CN111417720A - 用于选择性扩增表达具有鼠恒定区的tcr的细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了选择性扩增许多T细胞的方法。该方法可包括：修饰人T细胞以表达TCR，其中TCR包括鼠恒定区；产生细胞群，其包括表达TCR的许多人T细胞和不表达TCR的许多人T细胞；以及在(i)经辐照的饲养细胞，(ii)一种或多种细胞因子，和(iii)抗体或其抗原结合部分的存在下培养所述细胞群，其中抗体对TCR的鼠恒定区具有抗原特异性，以便选择性扩增表达TCR的T细胞数目超过未表达TCR的T细胞数目。本申请还公开了相关细胞群、药物组合物以及治疗或预防癌症的方法。

Description

用于选择性扩增表达具有鼠恒定区的TCR的细胞的方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2017年10月5日提交的第62/568,339号美国临时专利申请的权益，其通过引用整体并入本文。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明是由美国国立卫生研究院国家癌症研究所(National Institutes ofHealth,National Cancer Institute)在政府支持下完成的，项目号为Z1A BC 010985。政府拥有本发明的某些权利。

通过引用并入以电子方式提交的材料

通过引用整体并入本文的是与此同时提交并且标识如下的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表：日期为2018年9月24日的一个名为“740358_ST25.txt”的8,876字节ASCII(文本)文件。

发明背景

通过施用经修饰以表达外源性T细胞受体(TCR)的细胞来治疗癌症在一些患者中产生了阳性临床结果。然而，仍然存在此类疗法更广泛成功的障碍。例如，编码外源性TCR的基因的低递送效率可能导致表达外源性TCR的细胞数目较低。因此，对产生表达外源性TCR的细胞的改进方法的需求尚未得到满足。

发明简述

本发明的实施方案提供了选择性扩增多个T细胞的方法，所述方法包括：修饰人T细胞以表达TCR，其中TCR包含鼠恒定区；产生细胞群，其包含多个表达TCR的人T细胞和多个不表达TCR的人T细胞；以及在(i)辐照的饲养细胞、(ii)一种或多种细胞因子和(iii)抗体或其抗原结合部分的存在下培养细胞群，其中抗体对TCR的鼠恒定区具有抗原特异性，以便选择性扩增表达TCR的T细胞的数目超过未表达TCR的T细胞的数目。

本发明的另外实施方案提供了包含根据本发明的方法制备的选择性扩增的多个T细胞的相关细胞群，以及包含所述细胞群的药物组合物。

本发明的又一个实施方案提供了治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法的方法，该方法包括根据本发明的方法选择性扩增多个T细胞，并以有效治疗或预防哺乳动物中的癌症的量向哺乳动物施用选择性扩增的多个T细胞。

若干附图视图的简述

图1A是说明编码人TCRα链可变区(hVα)、鼠TCRα链恒定区(mCα)、合成接头序列(L)、人TCRβ链可变区(hVβ)和鼠TCRβ链恒定区(mCβ)的核苷酸构建体的示意图。

图1B是说明根据本发明的实施方案选择性扩增表达mTCR的多个T细胞的方法的示意图。

图2显示了实验数据(点状图)，说明了在经历使用OKT3 Ab的标准快速扩增方案(REP)或使用H57 Ab的选择性扩增的抗-突变的ERBB2mTCR或抗-突变的ERBB2IP mTCR-电穿孔的细胞(ERBB2mutTCR或ERBB2IPmutTCR)中通过FACS检测到的(i)CD3、CD4或CD8表达和(ii)mTCRβ表达。仅用电穿孔缓冲液电穿孔的T细胞(模拟物；无DNA/TCR)用作阴性对照。点状图中的数目是检测到的mTCR⁺细胞的百分比。

图3A和3B是显示抗-突变的ERBB2IP mTCRβ⁺(ERBB2IPmutTCR)(A)或抗-突变的ERBB2(ERBB2mutTCR)mTCRβ⁺(B)细胞在用各种浓度(ng/mL)的H57 Ab选择性扩增之后检测到还表达CD3、CD4或CD8的百分比(％)的图。仅用电穿孔缓冲液电穿孔的T细胞(模拟物；无DNA/TCR)用作阴性对照。用OKT3 Ab进行标准REP而不是用H57 Ab进行选择性扩增的电穿孔的细胞用作非特异性T细胞生长的阳性对照。

图4A是说明根据本发明的实施方案选择性扩增表达包含鼠恒定区(mTCR)的TCR的多个T细胞的方法的示意图。

图4B是说明H57 Ab与TCR的鼠TCRβ链恒定区(mCβ)的结合的示意图。TCR的其他组分包括人TCRα链可变区(hVα)、鼠TCRα链恒定区(mCα)、合成接头序列(L)和人TCRβ链可变区(hVβ)。

图5A-5D显示了在未转染的未染色的细胞(A)、未转染的染色细胞(B)、仅用电穿孔缓冲液(模拟物)电穿孔的细胞(无TCR/转座子(Tn))(C)和用编码mTCR(4149-TCRa2b2/pSBSO)的SBTS质粒和编码实施例3中所述的转座酶的SBTS质粒电穿孔的细胞(pKan-CMV-SB11)(D)中通过FACS检测的说明CD3表达和鼠TCRβ链(mTCRβ)表达的实验数据(点状图)。点状图中的数字是CD3⁺/mTCRβ⁺(右上象限)、CD3⁺/mTCRβ^-(右下象限)、CD3^-/mTCRβ^-(左下象限)和CD3^-/mTCRβ⁺细胞(左上象限)的百分比。

图6显示了实验数据(点状图)，说明了在指定起始数目的电穿孔的细胞下经历用指定浓度的H57 Ab(ng/mL)进行选择性扩增的mTCR-电穿孔的细胞(REP中的mTCR⁺细胞)中通过FACS检测到的CD3表达和mTCRβ表达。仅用电穿孔缓冲液(模拟物)(无TCR)电穿孔的细胞用作阴性对照。点状图中的数字是CD3⁺/mTCRβ⁺(右上象限)、CD3⁺/mTCRβ^-(右下象限)、CD3^-/mTCRβ^-(左下象限)和CD3^-/mTCRβ⁺细胞(左上象限)的百分比。

图7显示了实验数据(点状图)，说明了在经历用H57 Ab或OKT3 Ab进行的第二次扩增并染色或未染色的mTCR-电穿孔的细胞中通过FACS检测到的CD3表达和mTCRβ表达。还显示了实验数据(点状图)，说明了在经历用OKT3 Ab进行的第二次扩增的mTCR-电穿孔的细胞中通过FACS检测到的CD4和CD8表达。

图8A和8B显示了实验数据(点状图)，说明了在扩增前(快速扩增方案(REP)前)通过FACS检测到的未转导(UT)(图8B)和转导的(图8A)细胞的CD8表达和抗-MART-1TCR表达。

图8C显示了实验数据(点状图)，说明了通过FACS检测到的扩增前(前-REP)和稀释至约5％mTCRb+细胞之后图8A的转导细胞的CD8表达和抗-MART-1TCR表达。

图9显示了实验数据(点状图)，说明了用(i)50CU或500CU的IL-2和(ii)OKT3 Ab或H57 Ab(“mTCRb”)扩增后，通过FACS检测到的UT细胞或图8C的经稀释的转导细胞的CD8表达和抗-MART-1TCR表达。

图10A是显示了用(i)50CU或500CU的IL-2和(ii)OKT3 Ab或H57Ab(“mTCRb”)扩增后，检测到的UT细胞或图8C的稀释的转导细胞的转导细胞百分比的图。

图10B是显示了用(i)50CU或500CU IL-2和(ii)OKT3 Ab或H57 Ab(“mTCRb”)扩增后，UT细胞或图8C的稀释的转导细胞实现的倍数扩增的图。

图11A-11C显示了实验数据(点状图)，说明了在UT细胞(图11A)或在四倍稀释之前(图11B)和之后(图11C)用抗-MART-1TCR转导的细胞扩增之前通过FACS检测到的CD8表达和mTCRb表达。

图12A-12E显示了实验数据(点状图)，说明了在用OKT3和500CU IL-2(图12A)、H57(mTCRb)和500CU IL-2(图12B)、H57(mTCRb)和50CU IL-2(图12C)、或H57(mTCRb)和无IL-2(图12D)扩增UT细胞(图12E)或图11C的经稀释的TCR-转导细胞之后通过FACS检测到的CD8表达和mTCRb表达。

图13A是显示用(i)0CU、50CU或500CU的IL-2和(ii)OKT3 Ab或H57 Ab(“mTCRb”)扩增后检测到的UT细胞或图11C的稀释的转导细胞的转导细胞百分比的图。

图13B是显示用(i)0CU、50CU或500CU的IL-2和(ii)OKT3 Ab或H57 Ab(“mTCRb”)扩增后，UT细胞或图11C的稀释的转导细胞实现的倍数扩增的图。

图14A-14F显示了说明在扩增前(图14A)或在用OKT3(30ng/ml)(图14B)或H57(mTCRb)(5ng/ml(图14F)、10ng/ml(图14E)、50ng/ml(图14D)或500ng/ml(图14C))扩增经转导的细胞之后通过FACS检测到的CD8表达和mTCRb表达的实验数据(点状图)。图15是显示用OKT3(30ng/ml)或H57(mTCRb)(5、10、50或500ng/ml)扩增后，对mTCR-转导的细胞实现的倍数扩增的图。

图16A-16E显示了实验数据(点状图)，说明了在经历用H57进行的第一轮扩增的mTCR-转导细胞的第二轮扩增之后通过FACS检测到的CD8表达和mTCRb表达。第二轮扩增用OKT3(30ng/ml)(图16A)或H57(mTCRb)(5ng/ml(图16E)、10ng/ml(图16D)、50ng/ml(图16C)或500ng/ml(图16B))进行。

