PT2252627T - Constructos de fusão de domínio lítico e métodos para produzir e utilizar os mesmos - Google Patents

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Leuschner Carola
Alila Hector
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Esperance Pharmaceuticals
Univ Louisiana State
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Description

DESCRIÇÃO
CONSTRUCTOS DE FUSÃO DE DOMÍNIO LITICO E MÉTODOS PARA PRODUZIR E UTILIZAR OS MESMOS
Campo da técnica A presente invenção é definida pelas reivindicações. A invenção refere-se a constructos de fusão conforme definido pelas reivindicações, métodos para utilizar tais constructos de fusão e utilizações de tais constructos de fusão para tratar distúrbios de hiperproliferação, tais como neoplasia, cancros, tumores e malignidades metastáticos e não metastáticos.
Introdução A necessidade de desenvolver novos produtos terapêuticos para o tratamento de tumores primários e metástases é claramente evidente quando a taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes com cancro é considerada: Apenas 10 a 40% dos pacientes com cancro de pulmão, colorretal, de mama e de próstata sobrevivem se diagnosticados com doença metastática distante. Por exemplo, Hansel el al. (2007), Mol Cell Endocrinol., 2007 260 a 262:183 a 179 relatou que cancros de mama e suas metástases podem ser destruídos por conjugados de péptidos líticos in vitro e in vivo.
Sumário A invenção baseia-se, pelo menos em parte, em domínios líticos fundidos ou conjugados a uma porção química de ligação, denominados no presente documento como constructos de fusão. Acredita-se que o contacto de uma célula com um domínio lítico cause a rutura da membrana celular que resulta na morte celular. A porção química de ligação direciona células para destruição pelo domínio lítico, incluindo células proliferativas ou células hiperproliferativas indesejáveis ou anormais, tais como neoplasias, cancros, tumores e malignidades metastáticos e não metastáticos. Várias células malignas, de tumor, cancro e neoplásicas metastáticas e não metastáticas superexpressam recetores ou ligandos. Por exemplo, muitas neoplasias, cancros, tumores e malignidades metastáticos e não metastáticos expressam recetores para hormonas (por exemplo, hormona luteinizante/gonadotrofina coriónica (LH/CG), ou hormona libertadora de hormona luteinizante (LHRH etc.), fatores de crescimento, citocinas, anticorpos etc. que podem ser utilizados como uma porção química de ligação do constructo de fusão.
Os constructos de fusão podem ser projetados para direcionar qualquer célula ou população de células que expressa o sítio de ligação para a porção química de ligação. As porções químicas de ligação tais como ligandos, anticorpos e fragmentos dos mesmos, fatores de crescimento, citocinas, etc. podem ser ligadas a um domínio lítico para fornecer o extermínio direcionado de células que expressam ou contêm recetores, antígenos, anticorpos, ligandos etc. reduzindo ou inibindo, assim, a proliferação ou o crescimento celular.
Os constructos de fusão não exigem que as células se dividam a fim de exterminar as células-alvo. Ademais, não é provável que os constructos de fusão sejam imunogénicos devido ao facto de que os mesmos podem ser produzidos para terem tamanho relativamente pequeno. Adicionalmente, os constructos de fusão exterminam células resistentes a múltiplos fármacos.
Além disso, os constructos de fusão podem ter maior atividade citotóxica (IC50 baixa) em termos de atividade antiproliferativa de células ou atividade de extermínio e baixa atividade hemolítica (HA50) , de modo que a razão entre IC50: HA50 (IC50 /HA50) seja menor do que outros compostos com tais atividades. Por exemplo, os constructos de fusão podem ter maior atividade antiproliferativa de células do que Phor21-pCG-ala, Phor21-GSGGS-pCG-ala, Phor21-ASAAS-3CG-ala ou Phor 14-pCG-ala, conforme confirmado por um valor de IC50 menor; podem ter uma razão entre IC50 /HA50 menor do que Phor2l-pCG-ala, Phor21-GSGGS-pCG-ala, Phor2l-ASAAS-pCG-ala ou Phor 14-pCG-ala; ou têm uma razão entre IC50 /HA50 menor do que cerca de 0,02, 0,01 ou 0,005.
Em conformidade com a invenção, que é revelada nas reivindicações, são fornecidos constructos de fusão que incluem um primeiro e um segundo domínios conforme definido pelas reivindicações. É também descrito no presente documento um constructo de fusão que inclui ou que consiste num primeiro domínio que consiste numa sequência de L- ou D-aminoácidos de 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 resíduos que inclui uma sequência de péptidos selecionada a partir de, por exemplo, KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK e um segundo domínio que inclui ou consiste numa porção química de ligação ou direcionamento. É também descrito no presente documento um constructo de fusão que inclui ou que consiste num primeiro domínio que consiste numa sequência de L- ou D-aminoácidos selecionada a partir de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK e um segundo domínio que inclui ou consiste numa porção química de ligação ou direcionamento. É adicionalmente descrito no presente documento um constructo de fusão que inclui ou que consiste num primeiro domínio que consiste numa sequência de L- ou D-aminoácidos selecionada a partir de, KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK e um segundo domínio que consiste numa sequência de 1 a 25 L- ou D-aminoácidos (por exemplo, porção química de ligação ou direcionamento) distinto do referido primeiro domínio. São também fornecidos no presente documento péptidos isolados e purificados que incluem ou consistem num primeiro domínio. Um péptido isolado ou purificado pode ser KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KF AKF AKKF AKF AKKFAKF OU KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA. Um péptido isolado ou purificado pode ser KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF ou KFAKFAKKFAKFAKKF AKF A que tem um ou mais dos resíduos K substituídos por qualquer um de um resíduo F ou L, um ou mais dos resíduos F substituídos por qualquer um de um resíduo K, A ou L ou um ou mais dos resíduos A substituídos por qualquer um de um resíduo K, F ou L.
Os constructos de fusão incluem uma porção química de ligação que se liga a um recetor, ligando ou um antígeno. Uma porção química de ligação também inclui um ligando, antígeno ou um anticorpo. Os ligandos incluem ou consistem numa molécula que se liga a um recetor, tal como um agonista ou antagonista de recetor. Uma porção química de ligação pode incluir ou consistir numa estrutura linear ou cíclica.
Os exemplos não limitantes específicos de porções químicas de ligação incluem um ou mais aminoácidos (por exemplo, péptidos, polipéptidos, proteínas), ácidos nucleicos e hidratos de carbono. As classes não limitantes específicas das porções químicas de ligação incluem hormonas, análogos de hormona e fragmentos de hormonas e análogos de hormona, fatores de crescimento, citocinas, anticorpos etc. que se ligam a um recetor. Os exemplos não limitantes específicos de hormonas incluem uma hormona libertadora de gonadotrofina ou seus análogos, cadeia beta de hormona luteinizante, hormona luteinizante, gonadotrofina coriónica, subunidade beta de gonadotrofina coriónica, hormona estimulante de melanócitos, estradiol, dietilstilbesterol, lactoferrina, dopamina, somatostatina ou seus análogos, hormona foliculo-estimulante (FSH), glicocorticoide, estrogénio, testosterona, androstenediona, di-hidrotestosterona, desidroepiandrosterona, androgénios, progesterona, hormona estimulante de tiroide (TSH), insulina, catecolaminas, hormona adrenocorticotrópica (ACTH), angiotensina, hormona antidiurética, calcitonina, colecistoquinina, bombesina, hormona libertadora de corticotrofina, gastrina, grelina, glucagon, Hormona Libertadora de Hormona de Crescimento e seus análogos, inibina, orexina, péptido KiSS (GPR54), kisspeptina, Prolactina, Hormona Libertadora de Prolactina, Hormona de Crescimento, Her2/neu, folato, vitamina H, ferritina, Hormona da Paratireoide, Relaxina, Secretina, Hormona Libertadora de Tirotropina, Endotelina, Renina, Lipotropina, melatonina etc. Os exemplos não limitantes específicos de fatores de crescimento são fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento semelhante à insulina 1 e 2 (IGF-1, IGF-2), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), Fator de Crescimento Nervoso (NGF), Fator de Crescimento de Fibroblasto (FGF), Fator de Crescimento Transformador alfa e beta (TGFa, TGF3), Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF), ator de Crescimento de Hepatócito (HGF), ceruloplasmina etc. As classes não limitantes especificas de citocinas ou ligandos são interleucinas (por exemplo interleucina 2, interleucina 17, CD154, ligando Fas etc.), Fatores de Necrose Tumoral (TNFs), interferões etc.
As porções químicas de ligação podem ser opcionalmente expressas numa célula. As células que expressam uma porção química de ligação (por exemplo, recetor, ligando, antígeno, anticorpo) ou que podem ser direcionadas em conformidade com os métodos descritos no presente documento incluem células hiperproliferativas. As células que expressam um recetor, ligando ou antigeno ou que podem ser direcionadas em conformidade com os métodos descritos no presente documento também incluem células de mama, de ovário, uterinas, cervicais, da próstata, testiculares, pancreáticas, da pele, células sanguíneas, adrenais, pituitárias e endométricas. As classes não limitantes específicas de porções químicas de ligação expressas numa célula são recetores para hormonas, citocinas, fatores de crescimento (por exemplo, recetores EGF, Her2/neu, R0R1), ferritina, recetores de transferrina, moléculas de adesão celular etc. Os exemplos não limitantes específicos de antígenos expressos em células proliferativas que podem ser direcionados com anticorpos ou seus fragmentos são CD19, CD20, CD23, CD27, CD28, CD30, CD33, CD40, CD52, CD56, CD70, CD 154, recetores do tipo imunoglobulina etc.). Os antígenos adicionais incluem, por exemplo, antigeno específico para próstata (PSA), antigeno de membrana específico para próstata (PSMA), antigeno carcinoembrionário (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), antigeno específico para próstata (PSA), antigeno de cancro 125 (CA-125) e outras moléculas recetoras que se ligam aos ligandos revelados no presente documento. 0 primeiro e o segundo domínios podem incluir ou consistir num aminoácido ou uma sequência de aminoácidos. Em aspetos particulares, um primeiro ou um segundo domínio tem cerca de 1 a 10, 10 a 20, 15 a 20 (isto é, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos), 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100 ou mais resíduos de aminoácido.
Em um aspeto particular, um primeiro domínio inclui ou consiste numa estrutura alfa-helicoidal anfipática. Em aspetos adicionalmente particulares, um segundo domínio inclui ou consiste numa sequência de aminoácidos apresentada como SYAVALSAQAALARR ou QHWSYGLRPG. 0 primeiro e o segundo domínios podem ser posicionados ou na terminação NH ou na terminação C um em relação com o outro. Assim, o primeiro domínio (péptido lítico) pode ser posicionado na terminação NH em relação com o segundo domínio (porção química de ligação ou ligando), ou o segundo domínio (porção química de ligação ou ligando) pode ser posicionado na terminação C em relação com o primeiro domínio (péptido lítico). 0 primeiro e o segundo domínios podem incluir ou consistir num ou mais D-aminoácidos. Em aspetos particulares, um primeiro domínio tem um D-aminoácido, por exemplo, em qualquer resíduo K, F ou A. 0 primeiro e o segundo domínios podem ser unidos por uma ligação covalente. Por exemplo, um primeiro e um segundo domínio podem ser unidos por um péptido ou um ligante não péptido. Em aspetos particulares, o primeiro e o segundo domínios são unidos por uma sequência de péptidos que tem cerca de 1 a 25 resíduos de aminoácido ou que tem uma cadeia carbónica linear. Em aspetos mais particulares, o primeiro e o segundo domínios são unidos por uma sequência de péptidos que inclui ou consiste num ou mais resíduos de aminoácido A, S ou G. Em aspetos adicionalmente particulares, o primeiro e o segundo domínios são unidos por uma sequência de péptidos que inclui ou que consiste em GSGGS, ASAAS ou CCCCCC. 0 primeiro e o segundo domínios podem incluir ou consistir adicionalmente em domínios adicionais. Assim, em vários aspetos, um constructo de fusão inclui um terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo domínios etc.
Os constructos de fusão incluem ou consistem em formas isoladas e purificadas. Os constructos de fusão também incluem ou consistem numa mistura. Tais misturas incluem composições, tal como uma mistura de constructo de fusão e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável apropriado para a administração a ou contacto in vivo com um indivíduo ou uma mistura de constructo de fusão e um agente imunoestimulante ou antiproliferativo de células.
Os constructos de fusão incluem ou consistem numa forma farmacêutica unitária. Um constructo de fusão pode ser uma dosagem unitária numa quantidade eficaz para tratar um indivíduo que tem proliferação celular indesejável ou um distúrbio de hiperproliferação. Um constructo de fusão pode ser uma dosagem unitária numa quantidade eficaz para tratar um indivíduo que tem uma neoplasia, tumor ou cancro. Um constructo de fusão pode ser uma dosagem unitária numa quantidade eficaz para reduzir a fertilidade de um indivíduo.
Os constructos de fusão podem ser incluídos dentro de kits, opcionalmente com instruções para praticar um método. Um kit pode incluir um constructo de fusão e instruções para reduzir ou inibir a proliferação de uma célula, reduzir ou inibir a proliferação de uma célula hiperproliferativa, reduzir ou inibir a proliferação de uma célula neoplásica, de tumor ou cancro, tratar um indivíduo que tem um distúrbio de hiperproliferação, tratar um indivíduo que tem uma neoplasia, tumor ou cancro, ou reduzir a fertilidade de um animal.
Em conformidade com a invenção, são também fornecidos ácidos nucleicos que codificam constructos de fusão conforme definido pela reivindicação 6, item (b) . É também descrito no presente documento um ácido nucleico que codifica um constructo de fusão que inclui ou que consiste num primeiro domínio que consiste numa sequência de L- ou D-aminoácidos de 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 resíduos que inclui uma sequência de péptidos selecionada a partir de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK e um segundo domínio que inclui ou consiste numa porção química de ligação ou direcionamento. É também descrito no presente documento um ácido nucleico que codifica um constructo de fusão que inclui ou que consiste num primeiro dominio que consiste numa sequência de L- ou D-aminoácidos selecionada a partir de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK e um segundo domínio que inclui ou consiste numa porção química de ligação ou direcionamento. É também descrito no presente documento um ácido nucleico que codifica um constructo de fusão que inclui um primeiro domínio que consiste numa sequência de L- ou D-aminoácidos selecionada a partir de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK e um segundo domínio que inclui ou que consiste numa sequência de 1 a 25 L- ou D-aminoácidos (por exemplo, porção química de ligação ou direcionamento) distinto do referido primeiro domínio. Ácidos nucleicos podem ser incluídos num vetor, tal como um vetor de expressão que, quando expresso numa célula codifica um constructo de fusão. As células hospedeiras podem ser transformadas com um ácido nucleico num vetor, de modo que a célula expresse um constructo de fusão codificado pelo ácido nucleico.
Os constructos de fusão são úteis para, entre outras coisas, reduzir ou inibir a proliferação de uma célula, reduzir ou inibir a proliferação celular, reduzir ou inibir a proliferação de uma célula hiperproliferativa, reduzir ou inibir a proliferação de uma célula neoplásica, de tumor, de cancro ou maligna e tratar a proliferação celular indesejável ou anormal, tais como células hiperproliferativas ou distúrbios de hiperproliferação. Os exemplos não limitantes de distúrbios de hiperproliferação incluem hiperplasia benigna, neoplasias, cancros, tumores e malignidades metastáticos e não metastáticos (por exemplo, um tumor sólido ou líquido, mieloma, linfoma, leucemia, carcinoma, sarcoma, melanoma, neural, reticuloendotelial e hematopoiético). São também fornecidos no presente documento métodos para reduzir ou inibir a proliferação de uma célula; métodos para reduzir ou inibir a proliferação celular; métodos para reduzir ou inibir a proliferação de uma célula hiperproliferativa; e métodos para reduzir ou inibir a proliferação de uma célula neoplásica, de tumor, de cancro ou maligna. Um método pode incluir colocar uma célula em contacto com um constructo de fusão numa quantidade suficiente para reduzir ou inibir a proliferação da célula; colocar uma célula em contacto com um constructo de fusão numa quantidade suficiente para reduzir ou inibir a proliferação celular; colocar uma célula em contacto com um constructo de fusão numa quantidade suficiente para reduzir ou inibir a proliferação da célula hiperproliferativa; e colocar uma célula em contacto com um constructo de fusão numa quantidade suficiente para reduzir ou inibir a proliferação da célula neoplásica, de tumor, de cancro ou maligna.
Em conformidade com a revelação, são adicionalmente fornecidos métodos para reduzir ou inibir seletivamente a proliferação de uma célula que expressa um recetor ou antígeno; reduzir ou inibir seletivamente a proliferação de uma célula hiperproliferativa que expressa um recetor ou antígeno; e reduzir ou inibir seletivamente a proliferação de uma célula neoplásica, de tumor, de cancro ou maligna que expressa um recetor ou antígeno conforme definido pelas reivindicações. Tal método inclui colocar uma célula em contacto com o constructo de fusão numa quantidade suficiente para reduzir ou inibir a proliferação da célula, em que a porção química de ligação do referido péptido liga-se ao recetor, ligando ou antígeno expresso pela célula; colocar uma célula em contacto com o constructo de fusão numa quantidade suficiente para reduzir ou inibir a proliferação da célula hiperproliferativa, em que a porção química de liqação do referido péptido liqa-se ao recetor, liqando ou antígeno expresso pela célula hiperproliferativa; e colocar uma célula em contacto com o constructo de fusão numa quantidade suficiente para reduzir ou inibir a proliferação da célula neoplásica, de tumor, de cancro ou maligna, em que a porção química de ligação do referido constructo de fusão liga-se ao recetor, ligando ou antígeno expresso pela célula.
As células direcionadas em conformidade com os métodos da invenção incluem células que expressam um recetor ou um antígeno, tal como um recetor de hormona, por exemplo, uma hormona esteroide sexual ou gonadal ou recetor de hormona esteroide sexual ou gonadal. As células direcionadas em conformidade com os métodos da invenção também incluem células que expressam um recetor que se liga à hormona libertadora de gonadotrofina I, hormona libertadora de gonadotrofina II, hormona libertadora de hormona luteinizante de lampreia III, cadeia beta de hormona luteinizante, hormona luteinizante, gonadotrofina coriónica, subunidade beta de gonadotrofina coriónica, hormona estimulante de melanócito, estradiol, dietilstilbesterol, dopamina, somatostatina, hormona foilculo-estimulante (FSH), glicocorticoide, estrogénio, testosterona, androstenediona, di-hidrotestosterona, desidroepiandrosterona, progesterona, androgénio, prolactina, hormona libertadora de prolactina, hormona antidiurética, angiotensinas, catecolaminas, fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento semelhante à insulina 1 e 2 (IGF-1, IGF-2), hormona de crescimento (GH), Her2/neu, vitamina H, folato, transferrina, hormona estimulante da tireoide (TSH), hormona da paratireoide (PTH), endotelina, bombesina,
Renina, Lipotropina, hormona melatonina, relaxina, secretina, hormona de crescimento, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), péptido intestinal vasoativo, lactoferrina, uma integrina (por exemplo, alfa-5 beta 3 ou alfa-5 beta 1 integrina), fator de crescimento nervoso, fator de crescimento transformador alfa e beta (TGF-α e β), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), CD-33, CD19, CD20, CD40, R0R1, IGF-1, antigeno carcinoembrionário (CEA), alfa-fetoproteina (AFP), antigeno especifico para próstata (PSA), antigeno de membrana especifico para próstata (PSMA), antigeno de cancro 125 (CA -125), interleucina 17, CD 154, recetor de interleucina-2 (IL-2) solúvel, tirosinase, MAGE-1, MAGE-2, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, glicoproteina (gp) 75, gplOO, beta-catenina, PRAME, MUM-1, ZFP161, Ubiquitina-1, H0X-B6, YB-1, Osteonectina, ILF3, ácido fólico ou um derivado do mesmo, um membro da família de fator de necrose tumoral (TNF), TNF-alfa, TNF-beta (linfotoxina, LT), TRAIL, Fas, LIGHT, 41BB, fator de crescimento transformador alfa, fator de crescimento transformador beta, insulina, ceruloplasmina, HIV-tat, um péptido ou proteína que compreende um motivo de sequência RGD, um monossacárido, dissacárido, oligossacárido, ácido siálico, galactose, manose, fucose ou ácido acetilneuramínico.
