JP5114418B2 - 細胞死を抑制する又は細胞増殖を高めるための方法及び組成物 - Google Patents
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Description
本発明は2006年9月9日に出願された、米国仮特許出願第60/715,722号の優先権を主張し、その内容の全てを参照として本明細書に組み入れる。
本検討は、国立衛生研究所(National Institute of Health, Bethesda, MD)、国立神経障害及び脳卒中研究所(National Institute of Neurological Disorders and Stroke)によって支援された。政府は本発明においてある特定の権利を有している。
Bcl−2タンパク質群の1つであるBcl−XLは、造血細胞を含む多くの細胞型において、様々の刺激によって誘導される細胞死を抑制することができる。Bcl−2群のタンパク質は、プログラムされた細胞死の重要な調節因子である。それらの機能は、細胞の内外で発生し、細胞の細胞死への関与に介在する、細胞の生存と死のシグナルを統合することである。細胞がアポトーシスに一旦関与すると、その実行段階が、ミトコンドリアからのシトクロムcの放出及びカスパーゼの活性化によって開始される。カスパーゼの活性化の次に、効率的な細胞異化代謝に関連する形態学的及び生化学的な変化が引き起こされる。Bcl−2群のタンパク質は、一般にアポトーシスを促進するか又は抑制するタンパク質の何れかに分類される。Bcl−XLは、Bcl−2群の一員として特定化されており、種々の細胞型において、様々な刺激によって誘導される細胞死を抑制することができる。Bcl−XLは、細胞表面の受容体を介して特定の標的細胞に送達されて、細胞死を防止することができる。Bc1−XLを含むキメラポリペプチドは、異なるバクテリア毒素の受容体結合ドメイン、又はHIV TATタンパク質の形質導入ドメインに融合し、細胞死を誘導する軸索切断、虚血及び外傷からインビボの神経細胞を救出する。
ヒト顆粒球マクロファージコロニーの刺激因子(GM−CSF)は、骨髄前駆細胞から好中球、好酸球及びマクロファージの増殖及び成熟を促進するサイトカインである。顆粒球マクロファージコロニーの刺激因子(GM−CSF)は、最初はマウスの骨髄において、前駆細胞からの顆粒球及びマクロファージコロニーの生育を刺激する能力があることで発見された(Burgess, A. W. & Metcalf, D. (1980) Blood 56, 947-58)。GM−CSFが、特に免疫及び炎症反応時の顆粒球、マクロファージ及び好酸球のようなより成熟した細胞の細胞数及び活性状態に影響を及ぼす能力に関連するその他の機能を有することが続いて示された(Burgess, A. W. & Metcalf, D. (1980) Blood 56, 947-58., Simon et al., (1977) Eur J Immunol 27, 3536-9)。GM−CSFの機能は、GM−CSFに特異的なα鎖、及びヒトでは、IL−3及びIL−5受容体で共有されるシグナル伝達βサブユニットからなる特異的な受容体に結合することによって介在する(Kitamura et al., (1991) Cell 66, 1165-74; Tavernier et al., (1991) Cell 66, 1175-84; Haman et al., (1999) J Biol Chem 274, 34155-63)。GM−CSF受容体は、造血細胞由来の組織中に、更に星状膠細胞、乏突起膠細胞、骨髄由来のミクログリア及び神経細胞のような、神経系の細胞を含む他の細胞型中にも見出される(Sawada, M., Itoh, Y., Suzumura, A. & Marunouchi, T. (1993) Neurosci Lett 160, 131-4)。
GM−CSF受容体リガンドは、GM−CSF受容体に選択的に結合できるポリペプチドの何れかを含有する。GM−CSF受容体リガンドは、GM−CSF受容体に結合する内因性のリガンド、又はその断片であってよいが、本発明はそのように限定するものではない。本発明は、GM−CSF受容体に選択的に結合するポリペプチドの何れかを実質的に包含する。GM−CSF受容体に「選択的に結合する」ポリペプチドは、GM−CSF受容体とは結合するが、サンプル、例えば生体サンプル中のその他の分子と実質的に結合しないものである。好ましくは、GM−CSF受容体に選択的に結合するGM−CSF受容体リガンドは、10mM以下の親和性定数で結合する。種々の態様では、GM−CSF受容体に選択的に結合するGM−CSF受容体リガンドは、1mM、100nM、10nM、1nM、0.1nM以下、又は0.01又は0.001nMよりも小さい親和性定数でGM−CSF受容体と結合する。一態様では、「GM−CSF受容体」は、GenBank受入番号第NP 000386と実質的な同一性を有するポリペプチドである。GM−CSF受容体リガンドは、内因的に発現する場合、天然のGM−CSF受容体、GM−CSF受容体と結合する抗体、及びその断片と結合するポリペプチドを含む。一態様では、天然のGM−CSF受容体と結合するポリペプチド又はその断片は、GenBank受入番号第P04141と実質的に同一であって、GM−CSF受容体と結合する。
ナノ抗体は、軽鎖の非存在下で十分に機能するように進化した、天然の重鎖抗体の最小断片である。ナノ抗体は、単鎖Fv断片の半分の大きさであるにも関わらず、通常抗体の親和性及び特異性を有している。ナノ抗体が、通常の抗体が到達できない治療標的に結合できるのは、その強烈な安定性とヒト抗体構造との高度な相同性と組み合わせた独特の構造の結果である。多価を有する組み換え抗体の断片は、癌細胞に対して高い結合活性及び独特な標的特異性を示す。これらの多重結合のscFv(例えば、二価抗体、四価抗体)は、約60〜100kDaと低分子量のサイズが、血液からの速い除去及び迅速な組織への取り込みをもたらすので、親抗体を凌ぐ改善をもたらす。Powerらの「Generation of recombinant multimeric antibody fragments for tumor diagnosis and therapy. Methods Mol Biol, 207, 335-50, 2003」、及びWuらの「Anti-carcinoembryonic antigen (CEA) diabody for rapid tumor targeting and imaging. Tumor Targeting, 4, 47-58, 1999」を参照されたい。
GM−CSF受容体リガンドは、抗アポトーシス部分と融合して、キメラポリペプチドを形成する。本明細書に記載のように、このような融合は、抗アポトーシス部分及びGM−CSF受容体リガンドを含む単一キメラポリペプチドをコードする転写融合を生成することによって行うことができる。また、GM−CSF受容体リガンド及び抗アポトーシス部分は、同一又は異なる発現ベクター上に含まれていてもよい、別々の発現カセットから発現することができる。2つのペプチドが、別々に発現される場合には、それらの結合をもたらす二量化ドメインを含むことが好ましい。
