ES2382777T3

ES2382777T3 - Receptor de células T quimérico y materiales relacionados y métodos de uso

Info

Publication number: ES2382777T3
Application number: ES07797329T
Authority: ES
Inventors: Richard A. Morgan; Cyrille J. Cohen; Steven A. Rosenberg
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2006-05-03
Filing date: 2007-05-03
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2027-05-03
Also published as: ATE550356T1; WO2007131092A2; WO2007131092A3; US20090304657A1; CA2651174A1; PT2016102E; AU2007248019B2; AU2007248019A1; EP2016102A2; EP2016102B1; DK2016102T3; US20130116167A1

Abstract

Célula humana que comprende un receptor de células T (TCR) quimérico que comprende una región variable de un TCR humano y una región constante que comprende al menos el dominio extracelular de una región constante de un TCR de huésped no humano, o una variante funcional del mismo, en el que la variante funcional tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 80% con el TCR quimérico y se une específicamente al antígeno para el que el TCR quimérico tiene especificidad antigénica.

Description

Receptor de células T quimérico y materiales relacionados y métodos de uso.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional estadounidense n.º 60/796.853, presentada el 3 de mayo de 2006.

Material presentado en disco compacto

Lista de secuencias de nucleótidos/aminoácidos legible por ordenador presentada simultáneamente con el presente documento e identificada tal como sigue: Un archivo de 211.000 bytes ASCII (texto) denominado “701228ST25.TX-T,” creado el 1 de mayo de 2007.

Antecedentes de la invención

Varios estudios han demostrado que es viable transducir genes del receptor de células T (TCR) en linfocitos humanos para redirigir la especificidad antigénica de poblaciones transducidas a antígenos de interés (revisado en Dembic et al., Nature, 320, 232-238 (1986), Schumacher, Nat. Rev. Immunol., 2, 512-519 (2002), Kershaw et al., Nat. Rev. Immunol., 5, 928-940 (2005), Xue et al., Clin. Exp. Immunol., 139, 167-172 (2005), Rossig et al., Mol. Ther., 10, 5-18 (2004), y Murphy et al., Immunity, 22, 403-414 (2005)). De particular interés es la reprogramación de linfocitos humanos para el tratamiento del cáncer, puesto que se ha mostrado que la inmunoterapia adoptiva celular media la regresión de tumores sólidos grandes en pacientes con melanoma metastásico (Dudley et al., Science, 298, 850-854 (2002), y (Dudley et al., J Clin. Oncol., 23, 2346-2357 (2005)). Sin embargo, una limitación de la inmunoterapia adoptiva es la necesidad de aislar y expandir linfocitos reactivos al tumor que existen previamente en el paciente. Por tanto, procedimientos de transferencia de TCR a linfocitos humanos pueden superar el requisito de inmunidad específica de tumor preexistente y la necesidad de identificar y aislar laboriosamente células T reactivas al tumor a partir de cada paciente. En este sentido, varios grupos han mostrado que es posible modificar por ingeniería genética linfocitos para que expresen TCR humanos que confieren actividad antitumoral novedosa (Morgan et al., J. Immunol., 171, 3287-3295 (2003), Hughes et al., Hum. Gene Ther., 16, 1-16 (2005), Zhao et al., J. Immunol., 174, 4415-4423 (2005), Roszkowski et al., Cancer Res., 65, 1570-1576 (2005), y Engels et al., Hum. Gene Ther., 16, 799-810 (2005)).

Un posible obstáculo en los enfoques de transferencia de genes de TCR es el apareamiento erróneo de las subunidades de TCR introducidas con las cadenas de TCR endógeno. El efecto inmediato de la competición entre subunidades de TCR exógeno y endógeno puede dar como resultado la reducción de la densidad en la superficie celular del TCR exógeno (Roszkowski et al., Cancer Res., 65, 1570-1576 (2005), Rubinstein et al., J. Immunol., 170, 1209-1217 (2003), Munthe et al., Cell Immunol., 170, 283-290 (1996), Blichfeldt et al., Eur. J. Immunol., 26, 28762884 (1996)). Adicionalmente, el apareamiento erróneo de las subunidades de TCR introducidas con las cadenas de TCR endógeno puede conducir a la formación de heterodímeros de TCR no deseados, tales como aquellos con posible autorreactividad (Schumacher, Nat. Rev. Immunol. 2: 512-519 (2002) y Xue et al., Clin. Exp. Immunol. 139: 167-172 (2002)).

En vista de lo anterior, hay una necesidad en la técnica de TCR mejorados y células que expresan tales TCR.

La invención proporciona tales TCR y células, especialmente para su uso en métodos de tratamiento o prevención de enfermedades, tales como cáncer.

Breve sumario de la invención

La invención proporciona TCR quiméricos que tienen propiedades biológicas potenciadas que proporcionan mayores respuestas de células T contra el antígeno reconocido por el TCR quimérico. Los TCR quiméricos de la invención comprenden una región variable de un TCR humano y una región constante que comprende al menos un dominio extracelular de una región constante de un TCR no humano, por ejemplo, un TCR murino.

La invención también proporciona variantes funcionales de los TCR quiméricos de la invención, teniendo las variantes funcionales una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 75% con el TCR quimérico y uniéndose específicamente al antígeno para el que el TCR quimérico tiene especificidad antigénica.

La invención proporciona además polipéptidos y proteínas relacionados con los TCR quiméricos de la invención y variantes funcionales descritas en el presente documento, así como ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para cualquiera de los TCR quiméricos de la invención, incluyendo variantes funcionales de los mismos, polipéptidos y proteínas. Se proporcionan además en el presente documento vectores de de expresión recombinantes relacionados, y células huésped, especialmente células huésped humanas.

También se proporcionan por la invención composiciones farmacéuticas que comprenden los TCR quiméricos de la invención, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células huésped y poblaciones de las mismas.

También se proporciona por la invención un método de tratamiento o prevención de una enfermedad, por ejemplo, cáncer o una enfermedad infecciosa, en un huésped. El método comprende administrar al huésped la composición farmacéutica de la invención en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la enfermedad en el huésped.

La invención proporciona además un método de detección de una célula enferma en un huésped. El método comprende (i) poner en contacto una muestra que comprende células del huésped con el TCR quimérico de la invención, proteína, vector de expresión recombinante, célula huésped o población de células huésped, formando de ese modo un complejo, y (ii) detectar el complejo, en el que la detección del complejo es indicativa de una célula enferma en el huésped.

Se proporciona además por la invención un método de mejora de la actividad biológica de un TCR humano. El método comprende reemplazar la región constante del TCR humano por una región constante que comprende al menos un dominio extracelular de una región constante de un TCR no humano.

Breve descripción de las varias vistas del/de los dibujo(s)

Las figuras 1A a 1I son representaciones esquemáticas de los TCR descritos en el presente documento. La figura 1A es una representación esquemática del TCR MM de p53, que es un TCR anti-p53 completamente murino que comprende cadenas a y 1 murinas, cada una de las cuales comprende una región variable (V) y una región constante (C). La figura 1B es una representación esquemática del TCR MH de p53, que es una versión humanizada del TCR MM de p53 que comprende regiones variables de ratón en cada una de las cadenas ay 1 (MVa y MV1) y regiones constantes humanas en cada una de las cadenas ay 1(HCa y HC1). La figura 1C es una representación esquemática del TCR de MART HH, que es un TCR anti-MART-1 completamente humano que comprende cadenas ay 1humanas, cada una de las cuales comprende una región variable (V) y una región constante (C). La figura 1D es una representación esquemática del TCR de MART HM, que es una versión murinizada del TCR de MART HH que comprende regiones variables humanas en cada una de las cadenas ay 1(HVa y HV1) y regiones constantes de ratón en cada una de las cadenas ay 1(MCa y MC1). La figura 1E es una representación esquemática del TCR HMF5 de MART, que es un TCR anti-MART-1 humano murinizado que comprende regiones variables humanas en cada una de las cadenas ay 1(HVa y HV1) y regiones constantes de ratón en cada una de las cadenas ay 1(MCa y MC1). El TCR HMF5 de MART comprende regiones variables que son diferentes de las regiones variables de los TCR de MART HH y MART HM. La figura 1F es una representación esquemática del TCR HMF4B2 de MART, que es un TCR anti-MART-1 humano murinizado que comprende las regiones variables humanas de los TCR de MART HH y MART HM (HVa y HV1), regiones constantes de ratón de la cadena a ratón y la cadena 12 de ratón (MCa y MC12). La figura 1G es una representación esquemática del TCR HH de NY2, que es un TCR anti-NY-ESO-1 completamente humano que comprende cadenas a y 1 humanas, cada una de las cuales comprende una región variable (V) y una región constante (C). La figura 1H es una representación esquemática del NY2 HM, que es una versión murinizada de NY2 HH que comprende las regiones variables humanas de NY2 HH (HVa y HV1) y regiones constantes de ratón en cada una de las cadenas a y 1 (MCa y MC1). La figura 1I es una representación esquemática del TCR HM de GP100, que es un TCR anti-gp100 humano murinizado que comprende regiones variables humanas en cada una de las cadenas ay 1(HVa y HV1) y regiones constantes 1de ratón en cada una de las cadenas ay 1(MCa y MC1).

Las figuras 2A a 2D son gráficos de citometría de flujo de células electroporadas con ARNm que codifica para el TCR MM de p53 (figura 2A), TCR MH de p53 (figura 2B), TCR de MART HM (figura 2C) o TCR de MART HH (figura 2D), teñidas con bien pentámero de p53 (figuras 2A y 2B) o bien tetrámero de MART-1 (figuras 2C y 2D), y analizadas mediante FACS. Se muestran el porcentaje de células positivas, así como la intensidad de fluorescencia media relativa (entre paréntesis) de la población seleccionada.

La figura 3A es un gráfico de la secreción de IFNy tal como se detecta mediante ELISA de PBL humanos electroporados con ARNm que codifica para: el TCR de p53-MM, TCR de p53-MH, la cadena a del p53-MM y la cadena 1del p53-MH (p53 Ma/H1), o la cadena 1 del p53 MM y la cadena a del p53-MH (p53 M1/Ha) y cocultivados con células T2 pulsadas con el péptido p53264-272 o péptidos control no específicos (controles no mostrados).

La figura 3B es un gráfico de la secreción de IFNy tal como se detecta mediante ELISA de PBL humanos electroporados con ARNm que codifica para el TCR de MART HH, TCR de MART HM, la cadena a del MART HH y la cadena 1del MART HM (MART Ha/M1), o la cadena 1del MART HH y la cadena a del MART HM (MART H1/Ma) y cocultivados con células T2 pulsadas con péptido específico (MART-1 27L26-35) o péptidos control no específicos (péptido gp100-209, gp100-280, p53149-157 y HBVc, controles no mostrados).

La figura 3C es un gráfico de la secreción de IFN-ytal como se detecta mediante ELISA de células enriquecidas en CD4 electroporadas con ARNm que codifica para las cadenas alfa y beta de NY2-HH, que es un TCR de NY-ESO-1 restringido por HLA-DP4, o su homólogo quimérico de ratón (NY2-HM) que comprende regiones constantes murinas y cocultivadas con células EBV-B HLA-DP4+ (DKEBV-B) pulsadas sin (sin péptido) o con péptido NY-ESO-1p161-180 (NY-ESO-1161-180).

La figura 4A es un gráfico del % de expresión de TCR de MART relativa de células Jurkat RT3-T3.5 deficientes para TCR electroporadas con ARNm que codifica para cada cadena del MART-HH (blanco) o MART-HM (negro), junto con ARNm que codifica para cada cadena de un TCR competidor (p53 MH, TCR de gp100, TCR de NY-ESO M, TCR de NY-ESO R) y teñidas con tetrámero de MART-1. La cantidad de ARNm usada en la electroporación fue de 1 !g de ARNm para cada cadena del TCR, excepto en células marcadas con p53 MH (0,2), se usaron 0,2 !g de ARNm que codifica para cada cadena del TCR competidor. Todas las diferencias fueron estadísticamente significativas basándose en una prueba de la t de Student (p<0,05).

La figura 4B es una colección de inmunotransferencias de tipo Western de células Jurkat RT3-T3.5 deficientes para TCR electroporadas con el MART-HH o MART-HM, lisadas con detergente suave (Brij96) o un detergente fuerte (NP40), inmunoprecipitadas con un anticuerpo específico para V112, y transferidas para CD3-�. Como control para la carga de proteína, se usaron lisados celulares no sometidos a inmunoprecipitación y se transfirieron para CD3-�. Los datos representan uno de tres experimentos independientes.

Las figuras 5A y 5B son gráficos de la secreción de IFN-y y la secreción de GM-CSF, respectivamente, tal como se determina mediante ELISA de PBL humanos que expresan o bien el TCR de MART-HH (barras blancas) o bien el TCR de MART-HM (barras negras) y cocultivados con las líneas celulares de melanoma HLA-A2+ (526 y 624), la línea celular de melanoma HLA-A2- (888) o la línea de osteosarcoma Saos-2 HLA-A2+.

Las figuras 5C y 5D son gráficos de la secreción de IFN-y y la secreción de GM-CSF, respectivamente, tal como se determina mediante ELISA de PBL humanos que expresan o bien el TCR de p53-MM (barras blancas) o bien el TCR de p53-MH (barras negras) y cocultivados con las células tumorales p53+/HLA-A2+ (MDA-MB-231 y H2087), las células Saos-2 p53-/HLA-A2+ y células control HLA-A2-(888).

Las figuras 6A a 6E son una serie de gráficos del % de lisis específica de células efectoras (PBL humanos CD8+ que expresan el TCR de MART-HH (triángulo) o el TCR de MART-HM (cuadrado) o PBL que se electroporaron como control (estrella)) cocultivadas con las líneas de células tumorales diana marcadas con 51Cr antes del cocultivo a la razón de efector:diana (E:D) especificada. En la figura 6A, la línea celular HLA-A2+/de melanoma, 526, fue la célula tumoral diana. En la figura 6B, la línea celular HLA-A2+/de melanoma, 624.38, fue la línea celular diana. En la figura 6C, la célula HLA-A2-/de melanoma, 938, se usó como células tumorales diana. En la figura 6D, la línea celular HLAA2+/de osteosarcoma se usó como células tumorales diana. En la figura 6E, las células tumorales diana fueron células Saos-2.

Las figuras 7A a 7C son gráficos de la secreción de IFNy, GM-CSF e IL-2, respectivamente, tal como se determina mediante ELISA, de PBL humanos CD4+ que expresan o bien el TCR de MART-HH (barras blancas) o bien el TCR de MART-HM (barras negras) y cocultivados con líneas celulares HLA-A2+/de melanoma (526 y 624), células HLAA2-/de melanoma (938) o con células no tumorales (NT).

Las figuras 8A y 8B son gráficos de la secreción de IFNy y GM-CSF, respectivamente, de PBL humanos que expresan MART-HH (barras negras), MART-HM (barras blancas), F4-Mut31-alfa/MART-HM beta (barras con líneas diagonales), F4-Mut74-alfa/MART-HM beta (barras con líneas horizontales), F4-Cpa/MART-HM beta (barras a cuadros), MART-HM alfa/F4-Cpb (barras con líneas verticales), o sin TCR exógeno (barras con puntos) y cocultivados con líneas celulares HLA-A2+/de melanoma (526 y 624) o células HLA-A2-/de melanoma (938 o 888).

Las figuras 9A y 9B son gráficos de la secreción de IFNy y GM-CSF, respectivamente, de PBL humanos que expresan MART-HH (barras negras), MART-HM (barras blancas), MART-HM alfa/F4-Mut62-beta (barras con líneas diagonales), MART-HM alfa/F4-Mut97-beta (barras con líneas diagonales), F4-Cpa/F4Cpb (barras con líneas verticales) o sin TCR exógeno (barras con puntos) y cocultivados con líneas celulares HLA-A2+/de melanoma (526 y 624) o células HLA-A2-/de melanoma (938 o 888).

La figura 10 es un gráfico de la secreción de GM-CSF de PBL humanos que expresan el TCR indicado y cocultivados con células 526 (barras blancas), células 624 (barras negras), células 888 (barras con líneas horizontales) o 938 (barras con líneas diagonales).

Las figuras 11A y 11B son gráficos de la secreción de IFNy de PBL humanos que expresan las cadenas alfa y beta indicadas y cocultivados con células 526 (figura 11A) o células 624 (figura 11B).

La figura 12 es una lista de secuencias de nucleótidos que codifican para cadenas de TCR de variantes funcionales descritas en el presente documento. Los nucleótidos en negrita representan una secuencia derivada de ratón y los nucleótidos que no están en negrita representan una secuencia derivada de ser humano.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona receptores de células T (TCR) quiméricos que presentan actividad biológica potenciada. Por ejemplo, los TCR quiméricos de la invención están marcados por su superior capacidad para la expresión en la superficie celular, asociación más fuerte con CD3, capacidad aumentada para secretar citocinas (por ejemplo, IFNy, GM-CSF y IL-2) tras la estimulación con antígeno, y capacidad potenciada para reconocer y destruir células tumorales. Los TCR quiméricos de la invención comprenden una región variable de un TCR humano y una región constante que comprende al menos un dominio extracelular de una región constante de un TCR no humano.

Tal como se usa en el presente documento, el término “quimérico” se refiere a una molécula, por ejemplo, un TCR, compuesta por partes de diferentes orígenes. Una molécula quimérica, como un todo, se produce de manera no natural, por ejemplo sintético o recombinante, aunque las partes que comprenden la molécula quimérica pueden producirse de manera natural.

Para fines en el presente documento, el término “humano” o “no humano”, cuando se usa en referencia a un TCR, o una parte del mismo (por ejemplo, una región variable, una región constante, una cadena a, una cadena 1), quiere decir que el TCR, o parte del mismo, es un TCR, o parte del mismo, que se expresa de manera endógena por una célula del “ser humano” o del “no humano”. Por ejemplo, la frase “TCR humano” significa que el TCR es endógeno para (se produce de manera natural en) un ser humano. Además, para fines en el presente documento, “no humano” se refiere a cualquier huésped, tal como cualquier huésped mencionado en el presente documento, que no es un ser humano.

Los TCR quiméricos de la invención pueden tener especificidad antigénica por cualquier antígeno. La frase “tener especificidad antigénica” tal como se usa en el presente documento significa que el TCR puede unirse específicamente a y reconocer inmunológicamente el antígeno, de manera que la unión del TCR al antígeno provoca una respuesta inmunitaria. En una realización preferida de la invención, el antígeno es un antígeno que es característico de una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmunitaria, cáncer, etc. En una realización más preferida, el antígeno es un antígeno de cáncer.