图17的图显示了在经历用H57进行的第一轮扩增的mTCR-转导细胞的第二轮扩增之后获得的mTCR-转导细胞的倍数扩增。用OKT3(30ng/ml)或H57(mTCRb)(5、10、50或500ng/ml)进行第二轮扩增。

图18显示了实验数据(点状图)，说明了在用4149-HUWE1-TCR1或4149-TP53-TCRa2b2对来自供体1和2的PBMC进行电穿孔之后通过FACS检测到的CD3表达和mTCRb表达。未染色的PBMC、未转染的PBMC和用单独的电穿孔缓冲液电穿孔的PBMC(模拟物)(无TCR)用作阴性对照。

图19A-19B显示了实验数据(点状图)，说明了来自用4149-HUWE1-TCR1或4149-TP53-TCRa2b2转座并经历一轮用H57进行的扩增的供体1和2的PBMC进行的CD3表达和mTCRb表达(图19B)。未染色的PBMC(图19A)和仅用电穿孔缓冲液电穿孔的PBMC(模拟物)(无TCR)(图19B)用作阴性对照。

图20A-20B显示了实验数据(点状图)，说明了由来自用4149-HUWE1-TCR1或4149-TP53-TCRa2b2转座且经历一轮用H57进行的扩增(图20B)然后使用标准REP进行扩增的供体1和2的PBMC进行的CD3表达和mTCRb表达。未染色的PBMC(图20A)和仅用电穿孔缓冲液电穿孔的PBMC(模拟物)(无TCR)(图20B)用作阴性对照。

图21A是显示共培养(i)用DMSO、WT HUWE1肽或突变的(mut)HUWE1肽脉冲的DC与(ii)来自用4149-HUWE1-TCR1转座的供体1的细胞之后分泌的IFN-γ的浓度的图。单独培养的DC用作对照。平均值±SEM；n＝3个技术重复。

图21B是显示共培养(i)用DMSO、WT TP53肽或mut TP53肽脉冲的DC与(ii)来自用4149-TP53-TCRa2b2转座的供体1的细胞之后分泌的IFN-γ的浓度的图。单独培养的DC用作对照。平均值±SEM；n＝3个技术重复。

图21C是显示在共培养(i)用DMSO、WT HUWE1肽、mut HUWE1肽脉冲的DC与(ii)来自用4149-HUWE1-TCR1转座的供体2的细胞之后分泌的IFN-γ的浓度的图。单独培养的DC用作对照。平均值±SEM；n＝3个技术重复。

图21D是显示共培养(i)用DMSO、WT TP53肽或mut TP53肽脉冲的DC与(ii)用4149-TP53-TCRa2b2转座的来自供体2的细胞之后共分泌的IFN-γ的浓度的图。单独培养的DC用作对照。平均值±SEM；n＝3个技术重复。

图22是说明根据本发明的一个实施方案选择性扩增表达包含鼠恒定区(mTCR)的TCR的T细胞的数目的方法的示意图。

图23A是显示在实施例14中所述的方法期间在以下四个时间点测量的一个比色皿中的总细胞数的图：电穿孔后(空心条)、H57选择性扩增后(条纹条)、用H57-缀合的珠粒富集后(灰色条)，和用OKT3进行的标准REP后(黑色条)。用4149-HUWE1-TCR1或4149-TP53-TCRa2b2对细胞进行电穿孔。一式三份比色皿平行向前移动，使得显示的数据为平均值+/-SEM(n＝3)。

图23B是显示在实施例14中所述的方法期间在四个时间点测量的在一个比色皿中CD3+mTCR+细胞的百分比的图：电穿孔之后(空心条)、用H57选择性扩增之后(条纹条)、用H57-缀合的珠粒富集后(灰色条)以及用OKT3进行标准REP之后(黑色条)。用4149-HUWE1-TCR1或4149-TP53-TCRa2b2对细胞进行电穿孔。一式三份的比色皿平行向前移动，使得显示的数据为平均值+/-SEM(n＝3)。

图23C-23D是显示在实施例14所述的方法的第28天测量的4149-HUWE1-TCR1-转座(mTCR+)(图23C)或4149-TP53-TCRa2b2-转座(mTCR+)(图23D)的细胞的百分比的图。仅用电穿孔缓冲液电穿孔的PBMC(模拟物)(无TCR)用作阴性对照。模拟物由(1)表示，并且TCR-转座的细胞由(2)表示。一式三份的比色皿平行向前移动，以使显示的数据为平均值+/-SEM(n＝3)。

图23E是显示在实施例14中所述方法的第28天(OKT3 REP后)测量的CD4+mTCRβ+细胞(空心条)或CD8+mTCRβ+细胞(实心条)的百分比的图。TCR是4149-HUWE1-TCR1或4149-TP53-TCRa2b2。一式三份的比色皿平行向前移动，使得显示的数据为平均值+/-SEM(n＝3)。

图24A是显示在细胞数目扩增之前(第1天)(空心条)或扩增之后(第28天)(实心条)测量的对指定标记呈阳性的细胞的百分比的图。将细胞用4149-HUWE1-TCR1转座。

图24B是显示在扩增细胞数之前(第1天)(空心条)或之后(第28天)(实心条)测量的具有指定表型的mTCRβ+细胞的百分比的图。将细胞用4149-HUWE1-TCR1转座。表型是中心记忆T(T_CM)细胞、记忆干T细胞(T_SCM细胞)、天然T细胞(T_N)、效应记忆T细胞(T_EM)和效应记忆RA T细胞(T_EMRA)。

图24C是显示了对在细胞数目扩增之前(第1天)(空心条)或之后(第28天)(实心条)测量的指定标记呈阳性的细胞的百分比的图。将细胞用4149-TP53-TCRa2b2转座。

图24D是显示在细胞数目扩增之前(第1天)(空心条)或之后(第28天)(实心条)测量的具有指定表型的mTCRβ+细胞的百分比的图。将细胞用4149-TP53-TCRa2b2转座。

图25A是显示共培养(i)用DMSO或10、1或0.1μg/mL的WT HUWE1肽(空心条)或mutHUWE1肽(实心条)脉冲的DC与用4149-HUWE1-TCR1转座的细胞之后分泌的IFN-γ的浓度的图。

图25B是显示共培养(i)用DMSO或10、1或0.1μg/mL的WT TP53肽(空心条)或mutTP53肽(实心条)脉冲的DC与(ii)用4149-TP53-TCRa2b2转座的细胞之后分泌的IFN-γ的浓度的图。

发明详述

本发明的实施方案提供了选择性扩增T细胞数目的方法。该方法可包括修饰人T细胞以表达TCR，其中TCR包含鼠恒定区(下文称“mTCR”)。本发明的方法可以提供多种优势的任一种或多种。例如，本发明的方法可以提供使表达mTCR的T细胞的数目超过不表达mTCR的细胞的数目的选择性扩增。如本文所述，与通过不选择性地扩增T细胞数目的方法制备的细胞群相比，本发明的方法可以为细胞群提供更大比例的表达mTCR的细胞。不受特定理论或机制的约束，认为与具有更小比例的表达mTCR的细胞的细胞群相比，具有更大比例的表达mTCR的细胞的细胞群可以提供提高的靶癌细胞破坏和改善的癌症治疗中的一种或两种。

TCR通常包含两条多肽(即，多肽链)，诸如TCR的α-链、TCR的β-链、TCR的γ-链、TCR的δ-链或其组合。TCR的此类多肽链是本领域已知的。mTCR可以包含任何氨基酸序列，只要该mTCR包含鼠恒定区并且可以特异性结合并免疫识别抗原，诸如病症相关的抗原或其表位。

mTCR可以是外源性TCR，即并非T细胞天然的TCR(不天然存在于T细胞上)。外源性TCR可以是重组TCR。重组TCR是通过一种或多种外源性TCRα-、β-、γ-和/或δ-链编码基因的重组表达生成的TCR。制备重组TCR的方法是本领域中已知的。

在本发明的一个实施方案中，mTCR包含两条多肽链，其每一条包含含TCR的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3的可变区。优选地，mTCR包含α链的CDR1、α链的CDR2、α链的CDR3、β链的CDR1、β链的CDR2和β链的CDR3。

在一个实施方案中，mTCR可包含含上述CDR的TCR的可变区的氨基酸序列。在这方面，TCR可包含α链可变区和β链可变区。

在本发明的一个实施方案中，mTCR除了上述可变区或CDR之外还包含鼠恒定区。优选地，mTCR包含α链鼠恒定区和β链鼠恒定区两者。如本文所用，术语“鼠”当指代TCR或本文所述的TCR的任何组分(如，互补决定区(CDR)、可变区、恒定区、α链和/或β链)时，意指源自小鼠的TCR(或其组分)，即源自小鼠T细胞或曾由小鼠T细胞表达的TCR(或其组分)。

mTCR可以包含含可变区和恒定区的TCRα链，和含可变区和恒定区的TCRβ链。以下将α链可变区和β链可变区统称为TCR的“可变区”。α链恒定区和β链恒定区在下文中统称为TCR的“恒定区”。

在本发明的一个实施方案中，mTCR是鼠TCR。鼠TCR可包含完全源自小鼠的多肽链。在这方面，鼠TCR可包含鼠可变区和鼠恒定区。鼠TCR的实例包括但不限于美国专利号8,216,565和9,487,573以及美国专利申请号15/528,813中公开的那些。

在本发明的另一个实施方案中，mTCR是由源自来自两种不同哺乳动物物种(即，小鼠和非小鼠物种)的TCR的氨基酸序列组成的嵌合或杂交TCR。例如，mTCR可包含人可变区和鼠恒定区。包含人可变区和小鼠恒定区的嵌合TCR的实例公开于专利申请号PCT/US2016/050875、PCT/US2017/044615、PCT/US2017/027865、美国专利申请公开号2013/0274203、2017/0145070和2016/0152681；和美国专利号8,785,601中。