Bcl−xLは、Bcl−2から独立したアポトーシスの調節因子として働く。Bcl−xLは、ミトコンドリア膜の外に局在し、ミトコンドリアからのATP排出を調節すること及び/又はアポトーシス促進性のBcl−2関連タンパク質の活性化を抑制することにより、細胞を死から保護すると示唆されている(Basafiez et al., J. Biol. Chem., 277, 49360-49365 (2002); Vander Heiden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 4666-4667 (2000); Zong et al., Genes Dev. 15, 1481-1486 (2001))。Bcl−xLをコードする遺伝子(例えば、GenBAnk受入番号第Z23115)の選択的スプライシングは、2つの異なるBCLXmRNAをもたらす(Boise et al., Cell 74:597-608, 1993)。大きいmRNA(Bcl−xL)が産生するタンパク質は、Bcl−2とサイズ及び予測構造が類似していて、これは少なくともBCL2と同様に、成長因子の離脱による細胞死を抑制する(Boise et al., Cell 74:597-608, 1993)。Bcl−xLポリペプチドは、GenBank受入番号第Q07817と実質的に同一の配列を有していて、アポトーシスを調節することができる。好ましくは、本発明のBcl−xLポリペプチドは、アポトーシスを減少させる。
本発明の方法で有用な、抗アポトーシスBcl−2群のその他のものは、Mcl−1及びA1を含有する。MCL1は、ヒト骨髄白血病細胞株から単離された(Kozopas, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 90:3516-3520, 1993)。MCL1の発現は、分化マーカー及び成熟形態の出現前の、ML−1分化の誘導又はプログラミングの初期に増加した。MCL1は、BCL2と、特にそのカルボキシル部位において、同様な配列を示す。酵母2−ハイブリッド分析は、350アミノ酸のMCL1タンパク質全長(MCL1L)がアポトーシス促進性のBcl−2群タンパク質と相互作用し、アポトーシスを抑制するこを示した(Bae et al., J. Biol. Chem. 275:25255-25261, 2000)。Bcl−2相同ドメイン1、2及び膜貫通ドメインを欠いている271アミノ酸の変異体は、この抗アポトーシス活性がない(Bae et al., J. Biol. Chem. 275:25255-25261, 2000)。本発明において有用なMCL1タンパク質の断片は、少なくとも1つのBcl−2相同ドメインを包含し、アポトーシスを減少させることが好ましい。
A1は、抗アポトーシス活性を有するBcl−2群のその他のタンパク質である。Linらの「J. Immun. 151:1979-1988, 1993」は、BCL2関連タンパク質A1(Bcl2a1)と呼ばれる、新規なマウスcDNA配列を単離して、これをアポトーシス調節因子のBCL2群の1つとして同定した。BCL2A1遺伝子は、BCL2L5、BFL1及びGRSとも呼ばれる。好ましくは、A1は、GenBank受入番号第NP 004040のアミノ酸配列と実質的に同一である。A1のペプチド配列は、Bcl−2及びBcl−2関連遺伝子であるMCL1と類似性を示す、80個のアミノ酸の断片を含有する(Lin et al., J. Immunol. 151(4):1979-88, 1993)。本発明の抗アポトーシス部分が、少なくとも1つのこの領域を含有していることが好ましい。
本発明は、少なくとも1つのGM−CSF受容体リガンド及び抗アポトーシス部分を含有するキメラポリペプチドを提供する。一態様では、キメラポリペプチドは、GM−CSF受容体リガンド及びBcl−xL部分を含有する。「GM−CSF−Bcl−xLキメラポリペプチド」は、少なくとも1つのGM−CSFポリペプチドの断片及びBcl−XLポリペプチドの断片を含有するポリペプチドであって、ここにおけるキメラポリペプチドは、GM−CSF受容体と結合し、細胞の生存を高めるか、細胞の増殖を促進するか、又はアポトーシスを減少させる。典型的なGM−CSF−Bcl−xLキメラポリペプチドの配列は、図10A(アンダーラインを付けて)及び図10Bに示される。このようなポリペプチドをコードする典型的な核酸分子の配列は、図11Aに示される。
GM−CSF−リンカー−BclxL−リンカー−GM−CSF、又は
GM−CSF−リンカー−BclxL−リンカー−GM−CSF−リンカー−BclxL。
あるいは、キメラポリペプチドのC又はNH末端に存在するアミノ酸尾部による介在によって、二量化がなされる。
本発明は更に、少なくともGM−CSF受容体リガンド及び抗アポトーシス部分を含有するキメラポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。本発明の方法で特に有用なものは、GM−CSF受容体リガンド(例えば、GM−CSF)、Bcl−2群のポリペプチド(例えば、Bcl−xL)又はそれらの断片を、コードする核酸分子である。典型的な核酸分子の配列は、図11A及び11Bに示されている。本発明の方法におけるその他の有用な核酸配列は、これらに限定されないが、BCL2関連のタンパク質A1(これは、GenBank受入番号第NM 004049.2で提供される)、Bcl−xL(BCL2同類1)(これは、GenBank受入番号第NM 001191で提供される)及びMcl−1(これは、GenBank受入番号第NM 021960で提供される)の配列である。
一般に、本発明のキメラポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸又はその断片の全部又は部分を、適当な発現媒介物中に有している適当な宿主細胞の形質転換によって産生することができる。
トランスジェニックマウスを作成する望ましい方法を以下に述べるが、これはその一つに過ぎない。この一般的なプロトコールは、当業者によって修飾することができる。
6週齢の雌マウスに、妊馬血清性性腺刺激ホルモン(PMSG;Sigma)の5IU、次いで48時間後のヒト絨毛性腺刺激ホルモン(hCG;Sigma)の5IU注射(0.1cc、IP)によって過剰排卵を誘発する。hCG注射後直ちに、雌と雄を一緒にする。hCG投与21時間後に、交尾した雌を、CO2窒息又は頸椎脱臼によって犠牲にし、摘出した卵管から胚を回収して、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA、Sigma)を含有するダルベッコ(Dulbecco)・リン酸緩衝生理食塩水に入れる。周囲の卵丘細胞を、ヒアルロニダーゼ(1mg/ml)で除去する。次いで、前核性の胚を洗浄して、5%のCO2、95%の空気の湿った雰囲気下の37.5℃のインキュベーター内の、0.5%のBSAを含有するアール(Earle)平衡塩溶液(EBSS)中に、注射する時まで入れておく。胚は、2細胞期に移植することができる。