Os métodos que também são descritos no presente documento incluem, entre outros, contactar um indivíduo que precisa inibir, reduzir ou impedir a proliferação, sobrevivência, diferenciação, morte ou atividade de uma célula, tal como uma célula hiperprolifertiva ou uma célula com proliferação indesejada. Os indivíduos exemplificativos incluem um indivíduo que tem ou está em risco de ter proliferação celular indesejável ou anormal; um indivíduo que tem ou está em risco de ter uma hiperplasia benigna; ou uma neoplasia, cancro, tumor ou malignidade metastática ou não metastática (por exemplo, um tumor sólido ou líquido, mieloma, linfoma, leucemia, carcinoma, sarcoma, melanoma, neural, reticuloendotelial e neoplasia hematopoiética). São também fornecidos no presente documento métodos para tratar um indivíduo que tem um distúrbio de hiperproliferação e métodos para tratar um indivíduo que tem uma neoplasia, tumor, cancro ou malignidade (metastática, não metastática ou benigna). Um método pode incluir administrar a um indivíduo uma quantidade do constructo de fusão suficiente para tratar o distúrbio de hiperproliferação; e administrar a um indivíduo uma quantidade do constructo de fusão suficiente para reduzir ou inibir a proliferação da neoplasia, tumor, cancro ou malignidade.
Os métodos incluem tratar um indivíduo que tem ou está em risco de ter uma metástase. Por exemplo, uma quantidade de um constructo de fusão eficaz para reduzir ou inibir o espalhamento ou a disseminação de um tumor, cancro ou neoplasia para outros sítios, locais ou regiões dentro do indivíduo. Um método pode reduzir ou inibir a metástase de um tumor ou cancro primário a um ou mais outros sítios, a formação ou o estabelecimento de uma metástase num ou mais outros sítios, locais ou regiões reduzindo ou inibindo, assim, a reincidência de tumor ou cancro ou a progressão do tumor ou cancro. Um método pode reduzir ou inibir o crescimento, a proliferação, a mobilidade ou a invasividade de células de tumor ou cancro que desenvolvimento potencialmente ou de facto metástases (por exemplo, células de tumor disseminadas); pode reduzir ou inibir a formação ou o estabelecimento da metástase que surge a partir de um tumor ou cancro primário a um ou mais outros sítios, locais ou regiões distintas do tumor ou cancro primário; pode reduzir ou inibir o crescimento ou a proliferação de uma metástase num ou mais outros sítios, locais ou regiões distintas do tumor ou cancro primário após a metástase ter- se formado ou ter sido estabelecida; ou pode reduzir ou inibir a formação ou o estabelecimento de metástase adicional após a metástase ter sido formada ou estabelecida. Um método pode reduzir ou inibir a reincidência ou a progressão da neoplasia, tumor, cancro ou malignidade. São também fornecidos no presente documento métodos para reduzir ou inibir a metástase de uma neoplasia, tumor, cancro ou malignidade a outros sitios ou a formação ou o estabelecimento de neoplasia, tumor, cancro ou malignidade metastática em outros sitios distais de uma neoplasia, tumor, cancro ou malignidade primária. Um método pode incluir administrar a um indivíduo uma quantidade do constructo de fusão suficiente para reduzir ou inibir a metástase da neoplasia, tumor, cancro ou malignidade a outros sitios ou a formação ou o estabelecimento de neoplasia, tumor, cancro ou malignidade metastática em outros sitios distais da neoplasia, tumor, cancro ou malignidade primária. A neoplasia, tumor, cancro e malignidade tratáveis em conformidade com a revelação incluem massa celular sólida, células hematopoiéticas ou um carcinoma, sarcoma (por exemplo linfossarcoma, lipossarcoma, osteossarcoma, condrossarcoma, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma ou fibrossarcoma), linfoma, leucemia, adenoma, adenocarcinoma, melanoma, glioma, glioblastoma, meningioma, neuroblastoma, retinoblastoma, astrocitoma, oligodendrocitoma, mesotelioma, reticuloendotelial, neoplasia, tumor, cancro ou malignidade linfática ou hematopoiética (por exemplo, mieloma, linfoma ou leucemia).
Neoplasia, tumor, cancro e malignidade tratáveis em conformidade com a revelação podem estar presentes em ou afetar um pulmão (cancro de pulmão de células pequenas ou de pulmão de células não pequenas), tireoide, cabeça ou pescoço, nasofaringe, garganta, nariz ou seios nasais, cérebro, dorso, mama, glândula adrenal, glândula pituitária, tireoide, linfa, trato gastrointestinal (boca, esófago, estômago, duodeno, ileo, jejuno (intestino delgado), cólon, reto), trato geniturinário (útero, ovário, colo do útero, endométrio, bexiga, testículo, pênis, próstata), rim, pâncreas, fígado, osso, medula óssea, linfa, sangue, músculo, pele ou célula-tronco.
Os métodos podem ser praticados com outros tratamentos ou terapias (por exemplo, ressecção cirúrgica, radioterapia, terapia de radiação ionizante ou guímica, quimioterapia, imunoterapia, terapia térmica local ou regional (hipertermia) ou vacinação). Tais tratamentos e terapias podem ser administrados antes, substancialmente ao mesmo tempo (separadamente ou numa mistura) ou após a administração de um constructo de fusão. Um método pode incluir administrar um tratamento ou terapia antiproliferativa de células, antineoplásica, antitumor, anticancro ou de intensificação imunológica. Um método pode incluir administrar um agente alquilante, antimetabólito, extrato vegetal, alcaloide vegetal, nitrosoureia, hormona, nucleósido ou análogo de nucleótido; ciclofosfamida, azatioprina, ciclosporina A, prednisolona, melfalano, clorambucilo, mecloretamina, busulfano, metotrexato, 6-mercaptopurina, tioguanina, 5-fluorouracilo, citosina arabinósido, 5-azacitidina (5-AZC) e compostos relacionados com 5-azacitidina, bleomicina, actinomicina D, mitramicina, mitomicina C, carmustine, lomustina, semustina, estreptozotocina, hidroxiureia, cisplatina, carboplatina, oxiplatina, mitotano, procarbazina, dacarbazina, taxol, vinblastina, vincristina, doxorrubicina ou dibromomanitol, inibidores de topoisomerase, (irinotecano, topotecano, etopósido, tenipósido), gemcitabina, pemetrexed etc. Célula ou imunoterapias incluem linfócitos, células plasmáticas, macrófagos, células dendríticas, células T, células NK ou células B; um anticorpo, um fator de crescimento celular, um fator de sobrevivência celular, um fator de diferenciação celular, uma citocina ou uma quimiocina (os exemplos são interleucinas IL-2, IL-la, IL-Ιβ, IL-3, IL-6, IL-7, fator estimulante de colónia de granulócitos-macrófagos (GMCSF), IFN-γ, IL-12, TNF-α, ΤΝΡβ, MIP-la, MIP-1β, RANTES, SDF-1, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaxina, eotaxina-2, I-309/TCA3, ATAC, HCC-1, HCC-2, HCC-3, LARC/MIP-3a, PARC, TARC, ΟΚβ, 0Κβ6, 0Κβ7, 0Κβ8, 0Κβ9, ΟΚβΙΙ, 0Κβ12, CIO, IL-8, GROoí, GROβ, ENA-78, GCP-2, PBP/CTAPII^-TG/NAP-2, Mig, PBSF/SDF-1 ou linfotactina) etc.
Os agentes adicionais que são aplicáveis com constructos de fusão são fármacos direcionados ou produtos biológicos tais como anticorpos ou moléculas pequenas. Os exemplos não limitantes de anticorpos monoclonais incluem rituximab (Rituxan®), trastuzumab (Herceptin), bevacizumab (Avastin), cetuximab (Erbitux), alemtuzumab (Campath), panitumumab (Vectibix), ibritumomab tiuxetan (Zevalin), tositumomab (Bexxar) etc. que podem ser utilizados em combinação com, entre outros, um constructo de fusão descrito no presente documento. Outros fármacos direcionados que são aplicáveis para utilização com os constructos de fusão são imatinib (Gleevec), gefitinib (Iressa), bortzomib (Velcade), lapatinib (Tykerb), sunitinib (Sutent), sorafenib (Nevaxar), nilotinib (Tasigna) etc.
Os métodos descritos no presente documento incluem fornecer a um indivíduo um benefício. Um método de tratamento pode resultar na destruição parcial ou completa da massa, volume, tamanho da célula neoplásica, de tumor, de cancro ou maligna ou números de células, estimular, induzir ou aumentar a necrose, lise ou apoptose da célula neoplásica, de tumor, de cancro ou maligna, reduzir o tamanho de volume, a massa celular da neoplasia, tumor, cancro ou malignidade, inibir ou impedir a progressão ou um aumento no volume, massa, tamanho ou números de células da neoplasia, tumor, cancro ou malignidade ou prolonga a expectativa de vida; resulta na redução ou diminuição da gravidade, duração ou frequência de um sintoma adverso ou complicação associada à ou causada pela neoplasia, tumor, cancro ou malignidade; resulta na redução ou diminuição da dor, desconforto, náusea, fraqueza ou letargia; ou resulta em energia aumentada, apetite, mobilidade melhorada ou bem-estar psicológico. São também fornecidos no presente documento métodos para reduzir a fertilidade de um animal; métodos para tratar ou reduzir a endometriose, hiperplasia de próstata benigna, uma fibroide ou pólipo. Um método pode incluir administrar a um animal (por exemplo, mamifero, tal como um ser humano) uma quantidade de um constructo de fusão suficiente para reduzir a fertilidade; administrar a um animal (por exemplo, mamifero, tal como um ser humano) uma quantidade de um constructo de fusão suficiente para tratar ou reduzir a endometriose; administrar a um animal (por exemplo, mamifero, tal como um ser humano) uma quantidade de um constructo de fusão suficiente para tratar ou reduzir a hiperplasia de próstata benigna; e administrar a um animal (por exemplo, mamifero, tal como um ser humano) uma quantidade de um constructo de fusão suficiente para tratar ou reduzir uma fibroide ou pólipo.
Os indivíduos tratáveis em conformidade com os métodos incluem mamíferos. Um indivíduo pode ser um ser humano. Descrição dos desenhos A Figura 1 mostra que LHRH-Phor21 extermina as células de cancro mais rápido do que Phor21-pCG-ala. Células de cancro de mama humanas (MDA-MB-435S.luc, vários números de passagem) foram incubadas com Phor21-pCG-ala ou LHRH-Phor21. A Figura 2 mostra a citotoxicidade à célula MDA-MB-435S.luc (IC50 micromolar) de constructos de fusão pCG-ala que têm 21 (Phor21), 18 (Phorl8 (338983) = CLIP71) e 15 (Phorl5) aminoácidos em seu domínio lítico, em comparação a Phor2l-pCG-ala. A Figura 3 mostra a citotoxicidade a células MDA-MB-435S.luc (IC50 micromolar) de constructos de fusão pCG-ala e LHRH. Os constructos de fusão mais tóxicos a células MDA-MB-435S.luc do que Phor21-3CG-ala são listados à direita da Figura. A Figura 4 mostra a citotoxicidade à célula MDA-MB-435S.luc (IC50 micromolar) de constructos de fusão de LHRH. Os constructos de fusão são: 323033 = Phor21-pCG-ala, 337479 = LHRH-Phor21, 337480 = Phor21-LHRH, 338611 = D-ala-Phor21-LHRH, 338612 = Phorl8-ASAAS-LHRH, 338613 = Phorl8-LHRH, 339385 = D-ala-Phorl8-LHRH e 339347 = Phorl8-Lupron. A Figura 5 mostra a atividade hemolítica aguda (HA50 micromolar) de constructos de fusão e LHRH a células sanguíneas vermelhas humanas em comparação a Phor21^CG-ala. Todos os constructos de fusão tinham atividade hemolítica significativamente menor do que Phor2l^CG-ala, exceto para LHRH-Phor21, Phor21-LHRH e Phorl8-Lupron (QHWSY(D-Leu)LRPNEt = Lupron). A Figura 6 mostra uma comparação da citotoxicidade e da atividade hemolítica. Os péptidos indicados com setas são mais tóxicos às células do que Phor21-pCG-ala. A Figura 7 é um esboço do cronograma de tratamento.
As Figuras 8A a 8J são um resumo das afeções de tumor durante o tratamento e no ponto final do estudo com 3 conjugados de 3CG em comparação a Phor21 não conjugado, Phorl8 não conjugado (338983)= (CLIP71) e um conjugado de (KKKFAFA)3 (338984) . Os códigos de constructo de fusão, 33 = Phor2^-CG-ala; 76 = Phorl8-pCG-ala; 81 = D-ala-Phor21-3CG-ala; 85 = D-ala-Phorl8-LHRH; 47 = Phorl8-Lupron; 13 = Phorl8-LHRH; 11 = D-ala-Phor21-LHRH; 12 = Phorl8-ASAAS-LHRH; 71 = Phorl5-pCG-ala; e 74 = Phorl5-C6-pCG-ala são seguidos pelas quantidades do constructo utilizado no estudo .
As Figuras 9A a 9H mostram o volume de tumor dos grupos de tratamento em comparação à solução salina e os valores de linha de base para A) Phor21-pCG-ala (33) ; B) D-ala-Phor21-LHRH (11); C) Phorl8-Lupron (47); D) Phorl8-ASAAS-LHRH (12); E) Phorl8-LHRH (13); F) (KKKFAFA)3 -LHRH; G) D-ala-Phorl8-LHRH (85) nos períodos de tempo indicados até 30 dias; e H) em comparação à linha de base.
As Figuras 10A a 10E mostram um resumo de afeções de tumor no ponto final do estudo com 5 conjugados de LHRH em comparação a Phor21-pCG-ala para A) Pesos de tumor, B) Alteração de peso de tumor em comparação à linha de base, C) Número total de células de tumor vivas, D) alterações do número total de células de tumor vivas em comparação à linha de base e E) pesos corporais. 338614 = (KKKFAFA) 3 LHRH, 338612 = Phorl8-ASAAS-LHRH, 338613 = Phorl8-LHRH e 339385 = D-ala-Phorl8-LHRH. A Figura 11 mostra células de cancro de ovário (OVCAR 3) que são resistentes a múltiplos fármacos, incubadas com concentrações crescentes de Phor21^CG-ala na presença de Doxorrubicina nas quantidades indicadas e potenciação de extermínio celular por um fator de 200 na maior concentração de doxorrubicina pela combinação. A Figura 12 mostra a citotoxicidade de célula de CHO (Ovário de Hamster Chinês) e TM4 em comparação às células MDA-MB-435S.luc com constructos de fusão de LHRH e Phor21 e PCG e Phor21. As células TM4 são negativas para recetor de LHRH, as células de CHO são negativas para recetor CG, e as células MDA-MB-435S.luc expressam recetores de LHRH e CG. Descrição detalhada A invenção baseia-se, pelo menos em parte, num constructo de fusão que inclui uma porção lítica de primeiro domínio unida ou fundida a uma porção química de ligação a segundo domínio conforme definido pelas reivindicações. Em uma configuração típica, um primeiro domínio de constructo de fusão inclui uma porção lítica que é direta ou indiretamente tóxica a uma célula que pode, assim, reduzir a proliferação ou sobrevivência celular ou estimular, induzir, aumentar ou intensificar a morte, extermínio ou apoptose celular; e um segundo domínio de constructo de fusão inclui uma porção que direciona uma célula, denominada como uma entidade de porção química de ligação. São também fornecidos no presente documento constructos de fusão que incluem ou consistem num primeiro domínio "lítico" e incluem ou consistem num segundo domínio de "direcionamento" ou "ligação". Um constructo de fusão pode incluir um primeiro domínio que consiste numa sequência de L- ou D-aminoácidos de 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 resíduos que inclui uma sequência de péptidos (selecionada a partir de aminoácidos tais como Lisina=K, Fenilalanina = F e Alanina = A) , por exemplo, KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK e um segundo domínio que inclui ou consiste numa porção química de ligação ou direcionamento. Um constructo de fusão pode incluir um primeiro domínio que consiste numa sequência de L- ou D-aminoácidos selecionada a partir de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK e um segundo domínio que inclui ou consiste numa porção química de ligação ou direcionamento. Um constructo de fusão pode incluir ou consistir num primeiro domínio que consiste numa sequência de L- ou D-aminoácidos selecionada a partir de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK e um segundo domínio que consiste numa sequência de 1 a 25 L- ou D-aminoácidos (por exemplo, porção química de ligação ou direcionamento) distinto do referido primeiro domínio.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "fusão" ou "quimérico" e variações gramaticais do mesmo, quando utilizado em referência a um constructo, significa que o constructo contém porções ou secções que são derivadas, obtidas ou isoladas de ou baseiam-se em ou são modeladas em relação com duas entidades moleculares diferentes que são distintas uma da outra e não existem tipicamente juntas na natureza. Isto é, por exemplo, uma porção do constructo de fusão inclui ou consiste numa porção lítica e uma segunda porção do constructo inclui ou consiste numa porção de direcionamento, tal como uma porção química que tem capacidade de ligação, cada um do primeiro e do segundo domínios estruturalmente distintos. Um constructo de fusão pode também ser denominado como um "conjugado", em que o conjugado inclui ou consiste numa porção lítica de primeiro domínio e uma porção química de ligação ou direcionamento de segundo domínio.
Os primeiros domínios e/ou os segundos domínios dos constructos de fusão incluem ou consistem em sequências de aminoácidos (péptidos, polipéptidos, proteínas, lectinas), ácidos nucleicos (ADN, ARN) e hidratos de carbono (sacáridos, ácido siálico, galactose, manose, fucose, ácido acetilneuramínico etc.). Os termos "sequência de aminoácidos", "proteína", "polipéptido" e "péptido" são utilizados de forma intercambiável no presente documento para referirem-se a dois ou mais aminoácidos, ou "resíduos", covalentemente ligados por uma ligação de amida ou equivalente. As sequências de aminoácidos podem ser ligadas por ligações químicas não naturais e de não amida que incluem, por exemplo, aquelas formadas com glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, maleimidas bifuncionais ou N,N'-diciclo-hexilcarbodi-imida (DCC). As ligações de não amida incluem, por exemplo, cetometileno, aminometileno, olefina, éter, tioéter e similares (veja-se, por exemplo, Spatola em Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Volume 7, páginas 267 a 357 (1983), "Peptide and Backbone Modifications", Marcel Decker, NY). 0 primeiro e o segundo domínios de um constructo de fusão ou quimera incluem sequências de L-aminoácidos, sequências de D-aminoácidos e sequências de aminoácidos com misturas de L-aminoácidos e D-aminoácidos. As sequências de aminoácidos do primeiro e do segundo domínios podem ser uma estrutura linear ou cíclica, conjugadas a uma porção química distinta (por exemplo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo etc. domínios), formam ligações de dissulfeto intra ou intermoleculares e também formam multímeros ou oligómeros de ordem mais elevada com uma sequência de aminoácidos igual ou diferente ou outras moléculas.
Os comprimentos exemplificativos dos constructos de fusão são de cerca de 5 a 15, 20 a 25, 25 a 50, 50 a 100, 100 a 150, 150 a 200 ou 200 a 300 ou mais resíduos de aminoácido de comprimento. Um primeiro ou segundo domínio pode incluir ou consistir numa sequência de aminoácidos de cerca de 1 a 10, 10 a 20, 15 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100 ou mais resíduos. Um primeiro domínio pode consistir numa sequência de aminoácidos de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 28 ou mais resíduos.