在本发明的一个实施方案中，mTCR是抗原-特异性TCR。如本文所用的短语“抗原-特异的”和“抗原特异性”意指mTCR可特异性结合并免疫识别抗原或其表位，使得mTCR与抗原或其表位的结合引发免疫响应。

被抗原-特异性mTCR识别的抗原可以是为病症的特征的任何抗原。例如，抗原可以是但不限于癌抗原(也称为肿瘤抗原或肿瘤相关的抗原)或病毒抗原。病毒抗原是本领域已知的，并且包括例如任何病毒蛋白，如env、gag、pol、gp120、胸苷激酶等。

如本文所用，术语“癌抗原”是指由肿瘤细胞或癌细胞单独或主要表达或过表达的任何分子(如蛋白质、多肽、肽、脂质、碳水化合物等)，使得抗原与肿瘤或癌症有关。癌抗原可以另外由正常、非肿瘤或非癌性细胞表达。然而，在此类情况下，正常、非肿瘤或非癌性细胞对癌抗原的表达不如肿瘤或癌细胞对癌抗原的表达稳健。在这方面，与由正常、非肿瘤或非癌性细胞对抗原的表达相比，肿瘤或癌细胞可以过表达抗原或以显著更高的水平表达抗原。此外，癌抗原可以另外由处于不同发育或成熟状态的细胞表达。例如，癌抗原可以另外由胚胎期或胎儿期的细胞表达，所述细胞通常在成年宿主中不存在。可替代地，癌抗原可以另外由干细胞或前体细胞表达，所述细胞通常在成年宿主中不存在。癌抗原是本领域已知的，并且包括例如间皮素、CD19、CD22、CD276(B7H3)、gp100、MART-1、表皮生长因子受体变体III(EGFRVIII)、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶、突变的KRAS、NY-ESO-1(也称为CAG-3)、MAGE-1、MAGE-3等。

在一个实施方案中，癌抗原是新抗原。新抗原是由肿瘤细胞或癌细胞在瘤形成转化期发生的基因突变生成的肿瘤特异性或癌症特异性抗原。新抗原可以是患者独有的。在一个优选的实施方案中，新抗原是免疫原性新抗原。

癌抗原可以是由任何癌症或肿瘤的任何细胞表达的抗原，包括本文所述的癌症和肿瘤。癌抗原可以是仅一种类型的癌症或肿瘤的癌抗原，使得癌抗原与仅一种类型的癌症或肿瘤相关或为仅一种类型的癌症或肿瘤的特征。可替代地，癌抗原可以是多于一种类型的癌症或肿瘤的癌抗原(如，可以是特征性的)。例如，癌抗原可以由乳腺癌细胞和前列腺癌细胞两者表达，并且完全不被正常、非肿瘤或非癌细胞表达。

与由抗原-特异性mTCR识别的抗原有关或特征在于由抗原-特异性mTCR识别的抗原的病症可以是任何病症。例如，如本文所讨论的，病症可以是癌症或病毒病症。

癌症可以是任何癌症，包括以下中的任一种：急性淋巴细胞癌，急性髓样白血病，肺泡横纹肌肉瘤，骨癌，脑癌，乳腺癌，肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌，眼癌，肝内胆管癌，关节癌，颈癌、胆囊癌或胸膜癌，鼻癌、鼻腔癌或中耳癌，口腔癌，外阴癌，慢性淋巴细胞性白血病，慢性髓样癌，结肠癌，食道癌，子宫颈癌，胃肠道类癌肿瘤，霍奇金淋巴瘤，下咽癌，肾癌，喉癌，肝癌，肺癌，恶性间皮瘤，黑色素瘤，多发性骨髓瘤，鼻咽癌，非霍奇金淋巴瘤，卵巢癌，胰腺癌，腹膜癌、大网膜癌和肠系膜癌，咽癌，前列腺癌，直肠癌，肾癌(如，肾细胞癌(RCC))，小肠癌，软组织癌，胃癌，睾丸癌，甲状腺癌，输尿管癌和尿膀胱癌。

为了本文的目的，“病毒性病症”意指可以由人传播给人或由生物体传播给生物体并且是由病毒引起的病症。在本发明的一个实施方案中，病毒性病症由选自以下的病毒导致：疱疹病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、冠状病毒、正粘病毒、副粘病毒、黄病毒和杯状病毒。例如，病毒性病症可以由选自以下的病毒导致：呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒、单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、水痘病毒、巨细胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类T-嗜淋巴细胞病毒、杯状病毒、腺病毒和沙粒病毒。

病毒性病症可以例如是流感、肺炎、疱疹、肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、慢性疲劳综合征、突发性急性呼吸综合征(SARS)、肠胃炎、肠炎、心脏炎、脑炎、细支气管炎、呼吸道乳头状瘤病、脑膜炎、HIV/AIDS和单核细胞增多症。

在本发明的一个实施方案中，所述方法包括修饰人T细胞以表达mTCR。可以分离或纯化T细胞。如本文所用，术语“分离的”意指已经从其自然环境中移出。如本文所用，术语“纯化的”意指纯度已经提高，其中“纯度”是相对术语，并且不一定解释为绝对纯度。“纯化的”T细胞是指已与其他天然组分(诸如组织、细胞、蛋白质、核酸等)分离的T细胞。

T细胞可以是任何T细胞，诸如培养的T细胞，如原代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞，如Jurkat、SupT1等，或获自非小鼠哺乳动物的T细胞。如果从非小鼠哺乳动物获得，则T细胞可以从许多来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺、脾脏或其他组织或体液。细胞也可以被富集或纯化。优选地，T细胞是人T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞，并且可以处于任何发育阶段，包括但不限于CD4⁺/CD8⁺双重阳性T细胞，CD4⁺辅助T细胞，如Th₁和Th₂细胞，CD4⁺T细胞，CD8⁺T细胞(如细胞毒性T细胞)，外周血单核细胞(PBMC)，外周血白细胞(PBL)，肿瘤浸润细胞(TIL)，记忆T细胞，天然T细胞等。

所述方法可包括使用任何适用于将mTCR或编码mTCR的核酸引入至人T细胞中以及获得人T细胞对mTCR的表达的技术来修饰人T细胞以表达mTCR。此类技术描述于例如Green和Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,NY(2012)中。可用于修饰人T细胞以表达TCR的技术的实例包括但不限于转染、转化、转导、电穿孔和基因编辑技术。在本发明的一个实施方案中，使用转座子、慢病毒载体或逆转录病毒载体修饰人T细胞。转座子的实例包括但不限于睡美人转座子系统(SBTS)(可获自Intrexon(Germantown,MD)和Ziopharm(Boston,MA))，PIGGYBAC转座子系统(可获自Transposagen,Lexington,KY)和Tol2转座子系统。基因编辑技术的实例可包括成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统(Cheng等人,Cell Res.,23:1163-71(2013))、兆核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物基核酸酶(TALEN)。

所述方法还可以包括产生包含多个表达mTCR的人T细胞和多个不表达mTCR的人T细胞的细胞群。修饰人T细胞以表达mTCR可以以可变的效率进行。因此，修饰人T细胞以表达mTCR可产生混合的细胞群，其包括表达mTCR的细胞以及不表达mTCR的细胞。

所述方法还可以包括在(i)经辐照的饲养细胞、(ii)一种或多种细胞因子和(iii)抗体或其抗原结合部分的存在下培养细胞群，其中所述抗体特异性地结合至mTCR的鼠恒定区，从而选择性地扩增表达mTCR的T细胞数超过不表达mTCR的T细胞数(在本文中也称为“选择性扩增”)。

经辐照的饲养细胞可包括适用于扩增T细胞数的任何经辐照的饲养细胞。在本发明的实施方案中，经辐照的饲养细胞包括(i)经辐照的同种异体饲养细胞；(ii)经辐照的自体饲养细胞；或(ii)(i)和(ii)两者。所采用的经辐照的饲养细胞的数目不受限制并且可由技术人员根据多种因素选择，诸如例如待获得的细胞的应用和所需数目。例如，多个2x 10⁷个经辐照的饲养细胞可用于在小规模调研研究中的扩增。多个1x 10⁸个经辐照的饲养细胞可以用于中等规模扩增。约2至约30倍的5x 10⁸个经辐照的饲养细胞可用于大规模扩增(如，临床产生)(通常高达约1.5x 10¹⁰)。例如，该方法可采用约1x 10⁹至约4x 10⁹个同种异体饲养细胞和/或自体饲养细胞、优选约2x 10⁹至约3x 10⁹个同种异体饲养细胞和/或自体饲养细胞。

一种或多种细胞因子可以包括适用于扩增T细胞数目的任何一种或多种细胞因子。在本发明的实施方案中，一种或多种细胞因子包括白介素(IL)-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21中的任一种或多种。

所述方法还可包括在抗体或其抗原结合部分的存在下培养细胞群，其中抗体特异性结合至mTCR的鼠恒定区。抗体可以是本领域已知的任何类型的免疫球蛋白。例如，抗体可以是重组抗体。抗体可以是任何同种型的，如IgA、IgD、IgE、IgG(如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgM等。抗体可以是单克隆的或多克隆的。抗体可以是天然存在的抗体，如从哺乳动物如兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等分离和/或纯化的抗体。可替代地，该抗体可以是遗传工程化的抗体，如，人源化抗体或嵌合抗体。抗体可以是单体形式或聚合形式。此外，该抗体或其抗原结合片段对mTCR的鼠恒定区可以具有任何水平的亲和力或亲合力。

在本发明的一个实施方案中，抗体包含两条多肽链(重链和轻链)，其每条包含含抗体的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3的可变区。抗体可包含重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。在本发明的一个实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区。

