KR20200068263A - Ny-eso-1 특이적 t 세포 수용체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암 특이적 항원인 NY-ESO-1에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체의 알파 쇄 또는 베타 쇄를 발현하기 위한 핵산, 그에 따라 코드되는 폴리펩타이드, 및 상기 T 세포 수용체를 발현하는 세포를 유효성분으로 포함하는 NY-ESO-1 관련 질환의 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 알파 쇄 및 베타 쇄를 발현하기 위한 유전자에 포함되는 뉴클레오티드 서열 및 이들에 의해 코드되는 펩타이드의 아미노산 서열을 제공하여, NY-ESO-1을 발현하는 암 세포 및 종양 세포에 대한 특이적 면역 치료가 가능한 재조합 T 세포 수용체를 발현하는 세포 독성 T 세포(CTL), 억제 T 세포 또는 자연살해 세포 (NK 세포)의 제조가 가능하여, 종래 암 치료에 주로 활용되던 화학적 및 수술적 용법의 한계를 극복하거나 보완할 수 있는 치료 방법을 제공하는 효과가 있다.
Description
본 발명은 암 특이적 항원인 NY-ESO-1에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체의 알파 쇄 또는 베타 쇄를 발현하기 위한 핵산, 그에 따라 코드되는 폴리펩타이드, 및 상기 T 세포 수용체를 발현하는 세포를 유효성분으로 포함하는 NY-ESO-1 관련 질환의 치료용 조성물에 관한 것이다.
최근 식습관의 변화, 환경의 변화 및 고령화 추세에 따라 암 환자가 증가하고 있으나, 암세포의 유전적인 불완전성으로 인한 내성 획득으로 기존의 항암제만으로 암을 완전히 치료하기에는 한계가 있다. 이에 대한 대안으로 최근에는 면역치료법이 대두되고 있는데, 면역치료법은 암에 대한 선택성 및 특이성이 높고, 부작용이 적어 이에 따른 연구가 활발히 진행되고 있다.
이 중에서도 T 세포의 경우 단일 클론 T 세포 수용체(TCR)가 세포막에 발현되어 항원 제시 세포 (antigen presenting cell, APC)의 주조직 적합체/펩타이드 (major histocompatibility complex/peptide, pMHC)를 인지하는데, 이러한 세포성 적응 면역은 매우 정교하게 작동되어 인체에 감염성 물질이 침입하거나 암세포가 발생하면 이를 효과적으로 제거할 수 있어야 한다. 이 때 만약 항원 특이적 적응 면역 체계가 제대로 작동하지 않으면 감염성 질환 대응 및 암세포 제거 기능에 심각한 문제를 초래하게 된다.
T 세포 수용체(TCR)는 항원을 특이적으로 인지하는 αβ헤테로다이머 (heterodimer)와 신호전달을 위한 CD3 분자 (CD3εγ, CD3εδ, CD3ζζ)들로 구성되는 αβ TCR 복합체 형태로 작동하는데, αβ헤테로다이머는 항체의 Fab와 유사한 구조를 가지고 있고, CD3의 εγδ서브유닛은 각각 Ig 도메인을 세포외 구성으로 갖는다. αβ헤테로다이머가 특이적으로 항원을 인지하면 CD3 분자를 매개로 세포 내로 신호전달이 이루어지는데, 이러한 신호전달은 세포내 티로신 키나아제 (LCK, ZAP70, LAT, PLCγ) 인산화, 세포질 Ca2 + 농도변화 및 세포내 전사 시스템의 변화를 통하여 T세포 활성화를 유도하는 것으로 알려져 있다.
종양 특이적 T 세포로 암의 치료를 목적으로 하는 효능이 우수한 T 세포 수용체로 1G4가 알려져 있다. 미국국립암센터(NCI)의 Rosenberg 그룹에시 수행한 임상시험에서 synovial cell sarcoma와 흑색종에서 55-61%의 치료 반응을 보여 항암면역 치료 요법으로 개발 진행되고 있다. (PF Robbins et al., (2015) Clin Cancer Res. 21(5): 1019-1027)
한편, 흑색종 세포에서 발현되는 주요 항원 중 하나인 NY-ESO-1 유전자는 X 염색체 Xq28 부위에 존재한다. NY-ESO-1은 180개의 아미노산 잔기로 구성된 단백질로 세포질내에서 발현되며 현재까지 세포 내 기능은 규명되지 않았다.
NY-ESO-1는 cancer/testis (CT) 항원 중의 하나로 다수의 고형암에서 발현되는 특징을 가진다. 특히 아미노산 서열 157-165에 해당하는 SLLMWITQC 펩티드 서열은 human leukocyte antigen (HLA)에 결합하여 세포 표면 발현되어 면역세포에 의해 인지된다 (Nishant Singh et al., (2015) The FASEB JOURNAL, Abstract Number:571.30).
해당 펩타이드 서열은 HLA-A2와 결합하여 T 세포에 의해 인지되는 주요 T 세포 수용체(TCR)의 에피토프로 규명되어 항암면역 치료의 표적으로 연구되고 있다(US 9128080 B2, US 2013-0116167 A1, US 8088379 B2). 그러나, 아직까지 이들 T 세포 수용체의 제한적인 효능과 부작용으로, 더 좋은 효과를 보이는 T 세포 수용체를 개발할 필요가 있는 것으로 판단되었다.
이에 본 발명자들은 NY-ESO-1을 표적으로 하는 신규한 T 세포 수용체를 동정하기 위하여 예의 노력한 결과, NY-ESO-1을 표적으로 하는 신규한 T 세포 수용체를 동정하였고, 상기 T 세포 수용체를 구성하는 알파 쇄와 베타 쇄의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 확인하였으며, 상기 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체를 세포 독성 T 세포(CTL)에 발현시킨 재조합 T 세포를 제작하고 종래 알려진 T 세포 수용체보다 우수한 암세포 특이적 세포 사멸 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
I Boria et al., (2008) BMC Immunology 9:50
S Yang et al., (2008) Gene Therapy 15: 1411-1423
Nishant Singh et al., (2015) The FASEB JOURNAL, Abstract Number:571.30
PF Robbins et al., (2015) Clin Cancer Res. 21(5): 1019-1027
본 발명의 목적은 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 알파 또는 베타 쇄의 가변 도메인을 구성하는 신규한 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체 및 상기 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체가 표면에 발현된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 알파 또는 베타 쇄의 가변 도메인을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터가 도입된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 NY-ESO-1 관련질환의 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 3 또는 5의 아미노산 서열로 표시되는, NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 알파 쇄의 가변 도메인을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 표시되는, NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 베타 쇄의 가변 도메인을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 알파 쇄의 가변 도메인 및 상기 베타 쇄의 가변 도메인을 포함하는 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체가 표면에 발현된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 알파 쇄의 가변 도메인을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 베타 쇄의 가변 도메인을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산이 도입된 재조합 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 NY-ESO-1 관련 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 세포를 유효성분으로 포함하는 NY-ESO-1 관련 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 알파 쇄 및 베타 쇄를 발현하기 위한 유전자에 포함되는 뉴클레오티드 서열 및 이들에 의해 코드되는 펩타이드의 아미노산 서열을 제공하여, NY-ESO-1을 발현하는 암 세포 및 종양 세포에 대한 특이적 면역 치료가 가능한 재조합 T 세포 수용체를 발현하는 세포 독성 T 세포(CTL), 억제 T 세포 또는 자연살해 세포 (NK 세포)의 제조가 가능하여, 본 발명에 따른 세포 치료방법은 종래 알려진 T 세포 치료 요법보다 우수한 암세포 특이적 세포 사멸 효과를 갖는바, 기존의 암 치료에 주로 활용되던 화학적 및 수술적 용법의 한계를 극복하거나 보완할 수 있는 효과적인 치료 방법을 제공할 수 있고, 기타 NY-ESO-1 관련 질환의 치료에도 적용될 수 있다.
도 1은 항원 특이적 T 세포 수용체를 발굴하기 위한 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 NY-ESO-1 특이적 T 세포 클론 3종에 대해 ELIspot 방법을 통하여 항원 특이적 T 세포 활성화능을 확인한 결과이다.
도 3은 NY-ESO-1 특이적 T 세포 클론 중 MTN4의 항원특이적 세포 사멸능을 확인하였다.
도 4는 T 세포 수용체 서열 확보를 위해 NY-ESO-1 특이적 T 세포 클론의 PCR 반응을 통해 증폭된 TRAV 및 TRBV 밴드를 확인한 결과이다.
도 5는 NY-ESO-1 특이적 T 세포 발현을 위한 발현벡터의 벡터 맵을 일부 도시하고, 해당 부위의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 재조합 T 세포 수용체의 T 세포의 표적 세포에 의한 활성도를 CD69의 세포 표면 발현 정도를 통해 확인하였다.
도 7은 본 발명에 따른 재조합 T 세포 수용체가 표면에 발현된 세포 투여에 따른 흑색종이 유발된 마우스에서의 종양 감소 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 재조합 T 세포 수용체가 표면에 발현된 세포 투여에 따른 흑색종이 유발된 마우스에서의 종양 감소 효과를 확인한 후 종양조직의 중량 비교를 통해 효능을 확인하였다.