Os primeiros domínios de constructo de fusão, sozinhos ou em combinação com um segundo domínio, formam opcionalmente uma alfa-hélice anfipática. Uma alfa-hélice anfipática contém principalmente aminoácidos hidrofílicos num lado da alfa-hélice, e o outro lado contém principalmente aminoácidos hidrofóbicos. Já que a alfa-hélice faz uma volta completa a cada 3,6 resíduos, a sequência de aminoácidos de uma alfa-hélice anfipática alterna entre resíduos hidrofílicos e hidrofóbicos a cada 3 a 4 resíduos. É previsto que um padrão ou motivo de repetição PNNPNNP forme uma alfa-hélice anfipática em que P representa um resíduo de aminoácido positivamente carregado, e N um resíduo de aminoácido neutro. Um padrão de repetição PNNPNNP fornece um sítio de ligação catiónico para o péptido lítico a uma membrana celular negativamente carregada e um sítio hidrofóbico para interação/penetração da membrana. Os constructos de fusão incluem, portanto, primeiros domínios com um ou mais padrões ou motivos de repetição PNNPNNP ininterruptos ou um ou mais padrões ou motivos de repetição PNNPNNP interrompidos que podem formar uma alfa-hélice anfipática. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos de 15 ou 18 resíduos, tais como KFAKFAKKFAKFAKK e KFAKFAKKFAKFAKKFAK, tem motivos de repetição PNNPNNP ininterruptos e interrompidos.
Um segundo domínio de constructo de fusão, tal como uma porção quimica de ligação ou direcionamento, inclui ou consiste num ligando, anticorpo (ou um fragmentos de ligação a antigeno do mesmo), antígeno, integrina, recetor de integrina (por exemplo, proteínas ou péptidos contendo motivo de sequência "RGD" e componentes que podem estar presentes na matriz extracelular (ECM), tais como mono-, di- ou oligossacáridos, ácido siálico, galactose, manose, fucose, ácido acetilneuramínico) , fator de crescimento, citocina, quimiocina e porções químicas de direcionamento e ligação que se ligam a recetores, anticorpos, antígenos, integrinas, recetores de integrina (por exemplo, proteínas ou péptidos contendo motivo de sequência "RGD" e componentes que podem estar presentes na matriz extracelular (ECM) , tais como mono-, di- ou oligossacáridos, ácido siálico, galactose, manose, fucose, ácido acetilneuramínico), recetores de fator de crescimento, recetores de citocina e recetores quimiocina.
Um "recetor" está tipicamente presente em (por exemplo, um recetor de membrana) ou dentro de uma célula. Um recetor pode associar-se à superfície da membrana celular ou atravessar a membrana celular. Por exemplo, uma proteína recetora pode ter um domínio transmembranar que atravessa a membrana celular, opcionalmente com uma porção que é citoplasmática ou extracelular ou ambos. Os recetores incluem, portanto, recetores nativos de comprimento completo contendo uma porção extracelular, transmembranar ou citoplasmática, assim como formas truncadas ou fragmentos das mesmas (por exemplo, uma porção extracelular, transmembranar ou citoplasmática ou subsequência do recetor sozinho ou em combinação). Por exemplo, um recetor solúvel não tem tipicamente uma transmembrana e pode também não ter, opcionalmente, toda ou uma parte da região extracelular ou citoplasmática nativa (se estiver presente no recetor nativo). Tais formas e fragmentos de recetor truncado podem reter ligação pelo menos parcial a um ligando.
Os domínios de porção química de direcionamento e ligação dos constructos de fusão incluem ou consistem em qualquer entidade que se liga a um recetor, denotado como ligando de recetor, especifica ou não especificamente. Os exemplos não limitantes de porções químicas de direcionamento e ligação incluem, portanto, hormona, um análogo de hormona, um fragmento de uma hormona ou análogo de hormona que se liga a um recetor de hormona, um fator de crescimento, análogo de fator de crescimento, um fragmento de um fator de crescimento ou análogo de fator de crescimento que se liga a um recetor, um recetor de hormona ou um ligando que se liga a uma hormona ou a um recetor de hormona e porções químicas de direcionamento e ligação que se ligam a uma hormona, um análogo de hormona, um fragmento de uma hormona ou análogo de hormona que se liga a um recetor de hormona, um recetor de hormona ou um ligando que se liga a uma hormona ou a um recetor de hormona, fator de crescimento, análogo de fator de crescimento, um fragmento de um fator de crescimento ou análogo de fator de crescimento que se liga a um recetor, um recetor de fator de crescimento ou um ligando que se liga a um fator de crescimento ou a um recetor de fator de crescimento etc.
As hormonas exemplificativas úteis como porções químicas de ligação incluem hormona libertadora de gonadotrofina I, hormona libertadora de gonadotrofina II, hormona libertadora de hormona luteinizante de lampreia III, cadeia beta de hormona luteinizante, hormona luteinizante (LH), gonadotrofina coriónica (CG), subunidade beta de gonadotrofina coriónica (β- ou beta-CG), hormona estimulante de melanócitos, estradiol, dietilstilbesterol, dopamina, somatostatina, hormona folículo-estimulante (FSH), glicocorticoides, estrogénios, testosterona, androstenediona, di-hidrotestosterona, desidroepiandrosterona, progesteronas, androgénioss e derivados dos mesmos. Os recetores de hormona exemplificativos úteis como porções químicas de ligação incluem recetor de hormona libertadora de gonadotrofina I, recetor de hormona libertadora de gonadotrofina II, recetor de hormona libertadora de hormona luteinizante de lampreia III, recetor de hormona luteinizante, recetor de gonadotrofina coriónica, recetor de hormona estimulante de melanócitos, recetor de estradiol, recetor de dopamina, recetor de somatostatina, recetor de hormona folículo-estimulante (FSH), recetor de fator de crescimento epidérmico (EGF), recetor de hormona de crescimento (GH) , recetor de Her2-neu, recetor de hormona glicocorticoide, recetor de estrogénio, recetor de testosterona, recetor de progesterona e recetor de androgénio.
Os fatores de crescimento exemplificativos incluem fator de crescimento epidérmico (EGF), hormona de crescimento (GH) e Her2-neu. Os recetores de fator de crescimento exemplificativos incluem recetor de fator de crescimento epidérmico (EGF), recetor de hormona de crescimento (GH) e recetor de Her2-neu, IGF-1.
Os exemplos não limitantes específicos de porções químicas de direcionamento ou ligação incluem LHRH, fragmentos funcionais (de ligação) de LHRH das mesmas, análogos de LHRH e pCG, fragmentos funcionais (de ligação) de βΟΘ das mesmas e análogos de pCG. LHRH é um ligando completamente funcional e pode produzir efeitos farmacológicos através da interação de recetor de ligando, tal como a ativação de trajetórias de transdução de sinal. pCG-ala é um fragmento de hCG que pode se ligar à membrana celular sem produzir qualquer efeito farmacológico. Os exemplos não limitantes específicos de porções químicas de direcionamento ou ligação incluem ou consistem numa sequência de aminoácidos dentro ou apresentada como: SYAVALSAQAALARR; SYAVALSAQAALARRA, que são fragmentos de PCG, e QHWSYGLRPG, que é uma sequência de LHRH.
As porções químicas de direcionamento e ligação incluem adicionalmente antigenos para ligandos expressos exclusiva ou preferencialmente em células neoplásicas, de tumor ou de cancro e vasos linfáticos ou sanguíneos associados às células neoplásicas, de tumor ou de cancro. Tais antigenos podem ser convenientemente denominados como "antigenos associados a tumor" ou "TAA" e incluem antígeno carcinoembrionário (CEA), alfa-fetoproteína(AFP), antígeno específico para próstata (PSA), antígeno de membrana específico para próstata (PSMA), CA-125 (cancro de ovário epitelial residual), recetor de interleucina-2 (IL-2) solúvel, RAGE-1, tirosinase, MAGE-1, MAGE-2, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, glicoproteína (gp) 75, gplOO, beta-catenina, PRAME, MUM-1, ZFP161, Ubiquilina-1, H0X-B6, YB-1, Osteonectina e ILF3, IGF-1, para citar alguns. Outros antigenos que podem ser direcionados são CD19, CD20, CD23, CD27, CD28, CD30, CD33, CD40, CD52, CD56, CD70, CD154 recetores semelhantes à imunoglobulina etc.).
As porções químicas de direcionamento e ligação incluem adicionalmente transferrina, ácido fólico e derivados do mesmo (por exemplo, folato) e membros da família de fator de necrose tumoral (TNF) e recetores de TNF, tais como TNF-alfa, TNF-beta (linfotoxina, LT), TRAIL, Fas, LIGHT, 4IBB.
Os constructos de fusão em que um segundo domínio inclui ou consiste num domínio de direcionamento ou ligação podem ligar-se a uma célula que produz ou expressa um antígeno, recetor ou ligando, integrina, anticorpo ou antigeno ou TAA ao qual o segundo domínio liga-se. Os exemplos não limitantes de células incluem células hiperproliferativas e células que exibem hiperproliferação anormal ou indesejável. Em exemplos não limitantes particulares, tais células incluem células neoplásicas, de cancro, de tumor e malignas metastáticas e não metastáticas, assim como células neoplásicas, de cancro, de tumor e malignas disseminadas e células neoplásicas, de cancro, de tumor e malignas inativas. As células que expressam um antígeno, recetor, ligando, integrina, TAA, etc. a níveis elevados em relação com células normais ou não hiperproliferativas fornecem seletividade a tais células. Assim, uma porção química de ligação ou direcionamento pode ligar-se a um antígeno, recetor, ligando, integrina ou TAA que é expresso em ou produzido por uma célula hiperproliferativa (por exemplo, neoplasias, cancros, tumores e malignidades metastáticos e não metastáticos e células neoplásicas, de cancro, de tumor e malignas disseminadas e inativas), mas não detetavelmente expressa e é produzido ou expresso a níveis relativamente mais baixos por uma célula normal ou não hiperproliferativa, direcionando assim preferencialmente as células hiperproliferativas. Os tipos de célula e tecido não limitantes exemplificativos que expressam um antígeno, recetor, ligando, integrina ou TAA incluem uma célula da mama, do ovário, uterina, cervical, da próstata, testicular, adrenal, pituitária, pancreática, hepática, gastrointestinal, da pele, do músculo ou endometrial.
Os exemplos adicionais de porções quimicas de ligação incluem anticorpos e fragmentos de anticorpo. Um "anticorpo" refere-se a qualquer molécula de imunoglobulina monoclonal ou policlonal, tais como IgM, IgG, IgA, IgE, IgD e qualquer subclasse das mesmas. As subclasses exemplif icat ivas para IgG são IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4. Os anticorpos incluem aqueles produzidos por ou expressos em células, tais como células B. Um fragmento ou subsequência de anticorpo refere-se a uma porção de um anticorpo de comprimento completo que retém capacidade de ligação ao antigeno pelo menos parcial de um anticorpo de comprimento completo de comparação. Os fragmentos de anticorpo exemplificativos incluem Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fv de cadeia única (scFv), Fvs ligado a dissulfeto (sdFv), VL, VH, (Fab3) triespecifico, (Fab2) biespecifico, diabody ( (VL-VH) 2 ou (VH-VL) 2) , triabody (trivalente) , tetrabody (tetravalente) , minibody ((scFv-CH3) 2) , Fv de cadeia única biespecifico (Bis-scFv), IgGdeltaCH2, scFv-Fc, (scFv)2-Fc ou outro fragmento de ligação ao antigeno de uma imunoglobulina intacta.
Os constructos de fusão incluem aqueles com um primeiro domínio na terminação amino e um segundo domínio na terminação carboxilo. Os constructos de fusão também incluem aqueles com um primeiro domínio na terminação carboxilo e um segundo domínio na terminação amino. Quando domínios adicionais estão presentes (por exemplo, terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo etc. domínios), um primeiro domínio é posicionado na terminação NH2 em relação com um segundo domínio, ou um segundo domínio é posicionado na terminação NH2 em relação com um primeiro domínio.
As subsequências e substituições de aminoácidos das várias sequências apresentadas no presente documento, tais como KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK ou uma porção química de ligação, são também incluídas. Uma subsequência de um primeiro ou segundo domínio pode ter pelo menos 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 35 ou mais resíduos de aminoácido. São também descritas no presente documento modificações ou variações, tais como substituições, adições ou deleções de um primeiro ou um segundo domínio ou tanto o primeiro quanto o segundo domínios. Assim, um constructo de fusão que inclui um primeiro ou um segundo domínio de sequência de péptidos pode incorporar qualquer número de substituições conservativas ou não conservatives de aminoácidos, contanto que tais substituições não destruam a atividade (lítica ou de ligação) do primeiro ou do segundo domínios. Assim, por exemplo, uma porção lítica modificada (primeiro domínio) pode reter atividade lítica pelo menos parcial, tal como extermínio ou apoptose celular, de um primeiro domínio não modificado, e uma porção química de ligação modificada ou mimético da mesma pode reter pelo menos uma atividade de ligação parcial de uma porção química de ligação não modificada.
Uma "substituição conservativa" é uma substituição de um aminoácido por um resíduo biológica, química ou estruturalmente similar. Biologicamente similar significa que a substituição é compatível com uma atividade biológica, por exemplo, atividade lítica. Estruturalmente similar significa que os aminoácidos têm cadeias laterais com comprimento similar, tal como alanina, glicina e serina, ou que têm tamanho similar, ou a estrutura de um primeiro ou segundo domínio ou domínio adicional é mantida, tal como uma alfa-hélice anfipática. Similaridade química significa que os resíduos têm a mesma carga ou são hidrofílicos ou hidrofóbicos. Os exemplos particulares incluem a substituição de um resíduo hidrofóbico, tal como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro, ou a substituição de um resíduo polar por outro, tal como a substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por aspártico ou glutamina por asparagina, serina por treonina, etc. Ensaios de rotina podem ser utilizados para determinar se uma variante de constructo de fusão tem atividade, por exemplo, atividade lítica ou atividade de ligação.
Os exemplos específicos incluem uma substituição ou deleção de um ou mais aminoácidos (por exemplo, 1 a 3, 3a 5, 5 a 10, 10 a 20 ou mais) resíduos de um primeiro ou segundo domínio de péptido. Um constructo de fusão modificado por ter uma sequência de péptidos com 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou mais de identidade com uma sequência de referência (por exemplo, um primeiro domínio, tal como KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA OU KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK ou um segundo domínio tal como uma porção química de ligação).
Um constructo de fusão pode incluir um primeiro dominio de péptido que inclui ou consiste numa sequência de L- ou D-aminoácidos de 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 resíduos que inclui um péptido selecionado a partir de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK que tem um ou mais dos resíduos K substituídos por um resíduo F ou L, um ou mais dos resíduos F resíduos substituídos por um residuo K, A ou L ou um ou mais dos resíduos A substituídos por um resíduo K, F ou L. Um constructo de fusão inclui um primeiro domínio de péptido que consiste numa sequência de L- ou D-aminoácidos selecionada a partir de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK que tem um ou mais dos resíduos K substituídos por um resíduo F ou L, um ou mais dos resíduos F substituídos por um resíduo K, A ou L ou um ou mais dos resíduos A substituídos por um resíduo K, F ou L; e um segundo domínio de péptido que inclui ou consiste numa porção química de ligação. Um constructo de fusão pode incluir ou consistir num primeiro domínio de péptido que consiste numa sequência de L- ou D-aminoácidos selecionada a partir de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KF AKF AKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK que tem um ou mais dos resíduos K substituídos por qualquer um de um resíduo F ou L, um ou mais dos resíduos F substituídos por qualquer um de um resíduo K, A ou L ou um ou mais dos resíduos A substituídos por qualquer um de um resíduo K, F ou L e um segundo domínio de péptido que consiste numa sequência de 1 a 25 L- ou D-aminoácidos (por exemplo, porção química de ligação) distinto do primeiro domínio.
Os termos "identidade" e "homologia" e variações gramaticais dos mesmos significam que as duas ou mais entidades referenciadas são iguais. Assim, quando duas sequências de aminoácidos são idênticas, as mesmas têm a mesma sequência de aminoácidos. "Áreas, regiões ou domínios de identidade" significam que uma porção de duas ou mais entidades referidas são iguais. Assim, quando duas sequências de aminoácidos são idênticas ou homólogas em relação com uma ou mais regiões de sequência, as mesmas compartilham identidade nessas regiões. 0 termo "complementar", quando utilizado em referência a uma sequência de ácido nucleico significa que as regiões referidas são 100% complementares, isto é, exibem 100% de emparelhamento de base sem nenhuma incompatibilidade.
Devido à variação na quantidade de conservação de sequência entre proteínas estrutural e funcionalmente relacionadas, a quantidade de identidade de sequência exigida para reter uma função ou atividade (por exemplo, lítica ou de ligação) depende da proteína, da região e da função ou atividade dessa região. Por exemplo, para uma sequência de péptidos lítica, múltiplos padrões ou motivos de repetição de sequência PNNPNNP podem estar presentes, mas um ou mais padrões ou motivos de repetição de sequência PNNPNNP interrompidos ou não interrompidos não precisam estar presentes. A extensão da identidade entre duas sequências pode ser verificada utilizando um programa de computador e algoritmo matemático conhecido na técnica. Tais algoritmos que calculam a identidade (homologia) de sequência percentual geralmente consideram lacunas e incompatibilidades de sequência ao longo da região de comparação. Por exemplo, um algoritmo de pesquisa BLAST (por exemplo, BLAST 2.0) (veja-se, por exemplo, Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215:403 (1990), publicamente disponível através do NCBI) tem parâmetros exemplificativos da seguinte forma: Incompatibilidade -2; abertura de lacuna 5; extensão de lacuna 2. Para comparações de sequências de polipéptidos, um algoritmo BLASTP é tipicamente utilizado em combinação com uma matriz de pontuação, tal como PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 ou BLOSUM 50. Programas de comparação de sequências FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) e SSEARCH são também utilizados para quantificar a extensão da identidade (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185 (2000); e Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195 (1981)). Programas para quantificar a similaridade estrutural de proteína que utilizam mapeamento topológico com base em Delaunay foram também desenvolvidos (Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)).
Os resíduos individuais e o primeiro e segundo domínios e domínios adicionais podem ser unidos por uma ligação covalente ou não covalente. Os exemplos não limitantes de ligações covalentes são ligações de amida, ligações químicas não naturais e de não amida que incluem, por exemplo, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, maleimidas bifuncionais, N,N'-diciclo-hexilcarbodi-imida (DCC) ou N,N'-di-isopropilcarbodi-imida (DIC) . Os grupos de ligação alternativos às ligações de amida incluem, por exemplo, cetometileno (por exemplo, C (=0)-CH2- for —C (=0)—NH—), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (CH=CH), éter (CH2-0) , tioéter (CH2-S) , tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tioamida ou éster (veja-se, por exemplo, Spatola (1983) em Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Volume 7, páginas 267 a 357, "Peptide and Backbone Modifications", Marcel Decker, NY). 0 primeiro e o segundo domínios podem ser fundidos ou unidos imediatamente adjacentes um ao outro por uma ligação covalente ou uma não covalente. 0 primeiro e o segundo domínios podem ser separados por uma região de intervenção, tal como uma articulação, espaçador ou ligante posicionado entre um primeiro e um segundo domínios. Um primeiro e um segundo domínios podem ser unidos por uma cadeia carbónica. Cadeias de múltiplos carbonos incluem ácidos carboxílicos (por exemplo, ácidos dicarboxílicos) tais como ácido glutárico, ácido succínico e ácido adípico.
Um primeiro e um segundo domínios podem ser unidos por uma articulação, espaçador ou ligante de aminoácido, péptido ou não péptido posicionado entre o primeiro e o segundo domínios. As sequências de articulação, espaçador ou ligante de péptido podem ter qualquer comprimento, mas estão tipicamente na faixa de cerca de 1 a 10, 10 a 20, 20 a 30, 30 a 40 ou 40 a 50 resíduos de aminoácido. Uma articulação, espaçador ou ligante de péptido posicionado entre um primeiro e um segundo domínio pode ter de 1 a 25 resíduos de L- ou D-aminoácido ou 1 a 6 resíduos de L- ou D-aminoácido. Os resíduos de aminoácido particulares que são incluídos nas sequências posicionadas entre o primeiro e o segundo domínios incluem um ou mais dos resíduos de aminoácido C, A, S ou G. Os exemplos não limitantes específicos de péptidos posicionados entre o primeiro e o segundo domínios incluem uma sequência dentro de ou apresentada como: GSGGS, ASAAS ou CCCCCC. Os derivados de aminoácidos e péptidos podem ser posicionados entre o primeiro e o segundo domínio. Um exemplo não limitante específico de um derivado de aminoácido é um derivado de lisina ou um ligante de 6 carbonos tal como ácido a-amino-caproico.
