life Sciences)，并在6分钟以后以3min的曝光时间获取图像。使用Living Image Version 4.1软件(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA,USA)分析每只小鼠的生物发光信号，作为光子/s/cm²/sr。用外周血或骨髓的流式细胞计量术跟踪不表达萤光素酶的异种移植物。

证实了3G11杂交瘤生产的抗-TSLPR抗体与过表达TSLPR的前体-B细胞急性成淋巴细胞性白血病(“TSLPRhi ALL”)的结合(图1)。图2显示了通过市售的TSLPR抗体确定的表达。然后确定了重链和轻链可变区(Fv)的序列。使用甘氨酸接头构建单链Fv(scFv)序列，并插入编码CD8α铰链和CD8跨膜区域(其具有CD3zeta和41BB(CD137)细胞内结构域)的嵌合抗原受体慢病毒载体主链中(图3和4)。因为scFv到T细胞表面的距离可能影响CAR功能，所以还为“长”CAR制备了含有在scFv和跨膜序列之间的免疫球蛋白CH2CH3间隔区结构域的构建体。然后使用编码TSLPRCAR的慢病毒载体转导CD3/CD28珠子活化的人T细胞，从而导致高基因转移效率，如通过蛋白L和TSLPR Fc融合蛋白所检测到的(图5A和5B)。尽管转导发生在培养的第2和3天，但是表达CAR的T细胞的比例在后续培养过程中增加，从而提示表达CAR构建体的T细胞的优先存活或繁殖增强。TSLPR在免疫系统以外的正常组织中具有有限的表达。已经在树突细胞和活化的T细胞子集上发现了它。基于在正常儿科组织微阵列上的免疫组织化学，其中淋巴组织中分散的罕见细胞具有稳健的膜表达，可能代表树突细胞。在胰腺、肾小管细胞和结肠粘膜层中还存在一些染色，其中这些组织中的染色与细胞表面表达不一致。在心脏中不存在染色。如已经用一些原代前B ALL证实的，TSLPRhi ALL细胞系(MUTZ5)和人TSLPRhi异种移植物(JHH331)以与CD19和CD 22相当的水平表达TSLPR(图2)。

执行试验以确定用TSLPR CAR构建体转导的T细胞是否表现出对以下细胞系的活性：被转导成表达TSLPR的前B ALL细胞系REH(REH-TSLPR)以及天然地过表达TSLPR的ALL系(MUTZ5)。如在图6中所示，当与REH-TSLPR一起温育时，短和长CAR T细胞都产生高水平的干扰素γ(IFNγ)和肿瘤坏死因子α(TNFα)。另外，具有TSLPR CAR的T细胞在有TSLPR转导的ALL细胞和天然地过表达TSLPR的ALL细胞存在下生产宽范围的炎症性细胞因子(图7A-7H和8A-8E)。当测量TSLPR CART细胞的裂解能力时，短和长构建体表现出对REH-TSLPR的相等活性。但是，与长CAR相比，短TSLPR CAR介导MUTZ5的更大裂解，尽管在REH-TSLPR和MUTZ5上存在相当的TSLPR水平(图2和9A-D)。