El término “antígeno de cáncer” tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier molécula (por ejemplo, proteína, péptido, lípido, hidrato de carbono, etc.) expresado de manera única o sobreexpresado por una célula tumoral o célula cancerosa, de manera que el antígeno está asociado con el tumor o cáncer. El antígeno de cáncer puede expresarse adicionalmente por células normales, no tumorales o no cancerosas. Sin embargo, en tales casos, la expresión del antígeno de cáncer por células normales, no tumorales o no cancerosas no es tan robusta como la expresión por células tumorales o cancerosas. En este sentido, las células tumorales o cancerosas pueden sobreexpresar el antígeno o expresar el antígeno a un nivel significativamente superior, en comparación con la expresión del antígeno por células normales, no tumorales o no cancerosas. Además, el antígeno de cáncer puede expresarse adicionalmente por células de un estado diferente de desarrollo o maduración. Por ejemplo, el antígeno de cáncer puede expresarse adicionalmente por células del estadio embrionario o fetal, células que no se encuentran normalmente en un huésped adulto. Alternativamente, el antígeno de cáncer puede expresarse adicionalmente por células madre o células precursoras, células que no se encuentran normalmente en un huésped adulto.

El antígeno de cáncer puede ser un antígeno expresado por cualquier célula de cualquier cáncer o tumor, incluyendo los cánceres y tumores descritos en el presente documento. El antígeno de cáncer puede ser un antígeno de cáncer de sólo un tipo de cáncer o tumor, de manera que el antígeno de cáncer está asociado con o es característico de sólo un tipo de cáncer o tumor. Alternativamente, el antígeno de cáncer puede ser un antígeno de cáncer (por ejemplo, puede ser característico) de más de un tipo de cáncer o tumor. Por ejemplo, el antígeno de cáncer puede expresarse por células cancerosas tanto de mama como de próstata y no expresarse en absoluto por células normales, no tumorales o no cancerosas. En una realización preferida de la invención, el antígeno de cáncer es un antígeno de melanoma. En una realización más preferida, el antígeno de cáncer es MART-1, gp-100, p53 o NY-ESO-1.

El TCR quimérico de la invención puede comprender dos polipéptidos (es decir, cadenas polipeptídicas), tal como una cadena a de un TCR, una cadena 1 de un TCR, una cadena y de un TCR, una cadena 8 de un TCR, o una combinación de las mismas, cada una de las cuales comprende una región variable y una región constante. Tales cadenas polipeptídicas de TCR se conocen en la técnica. Los polipéptidos del TCR quimérico de la invención pueden comprender cualquier región variable y cualquier región constante, siempre que la región variable sea una región variable de un TCR humano y la región constante comprenda al menos un dominio extracelular de una región constante de un TCR no humano. El organismo no humano puede ser independientemente cualquier huésped, tal como cualquiera de los huéspedes descritos en el presente documento, que no es un ser humano. En este sentido, el TCR quimérico puede comprender, por ejemplo, dos polipéptidos, cada uno de los cuales comprende una región variable de un TCR humano y una región constante de un TCR murino.

La región constante de los TCR quiméricos de la invención puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos, siempre que la región constante comprenda al menos un dominio extracelular de una región constante de un TCR de un huésped no humano. La región constante del TCR quimérico de la invención puede comprender, por ejemplo, un dominio extracelular de una región constante de un TCR murino, un TCR de oveja, un TCR de cabra, etc. Sin querer restringirse a ninguna teoría particular, se contempla que el dominio extracelular de la región constante de los TCR quiméricos, en parte, confiere las actividades biológicas potenciales de los TCR quiméricos.

En una realización preferida de la invención, el TCR quimérico comprende una región constante que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos el dominio extracelular de una región constante de un TCR murino. En este sentido, el TCR quimérico puede comprender una región constante que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 3, o una combinación de las mismas, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 y 2 o SEQ ID NO: 1 y 3. En el caso de que el dominio extracelular sea de una región constante murina, la región constante del TCR quimérico puede comprender el dominio extracelular de una región constante murina en combinación con otras partes, por ejemplo, un dominio transmembrana y/o un dominio intracelular, de una región constante de un TCR murino o de un TCR no murino. Por ejemplo, la región constante del TCR quimérico puede comprender un dominio extracelular de una región constante de un TCR murino en combinación con un dominio transmembrana y un dominio intracelular de una región constante de un TCR humano. Alternativamente, la región constante del TCR quimérico puede comprender un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular de una región constante de un TCR murino. En este sentido, el TCR quimérico puede comprender una región constante que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 4 a 6, o una combinación de las mismas, por ejemplo, SEQ ID NO: 4 y 5 o SEQ ID NO: 4 y 6.

Alternativa o adicionalmente, el TCR quimérico puede comprender cualquier región variable de un TCR humano. En este sentido, el TCR quimérico puede comprender una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 7 a 14. En una realización preferida de la invención, el TCR quimérico comprende una región variable de una cadena a y una región variable de una cadena 1. En una realización más preferida, la región variable de la cadena a comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 9, 11 y 13, y la región variable de la cadena 1 comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, 10, 12 o 14. En la realización más preferida, el TCR quimérico comprende una combinación de regiones variables, una en cada cadena polipeptídica, que comprende una combinación de secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 y 8, 9 y 10, 11 y 12, y 13 y 14.

Alternativa o adicionalmente, el TCR quimérico puede comprender una cadena a de un TCR y una cadena 1 de un TCR. Cada una de la cadena a y la cadena 1 del TCR quimérico de la invención puede comprender independientemente cualquier secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, la cadena a comprende la región variable de una cadena a tal como se expuso anteriormente. En este sentido, el TCR de la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15, 18, 21 y 24 (secuencias de aminoácidos de cadena a). Un TCR de la invención de este tipo puede aparearse con cualquier cadena 1 de un TCR. Preferiblemente, la cadena 1 del TCR de la invención comprende la región variable de una cadena 1 tal como se expuso anteriormente. En este sentido, el TCR quimérico de la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25 y 26. El TCR de la invención, por tanto, puede comprender la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15 a 26, o una combinación de las mismas, por ejemplo, SEQ ID NO: 15 y 16, 15 y 17, 18 y 19, 18 y 20, 21 y 22, 21 y 23, 24 y 25, o 24 y 26.

También se proporciona por la invención un polipéptido aislado o purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15 a 26 y 86 a 133. El término “polipéptido” tal como se usa en el presente documento incluye oligopéptidos y se refiere a una única cadena de aminoácidos conectados por uno o más enlaces peptídicos.

La invención proporciona además una proteína aislada o purificada que comprende al menos uno de los polipéptidos descritos en el presente documento. Por “proteína” quiere decirse una molécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas. La proteína de la invención puede comprender, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o más cadenas polipeptídicas. En una realización preferida, la proteína de la invención comprende dos cadenas polipeptídicas. En una realización más preferida, la proteína de la invención comprende dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales comprende independientemente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15-26 y 86 a 133. En la realización más preferida de la invención, la proteína comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, en la que primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica comprenden respectivamente: SEQ ID NO: 15 y 16, SEQ ID NO: 15 y 17, SEQ ID NO: 18 y 19, SEQ ID NO: 18 y 20, SEQ ID NO: 21 y 22, SEQ ID NO: 21 y 23, SEQ ID NO: 24 y 25, SEQ ID NO: 24 y 26, SEQ ID NO: 112 y 16, SEQ ID NO: 113 y 16, SEQ ID NO: 115 y 16, SEQ ID NO: 116 y 16, SEQ ID NO: 112 y 33, SEQ ID NO: 113 y 33, SEQ ID NO: 114 y 33, SEQ ID NO: 115 y 33, SEQ ID NO: 15 y 120, SEQ ID NO: 116 y 120, SEQ ID NO: 15 y 121, SEQ ID NO: 32 y 121, SEQ ID NO: 112 y 121, SEQ ID NO: 113 y 121, SEQ ID NO: 116 y 121, SEQ ID NO: 114 y 121, o SEQ ID NO: 115 y 121.

Alternativamente, la proteína puede comprender una única cadena polipeptídica que comprende dos o más polipéptidos fusionados entre sí. En este caso, la proteína puede ser una proteína de fusión. En una realización preferida de la invención, la proteína de fusión comprende un único polipéptido que comprende dos de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento que están fusionados entre sí, por ejemplo, un único polipéptido que comprende SEQ ID NO: 15 y 16, SEQ ID NO: 15 y 17, SEQ ID NO: 18 y 19, SEQ ID NO: 18 y 20, SEQ ID NO: 21 y 22, SEQ ID NO: 21 y 23, SEQ ID NO: 24 y 25, SEQ ID NO: 24 y 26, SEQ ID NO: 112 y 16, SEQ ID NO: 113 y 16, SEQ ID NO: 115 y 16, SEQ ID NO: 116 y 16, SEQ ID NO: 112 y 33, SEQ ID NO: 113 y 33, SEQ ID NO: 114 y 33, SEQ ID NO: 115 y 33, SEQ ID NO: 15 y 120, SEQ ID NO: 116 y 120, SEQ ID NO: 15 y 121, SEQ ID NO: 32 y 121, SEQ ID NO: 112 y 121, SEQ ID NO: 113 y 121, SEQ ID NO: 116 y 121, SEQ ID NO: 114 y 121, o SEQ ID NO: 115 y 121.

Alternativamente, la proteína de fusión puede comprender un polipéptido de una región variable de una primera cadena de TCR (por ejemplo, una cadena a) y un polipéptido de una segunda cadena de TCR entera (longitud

completa) (por ejemplo, una cadena 1). Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender un primer polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 7-14 y un segundo polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15-26. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 16 ó 17; SEQ ID NO: 8 y 15; SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 19 o 20; SEQ ID NO: 10 y 18; SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 22 o 23; SEQ ID NO: 12 y 21; SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 25

o 26; SEQ ID NO: 14 y 24.

La proteína de fusión puede comprender opcionalmente uno o más ligadores que unen los dos o más polipéptidos entre sí. El ligador puede ser, por ejemplo, un péptido (por ejemplo, un péptido FMDV 2A (véase Felipe, Genetic Vaccines and Therapy 2: 13 - publicación electrónica, 13 de septiembre de 2004)) que une entre sí dos polipéptidos, tal como se describe en el presente documento.

Alternativa o adicionalmente, la primera y/o segunda cadena(s) polipeptídica(s) de la proteína de fusión puede(n) comprender además otras secuencias de aminoácidos, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que codifica para una inmunoglobulina o una parte de la misma. En este sentido, la invención también proporciona una proteína de fusión que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento junto con al menos otro polipéptido. El otro polipéptido puede existir como un polipéptido separado de la proteína de fusión, o puede existir como un polipéptido, que se expresa en marco (en tándem) con uno de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento. El otro polipéptido puede codificar para cualquier molécula peptídica

o proteínica, o una parte de la misma, incluyendo, pero sin limitarse a una inmunoglobulina, CD3, CD4, CD8, una molécula del CMH, etc.

La proteína de fusión puede comprender una o más copias del polipéptido de la invención y/o una o más copias del otro polipéptido. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o más copias del polipéptido de la invención y/o del otro polipéptido. Se conocen en la técnica métodos adecuados de preparación de proteínas de fusión, e incluyen, por ejemplo, métodos recombinantes. Véase, por ejemplo, Choi et al., Mol. Biotechnol., 31, 193202 (2005).

La proteína de la invención puede ser un anticuerpo recombinante que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, “anticuerpo recombinante” se refiere a una proteína recombinante (por ejemplo, diseñada por ingeniería genética) que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención y una cadena polipeptídica de un anticuerpo, o una parte del mismo. El polipéptido de un anticuerpo, o parte del mismo, puede ser una cadena pesada, una cadena ligera, una región variable constante de una cadena pesada o ligera, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv), o un fragmento Fc, Fab o F(ab)2’ de un anticuerpo, etc. La cadena polipeptídica de un anticuerpo, o parte del mismo, puede existir como un polipéptido separado del anticuerpo recombinante. Alternativamente, la cadena polipeptídica de un anticuerpo, o parte del mismo, puede existir como un polipéptido, que se expresa en marco (en tándem) con el polipéptido de la invención. El polipéptido de un anticuerpo, o parte del mismo, puede ser un polipéptido de cualquier anticuerpo o cualquier fragmento de anticuerpo, incluyendo cualquiera de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo descritos en el presente documento.

Se incluyen en el alcance de la invención variantes funcionales de los TCR quiméricos, polipéptidos y proteínas de la invención descritos en el presente documento. El término “variante funcional” tal como se usa en el presente documento se refiere a un TCR, polipéptido o proteína que tiene similitud o identidad de secuencia sustancial o significativa con un TCR, polipéptido o proteína de origen, variante funcional que conserva la actividad biológica del TCR, polipéptido o proteína del que es una variante. Variantes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas variantes del TCR, polipéptido o proteína descritos en el presente documento (el TCR, polipéptido o proteína de origen) que conserva la capacidad para unirse específicamente al antígeno de cáncer para el que el TCR de origen tiene especificidad antigénica o al que el polipéptido o proteína de origen se une específicamente, en un grado similar, el mismo grado o en un grado superior, que el TCR, polipéptido o proteína de origen. En referencia al TCR, polipéptido

o proteína de origen, la variante funcional puede ser, por ejemplo, al menos aproximadamente el 30%, 50%, 75%, 80%, 90%, 98% o más idéntica en secuencia de aminoácidos al TCR, polipéptido o proteína de origen.

La variante funcional puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos siempre que la secuencia de aminoácidos tenga identidad de secuencia significativa con la secuencia de aminoácidos del TCR original. En una realización preferida de la invención, la variante funcional tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 75% idéntica a la secuencia de aminoácidos del TCR original. En una realización más preferida de la invención, la variante funcional tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos del TCR original. En la realización más preferida de la invención, la variante funcional tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos del TCR original.

La secuencia de aminoácidos de la variante funcional puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína de origen con al menos una sustitución de aminoácido conservativa. Se conocen en la técnica sustituciones de aminoácidos conservativas, e incluyen sustituciones de aminoácidos en las que un aminoácido que tiene ciertas propiedades físicas y/o químicas se intercambia por otro aminoácido que tiene las mismas propiedades químicas o físicas. Por ejemplo, la sustitución de aminoácido conservativa puede ser un aminoácido ácido sustituido por otro aminoácido ácido (por ejemplo, Asp o Glu), un aminoácido con una cadena lateral no polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral no polar (por ejemplo, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, etc.), un aminoácido básico sustituido por otro aminoácido básico (Lys, Arg, etc.), un aminoácido con una cadena lateral polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral polar (Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc.), etc.

Alternativa o adicionalmente, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína de origen con al menos una sustitución de aminoácido no conservativa. En este caso, es preferible que la sustitución de aminoácido no conservativa no interfiera con ni inhiba la actividad biológica de la variante funcional. Preferiblemente, la sustitución de aminoácido no conservativa potencia la actividad biológica de la variante funcional, de manera que la actividad biológica de la variante funcional aumenta en comparación con el TCR, polipéptido o proteína de origen.

La(s) sustitución/sustituciones de aminoácido(s) de la secuencia de aminoácidos de la variante funcional puede(n) ser dentro de cualquier región de la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, la(s) sustitución/sustituciones de aminoácido(s) puede(n) ubicarse dentro de la región de la secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable o la región constante de la variante funcional. En el caso de que la(s) sustitución/sustituciones de aminoácido(s) se ubique(n) dentro de la región de la secuencia de aminoácidos que codifica para la región variable, se entiende que la(s) sustitución/sustituciones de aminoácido(s) no disminuyen significativamente la capacidad de la variante funcional para unirse al antígeno para el que el TCR original tiene especificidad antigénica.

Preferiblemente, la(s) sustitución/sustituciones de aminoácido(s) de la secuencia de aminoácidos de la variante funcional se ubica(n) dentro de la región de la secuencia de aminoácidos que codifica para la región constante de la variante funcional. En este sentido, la variante funcional puede comprender, por ejemplo, una región constante quimérica en la que una o más partes de la región constante de la variante funcional se deriva(n) de una región constante no humana, por ejemplo, una región constante murina, y la(s) otra(s) parte(s) de la región constante se deriva(n) de una región constante humana. Para fines en el presente documento, el término “parte” quiere decir cualquier parte adecuada de una región constante, tal como una parte que comprende el dominio extracelular, el péptido de conexión, el dominio transmembrana o el dominio intracelular de la región constante. La parte puede comprender, por ejemplo, al menos 20, 21, 30, 40, 50 ó 60 aminoácidos contiguos de la región constante a la que se hace referencia.

La variante funcional puede comprender, por ejemplo, una región constante quimérica en la que los primeros 31 aminoácidos se derivan de una región constante humana y la parte restante se deriva de la región constante murina. También, por ejemplo, la variante funcional puede comprender una región constante quimérica en la que los primeros 74 aminoácidos se derivan de una región constante humana y la parte restante se deriva de la región constante murina. Otras variantes funcionales a modo de ejemplo que comprenden regiones constantes quiméricas se describen en el presente documento en la tabla 7.

En este sentido, la invención proporciona una variante funcional que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 86-95, secuencias que comprenden partes humanas y partes murinas del dominio extracelular de la región constante. En una realización preferida de la invención, la variante funcional comprende una región constante quimérica que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 99-108. En una realización más preferida de la invención, la variante funcional comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 112 a 121, secuencias que están codificadas por las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 134-147. En la realización más preferida de la invención, la variante funcional comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, en la que la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica comprenden respectivamente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 112 y 16, SEQ ID NO: 113 y 16, SEQ ID NO: 116 y 16, SEQ ID NO: 112 y 33, SEQ ID NO: 113 y 33, SEQ ID NO: 114 y 33, SEQ ID NO:115 y 33, SEQ ID NO: 15 y 120, SEQ ID NO: 116 y 120, SEQ ID NO: 15 y 121, SEQ ID NO: 32 y 121, SEQ ID NO: 112 y 121, SEQ ID NO: 113 y 121, SEQ ID NO: 114 y 121, SEQ ID NO: 115 y 121, y SEQ ID NO: 116 y 121.