Os constructos de fusão com ou sem uma articulação, espaçador ou ligante ou um terceiro, quarto, quinte, sexto, sétimo etc. domínios podem ser inteiramente compostos de aminoácidos naturais ou aminoácidos sintéticos não naturais ou análogos de aminoácido ou podem incluir formas derivadas. Um constructo de fusão pode incluir num primeiro ou num segundo domínios um ou mais D-aminoácidos substituídos por L-aminoácidos, misturas de D-aminoácidos e L-aminoácidos ou uma sequência composta inteiramente de resíduos de D-aminoácido.
Os constructos de fusão podem conter qualquer combinação de componentes estruturais não naturais que são tipicamente de três grupos estruturais: a) grupos de ligação de resíduo diferentes das ligações ligadas por amida naturais ("ligação de péptido"); b) resíduos não naturais no lugar de resíduos de aminoácido de ocorrência natural; ou c) resíduos que induzem imitação estrutural secundária, isto é, induzem ou estabilizam uma estrutura secundária, por exemplo, uma conformação de alfa-hélice. Os constructos de fusão incluem estruturas cíclicas tal como uma ligação de amida de extremidade a extremidade entre as terminações amino e carbóxi da molécula ou ligação (ou ligações) de dissulfeto intra ou intermolecular. Os constructos de fusão podem ser modificados in vitro ou in vivo, por exemplo, modificados de modo pós-traducional para incluir, por exemplo, resíduos de açúcar ou hidrato de carbono, grupos fosfato, ácidos graxos, lípidos etc.
Os exemplos específicos de uma adição incluem um terceiro, um quarto, um quinto, um sexto ou um sétimo domínio. Os constructos de fusão com um primeiro e um segundo domínio incluem, portanto, um ou mais domínios adicionais (terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo etc.) covalentemente ligados aos mesmos para conferir uma função ou atividade distinta ou complementar. Os domínios exemplificativos adicionais incluem domínios que facilitam o isolamento que incluem, por exemplo, péptidos quelantes de metal tais como tratos de poli-histidina e nódulos de histidina-triptofano que permitem a purificação em metais imobilizados; domínios de proteína A que permitem a purificação na imunoglobulina imobilizada; e o domínio utilizado no sistema de purificação por extensão/afinidade FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA) . A inclusão opcional de uma sequência de clivagem tal como Fator Xa ou enteroquinase entre um domínio de purificação e o constructo de fusão pode ser utilizada para facilitar a purificação. Por exemplo, um vetor de expressão pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que codifica constructo de fusão ligada a seis resíduos de histidina seguidos por uma tiorredoxina e um sítio de clivagem de enteroquinase. Os resíduos de histidina facilitam a deteção e a purificação do constructo de fusão, enquanto que o sítio de clivagem de enteroquinase fornece um meio para purificar o constructo do restante da proteína (veja-se, por exemplo, Kroll, ADN Cell. Biol. 12:441 (1993)). A atividade de constructo de fusão pode ser afetada por vários fatores, e, portanto, os constructos de fusão podem ser projetados ou otimizados levando em consideração um ou mais desses fatores. Tais fatores incluem, por exemplo, comprimento de um constructo de fusão que pode afetar a toxicidade a células. Particularmente, citotoxicidade aumentada foi observada quando Phor21-pCG-ala e Phor21 foram comparados a Phorl4-3CG-ala. A atividade de extermínio celular de domínios de péptido líticos formadores de alfa-hélice pode também depender da estabilidade da hélice, articulação e espaçadores podem afetar a interação membranar de um primeiro domínio e a estrutura helicoidal de um domínio lítico de péptido. Por exemplo, constructos de fusão mais curtos, tais como constructos menores do que 21 aminoácidos que incluem opcionalmente um espaçador ou articulação, podem exibir citotoxicidade aumentada devido à estabilidade de hélice aumentada. Particularmente, espaçadores tais como ASAAS e ácido 6-aminocaproico tendem a aumentar a toxicidade de constructos de fusão mais curtos. A carga de domínios de péptido líticos que é determinada em parte pelos resíduos de aminoácido particulares presentes no domínio também afeta a potência de extermínio celular. 0 posicionamento da porção química de ligação em relação com o domínio lítico (terminação N ou C) pode também afetar a atividade de extermínio celular dos constructos de fusão. Por exemplo, uma porção química de ligação posicionada na terminação C em relação com o domínio lítico teve maior atividade de extermínio celular do que se fosse posicionada na terminação N em relação com o domínio lítico. A meia-vida in vivo de constructo de fusão pode ser aumentada construindo-se domínios de péptido de constructo de fusão com um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural ou derivados. Por exemplo, os constructos de fusão com D-aminoácidos (por exemplo, até 30% ou mais de todos os resíduos são D-enantiómeros) são resistentes à proteólise sérica e, portanto, podem ser ativos por tempos mais longos aumentando, assim, a potência in vivo. Ademais, a construção de domínios de péptido de constructo de fusão com um ou mais aminoácidos de ocorrência não natural ou derivados pode reduzir a atividade hemolítica. Tais constructos de fusão com D-enantiómeros também têm uma maior tendência a serem monoméricos em solução- os mesmos não se agregam significativamente. São também fornecidos no presente documento constructos de fusão que têm maior atividade antiproliferativa de células do que um ou mais dos Phor21-Phor21-GSGGS^CG-ala, Phor21-ASAAS-pCG-ala ou Phor 14-pCG-ala, conforme verificado por um valor de IC50 mais baixo que representa a quantidade de constructo de fusão exigida para alcançar a citotoxicidade celular. São também fornecidos no presente documento constructos de fusão que têm menos atividade hemolítica, conforme representado pela razão entre IC50 /HA50 (atividade hemolítica) , do que Phor21^CG-ala, Phor21-GSGGS^CG-ala, Phor21-ASAAS^CG-ala ou Phor 14-pCG-ala. São adicionalmente fornecidos no presente documento constructos de fusão que têm uma atividade hemolítica, conforme representado pela razão entre IC50 /HA50 (atividade hemolítica) , menor do que cerca de 0,02, 0,01 ou 0,005. As condições de ensaio representativas para determinar a citotoxicidade celular e a atividade hemolítica são apresentadas no Exemplo 1.
Os péptidos e peptidomiméticos podem ser produzidos e isolados utilizando os métodos conhecidos na técnica. Os péptidos podem ser sintetizados, inteiros ou em parte, utilizando métodos químicos conhecidos na técnica (veja-se, por exemplo, Caruthers (1980). Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215; Horn (1980); e Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA) . A síntese de péptido pode ser realizada utilizando vários conjuntos de procedimentos de fase sólida (veja-se, por exemplo, Roberge Science 269:202 (1995); Merrifield, Methods
Enzymol. 289:3(1997)), e a síntese automatizada pode ser alcançada, por exemplo, utilizando o Sintetizador de Péptido ABI 431 A (Perkin Elmer) em conformidade com as instruções do fabricante. Os péptidos e imutações de péptido podem também ser sintetizados utilizando metodologias combinatórias. Os resíduos e polipéptidos sintéticos que incorporam miméticos podem ser sintetizados utilizando uma variedade de procedimentos e metodologias conhecidos na técnica (veja-se, por exemplo, Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman, et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY). Os péptidos modificados podem ser produzidos por métodos de modificação química (veja-se, por exemplo, Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440 (1997); Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19:373 (1995); e Blommers, Biochemistry 33:7.886 (1994). São também fornecidos no presente documento ácidos nucleicos que codificam os constructos de fusão descritos no presente documento e vetores que incluem o ácido nucleico que codifica os constructos de fusão. Um ácido nucleico pode codificar um constructo de fusão que inclui um primeiro domínio que consiste numa sequência de aminoácidos de 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 resíduos que inclui uma sequência de péptidos selecionada a partir de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKF AKF AKKF AKF AK e um segundo domínio que inclui ou consiste numa porção química de ligação ou direcionamento. Um ácido nucleico pode codificar um constructo de fusão que inclui um primeiro domínio que consiste numa sequência de aminoácidos selecionada a partir de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK e um segundo domínio que inclui ou consiste numa porção química de ligação ou direcionamento. Um ácido nucleico pode codificar um constructo de fusão que inclui ou consiste num primeiro domínio que consiste numa sequência de aminoácidos selecionada a partir de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK e um segundo domínio que consiste numa sequência de 1 a 25 aminoácidos (por exemplo, porção química de ligação ou direcionamento) distinto do referido primeiro domínio. Ácido nucleico, que pode também ser denominado no presente documento como um gene, polinucleótido, sequência de nucleótido, iniciador, oligonucleótido ou sonda refere-se a polímeros contendo purina e pirimidina naturais ou modificados de qualquer comprimento, ou polirribonucleótidos ou polidesoxirribonucleótido ou polirribo-polidesoxirribo nucleótidos misturados e formas α-anoméricas dos mesmos. Os dois ou mais polímeros contendo purina e pirimidina são tipicamente ligados por uma ligação de fosfoéster ou análogo da mesma. Os termos podem ser utilizados de maneira intercambiável para referirem-se a todas as formas de ácido nucleico, incluindo ácido desoxirribonucleico (ADN) e ácido ribonucleico (ARN). Os ácidos nucleicos podem ser de fita simples, duplos ou triplos, lineares ou circulares. Os ácidos nucleicos incluem ADN genómico, cADN e antissenso. 0 ácido nucleico ARN pode ser mARN emendado ou não emendado, rARN, tARN ou antissenso. Os ácidos nucleicos incluem de ocorrência natural, sintéticos, assim como análogos e derivados de nucleótido.
Como um resultado da degenerescência do código genético, ácidos nucleicos incluem sequências degeneradas em relação com as sequências que codificam os constructos de fusão descritos no presente documento. Assim, sequências de ácidos nucleicos degeneradas que codificam constructos de fusão são fornecidas. 0 ácido nucleico pode ser produzido utilizando qualquer um de uma variedade de métodos de síntese química e clonagem padrão conhecidos e pode ser alterado intencionalmente por mutagénese sítio-dirigida ou outros conjuntos de procedimentos conhecidos por um perito na especialidade. A pureza dos polinucleótidos pode ser determinada através de seguenciação, eletroforese em gel, espectrometria UV.
Os ácidos nucleicos podem ser inseridos num constructo de ácido nucleico em que a expressão do ácido nucleico é influenciada ou regulada por um "elemento de controlo de expressão", denominado no presente documento como uma "cassete de expressão". 0 termo "elemento de controlo de expressão" refere-se a um ou mais elementos de sequência de ácidos nucleicos que regulam ou influenciam a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos a qual os mesmos são operacionalmente ligados. Um elemento de controlo de expressão pode incluir, conforme apropriado, promotores, intensificadores, terminadores de transcrição, silenciadores de gene, um codão inicial (por exemplo, ATG) na frente de um gene que codifica proteína etc.
Um elemento de controlo de expressão operacionalmente ligado a uma sequência de ácidos nucleicos controla a transcrição e, conforme apropriado, a tradução da sequência de ácidos nucleicos. 0 termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma justaposição em que os componentes referidos estão numa relação que permite que os mesmos funcionem da maneira pretendida. Tipicamente, os elementos de controlo de expressão são justapostos nas extremidades 5' ou 3' dos genes, mas podem também ser intrónicos.
Os elementos de controlo de expressão incluem elementos que ativam a transcrição constitutivamente, que são induzíveis (isto é, exigem um sinal externo para a ativação) ou desrepressível (isto é, exigem um sinal para desativar a transcrição; quando o sinal não estivar mais presente, a transcrição é ativada ou "desreprimida"). São também incluídos nas cassetes de expressão descritas no presente documento elementos de controlo suficientes para tornar a expressão génica controlável para tipos de célula ou tecidos específicos (isto é, elementos de controlo específicos para tecido). Tipicamente, tais elementos são localizados a montante ou a jusante (isto é, 5' e 3') da sequência de codificação. Os promotores são geralmente posicionados em 5' da sequência de codificação. Os promotores, produzidos por conjuntos de procedimentos sintéticos ou de ADN recombinante, podem ser utilizados para fornecer a transcrição dos polinucleótidos descritos no presente documento. Um "promotor" significa um elemento de sequência mínimo suficiente para conduzir a transcrição. Ácidos nucleicos podem ser inseridos num plasmídeo para a propagação numa célula hospedeira e para a manipulação genética subsequente, se desejado. Um plasmídeo é um ácido nucleico que pode ser estavelmente propagado numa célula hospedeira; os plasmídeos podem conter opcionalmente elementos de controlo de expressão a fim de acionar a expressão do ácido nucleico. Um vetor é utilizado no presente documento de modo sinónimo a um plasmídeo e pode também incluir um elemento de controlo de expressão para expressão numa célula hospedeira. Os plasmídeos e vetores geralmente contêm pelo menos uma origem de replicação para propagação numa célula e um promotor. Os plasmídeos e vetores são, portanto, úteis para manipulação genética de ácidos nucleicos que codificam constructo de fusão, produzir constructos de fusão ou ácido nucleico antissenso e expressar constructos de fusão em células hospedeiras e organismos, por exemplo.
Os promotores de sistema bacteriano incluem promotores T7 e induzíveis tais como pL de bacteriófago À, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) e promotores responsivos à tetraciclina. Os promotores de sistema de célula de inseto incluem promotores constitutivos ou induzíveis (por exemplo, ecdisona). Os promotores constitutivos de célula de mamífero incluem SV40, RSV, papilomavírus bovino (BPV) e outros promotores de vírus ou promotores induzíveis derivados do genoma de células de mamífero (por exemplo, promotor de metalotioneína IIA; promotores de choque térmico) ou de vírus de mamíferos (por exemplo, o promotor tardio de adenovirus; a repetição terminal longa de vírus de tumor mamário de murganho induzível). Alternativamente, um genoma retroviral pode ser geneticamente modificado para introduzir e direcionar a expressão de um constructo de fusão em células hospedeiras apropriadas.
Os sistemas de expressão incluem adicionalmente vetores projetados para utilização in vivo. Os exemplos não limitantes particulares incluem vetores adenovirais (Patentes n° U.S. 5,700,470 e 5,731,172), vetores adeno-associados (Patente n° U.S. 5,604,090), vetores do vírus herpes simplex (Patente n° U.S. 5,501,979), vetores retrovirais (Patentes n° U.S. 5,624,820 , 5,693,508 e 5,674,703), vetores BPV (Patente n° U.S. 5,719,054) e vetores CMV (Patente n° U.S. 5,561,063).
Os vetores de levedura incluem promotores constitutivos e induzíveis (veja-se, por exemplo, Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, Capítulo 13, ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant et al. Methods in Enzymology, 153:516 (1987), eds. Wu & Grossman; Bitter Methods in Enzymology, 152:673 (1987), eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y.; e, Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (1982) eds. Cold Spring Harbor Press, Volumes I e II) . Um promotor de levedura constitutivo tal como ADH ou LEU2 ou um promotor induzível tal como GAL pode ser utilizado (R. Rothstein em: ADN Cloning, A Practical Approach, Volume 11, Capítulo 3, ed. D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986). Os vetores que facilitam a integração de sequências de ácidos nucleicos estranhas num cromossoma de levedura, por meio da recombinação homóloga, por exemplo, são conhecidos na técnica. Cromossomas artificiais de levedura (YAC) são tipicamente utilizados quando os polinucleótidos inseridos são muito grandes para vetores mais convencionais (por exemplo, maiores do que cerca de 12 quilopares de bases).
Os vetores de expressão também podem conter um marcador selecionável que confere resistência a um marcador identificável ou de pressão seletiva (por exemplo, beta-galactosidase), permitindo, assim, que as células que têm o vetor sejam selecionadas, cultivadas e expandidas. Alternativamente, um marcador selecionável pode estar num segundo vetor que é cotransfetado numa célula hospedeira com um primeiro vetor contendo um ácido nucleico que codifica um constructo de fusão.
Os sistemas de seleção incluem, porém, sem limitação, gene de timidina quinase do virus herpes simplex (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), gene de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:2.026 (1962)) e genes de adenina fosforribosiltransferase (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) que podem ser empregados em células tk, hgprt ou aprt, respetivamente. Adicionalmente, a resistência antimetabólito pode ser utilizada como a base de seleção para dhfr que confere resistência a metotrexato (O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:1.527 (1981)); o gene gpt que confere resistência a ácido micofenólico (Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2.072 (1981)); gene da neomicina que confere resistência ao aminoglicosídeo G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1(1981)); puromicina; e gene da higromicina que confere resistência à higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Os genes selecionáveis adicionais incluem trpB que permite que as células utilizem indol no lugar de triptofano; hisD que permite que as células utilizem histinol no lugar de histidina (Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:8.047 (1988)); e ODC (ornitina descarboxilase) que confere resistência ao inibidor de ornitina descarboxilase, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue (1987) em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory).
As células hospedeiras que expressam constructos de fusão e as células hospedeiras transformadas com ácidos nucleicos que codificam constructos de fusão e vetores incluindo um ácido nucleico que codifica o constructo de fusão são também fornecidos. Uma célula hospedeira pode ser uma célula procariótica. Uma célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica. Em vários aspetos, a célula eucariótica é uma célula de levedura ou mamífero (por exemplo, ser humano, primata, etc.).
Conforme utilizado no presente documento, uma "célula hospedeira" é uma célula na qual um ácido nucleico é introduzido que pode ser um constructo de fusão propagado, transcrito ou codificado que é expresso. O termo também inclui qualquer progénie ou subclones da célula hospedeira. As células hospedeiras incluem células que expressam constructo de fusão e células que não expressam constructo de fusão. As células hospedeiras que não expressam um constructo de fusão são utilizadas para propagar ácido nucleico ou vetor que inclui um ácido nucleico que codifica um constructo de fusão ou um antissenso.
As células hospedeiras incluem, porém, sem limitação, micro-organismos tais como bactérias e leveduras; e células de planta, inseto e mamífero. Por exemplo, as bactérias transformadas com vetores de expressão de ácido nucleico de bacteriófago, ácido nucleico de plasmídeo ou ácido nucleico de cosmídeo recombinantes; levedura transformada com vetores de expressão de levedura recombinantes; sistemas de célula vegetal infetados com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeo recombinantes (por exemplo, plasmídeo Ti); sistemas de célula de inseto infetados com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, baculovírus); e sistemas de célula animal infetados com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, retrovirus, adenovirus, vírus vaccinia) ou sistemas de célula animal transformados manipulados para propagação ou expressão temporária ou estável.
Os constructos de fusão, ácidos nucleicos que codificam constructos de fusão, vetores e células hospedeiras que expressam constructos de fusão ou transformadas com ácidos nucleicos que codificam constructos de fusão e antissenso incluem formas isoladas e purificadas. 0 termo "isolado", quando utilizado como um modificador de uma composição descrita no presente documento, significa que a composição é produzida pelas mãos de um homem ou é separada, de modo substancialmente completo ou pelo menos em parte do ambiente in vivo de ocorrência natural. Geralmente, uma composição isolada é substancialmente livre de um ou mais materiais aos quais a mesma normalmente associa-se em natureza, por exemplo, uma ou mais proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, hidratos de carbono, membranas celulares. 0 termo "isolado" não exclui formas físicas alternativas da composição, tais como multímeros/oligómeros, variantes, modificações ou formas derivatizadas expressas em células hospedeiras produzidas pelas mãos de um homem. 0 termo "isolado" também não exclui formas (por exemplo, formulações farmacêuticas e composições de combinação) em que há combinações nas mesmas, qualquer uma das quais é produzida pelas mãos de um homem.