도 9은 본 발명에 따른 재조합 T 세포 수용체가 표면에 발현된 세포 투여에 따른 흑색종이 유발된 마우스에서의 종양 조직에 투여한 T세포의 투과를 면역염색을 통해 확인하였다.
도 2는 NY-ESO-1 특이적 T 세포 클론 3종에 대해 ELIspot 방법을 통하여 항원 특이적 T 세포 활성화능을 확인한 결과이다.
도 3은 NY-ESO-1 특이적 T 세포 클론 중 MTN4의 항원특이적 세포 사멸능을 확인하였다.
도 4는 T 세포 수용체 서열 확보를 위해 NY-ESO-1 특이적 T 세포 클론의 PCR 반응을 통해 증폭된 TRAV 및 TRBV 밴드를 확인한 결과이다.
도 5는 NY-ESO-1 특이적 T 세포 발현을 위한 발현벡터의 벡터 맵을 일부 도시하고, 해당 부위의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 재조합 T 세포 수용체의 T 세포의 표적 세포에 의한 활성도를 CD69의 세포 표면 발현 정도를 통해 확인하였다.
도 7은 본 발명에 따른 재조합 T 세포 수용체가 표면에 발현된 세포 투여에 따른 흑색종이 유발된 마우스에서의 종양 감소 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 재조합 T 세포 수용체가 표면에 발현된 세포 투여에 따른 흑색종이 유발된 마우스에서의 종양 감소 효과를 확인한 후 종양조직의 중량 비교를 통해 효능을 확인하였다.
도 9은 본 발명에 따른 재조합 T 세포 수용체가 표면에 발현된 세포 투여에 따른 흑색종이 유발된 마우스에서의 종양 조직에 투여한 T세포의 투과를 면역염색을 통해 확인하였다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 NY-ESO-1에서 유래한 HLA-A2(human leukocyte antigen-A2)의 제한 펩타이드인 SLLMWITQC (157-165)를 특이적으로 인지하는 세포 독성 T 세포 클론을 확보하고, 이로부터 T 세포 수용체의 알파 쇄 및 베타 쇄 가변 도메인의 핵산 서열 및 아미노산 서열을 분석하였으며, 이를 기초로 상기 가변 도메인을 포함하는 재조합 T 세포 수용체를 발현하는 세포 독성 T 세포를 제작하고, 상기 세포 독성 T 세포의 종양 세포주에 대한 특이적 세포 독성 및 종양이 유발된 마우스 모델에서의 종양 감소 효과를 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 서열번호 1, 3 또는 5의 아미노산 서열로 표시되는, NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 알파 쇄의 가변 도메인에 관한 것이고, 다른 관점에서 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 표시되는, NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 베타 쇄의 가변 도메인에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 군 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는, NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 알파 또는 베타 쇄의 가변 도메인의 전부 또는 일부를 구성하는 폴리펩타이드에 관한 것으로, 서열번호 1, 3 또는 5의 아미노산 서열로 표시되는, NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 알파 쇄의 가변 도메인의 전부 또는 일부를 구성하는 폴리펩타이드; 또는 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 표시되는, NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 베타 쇄의 가변 도메인의 전부 또는 일부를 구성하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명에서 서열번호 1, 3 또는 5는 각각 NY-ESO-1을 특이적으로 인식하는 T 세포 수용체의 알파 쇄 변이부에서 유래한 서열로, 서열번호 1, 3 또는 5와 동일한 서열 뿐 아니라 상동성이 적어도 80%, 90% 또는 95% 이상 아미노산 서열 상동성을 지니는 변이 서열을 가질 수 있다. 이는 예를 들어, 서열번호 1, 3 또는 5로 표시되는 아미노산 배열에 있어서 1 개 내지 수 개의 아미노산이 치환, 부가, 결실되어도 T 세포 수용체의 3차원 구조의 변화를 유도하지 않아 이들 펩타이드가 본래의 펩타이드와 동등한 기능을 갖는 경우를 들 수 있다. 같은 맥락에서, 본 발명에서 서열번호 2, 4, 또는 6은 NY-ESO-1을 특이적으로 인식하는 T 세포 수용체의 베타 쇄 변이부에서 유래한 서열로, 서열번호 2, 4, 또는 6과 동일한 서열 뿐 아니라 상동성이 적어도 80%, 90% 또는 95% 이상 아미노산 서열 상동성을 지니는 변이 서열을 가질 수 있다. 이는 예를 들어, 서열번호 2, 4, 또는 6으로 표시되는 아미노산 배열에 있어서 1 개 내지 수 개의 아미노산이 치환, 부가, 결실되어도 T 세포 수용체의 3차원 구조의 변화를 유도하지 않아 이들 펩타이드가 본래의 펩티드와 동등한 기능을 갖는 경우를 들 수 있다. 이러한 아미노산의 변이 서열도 본 발명의 권리범위에 포함된다 할 것이다.
T 세포 수용체의 알파 쇄 및 베타 쇄 가변 도메인은 가장 다양성이 풍부한 영역이고, 항원 인식의 특이성에 가장 강하게 관여하는 부분에 해당하여, 본 발명의 펩타이드 배열은 NY-ESO-1 특이적 세포 독성 T 세포의 특유의 배열이라고 판단할 수 있고, 따라서 어떤 T 세포가 본 발명의 펩타이드 배열을 갖고 있으면, 그 T 세포는 NY-ESO-1 특이성이 있는 T 세포로 간주될 수 있다. 따라서, 본 발명은 NY-ESO-1이 발현되는 암이나 종양의 특이적 진단 마커로 활용될 수 있을 것이다.
상동성 비교는 육안 또는 더 일반적으로는 쉽게 이용할 수 있는 서열 비교 프로그램으로 수행된다. 이 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 두 개 또는 그 이상의 서열간의 % 상동성을 계산할 수 있다. 예컨대, 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예로는 BLAST 패키지(Ausubel et al., 1999 ibid - Chapter 18을 참고), FASTA(Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410) 및 비교 도구의 GENEWORKS 스위트(suite)를 포함하나 이것으로 한정하는 것은 아니다. 또한, 서열은 침묵 변이(silent change)를 일으키는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환이 일어나고, 이로부터 기능적으로 동등한 물질을 초래한다. 의도적인 아미노산 치환은 기질의 두 번째 결합 활성이 유지되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성을 근거로 하여 일어난다. 예를 들면 음전하를 띤 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함; 양전하를 띤 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함; 및 비슷한 친수성 값의 비전하성 극성 헤드 그룹을 지닌 아미노산은 루신, 이소루신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다. 또한, 본 발명은 염기성에 대해서는 염기성, 산성에 대해서는 산성, 극성에 대해서는 극성으로 등 유사한 것끼리의 치환인 상동성 치환을 포함한다. 또한 비-상동성 치환은 오르니틴, 디아미노부티르산 오르니, 노르루신 오르니틴, 피릴알라닌(pyriylalanine), 티에닐알라닌(thienylalanine), 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비천연 아미노산의 포함과 관련되는 또 다른 대안적인 잔기의 클래스로부터 발생한다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 알파 쇄의 가변 도메인 및 베타 쇄의 가변 도메인을 포함하는 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 T 세포 수용체는 서열번호 1, 3, 또는 5의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드가 T 세포 수용체의 알파 쇄의 가변 도메인의 전부 또는 일부를 형성하고, 서열번호 2, 4, 또는 6의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드가 T 세포 수용체의 베타 쇄의 가변 도메인의 전부 또는 일부를 형성하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
구체적으로는, 상기 T 세포 수용체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 알파 쇄의 가변 도메인의 전부 또는 일부로 포함하고, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 베타 쇄의 가변 도메인의 전부 또는 일부로 포함하거나, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 알파 쇄의 가변 도메인의 전부 또는 일부로 포함하고, 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 베타 쇄의 가변 도메인의 전부 또는 일부로 포함하거나, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 알파 쇄의 가변 도메인의 전부 또는 일부로 포함하고, 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩타이드를 베타 쇄의 가변 도메인의 전부 또는 일부로 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "T-세포 수용체 또는 TCR"은 MHC 분자와 결합하는 항원을 인식하는 것을 담당하는 T 세포 표면에서 발견된 분자로, MHC 분자에 의해 제시될 때 펩타이드를 인식하는 것이 가능한 분자를 의미하는 관습적인 의미로 사용된다. 분자는 α 및 β또는 선택적으로 γ및 δ두 개의 체인의 헤테로다이머이거나 신호체인 TCR 컨스트럭트이다. 본 발명의 TCR은 다른 종으로부터 유래된 서열을 포함하는 하이브리드 TCR이다. 예를 들면 마우스 TCR이 인간 TCRs보다 인간 T 세포에서 더 효과적으로 발현되므로, 상기 TCR은 인간 가변 영역과 뮤린 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 T 세포 수용체는 HLA-A2(human leukocyte antigen-A2)와 NY-ESO-1의 157-165번째 아미노산 서열인 SLLMWITQC 의 전체 또는 일부를 인식한다. T 세포 수용체는 하나 또는 그 이상의(예를 들면 5까지) 업스트림 또는 다운스트림 아미노산을 함께 지닌 서열의 부분을 인식할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 알파 쇄의 가변 도메인을 코딩하는 핵산에 관한 것이고, 또 다른 관점에서 상기 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 베타 쇄의 가변 도메인을 코딩하는 핵산에 관한 것으로, 상기 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 알파 쇄의 가변 도메인은 서열번호 7, 9 또는 11의 핵산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 베타 쇄의 가변 도메인을 코딩하는 핵산은 서열번호 8, 10 또는 12의 핵산 서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다. 즉, 본 발명은 서열번호 7, 9 또는 11의 핵산 서열로 표시되는, NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 알파 쇄의 가변 도메인의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산; 또는 서열번호 8, 10 또는 12의 핵산 서열로 표시되는, NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 베타 쇄의 가변 도메인의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
상기 핵산은 서열번호 1 내지 6의 아미노산 서열에 대해 각각 80%, 90% 또는 95% 이상 아미노산 서열 상동성을 지니는 변이체를 코딩하는 변이 서열을 포함할 수 있다. 이는 예를 들어, 상기 핵산이 코딩하는 펩타이드가, 본 발명의 T 세포 수용체의 3차원 구조의 변화를 유도하지 않아 이들 펩타이드가 본래의 펩타이드와 동등한 기능을 갖는 경우라면, 이러한 핵산의 변이 서열도 본 발명의 권리범위에 포함된다는 것을 의미한다.