抗体的抗原结合部分可以是具有至少一个抗原结合位点的任何部分。在本发明的一个实施方案中，抗原结合部分可包含抗体的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。在本发明的另一个实施方案中，抗原结合部分可包含抗体的重链可变区和轻链可变区。抗体的抗原结合部分可以是Fab片段(Fab)、F(ab’)2片段、Fab’片段、Fv片段、单链可变区片段(scFv)、二硫键稳定的可变区片段(dsFv)、scFv2CH3、scFv4、scFv3、scFv2、scFv-Fc或(scFv)2。可以使用常规重组DNA工艺技术来生成单链可变区片段(scFv)，其是包含经由合成肽连接至抗体轻链的V结构域的抗体重链的可变(V)结构域的融合蛋白。类似地，二硫键-稳定的可变区片段(dsFv)可通过重组DNA技术制备。然而，抗体的抗原结合部分不限于这些示例性类型的抗原结合部分。除非另外指定，否则抗体及其抗原结合部分在下文中被统称为“抗体”。

抗体可以是特异性结合至mTCR的鼠恒定区的任何抗体。在本发明的一个实施方案中，抗体特异性结合至mTCR的鼠恒定区并不结合至人TCR的任何部分，如人TCR恒定区或人TCR复合物的任何部分。TCR复合物包含具有三个二聚体信号传导链的TCRα和β链：CD3δ/ε、CD3γ/ε和CD247ζ/ζ或ζ/η。CD3δ/ε和CD3γ/ε链被统称为CD3复合物。

抗体可以特异性结合至mTCR的α链的鼠恒定区或mTCR的β链的鼠恒定区。在一个优选的实施方案中，抗体特异性结合至mTCR的β链的鼠恒定区。抗体特异性结合的mTCRβ链的鼠恒定区可包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:1的氨基酸序列(mTCRβ链的全长鼠恒定区的氨基酸序列)。抗体可特异性结合至mTCRβ链的鼠恒定区的任何部分。例如，抗体可特异性结合至SEQ ID NO:2的氨基酸序列(mTCRβ链的全长鼠恒定区的示例性最小表位的氨基酸序列)。在本发明的一个实施方案中，抗体特异性结合至SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸残基D2、R4、N5、T7、E101、D103、K104、W105、P106、E107、G108、S109和P110。

特异性结合至mTCR的鼠恒定区的抗体可商购获得。例如，特异性结合至mTCR的β链的鼠恒定区的抗体是H57抗体(也称为H57-597)(可获自Biolegend,San Diego,CA)。H57是美国仓鼠IgG抗体并且描述于例如Kubo等人,J.Immunol.,142(8):2736-42(1989)和Grégoire等人,PNAS,88:8077-81(1991)中。H57抗体的表位描述于例如Wang等人,EMBO J.,17(1):10-26(1998)中。H57抗体特异性结合至SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸残基D2、R4、N5、T7、E102、D104、K105、W106、P107、E108、G109、S110和P111。

在本发明的一个实施方案中，抗体包含重链可变区和轻链可变区。例如，抗体(Ab)可包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H57 Ab重链的可变区)或SEQ ID NO:4的氨基酸序列(H57 Ab轻链的可变区)或SEQ ID NO:3和4的氨基酸序列两者。优选地，抗体包含SEQ ID NO:3和4两者的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:3的H57 Ab重链的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3，和SEQ ID NO:4的H57 Ab轻链的CDR1、CDR2和CDR3。

在本发明的一个实施方案中，抗体包含含上述的可变区的重链和轻链。例如，抗体可包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:5的氨基酸序列(H57 Ab重链)或SEQ ID NO:6的氨基酸序列(H57 Ab轻链)，或SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列两者。优选地，抗体包含SEQ ID NO:5和6两者的氨基酸序列。

如本文所述，在(i)经辐照的饲养细胞、(ii)一种或多种细胞因子和(iii)抗体的存在下培养细胞群有利地选择性扩增表达mTCR的T细胞的数目超过不表达mTCR的T细胞的数目。在这方面，与不采用特异性结合至TCR的鼠恒定区的抗体的扩增细胞数目的方法相比，本发明的方法可以有利地提供具有更大比例表达mTCR的细胞的细胞群。在本发明的一个实施方案中，该方法将表达mTCR的T细胞的数目增加约5-倍或更小至约4,000-倍或更大。例如，本发明的方法可将mTCR-表达细胞的数目增加约5倍至约4,000倍、约100倍至约3,500倍、约1,000倍至约3,000倍、约1,500倍至约2,500倍、约10倍至约1,000倍、约50倍至约850倍、约100倍至约900倍、约150倍至约850倍、约200倍至约800倍、约250倍至约750倍、约300倍至约700倍、约350倍至约650倍、或约400倍至约600倍。例如，本发明的方法可将mTCR-表达细胞的数目增加约10倍、约50倍、约100倍、约150倍、约200倍、约250倍、约300倍、约350倍、约400倍、约450倍、约500倍、约550倍、约600倍、约650倍、约700倍、约750倍、约800倍、约850倍、约900倍、约950倍、约1,000倍或任何两个前述值的范围。前述倍数扩增可以经约10至约14天、优选约14天的时间段内实现。前述的倍数扩增可以在约10至约14天、优选约14天的时间段内实现。通过本发明的方法实现的倍数扩增可以是高度可变的并且可以是供体依赖性的。

在本发明的一个实施方案中，所述方法产生了选择扩增的细胞群，其中选择扩增的群体中约10％至约95％的细胞表达包含鼠恒定区的TCR。在这方面，该方法可产生选择性扩增的细胞群，其中在所述选择性扩增的群中约10％至约95％、约15％至约90％、约20％至约85％、约25％至约80％、约30％至约75％、约35％至约70％、或约40％至约65％的细胞表达mTCR。该方法可产生选择性扩增的细胞群，其中在所述选择性扩增的群体中约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或任何两个前述值范围内的细胞表达mTCR。

本发明的方法可以有利地产生可适用于多种应用中的任一种的任何数量的mTCR-表达T细胞。在本发明的一个实施方案中，该方法可产生约1x 10⁶至约1x 10¹¹或更多个表达mTCR的T细胞。例如，在小容器(如，T25烧瓶)中，本发明的方法可产生约1x 10⁶至约1x 10⁷个表达mTCR的T细胞。在较大的容器(如，T175烧瓶)中，本发明的方法可产生约5x10⁶至约3x10⁷个表达mTCR的T细胞。在其他容器(如GREX烧瓶，可获自Wilson Wolf Manufacturing,New Brighton,MN)中，本发明的方法可产生约1x 10⁹至约1x 10¹⁰个表达mTCR的T细胞。表达mTCR的约1x10⁶至约1x 10¹⁰个T细胞的群体可用于小规模筛选实验。表达mTCR的较大数目的细胞，如约1.5x 10¹⁰或更多个还可使用本发明的方法获得，如用于临床应用。由本发明的方法产生的mTCR-表达T细胞的数目可高度可变并且可以是供体-依赖性的。

该方法可以包括进行不超过单轮的选择性扩增mTCR-表达细胞的数目或多轮的选择性扩增mTCR-表达细胞的数目。在本发明的一个实施方案中，该方法包括进行如本文关于本发明的其他方面所述的一轮或多轮选择性扩增，然后进行细胞数目的一轮或多轮非选择性扩增。在这方面，该方法还可包括在(i)经辐照的同种异体饲养细胞和经辐照的自体饲养细胞中的一种或两种，(ii)一种或多种细胞因子，和(iii)特异性结合至人CD3复合物的抗体或其抗原结合部分(在本文中也称为“非选择性扩增”)的存在下培养人T细胞。T细胞的数目的扩增可通过多种方法中任一种实现，如例如以下中所述：美国专利8,034,334；美国专利8,383,099；美国专利申请公开号2012/0244133；Dudley等人,J.Immunother.,26:332-42(2003)；和Riddell等人,J.Immunol.Methods,128:189-201(1990)。例如，可以使用在饲养淋巴细胞和白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)的存在下特异性结合至人CD3复合物的抗体或其抗原结合部分，非选择性扩增T细胞的数目，其中IL-2是优选的。特异性结合至人CD3复合物的抗体的实例是OKT3(可获自Ortho-McNeil,Raritan,N.J.)。

多轮选择性扩增，或一轮或多轮选择性扩增然后是一轮或多轮非选择性扩增可将mTCR的数目增加约100,000-倍或更多。在本发明的一个实施方案中，该方法产生细胞群，其中群体中的约20％至约99％的细胞表达包含鼠恒定区的TCR。多轮选择性扩增，或一轮或多轮选择性扩增然后是一轮或多轮非选择性扩增可产生细胞群，其中群体中约25％至约95％、约30％至约90％、约35％至约85％、约40％至约80％、约45％至约75％、或约50％至约70％的细胞表达mTCR。该方法可产生细胞群，其中群体中约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或任何两个前述值范围内的细胞表达mTCR。

在本发明的一个实施方案中，该方法还包括使用特异性结合至TCR的鼠恒定区的抗体或其抗原结合部分将表达TCR的T细胞与不表达TCR的T细胞分离。在这方面，该方法可以包括使包含表达mTCR的细胞和不表达mTCR的细胞的混合细胞群与抗体物理接触，使得抗体特异性结合至TCR的鼠恒定区。抗体可以附接至支持物，如珠粒。该方法还可以包括洗涤抗体和细胞，使得从表达mTCR的细胞中去除全部或部分不表达mTCR的细胞。该方法可以进一步包括从抗体洗脱mTCR-表达细胞。用于分离T细胞的技术的实例描述于例如Deniger等人,Mol.Ther.,24(6):1078-89(2016)和Field等人,PLoS One,8(6):e68201(2013)中。

本发明的方法可以有利地提供富集表达mTCR的细胞的细胞群。因此，本发明的一个实施方案提供了细胞群，其包含通过本文所述的任何方法制备的选择性扩增数目的T细胞。细胞群可以是异源群，其包含mTCR-表达细胞连同至少一种其他细胞，如不表达mTCR的T细胞，或除T细胞以外的细胞，如B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞、脑细胞等。可替代地，细胞群可以是基本上均质的群体，其中该群体主要包括mTCR-表达T细胞(如，基本上由mTCR-表达T细胞组成)。该群体也可以是克隆细胞群，其中该群体的所有细胞都是表达mTCR的单个T细胞的克隆，使得该群体的所有细胞都表达mTCR。在本发明的一个实施方案中，细胞群是包含表达mTCR的T细胞的克隆群体。