Uma composição "isolada" pode também ser "purificada" quando livre de alguns, de uma quantidade substancial de, da maioria ou de todos os materiais aos quais a mesma tipicamente associa-se em natureza. Assim, um constructo de fusão isolado que também é substancialmente puro não inclui polipéptidos ou polinucleótidos presentes entre milhões de outras sequências, tais como proteínas de uma biblioteca de proteínas ou ácidos nucleicos numa biblioteca genómica ou de cADN, por exemplo. Uma composição "purificada" pode ser combinada com uma ou mais outras moléculas. São também fornecidas no presente documento misturas de constructos de fusão e composições de combinação. Uma mistura pode incluir um ou mais constructos de fusão e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Uma mistura pode incluir um ou mais constructos de fusão e um agente ou tratamento antiproliferativo de células, antitumor, anticancro ou antineoplásico. Uma mistura pode incluir um ou mais constructos de fusão e um agente de intensificação imunológica. Combinações, tais como um ou mais constructos de fusão num veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, com um ou mais de um agente ou tratamento antiproliferativo de células, antitumor, anticancro ou antineoplásico e um tratamento ou agente de intensificação imunológica são também fornecidas.
Os constructos de fusão descritos no presente documento, tais como polipéptidos que tem uma sequência de aminoácidos que inclui um primeiro domínio lítico e um segundo domínio de porção química de ligação, podem ser utilizados para direcionar células à lise, morte celular ou apoptose. Tais células podem ser seletivamente direcionadas. Por exemplo, uma célula que expressa um recetor, ligando, antígeno ou anticorpo pode ser direcionada por um constructo de fusão e, assim, ser preferencialmente exterminada em comparação às células que expressam menos do recetor, ligando, antígeno ou anticorpo. São também fornecidos no presente documento métodos para reduzir ou inibir a proliferação de uma célula e métodos para reduzir ou inibir a proliferação celular. Um método pode incluir colocar uma célula em contacto com um constructo de fusão numa quantidade suficiente para reduzir ou inibir a proliferação da célula. Um método pode incluir colocar uma célula em contacto com um constructo de fusão numa quantidade suficiente para reduzir ou inibir a proliferação celular. São também fornecidos métodos para reduzir ou inibir a proliferação de uma célula hiperproliferativa e métodos para reduzir ou inibir a proliferação de células hiperproliferativas. Um método pode incluir colocar uma célula hiperproliferativa ou células hiperproliferativas em contacto com um constructo de fusão numa quantidade suficiente para reduzir ou inibir a proliferação. São adicionalmente fornecidos métodos para reduzir ou inibir uma proliferação de uma célula neoplásica, de cancro, de tumor e maligna metastática ou não metastática. Um método pode incluir colocar uma célula neoplásica, de cancro, de tumor ou maligna em contacto com um constructo de fusão numa quantidade suficiente para reduzir ou inibir a proliferação da célula. São ainda adicionalmente fornecidos métodos para reduzir ou inibir uma proliferação de uma célula neoplásica, de cancro, de tumor e maligna metastática ou não metastática inativa ou que não se divide. Um método pode incluir colocar uma célula neoplásica, de cancro, de tumor ou maligna inativa ou que não se divide em contacto com um constructo de fusão numa quantidade suficiente para reduzir ou inibir a proliferação da célula inativa ou que não se divide. São adicionalmente fornecidos métodos para reduzir ou inibir seletivamente a proliferação de uma célula (por exemplo, uma célula hiperproliferativa) que expressa um recetor, ligando, anticorpo ou antigeno. Um método pode incluir colocar a célula em contacto com um constructo de fusão numa quantidade suficiente para reduzir ou inibir a proliferação da célula (por exemplo, célula hiperproliferativa) , em que a porção química de ligação do referido péptido liga-se ao recetor, ligando, anticorpo ou antígeno expresso pela célula. São ainda adicionalmente fornecidos métodos para reduzir ou inibir seletivamente a proliferação de uma célula neoplásica, de tumor, de cancro ou maligna que expressa um recetor, ligando, anticorpo ou antígeno. Um método pode incluir colocar a célula em contacto com um constructo de fusão numa quantidade suficiente para reduzir ou inibir a proliferação da célula neoplásica, de tumor, de cancro ou maligna, em que a porção química de ligação do referido constructo de fusão liga-se ao recetor, ligando, anticorpo ou antígeno expresso pela célula. 0 termo "colocar em contacto" significa uma ligação ou interação direta ou indireta entra duas ou mais entidades (por exemplo, entre um constructo de fusão e uma célula). Colocar em contacto, conforme utilizado no presente documento, inclui em solução, em fase sólida, in vitro, ex vivo, numa célula e in vivo. Colocar em contacto in vivo pode ser denominado como administrar ou administração.
As células para direcionar a redução ou a inibição da proliferação, seletiva ou não seletivamente, incluem células que expressam qualquer molécula à qual a porção química de ligação do constructo de fusão liga-se. As células exemplificativas incluem uma célula que expressa um recetor (por exemplo, um recetor de hormona, recetor de fator de crescimento, um recetor de citocina, um recetor de quimiocina), ligando (por exemplo, uma hormona, fator de crescimento, citocina, quimiocina) ou anticorpo ou um antígeno ou uma integrina ou recetor de integrina (péptidos contendo motivo de sequência "RGD") ou um componente presente na matriz extracelular (ECM), tais como mono, di ou oligossacáridos, ácido siálico, galactose, manose, fucose, ácido acetilneuramínico, péptidos contendo motivo de sequência "RGD", etc.
As células-alvo incluem células que expressam uma hormona esteroide sexual ou gonadal ou recetor de hormona esteroide sexual ou gonadal. As células alvo também incluem células que expressam um recetor que se liga à hormona libertadora de gonadotrotina I, hormona libertadora de gonadotrofina II, hormona libertadora de hormona luteinizante de lampreia III, hormona luteinizante, gonadotrofina coriónica, hormona estimulante de melanócitos, estradiol, dietilstilbesterol, dopamina, somatostatina, hormona folículo-estimulante (FSH), glicocorticoide, estrogénio, testosterona, androstenediona, di-hidrotestosterona, desidroepiandrosterona, progesterona, androgénio, fator de crescimento epidérmico (EGF), Her2/neu, vitamina H, ácido fólico ou um derivado do mesmo (por exemplo, folato), transferrina, hormona estimulante da tireoide (TSH), endotelina, bombesina, hormona de crescimento, péptido intestinal vasoativo, lactoferrina, uma integrina (por exemplo, alfa-5 beta 3 ou alfa-5 beta 1 integrina), fator de crescimento nervoso, CD19, CD20, CD23, CD27, CD28, CD30, CD33, CD40, CD52, CD56, CD70, CD154, recetores semelhantes à imunoglobulina, R0R1, IGF-1, antígeno carcinoembrionário (CEA), antígeno específico para próstata (PSA), antígeno de membrana específico para próstata (PSMA), fator de crescimento transformador alfa, fator de crescimento transformador beta, fator de crescimento semelhante à insulina, fator de crescimento endotelial vascular, insulina, ceruloplasmina ou HIV-tat.
As células-alvo incluem adicionalmente células que expressam um recetor que se liga a uma hormona esteroide sexual ou gonadal ou recetor de hormona esteroide sexual ou gonadal. As células-alvo incluem, além disso, células que expressam um recetor que se liga uma hormona libertadora de gonadotrofina I, hormona libertadora de gonadotrofina II, hormona libertadora de hormona luteinizante de lampreia III, cadeia beta de hormona luteinizante, hormona luteinizante, gonadotrofina coriónica, subunidade beta de gonadotrofina coriónica, hormona estimulante de melanócitos, estradiol, dietilstilbesterol, dopamina, somatostatina, hormona foliculo-estimulante (FSH), glicocorticoide, estrogénio, testosterona, androstenediona, di-hidrotestosterona, desidroepiandrosterona, progesterona, androgénio, fator de crescimento epidérmico (EGF), Her2/neu, vitamina H, ácido fólico ou um derivado do mesmo (por exemplo, folato), transferrina, hormona estimulante da tireoide (TSH), endotelina, bombesina, hormona de crescimento, péptido intestinal vasoativo, lactoferrina, uma integrina (por exemplo, alfa-5 beta 3 ou alfa-5 beta 1 integrina), fator de crescimento nervoso, CD19, CD20, CD23, CD27, CD28, CD30, CD33, CD40, CD52, CD56, CD70, CD154, recetores semelhantes à imunoglobulina, R0R1, IGF-1, antigeno carcinoembrionário (CEA), antígeno específico para próstata (PSA), antígeno de membrana específico para próstata (PSMA), fator de crescimento transformador alfa, fator de crescimento transformador beta, insulina, ceruloplasmina, HIV-tat ou um análogo do mesmo (por exemplo, mifepristona, flutamida, lupron, zoladex, supprelin, synatel triptorelina, buserelina, centrorelix, ganirelix, abarelix, antide, teverelix ou degarelix (Fe200486)).
As células para direcionar a redução ou inibição da proliferação, seletiva ou não seletivamente, incluem adicionalmente células gue expressam "antígenos associados a tumor", tais como antígeno carcinoembrionário (CEA), alfa-fetoproteína(AFP), antígeno específico para próstata (PSA), antígeno de membrana específico para próstata (PSMA), CA-125 (cancro de ovário epitelial residual), recetor de interleucina-2 (IL-2) solúvel, RAGE-1, tirosinase, MAGE-1, MAGE-2, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, glicoproteína (gp) 75, gplOO, beta-catenina, PRAME, MUM-1, ZFP161, Ubiquilina-1, H0X-B6, YB-1, Osteonectina e ILF3. As células para direcionar a redução ou inibição da proliferação, seletiva ou não seletivamente, incluem ainda adicionalmente células que expressam transferrina, ácido fólico e derivados do mesmo (por exemplo, folato) e um membro da família de fator de necrose tumoral (TNF) ou, tal como TNF-alfa, TNF-beta (linfotoxina, LT) , TRAIL, Fas, LIGHT e 41BB e recetores para os mesmos.
Os constructos de fusão e métodos descritos no presente documento são também aplicáveis ao tratamento de proliferação celular indesejável ou anormal e distúrbios de hiperproliferação. Assim, métodos para tratar a proliferação celular indesejável ou anormal e distúrbios de hiperproliferação são também fornecidos no presente documento. Um método pode incluir administrar a um indivíduo (que precisa do tratamento) uma quantidade de um constructo de fusão suficiente para tratar a proliferação celular indesejável ou anormal ou o distúrbio de hiperproliferação. 0 termo "distúrbio de hiperproliferação" refere-se a qualquer proliferação, crescimento ou sobrevivência de célula (por exemplo, falha em passar pela morte celular programada ou apoptose) indesejável ou anormal. Tais distúrbios incluem hiperplasias benignas, neoplasias metastáticas e não metastáticas, cancros, tumores e malignidades. A proliferação celular indesejável ou anormal e distúrbios de hiperproliferação podem afetar qualquer célula, tecido, órgão num indivíduo. A proliferação celular indesejável ou anormal e distúrbios de hiperproliferação podem estar presentes num indivíduo, local, regional ou sistematicamente. Um distúrbio de hiperproliferação pode surgir de uma multiplicidade de tecidos e órgãos, incluindo, porém, sem limitação, mama, pulmão (por exemplo, célula pequena e célula não pequena) , tireoide, cabeça e pescoço, cérebro, nasofaringe, garganta, nariz ou seios nasais, linfoide, glândula adrenal, glândula pituitária, tireoide, linfa, trato gastrointestinal (boca, esófago, estômago, duodeno, ileo, jejuno (intestino delgado), cólon, reto), trato geniturinário (útero, ovário, vagina, colo do útero, endométrio, trompa de Falópio, bexiga, testículo, pênis, próstata), rim, pâncreas, fígado, osso, medula óssea, linga, sangue, músculo, pele e células-tronco que podem ou não metastizar a outros sítios, regiões ou locais secundários.
Os constructos de fusão e métodos descritos no presente documento são também aplicáveis a tumor, cancro, malignidade ou neoplasia metastática ou não metastática de qualquer origem de célula, órgão ou tecido. Tais distúrbios podem afetar virtualmente qualquer tipo de célula ou tecido, por exemplo, carcinoma, sarcoma, melanoma, distúrbios neoplásicos neurais e reticuloendoteliais ou hematopoiéticos (por exemplo, mieloma, linfoma ou leucemia).
Conforme utilizado no presente documento, os termos "neoplasia" e "tumor" referem-se a uma célula ou população de células cujo crescimento, proliferação ou sobrevivência é maior do que o crescimento, proliferação ou sobrevivência de uma célula de contraparte normal, por exemplo, um distúrbio proliferativo ou de diferenciação de células. Um tumor é uma neoplasia que formou uma massa ou crescimento distinto. Um "cancro" ou "malignidade" refere-se a uma neoplasia ou tumor que pode invadir espaços, tecidos ou órgãos adjacentes. Uma "metástase" refere-se a uma neoplasia, tumor, cancro ou malignidade que se disseminou ou se espalhou de seu sítio primário para um ou mais sítios, locais ou regiões secundárias dentro do indivíduo, em que os sítios, locais ou regiões são distintas do tumor ou cancro primário. Células neoplásicas, de tumor, de cancro e malignas (metastáticas ou não metastáticas) incluem células neoplásicas, de tumor, de cancro e malignas inativas ou residuais. Tais células consistem tipicamente em células de tumor remanescentes que não estão se dividindo (interrupção G0-G1) . Essas células podem persistir num sitio primário ou como células neoplásicas, de tumor, de cancro ou malignas disseminadas como uma doença residual mínima. Essas células neoplásicas, de tumor, de cancro ou malignas inativas permanecem assintomáticas, mas podem desenvolver sintomas graves e morte uma vez que essas células inativas proliferam. Os métodos descritos no presente documento podem ser utilizados para reduzir ou inibir a proliferação de células neoplásicas, de tumor, de cancro ou malignas inativas, o que pode, por sua vez, inibir ou reduzir a reincidência de tumor ou cancro ou a metástase ou progressão de tumor ou cancro.
Os métodos para tratar um indivíduo que tem tumor, cancro, malignidade ou neoplasia metastática ou não metastática são também fornecidos no presente documento. Um método pode incluir administrar a um indivíduo (que precisa do tratamento) uma quantidade de um constructo de fusão suficiente para tratar (por exemplo, reduzir ou inibir a proliferação) o tumor, cancro, malignidade ou neoplasia metastática ou não metastática. 0 tumor, cancro, malignidade ou neoplasia metastática ou não metastática pode estar em qualquer estágio, por exemplo, precoce ou avançado, tal como um tumor de estágio I, II, III, IV ou V. 0 tumor, cancro, malignidade ou neoplasia metastática ou não metastática pode ter sido submetida a um tratamento anterior ou pode estar estabilizada (não progredindo) ou em remissão.
Em termos de metástase, os métodos descritos no presente documento podem ser utilizados para reduzir ou inibir a metástase de um tumor ou cancro primário a outros sítios ou a formação ou o estabelecimento de tumores ou cancros metastáticos em outros sítios distais do tumor ou cancro primário inibindo ou reduzindo, assim, a reincidência de tumor ou cancro ou a progressão do tumor ou cancro. Assim, os métodos descritos no presente documento incluem, entre outras coisas, 1) reduzir ou inibir o crescimento, a proliferação, a mobilidade ou a invasividade de células de tumor ou cancro que desenvolvimento potencialmente ou de facto metástases (por exemplo, células de tumor disseminadas, DTC); 2) reduzir ou inibir a formação ou o estabelecimento da metástase que surge a partir de um tumor ou cancro primário a um ou mais outros sítios, locais ou regiões distintas do tumor ou cancro primário; 3) reduzir ou inibir o crescimento ou a proliferação de a metástase num ou mais outros sítios, locais ou regiões distintas do tumor ou cancro primário após a metástase ter-se formado ou ter sido estabelecida; e 4) reduzir ou inibir a formação ou o estabelecimento de metástase adicional após a metástase ter sido formada ou estabelecida.
As células de um tumor, cancro, malignidade ou neoplasia metastática ou não metastática podem ser agregadas numa massa celular "sólida" ou podem ser dispersas e difundidas. Um tumor "sólido" refere-se a cancro, neoplasia ou metástase que tipicamente agrega-se e forma uma massa. Os exemplos não limitantes específicos incluem tumores viscerais tais como melanomas, cancros de mama, pancreáticos, uterinos e ovarianos, cancro testicular, incluindo seminomas, cancro gástrico ou de cólon, hepatomas, carcinomas adrenais, renais e de bexiga, cancros de pulmão, de cabeça e pescoço e tumores/cancros cerebrais.
Carcinomas, que se referem a malignidades de tecido epitelial ou endócrino, incluem carcinomas do sistema respiratório, carcinomas do sistema gastrointestinal, carcinomas do sistema geniturinário, carcinomas testiculares, carcinomas de mama, carcinomas prostáticos, carcinomas do sistema endócrino e melanomas. Os carcinomas exemplificativos incluem aqueles que se formam a partir do útero, colo do útero, pulmão, próstata, mama, cabeça e pescoço, cólon, pâncreas, testículos, glândula adrenal, rim, esófago, estômago, fígado e ovário. 0 termo também inclui carcinossarcomas, por exemplo, que incluem tumores malignos compostos de tecidos carcinomatosos e sarcomatosos. Adenocarcinoma inclui um carcinoma de um tecido glandular ou em que o tumor forma uma estrutura semelhante à glândula.
Sarcomas referem-se a tumores malignos de origem de células mesenquimais. Os sarcomas exemplificativos incluem, por exemplo, linfossarcoma, lipossarcoma, osteossarcoma, condrossarcoma, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma e fibrossarcoma.
As neoplasias neurais incluem glioma, glioblastoma, meningioma, neuroblastoma, retinoblastoma, astrocitoma e oligodendrocitoma.
Urn "tumor líquido" refere-se à neoplasia que é dispersa ou é difundida em natureza, na medida em que a mesma não forma tipicamente uma massa sólida. Os exemplos particulares incluem neoplasia do sistema reticuloendotelial ou hematopoiético, tais como linfomas, mielomas e leucemias. Os exemplos não limitantes de leucemias incluem mieloma múltiplo, mieloblástico, linfoblástico crónico e linfoblástico agudo. Tipicamente, tais doenças surgem de leucemias aguas insuficientemente diferenciadas, por exemplo, leucemia eritroblástica e leucemia megacarioblástica aguda. Os distúrbios mieloides específicos incluem, porém, sem limitação, leucemia promielélica aguda (APML), leucemia mieloide aguda (AML) e leucemia mieloide crónica (CML). As malignidades linfoides incluem, porém, sem limitação, leucemia linfoblástica aguda (ALL) , que inclui ALL de linhagem B e ALL de linhagem T, leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia prolinfocítica (PLL), leucemia de células pilosas (HLL) e macroglobulinemia de Waldenstrom (WM). Os linfomas malignos específicos incluem linfoma de não Hodgkin e variantes, linfomas de células T periféricas, leucemia/linfoma de células T adultas (ATL), linfoma de células T cutâneas (CTCL), leucemia linfocítica granular grande (LGF), doença de Hodgkin e doença de Reed-Sternberg.
Conforme revelado no presente documento, a proliferação celular indesejável ou anormal ou distúrbios de hiperproliferação podem ocorrer no útero, mama, vagina, colo do útero e trompa de Falópio. A endometriose ocorre quando células do útero crescem fora do útero e para outras áreas, tais como ovários, bexiga ou intestinos. Fibroides e pólipos podem afetar útero, mama, vagina, colo do útero e tromba de Falópio.
Assim, são também fornecidos no presente documento métodos para tratar endometriose e fibroides ou pólipos. Um método pode incluir administrar a um indivíduo uma quantidade de um constructo de fusão suficiente para tratar endometriose. Um método pode incluir administrar a um indivíduo uma quantidade de um constructo de fusão suficiente para tratar um fibroide ou pólipo. Células-alvo incluem células que participam da ou são exigidas para reprodução ou fertilidade. Assim, são também fornecidos no presente documento métodos para reduzir a fertilidade de um animal. Um método pode incluir administrar a um indivíduo uma quantidade de um constructo de fusão suficiente para reduzir a fertilidade ou reduzir a probabilidade de gravidez ou reduzir a produção de esperma num mamífero do sexo masculino.