Alternativamente, la variante funcional puede comprender una región constante de un organismo no humano, por ejemplo, TCR murino con una sustitución de aminoácido en la que un aminoácido se ha sustituido por un residuo de cisteína (Cys). La variante funcional puede comprender, por ejemplo, un dominio extracelular que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 96-98, secuencias que comprenden un dominio extracelular de una región constante murina en la que un aminoácido se ha reemplazado por Cys. Preferiblemente, la variante funcional comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 109-111, secuencias que comprenden una región constante murina en la que un aminoácido se ha reemplazado por Cys. Más preferiblemente, la variante funcional comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 122 a 133. Lo más preferiblemente, la variante funcional comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, en la que primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica comprenden respectivamente una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 122 y 123, SEQ ID NO: 122 y 124, SEQ ID NO: 125 y 126, SEQ ID NO: 125 y 127, SEQ ID NO: 128 y 129, SEQ ID NO: 128 y 130, SEQ ID NO: 131 y 132, y SEQ ID NO: 131 y 133.

El TCR, polipéptido o proteína puede consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos especificadas descritas en el presente documento, de manera que otros componentes de la variante funcional, por ejemplo, otros aminoácidos, no cambian materialmente la actividad biológica de la variante funcional. En este sentido, el TCR, polipéptido o proteína de la invención puede consistir, por ejemplo, esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 ó 16, o tanto SEQ ID NO: 15 como 16, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 ó 17, o tanto SEQ ID NO: 15 como 17, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ó 19, o tanto SEQ ID NO: 18 como 19, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ó 20, o tanto SEQ ID NO: 18 como 20, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ó 22, o tanto SEQ ID NO: 21 como 22, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 ó 23, o tanto SEQ ID NO: 21 como 23, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ó 25, o tanto SEQ ID NO: 24 como 25, o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ó 26, o tanto SEQ ID NO: 24 como

26.

Asimismo, la variante funcional puede consistir, por ejemplo, esencialmente en SEQ ID NO: 112 ó 16, SEQ ID NO: 113 ó 16, SEQ ID NO:116 ó 16, SEQ ID NO: 112 ó 33, SEQ ID NO: 113 ó 33, SEQ ID NO: 114 ó 33, SEQ ID NO: 115 ó 33, SEQ ID NO: 15 ó 120, SEQ ID NO: 116 ó 120, SEQ ID NO: 15 ó 121, SEQ ID NO: 32 ó 121, SEQ ID NO: 112 ó 121, SEQ ID NO: 113 ó 121, SEQ ID NO:114 ó 121, SEQ ID NO: 115 ó 121, SEQ ID NO: 116 ó 121, SEQ ID NO: 122 ó 123, SEQ ID NO: 122 ó 124, SEQ ID NO: 125 ó 126, SEQ ID NO: 125 ó 127, SEQ ID NO: 128 ó 129, SEQ ID NO: 128 ó 130, SEQ ID NO: 131 ó 132, o SEQ ID NO: 131 ó 133, o la variante funcional puede consistir esencialmente en ambas secuencias especificadas.

Los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales) pueden ser de cualquier longitud, es decir, pueden comprender cualquier número de aminoácidos, siempre que los TCR, polipéptidos o proteínas (o partes funcionales o variantes funcionales de los mismos) conserven su actividad biológica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser de aproximadamente 50 a aproximadamente 5000 aminoácidos de largo, tal como 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos de longitud. En este sentido, los polipéptidos de la invención también incluyen oligopéptidos.

Se incluyen en el alcance de la invención partes funcionales de los TCR quiméricos, polipéptidos y proteínas de la invención descritos en el presente documento. Las partes funcionales pueden comprender cualquier parte que comprenda aminoácidos contiguos del TCR, polipéptido o proteína de la invención del que es una parte, siempre que la parte funcional comprenda una región variable de un primer huésped y una región constante que comprende al menos un dominio extracelular de una región constante de un segundo huésped. El término “parte funcional” cuando se usa en referencia a un TCR se refiere a cualquier parte o fragmento del TCR de la invención, parte o fragmento que conserva la actividad biológica del TCR del que es una parte (el TCR original). Partes funcionales abarca, por ejemplo, aquéllas partes de un TCR que conservan la capacidad para, por ejemplo, unirse específicamente a un antígeno de cáncer o detectar una célula enferma, tratar o prevenir una enfermedad, por ejemplo, cáncer, en un grado similar, el mismo grado, o en un grado superior, que el TCR original. En referencia al TCR original, la parte funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente el 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% o más del TCR original.

La parte funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxilo terminal de la parte,

o en ambos extremos terminales, aminoácidos adicionales que no se encuentran en la secuencia de aminoácidos del TCR original. Deseablemente, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la parte funcional, por ejemplo, unirse específicamente a un antígeno de cáncer o detectar una célula enferma, tratar o prevenir una enfermedad, por ejemplo, cáncer, etc. Más deseablemente, los aminoácidos adicionales potencian la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del TCR original.

Los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales) de la invención pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos que se producen de manera natural. Tales aminoácidos sintéticos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexanocarboxílico, norleucina, ácido a-amino-n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometil-cisteína, trans-3- y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, 1fenilserina, 1-hidroxifenilalanina, fenilglicina, a-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolin-2carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida del ácido aminomalónico, N’-bencil-N’-metil-lisina, N’,N’-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido aaminociclopentanocarboxílico, ácido a-aminociclohexaneocarboxílico, ácido a-aminocicloheptanocarboxílico, ácido a-(2-amino-2-norbomano)-carboxílico, ácido a,y-diaminobutírico, ácido a,1-diaminopropiónico, homofenilalanina y aterc-butilglicina.

Los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales) pueden glicosilarse, amidarse, carboxilarse, fosforilarse, esterificarse, N-acilarse, ciclarse mediante, por ejemplo, un puente disulfuro, o convertirse en una sal de adición de ácido y/o opcionalmente dimerizarse o polimerizarse, o conjugarse.

Cuando los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales) están en forma de una sal, preferiblemente, los polipéptidos están en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen las derivadas de ácidos minerales, tales como ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos, tales como ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico y arilsulfónico, por ejemplo, ácido p-toluenosulfónico.

El TCR, polipéptido y/o proteína de la invención (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales del mismo) puede obtenerse mediante métodos conocidos en la técnica. Se describen métodos adecuados de síntesis de novo de polipéptidos y proteínas en, por ejemplo, Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2000; y patente estadounidense n.º 5.449.752. Además pueden producirse polipéptidos y proteínas de manera recombinante usando los ácidos nucleicos descritos en el presente documento usando métodos recombinantes convencionales. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, NY, 1994. Además, algunos de los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales de los mismos) pueden aislarse y/o purificarse, en parte, a partir de una fuente, tal como una planta, una bacteria, un insecto, un mamífero, por ejemplo, una rata, un ser humano, etc. Se conocen bien en la técnica métodos de aislamiento y purificación. Alternativamente, los TCR, polipéptidos y/o proteínas descritos en el presente documento (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales de los mismos) pueden sintetizarse comercialmente por compañías tales como Synpep (Dublín, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD) y Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). En este sentido, los TCRs polipéptidos y proteínas de la invención pueden ser sintéticos, recombinantes, aislados y/o purificados.

Se incluyen en el alcance de la invención conjugados, por ejemplo, bioconjugados, que comprenden cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas de la invención (incluyendo cualquiera de las variantes o partes funcionales de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células huésped, poblaciones de células huésped,

o anticuerpos, o partes de unión a antígeno de los mismos. Se conocen en la técnica conjugado, así como métodos de síntesis de conjugados en general (véase, por ejemplo, Hudecz, F., Methods Mol. Biol., 298: 209-223 (2005) y Kirin et al., Inorg Chem., 44(15): 5405-5415 (2005)).

Se proporciona además por la invención un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales de los mismos). El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que codifique para cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas, o partes funcionales o variantes funcionales de los mismos. Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 27-35 y 134-147. La secuencia de nucleótidos puede comprender alternativamente una secuencia de nucleótidos que está degenerada para cualquiera de SEQ ID NO: 27-35 y 134

147.

También se proporciona un ácido nucleico cebador que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una parte de la secuencia de nucleótidos que codifica para cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales de los mismos). El ácido nucleico cebador de la invención puede modificarse para que comprenda un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo y una partícula elemental. El ácido nucleico cebador de la invención es útil en la detección del ácido nucleico que codifica para el TCR, polipéptido o proteína. Pueden realizarse análisis tanto cualitativos como cuantitativos en células que comprenden el ácido nucleico de la invención que codifica para el TCR, polipéptido o proteína. Tales análisis incluyen, por ejemplo, cualquier tipo de ensayo basado en o ensayo de hibridación, por ejemplo, transferencia de tipo Southern, transferencia de tipo Northern.

Por “ácido nucleico” tal como se usa en el presente documento se incluye “polinucleótido”, “oligonucleótido” y “molécula de ácido nucleico” y generalmente significa un polímero de ADN o ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido (por ejemplo, aislado y/o purificado) a partir de fuentes naturales, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que puede contener enlace internucleotídico no natural o alterado, tal como un enlace fosforamidato o un enlace fosforotioato, en lugar del fosfodiéster hallado entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. Se prefiere generalmente que el ácido nucleico no comprenda ninguna inserción, deleción, inversión y/o sustitución. Sin embargo, puede ser adecuado en algunos casos, tal como se comenta en el presente documento, que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones.

Preferiblemente, los ácidos nucleicos de la invención son recombinantes. Tal como se usa en el presente documento, el término “recombinante” se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de células vivas uniendo segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos a moléculas de ácido nucleico que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de las descritas en (i) anteriormente. Para fines en el presente documento, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo.

Los ácidos nucleicos pueden construirse basándose en reacciones de síntesis química y/o ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente, y Ausubel et al., citado anteriormente. Por ejemplo, un ácido nucleico puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos que se producen de manera natural o nucleótidos modificados de manera diversa diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, 5fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina N6-sustituida, 7-metilguanina, 5metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5’-metoxicarboximetiluracilo, 5metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, pueden adquirirse uno o más de los ácidos nucleicos de la invención de compañías tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX).

Los ácidos nucleicos de la invención pueden incorporarse en un vector de expresión recombinante. En este sentido, la invención proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. Para fines en el presente documento, el término “vector de expresión recombinante” significa con constructo de oligonucleótido o polinucleótido genéticamente modificado que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido por una célula huésped, cuando el constructo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para hacer que el ARNm, proteína, polipéptido o péptido se exprese dentro de la célula. Los vectores de la invención no se producen de manera natural como un todo. Sin embargo, partes de los vectores pueden producirse de manera natural. Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluyendo, pero sin limitarse a ADN y ARN, que pueden ser monocatenarios o bicatenarios, sintetizados u obtenidos en parte de fuentes naturales, y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender enlaces internucleotídicos que se producen de manera natural o que no se producen de manera natural, o ambos tipos de enlaces. Preferiblemente, los nucleótidos alterados o enlaces internucleotídicos que no se producen de manera natural no dificultan la transcripción o replicación del vector.

El vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y puede usarse para transformar o transfectar cualquier huésped adecuado. Los vectores adecuados incluyen los diseñados para la propagación y expansión o para la expresión o ambos, tales como plásmidos y virus. El vector puede seleccionarse del grupo que consiste en la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También pueden usarse vectores de bacteriófagos, tales como AGT10, AGT11, AZapII (Stratagene), AEMBL4 y ANM1149. Los ejemplos de vectores de expresión vegetales incluyen pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión animales incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). Preferiblemente, el vector de expresión recombinante es un vector viral, por ejemplo, un vector retroviral.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden prepararse usando técnicas de ADN recombinante descritas en, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente, y Ausubel et al., citado anteriormente. Pueden prepararse constructos de vectores de expresión, que son circulares o lineales, para que contengan un sistema de replicación funcional en una célula huésped procariota o eucariota. Pueden derivarse sistemas de replicación, por ejemplo, de ColEl, plásmido 2 !, A, SV40, virus del papiloma bovino y similares.

De manera deseable, el vector de expresión recombinante comprende secuencias reguladoras, tales como codones de iniciación y terminación de la transcripción y traducción, que son específicas para el tipo de huésped (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en el que el vector va a introducirse, según sea apropiado y teniendo en cuenta si el vector está basado en ADN o ARN.

El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de huéspedes transformados o transfectados. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocida, por ejemplo, resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un huésped auxótrofo para proporcionar prototrofía, y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión de la invención incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.

El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor nativo o no nativo operativamente unido a la secuencia de nucleótidos que codifica para el TCR, polipéptido o proteína (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales de los mismos), o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria a o que se hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica para el TCR, polipéptido o proteína. La selección de promotores, por ejemplo, fuertes, débiles, inducibles, específicos de tejido y específicos de desarrollo, se encuentra dentro del conocimiento habitual del experto. De manera similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también se encuentra dentro del conocimiento del experto. El promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de VRS y un promotor encontrado en la repetición terminal larga del virus de células madre murinas.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse o bien para expresión transitoria, para expresión estable, o bien para ambas. Además, los vectores de expresión recombinantes pueden prepararse para expresión constitutiva o para expresión inducible. Adicionalmente, los vectores de expresión recombinantes pueden prepararse para que incluyan un gen suicida.

Tal como se usa en el presente documento, el término “gen suicida” se refiere a un gen que provoca que la célula que expresa el gen suicida muera. El gen suicida puede ser un gen que confiere sensibilidad a un agente, por ejemplo, un fármaco, en la célula en la que se expresa el gen, y provoca que la célula muera cuando la célula se pone en contacto con o se expone al agente. Se conocen en la técnica genes suicidas (véase, por ejemplo, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics en el Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, R.U.), Humana Press, 2004) e incluyen, por ejemplo, gen de timidina cinasa (TK) del virus del herpes simple (VHS), citosina desaminasa, purina nucleósido fosforilasa y nitrorreductasa.

La invención proporciona además una célula huésped que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, el término “célula huésped” se refiere a cualquier tipo de célula que puede contener el vector de expresión recombinante de la invención. La célula huésped puede ser una célula eucariota, por ejemplo, planta, animal, hongos o algas, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, bacterias o protozoos. La célula huésped puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, por ejemplo, un ser humano. La célula huésped puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. Se conocen en la técnica células huésped adecuadas e incluyen, por ejemplo, células de E. coli DH5a, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293 y similares. Para fines de amplificación o replicación del vector de expresión recombinante, la célula huésped es preferiblemente una célula procariota, por ejemplo, una célula DH5a. Para fines de producción de un TCR, polipéptido o proteína recombinante, la célula huésped es preferiblemente una célula de mamífero. Lo más preferiblemente, la célula huésped es una célula humana. Aunque la célula huésped puede ser de cualquier tipo celular, puede originarse a partir de cualquier tipo de tejido y puede estar en cualquier fase de desarrollo, la célula huésped preferiblemente es un linfocito de sangre periférica (PBL). Más preferiblemente, la célula huésped es una célula T.

Para fines en el presente documento, la célula T puede ser cualquier célula T, tal como una célula T cultivada, por ejemplo, una célula T primaria o una célula T de una línea de células T cultivada, por ejemplo, Jurkat, SupT1, etc., o una célula T obtenida de un mamífero. Si se obtiene de un mamífero, la célula T puede obtenerse de numerosas fuentes, incluyendo pero sin limitarse a sangre, médula ósea, ganglios linfáticos, el timo u otros tejidos o fluidos. Las células T también pueden enriquecerse o purificarse. La célula T puede obtenerse mediante maduración de células madre hematopoyéticas, o bien in vitro o bien in vivo, para dar células T. Preferiblemente, la célula T es una célula T humana. Más preferiblemente, la célula T es una célula T aislada de un ser humano. La célula T puede ser cualquier tipo de célula T y puede estar en cualquier fase de desarrollo, incluyendo pero sin limitarse a, células T positivas dobles para CD4+/CD8+, células T cooperadoras CD4+, por ejemplo, células Th1 y Th2, células T CD8+ (por ejemplo, células T citotóxicas), células mononucleares de sangre periférica (CMSP), leucocitos de sangre periférica (PBL), células infiltrantes de tumor (TIL), células T de memoria, células T naïve y similares. Preferiblemente, la célula T es una célula T CD8+ o una célula T CD4+.

También se proporciona por la invención una población de células que comprende al menos una célula huésped descrita en el presente documento. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula huésped que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos, además de al menos otra célula, por ejemplo, una célula huésped (por ejemplo, una célula T), que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinantes, o una célula distinta de una célula T, por ejemplo, una célula B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula muscular, una célula cerebral, etc. Alternativamente, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células huésped (por ejemplo, que consisten esencialmente en) que comprenden el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población clonal de células, en la que todas las células de la población son clones de una única célula huésped que comprende un vector de expresión recombinante, de manera que todas las células de la población comprenden el vector de expresión recombinante. En una realización de la invención, la población de células es una población clonal que comprende células huésped que comprenden un vector de expresión recombinante tal como se describe en el presente documento.

La invención proporciona además un anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítopo que comprende la unión entre la región variable y la región constante de cualquiera de los TCR descritos en el presente documento. El anticuerpo puede ser cualquier tipo de inmunoglobulina que se conoce en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, etc. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo que se produce de manera natural, por ejemplo, un anticuerpo aislado y/o purificado a partir de un mamífero, por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, hámster, ser humano, etc. Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo modificado por ingeniería genética, por ejemplo, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. El anticuerpo puede estar en forma monomérica o polimérica. Además, el anticuerpo puede tener cualquier nivel de afinidad o avidez por el epítopo del TCR de la invención. De manera deseable, el anticuerpo es específico para el epítopo que comprende la unión entre la región variable y la región constante de cualquiera de los TCR descritos en el presente documento, de manera que hay reacción cruzada mínima con otros péptidos o proteínas (epítopos).

Se conocen en la técnica métodos para someter a prueba anticuerpos para determinar la capacidad para unirse al epítopo del TCR de la invención e incluyen cualquier ensayo de unión anticuerpo-antígeno, tal como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ELISA, inmunotransferencia de tipo Western, inmunoprecipitación y ensayos de inhibición competitiva (véase, por ejemplo, Janeway et al., citado más adelante, y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2002/0197266 A1).

Se conocen en la técnica métodos adecuados de preparación de anticuerpos. Por ejemplo, se describen métodos de hibridoma convencionales en, por ejemplo, Harlow y Lane (ed.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), y C.A. Janeway et al. (ed.), Immunobiology, 5ª Ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2001)). Alternativamente, se conocen en la técnica otros métodos, tales como métodos de hibridoma de VEB (Haskard y Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), y Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)), y sistemas de expresión de vector bacteriófago (véase, por ejemplo, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)). Además, se describen métodos de producción de anticuerpos en animales no humanos en, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.545.806, 5.569.825 y 5.714.352, y la solicitud de patente estadounidense con número de publicación 2002/0197266 A1).