可以分离和/或纯化本发明的细胞群。如本文所用，术语"分离的"意指已经从其自然环境中移除。如本文所用，术语"纯化的"意指纯度已经提高，其中"纯度"是相对术语，并且不一定解释为绝对纯度。例如，纯度可以为至少约50％，可以大于约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或可以为约100％。

可以将本发明的细胞群配制成组合物，诸如药物组合物。在这方面，本发明提供了包含本文所述的任何细胞群和药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的药物组合物可以包含本发明的任何细胞群与另一种或多种药学活性剂或药物(诸如化疗剂，如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等)的组合。

优选地，载体是药学上可接受的载体。关于药物组合物，载体可以是常规用于T细胞的那些载体中的任一种。用于制备可施用组合物的方法是本领域技术人员已知的或显而易见的，并且在例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版,Pharmaceutical Press(2012)中有更详细的描述。优选的是，在使用条件下，药学上可接受的载体是不具有有害的副作用或毒性的药学上可接受的载体。

载体的选择可以通过用于施用本发明细胞群的特定方法来确定。因此，存在本发明的药物组合物的多种适合的制剂。适合的制剂可以包括用于肠胃外、皮下、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、肿瘤内或腹膜内施用的那些中的任一种。可以使用一种以上的途径来施用本发明的细胞群，并且在某些情况下，特定的途径可以提供比另一种途径更直接和更有效的响应。

优选地，本发明的细胞群通过注射例如静脉内施用。注射用细胞的药学上可接受的载体可以包括任何等渗载体，诸如例如生理盐水(约0.90％w/v的NaCl水溶液，约300mOsm/L NaCl水溶液或约9.0g NaCl/升水)、NORMOSOL R电解质溶液(Abbott,Chicago,IL)、PLASMA-LYTE A(Baxter,Deerfield,IL)、约5％葡萄糖水溶液或林格氏乳酸。在一个实施方案中，药学上可接受的载体补充有人血清蛋白。用于输注的药物组合物可以或可以不含有IL-2。如果药物组合物含有IL-2，则可使用约300IU/mL的浓度。

为了本发明的目的，施用的量或剂量(如细胞数)应足以在合理的时间范围内在哺乳动物中实现如治疗或预防响应。例如，剂量(如，细胞数)应足以结合至病症相关的抗原，或从施用时间起在约2小时或更长(如12小时)至24或更长小时的时间段内检测、治疗或预防病症。在某些实施方案中，时间段可以甚至更长。剂量将由细胞群的功效和哺乳动物(如人)的状况以及待治疗的哺乳动物(如人)的体重来确定。

用于确定施用剂量的许多测定是本领域已知的。为了本发明的目的，测定可用于确定待施用给哺乳动物的起始剂量，所述测定包括将给定剂量的T细胞给予一组哺乳动物(其中每一只给予不同剂量的T细胞)中的哺乳动物之后，比较靶细胞裂解或由表达mTCR的此类T细胞分泌IFN-γ的程度。施用一定剂量后，靶细胞裂解或IFN-γ分泌的程度可以通过本领域已知的方法进行测定。

本发明细胞群的剂量也将由特定细胞群的施用可能伴随的任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。通常，主治医师将通过考虑各种因素来决定治疗每位个体患者的细胞群的剂量，诸如年龄、体重、总体健康、饮食、性别、待施用的本发明的细胞群、施用途径和所治疗的疾患的严重程度。在一个实施方案中，每次输注所施用的细胞数可变化，如，从约1x 10⁶至约1x 10¹²个细胞或更大。在某些实施方案中，可以施用至少约1.5x 10¹⁰个细胞。

由本发明的方法产生的细胞群可用于治疗或预防病症，如癌症。因此，本发明的另一个实施方案提供了治疗或预防哺乳动物中病症的方法，该方法包括根据本文就本发明的其他方面描述的任何方法选择性扩增T细胞数，并以有效治疗或预防哺乳动物中的病症的量向哺乳动物施用选择性扩增数目的T细胞。

为了本发明的方法的目的，其中施用细胞群，细胞可以是哺乳动物同种异体或自体的细胞。优选地，细胞是哺乳动物自体的。

在本发明的一个实施方案中，病症是癌症。癌症可以是就本发明的其他方面而言本文所述的任何癌症。

在本发明的一个实施方案中，病症是病毒性病症。病毒性病症可以是本文就本发明的其他方面所述的任何病毒病症。

如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目哺乳动物，诸如小鼠和仓鼠，以及兔形目哺乳动物，诸如兔。优选地，哺乳动物来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。更优选地，哺乳动物来自偶蹄目，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)，或属于奇蹄目，包括马科动物(马)。最优选地，哺乳动物属于灵长目、类猴目(Ceboids)或类猿目(猴)或属于类人猿目(人类和猿类)。特别优选的哺乳动物是人类。

如本文所用，术语“治疗”和“预防”以及由此衍生的词不一定意味着100％或完全的治疗或预防。而是，存在不同程度的治疗或预防，本领域普通技术人员认识到其具有潜在的益处或治疗效果。在这方面，本发明的方法可以在哺乳动物中提供任何数量的任何水平的癌症治疗或预防。此外，通过本发明的方法提供的治疗或预防可以包括治疗或预防一种或多种正在治疗或预防的病症或病症症状，如癌症。例如，通过本发明的方法提供的治疗或预防可以包括促进肿瘤的消退。同样，出于本文的目的，“预防”可以涵盖延迟病症或其症状或疾患的发作。

以下实施例进一步说明了本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。

实施例1

该实施例表明，选择性扩增表达包含鼠恒定区(mTCR)的TCR的T细胞的数量增加表达mTCR的细胞的数量。

编码两种TCR的RNA(一种对癌症-特异性、经突变的ERBB2新抗原具有抗原特异性，并且另一种对癌症特异性、经突变的ERBB2IP新抗原具有抗原特异性)从自癌症患者分离的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)分离。通过逆转录从RNA扩增cDNA，然后通过PCR扩增cDNA拷贝。如Deniger等人,Mol.Ther.,24(6):1078-89(2016)中所述制备mTCR构建体(用于每一TCR一种)。简而言之，将人TCR-α-V-J区融合至小鼠TCR-α恒定链，并且将人TCR-β-V-D-J区融合至小鼠TCR-β恒定链，其中合成接头序列位于阿尔法(α)和贝塔(β)链之间(图1A)。两种mTCR构建体均已合成并克隆至睡美人转座子系统(SBTS))质粒(可从Intrexon(Germantown,MD)和Ziopharm(Boston,MA)获得)中，并描述于Deniger等人,PLoS One,10(6):e0128151(2015)和Singh等人,Cancer Res.,71(10):3516-27(2011)中。

示例了根据本发明的一个实施方案用mTCR对外周血单核细胞(PBMC)进行电穿孔和选择性扩增mTCR⁺T细胞的数目的方法的示意图显示于图1B中。如图1B所示，使用AMAXANUCLEOFECTOR II设备和试剂盒(Lonza,Basel,Switzerland)，将编码两种mTCR中的每一个的SBTS质粒和编码转座酶的SBTS质粒(5μg)分别电穿孔至自体PBMC(2x10⁷)中。24小时后，获得包含表达mTCR的细胞和不表达mTCR的细胞的混合的经电穿孔的细胞群。

如图1B所示，选择性地扩增在混合群体中表达鼠TCR恒定区的T细胞(mTCR⁺T细胞)的数目。为了选择性扩增mTCR⁺T细胞，在存在(i)H57抗体(Ab)(Biolegend,San Diego,CA)或OKT3抗体、(ii)IL-2和(iii)IL-21的情况下，将来自混合的经电穿孔的细胞群(2x 10⁶)与经辐照的外周血淋巴细胞(PBL)(2x 10⁷)共培养。

选择性扩增mTCR⁺T细胞的数目后，将细胞用(i)抗-CD3 Ab、抗-CD4 Ab或抗-CD8Ab和(ii)抗-mTCRβ抗体(H57)染色。仅用电穿孔缓冲液电穿孔的PBMC(模拟物)(无TCR)用作阴性对照。

通过荧光激活细胞分选术(FACS)对染色的细胞计数。结果示于图2中。如图2所示，与OKT3相比，用H57 Ab进行的选择性扩增增加了抗-突变的ERBB2 mTCR⁺T细胞的数目和抗-突变的ERBB2IP mTCR⁺T细胞的数目。

实施例2

该实施例表明，用更高浓度的H57 Ab获得更高数目的mTCR⁺。

用实施例1所述的抗ERBB2IP mTCR或抗-ERBB2 mTCR构建体电穿孔PBMC。如实施例1所述，用各种浓度的H57 Ab(0ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL或500ng/mL)选择性扩增混合的群体中表达鼠TCR恒定区的T细胞(mTCR⁺T细胞)的数目。

在mTCR⁺T细胞的数目的选择性扩增之后，将细胞用(i)抗-CD3 Ab、抗-CD4 Ab或抗-CD8 Ab和(ii)抗-mTCRβ抗体(H57)染色。仅用电穿孔缓冲液电穿孔的PBMC(模拟物)(无TCR)用作阴性对照。经历用OKT3 Ab(30ng/mL)进行的标准REP而不是用H57 Ab进行的选择性扩增的电穿孔的细胞用作非特异性T细胞生长的阳性对照。

通过FACS对染色的细胞计数。结果显示在图3A和3B中。如图3A和3B中所示，以更高浓度的H57Ab获得了更高数量的抗-突变的ERBB2mTCR⁺和抗-突变的ERBB2IP mTCR⁺细胞。