Conforme também revelado no presente documento, a proliferação celular indesejável ou anormal ou distúrbios de hiperproliferação podem ocorrer na próstata. Assim, são também fornecidos no presente documento métodos para tratar a hiperplasia de próstata benigna ou neoplasia de próstata metastática. Um método pode incluir administrar a um indivíduo uma quantidade de um constructo de fusão suficiente para tratar a hiperplasia de próstata benigna ou neoplasia de próstata metastática.
Qualquer composição, tratamento, protocolo, terapia ou regime que tem um efeito ou atividade antiproliferativa de células pode ser combinado com um constructo de fusão ou utilizado em combinação com um método descrito no presente documento. Os constructos de fusão e métodos descritos no presente documento incluem, portanto, tratamentos, protocolos e terapias antiproliferativos de células, antitumor, anticancro, antineoplásicos e antimetastáticos que incluem qualquer outra composição, tratamento, protocolo ou regime terapêutico que inibe, diminui, retarda, atrasa, reduz ou previne um distúrbio de hiperproliferação, tal como tumor, cancro, crescimento maligno ou neoplásico, progressão, metástase, proliferação ou sobrevivência ou piora in vitro ou in vivo. Os exemplos não limitantes particularmente de uma terapia antiproliferativa (por exemplo, tumor) incluem quimioterapia, imunoterapia, radioterapia (ionizante ou química), terapia térmica local (hipertermia), ressecção cirúrgica e vacinação. Um constructo de fusão pode ser administrado antes, substancialmente ao mesmo tempo ou após a administração do tratamento ou terapia antiproliferativa de células, antineoplásica, antitumor, anticancro, antimetastática ou de intensificação imunológica. Um constructo de fusão pode ser administrado como uma combinação de composições com o tratamento ou terapia antiproliferativa de células, antineoplásica, antitumor, anticancro, antimetastática ou de intensificação imunológica para tumor, cancro, malignidade ou neoplasia metastática ou não metastática.
Composições, terapias, protocolos ou tratamentos antiproliferativos, antineoplásicos, antitumor, anticancro e antimetastáticos incluem aqueles que impedem, perturbam, interrompem, inibem ou atrasam a progressão de ciclo celular ou a proliferação celular; estimulam ou intensificam a apoptose ou morte celular, inibem a síntese ou o metabolismo de ácido nucleico ou proteína, inibem a divisão celular ou diminuem, reduzem ou inibem a sobrevivência celular ou produção ou utilização de um fator de sobrevivência celular, fator de crescimento ou trajetória de sinalização necessária (extracelular ou intracelular). Os exemplos não limitantes de classes de agente químico que têm atividades antiproliferativas de células, antineoplásicas, antitumor, anticancro e antimetastáticas incluem agentes alquilantes, antimetabólitos, extratos vegetais, alcaloides vegetais, nitrosoureias, hormonas, nucleósido e análogos de nucleótido. Os exemplos específicos de fármacos que têm atividades antiproliferativas de células, antineoplásicas, antitumor, anticancro e antimetastáticas incluem ciclofosfamida, azatioprina, ciclosporina A, prednisolona, melfalana, clorambucilo, mecloretamina, busulfano, metotrexato, 6-mercaptopurina, tioguanina, 5-fluorouracilo, citosina arabinósido, AZT, 5-azacitidina (5-AZC) e compostos relacionados com 5-azacitidina tais como decitabina (5-aza-2'desoxicitidina) , citarabina, 1-beta-D-arabinofuranosil-5-azacitosina e di-hidro-5-azacitidina, bleomicina, actinomicina D, mitramicina, mitomicina C, carmustina, lomustina, semustina, estreptozotocina, hidroxiureia, cisplatina, mitotano, procarbazina, dacarbazina, taxol, vinblastina, vincristina, doxorrubicina e dibromomanitol etc.
Os agentes adicionais que são aplicáveis com os constructos de fusão e métodos são conhecidos na técnica e podem ser empregados. Por exemplo, produtos biológicos tais como anticorpos, fatores de crescimento celular, fatores de sobrevivência celular, fatores de diferenciação celular, citocinas e quimiocinas podem ser administrados. Os exemplos não limitantes de anticorpos monoclonais incluem rituximab (Rituxan®), trastuzumab (Herceptin), bevacizumab (Avastin), cetuximab (Erbitux), alemtuzumab (Campath), panitumumab (Vectibix), ibritumomab tiuxetan (Zevalin), tositumomab (Bexxar) etc. que podem ser utilizados em combinação com, entre outros, um constructo de fusão descrito no presente documento. Outros fármacos direcionados que são aplicáveis para utilização com os constructos de fusão são imatinib (Gleevec), gefitinib (Iressa), bortzomib (Velcade), lapatinib (Tykerb), sunitinib (Sutent), sorafenib (Nevaxar), nilotinib (Tasigna) etc. Os exemplos não limitantes de fatores de crescimento celular, fatores de sobrevivência celular, fatores de diferenciação celular, citocinas e quimiocinas incluem IL-2, IL-la, IL-Ιβ, IL-3, IL-6, IL-7, fator estimulante de colónia de granulócitos-macrófagos (GMCSF), IFN-y, IL-12, TNF-α, ΤΝΕβ, ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ, RANTES, SDF-1, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaxina, eotaxina-2, I-309/TCA3, ATAC, HCC-1, HCC-2, HCC-3, LARC/MIP-3a, PARC, TARC, ΟΚβ, CKp6, 0Κβ7, 0Κβ8, 0Κβ9, ΟΚβΙΙ, 0Κβ12, CIO, IL-8, GROa, GROβ, ENA-78, GCP-2, ΡΒΡ/ΰΤΑΡΙΙΙβ-ΤΟ/ΝΑΡ-2, Mig, PBSF/SDF-1 e linfotactina.
Os exemplos não limitantes adicionais incluem tratamentos e terapias de intensificação imunológica, que incluem terapias baseadas em célula. Em particular, os tratamentos e as terapias de imunológica incluem administrar linfócitos, células plasmáticas, macrófagos, células dendriticas, células NK e células B. São também fornecidos métodos para tratar um tumor, um cancro, uma malignidade ou uma neoplasia metastática ou não metastática, métodos para tratar um indivíduo que precisa de tratamento devido ao facto de ter ou estar em risco de ter um tumor, um cancro, uma malignidade ou uma neoplasia metastática ou não metastática e métodos para aumentar a eficácia e aprimorar uma terapia antiproliferativa, antitumor, anticancro, antineoplasia ou antimalignidade. Um método pode incluir administrar a um indivíduo com ou em risco de um tumor, um cancro, uma malignidade ou uma neoplasia metastática ou não metastática, uma quantidade de um constructo de fusão suficiente para tratar o tumor, o cancro, a malignidade ou a neoplasia metastática ou não metastática; administrar ao indivíduo uma quantidade de um constructo de fusão suficiente para tratar o indivíduo; e administrar a um indivíduo que está passando ou passou por um tumor, um cancro, uma malignidade ou uma neoplasia metastática ou não metastática, uma quantidade de um constructo de fusão suficiente para aumentar a eficácia da terapia antiproliferativa, antitumor, anticancro, antineoplasia ou antimalignidade.
Os métodos descritos no presente documento podem ser praticados antes (isto é, profilaxia), concomitantemente com ou após a evidência da presença de proliferação celular indesejável ou anormal ou um distúrbio, uma doença ou uma afeção hiperproliferativa começar (por exemplo, um ou mais sintomas). Administrar um constructo de fusão antes, concomitantemente ou imediatamente após o desenvolvimento de um sintoma de proliferação celular indesejável ou anormal ou um distúrbio hiperproliferativo pode diminuir a ocorrência, a frequência, a gravidade, a progressão ou a duração de um ou mais sintomas da proliferação celular indesejável ou anormal ou um distúrbio, uma doença ou uma afeção hiperproliferativa no indivíduo. Adicionalmente, administrar um constructo de fusão antes, concomitantemente ou imediatamente após o desenvolvimento de um ou mais sintomas da proliferação celular indesejável ou anormal ou um distúrbio, uma doença ou uma afeção hiperproliferativa pode inibir, diminuir ou prevenir a propagação ou a disseminação de células hiperproliferantes (por exemplo, metástase) a outros sítios, regiões, tecidos ou órgãos num indivíduo, ou estabelecimento de células hiperproliferantes (por exemplo, metástase) em outros sítios, regiões, tecidos ou órgãos num indivíduo.
Os constructos de fusão e os métodos descritos no presente documento, tais como métodos de tratamento, podem fornecer um benefício ou aprimoramento terapêutico detetável ou mensurável a um indivíduo. Um benefício ou um aprimoramento terapêutico é qualquer benefício mensurável ou detetável, objetivo ou subjetivo, transiente, temporário ou a longo prazo ao indivíduo ou aprimoramento na afeção, no distúrbio ou na doença, um sintoma adverso, consequência ou causa subjacente, de qualquer grau, num tecido, um órgão, uma célula ou uma população de células do indivíduo. Os benefícios e aprimoramentos terapêuticos incluem, porém, sem limitação, reduzir ou diminuir a ocorrência, a frequência, a gravidade, a progressão ou a duração de um ou mais sintomas ou complicações associadas a um distúrbio, uma doença ou uma afeção, ou uma causa subjacente ou efeito consequencial do distúrbio, da doença ou da afeção. Os constructos de fusão e métodos descritos no presente documento incluem fornecer um beneficio ou aprimoramento terapêutico a um indivíduo.
Num método descrito no presente documento em que um benefício ou aprimoramento terapêutico é um resultado desejado, um constructo de fusão descrito no presente documento pode ser administrado numa quantidade suficiente ou eficaz a um indivíduo que precisa do mesmo. Uma "quantidade suficiente" ou "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade que fornece, em doses únicas ou múltiplas, sozinha ou em combinação com uma ou mais outras composições (agentes terapêuticos, tal como um fármaco quimioterápico ou estimulante imunológico), tratamentos, protocolos ou agentes de regimes terapêuticos, uma resposta detetável de qualquer duração de tempo (longo ou curto prazo), um resultado desejado em ou um benefício a um indivíduo de qualquer grau mensurável ou detetável ou por qualquer duração de tempo (por exemplo, por horas, dias, meses, anos ou curado). As doses ou "quantidade suficiente" ou "quantidade eficaz" para tratamento (por exemplo, para fornecer um beneficio ou um aprimoramento terapêutico) tipicamente são eficazes para atenuar um distúrbio, uma doença ou uma afeção, ou um, múltiplos ou todos os sintomas adversos, consequências ou complicações do distúrbio, doença ou afeção, numa extensão mensurável, embora reduzir ou inibir uma progressão ou piora do distúrbio, da doença ou da afeção ou um sintoma seja considerado um resultado satisfatório. 0 termo "atenuar" significa um aprimoramento objetivo ou subjetivo detetável numa afeção do indivíduo. Um aprimoramento detetável inclui uma redução subjetiva ou objetiva na ocorrência, na frequência, na gravidade, na progressão ou na duração de um sintoma causado ou associado a um distúrbio, uma doença ou uma afeção, um aprimoramento numa causa subjacente ou uma consequência do distúrbio, da doença ou da afeção, ou uma reversão do distúrbio, da doença ou da afeção. 0 tratamento pode resultar, portanto, na inibição, na redução ou na prevenção de um distúrbio, uma doença ou uma afeção, ou um sintoma ou consequência associada, ou causa subjacente; inibição, redução ou prevenção de uma progressão ou piora de um distúrbio, uma doença, uma afeção, um sintoma ou uma consequência, ou causa subjacente; ou deterioração ou ocorrência adicional de um ou mais sintomas adicionais do distúrbio, da doença, da afeção ou do sintoma. Assim, um resultado bem-sucedido para o tratamento leva a um "efeito terapêutico" ou "benefício" ou inibição, redução ou prevenção da ocorrência, da frequência, da gravidade, da progressão ou da duração de um ou mais sintomas ou causas subjacentes ou consequências de uma afeção, um distúrbio, uma doença ou um sintoma no indivíduo. Os métodos de tratamento que afetam uma ou mais causas subjacentes da afeção, do distúrbio, da doença ou do sintoma são, portanto, considerados como sendo benéficos. A estabilização ou a inibição da progressão ou da piora de um distúrbio ou uma afeção é também um resultado bem-sucedido para o tratamento.
Um beneficio ou um aprimoramento terapêutico, portanto, não precisa ser a ablação completa de qualquer um, a maioria ou todos os sintomas, as complicações, as consequências ou causas subjacentes associadas à afeção, ao distúrbio ou à doença. Assim, um ponto final satisfatório é atingido quando há um aprimoramento incremental numa afeção do indivíduo ou uma redução parcial na ocorrência, na frequência, na gravidade, na progressão ou na duração, ou inibição ou reversão, de um ou mais sintomas adversos associados ou complicações ou consequências ou causas subjacentes, piora ou progressão (por exemplo, estabilização de um ou mais sintomas ou complicações da afeção, do distúrbio ou da doença) , de uma ou mais das manifestações ou características fisiológicas, bioquímicas ou celulares do distúrbio ou da doença, ao longo de um duração de tempo curta ou longa (horas, dias, semanas, meses, etc.) .
Um método de tratamento pode resultar em destruição parcial ou completa de um tumor metastático ou não metastático, um cancro, massa celular, volume, tamanho ou números de células malignos ou neoplásticos; resultados em estimulação, indução ou aumento de tumor metastático ou não metastático, cancro, apoptose, lise ou necrose de células malignas ou neoplásticas; resultados em redução de tumor metastático ou não metastático, cancro, massa celular, tamanho, volume maligno ou neoplástico; resultados em inibição ou prevenção da progressão ou um aumento em tumor metastático ou não metastático, cancro, massa celular, volume, tamanho ou números de células malignos ou neoplásticos; resultados em inibição ou diminuição da propagação ou da disseminação de células hiperproliferantes (por exemplo, metástase) a outros (secundários) sítios, regiões, tecidos ou órgãos num indivíduo, ou estabelecimento de células hiperproliferantes (por exemplo, metástase) em outros (secundários) sítios, regiões, tecidos ou órgãos num indivíduo; ou resultados em prolongamento do tempo de vida do indivíduo. Um método de tratamento pode também resultam na redução ou na diminuição da gravidade, da duração ou da frequência de um sintoma adverso ou complicação associada a ou causada pelo tumor, pelo cancro, pela malignidade ou pela neoplasia metastática ou não metastática.
Uma quantidade suficiente ou uma quantidade eficaz pode, porém, não necessariamente, ser fornecida numa administração única e pode, porém, não necessariamente, ser administrada sozinha ou em combinação com outra composição (por exemplo, agente quimioterápico ou de intensificação ou estimulação imunológica), tratamento, protocolo ou regime terapêutico. Por exemplo, a quantidade pode ser proporcionalmente aumentada conforme indicado pela necessidade do indivíduo, situação do distúrbio, da doença ou da afeção tratada ou os efeitos secundários do tratamento. Adicionalmente, uma quantidade suficiente ou uma quantidade eficaz não precisa ser suficiente ou eficaz se dada em doses únicas ou múltiplas sem uma segunda composição (por exemplo, agente quimioterápico ou agente de estimulação imunológica), tratamento, protocolo ou regime terapêutico, visto que doses, quantidades ou duração adicional acima e além de tais doses, ou composições adicionais (por exemplo, agentes quimioterápicos ou agentes de estimulação imunológica), tratamentos, protocolos ou regimes terapêuticos podem estar incluídos a fim de serem considerados eficazes ou suficientes num dado indivíduo. As quantidades consideradas suficientes também incluem quantidades que resultam numa redução da utilização de outro tratamento, regime terapêutico ou protocolo.
Uma quantidade suficiente ou uma quantidade eficaz não precisa ser eficaz em cada um e todos os indivíduos tratados, profilática ou terapeuticamente, nem uma maioria de indivíduos tratados num dado grupo ou população. Conforme é típico para tratamento ou métodos terapêuticos, alguns indivíduos exibirão maior ou menor resposta a um dado tratamento, regime terapêutico ou protocolo. Uma quantidade suficiente ou uma quantidade eficaz refere-se à suficiência ou à eficácia num indivíduo particular, não um grupo ou a população geral. Tais quantidades dependerão em parte da afeção tratada, tal como o tipo ou o estágio de proliferação celular indesejável ou anormal ou distúrbio hiperproliferativa (por exemplo, um tumor, um cancro, uma malignidade ou uma neoplasia metastática ou não metastática), o efeito terapêutico desejado, assim como o indivíduo particular (por exemplo, a biodisponibilidade dentro do indivíduo, género, idade, etc.).
Os exemplos não limitantes particulares de benefício ou aprimoramento terapêutico for proliferação celular indesejável ou anormal, tal como um distúrbio hiperproliferativo (por exemplo, um tumor, um cancro, uma malignidade ou uma neoplasia metastática ou não metastática) incluem uma redução em tamanho, massa ou volume celular, inibição de um aumento em tamanho, massa ou volume celular, um retardamento ou uma inibição da piora ou progressão, estimulação de necrose, lise ou apoptose celular, redução ou inibição de malignidade neoplástica ou tumoral ou metástase, redução de mortalidade e prolongamento do tempo de vida de um indivíduo. Assim, a inibição ou o retardamento de um aumento em tamanho, massa, volume celular ou metástase (estabilização) pode aumentar o tempo de vida (reduzir a mortalidade) mesmo se apenas por alguns dias, semanas ou meses, ainda que a ablação completa do tumor, do cancro, da malignidade ou da neoplasia metastática ou não metastática não tenha ocorrido. Os sintomas adversos e as complicações associadas a um distúrbio hiperproliferativo (por exemplo, um tumor, um cancro, uma malignidade ou uma neoplasia metastática ou não metastática) que podem ser reduzidos ou diminuídos incluem, por exemplo, dor, náusea, desconforto, falta de apetite, letargia e fraqueza. Uma redução na ocorrência, na frequência, na gravidade, na progressão ou na duração de um sintoma de proliferação celular indesejável ou anormal, tal como um distúrbio hiperproliferativo (por exemplo, um tumor, um cancro, uma malignidade ou uma neoplasia metastática ou não metastática) , tal como um aprimoramento na sensação subjetiva (por exemplo, energia aumentada, apetite, náusea reduzida, mobilidade aprimorada ou bem estar psicológico, etc.), são todos, portanto, exemplos de benefício ou aprimoramento terapêutico.
Por exemplo, uma quantidade suficiente ou eficaz de um constructo de fusão é considerada como tendo um efeito terapêutico se a administração resultar em menos fármaco quimioterápico, radiação ou imunoterapia ser necessária para o tratamento de proliferação celular indesejável ou anormal, tal como um distúrbio hiperproliferativo (por exemplo, um tumor, um cancro, uma malignidade ou uma neoplasia metastática ou não metastática). 0 termo "indivíduo" refere-se a animais, tipicamente animais mamíferos, tais como seres humanos, primatas não humanos (símios, gibões, chimpanzés, orangotangos, macacos), animais domésticos (cães e gatos), animais de quinta (cavalos, vacas, cabras, ovelhas, porcos) e animais de experimento (murganho, rato, coelho, porquinho-da-índia) . Os indivíduos incluem modelos de doença em animal, por exemplo, modelos de animal de proliferação celular indesejável ou anormal, tal como um distúrbio hiperproliferativo (por exemplo, um tumor, um cancro, uma malignidade ou uma neoplasia metastática ou não metastática) para análise de constructos de fusão in vivo.
Os indivíduos adequados para tratamento incluem aqueles que têm ou estão em risco de ter uma célula tumoral, cancerosa, maliqna ou neoplástica metastática ou não metastática, aqueles que passam assim como aqueles que estão passando ou passaram por terapia antiproliferativa (por exemplo, tumor, cancro, maliqnidade ou neoplasia metastática ou não metastática) , incluindo indivíduos em que o tumor está em remissão. Os indivíduos "em risco" tipicamente têm fatores de risco associados à proliferação celular indesejável ou anormal, desenvolvimento de hiperplasia (por exemplo, um tumor).