接下来试验了TSLPR CAR T细胞在输入小鼠中时减轻ALL的能力，所述小鼠带有过表达TSLPR的ALL。静脉内注射表达萤光素酶的REH-TSLPR以后4天，可检测到低水平的白血病。15x 10⁶个短CAR T细胞的注射似乎会完全减轻ALL，如通过成像(图10)和通过白血病注射以后第12天外周血的流式细胞计量术(关于CD45+/GFP+细胞的存在)所判断的(图11)。令人感兴趣的是，尽管对REH-TSLPR的体外活性相等，但是通过成像判断长CAR T细胞对小鼠中的白血病进展具有微小影响，有证据表明与接受GFP转导T细胞的小鼠相比在外周血中减少的白血病负担(尽管不是统计上不同的)。为了确定长和短CAR构建体的不同活性的原因，通过流式细胞计量术研究了CAR T细胞持久性，并且发现短CAR T细胞与长CAR T细胞相比以更大的数目存在于外周血中(图12A-B)。图12B显示了TSLPR Fc相对于CD8。CAR T相对于CD45显示了以下结果：在第16天，短CAR T细胞是在3.02％(CD45子集的5.36％)，长CAR T细胞是在0.038％(CD45子集的0.213％)；在第27天，短CAR T细胞是在44.1％(CD45子集的89.4％)，且长CAR T细胞是在2.14％(CD45子集的7.54％)。令人感兴趣的是，短CAR T细胞在外周血中以更大数目的存在在较后的时间点是最显著的，尽管维持TSLPR表达的ALL在接受长TSLPRCAR T细胞的小鼠中发生进展。因而，与长构建体相比用短TSLPR CAR构建体观察到的活性的显著增加与表达短CAR的T细胞的更大持久性有关。

为了在更确定的白血病中试验短TSLPR CAR T细胞，将输注延迟至REH-TSLPR注射以后第16天(图13)。值得注意的是，10x10⁶个短TSLPRCAR T细胞仍然能够诱导在大多数小鼠中维持至第40天的TSLPRhi ALL的快速清除(图13)。重要的是，没有证据表明当没有被TSLPR CAR T细胞过表达(“TSLPRlo ALL”)时TSLPR的进展的任何改变，从而证实了活性依赖于CAR靶标的表达。用短TSLPR CAR T细胞治疗的小鼠中复发的分析证实了CD19、CD10和TSLPR的保持表达，从而指示失效不是由于抗原的损失。与CD4+T细胞相比，CD8+T细胞通常表现出更大的体外裂解功能且被认为是体内直接抗肿瘤活性的重要介质。令人感兴趣的是，尽管在这些实验中使用的体外繁殖方案导致在第50天之前在输注之前CD4+T细胞的优势，但是CD8+T细胞显著地繁殖并代表在体内最大的T细胞子集(图14)。这种CD8+表达CAR的T细胞的繁殖在第50天之前与表面标志物的表达(其与效应物表型相关)有关(图15，显示了TSLPR CAR的物理分布)。还有高百分比的具有CCR7+/CD45RA表型的CAR T细胞，其与中央记忆的子集有关，被认为对于持久性和持续的抗肿瘤活性而言是重要的。

执行体内短CAR T细胞剂量滴定以确定观察到活性的范围和短TSLPR是否会减轻建立的白血病。如在图16A-C中所示，在15x 10⁶个细胞/小鼠的短TSLPR CAR细胞极大地减轻了ALL，在5-10x 10⁶个细胞/小鼠具有明显的活性，且在低至1x 10⁶个细胞/小鼠具有一些活性，特别地记作改善的存活(图16C)。在输注长CAR T细胞以后还观察到微小活性，与GFP T细胞相比在外周血中的白血病负担(图11)和在第6天的萤光素酶活性(图16B)仅稍微下降，但是继续在任何较晚的时间点在两个组之间没有差异，这与长CAR T细胞的失效相一致。

在天然地过表达TSLPR的前-B细胞ALL的3种异种移植物模型中试验了短TSLPR构建体。如在图17中所示，短TSLPR CAR极大地减轻了表达萤光素酶的人ALL TSLPRhi异种移植物。短TSLPR CAR也极大地减轻了来自小鼠的血液和骨髓的另外的TSLPRhi异种移植物(图18A和18B)。

图19表明短TSLPR CAR可以用低至120万CAR T细胞减轻患者异种移植物中的ALL。图20的点图显示了存在于小鼠血液样品中的CAR T细胞的百分比。图21显示了体内注射以后CAR T细胞的CD4至CD8的转移。