本明細書に記載のキメラポリペプチドをコードする導入遺伝子を含有する遺伝子組み換え植物は、組み換えポリペプチドを産生するために有用である。少なくとも1つのトランス遺伝子(例えば、GM−CSF−Bcl−xLキメラポリペプチドをコードするトランス遺伝子)を発現する、遺伝子組み換え植物、又はそのような植物の個体群は、キメラポリペプチドを産生するために有用である。一態様では、キメラポリペプチドは、安定に形質転換された植物細胞株、一過性に形質転換された植物細胞株、又は遺伝子組み換え植物によって発現される。植物細胞の安定な又は染色体外の形質転換に、又は遺伝子組み換え植物を確立するために適している多くのベクターは、一般に公開されており、そのようなベクターは、Powelsら(前記)、Weissbach及びWeissbach(前記)、及びGelvinら(前記)によって記載されている。このような細胞株を構築する方法は、例えば、Weissbach及びWeissbach(前記)、及びGelvinら(前記)によって記載されている。
植物発現ベクターの構築に際して、植物宿主にベクターを導入して遺伝子組み換え植物を産生するために、幾つかの標準的な方法を利用できる。これらの方法は、(1)アグロバクテリウム(アグロバクテリウム・ツメファシエンス又はアグロバクテリウム・ルチゾジェネス(A.rlzizogenes))介在の形質転換(例えば、「Lichtenstein and Fuller In: Genetic Engineering, vol. 6, PWJ Rigby, ed, London, Academic Press, 1987」及び「Lichtenstein, C.P., and Draper, J. In: DNA Cloning, Vol II, D.M. Glover, ed, Oxford, IRI Press, 1985」を参照されたい)、(2)粒子送達システム(例えば、「Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603, 1980」及び「BioRad Technical Bulletin 1687(前記)」を参照されたい)。(3)マイクロインジェクション手法(例えば、「Green et al.,(前記)」を参照されたい)、(4)ポリエチレングリコール(PEG)手法(例えば、「Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451, 1982」又は例えば、「Zhang and Wu, Theor. Appl. Genet. 76:835, 1988」を参照されたい)、(5)リポソーム介在のDNAの取り込み(例えば、「Freeman et al., Plant Cell Physiol. 25:1353, 1984」を参照されたい)、(6)エレクトロポレーション法(例えば、「Gelvin et al., supra」、「Dekeyser et al., supra」、「Fromm et al., Nature 319:791, 1986」、「Sheen Plant Cell 2:1027, 1990」又は「Jang and Sheen Plant Cell 6: 1665, 1994」を参照されたい)、及び(7)ボルテックス法(例えば、「Kindle supra」を参照されたい)を含む。
植物発現ベクターで形質転換された植物細胞は、例えば、単一の細胞、カルス組織、又は葉ディスク(discs)から、標準的な植物組織培養技術によって再生することができる。殆どすべての植物の、種々の細胞、組織又は器官をうまく培養して、完全な植物体に再生できることは、当業者によく知られている。そのような技術については、例えば、「Vasil supra」、「Green et al., supra」、「Weissbach and Weissbach, supra」及び「Gelvin et al., supra」に記載されている。ある特定な例では、35SCaMVプロモーター及びノパリン合成酵素のターミネーターで制御され、そして選択マーカー遺伝子(例えば、カナマイシン耐性)を保持する、クローン化されたキメラポリペプチド発現構築物が、アグロバクテリウムに形質転換される。葉ディスクの、アグロバクテリウム含有ベクターでの形質転換は、「Horsch et al.(Science 227:1229, 1985)」の記述に従って実施した。数週間後(例えば、3〜5週間後)、カナマイシン(例えば、100μg/ml)を含む植物組織培養培地で、推定される形質転換体を選択する。次いで、カナマイシン耐性の芽を、発根を開始させるホルモンを入れていない植物組織培養培地の上に置く。そして、温室で成長させるカナマイシン耐性の植物を選択する。必要により、次いで自殖させた遺伝子組み換え植物からの種子を、土を含まない培地に播いて、温室で育てることができる。ホルモンなしでカナマイシン含有培地に、表面を殺菌した種子を播いて、カナマイシン耐性の子孫を選択する。
本発明のキメラポリペプチドを発現している植物を同定及び定量するために、核酸レベルでの発現を、最初に測定する。発現を分析するための標準的な技術を、用いた。このような技術には、トランス遺伝子の核酸テンプレートだけを増幅するように設計されたオリゴヌクレオチド・プライマーを用いたPCR増幅アッセイ、及びトランス遺伝子に特異的なプローブを用いた溶液ハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、「Ausubel et al., supra」を参照されたい)を包含する。次いで、本発明のキメラポリペプチドをコードするような植物は、GM−CSF受容体リガンド又は抗アポトーシス部分の特異的な抗体を用いるウェスタン免疫ブロット分析を用いてタンパク質の発現について分析する(例えば、「Ausubel et al., supra」を参照されたい)。更に、標準的な手順によるインサイチュー・ハイブリダイゼーション及び免疫細胞化学は、遺伝子組み換え組織での発現部位の位置を決めるために、トランス遺伝子特異的なヌクレオチドプローブ及び抗体をそれぞれ用いて、実施することができる。