상기 변이 서열은 하나 또는 그 이상의 염기의 첨가, 결실 또는 치환일 수 있다. 변이가 첨가 또는 결실을 포함하면 이들은 세 번씩 또는 변이가 서열의 나머지 부분의 번역에 대해 프레임-시프트의 원인이 되지 않도록 균형(즉 각각의 결실에 대해 첨가)을 잡게 한다. 변이의 일부 또는 전체는 단백질 코드의 축중(degeneracy)으로 인한 인코딩된 단백질 서열에 영향을 끼치지 않는 센드(send)에서 "침묵"적이다. 변이의 일부 또는 전체는 상술한 바와 같이 보존적 아미노산 치환을 일으킨다. 변이는 불변 영역, 링커 또는 α 또는 β체인의 기본틀 부위를 인코딩하는 영역과 같은 하나 또는 그 이상의 영역에 집중되거나 분자 내에 분포될 수 있다.
상기 변이 서열은 SLLMWITQC:MHC 복합체를 결합시키는 서열의 전체 또는 일부를 인코딩하는 능력을 갖추어야만 한다.
핵산 서열은 이중 또는 단일 가닥이며, RNA 또는 DNA이다. 핵산 서열은 코돈 최적화된 것일 수 있다. 상이한 세포는 특정 코돈의 사용(usage)이 다르다. 이 코돈 바이어스(codon bias)는 세포 타입에서 특정한 tRNAs의 상대 빈도의 바이어스와 상응한다. 서열의 코돈을 변화시킴으로써 이들은 상응하는 tRNAs의 상대 빈도와 일치하게 조절되며, 이로부터 발현을 증가시키는 것이 가능하다.
HIV 및 다른 렌티바이러스(lentiviruses)를 포함하여 많은 바이러스는 많은 수의 희귀한(rare) 코돈을 사용하며, 일반적으로 사용되는 포유류 코돈과 상응하는 이들을 변화시킴으로써 포유류 생산자 세포에서 패키징 구성요소(packaging component)의 증가된 발현이 달성될 수 있다. 코돈 사용 표(codon usage tables)는 다양한 다른 생물뿐만 아니라 포유류 세포에 대해서도 당분야에 공지되어 있다. 또한, 코돈 최적화는 mRNA 불안정 모티프 및 복잡한 스플라이스 부위의 제거와 관련되어 있다.
본 발명에 따른 펩타이드 또는 핵산을 제조하는 경우에는 유전자 공학적 수법 및/또는 화학 합성법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 해당 핵산을 세포로부터 단리할 수도 있고, 또는 화학 합성할 수도 있다. 핵산은 PCR법 등의 공지 방법으로 증폭할 수도 있다. 또한, 예를 들면, 핵산(공지 방법으로 적당량까지 증폭하여 놓을 수도 있음)을 적당한 벡터에 조립하여 적당한 세포에 도입하고, 또는 유전자총이나 전기 천공 등에 의해서 적당한 세포에 도입하고, 이어서 본 발명에 따른 핵산이 도입된 세포를 배양하고, 발현시킴으로써 본 발명의 핵산 및 펩티드를 얻을 수 있다. 사용 가능한 벡터나 세포, 유전자 도입 조건, 배양 조건, 유전자나 펩티드의 단리 방법 등은 당업자에게 공지된 것이고, 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명의 핵산 및 펩티드를 제조하기 위해서 화학 합성법을 이용할 수도 있다. 이들 화학 합성법은 공지된 것이고, 유전자의 화학 합성법으로서는 아미다이트법에 의한DNA의 고상 합성이나 1-4포스포네이트법 등이 있고, 펩티드의 화학 합성법으로서는 Fmoc법 등이 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "벡터"란 용어는 자신에게 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 유형으로 "플라스미드"가 있는데, 플라스미드란 추가의 DNA 분절을 결찰시킬 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 말한다. 벡터의 또 다른 유형으로는 추가적인 DNA 분절을 바이러스 게놈으로 결찰시킬 수 있는 바이러스 벡터가 있다. 일부 벡터는 숙주세포로 도입될 때 이 숙주세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주세포로 도입될 때 숙주세포의 게놈으로 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 일부 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 본 명세서에서 이러한 벡터를 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")라 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드의 형태로 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 유형이기 때문에, "플라스미드"와 "벡터"는 서로 교환하여 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함한다.
상기 레트로바이러스는 용균성 바이러스와는 상이한 생활주기를 가진 RNA 바이러스이다. 이러한 점에서 레트로바이러스는 DNA 중간물질을 통해서 복제하는 전염성 독립체이다. 레트로바이러스가 세포를 감염시킬 때, 게놈은 역전사효소에 의해 DNA 형성으로 전환된다. DNA 카피는 새로운 RNA 게놈 및 감염성 바이러스 입자의 조립(assembly)을 위해 필수적인 바이러스성으로 인코딩되는 단백질의 생성을 위한 주형으로 쓰인다. 많은 레트로바이러스가 있는데, 예를 들면 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV), 생쥐 유방 종양 바이러스(MMTV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 후지나미 육종 바이러스(FuSV), 몰로니 설치류 백혈병 바이러스(Mo-MLV), FBR 뮤린 골육종 바이러스(FBR MSV), 몰로니 설치류 육종 바이러스(Mo-MSV), 아벨솔 쥐 백형병 바이러스(A-MLV), 조류 골수 세포증 바이러스-29(MC29) 및 조류의 적아구증 바이러스(AEV) 및 렌티바이러스를 포함하는 모든 다른 레트로바이러스과를 들 수 있다. 레트로바이러스의 상세한 목록은 Coffin et al(“”Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763)에 기술되어 있다.
또한, 렌티바이러스는 레트로바이러스에 속하나, 이들은 분화 세포 및 비-분화 세포 모두를 감염시킬 수 있다(Lewis et al (1992) EMBO J. 3053-3058).
인간 세포를 효율적으로 감염시키기 위해, 바이러스 입자는 양생 엔버로프(amphotropic envelopes) 또는 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스 엔버로프(gibbon ape leukemia virus envelopes)로 싸여 있다. CD3 분자 공급의 증가는 유전자 변형 세포에서 TCR 발현을 증가시킨다. 그러므로 벡터는 CD3-감마, CD3-델타, CD3-엡실론 및/또는 CD3-제타에 대한 유전자를 포함할 수도 있다. 상기 벡터는 단지 CD3-제타에 대한 유전자만을 포함한다. 유전자는 2A 자기-절단 서열과 같은 자기-절단 서열에 의해 연결된다. 또한, 하나 또는 그 이상의 분리된 벡터는 TCR-인코딩 벡터를 지닌 공동-트랜스퍼에 대한 CD3 유전자를 인코딩하기 위해 제공한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체가 표면에 발현된 세포 또는 상기 핵산이나 재조합 벡터가 도입된 세포에 관한 것이다. 상기 세포는 세포 독성 T 세포(CTL), 억제 T 세포 또는 자연살해 세포 (NK 세포)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서, NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체가 표면에 발현된 세포의 제조에 있어서, 상기 서열번호 1의 폴리펩타이드 또는 서열번호 2의 폴리펩타이드가 T 세포 수용체의 알파 쇄 또는 베타 쇄에 각각 도입되거나 함께 도입될 수 있다. 또한, 다른 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체가 표면에 발현된 세포의 제조에 있어서, 서열번호 3의 폴리펩타이드 또는 서열번호 4의 폴리펩타이드가 T 세포 수용체의 알파 쇄 또는 베타 쇄에 각각 도입되거나 함께 도입될 수 있으며, 또 다른 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체가 표면에 발현된 세포의 제조에 있어서, 서열번호 5의 폴리펩타이드 또는 서열번호 6의 폴리펩타이드가 T 세포 수용체의 알파 쇄 또는 베타 쇄에 각각 도입되거나 함께 도입될 수 있다. 상기 폴리펩타이드가 T 세포 수용체에 각각 도입되는 경우에는 다른 종류의 알파 쇄 또는 베타 쇄의 가변 도메인을 형성하는 폴리펩타이드와 적절히 조합함으로써 치료 효과의 향상을 유도할 수 있을 것이다. T 세포 수용체의 알파 쇄 또는 베타 쇄에 상기 폴리펩타이드를 도입하는 방법으로는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 핵산 서열을 재조합 벡터에 조립하여 적절한 세포에 도입할 수 있고, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 핵산 서열을 재조합 벡터에 조립하여 적절한 세포에 도입할 수 있으며, 서열번호 11 또는 서열번호 12의 핵산 서열을 재조합 벡터에 조립하여 적절한 세포에 도입할 수 있다. 한편, 유전차 총이나 전기 천공 등에 의해서 적당한 세포에 도입할 수 있고, 그 밖의 유전자 도입 조건이나 세포의 배양 조건 등은 당업자가 적절히 선택할 수 있을 것이다.