Además, puede usarse presentación en fago para generar el anticuerpo de la invención. En este sentido, pueden generarse bibliotecas de fago que codifican para dominios variables (V) de unión a antígeno de anticuerpos usando técnicas de ADN recombinante y biología molecular convencionales (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2001)). El fago que codifica para una región variable con la especificidad deseada se selecciona para la unión específica al antígeno deseado, y se reconstituye un anticuerpo completo o parcial que comprende el dominio variable seleccionado. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para el anticuerpo reconstituido se introducen en una línea celular adecuada, tal como una célula de mieloma usada para la producción de hibridomas, de manera que se secretan por la célula anticuerpos que tienen las características de anticuerpos monoclonales (véase, por ejemplo, Janeway et al., citado anteriormente, Huse et al., citado anteriormente y la patente estadounidense 6.265.150).

Pueden producirse anticuerpos mediante ratones transgénicos que son transgénicos para genes de inmunoglobulinas de cadena ligera y pesada específicos. Tales métodos se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo las patentes estadounidenses 5.545.806 y 5.569.825, y Janeway et al., citado anteriormente.

Se conocen bien en la técnica métodos para generar anticuerpos humanizados y se describen en detalle en, por ejemplo, Janeway et al., citado anteriormente, las patentes estadounidenses 5.225.539, 5.585.089 y 5.693.761, la patente europea n.º 0239400 B1 y la patente del Reino Unido n.º 2188638. También pueden generarse anticuerpos humanizados usando la tecnología de revestimiento de anticuerpos descrita en la patente estadounidense 5.639.641 y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994).

La invención también proporciona partes de unión a antígeno de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. La parte de unión a antígeno puede ser cualquier parte que tenga al menos un sitio de unión a antígeno, tal como Fab, F(ab’)2, dsFv, sFv, diacuerpos y triacuerpos.

Puede generarse un fragmento de anticuerpo de fragmento de región variable de cadena sencilla (sFv), que consiste en un fragmento de Fab truncado que comprende el dominio variable (V) de una cadena pesada de anticuerpo unida a un dominio V de un cadena de anticuerpo ligera a través de un péptido sintético, usando técnicas de tecnología de ADN recombinante de rutina (véase, por ejemplo, Janeway et al., citado anteriormente). De manera similar, pueden prepararse fragmentos de región variable estabilizados por puentes disulfuro (dsFv) mediante tecnología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)). Los fragmentos de anticuerpo de la invención, sin embargo, no se limitan a estos tipos a modo de ejemplo de fragmentos de anticuerpo.

Además, el anticuerpo, o parte de unión a antígeno del mismo, puede modificarse para que comprenda un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa del rábano) y partículas elementales (por ejemplo, partículas de oro).

Los anticuerpos de la invención y las partes de unión a antígeno de los mismos son útiles en la detección de la expresión del TCR de la invención en el que se encuentra el epítopo al que se une específicamente el anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo. Pueden realizarse análisis tanto cualitativos como cuantitativos en células que expresan el TCR de la invención usando los anticuerpos de la invención o partes de unión a antígeno de los mismos. Tales análisis incluyen cualquier tipo de inmunoensayo, incluyendo, por ejemplo, inmunotransferencias de tipo Western, inmunofluorescencia, inmunotinción, inmunoprecipitación, ELISA, radioinmunoensayo, etc.

Los TCR, polipéptidos, proteínas, (incluyendo partes funcionales y variantes funcionales de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células huésped (incluyendo poblaciones de las mismas) y anticuerpos (incluyendo partes de unión a antígeno de los mismos) de la invención, pueden aislarse y/o purificarse. El término “aislado” tal como se usa en el presente documento significa que se ha eliminado de su entorno natural. El término “purificado” tal como se usa en el presente documento significa que su pureza se ha aumentado, en el que “pureza” es un término relativo, y no debe interpretarse necesariamente como pureza absoluta. Por ejemplo, la pureza puede ser de al menos aproximadamente el 50%, puede ser superior al 60%, al 70% o al 80%, o puede ser del 100%.

Los TCR, polipéptidos, proteínas (incluyendo variantes y partes funcionales de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células huésped (incluyendo poblaciones de las mismas) y anticuerpos (incluyendo partes de unión a antígeno de los mismos) de la invención, todos los cuales se denominan conjuntamente “materiales de TCR de la invención” a continuación en el presente documento, pueden formularse en una composición, tal como una composición farmacéutica. En este sentido, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, partes funcionales, variantes funcionales, ácidos nucleicos, vectores de expresión, células huésped (incluyendo poblaciones de las mismas) y anticuerpos (incluyendo partes de unión a antígeno de los mismos), y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen cualquiera de los materiales de TCR de la invención pueden comprender más de un material de TCR de la invención, por ejemplo, un polipéptido y un ácido nucleico, o dos o más TCR diferentes. Alternativamente, la composición farmacéutica pueden comprender un material de TCR de la invención en combinación con otros fármacos o agentes farmacéuticamente activos, tales como agentes quimioterápicos, por ejemplo, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorubicina, doxorubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc.

Preferiblemente, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Con respecto a composiciones farmacéuticas, el portador puede ser cualquiera de los usados convencionalmente y está limitado sólo por consideraciones fisicoquímicas, tales como solubilidad y falta de reactividad con el/los compuesto(s) activo(s), y por la vía de administración. Los portadores farmacéuticamente aceptables descritos en el presente documento, por ejemplo, vehículos, adyuvantes, excipientes y diluyentes, los conocen bien los expertos en la técnica y están fácilmente disponibles al público. Se prefiere que el portador farmacéuticamente aceptable sea uno que es químicamente inerte frente al/a los agente(s) activo(s) y uno que no tiene efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.

La elección del portador se determinará en parte mediante el material de TCR de la invención particular, así como mediante el método particular usado para administrar el material de TCR de la invención. Por consiguiente, existe una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la invención. Las siguientes formulaciones para administración oral, de aerosol, parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, interperitoneal, rectal y vaginal son a modo de ejemplo y no son de ningún modo limitativas. Puede usarse más de una vía para administrar los materiales de TCR de la invención y, en ciertos casos, una vía particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra vía.

Los expertos en la técnica conocen bien formulaciones tópicas. Tales formulaciones son particularmente adecuadas en el contexto de la invención para su aplicación a la piel.

Formulaciones adecuadas para administración oral pueden consistir en (a) disoluciones líquidas, tales como una cantidad eficaz del material de TCR de la invención disuelta en diluyentes, tales como agua, solución salina o zumo de naranja; (b) cápsulas, sobres, comprimidos, pastillas para chupar y trociscos, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del principio activo, como sólidos o gránulos; (c) polvos; (d) suspensiones en un líquido apropiado; y

(e) emulsiones adecuadas. Las formulaciones líquidas pueden incluir diluyentes, tales como agua y alcoholes, por ejemplo, etanol, alcohol bencílico y los alcoholes de polietileno, o bien con o bien sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable. Formas de cápsulas pueden ser del tipo de gelatina de vaina blanda o dura habitual que contiene, por ejemplo, tensioactivos, lubricantes y cargas inertes, tales como lactosa, sacarosa, fosfato de calcio y almidón de maíz. Las formas de comprimidos pueden incluir uno o más de lactosa, sacarosa, manitol, almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, celulosa microcristalina, goma arábiga, gelatina, goma guar, dióxido de silicio coloidal, croscarmelosa sódica, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de zinc, ácido esteárico, y otros excipientes, colorantes, diluyentes, agentes de tamponamiento, agentes disgregantes, agentes humectantes, conservantes, agentes aromatizantes y otros excipientes farmacológicamente compatibles. Formas de pastillas para chupar pueden comprender el material de TCR de la invención en un aromatizante, habitualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto, así como pastillas que comprenden el material de TCR de la invención en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga, emulsiones, geles y similares que contienen, además, tales excipientes tal como se conocen en la técnica.

El material de TCR de la invención, solo o en combinación con otros componentes adecuados, puede prepararse en formulaciones de aerosol que van a administrarse a través de inhalación. Estas formulaciones de aerosol pueden colocarse en propelentes aceptables presurizados, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. También pueden formularse como productos farmacéuticos para preparaciones no presurizadas, tales como en un nebulizador o un atomizador. Tales formulaciones de pulverización también pueden usarse para pulverizar la mucosa.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen disoluciones de inyección estériles isotónicas, acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizadores y conservantes. El material de TCR de la invención puede administrarse en un diluyente fisiológicamente aceptable en un portador farmacéutico, tal como un líquido estéril o mezcla de líquidos, incluyendo agua, solución salina, dextrosa acuosa y disoluciones de azúcar relacionadas, un alcohol, tal como etanol o alcohol hexadecílico, un glicol, tal como propilenglicol o polietilenglicol, dimetilsulfóxido, glicerol, cetales tales como 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol, éteres, poli(etilenglicol) 400, aceites, ácidos grasos, glicéridos o ésteres de ácidos grasos, o glicéridos de ácidos grasos acetilados con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, tal como un jabón o un detergente, agente de suspensión, tal como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa, o agentes emulsionantes y otros adyuvantes farmacéuticos.

Los aceites que pueden usarse en formulaciones parenterales incluyen petróleo, aceites animales, vegetales o sintéticos. Los ejemplos específicos de aceites incluyen de cacahuete, soja, sésamo, semilla de algodón, maíz, oliva, vaselina y mineral. Los ácidos grasos adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen ácido oleico, ácido esteárico y ácido isoesteárico. Oleato de etilo y miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados.

Los jabones adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen sales de metal alcalino graso, de amonio y de trietanolamina, y los detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetildialquilamonio y haluros de alquilpiridinio, (b) detergentes aniónicos tales como, por ejemplo, sulfonatos de alquilo, arilo y olefina, sulfatos de alquilo, olefina, éter y monoglicérido, y sulfosuccinatos, (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de amina grasa, alcanolamidas de ácidos grasos y copolímeros de polioxietilenpolipropileno, (d) detergentes anfóteros tales como, por ejemplo, alquil-1aminopropionatos y sales de amonio cuaternario de 2-alquil-imidazolina, y (e) mezclas de los mismos.

Las formulaciones parenterales contendrán normalmente de desde aproximadamente el 0,5% hasta aproximadamente el 25% en peso del material de TCR de la invención en disolución. Pueden usarse conservantes y tampones. Con el fin de minimizar o eliminar la irritación en el sitio de inyección, tales composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tienen un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en tales formulaciones oscilará normalmente entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 15% en peso. Los tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol sorbitano, tales como monooleato de sorbitano y los aductos de alto peso molecular de óxido de etileno con una base hidrófoba, formada mediante la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones parenterales pueden presentarse en recipientes sellados de dosis unitaria o de múltiples dosis, tales como ampollas y viales, y pueden almacenarse en un estado secado por congelación (liofilizado) que requiere sólo la adición del excipiente del líquido estéril, por ejemplo, agua, para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse suspensiones y disoluciones de inyección extemporánea a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos del tipo descrito anteriormente.

Las formulaciones inyectables son según la invención. Los expertos en la técnica conocen bien los requisitos para portadores farmacéuticos eficaces para composiciones inyectables (véanse, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Filadelfia, PA, Banker y Chalmers, ed., páginas 238-250 (1982), y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4ª ed., páginas 622-630 (1986)). Preferiblemente, cuando se administran células, por ejemplo, células dendríticas, se administran las células a través de inyección.

Adicionalmente, los materiales de TCR de la invención, o composiciones que comprenden tales materiales de TCR de la invención, pueden prepararse en supositorios mezclando con una variedad de bases, tales como bases emulsionantes o bases solubles en agua. Pueden prepararse formulaciones adecuadas para administración vaginal como óvulos vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o fórmulas de pulverización que contienen, además del principio activo, portadores tales como se sabe en la técnica que son apropiados.

Se apreciará por un experto en la técnica que, además de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente, los materiales de TCR de la invención pueden formularse como complejos de inclusión, tales como complejos de inclusión de ciclodextrina o liposomas.

Para fines de la invención, la cantidad o dosis del material de TCR de la invención administrada debe ser suficiente para efectuar, por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica, en el sujeto o animal a lo largo de un marco de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material de TCR de la invención debe ser suficiente para unirse a un antígeno de cáncer, o detectar, tratar o prevenir el cáncer en un periodo de desde aproximadamente 1 hasta 4 semanas o más, por ejemplo, de 5 a 20 o más semanas, desde el momento de administración. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo podría ser incluso más largo. La dosis se determinará mediante la eficacia del material de TCR de la invención particular y el estado del animal (por ejemplo, ser humano), así como el peso corporal del animal (por ejemplo, ser humano) que va a tratarse.

Se conocen en la técnica muchos ensayos para determinar una dosis administrada. Para fines de la invención, un ensayo, que comprende comparar el grado en el que se lisan las células diana o se secreta IFN-y por células T que expresan el TCR, polipéptido o proteína de la invención tras la administración de una dosis dada de tales células T a un mamífero entre un conjunto de mamíferos de los cuales se administra a cada uno una dosis diferente de las células T, podría usarse para determinar una dosis de partida que va a administrarse a un mamífero. El grado al que se lisan las células diana o se secreta IFN-y tras la administración de una cierta dosis puede someterse a ensayo mediante métodos conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento como ejemplos 2 y 5.

La dosis del material de TCR de la invención también se determinarán mediante la existencia, naturaleza y grado de cualquier efecto secundario adverso que podría acompañar a la administración de un material de TCR de la invención particular. Normalmente, el médico encargado decidirá la dosificación del material de TCR de la invención con la que se trata cada paciente individual, teniendo en cuenta una variedad de factores, tales como edad, peso corporal, salud general, dieta, sexo, material de TCR de la invención que va a administrarse, vía de administración y la gravedad del estado que está tratándose. A modo de ejemplo y sin pretender limitar la invención, la dosis del material de TCR de la invención puede ser de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal del sujeto que está tratándose/día, de desde aproximadamente 0,0001 hasta aproximadamente 0,001 g/kg de peso corporal/día, o de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1 g/kg de peso corporal/día.

Un experto habitual en la técnica apreciará fácilmente que los materiales de TCR de la invención pueden modificarse de cualquiera de varias maneras, de modo que se aumenta la eficacia terapéutica o profiláctica de los materiales de TCR de la invención a través de la modificación. Por ejemplo, los materiales de TCR de la invención pueden conjugarse o bien directa o bien indirectamente a través de un ligador con un resto de direccionamiento. La práctica de conjugar compuestos, por ejemplo, materiales de TCR de la invención, con restos de direccionamiento se conoce en la técnica. Véanse, por ejemplo, Wadhwa et al., J. Drug Targeting, 3, 111-127 (1995) y la patente estadounidense n.º 5.087.616. El término “resto de direccionamiento” tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier molécula o agente que reconoce y se une específicamente a un receptor de la superficie celular, de manera que el resto de direccionamiento dirige la administración de los materiales de TCR de la invención a una población de células en cuya superficie se expresa el receptor. Los restos de direccionamiento incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, o fragmentos de los mismos, péptidos, hormonas, factores de crecimiento, citocinas y cualquier otro ligando natural o no natural, que se une a los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de factor de crecimiento epitelial (EGFR), receptor de células T (TCR), receptor de células B (BCR), CD28, receptor de factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), receptor de acetilcolina de tipo nicotínico (nAChR), etc.). El término “ligador” tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier agente o molécula que forma un puente entre los materiales de TCR de la invención y el resto de direccionamiento. Un experto habitual en la técnica reconoce que los sitios en los materiales de TCR de la invención, que no son necesariamente para la función de los materiales de TCR de la invención, son sitios ideales para unir un ligador y/o un resto de direccionamiento, siempre que el ligador y/o el resto de direccionamiento, una vez unido a los materiales de TCR de la invención, no interfiera(n) con la función de los materiales de TCR de la invención, es decir, la capacidad para unirse a un antígeno de cáncer, o detectar, tratar o prevenir el cáncer.

Alternativamente, los materiales de TCR de la invención pueden modificarse para dar una forma de depósito, de modo que la manera en la que los materiales de TCR de la invención se liberan en el cuerpo al que se administran se controla con respecto al tiempo y la ubicación dentro del cuerpo (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 4.450.150). Las formas de depósito de materiales de TCR de la invención pueden ser, por ejemplo, una composición implantable que comprende los materiales de TCR de la invención y un material poroso o no poroso, tal como un polímero, en el que los materiales de TCR de la invención se encapsulan o se difunden por todo el material y/o la degradación del material no poroso. Entonces se implanta el depósito en la ubicación deseada dentro del cuerpo y los materiales de TCR de la invención se liberan del implante a una velocidad predeterminada.

Se contempla que las composiciones farmacéuticas, TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células huésped o poblaciones de células de la invención pueden usarse en métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad en un huésped. Sin querer restringirse a ninguna teoría particular, se creen que los TCR de la invención tienen actividad biológica potenciada, de manera que el TCR (o polipéptido o proteína de la invención relacionados), cuando se expresan por una célula, puede mediar una respuesta inmunitaria más fuerte contra la célula que expresa el antígeno para el que el TCR es específico. En este sentido, la invención proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad en un huésped, que comprende administrar al huésped cualquiera de las composiciones farmacéuticas en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la enfermedad en el huésped.

La enfermedad puede ser cualquier enfermedad que implique un antígeno, por ejemplo, una enfermedad infecciosa, una enfermedad autoinmunitaria, un cáncer.

Para fines en el presente documento, “enfermedad infecciosa” significa una enfermedad que puede transmitirse de persona a persona o de organismo a organismo, y está provocada por un agente microbiano (por ejemplo, resfriado común). Se conocen en la técnica enfermedades infecciosas e incluyen, por ejemplo, hepatitis, enfermedades de transmisión sexual (por ejemplo, clamidia, gonorrea), tuberculosis, VIH/SIDA, difteria, hepatitis B, hepatitis C, cólera y gripe.

Para fines en el presente documento, “enfermedad autoinmunitaria” se refiere a una enfermedad en la que el cuerpo produce una respuesta inmunogénica (es decir, sistema inmunitario) frente a algún constituyente de su propio tejido. En otras palabras, el sistema inmunitario pierde su capacidad para reconocer algún tejido o sistema dentro del cuerpo como “propio” y los selecciona como diana y ataca como si fueran extraños. Las enfermedades autoinmunitarias pueden clasificarse en aquéllas en las que se ve afectado predominantemente un órgano (por ejemplo, anemia hemolítica y tiroiditis antiinmunitaria), y aquéllas en las que el proceso de enfermedad autoinmunitaria se difunde a través de muchos tejidos (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico). Por ejemplo, se piensa que la esclerosis múltiple está provocada por células T que atacan a las vainas que rodean las fibras nerviosas del cerebro y la médula espinal. Esto da como resultado pérdida de coordinación, debilidad y visión borrosa. Se conocen en la técnica enfermedades autoinmunitarias e incluyen, por ejemplo, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Grave, lupus, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, anemia hemolítica, tiroiditis antiinmunitaria, lupus eritematoso sistémico, enfermedad celíaca, enfermedad de Crohn, colitis, diabetes, esclerodermia, psoriasis y similares.