针对侵袭性的TSLPR ALL试验了短TSLPR CAR，其在静脉内注射进NSG小鼠以后60天之前导致致死。在第1天将100万侵袭性的TSLPRhiALL细胞静脉内地注射进NSG小鼠中，然后在第14天用120万TSLPRCAR+T细胞治疗。短TSLPR CAR表现出有效的活性(图22-25)，从而导致在早至CAR注射以后第14天脾肿大的减轻以及脾和血液中胚细胞计数的减少。令人感兴趣的是，尽管似乎在骨髓中也存在活性，白血病的清除不太迅速，并且在该早期评价时间不是统计上显著的。但是，CAR治疗与侵袭性TSLPRhi ALL的最终清除和延长的存活有关。

将短TSLPR CAR活性的活性与含有相同scFv(FM68scFv-CD8-CD137-CD3zeta)的CD19CAR和CD22CAR构建体(m971scFv-CD8-CD137-CD3zeta)的活性进行了对比。全都具有相同的41BB共刺激结构域，并导致可比较的转导效率。在减少JHH331Luc TSLPRhi异种移植物方面，短TSLPR CAR与CD19和CD22CAR相当(图24)。

实施例2

本实施例例证了两种另外的TSLPR CAR(短2D10(SEQ ID NO:41和45)和长2D10(SEQ ID NO:42和46))的试验以及与实施例1的CAR的对比。前导序列最先被编码，并增强向细胞表面的运输。它可能在成熟形式中被切掉。

通常遵循实施例1的方法。

图25A-C和26呈现了结果。图25A-C显示了当与表达TSLPR的白血病细胞系一起温育时用不同的TSLPR CAR构建体转导的T细胞的细胞裂解功能，其中REH用作负表达系。图26显示了不同的CAR构建体在体内的治疗功能。

在本文中引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)特此通过引用并入，达到与个别地且明确地指出每篇参考文献通过引用并入并且在本文中完全阐述相同的程度。

术语“一个/种”和“所述”和“至少一个/种”和类似所指物在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)的应用应当解释为覆盖单数和复数，除非在本文中另外指出或与上下文明显矛盾。与一个或多个项目结合使用的术语“至少一个/种”(例如，“A和B中的至少一个/种”)应当解释为是指选自列出的项目的一个项目(A或B)或列出的项目中的两个或更多个的任意组合(A和B)，除非在本文中另外指出或与上下文明显矛盾。除非另外指出，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应当解释为末端开放的术语(即，意指“包括、但不限于”)。并且，每当叙述“包含”(或它的等同词)时，“包含”视作包括“基本上由……组成”和“由……组成”。因而，一个“包含”(一个)要素的实施方案支持“基本上由列举的要素组成”和“由列举的要素组成”的实施方案。每当叙述“基本上由……组成”时，视作包括“由……组成”。因而，一个“基本上由(一个)要素组成”的实施方案支持“由列举的要素组成”的实施方案。除非在本文中另外指出，否则本文中数值范围的列举仅意图充当个别地提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，且每个单独值如同在本文中个别地阐述一样并入说明书中。可以以任意合适的次序执行本文描述的所有方法，除非在本文中另外指出或以其它方式与上下文明显矛盾。本文提供的任意和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用，仅仅意图更好地阐释本发明，且不构成对本发明范围的限制，除非另有声明。在说明书中的语言不应解释为，指示任何没有声明的要素是实践本发明所必需的。

本文描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。本领域普通技术人员在阅读前述描述以后，那些优选实施方案的变化可以变得显而易见。发明人预见到技术人员会根据需要采用这样的变体，并且本发明的发明人会以不同于本文具体描述的方式实现。因此，本发明包括适用法律允许的、所附权利要求阐明的主题的所有改进方案和等同方案。此外，本发明包括上述元件以其所有可能变化的任意组合，除非本文另外指明或者以其它方式与上下文明显矛盾。

Claims (26)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含对TSLPR特异性的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内T细胞信号传递结构域。

2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:18、20、22、24、25、27和29或SEQ ID NO:19、21、23、24、26、28和29的序列的轻链可变区。