GM−CSF−Bcl−xLキメラポリペプチドのGM−CSF受容体への結合は、アポトーシスになるリスクがある細胞の生存を高める。この発見の部分によれば、本発明の組成物は、活性、安定性又は血液脳関門通過能力を高める、候補化合物及びキメラポリペプチドを、高性能且つ廉価でスクリーニングするのに有用である。一態様では、新規なGM−CSF受容体リガンドは、GM−CSF受容体に結合することで単離される。好ましくは、これらのリガンドは、この受容体を活性化する。これらのリガンドは次いで、Bcl−xLポロペプチド又はその断片と融合して、細胞生存又はアポトーシスのそれらの効果をアッセイする。また、本発明の方法及び組成物は、本明細書に記載のGM−CSF−Bcl−xLキメラポリペプチドの生物活性を増強する候補化合物の単離に有用である。一態様では、このような候補化合物は、本発明のキメラポリペプチドと組み合わせて投与されると、細胞の生存を促進するか又はアポトーシスを減少させる
一般に、本発明のキメラポリペプチド(例えば、GM−CSF−Bcl−xL)の活性を増強できる化合物は、天然物又は合成(又は半合成)抽出物の両方のライブラリー又は化学物質ライブラリーから、又はポリペプチド又は核酸ライブラリーから、当該技術分野において公知の方法に従って、同定することができる。薬剤の発見及び開発分野の当業者は、抽出物又は化合物の正確な供給源が本発明のスクリーニング方法にとって重要ではないということを理解するであろう。スクリーニングに用いられる化合物は、公知の化合物(例えば、その他の疾患又は障害に用いられている公知の治療薬)を含んでいてもよい。また、殆ど全ての未知の化学抽出物及び化合物は、本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングすることができる。このような抽出物又は化合物の例には、これらに限定されないが、植物、真菌、原核生物、又は動物に基づく抽出物、発酵培養液及び合成化合物、更に現存化合物の修飾体も含まれる。
本発明のキメラポリペプチド及び関連化合物は、GM−CSF受容体を発現する実質上全ての種類の細胞の生存又は増殖を高めるのに有用である。GM−CSF受容体を発現する細胞が細胞死のリスクがある場合には、本明細書に記載されているキメラポリペプチドの投与が、細胞死に関連する疾患又は障害を防止又は治療するのに有用である。一態様では、細胞死は、化学療法剤のような、薬剤の毒性と関連している。例えば、本発明のキメラポリペプチドは、アポトーシス促進性の事象(例えば、化学療法、放射線照射、虚血性障害又は神経変性疾患)に応答するアポトーシスを受けるリスクのある細胞型の細胞死(例えば、アポトーシス細胞死)を防止又は治療する(例えば、改善する、安定にする、回復する又は遅延させる)のに有用である。一態様では、アポトーシスを受けるリスクのある細胞は、化学療法に応答するアポトーシスのリスクがある単球又は造血細胞型である。その他の態様では、本発明の方法及び組成物は、脳卒中、虚血性障害又は再灌流のような低酸素に関連する細胞死の治療又は防止に有用である。その他の態様では、この方法及び組成物は、細胞死を減少させるばかりではなく、細胞増殖を促進する。
本発明の組成物(例えば、キメラポリペプチド及びそれらをコードする核酸分子)は、水、食塩水、ブドウ糖水溶液、グリセロール又はエタノールのような、薬学的に許容される賦形剤に存在させて投与することができる。組成物は、その他の薬剤、医薬品、アジュバント、担体、及び湿潤又は乳化剤及びpH緩衝剤のような補助剤も含有することができる。本明細書に組み込まれている「Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 17th edition, Mack Publishing Company」のような標準的なテキストを、過度な実験を行わずに投与に適した組成物及び製剤を調製するために、参考にすることができる。適切な用量もこのテキスト及び本明細書で引用されている文献をベースにすることができる。適切な用量の投与の決定は、本明細書に記載のパラメーターが与えられた当業者の技術範囲内である。
GM−CSF−Bcl−XLキメラポリペプチド又はその断片のインビボ又はインビトロでの発現は、細胞死を受けるリスクのある細胞の生存又は増殖を促進するための、その他の治療的なアプローチである。本発明のキメラポリペプチドをコードする核酸分子を、アポトーシスのリスクがある対象の細胞に送達することができる。細胞におけるキメラポリペプチドの発現は、その細胞又は標的細胞若しくは組織の増殖を、促進し、アポトーシスを防止し、又はアポトーシスのリスクを減少させる。核酸分子は、対象の細胞に、治療有効レベルのキメラポリペプチドを産生できるように取り込まれる形態で送達されなければならない。形質転換ウィルス(例えば、レトロウィルス、アデノウィルス及びアデノ関連ウィルス)ベクターは、特にその感染の高効率性、及び安定な組み込み及び発現によって、体細胞遺伝子治療に使用することができる(例えば、「Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997」、「Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996」、「Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649, 1997」、「Naldini et al., Science 272:263-267, 1996」及び「Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997」を参照されたい)。
細胞死のリスクがある細胞の生存を高める、キメラポリペプチド、ポリペプチド類縁体及び関連化合物は、本発明の方法における治療剤として有用である。細胞の生育又は生存率を測定するためのアッセイは、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。「Crouch et al. (J. Immunol. Meth. 160, 81-8)」、「Kangas et al. (Med. Biol. 62, 338-43, 1984)」、「Lundin et al., (Meth. Enzymol. 133, 27-42, 1986)」、「Petty et al. (Comparison of J. Biolum Chemilum. 10, 29-34, 1995)」及び「Cree et al. (AntiCancer Drugs 6:398-404, 1995)」も参照されたい。細胞の生存率は、MTT(3−(4,5−ジメチルチアゾリル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド)(Barltrop, Bioorg. & Med. Chem. Lett. 1:611, 1991; Cory et al., Cancer Comm. 3, 207-12, 1991; Paull J. Heterocyclic Chem. 25, 911, 1988)を含む多くの方法を用いてアッセイすることができる。細胞生存能のアッセイも、商業的に利用可能である。これらのアッセイは、これらに限定されないが、ATPを検出して培地中の健常細胞又は細胞を定量するためにルシフェラーゼ技術を用いる、CELLTITER−GLO(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay (Promega)、及び乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)細胞傷害性アッセイである、CellTiter−Glo(登録商標)Luminescent Cell Viability Assay(Promega)を包含する。