实施例3

该实施例表明选择性扩增表达mTCR的T细胞的数目的方法。

编码对癌症-特异性p53-Y220C新抗原具有抗原特异性的TCR的RNA从分离自卵巢癌症患者4149的肿瘤浸润淋巴细胞中分离出来。通过逆转录从RNA中扩增cDNA，然后进行cDNA拷贝的PCR扩增。mTCR构建体通过融合人TCR-α-V-J区至小鼠TCR-α恒定链以及融合人TCR-β-V-D-J区至小鼠TCR-β恒定链来制备，其中合成接头序列位于α和β链之间(图4B)。将mTCR构建体合成并克隆至SBTS质粒中。

示例根据本发明的一个实施方案用mTCR对PBMC进行电穿孔和选择性扩增mTCR⁺T细胞的数目的方法的示意图示于图4A中。如图4A所示，自体PBMC获自患者并被冷冻保存。将冷冻保存的PBMC(200g)在20-23℃下解冻10分钟。将PBMC置于50/50培养基(3x 10⁶个细胞/mL)中，并在37℃下培养2小时。使用AMAXA NUCLEOFECTOR II设备和试剂盒(Lonza,Basel,Switzerland)将编码mTCR的SBTS质粒和编码转座酶的SBTS质粒电穿孔至自体PBMC中。人T细胞NUCLEOFECTOR溶液(300μL)含有编码mTCR的SBTS质粒(45μg)和编码转座酶的SBTS质粒(15μg)。将该人T细胞NUCLEOFECTOR溶液添加至比色皿(每个比色皿100μL)。将电穿孔的细胞在37℃下在孔(5mL 50/50培养基/孔)中培养过夜。大于18小时后，将50U/mL广谱核酸酶(benzonase)在37℃下孵育1小时。获得了包含表达mTCR的细胞和不表达mTCR的细胞的经混合的电穿孔的细胞群。

如图4A所示，在37℃下培养18个小时以上后，选择性扩增混合群中表达鼠TCR恒定区的T细胞(mTCR⁺T细胞)的数目。为了选择性扩增mTCR⁺T细胞，在H57 Ab(Biolegend,SanDiego,CA)(250ng/mL)、IL-2(50IU/mL)和IL-21(30ng/mL)存在的情况下，将mTCR⁺T细胞(5x10⁵)与经辐照的外周血淋巴细胞(PBL)(1x 10⁸)共培养。

在选择性扩增mTCR⁺T细胞的数目之后，使用标准快速扩增方案(REP)进一步扩增mTCR⁺T细胞的数目(参见实施例5)。在标准REP中，将选择性扩增的mTCR⁺T细胞(5x 10⁶)与经辐照的PBL(5x 10⁸)、OKT3抗体(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)共培养。OKT3抗体与人CD3复合物内ε-亚基上的表位反应。

比较实施例1

该实施例证实了在不存在选择性扩增的情况下表达mTCR的电穿孔的细胞的数目。

如实施例4中所述，用编码mTCR的SBTS质粒和编码转座酶的SBTS质粒对自体PBMC进行电穿孔。阴性对照包括未转染的自体PBMC和仅用电穿孔缓冲液(模拟物)电穿孔的PBMC。电穿孔的细胞用抗-CD3抗体和抗-mTCRβ抗体(H57)染色。未染色、未转染的自体PBMC用作仍然另一阴性对照。

在电穿孔后的第二天，通过FACS对染色的细胞进行计数，而不如实施例4所述进行选择性扩增。将FACS在淋巴细胞/PI^(neg)细胞上设门。PI是死细胞的染色。PI^(neg)细胞是活细胞。

结果示于图5A-5D中。如图5A-5D所示，在电穿孔而没有经历选择性扩增后，总群体中适度数量的细胞(约占总细胞的5％)表达了mTCR，。

实施例4

该实施例证实了用H57抗体选择性扩增电穿孔的T细胞选择性地增加了混合群体中表达包含鼠恒定区的TCR的细胞的数目。

如实施例3所述，用编码mTCR的SBTS质粒和编码转座酶的SBTS质粒对自体PBMC进行电穿孔。如实施例3所述，使用多种浓度的H57 Ab(250ng/mL、500ng/mL或750ng/mL)选择性扩增多种起始数目(1x 10⁵、5x 10⁵或10x 10⁵)的mTCR+T细胞。实验基于初始频率将输入归一化至5x 10⁵个mTCR+T细胞。例如，5％mTCR表达意指将1x 10⁷个总细胞进入扩增方案，以实现5x 10⁵个mTCR+T细胞。仅用电穿孔缓冲液(模拟物)电穿孔的PBMC用作阴性对照。经电穿孔的、选择性扩增的细胞用抗-CD3抗体和抗-mTCRβ抗体(H57)染色。

通过FACS对染色的细胞计数。将FACS在淋巴细胞/PI^(neg)细胞上设门。结果示于图6和表1-2中。如图6和表1-2所示，用H57 Ab进行的选择性扩增增加了群体中mTCR⁺T细胞的数目。

表1

表2

实施例5

该实施例表明，在用H57 Ab进行第一次扩增后，用OKT3 Ab进行第二次扩增进一步增加了mTCR⁺细胞的数目。

如实施例4所述的，将已经(i)在初始数目为5x 10⁵个mTCR+T细胞下使用(ii)250ng/mL H57 Ab进行了选择性扩增(在该实施例中称为“第一次扩增”)的电穿孔的细胞使用(i)如实施例3所述的用OKT3 Ab进行的标准REP或(ii)如实施例4所述的H57 Ab，在GREX烧瓶(Wilson Wolf Manufacturing,St Paul,MN)中进一步扩增(在该实施例中称为“第二次扩增”)。

第二次扩增后，将细胞用抗-CD3抗体和抗-mTCRβ抗体(H57)染色。通过FACS对染色的细胞进行计数。将FACS在淋巴细胞/PI(neg)细胞上设门。结果示于图7中。

如图7所示，在使用H57 Ab进行第一次扩增后，使用OKT3 Ab进行第二次扩增进一步增加了mTCR+细胞的数目。与使用H57 Ab进行的第二次扩增相比，使用OKT3 Ab进行的第二次扩增在更大程度上增加了mTCR+细胞的数目。

还在经历用OKT3 Ab和H57 Ab进行的第二次扩增的细胞中测量了活细胞的百分比、细胞总数、通过第二次扩增实现的细胞数目的倍数变化、mTCR+细胞的数目以及通过第二次扩增实现的mTCR+细胞的倍数变化，并进行比较。结果示于表3中。如表3所示，在用H57Ab进行第一次扩增后，用OKT3 Ab进行第二次扩增进一步增加了mTCR⁺细胞的数目。与使用H57 Ab进行的第二次扩增相比，使用OKT3 Ab进行的第二次扩增在更大程度上增加了mTCR⁺细胞的数目。

表3

实施例6

该实施例表明了选择性扩增表达mTCR的T细胞的数目增加了表达mTCR的细胞的数目。

在第0天使用标准方法，用编码鼠F5(mF5)抗-MART-1TCR的γ-逆转录病毒载体转导PBL。在第10天，制备经转导的细胞用于第二次扩增。使用以下方法进行扩增：(i)改变浓度的IL-2，(ii)改变比率的饲养细胞和(iii)OKT3 Ab(30ng/ml)或H57 Ab(50ng/ml)，如表4中所示。

表4

图8A-8B中的FACS图显示了在用OKT3 Ab或H57 Ab扩增前(快速扩增方案(REP)前)表达CD8和鼠F5(mF5)抗-MART-1TCR的未转导和转导细胞的百分比。扩增前的转导效率为83.9％。在扩增之前，将该转导的群体在细胞培养基中稀释至约5％鼠TCRβ链阳性(mTCRb+)细胞(图8C)。

用(i)OKT3(50ng/ml)或H57(50ng/ml)于(ii)500或50CU/IL-2中对图8C的5％mTCRb+起始群体中细胞数目进行扩增之后的结果显示于图9和10A-10B中。细胞数目在OKT3的情况下扩增约1500–2300-倍但不显示mTCRb+细胞群中的细胞的数目的选择性扩增。可替代地，细胞数目在H57的情况下扩增更少(500-800-倍)，然而，它们显示出mTCRb+细胞的百分比增加4-8倍。总之，在扩增中使用H57产生更多的mTCRb+细胞。

实施例7

该实施例证实了选择性扩增表达mTCR的T细胞的数目增加了表达mTCR的细胞的数目。

如实施例6所述，用编码鼠F5 TCR的逆转录病毒载体转导PBL。在用H57或OKT3扩增(起始细胞群)之前，经转导的细胞对CD8和mTCRb的表达示于图11A-11C中。起始的mTCR+群体最初具有64.7％mTCRb+细胞(图11B)。将起始mTCR+群体稀释四倍至14％mTCRb+(图11C)。

使用(ii)OKT3 Ab或H57 Ab在(i)没有IL-2、50CU IL-2或500CU IL-2的情况下扩增转导和UT细胞的数量。结果示于图12A-12E和13A-13B中。

扩增后，OKT3群体并未显示出整个mTCRb+细胞群的选择性扩增，CD8+和CD8-转化的细胞的百分比大致相等(5％)。相比之下，两个H57扩增群(分别为500或50CU/IL-2)都显示出选择性mTCRb+扩增，分别为31.2％和59.1％。与在500CU/IL-2中生长的细胞相比，使用50CU/IL-2进行H57扩增显示了mTCRb+细胞扩增增加了近2倍。

如图13-13B所示，在500CU/IL-2的存在下，用OKT3或H57扩增的细胞数量扩增了约1400-1600倍。然而，H57扩增加50CU/IL-2扩增了约3500-倍，是其他测试条件的两倍以上。