Os exemplos particulares de indivíduos em risco ou candidatos incluem aqueles com células que expressam um recetor, um ligando, um antígeno ou um anticorpo ao qual um constructo de fusão pode ligar-se, particularmente nos casos em que as células direcionadas para necrose, lise, extermínio ou destruição expressam números ou quantidades maiores de recetor, ligando, antígeno ou anticorpo do que as células não alvo. Tais células podem ser seletiva ou preferencialmente direcionadas para necrose, lise ou extermínio.
Os indivíduos em risco também incluem aqueles que são candidatos para e aqueles que passaram por ressecção cirúrgica, quimioterapia, imunoterapia, radioterapia ionizante ou química, terapia térmica local ou regional (hipertermia) ou vacinação. A revelação é, portanto, aplicável para tratar um indivíduo que está em risco de um tumor, um cancro, uma malignidade ou uma neoplasia metastática ou não metastática ou uma complicação associada a um tumor, um cancro, uma malignidade ou uma neoplasia metastática ou não metastática, por exemplo, devido ao reaparecimento ou novo crescimento de tumor, cancro, malignidade ou neoplasia metastática ou não metastática após um período de estabilidade ou remissão.
Os fatores de risco incluem género, estilo de vida (dieta, fumo), ocupação (pessoal médico e clinico, trabalhadores da agricultura e criação de gado), fatores ambientais (exposição a carcinógenos), histórico familiar (distúrbios autoimunes, diabetes, etc.), predisposição genética, etc. Por exemplo, indivíduos em risco de desenvolver melanoma incluem exposição excessiva ao sol (radiação ultravioleta), pele clara, números altos de nevos (nevo displástico), fenótipo do paciente, histórico familiar ou um histórico de um melanoma anterior. Os indivíduos em rico de desenvolver cancro podem ser, portanto, identificados por estilo de vida, ocupação, fatores ambientais, histórico familiar e peneiras genéticas para genes associados ao tumor, deleções de gene ou mutações de gene. Indivíduos em risco de desenvolver cancro de mama têm falta de Brcal, por exemplo. Indivíduos em risco de desenvolver cancro de cólon têm formação de pólipo em idade precoce ou com alta frequência ou genes supressores de tumor deletados ou com mutação, tal como polipose adenomatosa coli (APC), por exemplo.
Os indivíduos também incluem aqueles excluídos de outros tratamentos. Por exemplo, determinados indivíduos podem não ser bons candidatos para ressecção cirúrgica, quimioterapia, imunoterapia, radioterapia ionizante ou química, terapia térmica local ou regional (hipertermia) ou vacinação. Assim, os indivíduos candidatos para tratamento, conforme descrito no presente documento, incluem aqueles que não são candidatos para ressecção cirúrgica, quimioterapia, imunoterapia, radioterapia ionizante ou química, terapia térmica local ou regional (hipertermia) ou vacinação.
Os constructos de fusão podem ser formulados numa dose unitária ou forma farmacêutica unitária. Um constructo de fusão pode estar numa quantidade eficaz para tratar um indivíduo que tem proliferação celular indesejável ou anormal ou um distúrbio hiperproliferativo. Um constructo de fusão pode estar numa quantidade eficaz para tratar um indivíduo que tem um tumor, um cancro, uma malignidade ou uma neoplasia metastática ou não metastática. Um constructo de fusão pode estar numa quantidade eficaz para reduzir a fertilidade de um indivíduo. As doses unitárias exemplificativas estão na faixa de cerca de 25 a 250, 250 a 500, 500 a 1.000, 1.000 a 2.500 ou 2.500 a 5.000, 5.000 a 25.000, 5.000 a 50.000 ng; e de cerca de 25 a 250, 250 a 500, 500 a 1.000, 1.000 a 2.500 ou 2.500 a 5.000, 5.000 a 25.000, 5.000 a 50.000 pg.
As composições e os métodos descritos no presente documento podem ser colocados em contacto ou fornecidos in vitro, ex vivo ou in vivo. As composições podem ser administradas para fornecer o efeito pretendido como uma dosagem única ou múltiplas dosagens, por exemplo, numa quantidade eficaz ou suficiente. As doses exemplificativas estão na faixa de cerca de 25 a 250, 250 a 500, 500 a 1.000, 1.000 a 2.500 ou 2.500 a 5.000, 5.000 a 25.000, 5.000 a 50.000 pg/kg; de cerca de 50 a 500, 500 a 5.000, 5.000 a 25.000 ou 25.000 a 50.000 ng/kg; e de cerca de 25 a 250, 250 a 500, 500 a 1.000, 1.000 a 2.500 ou 2.500 a 5.000, 5.000 a 25.000, 5.000 a 50.000 pg/kg, em dias consecutivos ou dias alternados ou intermitentemente. As doses únicas ou múltiplas podem ser administradas em dias consecutivos, dias alternados ou intermitentemente.
As composições podem ser administradas e os métodos podem ser praticados por meio de administração sistémica, regional ou local, por qualquer via. Por exemplo, um constructo de fusão pode ser administrado por via sistémica, via regional ou via local, via intravenosa, via oral (por exemplo, ingestão ou inalação), via intramuscular, via intraperitoneal, via intradérmica, via subcutânea, intracavidade, via intracraniana, via transdérmica (tópica), via parenteral, por exemplo, via transmucosal ou via retal. As composições e os métodos descritos no presente documento, incluindo formulações farmacêuticas, podem ser administradas por meio de um sistema de entrada (micro)encapsulado ou embalado num implante para administração. São também fornecidos no presente documento constructos de fusão e métodos em que os constructos de fusão estão incluídos em composições farmacêuticas. Uma composição farmacêutica refere-se a veículos, diluentes ou excipientes "farmaceuticamente aceitáveis" e "fisiologicamente aceitáveis". Conforme utilizado no presente documento, o termo "farmaceuticamente aceitável" e "fisiologicamente aceitável", quando se refere a veículos, diluentes ou excipientes, inclui solventes (aquosos ou não aquosos), detergentes, soluções, emulsões, meios de dispersão, revestimentos, agentes de promoção ou retardamento de absorção ou isotónicos, compatíveis com administração farmacêutica e com os outros componentes da formulação. Tais formulações podem estar contidas num comprimido (revestido ou não revestido), cápsula (dura ou macia), microesfera, emulsão, pó, grânulo, cristal, suspensão, xarope ou elixir.
As composições farmacêuticas podem ser formuladas para serem compatíveis com uma via de administração particular. As composições para administração parenteral, intradérmica ou subcutânea podem incluir um diluente estéril, tal como água, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos. A preparação pode conter um ou mais conservantes para impedir o crescimento de micro-organismos (por exemplo, agentes antibacterianos, tal como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes, tal como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tal como ácido etilenodiaminatetra-acético; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade, tal como cloreto de sódio ou dextrose).
As composições farmacêuticas para injeção incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para administração intravenosa, os veículos adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). 0 veículo pode ser um solvente ou um meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez pode ser mantida, por exemplo, com a utilização de um revestimento, tal como lecitina, ou com a utilização de tensoativos. Os agentes antibacterianos e antifúngicos incluem, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico e timerosal. Incluir um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina, pode prolongar a absorção de composições injetáveis.
As formulações farmacêuticas adicionais e os sistemas de entrega são conhecidos na técnica e são aplicáveis nos métodos descritos no presente documento (veja-se, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18a edição, Mack Publishing Co., Easton, PA ; The Merck Index (1996) 12a edição, Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993); e Poznansky, et al., Drug Delivery Systems, R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. (1980), páginas 253 a 315). São também fornecidos no presente documento kits que incluem os constructos de fusão descritos no presente documento, composições de combinação e formulações farmacêuticas das mesmas embalados em material para embalagem adequado. Um kit inclui opcionalmente uma etiqueta ou inserto de embalagem que inclui uma descrição dos componentes ou instruções para utilização in vitro, in vivo ou ex vivo dos componentes no mesmo. As instruções exemplificativas incluem instruções para reduzir ou inibir a proliferação de uma célula, reduzir ou inibir a proliferação de células indesejáveis ou anormais, tal como uma célula hiperproliferante, reduzir ou inibir a proliferação de uma célula de tumor, cancro, maligna ou neoplástica metastática ou não metastática, tratar um indivíduo que tem um distúrbio hiperproliferativo, tratar um indivíduo que tem um tumor, cancro, malignidade ou neoplasia metastática ou não metastática ou reduzir a fertilidade de um animal.
Um kit pode conter uma coleção de tais componentes, por exemplo, dois ou mais constructos de fusão sozinhos ou em combinação com outra composição terapeuticamente útil (por exemplo, um fármaco antiproliferativo ou de intensificação imunológica). 0 termo "material para embalagem" refere-se a uma estrutura física que aloja os componentes do kit. 0 material para embalagem pode manter os componentes de forma esterilizada e pode ser produzido a partir de material comummente utilizado para tais propósitos (por exemplo, papel, fibra corrugada, vidro, plástico, folha metálica, ampolas, frascos, tubos, etc.).
Os kits descritos no presente documento incluem etiquetas ou insertos. As etiquetas ou insertos incluem "matéria impressa", por exemplo, papel ou cartolina, ou separada ou afixada a um componente, um kit ou material para embalagem (por exemplo, uma caixa) , ou fixada a uma ampola, tubo ou frasco que contém um componente do kit. As etiquetas ou insertos podem incluem adicionalmente um meio legível por computador, tal como um disco (por exemplo, disquete, disco rígido, disco ZIP), disco ótico, tal como CD- ou DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, fita magnética ou um meio de armazenamento elétrico, tal como RAM e ROM ou híbridos dos mesmos, tal como meio de armazenamento magnético/ótico, meio FLASH ou cartões do tipo de memória.
As etiquetas ou insertos podem incluir informações de identificação de um ou mais componentes nos mesmos, quantidades de dose, farmacologia clínica do ingrediente (ou ingredientes) ativo, incluindo mecanismo de ação, farmacocinética e farmacodinâmica. As etiquetas ou insertos podem incluir informações de identificação, informações do fabricante, números de lote, localização do fabricante e data.
As etiquetas ou insertos podem incluir informações sobre uma afeção, um distúrbio, uma doença ou um sintoma para o qual um componente do kit pode ser utilizado. As etiquetas ou insertos podem incluir instruções para o médico ou para um indivíduo utilizar um ou mais dos componentes do kit num método, um protocolo de tratamento ou um regime terapêutico. As instruções podem incluir quantidades de dosagem, frequência ou duração e instruções para praticar qualquer um dos métodos, protocolos de tratamento ou regimes terapêuticos apresentados no presente documento. As instruções exemplificativas incluem instruções para tratar uma proliferação celular indesejável ou anormal, células hiperproliferantes e distúrbios (por exemplo, tumor, cancro, malignidade ou neoplasia metastática ou não metastática). Os kits descritos no presente documento, portanto, podem incluir adicionalmente etiquetas ou instruções para praticar qualquer um dos métodos também descritos no presente documento, incluindo os métodos de tratamento.
As etiquetas ou insertos podem incluir informações ou qualquer beneficio que um componente possa fornecer, tal como um benefício profilático ou terapêutico. As etiquetas ou insertos podem incluir informações sobre efeitos secundários adversos potenciais, tais como avisos para o indivíduo ou médico em relação a situações em que poderia não ser adequado utilizar uma composição particular. Os efeitos secundários adversos poderiam também ocorrer quando o indivíduo tomou, tomará ou está atualmente tomando uma ou mais outras medicações que podem ser incompatíveis com a composição, ou o indivíduo passou, passará ou está atualmente passando por outro protocolo de tratamento ou regime terapêutico que poderia ser incompatível com a composição e, portanto, as instruções poderiam incluir informações em relação a tais incompatibilidades.
Os kits descritos no presente documento podem incluir adicionalmente outros componentes. Cada componente do kit pode estar confinado dentro de um recipiente individual e todos os vários recipientes podem estar dentro de uma embalagem única. Os kits descritos no presente documento podem ser projetados para armazenamento frio. Os kits descritos no presente documento podem ser, ainda, projetados para conter células hospedeiras que expressam constructos de fusão descritos no presente documento ou que contêm ácidos nucleicos que codificam constructos de fusão. As células no kit podem ser mantidas sob condições de armazenamento adequadas até as células estarem prontas para serem utilizadas. Por exemplo, um kit que inclui uma ou mais células pode conter um meio de armazenamento de células adequado de modo que as células possam ser descongeladas e cultivadas.
Conforme utilizado no presente documento, as formas no singular "um", "uma" e "o", "a" incluem referentes no plural a não ser que o contexto indique claramente de outro modo. Assim, por exemplo, a referência a "um constructo de fusão" ou um "domínio lítico" inclui uma pluralidade de tais constructos de fusão ou domínios líticos e assim por diante.
Conforme utilizado no presente documento, todos os valores numéricos ou faixas numéricas dentro das faixas ou frações dos valores ou os números inteiros dentro das faixas a não ser que o contexto indique claramente de outro modo. Assim, por exemplo, a referência a uma faixa de 90 a 100% inclui 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, etc., assim como 91,1%, 91,2%, 91,3%, 91,4%, 91,5%, etc., 92,1%, 92,2%, 92,3%, 92,4%, 92,5%, etc., e assim por diante.
Os exemplos a seguir são destinados a ilustrar o âmbito da invenção descrita nas reivindicações.
Exemplos Exemplo 1
Os estudos iniciais incluem triagem in vitro de 28 péptidos de domínio lítico que continham diferentes sequências de articulação entre a porção química de péptido lítico e ligandos; que continham 30% de D aminoácidos (D-enantiómeros), que tinham 18 e 15 aminoácidos de comprimento para a porção química de péptido lítico e continham uma sequência de articulação ou seus D-enantiómeros. A introdução de ácido α-aminocaproico como um espaçador em análogos de Phor21 de 21, 18 e 15 aminoácidos foi estudado. Os ligandos escolhidos para o estudo incluíram um fragmento de 15 aminoácidos da porção química de ligação da cadeia beta de gonadotrofina coriónica, e LHRH, um decapéptido que representa um ligando de funcionamento completo.
Exemplo 2
Esse exemplo descreve a triagem por toxicidade celular (IC50) e atividade hemolítica com utilização de uma linhagem de células de cancro de mama.
Constructos de fusão de dezoito pCG-ala e oito LHRH foram estudados e comparados a Phor21-pCG-ala e péptidos não conjugados Phor21 e Phorl8 (338913) = CLIP71. A linhagem de células de cancro de mama humano MDA-MB-435S.luc, que superexpressa gonadotrofina coriónica (CG) e recetores de hormona de libertação de hormona luteinizante (LHRH), foi utilizada para triagem nos números de passagem 248 a 252. A linhagem de células MDA-MB-435S.luc foi construída a partir da linha de células MDA-MB-435S obtida junto à Coleção de Cultura Celular do Tipo Americana por transfeção estável com o plasmídeo PRC/CMV-luc que contém o gene de piralisluciferase Photinus e um gene de resistência a anticorpo por lipofeção. A linhagem de células transfetada estavelmente foi selecionada com a utilização de G418 e os clones com a expressão mais alta para o gene de luciferase foram testados quanto à sua expressão de recetor de LH e LHRH.
As células MDA-MB-435S.luc foram cultivadas em meio L 15 de Leibovitz, 10% de soro fetal bovino, 0,01 mg/ml de insulina bovina, 100 IU/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina. As células foram cultivadas em frascos fechados firmemente. As incubações foram conduzidas com a utilização de placas de 96 poços a 10.000 células por poço. As células foram tipicamente semeadas em placas de 96 poços, e o meio foi substituído após 48 horas de incubação. Cada ensaio foi conduzido em concentrações crescentes de doses de 0, 0,001, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 e 100 micromolar de conjugado de péptido lítico-domínio de ligação. Cada conjugado de péptido lítico-domínio de ligação fornecido na forma liofilizada foi recém-dissolvida em solução salina e adicionado às células. A duração da incubação foi tipicamente de 24 h, e ensaios de viabilidade celular foram conduzidos com a utilização de ensaios de conversão de formazano (ensaio MTT). Os controlos continham solução salina ou 0,1% de triton como referência para morte celular de 0 e 100%, respetivamente.
Os dados foram processados e analisados com a utilização do software Graph Pad Prizm 4™ (Graph Pad Prizm, Inc). A análise estatística para significância foi determinada por um teste T de Student de duas caudas. Cada estudo foi conduzido para atingir um N de pelo menos 8. O efeito de aumentar o comprimento do constructo de fusão foi verificado (Javadpour et al., J Med Chem 39:3.107 (1996); Javadpour e Barkeley, Biochemistry 36:9.540 (1997); Leuschner e Hansel, Current Pharmaceutical Design, 10:2.299 (2004); e Leuschner e Hansel, Biol Reprod 73:255 (2005)). Os péptidos liticos conjugados na terminação C a pCG-ala mostraram toxicidade crescente com o aumento do comprimento do constructo. O IC50 para péptidos de vários comprimentos foi: 14 aminoácidos (Phor 14) 5,74, 15 aminoácidos (Phorl5) 1,92, 18 aminoácidos (Phorl8 = CLIP71) 1,09, 21 aminoácidos (Phor21) 2,31 e 28 aminoácidos (Phor28) 1,36 μΜ (Quadro 3). O efeito da posição da porção química de ligação (terminação N ou C) foi verificado. Em resumo, foram estudados os constructos de fusão Phor21-pCG-ala (terminação C) , pCG-ala Phor21 (terminação N) , LHRH-Phor21 (terminação N) e Phor21-LHRH (terminação C) . O IC50 dos péptidos foi: Phor21-3CG-ala 2,3 μΜ, para βΟΟ-3ΐ3-ΡϊιθΓ21 4,7 μΜ, para LHRH-Phor21 2,65 μΜ e para Phor21-LHRH 1,71 μΜ. Os dados demonstram que o posicionamento de terminal C das porções de ligação pCG-ala e LHRH mostraram maior toxicidade que se a porção química de ligação fosse posicionada na terminação N. O recetor de LHRH está presente em muitos cancros humanos (veja-se o Quadro 1) . A atividade de LHRH como a porção química de ligação foi comparada com pCG-ala como a porção química de ligação.
As toxicidades de LHRH-Phor21 e Phor21-3CG-ala foram comparadas em células de cancro de mama MDA-MB-435S.luc humanas in vitro, em incubação por 2 ou 24 horas. Os dados indicam que LHRH-Phor21 exterminou as células mais rápido que Phor2l-pCG-ala, LHRH-Phor21, produzindo extermínio de células dentro de 2 horas (Figura 1).
Quadro 1: Recetores de LH e LHRH em Cancros Humanos
A introdução de sequências de articulação, espaçador ou ligante entre o domínio lítico e porção química de ligação resultou em péptidos com potência maior que Phor21-3CG-ala em extermínio de células. (Figura 2, Quadro 2). Embora a introdução de sequências de articulação e espaçadores no constructo de fusão Phor21-pCG-ala não tenha alterado a atividade de extermínio de células significativamente, o efeito de ASAAS como uma sequência de articulação aumentou significativamente a toxicidade de péptidos líticos com 15 aminoácidos para o conjugado de pCG; esse efeito estava ausente no caso do péptido conjugado de 3CG e LHRH Phorl8-LHRH e Phorl8-ASAAS-LHRH, que foram igualmente eficazes in vitro (Quadro 2, Figura 4) . Um efeito similar foi observado quando a sequência de articulação foi substituído por um espaçador de 6 carbonos, ácido alfa amino caproico (Quadro 2) . A substituição de alanina por glicina na segunda sequência de articulação (GSGGS) resultou em atividade significativamente mais baixa, sugerindo que a glicina pode ter um efeito de desestabilização de hélice. (Figura 2, Quadro 2).