3.根据权利要求1或2所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:6、7、9、10、11、13和15或SEQ ID NO；6、8、9、10、12、14和16的序列的重链可变区。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:17的接头序列。

5.根据权利要求1-4中的任一项所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:1。

6.根据权利要求1-5中的任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含CD8氨基酸序列。

7.根据权利要求1-6中的任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域包含含有SEQ ID NO:35的CD8α铰链序列和SEQ ID NO:36的跨膜结构域序列的CD8氨基酸序列。

8.根据权利要求1-7中的任一项所述的CAR，其中所述细胞内T细胞信号传递结构域包含4-1BB、CD3ζ或二者。

9.根据权利要求1-8中的任一项所述的CAR，其中所述细胞内T细胞信号传递结构域包含SEQ ID NO:37的4-1BB氨基酸序列。

10.根据权利要求1-9中的任一项所述的CAR，其中所述细胞内T细胞信号传递结构域包含SEQ ID NO:38的CD3ζ氨基酸序列。

11.根据权利要求1-10中的任一项所述的CAR，其中所述CAR还包含含有SEQ ID NO:30-33的间隔区。

12.根据权利要求1所述的CAR，其中所述CAR包含SEQ ID NO:39-46的序列中的任一个。

13.一种核酸，其包含编码根据权利要求1-12中的任一项所述的CAR的核苷酸序列。

14.根据权利要求13所述的核酸，其中所述核苷酸序列经过密码子优化。

15.一种重组表达载体，其包含根据权利要求13或14所述的核酸。

16.根据权利要求15所述的重组表达载体，其中所述重组表达载体是慢病毒载体。

17.一种分离的宿主细胞，其包含根据权利要求15或16所述的重组表达载体。

18.包含至少一个根据权利要求17所述的宿主细胞的细胞群体。

19.特异性地结合根据权利要求1-12中的任一项所述的CAR的抗体或其抗原结合部分。

20.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-12中的任一项所述的CAR、根据权利要求13或14所述的核酸、根据权利要求15或16所述的重组表达载体、根据权利要求17所述的宿主细胞、根据权利要求18所述的细胞群体、或根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。

21.一种检测癌症的存在的方法，所述方法包括：

(a)使包含一个或多个细胞的样品与根据权利要求1-12中的任一项所述的CAR、根据权利要求13或14所述的核酸、根据权利要求15或16所述的重组表达载体、根据权利要求17所述的宿主细胞、根据权利要求18所述的细胞群体、或根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合部分、或根据权利要求20所述的药物组合物接触，由此形成复合物，和

(b)检测所述复合物，其中所述复合物的检测指示癌症的存在。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述癌症是BCP-ALL。

23.用于治疗或预防哺乳动物中的癌症的根据权利要求1-12中的任一项所述的CAR、根据权利要求13或14所述的核酸、根据权利要求15或16所述的重组表达载体、根据权利要求17所述的宿主细胞、根据权利要求18所述的细胞群体、或根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合部分、或根据权利要求20所述的药物组合物。

24.根据权利要求23所述的CAR、核酸、重组表达载体、宿主细胞、细胞群体、抗体或其抗原结合部分、或药物组合物，其中所述癌症是BCP-ALL。

25.用于治疗或预防哺乳动物中的增生性病症的根据权利要求1-12中的任一项所述的CAR、根据权利要求13或14所述的核酸、根据权利要求15或16所述的重组表达载体、根据权利要求17所述的宿主细胞、根据权利要求18所述的细胞群体、或根据权利要求19所述的抗体或其抗原结合部分、或根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述增生性病症与IKZF基因中的突变有关。

26.一种确定具有增生性病症的受试者是否是使用包含对TSLPR特异性的抗原结合结构域的嵌合抗原受体的治疗的候选对象的方法，所述方法包括：测量来自所述受试者的生物样品中的TSLPR表达水平；和确定所述生物样品的TSLPR表达水平与来自没有增生性病症的对照受试者的样品相比是否增加。