상기 재조합 벡터를 도입하는 방법으로는 대표적으로 "형질전환" 또는 "형질감염"하는 방법이 있을 수 있으나, 그 밖에도 당업계에서 DNA를 세포 내로 도입하는 방법은 모두 활용할 수 있을 것이다. "형질전환(transformation)" 및 "형질감염(transfection)"이라는 용어는 세포의 게놈의 대상체 세포의 게놈 내로의 흡수 및 통합을 유도하는, 상이한 유전자형의 또 다른 세포로부터의 정제된 재조합 DNA의 외부 적용에 의한 세포의 게놈의 지정된 변형을 의미한다. "형질전환된" 또는 "형질감염된"이라는 용어는 본 발명에서 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, T 세포는 입양 T 세포 처리 전에 본 발명에 기술된 변형되거나 고친화도의 TCR을 암호화하는 DNA 서열로 형질감염될 수 있다.
상기 세포는 본 발명의 T-세포 수용체를 발현시킨다. 상기 세포는 T-세포일 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 피험자로부터 분리된 T-세포에서 유래될 수 있다. T-세포는 말초혈액 림프구(PBL)의 집단과 같은 피험자로부터 분리된 혼합 세포군의 일부이다. PBL 집단 내의 T 세포는 항-CD3 및 CD28 항체를 사용하는 것과 같이 당 분야에 공지된 방법에 의해 활성화된다.
상기 T-세포는 CD4+ T 헬퍼 세포 또는 CD8+ 세포독성 T 세포이다. 세포는 CD4+ T 헬퍼 세포/CD8+ 세포독성 T 세포의 혼합 집단에 존재한다. 예를 들면 항-CD28 항체와 선택적으로 결합하는 항-CD3 항체를 사용하는 다클론성 활성화는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 증식을 유발시키지만 CD4+25+조절 T-세포의 증식 또한 유발시킨다. 조절 T 세포로의 TCR 유전자 전달이 유전자-변형 세포독성 및 T 헬퍼 세포의 항-바이러스 활성을 억제하는 것은 바람직하지 않다. 그러므로 CD4+CD25+ 집단은 TCR 유전자 전달 전에 대폭 감소한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 NY-ESO-1 관련 질환의 치료용 조성물에 관한 것이며, 구체적으로, 상기 조성물은 세포 치료제일 수 있다. 본 발명은 또한 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 NY-ESO-1 관련 질환의 예방 또는 치료용 치료제에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 상기 재조합 벡터가 도입된 세포를 환자 체외에서 배양하여 대량의 NY-ESO-1 특이적 세포 독성 T 세포를 얻을 수 있다. 그리고 이를 암 또는 종양 등과 같은 NY-ESO-1 관련 질환의 환자에 도입함으로써, NY-ESO-1을 발현하는 암 또는 종양세포를 사멸시킬 수 있고, 이로써 암 또는 종양을 치료할 수 있다.
본 발명에서, 상기 NY-ESO-1 관련 질환은 고형암 또는 종양일 수 있고, 상기 고형암은 피부암 또는 흑색종일 수 있다.
상기한 암 또는 종양 치료는 항암제나 방사선 요법 등의 다른 암치료와 병용할 수도 있다. 상기 암 또는 종양 치료는 광범한 암 또는 종양에 적용할 수 있고, 이들은 상기에서 예시하고 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
이 밖에 환자나 암의 종류에 따라서는 치료에 유효한 아미노산 배열이 상이할 수 있고, 개개의 상항에 따라 도입되는 유효량이 결정될 수 있다.
본 발명의 NY-ESO-1관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 비경구 투여를 위한 수용성 용액으로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 완충 용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소듐 카르복시메틸셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 전신계 또는 국소적으로 투여될 수 있으며, 이러한 투여를 위해 공지의 기술로 적합한 제형으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다.
주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다. 제형 투여는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등을 사용할 수 있다
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 조성물의 투여량은 성인에게 T 세포의 형태로 투여하는 경우 5×104 ~ 5×109의 세포가 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 T 세포의 TCR 발현 정도와 병적 상태를 고려하여 5×107 ~ 5×108의 세포가 포함될 수 있다. 1일에 5×105 ~ 1.5×106 cells/㎏의 양을, 바람직하게는 1.5×106 ~ 5×107 cells/㎏ 용량을, 일일 1회 내지 수회 반복 투여할 수 있다.
본 발명은 또한, NY-ESO-1 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용되기 위한 치료제의 제조를 위한 상기 재조합 벡터 또는 상기 세포의 용도를 제공한다.
본 발명에서, 용어 '예방'은 질병을 축소시키는 방지(averting), 지연(delaying), 방해(impeding) 또는 저해(hindering)와 관련된 것이다.
본 발명에서, 용어 '치료'는 질병의 증상을 개선, 치유 또는 감소 또는 질병의 진행을 감소 또는 정지시키기 위해 질병에 걸린 피험자를 돌보는 것과 관련된 것이다.
본 발명은 또한 약학적 유효량의 상기 벡터 또는 상기 세포를 포함하는 NY-ESO-1 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 NY-ESO-1 관련 질환 치료방법을 제공한다.
본 발명의 TCR을 포함하는 벡터 또는 상기 벡터로 형질전환된 세포(예컨대, T 세포)는 입양전달을 통해 NY-ESO-1 관련 질환 치료에 사용될 수 있다. 이를 위해, 피험자로부터 유전적으로 변형된 세포가 입양 전달되도록 T 세포를 분리한다. 상기 유전적으로 변형된 세포는 T 세포는 피험자에서 분리된 T-세포, TCR 유전자 전달 및 TCR-형질도입 세포의 입양 전달(adoptive transfer)로 피험자의 면역치료를 선택적으로 활성화함으로써 만들어진다. 피험자에서 분리된 T-세포는 동종인 상이한 피험자로부터 분리된다. 세포는 기증 피험자로부터 분리된다. 예를 들면, 피험자가 고형 장기 이식 중이거나 받았다면, 세포는 고형 장기가 유래되는 피험자로부터 유래한다.
상기 NY-ESO-1 관련 질환 치료방법에 사용되는 약학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
한편, 상기 NY-ESO-1 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물을 투여할 수 있는 개체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 개, 고양이, 마우스와 같은 동물일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1: NY-
ESO
-1 특이적
TCR
T 세포의 발굴
1-1. 단핵구 유래
수지상세포
준비
HLA-A2+의 건강한 공여자의 혈액을 PBS(2% FBS)와 1:1의 비율로 혼합하였다. 16ml의 림포프렙(stemcellTM, 미국)을 50ml 튜브에 넣고 그 위에 천천히 희석된 혈액을 올렸다. 400g에서 30분 동안 원심분리기(한일 514R, 한국)로 원심분리하고 강제감속 없이 정지하였다. 가장 상위층(플라즈마)을 제거하고 말초혈액단핵세포(PBMC)층을 새 튜브에 옮겨 담았다.
말초혈액단핵세포(PBMC)에 PBS(2% FBS)를 넣어 최종 부피를 50ml로 맞추어 주었다. 400g에서 10분 동안 원심분리기로 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 30ml의 PBS(2% FBS)를 넣어 세포 세척을 하였다. 400g에서 10분 동안 원심분리기로 추가 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 적혈구 용해 완충제(sigma) 2ml을 넣어 재현탁하고 3분 동안 배양하였다. 30ml의 PBS(2% FBS)를 넣고 400g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 뒤 배양 배지인 RPMI1640(welgene, 한국), 1% human AB serum(Corning, 미국))을 넣어 세포가 1.0×107/ml이 되도록 희석하였다. 6-웰 플레이트에 세포를 웰당 2ml(2.0×107)씩 넣고 3시간 동안 배양하였다. 파이펫으로 플레이트에 부착되지 않은 세포를 떼어내어 이후 naive T 세포 준비에 사용하였다. 플레이트에 부착되어 있는 세포에 새로운 배양 배지(dendritic cell medium(cellgenix), 1% human AB serum(corning), IL-4(10ng/ml, peprotech), GM-CSF(800U/ml, peprotech)) 3ml을 넣어 2일 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 2일 후 추가로 배양 배지(dendritic cell medium, IL-4(10ng/ml), GM-CSF(1600U/ml)) 1.5ml을 넣고 24시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 미성숙 수지상세포(immature DC)로 분화한 세포를 모두 모아서 계수하였다. 새로운 배양 배지(dendritic cell medium, 1% human AB serum, IL-4(10ng/ml), GM-CSF(800U/ml), LPS(10ng/ml), IFN-γNY-ESO-1 peptide(SLLMWITQC, 2.5μg/ml)를 넣어 세포가 0.5×106/ml이 되도록 희석하여 16시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하여 성숙 수지상세포를 준비하였다.