本発明は、治療又は予防のワクチンの産生中に、樹枝状細胞のアポトーシスを抑制又は増殖を促進する方法も提供する。一般に、ワクチンは、ワクチンの接種を必要とする対象由来の細胞(例えば、樹枝状細胞)を含んでいる。一般に、この細胞は、血液サンプル又は骨髄サンプルのような対象の生体サンプルから得られる。好ましくは、樹枝状細胞又は樹枝状幹細胞を対象から得て、細胞をインビトロで培養して樹枝状細胞の集団を得る。培養した細胞を、本発明のキメラポリペプチドの存在下に、抗原(例えば、癌抗原)と接触させる。望ましくは、キメラポリペプチドの存在下で抗原と接触させた細胞は、キメラポリペプチドの非存在下で接触させた樹枝状細胞に比べてアポトーシスのリスクが減少している。接触させた細胞は、状況に応じてインビトロで数を増やす。次いで、この細胞を対象に再導入し、そこで細胞は目的の抗原(例えば、癌抗原)に対する免疫応答を高める又は発現させる。このようなワクチンを作成する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、「Zhu et al., J. Neurooncol. 2005 Aug; 74(1):9-17」、「Nair et al., Int. J. Cancer. 1997:70:706-715」及び「Fong et al., Annu. Rev. Immunol. 2000; 18:245-273」に記載されている。
アジュバントは、ワクチンの効果を増強する免疫刺激剤である。有効なアジュバントは、これらに限定されないが、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムのようなアルミニウム塩、ムラミルペプチド、細菌の細胞壁成分、サポニンアジュバント、及び組成物の有効性を高める免疫刺激剤として作用するその他の物質を含む。
本発明の方法は、アポトーシスを調節する、又は増殖を促進するための手段を提供する。この調節は、インビボ又はインビトロで実施することができる。インビボでの治療的な使用のために、本明細書に記載の組成物又は薬剤は、例えば生理食塩水のような薬学的に許容される緩衝液中に製剤化して、全身投与することができる。本発明の組成物及び方法は、GM−CSFの投与が有用である殆ど全ての疾患の治療に用いることができる。このような疾患には、骨髄移植後の骨髄再生、冠動脈疾患、クローン病、細胞毒性薬剤治療、血行動態性の脳梗塞、感染症(例えば、HIV)、リンパ性白血病、粘膜炎、骨髄移植、骨髄異形成症候群、好中球減少、関節リウマチ、幹細胞移植(例えば、造血幹細胞移植)、白血球不足、創傷治癒が含まれる。
本明細書に記載のように、本発明のキメラポリペプチドは、アポトーシスを減少させる又は増殖を促進するのに有用である。従って、本発明の組成物は、必要により、過剰な細胞死によって特徴付けられている疾患又は障害の治療に一般に用いられている標準的な治療の何れかと組み合わせることができる。一態様では、標準的な治療は、低酸素症、虚血、再灌流、卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、ルー・ゲリック病、ハンチントン舞踏病、脊髄性筋萎縮症、脊髄損傷、幹細胞移植の処置、化学療法の治療又は放射線治療に関連する細胞死又はアポトーシスの治療に有用である。特に、パーキンソン病のようなドーパミン作動性細胞の死によって特徴付けられる疾患については、本発明のキメラポリペプチドが、ドーパミンの産生を促進する薬剤又はドーパミン模倣薬、アマンタジンのような抗運動障害薬剤又は抗コリン薬と、組み合わせて投与することができる。血栓症の存在と関連する虚血障害については、本発明のキメラポリペプチドが、抗血栓剤又は血栓溶解剤と組み合わせて投与することができる。このような方法は、当業者にとって公知であり、E.W.Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
キメラポリペプチドを含有する本発明の組成物を投与されている患者の治療又は病状は、患者の細胞、組織又は器官に存在する細胞死又はアポトーシスのレベルを評価することによって観察することができる。過剰な細胞死によって特徴付けられる疾患又は障害(例えば、神経変性疾患)に罹っている患者に対しての観察は、一般的に神経細胞の死に特に関連する神経症状の観察を含む。神経変性疾患に付随する神経症状には、次の、アポトーシスのレベル;振戦(震え);硬直;黒質機能障害;うつ;反射消失;低血圧;線維束収縮;筋萎縮;頭、胴及び手足の不随意運動;運動神経生存因子1(SMN1)遺伝子の変性;突発性のしびれ(知覚麻痺)又は脱力;突発性錯乱;突発性発話困難;突発性会話理解困難;突発性片目又は両目視覚困難;突発性歩行困難;目まい;平衡感覚障害;協調運動障害;病因不明の突発性頭痛;動作緩慢;姿勢の不安定;意識消失;精神攪乱;立ちくらみ(浮遊感);目まい;視力障害;疲れ目;耳鳴り;あと味の悪さ;倦怠感;無気力;睡眠パターンの変化;行動変化;気分の変容;記憶障害;集中力障害;注意欠陥障害;認知障害;嘔吐;悪心;けいれん;発作;目覚まし不能;瞳孔拡張;不明瞭な発語;四肢の衰弱又はしびれ;情動不安;及び興奮の何れか1つ又はそれ以上が含まれていてもよい。前記の症状の何れかの1つ又はそれ以上の重症度の減少をもたらす組成物は、本発明の方法において有用であると考えられる。
(実施例)
Bcl−XLを骨髄系列の細胞に送達するために、ヒトBcl−XLのcDNAを、ヒト顆粒球マクロファージコロニーの刺激因子(GM−CSF)の遺伝子のC−末端に融合させた。ヒスチジン標識がキメラタンパク質のN−末端に存在しており、この構築物を発現プラスミドpET28(+)(図1A)にクローン化した。図1Aは、GM−CSF融合タンパク質の構築物を説明する概略図を提供する。この構築物を、2つの異なる発現プラスミドにクローン化した。1番目のプラスミドのpET28(+)は、細菌(大腸菌)中で発現するために用いた。2番目のプラスミドのpPICZAは、酵母ピキア・パストリスで発現するために用いた。大腸菌中で発現したタンパク質は、不溶性で、封入体中に見出された。融合タンパク質を変性して、His結合カラムで精製した後、タンパク質をグルタチオン及びアルギニンの存在下で、希釈によってリフォールディングした。精製後、タンパク質は、SDS−PAGE及びウェスタンブロット(図1B)で示されるように、≧90%の同一性があって、予期された分子量を有していた。