实施例8

该实施例证实了选择性扩增表达mTCR的T细胞的数目增加了表达mTCR的细胞的数目。

如实施例6所述，用编码鼠F5 TCR的逆转录病毒载体转导PBL。在用H57或OKT3(前-REP)扩增之前，由转导的细胞对CD8和mTCRb的表达示于图14A-14F中。

使用(i)50CU IL-2和(ii)OKT3 Ab(30ng/ml)或H57 Ab(500、50、10、5ng/ml)扩增转导的细胞的数目。结果示于图14A-14F和图15中。如图14A-14F和图15所示，可以将H57抗体的浓度向低滴定10倍，而对选择性mTCRb+扩增没有任何不利影响。同样，所有测试组之间的总扩增倍数相似。还观察到用H57扩增后CD8-细胞的优先扩增。

实施例9

该实施例证明了用OKT3或H57进行的第二轮扩增的对经历实施例8中第一轮H57扩增的细胞的数目的进一步扩增。

使经历实施例8中用H57 Ab进行的扩增的mTCR-转导的细胞经受用OKT3或H57进行的第二次扩增，以确定是否可以实现进一步富集mTCRb+细胞。扩增条件与实施例8中所述的那些相同。

结果示于图16A-16E和图17中。用OKT3进行的第二次扩增并未进一步富集mTCRb+细胞，但细胞数量确实另外扩增了1000-倍。用H57进行的第二次扩增未增加mTCRb+细胞的任何另外富集，并且可导致500和50ng/ml下的mTCRb+细胞略有下降。经历了用H57进行的第二次扩增的群体的扩增倍数低，范围为200-500倍。

实施例10

该实施例证明了在电穿孔后的第二天由转座子表达突变-特异性TCR。

如图4A所示，从健康供体1和健康供体2获得自体PBMC并冷冻保存。将冷冻保存的PBMC解冻，并在20-23℃下旋转(200g)10分钟。将PBMC置于50/50培养基(3x 10⁶个细胞/mL)中，并在37℃下培养2小时。使用AMAXA NUCLEOFECTOR II设备和试剂盒(Lonza,Basel,Switzerland)将编码两种mTCR之一的SBTS质粒和编码转座酶的SBTS质粒电穿孔至自体PBMC中。这两种mTCR是(1)4149-HUWE1-TCR1(I类)和(2)4149-TP53-TCRa2b2(II类)。人T细胞NUCLEOFECTOR溶液(300μL)含有编码mTCR的SBTS质粒(45μg)和编码转座酶的SBTS质粒(15μg)。2小时的休息期后，通过在20-23℃下旋转(200g)10分钟来收集非贴壁PBMC，将培养基去除并用含SBTS质粒的人T细胞NUCLEOFECTOR溶液代替(每比色皿加入100μL)。将电穿孔的细胞在37℃下在孔(5mL 50/50培养基/孔)中培养过夜。>18小时后，将50U/mL广谱核酸酶在37℃下孵育1小时。获得了包含表达mTCR的细胞和不表达mTCR的细胞的混合的电穿孔的细胞群。

电穿孔后的第二天，用(i)抗-CD3 Ab和(ii)抗-mTCRβAb对电穿孔的细胞进行染色。未染色的PBMC、未转染的PBMC和仅用电穿孔缓冲液(模拟物)电穿孔的PBMC(无TCR)用作阴性对照。通过FACS(设门：淋巴细胞\活(PI-))测量电穿孔的细胞对CD3和mTCR的表达。结果显示于图18中。如图18所示，在电穿孔后的第二天，由转座子表达突变-特异性TCR。

实施例11

该实施例证实了用H57进行一轮扩增导致mTCR+T细胞数目的选择性过度生长。

如实施例10所述将来自供体1和2的PBMC电穿孔。如图4A所示，在37℃下培养18小时以上后，选择性扩增混合群体中表达鼠TCR恒定区的T细胞(mTCR⁺T细胞)的数目。为了选择性地扩增mTCR⁺T细胞的数目，在H57 Ab(Maine Biotechnology Services,Portland,ME)(250ng/mL)、IL-2(50IU/mL)和IL-21(30ng/mL)的存在下，将mTCR⁺T细胞(5x 10⁵)与经辐照的PBL(1x 10⁸)共培养。

如实施例10中所述，将选择性扩增的细胞染色并通过FACS评价。未染色的PBMC(图19A)和仅用电穿孔缓冲液(模拟物)电穿孔的PBMC(无TCR)(图19B)用作阴性对照。结果示于图19A-19B中。在图19A-19B中，在用H57进行一轮扩增后的第14天从一个T175烧瓶中确定了细胞计数。如图19A-19B所示，用H57进行的一轮扩增导致mTCR+T细胞的数目的选择性过度生长。

实施例12

该实施例证实了在透气烧瓶中用OKT3的第二轮扩增对经历用H57的第一轮扩增的细胞的数目进行的的进一步扩增导致TCR-转座的T细胞的数目的大规模扩增。

如实施例10所述将来自供体1和2的PBMC电穿孔。如实施例11中所述，用H57抗体选择性地扩增转座细胞的数目。选择性扩增mTCR⁺T细胞的数目后，使用标准REP进一步扩增mTCR⁺T细胞的数目。在标准REP中，将选择性扩增的mTCR⁺T细胞(5x 10⁶)与经辐照的PBL(5x10⁸)、OKT3抗体(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)共培养。

如实施例10中所述，将选择性扩增的细胞染色并通过FACS评价。未染色的PBMC(图20A)和仅用电穿孔缓冲液电穿孔的PBMC(模拟物)(无TCR)(图20B)用作阴性对照。表5中显示了来自一个GREX-100透气烧瓶(Wilson Wolf Corporation,St.Paul,MN)的标准REP后第14天的细胞计数。用H57进行选择性扩增后第14天的mTCR+细胞的百分比示于表6中。

表5

表6

结果显示在图20A-20B中。如图20A-20B所示，在透气烧瓶中用第二轮OKT3扩增对经历第一轮H57扩增的细胞的数目进行的进一步扩增导致TCR-转座的T细胞的数目大规模扩增。

实施例13

该实施例证实了用H57抗体选择性扩增的TCR-转座的T细胞对同源突变的新抗原具有特异性。

如实施例10所述将来自供体1和2的PBMC电穿孔。如实施例11所述，用H57抗体选择性扩增电穿孔的细胞的数目。4149-HUWE1-TCR1识别经突变的HUWE1。4149-TP53-TCRa2b2识别经突变的TP53(Y220C)。

用野生型(WT)HUWE1肽、突变的HUWE1肽、WT TP53或突变的TP53脉冲未成熟的DC。HUWE1肽以1μg/mL脉冲。TP53肽以10ng/mL脉冲。将5x 10⁴个肽-脉冲的未成熟DC和10⁵个T细胞的共培养物在37℃下孵育过夜。单独培养的DC和用DMSO脉冲的DC用作对照。IFN-γ分泌通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测量。

结果示于图21A-21D中。如图21A-21D所示，用H57抗体选择性扩增的TCR-转座的T细胞识别同源突变的新抗原。

实施例14

该实施例证实了选择性扩增表达mTCR的T细胞的数目的方法。

示例了根据本发明的一种实施方案用mTCR电穿孔PBMC和选择性扩增mTCR⁺T细胞数目的方法的示意图示于图22中。如图22所示，自体PBMC从患者获得并冷冻保存。一些PBMC用LD柱耗竭了CD4+细胞。将冷冻保存的PBMC在完全培养基(CM)中解冻，并在约22℃下以175g旋转10分钟。将细胞在汉克氏平衡盐溶液(HBSS)中洗涤并计数。细胞计数为6x 10⁷。

如图22所示，使用AMAXA NUCLEOFECTOR II设备和试剂盒(Lonza,Basel,Switzerland)，将编码mTCR的SBTS质粒(4149-HUWE1-TCR1或4149-TP53-TCRa2b2)和编码转座酶的SBTS质粒电穿孔至自体PBMC中。人T细胞NUCLEOFECTOR溶液(300μL)含有编码mTCR的SBTS质粒(45μg)和编码转座酶的SBTS质粒(15μg)。将该人T细胞NUCLEOFECTOR溶液添加至细胞，然后将细胞和DNA的混合物添加至比色皿(100μL/比色皿)。

如图22所示，将电穿孔的细胞在孔(每孔CM(5mL)、IL-2(50IU/mL)和IL-21(30ng/mL))中在37℃下培养过夜。>18小时后，将50U/mL广谱核酸酶在37℃下孵育1小时。将细胞收获、染色并通过FACS测量mTCR表达。获得包含表达mTCR的细胞(mTCR+>1％)和不表达mTCR的细胞的混合的电穿孔的细胞群。

如图22所示，在37℃下培养18个小时以上后，选择性扩增混合群体中表达鼠TCR恒定区的T细胞(mTCR⁺T细胞)的数目。为了选择性扩增mTCR⁺T细胞，在H57 Ab(MaineBiotechnology Services,Portland,ME)(250ng/mL)、IL-2(50IU/mL)和IL-21(30ng/mL)的存在下，将电穿孔的细胞(5x 10⁶)与经辐照的PBL(1x 10⁸)共培养。

如图22所示，将细胞培养13天。在该13天时间段期间，每2-3天用50/50CM与IL-2(50IU/mL)和IL-21(30ng/mL)饲养细胞。

如图22所示，通过将mTCR+细胞与LS柱(Miltenyi Biotec)中缀合有抗-生物素抗体和生物素化的H57抗体的微珠(Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)接触，来进一步富集mTCR+细胞。

用H57-缀合的珠粒富集mTCR+细胞后，使用标准REP进一步扩增mTCR+T细胞的数目。在标准REP中，将选择性扩增的mTCR⁺T细胞(5x 10⁶)与经辐照的PBL(5x 10⁸)、OKT3抗体(30ng/mL)和IL-2(3000IU/mL)共培养。