1-2. Naive CD8+ T cell 준비
완충액으로 PBS/1% human AB serum을 사용하여, CD8+ T 세포 분리 키트(miltenyi biotec Cat# 130-096-495, 독일)와 naive T 세포 분리 비드(miltenyi biotec Cat#130-046-001, 130-092-073, 독일)의 매뉴얼에 기재된 표준 방법에 의하여 naive CD8+ T 세포를 준비하였다. 세포에 배양 배지(dendritic medium, 5% human AB serum, IL-7(5ng/ml))를 넣어 3.0×106/ml로 희석하여 6-웰 플레이트에 웰당 2ml씩 분주하고 37℃, CO2 배양기에서 밤새 배양하였다.
1-3.
수지상세포와
T 세포의
공생배양
준비된 성숙 수지상세포는 배양 배지(dendritic medium, 5% human AB serum)를 넣어 5.0×105/ml로 희석하고, 준비된 naive CD8+ T 세포는 배양 배지(dendritic medium, 5% human AB serum, IL-7(5ng/ml), IL-21(60ng/ml))를 넣어 2.0×106/ml로 희석하였다. 수지상세포와 T 세포를 동일한 부피(1:1)로 혼합한 후 48-웰 플레이트에 웰당 500㎕씩 분주하여 37℃, CO2 배양기에서 72시간 동안 배양하였다.
1-4. T 세포 증식
공생 배양 시작으로부터 72시간 후에 배양 배지(dendritic medium, 5% human AB serum, IL-15(10ng/ml), IL-7(10ng/ml))를 웰당 500㎕씩 추가로 넣고 72시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 72시간 후에 플레이트를 12-웰 플레이트로 바꾸고 배양 배지(dendritic medium, 5% human AB serum, IL-15(10ng/ml), IL-7(10ng/ml))를 웰당 1ml씩 추가로 넣고 48시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 48시간 후에 플레이트를 6-웰 플레이트로 바꾸고 배양 배지(dendritic medium, 5% human AB serum, IL-15(10ng/ml), IL-7(10ng/ml))를 웰당 1ml씩 추가로 넣고 72시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다.
실시예
2: NY-
ESO
-1 특이적 T 세포 클론의 분리
NY-ESO-1 특이적 T 세포 클론을 희석법으로 배양하였다. 구체적으로, 우선 펩타이드 특이적인 spot을 확인한 세포독성 T 림프구(CTL)을 1 cell/well 또는 2-3 cells/well의 농도로 희석하여 96 well plate에서 배양하였다. 이 때, mitimycin C로 처리한 feeder cell(allo PBMC, LCL)과 1% 피토헤마글루티닌(phytohaemagglutinin) 및 100 IU/ml IL-2를 함께 넣어준 조건에서 배양하였다. 3~4 주 후에 T 세포의 증식이 일어난 well을 확인하고, 이 well들의 세포를 사용하여 IFN-g ELIspot 방법을 통하여 펩타이드 특이 세포의 존재 여부를 확인하였다. ELISPOT은 다음과 같이 진행되었다. Anti-human IFN-γ항체(Mabtech Cat# 3420-3-250)를 PBS로 1000배 희석하여 96-웰 ELISpot 플레이트(Millipore Cat# MSIPN4510)에 웰당 100㎕씩 넣고 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅된 플레이트에 PBS(5% FBS)를 웰당 200㎕씩 넣어 세척을 4번 반복하였다. 배양한 T 세포 50㎕를 각각 NY-ESO-1 펩타이트와 결합된 T2 또는 결합되지 않은 T2 세포 50㎕와 함께 항체로 코팅된 ELISpot 플레이트에 넣고 24시간 동안 배양하였다. 플레이트에 웰당 200㎕의 PBS(0.5% FBS)를 넣고 6번의 세척을 반복하였다. 바이오틴이 결합된 anti-IFN-γ항체(Mabtech Cat# 3420-6-250)를 PBS로 1000배 희석하여 플레이트에 웰당 100㎕씩 넣고 실온에서 90분 동안 반응하였다. 플레이트에 웰당 200㎕의 PBS(0.5% FBS)를 넣고 4번의 세척을 반복하였다. Streptavidin-alkaline phosphastase(Mabtech Cat# 3310-8)를 PBS로 2000배 희석하여 플레이트에 웰당 100㎕씩 넣고 실온에서 60분 동안 암반응하였다. 플레이트에 웰당 200㎕의 PBS를 넣고 4번의 세척을 반복하였다. NBT/BCIP(Thermo Cat# 34042)를 웰당 100㎕씩 넣은 후 발색이 될 때까지 암반응하였다. 이와 같은 방법으로 3종의 NY-ESO-1 특이적 T 세포 클론을 확인하였으며, 확인된 T 세포 클론은 추가적인 expansion 과정을 거쳐 세포 수를 증식하여 실험에 사용하였다.
실시예
3: NY-
ESO
-1 특이적 T 세포 클론의 동정 및 T 세포 표면에의 발현
확보된 T 세포 클론에서 총 RNA를 정제하였다. 정제한 총 RNA를 주형으로 하여 random hexamer (dN6)를 primer로 넣고 역전사 효소반응을 이용해서 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하고 알려진 TRAV 유전자의 대부분을 증폭할 수 있는 25개 forward 프라이머들과 1개 reverse 프라이머(TRACrev)를 넣고 PCR하여 TRAV를 증폭하였다. 다른 튜브에는 cDNA를 주형으로 하고 알려진 TRBV 유전자의 대부분을 증폭할 수 있는 17개 forward 프라이머들과 1개 reverse 프라이머(TRBCrev)를 넣고 PCR하여 TRBV를 증폭하였다. 반응에 사용된 프라이머 및 반응 조건은 각각 표 1과 표 2에 나타내었고, 상세하게는 논문(I Boria et al., (2008) BMC Immunology 9:50)을 참고하였다.
증폭된 산물을 1.5% 아가로오즈 겔로 전기영동하고 EtBr 염색하여 확인해 본 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 각각 360bp, 400bp 밴드를 확인할 수 있었다. 이후, 아가로오즈 겔로부터 DNA 밴드를 추출하여 서열을 확인하였으며, TCR 발현벡터에 클로닝하는데 사용하였다. 본 발명에서 확인된 3종의 T 세포 수용체의 알파 쇄 및 베타 쇄의 아미노산 서열은 각각 하기와 같다. 각각의 아미노산 서열로부터 재조합 TCR 발현을 위한 인공 핵산서열도 각각 하기에 표시되었다.