GM−CSF−Bcl−XLキメラタンパク質は、GM−CSF単独よりもより効果的に、細胞をアポトーシスから保護する。ヒト骨髄細胞株のHL−60の増殖でのGM−CSF−Bcl−XLの効果も試験した。GM−CSF−Bcl−XLは、48時間後に最大効果を示して増殖を増加させた。その時点での活性は、同モル量のサイトカインGM−CSFで処理された細胞で測定した活性よりも30%高かった(図1C)。
キメラタンパク質の生存促進性の活性における、融合タンパク質のBcl−XL部分の重要性を評価するために、キナーゼ抑制剤であるスタウロスポリンとSgTry490を用いて、GM−CSF部分の活性を抑制した。スタウロスポリンは、プロテインCキナーゼの抑制剤として最初に記載されたが、最近はスタウロスポリンが、異なるキナーゼの種々の配列に広く特異的な抑制剤であることが明確になった。GM−CSFがその受容体に結合する高い親和性は、受容体サブユニットのオリゴマー形成後に、キナーゼのリン酸転移手段によって、受容体関連のJak2キナーゼの活性化を誘発する。チロホスチン(tyrphostin)AG490(AG490)は、インビボ及びインビトロで白血病細胞の成長を阻止するJak2の活性を特異的に抑制する(Meydan et al., (1996) Nature 379, 645-8; Quelle et al., (1994) Mol Cell Biol 14, 4335-41)。末梢血単核細胞(PBMC)は、これら2つの抑制剤の存在下に48時間、異なる濃度のGM−CSF−Bcl−XLと培養した。
抗アポトーシス効果を介在するBcl−XLのC−末端アミノ酸(210〜37)の発現、効能及び重要性を比較するために、異なる構築物を形成した。これらの構築物は、GM−CSFのN−末端又はC−末端にBcl−XLを持つか、又はBcl−XLのC−末端に変異を含んでいる。これらの構築物は、大腸菌で発現される。Bcl−XLのC−末端の膜アンカーの発現、効能及び重要性を比較するために、C−末端(アミノ酸210〜37)に28個のアミノ酸欠失を有しているBcl−XL(1〜209)を持つ構築物を、GM−CSFのC−末端に融合させた。このタンパク質も大腸菌で発現される。
造血に対するGM−CSF−Bcl−XLの効果は、CD34陽性細胞のコロニーアッセイを用いて試験した。細胞を、メチルセルロース半固体培地中で保存した。骨髄から単離したCD34陽性細胞は、幹細胞因子(SCF)、エリスロポエチン及びサイトカインを補完した培地に蒔いた。培地へGM−CSF−Bcl−XLを添加すると、コロニーの数が2倍に増加した(図4A)。委託顆粒球−単球系前駆細胞(committed granulocyte-monocyte progenistor;CFU−GM)の生育及び赤芽球バースト形成細胞(BFU−E)のコロニーが、シタラビンによって大幅に減少した。CD34陽性細胞のGM−CSF−Bcl−XLとの培養は、GFU−Eに比べてCFU−GMを選択的に保護した(図4A)。サイトカインの欠乏は、コロニーの完全喪失を引き起こした(図4B)。GM−CSF−Bcl−XLは、コロニーの総数が減少した場合でも、サイトカインの欠乏から骨髄先駆細胞を保護した。GM−CSF−Bcl−XLの活性は、サイトカイン欠乏の影響から更にシタラビンの細胞毒性効果からも細胞を保護し、そして単球/マクロファージ系列の前駆細胞の分化を促進した。
図6Bでは、精製したマクロファージ/単球を、Jak2キナーゼ抑制因子であるTryAg−490(0.5μM)の非存在下(白棒)又は存在下(縞の棒)で72時間処理した。細胞を、14C−ロイシンと1時間パルス振動させ、そして回収した。ロイシンの取り込みを測定して、PBSで処理した対照細胞に対するパーセントで示した。3回の測定から平均値を決定して、融合タンパク質の濃度に対してプロットした。
GM−CSF−Bcl−XLは、GM−CSF受容体に結合して、細胞に移行してそこで細胞死を阻止する。
図7A、7B及び7Cに、スタウロスポリンの存在下でのGM−CSF−Bcl−XLの効果の経時変化を示す。GM−CSF−Bcl−XLタンパク質は、スタウロスポリン誘発アポトーシスから細胞を、アポトーシス誘発後24時間から少なくとも72時間まで保護する。
ピキアにおいて、GM−CSF−Bcl−XLは、細胞内で発現する。発現を、ウェスタン・ブロットで観察した。キメラ体の産生を、24時間後に観察した(図8)。高濃度のプロテアーゼ抑制剤を使用しても、GM−CSF−Bcl−XLは、タンパク質分解に対して敏感であって、プロテアーゼ抑制剤の使用が必ずしも分解を完全に除去するのに十分であるとは限らなかった。GM−CSF−Bcl−XLキメラポリペプチドのプロテアーゼに対する敏感性は、本発明のキメラポリペプチドの細胞生存増強活性を保持するプロテアーゼ耐性の変異体を選択によって克服することができる。そのようなポリペプチドを選択する方法は、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。
精製タンパク質の量は、ピキアが産生したGM−CSF−Bcl−XLの抗アポトーシス活性が、大腸菌から精製したGM−CSF−Bcl−XLの活性に匹敵することを確認するのに十分であった(図9)。抗アポトーシス効果は、Bcl−XLがGM−CSFと融合してGM−CSF−Bcl−XLを形成したときに増強された。予想通り、一般的なキナーゼ抑制剤であるスタウロスポリンは、高レベルでアポトーシスを誘発した。GM−CSFサイトカインをスタウロスポリンと共に投与したときにカスパーゼ活性は減少したが、Bcl−XLのC−末端(アミノ酸210〜37)に欠失があるGM−CSF−Bcl−XLをスタウロスポリンと共に投与したときにはカスパーゼ活性のレベルは更に20%減少した(図2)。
上記の実験は、以下の方法及び物質を用いて実施した。
ヒトGM−CSFに対するcDNAは、NdeI及びBamHIで分解され、次いでBglII及びEcoRIで分解された、ヒトBcl−XLのcDNA(野生型、又はC−末端膜アンカーが欠如している切断型)と融合させた。2つのcDNAの連結に、グリシン、セリン及びスレオニンを2つのタンパク質間のリンカーとして導入した。次いで、融合した遺伝子を、大腸菌のベクターpET28(+)に挿入して、His標識配列をGM−CSF−Bcl−XL(Bcl−XL△C)cDNAに導入した。
大腸菌BL21 DE3(OneShot(登録商標)BL21DE3株、Invitorgen)は、GM−CSF−Bcl−XLを発現させるために用いた。GM−CSF−Bcl−XLをコードするcDNAを含有する発現プラスミドpET28+で変換された遺伝子組み換え細菌は、2リットルのフラスコ内の50μg/mlのアンピシリン(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)を含有する1Lのスーパーブロス(3.2%のトリプトン、2.0%の酵母エキス、0.5%のNaCl、pH7.5(KD Medical, Columbia, MD))中で、37℃で生育させた。OD600が0.8〜1ODに達した時に、1mMのIPTG(Sigma)を添加してタンパク質の発現を誘発した。培養3時間後に、5,000Gで遠心分離して細胞を採取して、結合緩衝液(5mMのイミダゾール、20mMのTris/Cl(pH7.9)、0.5MのNaCl)に再懸濁した後、フレンチ・プレスを用いてペレットを溶解した。5,000Gで遠心分離して、封入小体を細胞残屑と共に採取して、20mlの結合緩衝液で4回洗浄した。