Con respecto a los métodos de la invención, el cáncer puede ser cualquier cáncer, incluyendo cualquiera de cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de huesos, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer del ano, canal anal o anorrectal, cáncer del ojo, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer del cuello, vesícula biliar o pleura, cáncer de la nariz, cavidad nasal u oído medio, cáncer de la cavidad oral, cáncer de la vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer esofágico, cáncer de cuello uterino, tumor carcinoide gastrointestinal, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma de no Hodgkin, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal (por ejemplo, carcinoma de células renales (RCC)), cáncer de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer de uréter y cáncer de vejiga urinaria. Preferiblemente, el cáncer es melanoma.

Los términos “tratar” y “prevenir” así como palabras que surgen de los mismos, tal como se usa en el presente documento, no implican necesariamente prevención o tratamiento completo o del 100%. Más bien, existen grados variables de tratamiento o prevención de los cuales un experto habitual en la técnica reconoce que tienen un beneficio potencial o efecto terapéutico. En este sentido, los métodos de la invención pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de tratamiento o prevención de cáncer en un mamífero. Además, el tratamiento o la prevención proporcionada por el método de la invención puede incluir el tratamiento o la prevención de uno o más estados o síntomas de la enfermedad, por ejemplo, cáncer, que está tratándose o previniéndose. Además, para fines en el presente documento, “prevención” puede abarcar retrasar la aparición de la enfermedad, o un síntoma o estado de la misma.

También se proporciona un método de detección de una célula enferma en un huésped. El método comprende (i) poner en contacto una muestra que comprende células del huésped con cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células huésped y poblaciones de células huésped de la invención descritas en el presente documento, formando de ese modo un complejo, y detectar el complejo, en el que la detección del complejo es indicativa de la presencia de la enfermedad en el huésped.

En el método de tratamiento o prevención de una enfermedad o de detección de una célula enferma, el TCR de la invención tiene especificidad antigénica por un antígeno que es característico de la enfermedad que va a tratarse, prevenirse o detectarse. Por ejemplo, si la enfermedad que va a tratarse, prevenirse o detectarse es melanoma, el TCR de la invención tiene especificidad antigénica por un antígeno de melanoma, por ejemplo, MART-1, NY-ESO-1, gp100, etc. Si una célula huésped o una población que comprende al menos una célula huésped se usa en el método, la célula huésped expresa de manera deseable un TCR que tiene especificidad antigénica por el antígeno de la enfermedad. Si un ácido nucleico o vector de expresión recombinante de la invención se usa en el método, el ácido nucleico o vector de expresión recombinante codifica de manera deseable para el TCR que tiene especificidad antigénica por un antígeno de la enfermedad que va a tratarse, prevenirse o detectarse, de manera que se logra la expresión del ácido nucleico o vector de expresión recombinante en una célula y el TCR expresado por la célula puede unirse al antígeno de la enfermedad.

Con respecto al método de detección de la invención de una célula enferma en un huésped, la muestra que comprende células del huésped puede ser una muestra que comprende células completas, lisados de las mismas, o una fracción de los lisados de células completas, por ejemplo, una fracción nuclear o citoplasmática, una fracción de proteína completa, o una fracción de ácido nucleico. Si la muestra comprende células completas, las células pueden ser cualquier célula del huésped, por ejemplo, las células de cualquier órgano o tejido, incluyendo células sanguíneas.

Para fines del método de detección de la invención, la etapa de puesta en contacto puede tener lugar in vitro o in vivo con respecto al huésped. Preferiblemente, la puesta en contacto es una etapa in vitro.

Además, la detección del complejo puede producirse a través de cualquiera de varias formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células huésped, poblaciones de células, o anticuerpos, o partes de unión a antígeno de los mismos de la invención, descritos en el presente documento, pueden marcarse con un marcador detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa del rábano) y partículas elementales (por ejemplo, partículas de oro).

Para fines de los métodos de la invención, en los que se administran células huésped o poblaciones de células al huésped, las células pueden ser células que son alogénicas o autólogas para el huésped. Preferiblemente, las células son autólogas para el huésped.

El huésped al que se hace referencia en el presente documento puede ser cualquier huésped. Preferiblemente, el huésped es un mamífero. Tal como se usa en el presente documento, el término “mamífero” se refiere a cualquier mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden Logomorpha, tales como conejos. Se prefiere que los mamíferos sean del orden Carnivora, incluyendo felinos (gatos) y caninos (perros). Se prefiere más que los mamíferos sean del orden Artiodactyla, incluyendo bovinos (vacas) y porcinos (cerdos) o del orden Perssodactyla, incluyendo equinos (caballos). Se prefiere más que los mamíferos sean del orden Primates, ceboides o simoides (monos) o del orden Antropoide (seres humanos y simios). Un mamífero especialmente preferido es el ser humano.

La invención proporciona además un método de mejora de la actividad biológica de un TCR, en el que el TCR es un TCR de un primer huésped. El método comprende reemplazar, por medio de, por ejemplo, ingeniería genética, la región constante del TCR por una región constante que comprende al menos un dominio extracelular de una región constante de un TCR de un segundo huésped.

Sin querer restringirse a ninguna teoría particular, se contempla que los TCR quiméricos de la invención presenten actividad biológica potenciada debido al apareamiento preferente de regiones constantes no humanas, por ejemplo, murinas en células que expresan los TCR quiméricos. En particular, se contempla que el dominio extracelular de la región constante no humana confiera al TCR quimérico actividades biológicas potenciadas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “actividad biológica” en el contexto de un TCR se refiere a cualquier actividad biológica de un TCR conocido en la técnica. Por ejemplo, la actividad biológica de un TCR puede ser el reconocimiento y la unión a un antígeno, la secreción de una citocina, por ejemplo, IL-2, GM-CSF, IFN-y, tras la unión al antígeno, la citólisis de una célula que presenta el antígeno, la expresión sobre la superficie celular, la asociación con CD3, la activación de moléculas posteriores, la activación de genes particulares, etc.

Con respecto al método de la invención de mejora de la actividad biológica de un TCR, el primer huésped puede ser cualquier huésped, incluyendo cualquiera de los huéspedes descritos en el presente documento. Preferiblemente, el primer huésped es un ser humano. Además, el segundo huésped del método de la invención puede ser cualquier huésped, incluyendo cualquiera de los huéspedes descritos en el presente documento. Se prefiere que el segundo huésped sea un ratón.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención pero, por supuesto, no deben interpretarse de ningún modo que limitan su alcance.

Las siguientes células se usan en los ejemplos descritos en el presente documento y se cultivan tal como se describe a continuación.

Todas las CMSP de este estudio son de pacientes con melanoma metastásico tratados en el Surgery Branch, National Cancer Institute (NCI), NIH, Bethesda, MD. Jurkat RT3-T3.5 es un mutante de Jurkat inducido por radiación que es negativo para TCR de superficie (Weiss et al., J. Exp. Med., 160, 1284-1299 (1984)) (ATCC TIB-153). Líneas celulares de melanoma: 526 (HLA-A2+), 624 (HLA-A2+), 624.38 (HLA-A2+), 888 (HLA-A2-), 938 (HLA-A2-) se generan en el Surgery Branch tal como se describió anteriormente (Topalian et al., J. Immunol., 142, 3714-3725 (1989)). Líneas celulares p53+/HLA-A2+ son: H2087 (ATCC/CRL-5922), MDA-MB-231(ATCC/HTB-26) y p53-/HLA-A2+ Saos 2 (ATCC-HTB-85). Células T2 son una línea celular linfoblastoide deficiente en función TAP cuya proteína HLA/A2 puede cargarse fácilmente con péptidos exógenos (Salter et al., Immunogenetics, 21, 235-246 (1985)).

Se cultivan todas las células en medios R10 que consisten en RPMI 1640 complementado con un 10% de FBS inactivado por calor (Biofluids, Rockville, MD) y se mantienen en un incubador a 37ºC y el 5% de CO2. Se cultivan linfocitos en medio AIM-V (Invitrogen, Carlsbad CA) complementado con un 5% de suero AB humano (Valley Biomedical, Winchester, VA) y 300 UI/ml de IL-2 a 37º C y el 5% de CO2.

EJEMPLO 1

Este ejemplo demuestra la generación de TCR quiméricos que comprenden una región variable humana y una región constante que comprenden al menos un dominio extracelular de una región constante no humana.

Se subclonan las cadenas a y 1 de un TCR murino (que comprende regiones tanto variables como constantes murinas) específico para p53264-272 (Cohen et al., J. Immunol., 175, 5799-5808 (2005)) en el vector pGEM-4Z/64A tal como se describió anteriormente (Zhao et al., Blood, 102, 4137-4142 (2003), Zhao et al., Mol. Ther., 12, 247-253 (2005)). Este TCR anti-p53 completamente murino se denomina en el presente documento TCR de p53 MM. Se subclonan las cadenas a y 1 de un TCR humano (que comprende regiones tanto variables como constantes humanas) específico para MART-1/27L (Hughes et al., Hum. Gene Ther., 16, 1-16 (2005)) en el vector pGEM

5 4Z/64A de la misma manera que para las cadenas a y 1 del TCR de p53 MM.

Se diseñan TCR quiméricos en los que las regiones constantes originales se reemplazan por secuencias de regiones constantes o bien de ratón o bien humanas para generar: (1) un TCR específico de p53 murino con regiones constantes humanas (p53-MH), (2) un TCR específico de MART-1 humano con regiones constantes 11 murinas (MART-HM), (3) un TCR específico de NY-ESO-1 humano con regiones constantes murinas (NY2 HM), (4)

10 un TCR específico de gp100 humano con regiones constantes murinas (gp100 HM), (5) un segundo TCR específico de MART-1 humano con regiones constantes 11 murinas (MART HMF5; que tiene regiones variables que son diferentes de las de MART HM), y (6) un TCR específico de MART-1 humano con regiones constantes 12 murinas (MART HMF4B2; que es el mismo TCR que MART HM, excepto porque las regiones constantes murinas son de la cadena 12 murina, en contraposición a la cadena 11 murina).

15 Específicamente, los TCR quiméricos se construyen intercambiando las regiones de los TCR completamente humanos o completamente murinos por regiones constantes o bien humanas o bien murinas usando un enfoque basado en megacebador (Sarkar et al., Biotechniques, 8, 404-407 (1990)).

Para humanizar el TCR de p53 MM, se reemplazan las regiones constantes murinas por las regiones constantes humanas del TCR de MART HH. La versión humanizada de p53 MM se denomina en el presente documento p53 20 MH. Los cebadores utilizados para amplificar el dominio a variable de p53 son p53vA-RNAF y p53vA-RNAR para generar el megacebador p53vA. Los cebadores usados para amplificar el dominio 1 variable de p53 son p53vB-RNAF y p53vB-RNAR para generar el megacebador p53vB. Se usan entonces los megacebadores para fusionar las regiones constantes humanas del TCR de MART HH con las regiones variables del TCR de p53 MM. Se usan p53vA-RNAF y p53HcA-RNAR para generar la cadena a de p53-MH, y se usan p53vB-RNAF y p53HcB-RNAR para

25 generar la cadena 1 de p53-MH. Cada una de las cadenas a y 1 de p53-MH se digieren con XbaI y NotI y se clonan en un vector pGEM-4Z/64A. Las secuencias de nucleótidos de los cebadores usados para construir el TCR de p53 MH se muestran en la tabla 1.

TABLA 1

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos SEQ ID NO.

p53vA-RNAF: ATCTAGAGCCGCCATGGCTCCTGGCGCTCCTCCCAG 36

p53vA-RNAR: 37

p53vB-RNAF: ATCTAGAGCCGCCATGGCTACAAGGCTCCTCTGTTAC 38

p53vB-RNAR: 39

p53HcA-RNAR: CTAGGCGGCCGCTCAGCTGGACCACAGCCGCAG 40

p53HcB-RNAR: 41

De manera similar, para “murinizar” TCR de MART HH humano, se amplifica en primer lugar la cadena a variable

30 con los cebadores MARTvA-RNAF y MARTvA-RNAR para generar el megacebdor MARTvA. Se amplifica la cadena 1 variable con los cebadores MARTvB-RNAF y MARTvB-RNAR para generar el megacebador MART-vB. Se someten entonces los megacebadores a una segunda reacción de PCR usando o bien los cebadores MARTvA-RNAF y MART-McA-RNAR para generar la cadena MARTHMa o bien los cebadores MARTvB-RNAF y MART-McB-RNAR para generar la cadena MART-HM1. Se digiere el producto MART-HMa con XbaI y NotI, mientras que se

35 digiere el producto MART-HM1 con HindIII y NotI. Se clona posteriormente cada uno de los productos de digestión en un vector pGEM-4Z/64A. La versión murinizada del TCR de MART HH se denomina en el presente documento MART HM. Las secuencias de los cebadores usados para construir MART HM se enumeran en la tabla 2.

TABLA 2

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos SEQ ID NO.

MARTvA-RNAF: 42

MARTvA-RNAR: 43

MARTvB-RNAF: 44

MARTvB-RNAR: 45

MART-McA-RNAR: CCGCGGCCGCTCAACTGGACCACAGCCTCAGCG 46

MART-McB-RNAR: CCGCGGCCGCTCATGAATTCTTTCTTTTGACCATAGC 47

También se construye una versión quimérica de ratón (“murinizada”) de un TCR específico de NY-ESO-1 restringido por HLA-DP4 (NY2 HH) (Zhao et al., J. Immunother., en prensa). La versión murinizada se denomina en el presente documento NY2 HM. En resumen, se amplifica la cadena a variable humana de NY2 HH usando los cebadores T7-ESO-II-a y AV9-2-mca-r y entonces se liga a una región constante a de ratón mediante PCR usando los cebadores T7-ESO-II-a y mCA-r1. Se amplifica la cadena 1 variable de NY2 HH con los cebadores T7-ESO-II-b y BV20-1-mcb-r y se une a la región constante 1 de ratón mediante PCR usando los cebadores T7-ESO-II-b y mCB-r1. Las secuencias de nucleótidos de los cebadores usados en la preparación del TCR de NY2 MH se muestran en la tabla

3.

TABLA 3

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos SEQ ID NO.

T7-ESO-II-a: 48

AV9-2-mca-r: 49

mCA-r1: AATGCGGCCGCTCAACTGGACCACAGCCTCAG 50

T7-ESO-II-b: 51

BV20-1-mcb-r: 52

mCB-r1: AATGCGGCCGCTCATGAATTCTTTCTTTTGACCATAG 53

Se usa el mismo enfoque usado para construir NY2 HM para construir una versión murinizada de un TCR específico de gp100 humano (gp100 HM), y se usa el enfoque usado para construir MART HM para construir dos TCR específicos de MART-1 murinizados adicionales, en los que, para uno de los TCR específicos de MART-1 adicionales, se reemplazó la región constante murina de MART HM por la regiones constantes murinas de la cadena

5 12 murina para generar el MART HMF4B2, mientras que, para el segundo TCR específico de MART-1 adicional, se reemplazaron las regiones variables de MART HM por diferentes regiones variables específicas de MART-1 para generar el TCR de MART HMF5.

En resumen, se amplifica la cadena a variable humana de MART HMF5 usando el cebador F5-9f y cebadores F5-10r y entonces se unen para generar un megacebador MART HMF5 vA, mientras que se amplifica la cadena 1 variable

10 humana usando los cebadores F5-13F y F5-14R y entonces se unen para construir el megacebador MART HMF5 vB. Se somete cada megacebador a una segunda reacción de PCR usando los cebadores F5-9f y Mca-r1 (para la cadena a) y los cebadores F5-13F y Mcb-rl (para la cadena 1). Se clona cada una de las cadenas alfa y beta del TCR de MART HMF5 en un vector pGEM.

Se amplifica la cadena a variable humana de GP100 HM usando los cebadores T7-gp100a y gp100 mcaR y

15 entonces se une a una región constante a de ratón mediante PCR usando los cebadores T7-gp100a y 64A-Malpha r. Se amplifica la cadena 1 variable humana de GP100 HM usando los cebadores T7-GP100b y gp100-mcBR y entonces se une a una región constante 1 de ratón mediante PCR usando los cebadores T7-GP100b y 64A-Mbeta r. Entonces se transcriben in vitro los productos de PCR de cada cadena. Las secuencias de los cebadores usados para construir estos TCR murinizados se muestran en las tablas 3 y 4.

20 TABLA 4 Se genera ARNm transcrito in vitro para las cadenas de TCR tanto a como 1 a partir de los vectores pGEM-4Z/64A que contienen los genes de TCR quiméricos usando mMESSAGE mMACHINE (Ambion, Austin, Texas) y se purifica usando el kit QIAgen RNAeasy mini® (Qiagen, Valencia, California).

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos SEQ ID NO.

F5-9f: 54

F5-10r: 55

F5-13F: 56

F5-14R: 57

T7-gp100a: 58

gp100-mcaR: 59

T7-gp100b: 60

gp100-mcBR: 61

64A-Malpha r: 62

64A-Mbeta r: 63

5 Se someten a electroporación PBL tal como se describió anteriormente (Zhao et al., 2005, citado anteriormente). En resumen, se recogen PBL mediante leucoféresis y se separan los linfocitos de las células sometidas a leucoféresis mediante centrifugación en un colchón de Ficoll/Hypaque. Se lavan los linfocitos en HBSS y se resuspenden en AIM-V complementado con un 5% de suero humano, OKT3 50 ng/ml, 300 UI/ml de IL-2 a una concentración de 1 x 106 células/ml. Entonces se siembran en placas los linfocitos a 1x106 células/ml en placas de 24 pocillos (Costar,

10 Cambridge, MA) y se cultivan durante al menos 1 semana con la adición de medio nuevo (sin OKT3) según se necesite para mantener una densidad celular de 1x106 células/ml.