서열번호 1. T 세포 수용체(
MTN
4)의
알파
쇄의
아미노산 서열
METLLGLLILWLQLQWVSSQSVAQPEDQVNVAEGNPLTVKCTYSVSGNPYLFWYVQYPNRGLQFLLKYITGDNLVKGSYGFEAEFNKSQTSFHLKKPSALVSDSALYFCAVRDISTSGTYKYIFGTGTRLKVLAN
서열번호 2. T 세포 수용체(
MTN
4)의
베타
쇄의
아미노산 서열
MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAVKVTQNSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHENMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTSMYLCASSFLTGDTQYFGPGTRLTVL
서열번호 3. T 세포 수용체(
MTN
9)의
알파
쇄의
아미노산 서열
METLLGLLILWLQLQWVSSSQQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQNSGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCATDDPGAGSYQLTFGKGTKLSVIPN
서열번호 4. T 세포 수용체(
MTN
9)의
베타
쇄의
아미노산 서열
MSIGLLCCAALSLLWAGPVNADGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASTLRLYSYNEQFFGPGTRLTVL
서열번호 5. T 세포 수용체(
MTN
11)의
베타
쇄의
아미노산 서열
METLLGLLILWLQLQWVSSEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSSSTYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDSAIYFCAEMKGSQGNLIFGKGTKLSVKPN
서열번호 6. T 세포 수용체(
MTN
11)의
베타
쇄의
아미노산 서열
MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVAGGGDTQYFGPGTRLTVL
서열번호 7. T 세포 수용체(
MTN
4)의
알파
쇄의
핵산 서열
ATGGAAACACTTTTGGGATTGTTGATTCTCTGGCTTCAGCTTCAATGGGTTAGTTCACAGTCAGTGGCTCAGCCGGAAGATCAGGTCAACGTTGCTGAAGGGAATCCTCTGACTGTGAAATGCACCTATTCAGTCTCTGGAAACCCTTATCTTTTTTGGTATGTTCAATACCCCAACCGAGGCCTCCAGTTCCTTCTGAAATACATCACAGGGGATAACCTGGTTAAAGGCAGCTATGGCTTTGAAGCTGAATTTAACAAGAGCCAAACCTCCTTCCACCTGAAGAAACCATCTGCCCTTGTGAGCGACTCCGCTTTGTACTTCTGTGCTGTGAGAGACATCTCTACCTCAGGAACCTACAAATACATCTTTGGAACAGGCACCAGGCTGAAGGTTTTAGCAAAT
서열번호 8. T 세포 수용체(
MTN
4)의
베타
쇄의
핵산 서열
ATGAGCATTGGACTGCTGTGTTGTGCAGCCCTTTCACTTCTGTGGGCTGGTCCGGTGAACGCTGTGAAAGTGACCCAGAACTCGAGATATCTAGTCAAAAGGACGGGAGAGAAAGTTTTTCTGGAATGTGTCCAGGATATGGACCATGAAAATATGTTCTGGTATCGACAAGACCCAGGTCTGGGGCTACGGCTGATCTATTTCTCATATGATGTTAAAATGAAAGAAAAAGGAGATATTCCTGAGGGGTACAGTGTCTCTAGAGAGAAGAAGGAGCGCTTCTCCCTGATTCTGGAGTCCGCCAGCACCAACCAGACATCTATGTACCTCTGTGCCAGCAGTTTTCTGACGGGGGATACGCAGTATTTTGGCCCAGGCACCCGGCTGACAGTGCTC
서열번호 9. T 세포 수용체(
MTN
9)의
알파
쇄의
핵산 서열
ATGGAAACACTTTTGGGATTGTTGATTCTCTGGCTTCAGCTTCAATGGGTTAGTTCAAGTCAACAGGGAGAAGAGGATCCTCAGGCCTTGAGCATCCAGGAGGGTGAAAATGCCACCATGAACTGCAGTTACAAAACTAGTATAAACAATTTACAGTGGTATAGACAAAATTCAGGTAGAGGCCTTGTCCACCTAATTTTAATACGTTCAAATGAAAGAGAGAAACACAGTGGAAGATTAAGAGTCACGCTTGACACTTCCAAGAAAAGCAGTTCCTTGTTGATCACGGCTTCCCGGGCAGCAGACACTGCTTCTTACTTCTGTGCTACGGACGACCCTGGGGCTGGGAGTTACCAACTCACTTTCGGGAAGGGGACCAAACTCTCGGTCATACCAAAT
서열번호 10. T 세포 수용체(
MTN
9)의
베타
쇄의
핵산 서열
ATGAGCATTGGACTGCTGTGTTGTGCAGCCCTTTCACTTCTGTGGGCTGGTCCGGTGAACGCTGATGGTGGAATCACTCAGTCCCCAAAGTACCTGTTCAGAAAGGAAGGACAGAATGTGACCCTGAGTTGTGAACAGAATTTGAACCACGATGCCATGTACTGGTACCGACAGGACCCAGGGCAAGGGCTGAGATTGATCTACTACTCACAGATAGTAAATGACTTTCAGAAAGGAGATATAGCTGAAGGGTACAGCGTCTCTCGGGAGAAGAAGGAATCCTTTCCTCTCACTGTGACATCGGCCCAAAAGAACCCGACAGCTTTCTATCTCTGTGCCAGTACCCTACGGCTTTACTCCTACAATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTA
서열번호 11. T 세포 수용체(
MTN
11)의
알파
쇄의
핵산 서열
ATGGAAACACTTTTGGGATTGTTGATTCTCTGGCTTCAGCTTCAATGGGTTAGTTCAgAgGATGTGGAGCAGAGTCTTTTCCTGAGTGTCCGAGAGGGAGACAGCTCCGTTATAAACTGCACTTACACAGACAGCTCCTCCACCTACTTATACTGGTATAAGCAAGAACCTGGAGCAGGTCTCCAGTTGCTGACGTATATTTTTTCAAATATGGACATGAAACAAGACCAAAGACTCACTGTTCTATTGAATAAAAAGGATAAACATCTGTCTCTGCGCATTGCAGACACCCAGACTGGGGACTCAGCTATCTACTTCTGTGCAGAGATGAAAGGAAGCCAAGGAAATCTCATCTTTGGAAAAGGCACTAAACTCTCTGTTAAACCAAAT
서열번호 12. T 세포 수용체(
MTN
11)의
베타
쇄의
핵산 서열
ATGAGCATTGGACTGCTGTGTTGTGCAGCCCTTTCACTTCTGTGGGCTGGTCCGGTGAACGCTGGAGTCACACAAACCCCAAAGCACCTGATCACAGCAACTGGACAGCGAGTGACGCTGAGATGCTCCCCTAGGTCTGGAGACCTCTCTGTGTACTGGTACCAACAGAGCCTGGACCAGGGCCTCCAGTTCCTCATTCAGTATTATAATGGAGAAGAGAGAGCAAAAGGAAACATTCTTGAACGATTCTCCGCACAACAGTTCCCTGACTTGCACTCTGAACTAAACCTGAGCTCTCTGGAGCTGGGGGACTCAGCTTTGTATTTCTGTGCCAGCAGCGTTGCGGGGGGGGGGGATACGCAGTATTTTGGCCCAGGCACCCGGCTGACAGTGCTC
T 세포 수용체의 발현을 위한 발현벡터로는 pLVX 벡터(Thermo Scientific, 미국)를 사용하였으며, TRAV와 TRBV 절편을 각각의 constant domain과 연결하고 이것을 2A peptide system을 이용해서 하나의 폴리펩타이드로 연결하였다. 2A peptide는 foot-and-mouth disease 바이러스 유래의 약 20개의 아미노산 서열로, 단백질이 발현될 때 스스로를 자르기 때문에 하나로 연결된 TCR α/β을 두 개로 나누어지도록 하여 TCR α chain과 TCR β이 하나의 발현벡터에서 발현되어 동일한 양이 만들어지게 할 수 있다. 또한 Furin cleavage site(퓨린 절단 부위) 와 V5 peptide tag, linker를 추가하여 TCR이 더 잘 발현되도록 하였다(S Yang et al., (2008) Gene Therapy 15: 1411-1423 참조), (도 5 참조).
mRNA 전기천공법으로 발현벡터를 T 세포로 도입하여 발현하였다. 우선 mRNA는 mMESSAGE mMACHINE T7 ultra kit(ambion, Cat# AM1345)를 사용하여 다음과 같이 준비하였다. 발현벡터를 제한효소 Eco52I(Thermo, Cat# ER0331)로 잘라 선형화하여 템프레이트로 사용하였다. 1μg 선형화된 DNA, 10μl T7 2X NTP/ARCA, 2μl 10X T7 reaction buffer, 2μl T7 enzyme mix 그리고 최종 부피가 20μl가 되도록 nuclease-free water를 넣고 잘 섞은 후 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 1μl TURBO DNase를 넣고 잘 섞은 후 37℃에서 15분 동안 반응하였다. 반응을 마친 후 36μl nuclease-free water, 20μl 5X E-PAP buffer, 10μl 25mM MnCl2, 10μl ATP solution, 4μl E-PAP를 넣고 잘 섞은 후 37℃에서 45분 동안 반응하였다. 반응을 마친 후 100μl nuclease-free water를 넣고 phenol/chloroform(bioneer, Cat# C-9017)을 200μl 넣고 잘 섞은 후 18000g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층만 모은 후 10μl ammonium acetate stop solution, 400μl 에탄올을 넣고 잘 섞은 후 -20℃에서 30분 동안 반응하였다. 23000g에서 20분 동안 원심분리하여 상층액은 버리고, 70% 에탄올 1ml을 넣고 잘 섞은 후 23000g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액은 버리고 mRNA를 nuclease-free water로 잘 녹인다. mRNA를 neon transfection system(thermo)을 이용하여 다음과 같이 T 세포 내로 도입하였다. 100μl T buffer에 1.0×106 T cell을 넣고 5μg mRNA를 섞은 후 1600V, 20ms, 1pulse 조건으로 전기천공하였다. 배양 배지(RPMI1640, 20% FBS, 300U/ml IL-2)에 T 세포를 넣고 3시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 그 결과 양성대조군 1G4와 비슷한 수준(99%)으로 발현됨을 확인하였다.
실시예
4: NY-
ESO
-1 특이적 T 세포 클론의 시험관 내 암세포 사멸 효능 평가
NY-ESO-1/HLA-A2 표면 발현하는 악성흑색종 유래의 표적세포 (target cell)를 아래와 같이 준비하여 암세포 사멸 효능을 평가하였다. 암 세포 (표적세포, A375)의 농도를 1.0×107 cells/mL로 맞춘 다음, 10μM calcein AM red-orange를 첨가하였다. 30분 동안 세포배양기 (37℃, 5% CO2)에서 보관하여 calcein AM dye에 염색되도록 한 후, 배양액으로 3번 세척하여 세포 안으로 흡수되지 않고 남은 calcein AM dye를 제거하였다(원심분리 조건 : 200g, 3분, 상온). 염색된 암세포의 농도를 2.5mM의 probenecid가 포함된 complete RPMI 배양액을 이용하여 1.0×105 cells/mL로 맞추어 준 후, 96-well plate의 각 well당 100㎕ (10,000개의 세포)씩 분주하였다. 작동세포 (effector cell)의 준비를 위해 배양 중인 PBMC 또는 human primary T cell을 2.5mM의 probenecid가 포함된 complete RPMI 배양액에 적정 농도만큼 현탁하였다. 이 경우, 작동세포:표적세포의 세포수의 비율(E:T)을 각각 50:1, 25:1, 12.5:1, 6.3:1, 3.1:1, 0:1로 설정한 다음, 정해진 표적세포 대비 필요한 작동세포의 수를 계산하여 농도를 정하였다. 세포 사멸반응은 100㎕의 calcein AM dye가 표지된 표적세포와 100㎕의 작동세포를 혼합하여 총 200㎕의 부피에서 4시간 동안 반응하였다. 96-well plate 기준으로, Positive control (maximum release)의 설정은 표적세포만 분주된 well에 1%의 Triton X-100을 처리한 후, 세포배양기에서 10분 동안 보관하였으며, 이는 세포 사멸반응의 마지막에 수행하였다.