ポリヒスチジン(6×His(配列番号21))配列を含有する組み換えタンパク質の精製に用いられるニッケル添加の親和性樹脂である、PROBOND Resin(Invitrogen)の2.5mlを、0.5×5cmのカラムに重力流で詰めた。樹脂を、5倍容量の発熱性物質及びヌクレアーゼを含まない超高純度の水、及び6M塩酸グアニジンを含有する5倍容量の結合緩衝液で洗浄した。カラムに調製した抽出液を詰めて、6Mグアニジンを含有する5倍容量の結合緩衝液及び6M塩酸グアニジンを含有する10倍容量の洗浄緩衝液(60mMのイミダゾール、20mMのTris−Cl(pH7.9)、0,5MのNaCl)で洗浄した。結合タンパク質を6M塩酸グアニジンを含有する4倍容量の溶出緩衝液(1Mのイミダゾール、20mMのTris−Cl(pH7.9)、0,5MのNaCl)で溶出した。クロマトグラフィー時の流速は、0.5ml/minであった。
25mMのDTTを6Mのグアニジン緩衝液中に溶出されたタンパク分画に加えて、溶出タンパク質を完全に変性し、そして10倍容量のリホールディング緩衝液(0.1MのTris/Cl(pH8.0)、0.5Mのアルギニン、1mMの酸化グルタチオン)中に滴下希釈してリホールドし、次いで48〜72時間25℃で培養した。タンパク質を、遠心ろ過装置Amicon Ultra 15 MWCO 10000(Millipore, Bedford MA)で、濃度が≧1mg/mlになるまで濃縮して、PBSに対して透析した。精製したタンパク質の量を、ブリリアントブルーRで染色して4〜20%のSDS−PAGEで、及びHis−Tag第1抗体(Novagen, Madison MA)を用いるウェスタン・ブロットで分析した。
GM−CSF−Bcl−XLをコードするcDNAは、AOX1プロモーターの制御下で、N−末端のHis−Tagを有するピキア細胞内発現ベクター(Invitrogen)のEcoRI部位に挿入した。Bcl−XLの最終コドンの後に、終止コドンを挿入した。ピキアX−33株は、線状化プラスミドで電気穿孔法によって形質変換して、形質変換体を100μg/mlのゼオシンを含有するYPDS(Yeast/Peptone/Dextrose/Sorbital)プレート上に蒔いて、組み換えクローンを単離した。
クロマトグラフィーは、大腸菌からのGM−CSF−Bcl−XLの精製と同じ条件下の同じ変更で実施した。用いた全ての緩衝液は、グアニジンを含まずに、COMPLETE PROTEASE INHIBITOR COCKTAIL EDTA−free/50mlの緩衝液を含有した。フラクションを集めて、4℃でPBSに対して透析した。GM−CSF−Bcl−XLの濃度を、比色分析(BCA kit, Pierce)によって測定した。GM−CSF−Bcl−XLの最終収率は、培養液1リットル当たり約5mgであった。次いでこのタンパク質を、0.22ミクロンの膜でのろ過により滅菌して、4℃で保存した。
HL−60細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC)から入手した。単球アフェレーシスは、NIH Blood Bankから入手した。組み換えタンパク質の効果を評価するために、細胞タンパク質合成抑制及び細胞増殖の2種類のアッセイを実施した。
正常健常提供者のアフェレーシス由来のバフィーコート及び単球は、NIH Blood Bankから入手した。PBMCは、フィコールグラジュエントで単離した。単核細胞を、10%のFCS(Biofluids, Rockville MD)を含むRPMIに再懸濁して、150×25mmの組織培養皿で2時間培養する。接着細胞を含んでいない培地を除去し、細胞を完全RPMIで2回洗浄した。付着した単球/マクロファージを徐々に解体して、遠心分離した。組み換えタンパク質の効果を評価するために、細胞増殖及びカスパーゼ3/7活性の2種類のアッセイを実施した。単球/マクロファージ細胞を、96ウェルのマイクロタイター中で、1晩、1×105細胞/mlの濃度で培養して、イスコフ培地(20%のFCS、10ng/mlのIL3、10ng/mlのIL6、10ng/mlのG−CSF)中で、必要な時間、各種濃度の精製タンパク質で処理した。細胞の生存能を、Celltiter 96Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit(Promega, Madison WI)で測定した。生存する細胞の数を、代謝的に活性な細胞の存在を示すATP存在量を定量して測定した。与えられた値は、平均値の標準偏差と共に3つのサンプルの平均値を示す。アポトーシス細胞の計算は、ApoOne Homogeneous Caspase 3/7 Assay kit(Promega)を用いて実施した。カスパーゼ3/7プロテアーゼ活性を、基質Z−DEVDローダミン110の開裂後の蛍光強度として、測定した。
細胞タンパク質合成の抑制を、以下のようにして測定した。100μlの培地中の細胞を、1×105細胞/mlの濃度で、96ウェルのマイクロタータープレート中で1晩培養し、そしてロイシンを含んでいないRPMI1640中で、必要な時間、各種濃度の精製タンパク質で処理した後、0.1mCi[14C]−ロイシンと1時間パルス振動させた。その後、細胞を、市販の細胞自動採取器PHD cell harvester(Cambridge Technology, Watertown, MA)を用いて、グラスファイバーのフィルター上に採取した。液体シンチレーション計測によって放射能を計測した。結果を、PBSで処理した対照細胞による放射性標識ロイシンの取り込みに対するパーセントとして表した。
上記より、種々の変更及び修飾を本明細書に記載の発明に実施して、各種の用途及び条件を導入することができることは、明らかであろう。このような態様も本発明の特許請求の範囲に含まれる。
Claims (36)
- GM−CSF受容体と特異的に結合して細胞の生存を高めるキメラペプチドであって、GM−CSF受容体リガンド及び細胞死を抑制できるBcl−xLポリペプチドを含んでなる、単離されたキメラペプチド。
- 前記GM−CSF受容体リガンドが、少なくとも1つのGM−CSFの断片又はGM−CSF受容体抗体の断片である、請求項1に記載のキメラポリペプチド。
- 1:1、1:2、又は1:3の比でGM−CSF及びBcl−XLを包含する、請求項1又は2に記載のキメラポリペプチド。
- GM−CSF受容体と特異的に結合して細胞の生存を高めるキメラペプチドであって、GM−CSFポリペプチド及びBcl−xLポリペプチドを含んでなる、単離されたキメラペプチド。
- 細胞死を抑制する、請求項1から4のいずれかに記載の単離されたキメラポリペプチド。