Se lavan los linfocitos en OPTI-MEM (Invitrogen, Carlsbad CA) y se resuspenden a 2,5 x 107 células/ml. Se transfieren las células a cubetas de 2 mm enfriadas sobre hielo y entonces se someten a electroporación a 500 V/500 !s usando un porador ElectroSquare ECM 830 (BTX, San Diego, CA). La cantidad de ARNm transcrito in

15 vitro para cada cadena es de 2 !g por 106 CMSP a menos que se indique lo contrario. Siempre que se necesite, se normaliza la cantidad de ARNm electroporado usando ARNm no específico. Tras la electroporación, se transfieren las células a placas de 6 pocillos que contienen medio de cultivo nuevo y se cultivan a 37ºC.

Veinticuatro horas tras la electroporación, se tiñen las células electroporadas con ARNm de p53 MM o p53 MH ARNm con pentámero de p53264-272/HLA-A2 Pro5 marcado con APC (ProImmune, Oxford, RU) y se tiñen las células

20 electroporadas con ARNm de MART HH o MART HM con tetrámero de MART-1/27L marcado con APC (Beckman Coulter, San Jose, CA). Se tiñen las células en un tampón FACS compuesto por PBS (Bio Whitaker, Walkersville, MD), BSA al 0,5% y azida sódica al 0,02%. Se mide la inmunofluorescencia, analizada como la fluorescencia log relativa de células vivas (1x105), usando un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey).

25 Tal como se observa en la figura 2, el TCR de p53-MM se expresa a un nivel superior (intensidad de fluorescencia media – IFM = 481) en la superficie de la mayoría de los linfocitos humanos electroporados (93,2%), mientras que sólo el 63,1% son positivos para el TCR quimérico de p53 MH, y la expresión es inferior (IFM = 116) (figura 2A y 2B respectivamente).

De manera similar, las células que expresan el TCR de MART-HM se tiñen en una proporción superior (72,5%) y

30 tienen una IFM mayor (88,5) que los linfocitos que expresan el TCR de MART-HH (30,1%; IFM = 44,8) (figura 2C y 2D respectivamente). La duración de la tinción de la superficie celular para el TCR de MART HM es también mayor que para el TCR de MART HH (tabla 5). A los dos días de la electroporación, las células electroporadas con MART-HH expresan cantidades inferiores de TCR (7,1%) que el MART-HM (46,8%), y el MART-HH es casi indetectable (1,3%) en el día 3 mientras que más del 17% de los linfocitos que expresan MART-HM son positivos para el

35 tetrámero.

TABLA 5

Día 1 tras la electroporación: Día 2 tras la electroporación Día 3 tras la electroporación

MART HH: 30,1% (44,8) 7,1%(20,2) 1,3% (17,2)

MART HM: 72,5% (88,5) 46,8% (25,2) 17,6% (17,2)

El porcentaje de células positivas, así como la intensidad de fluorescencia media relativa (entre paréntesis) de la población seleccionada en la ventana, se muestran a los 1, 2 y 3 días tras la electroporación. Este ejemplo demuestra que los TCR quiméricos que comprenden regiones variables humanas y regiones 40 constantes murinas presentan expresión potenciada en PBL humanos. EJEMPLO 2 Este ejemplo demuestra la actividad biológica potenciada de los TCR quiméricos.

Se someten a electroporación PBL humanos con los ARNm de las cadenas a y 1 de TCR del TCR de p53 MM, TCR de MART HH, TCR de p53 MH o MART HM, con los ARNm de la cadena a del TCR de p53 MM y la cadena 1 del p53 MH (p53Ma/H1), con la cadena a del TCR de p53 MH y los ARNm de la cadena 1 del TCR de p53 MM (p53M1/Ha), con la cadena a del TCR de MART HH y la cadena 1 del MART HM (MART Ha/ M1), o con la cadena a

5 del TCR de MART HM y la cadena 1 del TCR de MART HH (MART H1/ Ma), tal como se describe en el ejemplo 1. Se cultivan las células electroporadas y entonces se estimulan con OKT-3.

Se pulsan células T2 con 1 !g/ml de péptidos específicos para uno de los TCR (péptidos p53264-272 o MART-1 27L 2635) o con péptidos no específicos (gp100 210M 209-217, gp100280-288, HBVc 23Y 18-27 o p53149-157) en medio durante 2 h a 37ºC. Se lavaron tres veces las células pulsadas con medio.

10 Las secuencias de los péptidos de este ensayo se muestran en la tabla 6.

TABLA 6

Nombre del péptido: Secuencia SEQ ID NO.

p53264-272: LLGRNSFEV 64

MART-1 27L 26-35: ELAGIGILTV 65

gp100 210M 209-217: IMDQVPFSV 66

gp100280-288: YLEPGPVTA 67

HBVc 23Y 18-27: FLPSDYFPSV 68

p53149-157: STPPPGTRV 69

Flu-MP58-66: GILGFVFTL 70

NY-ESO-1161-180: WITQCFLPVFLAQPPSGQRA 71

Se incuban las células que responden (1x105 PBL electroporados) y 1x105 células estimuladoras (células T2 pulsadas) en un volumen de cultivo de 0,2 ml en pocillos individuales de placas de 96 pocillos. Se cocultivan las células estimuladoras y las células que responden durante de 16 a 24 h. Se mide la secreción de citocinas de

15 sobrenadantes de cultivo diluidos hasta el intervalo lineal del ensayo usando kits de ELISA disponible comercialmente (IFN-y, IL-2 y GM-CSF; Endogen, Cambridge, MA).

Mientras que todos los TCR de p53 MM, p53 MH, MART HH y MART HM median la liberación de IFN-y específica de antígeno, el TCR de p53-MM media la secreción de más de dos veces la cantidad de IFN-y en comparación con el TCR de p53-MH humanizado (57.800 frente a 25.600 pg/ml). El TCR de MART-HM murinizado media un aumento 20 del nivel de secreción de IFN-y en comparación con el TCR completamente humano, MART-HH (22.450 frente a

9.600 pg/ml para TCR de MART-1) (figura 3A-B). Se detecta poca o nada de secreción de IFN-y cuando cada cadena se sometió a electroporación sola o cuando las células T2 se pulsan con péptidos no específicos (datos no mostrados). Por consiguiente, se secretan niveles superiores de GM-CSF por PBL que expresan TCR con regiones constantes murinas (TCR de p53-MM o TCR de MART HM y cocultivados con células T2 pulsadas con péptidos

25 (p53-MM-24.274 frente a p53-MH-12.317 pg/ml y 31.376 frente a 15.023 pg/ml para MART HM y HH respectivamente).

También se somete a prueba la función de diferentes combinaciones de cadenas de TCR, por ejemplo la cadena a de p53-TCR (Ha) con la cadena 1 de p53-TCR de ratón completa original (M1). Ambas combinaciones Ha/M1 y Ma/H1 para TCR anti-p53 y anti-MART-1 pueden mediar la secreción específica de antígeno de IFN-y en cocultivos

30 con células T2 pulsadas con péptidos. Sin embargo, estas concentraciones son siempre inferiores que la combinación de TCR completamente humano (Ha/H1) o el TCR completamente murino (Ma/M1) (figura 3A-B). Estos datos sugieren que regiones constantes humanas y de ratón pueden aparearse aunque esto da como resultado menos actividad biológica.

Para investigar la generalidad de estos resultados a otros TCR quiméricos, se compara la actividad de un TCR

35 específico de NY-ESO-1 restringido por HLA-DP4/clase II humana (NY2-HH) con su forma murinizada (NY2-HM). Las células, que están enriquecidas en células CD4+ mediante un enfoque basado en perlas magnéticas (Dynal Biotech, Brown Deer, WI, y Miltenyi Biotech, Album, CA), se someten a electroporación con los ARNm que codifican para cualquiera de NY2-HH y NY2-HM. Posteriormente, se cocultivan las células electroporadas durante la noche en presencia de células EBV-B HLA-DP4+ pulsadas con o sin epítopo peptídico específico de TCR (NY-ESO-1161-180;

40 secuencia mostrada en la tabla 6).

Tal como se muestra en la figura 3C, se observan niveles superiores de IFN-y secretados por PBL que expresan NY2-HM en comparación con NY2-HH (1996 pg/ml frente a 642 pg/ml respectivamente), mientras que no hay ninguna diferencia significativa en los niveles de IFN-y secretados por cocultivos con células diana no pulsadas. Adicionalmente, la estrategia de reemplazamiento de la región constante de TCR también demuestra ser beneficiosa para otras dos clases de TCR humanos restringidos por CMH de clase I dirigidos contra los antígenos de melanoma gp100 y MART-1 (datos no mostrados), porque células que expresan el TCR de gp100 HM y los TCR de MART HMF5 presentan niveles superiores de secreción de IFN-y en comparación con los TCR homólogos completamente humanos.

Este ejemplo demuestra que TCR quiméricos que comprenden regiones variables humanas y regiones constantes murinas presentan una actividad biológica superior.

EJEMPLO 3

Este ejemplo demuestra el apareamiento preferente de cadenas de TCR de ratón con sus homólogos.

Debido a que una proporción aumentada de células positivas para el tetrámero MART-1 expresan la forma murinizada del TCR anti-MART-1 (MART HM), en vez de la versión completamente humana (MART HH), se plantea la hipótesis de que las regiones constantes de ratón se aparean preferentemente consigo mismas.

Para someter a prueba esta hipótesis, se realiza un experimento de competición. En resumen, se someten a electroporación células Jurkat RT3-T3.5 deficientes en TCR con 1 !g de cada uno del ARNm de la cadena a y el ARNm de la cadena 1 de o bien el TCR de MART-HH o bien el TCR de MART-HM, en combinación con 1 !g de cada uno del ARNm de la cadena a y el ARNm de la cadena 1 de un TCR competidor (TCR específico de gp100 (Morgan et al., J. Immunol., 171, 3287-3295 (2003)), p53-MH, o uno de dos TCR específicos de NY-ESO-1 (una amable donación del Dr. Paul Robbins, Surgery Branch, NCI). Se somete a electroporación una muestra con 0,2 !g de ARNm de TCR competidor. Veinticuatro horas tras la electroporación, se tiñen las células con tetrámero MART-1. Se calcula el porcentaje de expresión de TCR de MART-1 dividiendo el porcentaje de células positivas para el tetrámero electroporadas con ARNm de TCR competidor entre el porcentaje de células positivas para el tetrámero sin ARNm de TCR competidor y luego multiplicando por 100.

Tal como se demuestra en la figura 4A, el TCR de MART-HM es relativamente insensible a la expresión adicional de TCR competidores. En contraposición, la expresión del MART-HH se reduce significativamente cuando se expresa con TCR competidores. Esta competición parece ser dependiente de la dosis, puesto que se observa un aumento en la intensidad de fluorescencia para tanto MART-HH como MART-HM cuando la cantidad del p53-MH competidor disminuye en cinco veces hasta 0,2 !g. Adicionalmente, se indican niveles variables de competición entre la expresión de diferentes TCR competidores, lo que puede reflejar interacciones preferentes de ciertos TCR con las regiones variables de TCR de MART-1 que conducen a diferentes eficacias de expresión (Saito et al., J. Immunol., 143, 3379-3384 (1989), Gouaillard et al., Eur. J. Immunol, 31, 3798-3805 (2001), y Li et al., Immunology, 88, 524-530 (1996)) o una “exclusión alélica funcional” al nivel de la proteína (Sant’Angelo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 98, 6824-6829 (2001)).

Se tiñen las células electroporadas para detectar la expresión de superficie de V112 con un anticuerpo frente a V112 humano teñido con PE (Immunotech, Westbrook, ME) en el tampón FACS descrito en el ejemplo 1. Posteriormente, se analizan las células teñidas mediante FACS tal como se describió anteriormente en el ejemplo 1. Se observan niveles similares para ambos TCR de MART-1 (MART HH y MART HM) (datos no mostrados), lo que sugiere que la disminución en la tinción de tetrámeros de MART-HH no se debe a una expresión de cadenas de TCR inferior, sino más probablemente se debe a apareamiento no específico con las cadenas competidoras.

Este ejemplo demuestra un posible mecanismo mediante el cual los TCR quiméricos presentan una expresión aumentada en comparación con sus receptores homólogos.

EJEMPLO 4

Este ejemplo demuestra el aumento de la estabilidad del complejo CD3 /TCR que comprende TCR quiméricos que comprenden regiones variables humanas y regiones constantes de ratón.

Debido a su cola intracelular relativamente corta, el heterodímero de TCR no puede señalizar por sí mismo. En su lugar, la señal de reconocimiento de TCR se transporta por el complejo de CD3 que está unido de manera no covalente a las cadenas a y 1 de TCR (Call et al., Cell, 111, 967-979 (2002)). La naturaleza de la interacción entre las regiones constantes humanas o de ratón de TCR de los TCR quiméricos y el complejo de CD3 humano se examina a continuación.

Se someten a electroporación células Jurkat RT3-T3.5 con ARNm que codifican para o bien el TCR de MART-HH completamente humano o su homólogo quimérico de ratón, MART-HM. Veinticuatro horas tras la electroporación, se tiñen las células con tetrámero MART-1 tal como se describe en el ejemplo 1. La tinción reveló que las células electroporadas expresan los TCR (o bien MART-HM o bien MART-HH) a niveles similares. Se lavan las células electroporadas una vez con PBS y se colocan en tampón de lisis que contiene NP-40 al 1% o Brij96 al 1%, Tris-HCl 10 mM (pH 7,2), NaCl 140 mM, EDTA 2 mM, yodoacetamida 5 mM, Na3VO4 1 mM y cóctel inhibidor de proteasas completo (Boehringer Mannheim) tal como se describió anteriormente (Dittel et al, Immunity, 11, 289-298 (1999)). Brij 96 es un detergente suave que no disocia el complejo TCR/CD3, mientras que se sabe que NP-40 altera las interacciones TCR-CD3 humano (San Jose et al., Eur. J. Immunol., 28, 12-21 (1998), y Call et al., EMBO J., 23, 2348-2357 (2004)). Se eliminan los residuos nucleares mediante centrifugación y se someten los sobrenadantes resultantes a inmunoprecipitación con anticuerpo anti-TCR V112 (Immunotech -Westbrook, ME) e inmunotransferencia con un anticuerpo específico de CD3- (6B10.2, Santa Cruz, Santa Cruz -CA). Los controles para la carga de muestra consisten en transferencia para CD3- total en lisados celulares.

Tal como se observa en la figura 4B, TCR híbridos tanto humanos como de ratón conservan su interacción con la cadena CD3- en condiciones de detergente suave (Brij96). Sin embargo, cuando se usa el detergente más fuerte NP40, se pierde la asociación de CD3- con TCR que comprenden regiones constantes humanas. En cambio, se detecta una banda de CD3-clara para las células que se someten a electroporación con MART-HM, lo que demuestra que la interacción entre CD3 y el TCR que comprende regiones constantes murinas no se pierde tras la lisis con un detergente fuerte.

Además, experimentos preliminares muestran que son necesarias cadenas tanto a como 1 murinas para lograr una estabilidad de TCR/CD3 potenciada, puesto que ni la combinación de cadena a humana y cadena 1 murina (MART Ha/M1) ni cadena a murina y cadena 1 humana (MART Ma/H1) pueden mediar un efecto de este tipo.

Este ejemplo demuestra que TCR quiméricos que comprenden regiones variables humanas y regiones constantes de ratón presentan una asociación más fuerte con CD3.

EJEMPLO 5

Este ejemplo demuestra que TCR quiméricos que comprenden regiones variables humanas y regiones constantes de ratón tienen una capacidad aumentada para reconocer y destruir tumores.

Puesto que TCR quiméricos que albergan regiones constantes de ratón presentan una actividad biológica superior contra células T2 pulsadas con péptidos, se examina la posible relevancia clínica de estas observaciones sometiendo a prueba el reconocimiento y la destrucción de células tumorales.

Se cocultivan PBL que expresan el TCR de MART HH o MART HM durante veinticuatro horas con tumores humanos: tumores de melanoma HLA-A2+ (526, 624.38 y 624), tumor HLA-A2+/no melanoma (Saos-2) o líneas de melanoma HLA-A2- (938). Se mide la secreción de IFNy o GMCSF por los PBL tal como se describe en el ejemplo 2.

Tal como se muestra en la figura 5A y 5B, tumores de melanoma HLA-A2+ (526 y 624) estimulan específicamente a células T que expresan TCR de MART HH o MART HM para que secreten citocinas IFN-y y GM-CSF. Las células que expresan TCR de MART HM pueden secretar hasta 10 veces más citocina en comparación con el nivel de secreción de citocinas de células que expresan MART HH. No se observa secreción de citocinas significativa en cocultivos con tumor HLA-A2+/no melanoma (Saos-2) o líneas de melanoma HLAA2-(888).

Se cocultivan PBL que expresan el TCR anti-p53 murino original (p53 MM) o su versión humanizada (p53 MH) durante 24 horas con células tumorales HLA-A2+/p53+ (MDA-MB-231 y H2087), 888 o células Saos-2. Se mide la secreción de IFNy o GMCSF por los PBL tal como se describe en el ejemplo 2.

Tal como se muestra en la figura 5 C-D, el nivel de tanto IFN-y como GM-CSF secretado por las células T que expresan TCR humanizado (p53 MH) disminuye en comparación con el TCR completamente de ratón (p53 MM). Se observa de poca secreción de citocinas a secreción no significativa mediante cocultivos control, que consistían en las células que expresan TCR de p53 y o bien células HLA-A2- o bien células p53-.

Adicionalmente, se compara la citotoxicidad mediada por células de PBL humanos que expresan o bien el TCR de MART-HH o bien su híbrido de MART-HM en un ensayo de liberación de 51Cr de 3 horas (Topalian et al., J. Immunol., 142, 3714-3725 (1989)). En resumen, se aíslan células CD8+ a partir de cultivos de PBL usando un enfoque basado en perlas magnéticas (Dynal Biotech, Brown Deer, WI y Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Se someten a electroporación las células CD8+ con ARNm que codifica para el TCR de MART HH completamente humano o MART HM murinizado. Se cocultivan las células electroporadas con células tumorales marcadas con Cr51, que se marcan incubando células tumorales (1x105) durante 1 h a 37ºC con 50 !Ci de 51Cr (Amersham, Arlington Heights, IL). Se incuban células tumorales diana marcadas (2x103) con células efectoras (células CD8+) a razones de célula efectora:célula diana (E:T) de 15:1, 5:1, 1,5:1 o 0,5:1 durante 3 h a 37ºC en 0,2 ml de medio. Se recogen los sobrenadantes de las células y se cuentan usando un contador y automático Wallac 1470 Wizard (Wallac, Gaithersburg, MD). Se determinan las liberaciones de Cr51 total y espontánea incubando 2x103 dianas marcadas en

o bien SDS al 2% o medio durante 3 horas a 37ºC respectivamente. Se realiza cada punto de datos como un promedio de pocillos cuadruplicados. Se calcula el porcentaje de lisis específica tal como sigue: % de lisis específica = (liberación específica-liberación espontánea)/(liberación total-liberación espontánea) x 100.