所遵循的时间线如下：

第0天＝电穿孔(2x10⁷个总PBMC(TP53-TCR)或CD4-耗竭的PMBC(HUWE1-TCR))

第1天＝H57 REP(T175烧瓶；5x10⁶个细胞，1x10⁸个经辐照的PBMC，250ng/mL H57，50IU/mL IL-2，30ng/mL IL-21)

第14天＝H57珠粒富集(H57-生物素mAb(GMP),CliniMACS生物素珠粒，LS柱)

第15天＝OKT3 REP(GREX-100烧瓶；5e6个细胞，5e8个经辐照的PBMC，30ng/mLOKT3，3000IU/mL IL-2)

第28天＝收获，表型，共培养。

实施例15

该实施例证实了在实施例14所述的方法中在四个时间点获得的细胞总数和CD3+mTCR+细胞的百分比。

进行实施例14所述的方法。在实施例14所述的方法中的以下四个时间点测量一个比色皿中的细胞总数和一个比色皿中的CD3+mTCR+细胞百分比：电穿孔后，用H57进行选择性扩增后，用H57-缀合的珠富集后，以及用OKT3进行标准REP后。

电穿孔和H57-缀合的珠富集后，使细胞留下。未对计数进行调整以反映理论产量，而是反映实际产量。

结果显示在图23A(细胞总数)和图23B(CD3+mTCR+细胞百分比)中。

实施例16

该实施例证实了在实施例14所述的方法的第28天时(OKT3 REP后)测量的mTCRβ+细胞的百分比。

进行实施例14所述的方法。在第28天(OKT3 REP后)通过FACS测量mTCRβ+细胞的百分比。结果显示在图23C-23D中。图23C-23D中仅用电穿孔缓冲液电穿孔的PBMC(模拟物)(无TCR)用作阴性对照。

在第28天(OKT3 REP后)通过FACS测量CD4+mTCRβ+或CD8+mTCRβ+细胞的百分比。结果示于图23E中。

实施例17

该实施例证实了如实施例14所述的细胞数目扩增之前(第1天)和之后(第28天)的细胞的记忆细胞表型。

进行实施例14所述的方法。记忆表型标记的表达在细胞数目扩增之前(第1天)或之后(第28天)进行测量。结果显示于图24A-24D中。

实施例18

该实施例证实了在如实施例14所述扩增细胞数目之后T细胞的特异性。

进行实施例14所述的方法。用浓度为10、1或0.1μg/mL的WT HUWE1肽、经突变的HUWE1肽、WT TP53肽或经突变的TP53肽对未成熟的DC进行脉冲。将肽脉冲的未成熟DC和转座的T细胞的共培养物在37℃下孵育过夜。用DMSO脉冲的DC用作对照。通过ELISA测量IFN-γ分泌。结果示于图25A-25B中。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均以引用的方式在此并入，其程度如同每个参考文献均被单独地且具体地指示为通过引用并入并在本文中以其整体列出。

在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)术语“一个”和“一种”和“该”和“至少一种”以及类似指代的使用应被解释为涵盖了单数和复数形式两者，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。术语“至少一种”之后列出一项或多项(例如，“A和B中的至少一种”)应被理解为意指从所列各项(A或B)中选择的一项或所列各项(A和B)中两项或多项的任何组合，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非在本文中另外指出，否则本文中数值范围的叙述仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，就如同其在本文中被单独阐述一样。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何适合的顺序进行。除非另外要求保护，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于实施本发明必不可少。

本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于进行本发明的最佳模式。在阅读前述描述后，那些优选的实施方案的变型对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。本发明人期望熟练的技术人员适当地采用这样的变型，并且本发明人希望以不同于本文具体描述的方式来实施本发明。因此，本发明包括适用法律允许的对所附权利要求书中记载的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖在其所有可能的变型中的上述要素的任何组合。

序列表

<110> THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BY THE

SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES

<120> 用于选择性扩增表达具有鼠恒定区的TCR的细胞的方法

<130> 740358

<150> US 62/568,339

<151> 2017-10-05

<160> 6

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 173

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 1

Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro

1 5 10 15

Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn

35 40 45

Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys

50 55 60

Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala

65 70 75 80

Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe

85 90 95

His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro

100 105 110

Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly

115 120 125

Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu

130 135 140

Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser

145 150 155 160

Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser

165 170

<210> 2

<211> 109

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 2

Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser

1 5 10 15

Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala

20 25 30

Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly

35 40 45

Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu

50 55 60

Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr

65 70 75 80

Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His

85 90 95

Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro

100 105

<210> 3

<211> 121

<212> PRT

<213> 亚美尼亚仓鼠(Armenian hamster)

<400> 3

Glu Val Tyr Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Asn Ile Pro Asn Asn Tyr Ala Thr Glu Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Ser

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Ala Gly Arg Phe Asp His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 4

<211> 110

<212> PRT

<213> 亚美尼亚仓鼠(Armenian hamster)

<400> 4

Tyr Glu Leu Ile Gln Pro Ser Ser Ala Ser Val Thr Val Gly Glu Thr

1 5 10 15

Val Lys Ile Thr Cys Ser Gly Asp Gln Leu Pro Lys Asn Phe Ala Tyr

20 25 30

Trp Phe Gln Gln Lys Ser Asp Lys Asn Ile Leu Leu Leu Ile Tyr Met

35 40 45

Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Thr

50 55 60

Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp

65 70 75 80

Glu Ala Ala Tyr Tyr Cys Leu Ser Ser Tyr Gly Asp Asn Asn Asp Leu

85 90 95

Val Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Arg Gly Pro

100 105 110

<210> 5

<211> 222

<212> PRT

<213> 亚美尼亚仓鼠(Armenian hamster)

<400> 5

Glu Val Tyr Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Asn Ile Pro Asn Asn Tyr Ala Thr Glu Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Ser

65 70 75 80

Ile Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Ala Gly Arg Phe Asp His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val

115 120 125

Tyr Pro Leu Ala Pro Ala Cys Asp Ser Thr Thr Ser Thr Thr Asp Thr

130 135 140

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ser Val Leu His Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Ser Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Thr Trp Pro Lys Gln Pro Ile Thr Cys Asn Val Ala His

195 200 205

Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg

210 215 220

<210> 6

<211> 212

<212> PRT

<213> 亚美尼亚仓鼠(Armenian hamster)

<400> 6

Tyr Glu Leu Ile Gln Pro Ser Ser Ala Ser Val Thr Val Gly Glu Thr

1 5 10 15

Val Lys Ile Thr Cys Ser Gly Asp Gln Leu Pro Lys Asn Phe Ala Tyr

20 25 30

Trp Phe Gln Gln Lys Ser Asp Lys Asn Ile Leu Leu Leu Ile Tyr Met

35 40 45

Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Thr

50 55 60

Ser Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp

65 70 75 80

Glu Ala Ala Tyr Tyr Cys Leu Ser Ser Tyr Gly Asp Asn Asn Asp Leu

85 90 95

Val Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Arg Gly Pro Lys Ser

100 105 110

Ser Pro Lys Val Thr Val Phe Pro Pro Ser Pro Glu Glu Leu Arg Thr

115 120 125

Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Val Asn Asp Phe Tyr Pro Gly Ser

130 135 140

Ala Thr Val Thr Trp Lys Ala Asn Gly Ala Thr Ile Asn Asp Gly Val

145 150 155 160

Lys Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Gly Gln Asn Tyr Met Thr Ser Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Trp Lys Ser His Asn Arg Val Ser

180 185 190

Cys Gln Val Thr His Glu Gly Glu Thr Val Glu Lys Ser Leu Ser Pro

195 200 205

Ala Glu Cys Leu

210

Claims (20)

1.选择性扩增多个T细胞的方法，所述方法包括：

修饰人T细胞以表达TCR，其中所述TCR包含鼠恒定区；

产生包含多个表达所述TCR的人T细胞和多个不表达所述TCR的人T细胞的细胞群；和

在(i)经辐照的饲养细胞、(ii)一种或多种细胞因子以及(iii)抗体或其抗原结合部分的存在下，培养所述细胞群，其中所述抗体能特异性结合所述TCR的鼠恒定区，以便选择性扩增表达所述TCR的T细胞数目超过不表达所述TCR的T细胞数目。

2.根据权利要求1所述的方法，其还包括使用所述抗体或其抗原结合部分将表达所述TCR的T细胞与不表达所述TCR的T细胞分离。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述TCR对癌抗原具有抗原特异性。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述TCR对病毒抗原具有抗原特异性。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子包括IL-2、IL7、IL-12、IL-15和IL-21中的一种或多种。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其还包括在(i)经辐照的同种异体饲养细胞和经辐照的自体饲养细胞中的一种或两种、(ii)一种或多种细胞因子和(iii)能特异性结合人CD3复合物的抗体或其抗原结合部分的存在下培养所述人T细胞。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述抗体能特异性结合所述TCR的β链的鼠恒定区。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中修饰人T细胞以表达TCR包括使用兆核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas系统修饰人T细胞以表达TCR。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述抗体能特异性结合SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸残基D2、R4、N5、T7、E101、D103、K104、W105、P106、E107、G108、S109和P110。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述抗体包含SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4两者的氨基酸序列。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述方法产生选择性扩增的细胞群，其中在选择性扩增的群体中约10％至约75％的细胞表达包含鼠恒定区的TCR。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述方法产生选择性扩增的细胞群，其中在选择性扩增的群体中约20％至约99％的细胞表达包含鼠恒定区的TCR。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其包括使表达包含鼠恒定区的TCR的T细胞的数目增加约10倍至约1,000倍。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述TCR包含鼠可变区。

15.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述TCR包含人可变区。

16.细胞群，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的方法制备的选择性扩增的数目的T细胞。

17.药物组合物，其包含权利要求16所述的群体和药学上可接受的载体。

18.根据权利要求1-15中任一项所述的方法选择性扩增的T细胞，其用于治疗或预防哺乳动物中的病症。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述病症是病毒性病症。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述病症是癌症。

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