세포 사멸반응이 종료된 후, 작동세포에 의해 사멸한 표적세포로부터 흘러나온 calcein AM dye를 형광 플레이트 리더기를 이용하여 577/600nm (Ex/Em)에서 측정하였다. 사멸하지 않은 세포로부터 받는 간섭을 최소화하기 위해, 원심분리 후 50~100㎕의 상등액을 취하여 새로운 plate로 옮긴 다음 측정하였다. 이 경우 원심분리는 400g, 3분, 상온에서 진행하였다.
대조군/실험군의 설정을 위하여, Background : 과정 2의 세척에 사용된 배양액에서 측정한 수치, Negative control (spontaneous release) : 표적세포만 배양한 대조군의 상등액에서 측정한 수치, positive control (maximum release) : 표적세포만 배양한 대조군에 1% triton X-100을 10분 이상 처리하여 모든 세포의 사멸을 유도한 다음 상등액에서 측정한 수치를 정의하고, 작동세포에 의한 표적세포의 특이적 사멸(Specific lysis)의 정도를 아래의 식에 의해 계산하였다.
((test sample)-(spontaneous release))/((maximum release)-(spontaneous release)) x 100 (%)
NY-ESO-1/HLA-A2 표면 발현하는 악성흑색종 유래의 표적세포 (target cell)에 대한 사멸 효능을 평가한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 작동세포:표적세포의 세포수의 비율을 50:1로 하였을 때, NY-ESO-1 특이적 세포의 분해율이 40% 이상으로 나타나, 본 발명에 따른 재조합 T 세포 수용체의 발현에 의해 암 세포주 (A375)에서 NY-ESO-1 특이적 세포 사멸을 나타내어 암세포 특이적 세포독성을 나타내는 유의한 결과를 확인할 수 있었다(도 3).
실시예
5: Recombinant
TCR
형질전환된 T 세포 특성 분석
혈액 샘플로부터 분리된 PBMC를 5% Human serum (H3667, Sigma), 100U/ml IL-2 (200-02, Peprotech)이 첨가된 RPMI-1640 (LM011-01, Welgene)을 이용하여 1X106 cells/ml로 희석해 배양하였다. 이 때 Dynabead Human T-Activator CD3/CD28을 세포 수의 2배가 되도록 세포 위에 첨가하였다. 5일 후에 자석을 이용하여 비드(bead)와 세포를 분리한 후 비드를 제거하고 세포를 RPMI-1640 (+5% Human serum, 100U/ml IL-2)로 1X106 cells/ml가 되도록 지속적으로 유지 및 배양하였다. Retronectin (T100B, Takara)을 PBS를 이용하여 100ug/ml로 희석하였다. 24 well을 준비하여 각 well에 400ul씩 분주하고, 100ug/ml Retronectin을 100ul씩 분주하였다 (Final 5ug/cm2). 이 후 4℃에서 밤새 배양하거나 RT에서 2시간 동안 배양하였다. 이 후 상층액을 제거한 후 2% BSA를 500ul씩 분주하고 30분간 RT에서 배양하였다. -80℃에 보관된 Virus stock을 ice에서 2시간 이상 녹인 후 각 well의 상층액을 제거하고 1ml씩 분주하였다. 분주한 후에 32℃에서 2000g 2시간동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후 2% BSA로 한 번 wash를 해주고 배양 중인 PBMC를 5X105개/ml로 희석하여 각 well에 500ul씩 분주하였다. 분주한 후에 32℃에서 2000g 2시간 동안 원심분리 하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 렌티바이러스가 도입된 T 세포는 표적 세포로 NY-ESO-1 peptide가 표지된 T2 세포와 동일 비율로 혼합한 뒤, 16~18시간 정도 배양하였다. 그리고 세포를 취하여 CD69 항체로 표지한 다음, FACS 분석을 통해 T 세포 활성화를 평가하였다. 그 결과, 도 6에서와 같이, MTN4와 MTN9에서 T 세포 활성화를 확인할 수 있었고, 특히 MTN4의 활성화 정도가 우수하게 나타났다.
실시예
6: 동물모델을 이용한 NY-
ESO
-1 특이적 T 세포 클론의 암세포 사멸 효능 평가
종양세포(A375)를 4×105 cell/mice 농도로 NSG 마우스 우측 견갑부와 흉벽 사이의 부위에 1cc syringe(26 gauge) 사용하여 피하로 주입하였다. 종양 크기 평균이 50 ~ 60mm3 되었을 때 군분리 실시한 후 종양 이식 후 14일째에 본 발명에 따른 재조합 T 세포 수용체가 발현된 T 세포 치료제를 미정맥으로 통해 1×107 cell/200ul 농도로 투여하였으며, 치료제 투여일에는 IL-2도 1 x 105 IU/100ul 농도로 복강을 통해 함께 투였다.
그 결과, 도 7 및 도 8에서 나타낸 바와 같이 T 세포 치료제를 투여한 실험군에서 종양의 크기 변화가 감소되는 것을 확인할 수 있었다. MTN9의 경우 실험동물모델에서 기존에 알려진 항-NY-ESO-1 T 세포 수용체인 1G4(양성 대조군, PC)에 비해 우수한 암세포 사멸능을 보여 주는 것을 확인하였다.
한편, 동물 모델에서의 암조직은 다음과 같은 방법으로 분석하였다. 암조직을 5um 사이즈로 섹션하고 Ottix plus (X0076, Diapath)를 5분간 2회 처리한 후, Ottix shaper (X0096, Diapath)를 5분간 처리하였다. 수돗물로 5분간 세척해주고, 비커에 뜨거운 물을 채운 뒤 coplin jar에 슬라이드를 넣고 1x EDTA buffer를 넣어 90℃에 10-15분간 데운 후 상온에서 30분간 방치하였다. DDW로 3분간 세척해주고, Hydrophobic pen을 이용하여 염색할 부위를 표시하였다. Hydrogen peroxide block (Ab80437, Abcam)을 이용하여 섹션을 덮을 정도로 충분히 떨어뜨린 후 10분간 배양하였다. PBS를 이용하여 2회 세척해주고, Protein block (Ab80437, Abcam)을 발라준 후 10분간 RT에서 배양하고 PBS로 1회 세척하였다. anti-human CD3e antibody (A045229, Dako)를 1:100으로 희석한 후 첨가하여 90분간 RT에서 배양하였다. PBS를 이용하여 3회 세척해주고, anti-rabbit IgG (Ab80437, Abcam)을 첨가한 후 1시간동안 RT에서 배양하였다. PBS를 이용하여 3회 세척해준 후 DAB peroxidase substrate (SK-4100)으로 5-10분간 발색시켰다. PBS를 이용하서 4회 세척해준 후 Hematoxylin (H-3404, Vector)을 이용하여 counterstaining을 진행하였다. DDW를 이용하여 3-4분간 2회 세척해주고, VectaMount AQ (H-5501, Vector)를 2-3방울 떨어뜨려 Mounting 시켰다. 이후 현미경 (DM1i, Leica)를 이용하여 이미지를 분석하였다. 그 결과, 도 9에서와 같이, PBS 처리군을 제외한 각각의 암 조직에서 T 세포가 침투됨을 확인할 수 있었으며, 특히 형질전환하지 않은 T 세포를 투약한 Mock 실험군에 비해 본 발명의 MTN9, MTN11의 T 세포에서 암조직으로의 침투가 두드러지게 관찰되었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Medytox Inc.