Tal como se observa en las figuras 6A-C, tanto el MART HH completamente humano como los TCR de MART HM murinizados pueden mediar la lisis específica de líneas tumorales de melanoma HLA-A2+. Sin embargo, los linfocitos que expresan el TCR de MART-HM murinizado demuestran un nivel de citólisis superior en comparación con el TCR de MART-HH humano original (por ejemplo el 65,9% frente al 26,1% de lisis específica para la línea celular diana 526, a una razón E:T de 15:1, respectivamente - figura 6A). No se observa lisis significativa por PBL electroporados de manera simulada o por PBL cocultivados con tumores HLA-A2- o no melanoma (figuras 6D y E).

5 Este ejemplo demuestra que los TCR quiméricos que comprenden regiones variables humanas y regiones constantes de ratón presentan una capacidad superior para reconocer y destruir células tumorales.

EJEMPLO 6

Este ejemplo demuestra que el TCR quimérico que comprende regiones constantes murinas puede mediar el reconocimiento tumoral restringido por CMH de clase I por células CD4+.

10 Mientras que un TCR de alta afinidad puede ser menos dependiente de la participación de un correceptor (Sherman et al., Science, 258, 815-818 (1992)), los receptores restringidos por CMH de clase I normales requieren moléculas de CD8 para estabilizar la unión (van der Merwe et al., Annu. Rev. Immunol., 21, 659-684 (2003), y Wooldridge et al., J. Biol. Chem., 280, 27491-27501 (2005)). Puesto que la avidez de una célula T viene dictada por una combinación de la afinidad de su TCR por un complejo CMH/péptido definido y el número de moléculas de TCR

15 expresadas en la superficie (McKee et al., J. Transl. Med., 3, 35 (2005)), podría ser posible superar la necesidad de un correceptor aumentando la densidad del TCR transferido. Ya que el TCR de MART-HM se expresa a una densidad superior en la superficie celular (figuras 2C y 2D), se postula que este TCR quimérico podría ser biológicamente activo en células CD4+.

Se purifican células CD4+ (más del 95% de pureza) a partir de cultivos de PBL tal como se describe en el ejemplo 2.

20 Se estimulan las células CD4+ con OKT3 y se someten a electroporación con vectores que codifican para el TCR de MART-1 completamente humano original (MART-HH) o el TCR de MART-1 murinizado (MART-1HM), tal como se describe en el ejemplo 1. Se cocultivan las células electroporadas sin (NT) o con una línea tumoral de melanoma HLA-A2+ (526 y 624) o con una línea tumoral de melanoma HLA-A2- (938). Se determina la secreción de citocinas de las células electroporadas tal como se describe en el ejemplo 2.

25 Tal como se muestra en la figura 7A, células efectoras CD4+ que expresan MART-HM podían lograr un nivel superior de secreción de IFN-y en comparación con células efectoras CD4+ que expresan MART-HH. Además, sólo se detectan secreciones de GM-CSF e IL-2 por células que expresan PBL electroporados con MART-HM (figuras 7B y 7C). No se detecta secreción de citocinas significativa por células electroporadas con ARNm control (GFP) o por células no expuestas a dianas.

30 EJEMPLO 7

Este ejemplo demuestra la generación y las pruebas de TCR quiméricos variantes funcionales que comprenden una región variable humana y una región constante humana/de ratón quimérica.

Se construyen las cadenas alfa y beta de TCR quiméricos variantes funcionales mostrados en la tabla 7 usando técnicas de PCR solapante. En resumen, se usan un cebador sentido que coincide con la parte 5’ de la región

35 variable y un cebador antisentido que contiene la mutación en la región constante. Se usa entonces el producto amplificado de esta reacción en una segunda reacción de PCR como parte de los ADN de molde con el mismo cebador directo y un cebador inverso en la parte 3’ de la región constante. Entonces se clona el TCR de longitud completa y se secuencia para verificar la mutación.

TABLA 7

Nombre: SEQ ID NO: Cadena de TCR Descripción de región variable Descripción de región constante

F4-Mut31 alfa: 112 alfa igual que la región variable de MART-HM (región variable específica de MART-1 humano) aa 129-1549 de SEQ ID NO: 112 derivados de la región constante alfa humana + aa 150-264 de SEQ ID NO: 112 derivados de la región constante alfa de ratón

F4-Mut74 alfa: 113 alfa igual que la región variable de MART-HM aa 129-199 de SEQ ID NO: 113 derivados de la región constante alfa humana + aa 200-264 de SEQ ID NO: 113 derivados de la región constante alfa de ratón

F4-AEK-Mut31a/Cpa: 114 alfa igual que la región variable de MART-HM aa 129-167 y 216-245 de SEQ ID NO: 114 derivados de la región constante alfa humana + aa 168-215 y 246266 de SEQ ID NO: 114 derivados de la región constante alfa de ratón

F4-BFK-74a/Cpa: 115 alfa igual que la región variable de MART-HM aa 129-199 y 214-243 de SEQ ID NO: 115 derivados de la región constante alfa humana + aa 200-213 y 244264 de SEQ ID NO: 115 derivados de la región constante alfa de ratón

F4-Mut Cp alfa: 116 alfa igual que la región variable de MART-HM aa 129-213 y 244-264 de SEQ ID NO: 116 derivados de la región constante alfa de ratón + aa 214-243 de SEQ ID NO: 116 derivados de la región constante alfa humana

F4-Mut62 beta: 117 beta igual que la región variable de MART-HM aa 133-166 de SEQ ID NO: 117 derivados de la región constante beta humana + aa 167-305 de SEQ ID NO: 117 derivados de la región constante beta1 de ratón

F4-Mut97 beta: 118 beta igual que la región variable de MART-HM aa 133-220 de SEQ ID NO: 118 derivados de la región constante beta humana + aa 221-309 de SEQ ID NO: 118 derivados de la región constante beta1 de ratón

F4-CGHMut62b/Cpb: 119 beta igual que la región variable de MART-HM aa 133-166 y 261-304 de SEQ ID NO: 119 derivados de la región constante beta humana + aa 167-260 de SEQ ID NO: 119 derivados de la región constante beta1 de ratón

F4-Mut Cp beta: 120 beta igual que la región variable de MART-HM aa 133-260 de SEQ ID NO: 120 derivados de la región constante beta1 de ratón + aa 261-304 de SEQ ID NO: 120 derivados de la región constante beta humana

40 beta: 121 beta igual que la región variable de MART-HM aa 133-193 de SEQ ID NO: 121 derivados de la región constante beta1 de ratón + aa 194-308 de SEQ ID NO: 121 derivados de la región constante beta humana

Cys-F4 (H/M) alfa: 122 alfa igual que la región variable de MART-HM región constante alfa de ratón con aa 175 mutado a Cys

Cys-F4 (H/M) beta1: 123 beta igual que la región variable de MART-HM región constante beta1 de ratón con aa 189 mutado a Cys

Cys-F4 (H/M) beta2: 124 beta igual que la región variable de MART-HM región constante beta2 de ratón con aa 189 mutado a Cys

Cys-F5 (H/M) alfa: 125 alfa igual que la región variable de MART HMF5 región constante alfa de ratón con aa 180 mutado a Cys

Cys-F5 (H/M) beta1: 126 beta igual que la región variable de MART HMF5 región constante beta1 de ratón con aa 188 mutado a Cys

Cys-F5 (H/M) beta2: 127 beta igual que la región variable de MART HMF5 región constante beta2 de ratón con aa 188 mutado a Cys

Cys NY-ESO-1 (H/M) alfa: 128 alfa igual que la región variable de NY2 HM región constante alfa de ratón con aa 180 mutado a Cys

Cys NY-ESO-1 (HIM) beta1: 129 beta igual que la región variable de NY2 HM región constante beta1 de ratón con aa 185 mutado a Cys

Cys NY-ESO-1 (H/M) beta2: 130 beta igual que la región variable de NY2 HM región constante beta2 de ratón con aa 185 mutado a Cys

Cys-gp100 (H/M) alfa: 131 alfa igual que la región variable de gp100 HM región constante alfa de ratón con aa 180 mutado a Cys

Cys-gp100 (H/M) beta1: 132 beta igual que la región variable de gp100 HM región constante beta1 de ratón con aa 188 mutado a Cys

Cys-gp100 (H/M) beta2: 133 beta igual que la región variable de gp100 HM región constante beta2 de ratón con aa 188 mutado a Cys

Cys-IG4 (H/M) alfa: 134 alfa región variable de TCR específico de NY-ESO-1 humano (1G4) región constante alfa de ratón con aa 181 mutado a Cys

Cys IG4 (H/M) beta1: 135 beta región variable de TCR específico de NY-ESO-1 humano (1G4) región constante beta1 de ratón con aa 189 mutado a Cys

Cys IG4 (H/M) beta2: 136 beta región variable de TCR específico de NY-ESO-1 humano (1G4) región constante beta2 de ratón con aa 189 mutado a Cys

Las cadenas de TCR variantes funcionales mostradas en la tabla 7 se aparean con otra cadena de TCR tal como se muestra en la tabla 8 para formar TCR. Específicamente, el ARN que codifica para las cadenas o bien alfa o bien beta tal como se muestra en la tabla 8 se introduce por electroporación en PBL estimulados con OKT3 5-12 días antes de la electroporación. PBL electroporados como control o electroporados con vector que codifica para GFP o con ARN que codifica para las cadenas alfa y beta de MART-HM o de MART-HH sirven como controles. Se someten a prueba posteriormente los PBL para determinar la expresión mediante citometría de flujo usando un tetrámero MART-1 marcado y para determinar la secreción de citocinas tras el cocultivo con células MART-1+/HLA-A2+ (526, 624) o células HLA-A2- (888 ó 938) mediante ELISA tal como se describe esencialmente en el ejemplo 1 y 2.

TABLA 8

Nombre de la cadena alfa: Cadena alfa SEQ ID NO: Nombre de la cadena beta Cadena beta SEQ ID NO:

F4-Mut31 alfa: 112 cadena beta de MART-HM 16

F4-Mut74 alfa: 113 cadena beta de MART-HM 16

F4-AEK-Mut31a/Cpa: 114 cadena beta de MART-HM 16

F4-BFK-Mut74a/Cpa: 115 cadena beta de MART-HM 16

F4-Mut Cp alfa: 116 cadena beta de MART-HM 16

F4-Mut31 alfa: 112 cadena beta de MART-HH 33

F4-Mut74 alfa: 113 cadena beta de MART-HH 33

F4-AEK-Mut31a/Cpa: 114 cadena beta de MART-HH 33

F4-BFK-Mut74a/Cpa: 115 cadena beta de MART-HH 33

F4-Mut Cp alfa: 116 cadena beta de MART-HH 33

cadena alfa de MART-HM: 15 F4-Mut Cp beta 120

cadena alfa de MART-HM: 15 F4-Mut62 beta 117

cadena alfa de MART-HM: 15 F4-Mut97 beta 118

cadena alfa de MART-HM: 15 F4-CHG-Mut62b/Cpb 119

cadena alfa de MART-HH: 32 F4-Mut Cp beta 120

cadena alfa de MART-HH: 32 F4-Mut62 beta 117

cadena alfa de MART-HH: 32 F4-Mut97 beta 118

cadena alfa de MART-HH: 32 F4-CHG-Mut62b/Cpb 119

F4-Mut Cp alfa: 116 F4-Mut Cp beta 120

cadena alfa de MART-HM: 15 40 beta 121

cadena alfa de MART-HH: 32 40 beta 121

F4-Mut31 alfa: 112 40 beta 121

F4-Mut74 alfa: 113 40 beta 121

F4-Mut Cp alfa: 116 40 beta 121

31a/Cpa: 114 40 beta 121

74a/Cpa: 115 40 beta 121

Cys-F5 (H/M) alfa: 125 Cys-F5 (HIM) beta1 126

Cys-F5 (H/M) alfa: 125 Cys-F5 (H/M) beta2 127

Cys-F4 (H/M) alfa: 122 Cys-F4 (H/M) beta1 123

Cys-F4 (H/M) alfa: 122 Cys-F4 (H/M) beta2 124

Cys-NY-ESO-1 (H/M) alfa: 128 Cys-NY-ESO-1 (H/M) beta1 129

Cys-NY-ESO-1 (H/M) alfa: 128 Cys-NY-ESO-1 (H/M) beta2 130

Cys-gp100 (H/M) alfa: 131 Cys-gp100 (H/M) beta1 132

Cys-gp100 (H/M) alfa: 131 Cys-gp100 (H/M) beta2 133

Tal como se muestra en la tabla 9, las células electroporadas expresan el TCR quimérico indicado. TABLA 9

Nombre de la cadena alfa: Cadena alfa SEQ ID NO: Nombre de la cadena beta Cadena beta SEQ ID NO: % de células marcadas con tetrámero MART1 de células electroporadas

F4-Mut31 alfa: 112 cadena beta de MART-HM 16 84,2

F4-Mut74 alfa: 113 cadena beta de MART-HM 16 76,2

F4-Mut Cp alfa: 116 cadena beta de MART-HM 16 79,8

cadena alfa de MART-HM: 15 F4-Mut Cp beta 120 81,9

cadena alfa de MART-HM: 15 F4-Mut62 beta 117 41,4

cadena alfa de MART-HM: 15 F4-Mut97 beta 118 34,7

F4-Mut Cp alfa: 116 F4-Mut Cp beta 120 72,0

Tal como se muestra en las figuras 8-11, las células que expresan TCR quiméricos variantes funcionales secretan más citocinas (o bien IFN-gamma o bien GM-CSF) en respuesta a antígeno que células que expresan un TCR 5 humano de tipo natural o secretan una cantidad comparable de citocina en respuesta a antígeno en comparación con células que expresan el TCR de MART-HM quimérico.

Tal como se muestra en la tabla 10, las células que expresan las cadenas alfa y beta de Cys-F5 (H/M) secretan IFNgamma en un mayor grado que células que expresan el MART-HMF5 quimérico, que a su vez secretan la citocina en un mayor grado que células que expresan el TCR de MART-1 F5 humano de tipo natural.

10 TABLA 10

526: 624 888 938

Control: 178 97 100 0

MART-HHF5: 3845 7751 166 229

MART-HMF5: 8411 15463 150 174

Cys-F5 (H/M): 9211 18771 49 96

Este ejemplo demuestra que los TCR quiméricos variantes funcionales se expresan por PBL y reaccionan frente al antígeno en un mejor grado que el TCR homólogo completamente humano.

El uso de los términos “un” y “una” y “el/la” y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) debe interpretarse que cubre tanto el singular como 15 el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Las expresiones “que comprende”, “que tiene”, “que incluye” y “que contiene” deben interpretarse como expresiones de extremos abiertos (es decir, que significan “que incluye, pero no se limita a”) a menos que se indique lo contrario. La mención de intervalos de valores en el presente documento pretende simplemente servir como método de abreviatura de la referencia individual a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo, a menos que se 20 indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la memoria descriptiva como si se mencionase individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o expresiones a modo de ejemplo

(por ejemplo, “tal como”) proporcionadas en el presente documento, pretende simplemente esclarecer mejor la invención y no representa una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique lo contrario. Ninguna expresión en la memoria descriptiva debe interpretarse como que indica que cualquier elemento no reivindicado es esencial para la práctica de la invención.

Se describen realizaciones preferidas de esta invención en el presente documento, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Pueden resultar evidentes variaciones de esas realizaciones preferidas para los expertos habituales en la técnica tras leer la descripción anterior. Los inventores esperan que los expertos empleen tales variaciones como sea apropiado, y los inventores pretenden que la invención se ponga en práctica por lo demás tal como se describe específicamente en el presente documento.