- 細胞死が、低酸素、虚血、再灌流、脳卒中、パーキンソン病、ルー・ゲーリック病、ハンチントン舞踏病、脊髄性筋萎縮症、脊髄損傷、幹細胞移植の処置、化学療法の治療又は放射線治療に関連するものである請求項5に記載のキメラペプチド。
- キメラポリペプチドが、造血細胞、樹枝状細胞、神経細胞及び幹細胞よりなる群から選ばれる細胞の生存を高めるものである、請求項1から6のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
- キメラペプチドが、Bcl−xLの全長を包含する、請求項1から7のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
- キメラペプチドが、細胞死を抑制できるBcl−xLの断片の少なくとも1つを包含する、請求項1から7のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
- i.GVVLLGSLFSRK(配列番号8)、
ii.FELRYRRAFS(配列番号7)、及び
iii.SAINGNPSWHLADSPAVNGATG(配列番号6)、
よりなる群から選ばれるBcl−xLの断片を含有してなる請求項9に記載のキメラポリペプチド。 - GM−CSF受容体に結合するGM−CSFポリペプチドの断片の少なくとも1つを含有してなる請求項1から10のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
- i.APARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQTITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(配列番号19)、
ii.EARRLLNLSRD(配列番号20)、及び
iii.TMMASHYKQHCPPTPET(配列番号4)、
よりなる群から選ばれる断片を含有してなる請求項1から11のいずれかに記載のキメラポリペプチド。 - キメラペプチドが、血液脳関門を通過するポリペプチドの移送を増強するドメインを更に含有してなる請求項1〜12のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 前記ドメインが、TATドメインである、請求項13に記載のキメラポリペプチド。
- GM−CSF−BCL−XLアミノ酸配列(SEQ ID NO:1)に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有している、請求項1〜14の何れか一項に記載のキメラポリペプチド。
- プロテアーゼ抵抗を増強するアミノ酸配列において、変更、翻訳後の修飾又はその他の修飾を包含する、請求項1〜15の何れか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 二量体の形成を促進するアミノ酸配列において、変更、翻訳後の修飾又はその他の修飾を包含する、請求項1〜16の何れか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 変更が、野生型参照配列に関するGM−CSF又はBcl−xLのポリペプチドのアミノ酸配列において、挿入、欠失、ミスセンス又はアンチセンス変異である、請求項16又は17に記載のキメラポリペプチド。
- 融合タンパク質である、請求項1〜18の何れか一項に記載のキメラポリペプチド。
- 親和性標識を含有してなる請求項19に記載のキメラポリペプチド。
- 検出可能なアミノ酸配列を含有してなる請求項19に記載のキメラポリペプチド。
- 請求項1〜21の何れか一項に記載のキメラポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- 核酸分子が、SEQ ID NO:10に記載の核酸配列を有している核酸分子である請求項22に記載の単離された核酸分子。
- SEQ ID NO:10に対して少なくとも80%の核酸配列同一性を有している、請求項23に記載の単離された核酸分子。
- キメラポリペプチドをコードする核酸分子が、異種プロモーターの制御下にある、請求項22〜24の何れか一項に記載の核酸分子。
- 請求項22〜25の何れか一項に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
- 前記ベクターが、発現ベクターである、請求項26に記載のベクター。
- 請求項26又は27に記載のベクターを包含する、宿主細胞。
- 請求項1〜21の何れか一項に記載のキメラポリペプチドの有効量、及び薬学的に許容される賦形剤を含有してなる医薬組成物。
- 請求項1〜21の何れか一項に記載のキメラポリペプチドをコードする核酸分子の有効量、及び薬学的に許容される賦形剤を含有してなる医薬組成物。
- 化学療法剤、放射線療法剤、ホルモン剤、生物学的製剤、抗炎症剤、ドーパミン産生の増強薬剤、抗コリン作用薬、ドーパミン様薬、アマンタジン、抗血栓薬及び血栓溶解剤よりなる群から選ばれる薬剤を更に含んでなる、請求項29又は30に記載の医薬組成物。
- 医薬組成物が、細胞死又はアポトーシスのリスクがある細胞の細胞死を抑制及び/又は生存を高めるものである請求項29〜31のいずれかに記載の医薬組成物。
- 細胞死又はアポトーシスのリスクが、低酸素、虚血、再灌流、脳卒中、パーキンソン病、ルー・ゲーリック病、ハンチントン舞踏病、脊髄性筋萎縮症、脊髄損傷、幹細胞移植の処置、化学療法の治療又は放射線治療に関連するものである請求項32に記載の医薬組成物。
- 核酸分子が請求項26又は27に記載のベクターに挿入されている請求項30〜33の何れか一項に記載の医薬組成物。
- 患者からの生体サンプルの治療前の1つ又はそれ以上の表現型を測定すること、
請求項1〜21の何れか一項に記載のキメラポリペプチド又はそのポリペプチドをコードする核酸の治療有効量を投与後の患者から採取された生体サンプルにおいて、細胞死の抑制剤による初期治療後の1つ又はそれ以上の表現型を測定すること(ここにおける1つ又はそれ以上の表現型の変化が、細胞死の抑制剤治療の効果を示す)、
を含んでなる、対象における細胞の生存を高める治療の効果を評価する方法。 - 患者からの生体サンプルの治療前の1つ又はそれ以上の表現型を測定すること、
請求項1〜21の何れか一項に記載のキメラポリペプチド又はそのポリペプチドをコードする核酸の治療有効量を投与後の患者から採取された生体サンプルにおいて、細胞死の抑制剤による初期治療後の1つ又はそれ以上の表現型を測定すること(ここにおける1つ又はそれ以上の表現型の変化が、疾患が細胞死の抑制剤による治療に対する好ましい臨床応答を有しているであろうことの表れである)、
を含んでなる、細胞死の抑制剤による治療を行うために、細胞死によって特徴付けられる疾患又は障害を有している対象を選択する方法。
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