<120> NY-ESO-1 Specific T Cell Receptor and Use Thereof
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<160> 12
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Screened Amino Acid Sequence of Alpha Chain of T Cell
Receptor(MTN4)
<400> 1
Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp
1 5 10 15
Val Ser Ser Gln Ser Val Ala Gln Pro Glu Asp Gln Val Asn Val Ala
20 25 30
Glu Gly Asn Pro Leu Thr Val Lys Cys Thr Tyr Ser Val Ser Gly Asn
35 40 45
Pro Tyr Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Asn Arg Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Leu Lys Tyr Ile Thr Gly Asp Asn Leu Val Lys Gly Ser Tyr Gly
65 70 75 80
Phe Glu Ala Glu Phe Asn Lys Ser Gln Thr Ser Phe His Leu Lys Lys
85 90 95
Pro Ser Ala Leu Val Ser Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Val Arg
100 105 110
Asp Ile Ser Thr Ser Gly Thr Tyr Lys Tyr Ile Phe Gly Thr Gly Thr
115 120 125
Arg Leu Lys Val Leu Ala Asn
130 135
<210> 2
<211> 132
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Screened Amino Acid Sequence of Beta Chain of T Cell
Receptor(MTN4)
<400> 2
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asn Ala Val Lys Val Thr Gln Asn Ser Arg Tyr Leu Val
20 25 30
Lys Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp
35 40 45
His Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg
50 55 60
Leu Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile
65 70 75 80
Pro Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu
85 90 95
Ile Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala
100 105 110
Ser Ser Phe Leu Thr Gly Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg
115 120 125
Leu Thr Val Leu
130
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Receptor(MTN9)
<400> 3
Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp
1 5 10 15
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50 55 60
Leu Ile Leu Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu
65 70 75 80
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100 105 110
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Ser Val Ile Pro Asn
130
<210> 4
<211> 135
<212> PRT
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Receptor(MTN9)
<400> 4
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asn Ala Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu
20 25 30
Phe Arg Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu
35 40 45
Asn His Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp
65 70 75 80
Ile Ala Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro
85 90 95
Leu Thr Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys
100 105 110
Ala Ser Thr Leu Arg Leu Tyr Ser Tyr Asn Glu Gln Phe Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu
130 135
<210> 5
<211> 130
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Screened Amino Acid Sequence of Alpha Chain of T Cell
Receptor(MTN11)
<400> 5
Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp
1 5 10 15
Val Ser Ser Glu Asp Val Glu Gln Ser Leu Phe Leu Ser Val Arg Glu
20 25 30
Gly Asp Ser Ser Val Ile Asn Cys Thr Tyr Thr Asp Ser Ser Ser Thr
35 40 45
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Ala Gly Leu Gln Leu Leu
50 55 60
Thr Tyr Ile Phe Ser Asn Met Asp Met Lys Gln Asp Gln Arg Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu Leu Asn Lys Lys Asp Lys His Leu Ser Leu Arg Ile Ala Asp
85 90 95
Thr Gln Thr Gly Asp Ser Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Glu Met Lys Gly
100 105 110
Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Lys
115 120 125
Pro Asn
130
<210> 6
<211> 132
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Screened Amino Acid Sequence of Beta Chain of T Cell
Receptor(MTN11)
<400> 6
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Val Ala Gly Gly Gly Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg
115 120 125
Leu Thr Val Leu
130
<210> 7
<211> 405
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Screened Nucleic Acid Sequence of Alpha Chain of T Cell
Receptor(MTN4)
<400> 7
atggaaacac ttttgggatt gttgattctc tggcttcagc ttcaatgggt tagttcacag 60
tcagtggctc agccggaaga tcaggtcaac gttgctgaag ggaatcctct gactgtgaaa 120
tgcacctatt cagtctctgg aaacccttat cttttttggt atgttcaata ccccaaccga 180
ggcctccagt tccttctgaa atacatcaca ggggataacc tggttaaagg cagctatggc 240
tttgaagctg aatttaacaa gagccaaacc tccttccacc tgaagaaacc atctgccctt 300
gtgagcgact ccgctttgta cttctgtgct gtgagagaca tctctacctc aggaacctac 360
aaatacatct ttggaacagg caccaggctg aaggttttag caaat 405
<210> 8
<211> 396
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Screened Nucleic Acid Sequence of Beta Chain of T Cell
Receptor(MTN4)
<400> 8
atgagcattg gactgctgtg ttgtgcagcc ctttcacttc tgtgggctgg tccggtgaac 60
gctgtgaaag tgacccagaa ctcgagatat ctagtcaaaa ggacgggaga gaaagttttt 120
ctggaatgtg tccaggatat ggaccatgaa aatatgttct ggtatcgaca agacccaggt 180
ctggggctac ggctgatcta tttctcatat gatgttaaaa tgaaagaaaa aggagatatt 240
cctgaggggt acagtgtctc tagagagaag aaggagcgct tctccctgat tctggagtcc 300
gccagcacca accagacatc tatgtacctc tgtgccagca gttttctgac gggggatacg 360
cagtattttg gcccaggcac ccggctgaca gtgctc 396
<210> 9
<211> 399
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Screened Nucleic Acid Sequence of Alpha Chain of T Cell
Receptor(MTN9)
<400> 9
atggaaacac ttttgggatt gttgattctc tggcttcagc ttcaatgggt tagttcaagt 60
caacagggag aagaggatcc tcaggccttg agcatccagg agggtgaaaa tgccaccatg 120
aactgcagtt acaaaactag tataaacaat ttacagtggt atagacaaaa ttcaggtaga 180
ggccttgtcc acctaatttt aatacgttca aatgaaagag agaaacacag tggaagatta 240
agagtcacgc ttgacacttc caagaaaagc agttccttgt tgatcacggc ttcccgggca 300
gcagacactg cttcttactt ctgtgctacg gacgaccctg gggctgggag ttaccaactc 360
actttcggga aggggaccaa actctcggtc ataccaaat 399
<210> 10
<211> 405
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Screened Nucleic Acid Sequence of Beta Chain of T Cell
Receptor(MTN9)
<400> 10
atgagcattg gactgctgtg ttgtgcagcc ctttcacttc tgtgggctgg tccggtgaac 60
gctgatggtg gaatcactca gtccccaaag tacctgttca gaaaggaagg acagaatgtg 120
accctgagtt gtgaacagaa tttgaaccac gatgccatgt actggtaccg acaggaccca 180
gggcaagggc tgagattgat ctactactca cagatagtaa atgactttca gaaaggagat 240
atagctgaag ggtacagcgt ctctcgggag aagaaggaat cctttcctct cactgtgaca 300
tcggcccaaa agaacccgac agctttctat ctctgtgcca gtaccctacg gctttactcc 360
tacaatgagc agttcttcgg gccagggaca cggctcaccg tgcta 405
<210> 11
<211> 390
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Screened Nucleic Acid Sequence of Alpha Chain of T Cell
Receptor(MTN11)
<400> 11
atggaaacac ttttgggatt gttgattctc tggcttcagc ttcaatgggt tagttcagag 60
gatgtggagc agagtctttt cctgagtgtc cgagagggag acagctccgt tataaactgc 120
acttacacag acagctcctc cacctactta tactggtata agcaagaacc tggagcaggt 180
ctccagttgc tgacgtatat tttttcaaat atggacatga aacaagacca aagactcact 240
gttctattga ataaaaagga taaacatctg tctctgcgca ttgcagacac ccagactggg 300
gactcagcta tctacttctg tgcagagatg aaaggaagcc aaggaaatct catctttgga 360
aaaggcacta aactctctgt taaaccaaat 390
<210> 12
<211> 396
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Screened Nucleic Acid Sequence of Beta Chain of T Cell
Receptor(MTN11)
<400> 12
atgagcattg gactgctgtg ttgtgcagcc ctttcacttc tgtgggctgg tccggtgaac 60
gctggagtca cacaaacccc aaagcacctg atcacagcaa ctggacagcg agtgacgctg 120
agatgctccc ctaggtctgg agacctctct gtgtactggt accaacagag cctggaccag 180
ggcctccagt tcctcattca gtattataat ggagaagaga gagcaaaagg aaacattctt 240
gaacgattct ccgcacaaca gttccctgac ttgcactctg aactaaacct gagctctctg 300
gagctggggg actcagcttt gtatttctgt gccagcagcg ttgcgggggg gggggatacg 360
cagtattttg gcccaggcac ccggctgaca gtgctc 396
Claims (18)
- 서열번호 1, 3 또는 5의 아미노산 서열로 표시되는, NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 알파 쇄의 가변 도메인.
- 서열번호 2, 4 또는 6의 아미노산 서열로 표시되는, NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체의 베타 쇄의 가변 도메인.
- 제1항의 알파 쇄의 가변 도메인 및 제2항의 베타 쇄의 가변 도메인을 포함하는 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체.
- 제3항의 NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체가 표면에 발현된 세포.
- 제4항에 있어서, 상기 세포는 세포 독성 T 세포(CTL), 억제 T 세포 또는 자연살해 세포 (NK 세포)인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제1항의 가변 도메인을 코딩하는 핵산.
- 제6항에 있어서, 상기 가변 도메인은 서열번호 7, 9 또는 11의 핵산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산.
- 제2항의 가변 도메인을 코딩하는 핵산
- 제8항에 있어서, 상기 가변 도메인은 서열번호 8, 10 또는 12의 핵산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 핵산.
- 제6항 및 제8항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터
- 제6항 및 제8항의 핵산이 도입된 재조합 세포.
- 제11항에 있어서, 상기 세포는 세포 독성 T 세포(CTL), 억제 T 세포 또는 자연살해 세포 (NK 세포)인 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
- 제4항의 세포를 유효성분으로 포함하는 NY-ESO-1 관련 질환 치료용 약학적 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 NY-ESO-1 관련 질환은 고형암인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 고형암은 피부암 또는 흑색종인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제11항의 재조합 세포를 유효성분으로 포함하는 NY-ESO-1 관련 질환 치료용 약학적 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 NY-ESO-1 관련 질환은 고형암인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제17항에 있어서, 상기 고형암은 피부암 또는 흑색종인 것을 특징으로 하는 조성물.
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-
2018
- 2018-12-05 KR KR1020180155018A patent/KR20200068263A/ko unknown
Patent Citations (3)
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US20130116167A1 (en) | 2006-05-03 | 2013-05-09 | The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health & Human Servic | Anti-mart-1 t cell receptors and related materials and methods of use |
US8088379B2 (en) | 2006-09-26 | 2012-01-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Modified T cell receptors and related materials and methods |
US9128080B2 (en) | 2006-09-26 | 2015-09-08 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Modified T cell receptors and related materials and methods |
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