Lista de secuencias

<110> GOBIERNO DE LOS ESTADOS UNIDOS DE AMERICA, REPRESENTADO POR EL SECRETARIO, DEPARTAMENTO DE SALUD Y SERVICIOS HUMANOS

<120> RECEPTOR DE CÉLULAS T QUIMÉRICOS Y MATERIALES RELACIONADOS Y MÉTODOS DE USO 5 <130> 701228

<150> Documento 60/796.853

<151>

<160> 147

<170> PatentIn versión 3.4 10 <210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

<210> 2

<211> 146

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

<210> 3

<211> 146

<212> PRT

<213> Mus musculus 10 <400> 3

<210> 4

<211> 136

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

<210> 5

<211> 173

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

<210> 6

<211> 173

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

<210> 7

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 132

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 133

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 131

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 133

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 133

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 131

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 264

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 15

<210> 16

<211> 305

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 16

<210> 17

<211> 305

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 17

<210> 18

<211> 269

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 18

<210> 19

<211> 304

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 19

<210> 20

<211> 304

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 20

<210> 21

<211> 269

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 21

<210> 22

<211> 301

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 22

<210> 23

<211> 301

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 23

<210> 24

<211> 273

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Sintético

<400> 24

<210> 25

<211> 304

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 25

<210> 26

<211> 304

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 26

<210> 27

<211> 795

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 27

<210> 28 10 <211> 918

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético 15 <400> 28

<210> 29

<211> 918

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 29 <210> 30

<211> 810

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 30 <210> 31

<211> 915

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 31 <210> 32

<211> 810

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 32

10 <210> 33

<211> 915

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 33

<210> 34

<211> 810

<212> ADN

<213> Artificial 10 <220>

<223> Sintético

<400> 34

<210> 35

<211> 906

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 35

<210> 36

<211> 36

<212> ADN

5: <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 36

atctagagcc gccatggctc ctggcgctcc tcccag: 36

10: <210> 37

<211> 42

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

15: <223> Sintético

<400> 37

ggcagggtca gggttctgga tgtctggctt tataattagc tt: 42

<210> 38

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 38

atctagagcc gccatggcta caaggctcct ctgttac: 37

<210> 39

<211> 45

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 39

tgggaacacc ttgttcaggt cctctacaac tgtgagtctg gttcc: 45

<210> 40

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 40

ctaggcggcc gctcagctgg accacagccg cag: 33

<210> 41

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 41

ctaggcggcc gctcagaaat cctttctctt gaccatggc: 39

<210> 42

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 42

gctctagagc cgccatgttg cttgaacatt tattaataa: 39

<210> 43

<211> 45

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 43

agcaggttct gggttctgga tatttggaat gaccgtcaaa cttgt: 45

<210> 44

<211> 39

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 44

gcaagcttgc cgccatgggc acaaggttgt tcttctatg: 39

<210> 45

<211> 46

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 45

agagtcacat ttctcagatc ctctaggatg gagagtcgag tcccat: 46

<210> 46

<211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 46

ccgcggccgc tcaactggac cacagcctca gcg: 33

<210> 47

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 47

ccgcggccgc tcatgaattc tttcttttga ccatagc: 37

<210> 48

<211> 51

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 48

taatacgact cactataggg agagccgcca tgaactattc tccaggctta g: 51

<210> 49

<211> 48

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 49

cagcaggttc tgggttctgg atattggaac tcactgataa ggtggttc: 48

<210> 50

<211> 32

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 50

aatgcggccg ctcaactgga ccacagcctc ag: 32

<210> 51

<211> 56

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 51

taatacgact cactataggg agaagcttgc cgccatgctg ctgcttctgc tgcttc: 56

<210> 52

<211> 42

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 52

ggagtcacat ttctcagatc ctcgagcacc aggagccgcg tg: 42

<210> 53

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 53

aatgcggccg ctcatgaatt ctttcttttg accatag: 37

<210> 54

<211> 41

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 54

gctctagagc cgccatgatg aaatccttga gagttttact a: 41

<210> 55

<211> 45

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 55

agcaggttct gggttctgga tattgggttt cacagataac tccgt: 45

<210> 56

<211> 35

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 56

gcaagcttgc cgccatgaga atcaggctcc tgtgc: 35

<210> 57

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 57

gagtcacatt tctcagatcc tctacaactg tgagtctggt gcc: 43

<210> 58

<211> 61

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 58

taatacgact cactataggg agagtttaaa cgccgccatg gtgaagatcc ggcaattttt: 60

g: 61

<210> 59

<211> 45

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 59

cagcaggttc tgggttctgg atatttgggt tgatagtcag cctgg: 45

<210> 60

<211> 56

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 60

taatacgact cactataggg agaaagcttg ccgccatgga ctcctggacc ttctgc: 56

<210> 61

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 61

ggagtcacat ttctcagatc ctctagcacg gtgagccgtg tcc: 43

<210> 62

<211> 85

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 62

<210> 63

<211> 86

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 63

<210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 64 <210> 65

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 65

<210> 66

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 66

<210> 67

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 67

<210> 68

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 68

<210> 69

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 69

<210> 70 10 <211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético 15 <400> 70

<210> 71

<211> 20

<212> PRT 20 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 71

25 <210> 72

<211> 273

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 30 <223> Sintético

<400> 72 <210> 73

<211> 310

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 73

<210> 74

<211> 822

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 74

10 <210> 75

<211> 933

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<400> 75

<210> 76

<211> 268

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10 <220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de TCR de MART F4 completamente humano – cadena alfa

<400> 76

<210> 77

<211> 309

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de TCR de MART F4 completamente humano –cadena beta

<400> 77

<210> 78

<211> 273

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de TCR de MART F5 completamente humano - cadena alfa

<400> 78

<210> 79

<211> 308

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de TCR de MART F5 completamente humano - cadena beta

<400> 79

<210> 80

<211> 273

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de TCR de gp100 completamente humano - cadena alfa

<400> 80

<210> 81

<211> 310

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de TCR de gp100 completamente humano - cadena beta

<400> 81

<210> 82

<211> 273

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de TCR de NY-ESO-1 completamente humano - cadena alfa

<400> 82

<210> 83

<211> 307

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de TCR de NY-ESO-1 completamente humano - cadena beta

<400> 83

<210> 84

<211> 269

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de TCR de p53 completamente murino - cadena alfa

<400> 84

<210> 85

<211> 306

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de TCR de p53 completamente murino - cadena beta

<400> 85

<210> 86

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial

<220> <223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de dominio extracelular de región constante de F4 Mut31 alfa 116 aa

<400> 86

<210> 87

<211> 116 10 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220> 15 <221> misc_feature <223> secuencia de aminoácidos de dominio extracelular de región constante de F4-Mut74 alfa 116 aa

<400> 87

<210> 88

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial 10 <220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de dominio extracelular de región constante de F4-AEK-Mut31a/Cpa: 15 118 aa

<400> 88 <210> 89

<211> 116 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220> 10 <221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de dominio extracelular de región constante de F4-BFK-Mut74a/Cpa: 116 aa

<400> 89 <210> 90

<211> 116 5 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220> 10 <221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de dominio extracelular de región constante de Cp-alfa: 116 aa

<400> 90

<210> 91

<211> 146

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

10 <223> secuencia de aminoácidos de dominio extracelular de región constante de F4-Mut62 beta 146 aa

<400> 91

<210> 92

<211> 150

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature 10 <223> secuencia de aminoácidos de dominio extracelular de región constante de F4-Mut97 beta:

150 aa

<400> 92

<210> 93 5 <211> 146

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético 10 <220> <221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de dominio extracelular de región constante de F4-CGH-Mut62b/Cpb: 146 aa

<400> 93

<210> 94

<211> 146

<212> PRT

<213> Artificial 10 <220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de dominio extracelular de región constante de Cp-beta:

146 aa

<400> 94

<210> 95 5 <211> 150

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético 10 <220> <221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de dominio extracelular de región constante de m40b mutante: 150 aa

<400> 95

<210> 96

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial 10 <220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de dominio extracelular de región constante de MURINO-CYS alfa 116 aa

<400> 96

<210> 97 10 <211> 146

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético 15 <220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de dominio extracelular de región constante de MURINO-CYS beta1

146 aa

<400> 97

5 <210> 98

<211> 146

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 10 <223> Sintético

<220> <221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de dominio extracelular de región constante de MURINO-CYS beta2 146 aa

<400> 98

<210> 99

<211> 136

<212> PRT 10 <213> Artificial <220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de región constante de F4 Mut31 alfa 136 aa

<400> 99

10 <210> 100

<211> 136

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de región constante de F4-Mut74 alfa 136 aa

<400> 100

10 <210> 101

<211> 138

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de región constante de F4-AEK-Mut31a/Cpa: 138 aa

<400> 101

<210>: 102 10 <211> 136

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de región constante de F4-BFK-Mut74a/Cpa: 136 aa

<400> 102

<210>: 103 10 <211> 136

<212> PRT

<213> Artificial

<220> <223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de región constante de Cp-alfa: 136 aa

<400> 103

<210> 104

<211> 173 10 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220> <221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de región constante de F4-Mut62 beta 173 aa

<400> 104

<210> 105

<211> 177

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de región constante de F4-Mut97 beta: 177 aa

<400> 105

<210> 106

<211> 173

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de región constante de F4-CGH-Mut62b/Cpb: 173 aa

<400> 106

<210> 107

<211> 173

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético <220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de región constante de Cp-beta: 173 aa

<400> 107

<210> 108

<211> 177

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de región constante de m40b mutante: 177 aa

<400> 108

<210> 109

<211> 136

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de región constante de MURINO-CYS alfa 136 aa

<400> 109

<210> 110 10 <211> 173

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de región constante de MURINO-CYS beta1 173 aa

<400> 110

<210> 111

<211> 173

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético <220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de región constante de MURINO-CYS beta2 173 aa

<400> 111

<210> 112

<211> 264

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 5 <223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de F4 Mut31 alfa

264 aa 10 <400> 112

<210> 113

<211> 264

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de F4-Mut74 alfa 264 aa

<400> 113

<210> 114

<211> 266

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de F4-AEK-Mut31a/Cpa: 266 aa

<400> 114

<210> 115

<211> 264

<212> PRT

<213> Artificial 5 <220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de F4-BFK-Mut74a/Cpa: 10 264 aa

<400> 115

<210> 116

<211> 264

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de Cp-alfa: 264 aa

<400> 116

<210> 117

<211> 305

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature 10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de F4-Mut62 beta

305 aa

<400> 117

<210> 118

<211> 309

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

10 <223> secuencia de aminoácidos cadena de longitud completa de F4-Mut97 beta: 309 aa

<400> 118

<210> 119

<211> 305

<212> PRT

<213> Artificial 5 <220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de F4-CGH-Mut62b/Cpb: 10 305 aa

<400> 119

<210> 120

<211> 305

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de Cp-beta: 305 aa

<400> 120

<210> 121

<211> 309

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de m40b mutante: 309 aa

<400> 121

<210> 122

<211> 264

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature 10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de Cys-F4 (H/M) alfa

264 aa

<400> 122

<210> 123

<211> 305

<212> PRT

<213> Artificial 5 <220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de Cys-F4 (H/M) beta1 10 305 aa

<400> 123

<210> 124

<211> 305

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de Cys-F4 (H/M) beta2 305 aa

<400> 124

<210> 125

<211> 269

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de Cys-F5-(H/M) alfa 269 aa

<400> 125

<210> 126

<211> 304

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de Cys-F5 (H/M) beta1 304 aa

<400> 126

<210> 127

<211> 304

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de Cys-F5 (H/M) beta2 304 aa

<400> 127

<210> 128

<211> 269

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature 10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de Cys-NY-ESO-1-(H/M) alfa

269 aa

<400> 128

<210> 129

<211> 301

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de Cys-NY-ESO-1 (H/M) beta1 301 aa

<400> 129

<210> 130

<211> 301

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de Cys-NY-ESO-1 (H/M) beta2 301 aa

<400> 130

<210> 131

<211> 269

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de Cys-gp100-(H/M) alfa 269 aa

<400> 131

<210> 132

<211> 304

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature

10 <223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de Cys-gp100 (H/M) beta1 304 aa

<400> 132

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético 10 <220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de aminoácidos de cadena de longitud completa de Cys-gp100 (H/M) beta2 304 aa

<400> 133

<210> 134

<211> 795

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature 10 <223> secuencia de nucleótidos de cadena de longitud completa de F4-Mut31 alfa

<400> 134

<210> 135 5 <211> 795

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético 10 <220>

<221> misc_feature

<223> secuencia de nucleótidos de cadena de longitud completa de F4-Mut74 alfa

<400> 135 <210> 136

<211> 918 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220> 10 <221> misc_feature

<223> secuencia de nucleótidos de cadena de longitud completa de F4-Mut62 beta

<400> 136

<210> 137

<211> 930

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature 10 <223> secuencia de nucleótidos de cadena de longitud completa de F4-Mut97 beta

<400> 137

<210> 138

<211> 795

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature 10 <223> secuencia de nucleótidos de cadena de longitud completa de F4-AEK-Mut31a/Cpa

<400> 138 <210> 139

<211> 795 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220> 10 <221> misc_feature

<223> secuencia de nucleótidos de cadena de longitud completa de F4-BFK-Mut74a/Cpa

<400> 139

<210> 140

<211> 918

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature 10 <223> secuencia de nucleótidos de cadena de longitud completa de F4-CGH-Mut62b/Cpb

<400> 140

<210> 141

<211> 795

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature 10 <223> secuencia de nucleótidos de cadena de longitud completa de Cp-alfa

<400> 141

<210> 142

<211> 918

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature 10 <223> secuencia de nucleótidos de cadena de longitud completa de Cp-beta

<400> 142 <210> 143

<211> 930 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220> 10 <221> misc_feature

<223> secuencia de nucleótidos de cadena de longitud completa de m40b mutante

<400> 143

<210> 144

<211> 795

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature 10 <223> secuencia de nucleótidos de cadena de longitud completa de Cys-F4 (H/M) alfa

<400> 144

<210> 145

<211> 918

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature 10 <223> secuencia de nucleótidos de cadena de longitud completa de Cys-F4 (H/M) beta

<400> 145

<210> 146

<211> 810

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220>

<221> misc_feature 10 <223> secuencia de nucleótidos de cadena de longitud completa de Cys-F5 (H/M) alfa

<400> 146 <210> 147

<211> 915 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Sintético

<220> 10 <221> misc_feature

<223> secuencia de nucleótidos de cadena de longitud completa de Cys-F5 (H/M) beta

<400> 147

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Célula humana que comprende un receptor de células T (TCR) quimérico que comprende una región variable de un TCR humano y una región constante que comprende al menos el dominio extracelular de una región constante de un TCR de huésped no humano, o una variante funcional del mismo, en el que la variante funcional tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 80% con el TCR quimérico y se une específicamente al antígeno para el que el TCR quimérico tiene especificidad antigénica.
2.

TCR quimérico que comprende una región variable de un TCR humano y una región constante que comprende al menos el dominio extracelular de una región constante de un TCR de huésped no humano, o una variante funcional del mismo, en el que el TCR quimérico tiene especificidad antigénica por un antígeno de cáncer seleccionado del grupo que consiste en MART-1, gp-100, p53 y NY-ESO-1, en el que la variante funcional tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 80% con el TCR quimérico y se une específicamente al antígeno para el que el TCR quimérico tiene especificidad antigénica.
3.

Célula humana según la reivindicación 1 o TCR quimérico según la reivindicación 2, siendo el TCR de huésped no humano un TCR murino.
4.

Célula humana o TCR quimérico según la reivindicación 3, en el que el dominio extracelular comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 a 3.
5.

Célula humana o TCR quimérico según la reivindicación 4, en el que la región constante comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 a 6.
6.

Célula humana o TCR quimérico según la reivindicación 3, en el que la variante funcional comprende una región constante en la que una primera parte de la región constante se deriva de una región constante murina y una segunda parte de la región constante se deriva de una región constante humana, en el que las partes primera y segunda comprenden cada una al menos 20 aminoácidos contiguos de la región constante.
7.

Célula humana o TCR quimérico según la reivindicación 6, en el que la variante funcional comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 86-95.
8.

Célula humana o TCR quimérico según la reivindicación 7, en el que la variante funcional comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 99-108.
9.

Célula humana o TCR quimérico según la reivindicación 3, en el que la variante funcional comprende una región constante de un TCR murino con una sustitución de aminoácido en la que un aminoácido se ha sustituido por Cys.
10.

Célula humana o TCR quimérico según la reivindicación 9, en el que la variante funcional comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 96-98.
11.

Célula humana o TCR quimérico según la reivindicación 10, en el que la variante funcional comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 109-111.
12.

Célula humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 10, en la que el TCR quimérico, o una variante funcional del mismo, tiene especificidad antigénica por un antígeno de cáncer, preferiblemente MART-1, gp-100, p53 o NY-ESO-1.
13.

Célula humana según la reivindicación 12 o TCR quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, comprendiendo el TCR quimérico, o variante funcional del mismo, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 a 14, o una combinación de las mismas.
14.

Célula humana o TCR quimérico según la reivindicación 13, comprendiendo el TCR quimérico una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 15 a 26, o una combinación de las mismas, o en el que la variante funcional comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 112-133, o una combinación de las mismas.
15.

Célula humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 a 14, siendo la célula un PBL, preferiblemente un linfocito T.
16.

Población de dos o más células, en la que al menos una célula es la célula humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 a 15.
17.

Polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 15 a 26 y 86 a 133.
18.

Proteína que comprende al menos uno de los polipéptidos según la reivindicación 17.
19.

Proteína según la reivindicación 18, que comprende una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, en la que la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica comprenden respectivamente: SEQ ID NO: 15 y 16, SEQ ID NO: 15 y 17, SEQ ID NO: 18 y 19, SEQ ID NO: 18 y 20, SEQ ID NO: 21 y 22, SEQ ID NO: 21 y 23, SEQ ID NO: 24 y 25, SEQ ID NO: 24 y 26, SEQ ID NO: 112 y 16, SEQ ID NO: 113 y 16, SEQ ID NO: 115 y 16, SEQ ID NO: 116 y 16, SEQ ID NO: 112 y 33, SEQ ID NO: 113 y 33, SEQ ID NO: 114 y 33, SEQ ID NO: 115 y 33, SEQ ID NO: 15 y 120, SEQ ID NO: 116 y 120, SEQ ID NO: 15 y 121, SEQ ID NO: 32 y 121, SEQ ID NO: 112 y 121, SEQ ID NO: 113 y 121, SEQ ID NO: 116 y 121, SEQ ID NO: 114 y 121, o SEQ ID NO: 115 y 121.
20.

Ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el TCR quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11 o la reivindicación 14, el polipéptido según la reivindicación 17 o la proteína según la reivindicación 18 ó 19.
21.

Ácido nucleico según la reivindicación 20, en el que la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 27-35 y 134 a 147.
22.

Vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 20 ó 21.
23.

Célula huésped que comprende el vector de expresión recombinante según la reivindicación 22.
24.

Composición farmacéutica que comprende la célula humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 a 15, la población de células según la reivindicación 16, el TCR quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11 o la reivindicación 14, el polipéptido según la reivindicación 17, la proteína según la reivindicación 18 ó 19, el ácido nucleico según la reivindicación 20 ó 21, el vector de expresión recombinante según la reivindicación 22, la célula huésped según la reivindicación 23, o una combinación de los mismos.
25.

Célula humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 a 15, población de células según la reivindicación 16, TCR quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11 o la reivindicación 14, polipéptido según la reivindicación 17, proteína según la reivindicación 18 ó 19, ácido nucleico según la reivindicación 20 ó 21, vector de expresión recombinante según la reivindicación 22, célula huésped según la reivindicación 23, o una combinación de los mismos para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad en un huésped.
26.

Uso de una composición según la reivindicación 24 para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad en un huésped.
27.

Uso según la reivindicación 26, en el que la enfermedad es un cáncer, preferiblemente melanoma, o una enfermedad infecciosa.
28.

Uso según la reivindicación 26, en el que la célula humana es autóloga para el huésped.
29.

Uso de una célula humana según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 a 15, una población de células según la reivindicación 16, un TCR quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11 o la reivindicación 14, un polipéptido según la reivindicación 17, una proteína según la reivindicación 18 ó 19, un ácido nucleico según la reivindicación 20 ó 21, un vector de expresión recombinante según la reivindicación 22, una célula huésped según la reivindicación 23, o una combinación de los mismos en la preparación de una composición para la detección de una célula enferma en un huésped.
30.

Uso según la reivindicación 29, en el que la célula enferma es una célula cancerosa, preferiblemente melanoma, o una célula infectada.
31.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 30, en el que el huésped es un ser humano.
32.

Método in vitro de mejora de la actividad biológica de un TCR humano, que comprende reemplazar una región constante del TCR humano por una región constante que comprende al menos el dominio extracelular de una región constante de un TCR de huésped no humano.
33.

Método según la reivindicación 32, en el que el TCR de huésped no humano es un TCR murino.

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