Quadro 2: Efeito de comprimento de péptido de péptidos conjugados
a pCG-ala
Para verificar o efeito de substituições de D-aminoácido, um constructo de fusão Phor21-pCG-ala foi sintetizado como enantiómero D (doravante denominado como D-ala-Phor2l-3CG-ala). Esse constructo de fusão mostrou toxicidade comparável a células de cancro de mama MDA-MB-435S.luc in vitro (Phor21-3CG-ala 2,31 μΜ, D-ala-Phor21-pCG-ala 2,15 μΜ (Quadro 3); D-ala-Phorl8-pCG-ala foi 1,4 vezes mais potente que Phor21-pCG-ala (IC5o 1,6 μΜ) , a contraparte LHRH foi significativamente mais potente que o D-enantiómero (Phor21-LHRH (IC50 de 1,31 μΜ) em comparação com D-ala-Phor21-LHRH com IC50 de 0,75 μΜ, D-Phorl8-LHRH com IC50 de 1,42 μΜ e Phorl8-Lupron com IC50 de 1,95 μΜ.
Os valores de IC50 para péptidos liticos conjugados a pCG-ala e LHRH em células de cancro de mama MDA-MB-435S.luc são sumarizados no Quadro 3 e na Figura 3. Em resumo, os péptidos com IC50 significativamente mais baixo que Phor21-pCG-ala (2,31±0,16) foram: Phor28-pCG-ala (1,36 ±0,09 μΜ; p<0,0001), Phorl5-ASAAS-pCG-ala (1,48±0,24 μΜ; p<0,005), Phorl5-C6^CG-ala (1,31±0,17 μΜ; p<0,004) (C6=6 ácido aminocaproico) , Phorl8-pCG-ala (1,09±0,17 μΜ; p< 0, 0001),
Phor21-LHRH (1,31±0,1 μΜ; p< 0,0001), D-ala-Phor21-LHRH (0,75±0.1 μΜ; p<0, 0001), Phorl8-ASAAS-LHRH ( 0,8 8±0.12 μΜ; p < 0, 0001), Phorl8-LHRH (0,87±0.11 μΜ; p < 0, 0001), (KKKFAFA)3-LHRH (0,78±0,21 μΜ; p< 0,0004) e D-ala-Phorl8-LHRH (1,42±0,08 μΜ; p < 0,004).
Os constructos de fusão de LHRH foram em geral mais potentes (mais tóxicos e de ação mais rápida, Figura 1) que os constructos de fusão de pCG-ala. Em resumo, Phor21-LHRH, D-ala-Phor21-LHRH, Phorl8-ASAAS-LHRH, Phorl8-LHRH e controlo de péptido 338614 ( (KKKFAFA) 3= péptido inativo) foram significativamente mais tóxicos às células de cancro de mama humanas em comparação com Phor2l-pCG-ala (p<0,003). Todos os constructos de fusão de LHRH foram quase igualmente eficazes, exceto por LHRH-Phor21, que foi significativamente menos potente quando a porção química de ligação estava posicionada na terminação C em relação à porção litica. D-ala-Phorl8-LHRH foi igualmente eficaz em comparação com Phor21-LHRH; Phorl8-Lupron foram menos tóxicos, mas comparável a Phor21^CG-ala. (Figura 4, Quadro 3; Lupron é QHWSY(D-Leu)LRPNEt).
Os constructos de fusão com valores de IC50significativamente mais baixos que Phor21-LHRH (1,34±0,1 μΜ) foram: D-ala-Phor21-LHRH (0,75±0,12 μΜ; p< 0,002), Phorl8-ASAAS-LHRH (0,88±0,11 μΜ; p< 0,0001), Phorl8-LHRH (0,87±0,12 μΜ; p<0,004) e (KKKFAFA)3-LHRH (0,78±0,21 μΜ; p< 0,04) . Quando os mesmos constructos de fusão foram comparados entre as porções de ligação pCG-ala e LHRH, em todos os casos, os constructos de fusão de LHRH foram significativamente mais tóxicos em comparação com suas contrapartes pCG-ala.
Quadro 3: Péptidos citolíticos e conjugados de péptido -sumário de características de IC50 e HA50 em células MDA-MB-
435S
.luc
As atividades hemolíticas agudas para 21 constructos de fusão, incluindo Phorl8-Lupron e D-ala-Phorl8-LHRH, foram estudadas. Os resultados são sumarizados nas Figuras 5 e 6 e no Quadro 3. A atividade hemolítica foi determinada em placas de 96 poços com a utilização de uma diluição em série de péptidos expostos a 0,5% de RBC humana. Os controlos foram solução salina (sem morte de RBC) ou 0,1% de Triton X 100 (100% lise de RBC). As concentrações de péptido estavam na faixa de 0 a 100 μΜ. As incubações foram conduzidas por 2 h.
Para verificar o IC50 de vários constructos de fusão em diferentes linhagens celulares de cancro humano em comparação com cisplatina, os IC50 de constructos de fusão foram avaliados como no Quadro 3. Os resultados são mostrados abaixo:
Valores de IC50 [μΜ] em Linhagens de Células de Cancro Humano em comparação com Cisplatina
Os dados em geral indicam atividades hemoliticas muito baixas para os constructos de fusão estudados, exceto por Phor21-LHRH, LHRH-Phor21 e Phorl8-Lupron. Sob condições similares, os seguintes constructos de fusão não mostraram qualquer atividade hemolítica (veja-se a Figura 5): Phorl5-ácido aminocaproico-p-CG-ala (337474), D-ala-Phor21 β-CG-ala (337481) > 150.000 μΜ, Phor21, Phor 18 não conjugado = CLIP71, (KKKFAFA)3-pCG-ala, Phor 21 (338982), Phorl8 = CLIP71 (338983), D-ala-Phorl8-LHRH (339385) e (KKKFAFA)3-LHRH (338984). Os enantiómeros de D-aminoácido não tiveram atividade hemolítica mensurável.
Os constructos de fusão com atividades hemolíticas < 50 μΜ foram conforme segue: Phor21-LHRH (25 μΜ) , LHRH-Phor21 (33 μΜ) e Phorl8-Lupron (21 μΜ).
Os constructos de fusão com atividades hemolíticas > 100 μΜ foram conforme segue: Phorl8^-CG-ala (337476) e Phorl8-LHRH (338613).
Os constructos de fusão com atividades hemolíticas entre 50 e 100 μΜ foram conforme segue: (KKKFAFA) 3-LHRH (95 μΜ), Phor2l-3CG-ala e Phor2l-ASAAS-pCG-ala tiveram HA50 similar de 70 μΜ.
Os constructos de fusão com atividades hemolíticas entre 400 e 1.300 μΜ foram conforme segue: Phorl4-pCG-ala (337464), Phor18 GSGGS β-CG-ala (337467), Phorl8 ASAAS β-CG-ala, (337470), Phorl5 ASAAS β-CG-ala (337471), D-ala-Phor21-LHRH (338611) e Phorl8-ASAAS-LHRH (338612) .
Um critério clinicamente significativo é a razão entre toxicidade celular (IC50) e atividade hemolítica (HA50) ou IC50 /HA50 (Figura 6, Quadro 3) . Estudos in vivo foram realizados com a utilização de uma concentração máxima de 10 μΜ de constructo de fusão que está diversos fatores abaixo dos valores de HA50 medidos para a maioria dos constructos de fusão.
Os conjugados de LHRH com D-ala-Phor21, Phorl8-ASAAS D-ala-Phorl8 e Phorl8 tiveram razões IC5o/HA5o muito baixas de 0,001 a 0, 006 (em comparação com Phor2l^CG-ala 0,03) . A toxicidade a células MDA-MB-435S.luc é significativamente mais alta em comparação com Phor21-3CG-ala: D-ala) Phor21-LHRH é 3 mais tóxica que Phor21-3CG-ala, Phorl8-LHRH e Phorl8-ASAAS-LHR é 2 vezes mais potente, D-ala-Phorl8-LHRH é 1,5 mais potente (Figura 6).
Em resumo, os constructos de fusão avaliados pelos critérios de toxicidade aumentada e menos atividade hemolitica (razão IC5o/HA5o) poderiam ser: Phorl8-pCG-ala, Phorl8-ASAAS-pCG-ala, Phorl5-ASAAS-pCG-ala, Phorl5-C6-pCG-ala, D-ala-Phor21-LHRH, Phorl8-LHRH, Phorl8-ASAAS-LHRH e D-ala-Phorl8-LHRH.
Exemplo 3
Esse exemplo descreve estudos in vivo num modelo de xenoenxerto de murganho de cancro de mama com vários tipos e doses de constructos de fusão de pCG e LHRH.
Os murganhos Nu/Nu fêmeas foram injetados por via subcutânea com uma suspensão de MDA-MB-435S.luc/Matrigel HC 6 (1 x 10 células) . O cronograma de tratamento é mostrado na Figura 7. Em resumo, o tratamento começou no dia 13 após a injeção de célula tumoral e continuou no dia 19 e 25. Os tratamentos foram: controlo de solução salina, Phor21 (5 mg/kg), Phorl8 (5 mg/kg) , péptido (KKKFAFA)3 - pCG-ala (5 mg/kg), Phor21-pCG-ala (0,01, 1 e 5 mg/kg), Phorl8-pCG-ala (0,01, 1 e 5 mg/kg), D-ala-Phor21-pCG-ala (0,01 e 5 mg/kg), linha de base 8 a 12 murganhos por grupo, 14 grupos. As doses para injeções semanais foram 5, 1 e 0,01 mg/kg de peso corporal, dadas como uma injeção única de bolus.
Todos os grupos de murganhos toleraram as injeções bem. Apenas um murganho morreu em cada injeção com 337476 na dose de 5 mg/kg. A morte foi um evento agudo. Todos os murganhos em outros grupos de tratamento sobreviveram. Nenhum murganho morreu como consequência de injeção depois de 10 minutos após a injeção.
O efeito de injeções de péptido citolitico nos tumores primários é ilustrado na Figura 8. Em resumo, as Figuras 8A a 8C mostram volume de tumor durante o curso do estudo para cada péptido individual. As Figuras 8D a 8G mostra as caracteristicas do tumor na necropsia: volume do tumor (D), peso do tumor (E), células tumorais vivas (F), conduções do tumor (G). A eficácia do tratamento foi calculada como diferença entre medições no começo do tratamento em comparação com a medição no final do estudo (Figura 8H e 81) . A Figura 8J mostra o peso corporal dos murganhos na necropsia. A viabilidade de células nos tumores foi determinada ao final do estudo, quando os tumores foram medidos quanto à atividade de luciferase. 0 volume do tumor diminuiu significativamente em todos os animais tratados com péptidos contendo βΟΰ como um ligando (II, A), p<0,05 em comparação com a linha de base (exceto para 323033) a 0,01 mg/kg e os controlos de (KKKFAFA) 3-3CG-ala, Phor 21 e Phor 18 = CLIP71 não conjugado. Os volumes do tumor foram significativamente reduzidos em comparação com os controlos de solução salina em todos os grupos de tratamento, exceto para (KKKFAFA) 3-pCG-ala, Phor 21 e Phor 18, que foram ineficazes na redução do volume de xenoenxerto.
Os pesos do tumor também diminuiram significativamente (p<0,001) em todos os grupos de tratamento com péptidos conjugados a 3CG em comparação com animais tratados com solução salina ou péptidos (KKKFAFA)3. A viabilidade de célula tumoral, conforme medida por atividade de luciferase, correlacionou-se bem com as alterações observadas em pesos do tumor e volumes do tumor. A eficácia do tratamento, medida como redução de peso do tumor ou células tumorais viáveis em comparação com os valores de linha de base, mostrou uma resposta ao tratamento dependente de concentração para 323033 e 337476. 337481 mostrou consistentemente redução da carga tumoral e células tumorais vivas em dosagens de 0,01, 1 e 5 mg/kg. 323033 foi mais eficaz em dose de 1 mg/kg em comparação com 5 mg/kg (observou-se o mesmo já em experimentos anteriores), mas é apenas significativamente diferente de controlos de solução salina na dose mais baixa aplicada. Os constructos de fusão 337476 e 337481 foram significativamente mais eficazes a 5 e 0,01 mg/kg em comparação com 323033 (p<0,0001) na redução de cargas tumorais e células tumorais viáveis (p<0,004) abaixo dos valores de linha de base. O constructo de fusão 337481 não mostra dependência de concentração e foi o mais eficaz de todos os constructos testados.
Tumores císticos foram encontrados em murganhos tratados com os constructos de fusão 337476 e 337481, o gue ocorreu em 80 a 90%, mas apenas em 30% no grupo de tratamento com 323033 a 1 mg/kg. (Formação de cisto não foi vista nesse modelo de xenoenxerto. Os cistos consistiram em cápsulas preenchidas com líquido.) Embora não esteja claro, postulou-se que os tumores císticos ocorrem quando as células são exterminadas rapidamente num tumor de crescimento rápido. Os cistos estavam presentes em xenoenxertos de tumor de próstata tratados com Phor 21.
Os resultados de química do sangue e contagem sanguínea completa para os grupos de tratamento revelaram que em nenhum caso os tratamentos afetaram a função hepática, renal ou cardíaca. A contagem de plaquetas e contagem de WBC e RBC estavam dentro da faixa normal, indicando que o tratamento extermina especificamente as células tumorais e não causou anemia na referida concentração nem afetou qualquer outra função corporal vital observável. Os constructos de fusão foram bem tolerados sem nenhum efeito secundário a longo prazo.
Com base nos dados sobre eficácia de tumor in vivo supracitados, Phorl8-pCG-ala (337476) e D-ala-Phor2Ι-βΟΘ-ala (337481) são significativamente mais potentes que a referência Phor21-pCG-ala (323033) em relação à redução de peso do tumor (p<0,0001) e destruição de células tumorais viáveis (p<0, 004) em comparação com os valores de linha de base. Ambos constructos de fusão não causaram hemólise in vivo e não mostraram efeitos secundários persistentes na dose mais alta utilizada (5 mg/kg). É possível que a eficácia tumoral de Phorl8-3CG-ala pudesse ser maior com múltiplas injeções mesmo na dose mais baixa.
Para constructos de fusão de LHRH, o modelo de xenoenxerto de murganho para cancro de mama foi utilizado. Em resumo, murganhos Nu/Nu fêmeas, estirpe não consanguínea, 5 semanas de vida (Charles River) foram injetados por via subcutânea com uma suspensão de 6 MDA-MB-435S.luc/Matrigel (1 x 10 células). O tratamento foi iniciado no dia 21 após a injeção de célula tumoral e continuou no dia 26 e 29. As doses para injeções semanais de constructo de fusão foram 2, 0,2 e 0,02 mg/kg de peso corporal, dadas como uma injeção única de bolus. Todos os murganhos foram necropsiados 34 dias após a injeção de célula tumoral - os valores de linha de base para pesos de tumor foram obtidos sacrificando-se 8 murganhos no início do tratamento. Tumores primários, fígado, rim, pâncreas, coração, pulmão e baço, foram recolhidos e preparados para avaliação histológica em formalina. Os pesos do tumor foram registados na necropsia, parte dos tumores foi congelada a -80 °C para determinação de ensaio de luciferase.
Os grupos incluíram controlo de solução salina, Phor2l-pCG-ala - 323033 (0,02, 0,2 e 2 mg/kg), D-ala-Phor21-LHRH -338611 (0,02, 0,2 e 2 mg/kg), (KKKFAFA)3LHRH -338614 (5 mg/kg), Phorl8-LHRH - 338613 (0,02, 0,2 e 2 mg/kg), Phorl8-ASAAS-LHRH -338612 (0,02, 0,2 e 2 mg/kg), D-ala-Phorl8-LHRH - 339385 (0,02, 0,2 e 2 mg/kg) e Phorl8-Lupron - 339347 (0,02, 0,2 e 2 mg/kg), linha de base 12 murganhos por grupo.
Todos os grupos toleraram as injeções bem. Apenas dois murganhos morreram durante a segunda e a terceira injeções com Phorl8-ASAAS-LHRH na dose de 2 mg/kg (esses murganhos eram da mesma gaiola) . A morte foi um evento agudo. Todos os murganhos em outros grupos de tratamento sobreviveram. Nenhum murganho morreu como consequência de injeção depois de 10 minutos após a injeção. A Figura 9 sumariza os efeitos de injeções de constructo de fusão nos tumores primários como medidas de volume durante o curso do estudo para cada constructo individual. Em todos os grupos, os volumes do tumor diminuíram durante o tratamento, exceto para murganhos tratados com o conjugado de (KKKFAFA) 3-LHRH ou em controlo de solução salina, em que o crescimento tumoral exponencial foi observado. O volume do tumor registado depois de 30 após o tratamento mostra uma redução (p < 0,01) em comparação com a linha de base para todos os constructos de fusão com os menores volumes de tumor registados nos grupos de tratamento com Phorl8-ASAAS-LHRH e Phorl8-LHRH.
As características dos tumores na necropsia são sumarizadas na Figura 10: (A) peso do tumor, (B) alterações de pesos do tumor em comparação com a linha de base, (C) número total de células tumorais vivas, (D) alterações de células tumorais vivas totais em comparação com a linha de base e (E) pesos corporais na linha de base e na necropsia. A viabilidade de células tumorais foi determinada ao final do estudo, quando os tumores foram medidos quanto à atividade de luciferase. A eficácia do tratamento foi calculada como diferença entre medições no começo do tratamento em comparação com a medição no final do estudo (Figura 10B e 10D).
Os pesos do tumor e os números totais de células tumorais vivas diminuíram significativamente em todos os animais em todos os grupos de tratamento mesmo na dose mais baixa de 0,02 mg/kg quando os conjugados de LHRH foram dados em comparação com o controlo de solução salina e com péptido conjugado de (KKKFAFA)3-LHRH (p<0,0001). Os pesos de tumor totais diminuíram em comparação com a linha de base significativamente em todos os animais tratados com 2 mg/kg de péptidos contendo LHRH e a 0,02, 0,2 e 2 mg/kg para D-ala-Phorl8-LHRH (A), (p<0,05).
As seguintes concentrações resultaram em pesos de tumor similares à linha de base: Phor21-3CG-ala - 323033) a 0,02 mg/kg (p<0,07) e 0,2 (p<0,06); Phorl8-Lupron a 0,2 e 0,02 mg/kg de dosagem, Phorl8-LHRH a 0, 2 mg/kg e D-ala-Phor21-LHRH a 0,2 mg/kg. Quando os pesos de tumor totais foram comparados com uma dose de 0,02 mg/kg de Phor21-3CG-ala, Phorl8-ASAAS-LHRH e D-ala Phorl8-LHRH foram superiores à dosagem de 0,02 mg/kg (p<0,05). O número de células tumorais vivas foi determinado e plotado na Figura 10C como o número total de células tumorais vivas e na Figura 10D como alterações em células tumorais vivas em comparação com a linha de base. A viabilidade celular, conforme medida por atividade de luciferase, correlacionada com as alterações observadas em peso do tumor e volume do tumor exceto para Phorl8-ASAAS-LHRH e Phorl8-LHRH, em que uma redução de células tumorais vivas foi observada. O tratamento com D-ala-Phorl8-LHRH (339385) e Phorl8-ASAAS-LHRH (338612) foi superior a Phor2l-pCG-ala em dose de 2 mg/kg (p<0,04). A eficácia de tratamento medida como uma redução de peso de tumor ou células tumorais viáveis em comparação com os valores de linha de base mostrou uma resposta ao tratamento dependente de concentração para todos os constructos de fusão, exceto para D-ala-Phor21-LHRH em relação aos pesos de tumor e células tumorais vivas. D-ala-Phorl8-LHRH mostrou consistentemente redução dos pesos de tumor e células tumorais vivas em dosagens de 0,02, 2 e 2 mg/kg. Os constructos de fusão mais eficazes nesse experimento foi Phorl8-ASAAS-LHRH (338612) e D-ala-Phorl8-LHRH (339385) na redução do número de células tumorais vivas e pesos de tumor a 2 mg/kg. Phorl 8-ASAAS-LHRH e D- ala-Phorl8-LHRH foram superiores em comparação com dose de 2 e 0,02 mg/kg de Phor21-pCG-ala, (p<0,05). Phorl8-Lupron foi menos eficaz na redução do tamanho de tumor e células tumorais vivas.
Os resultados de química do sangue e contagem sanguínea completa para os grupos de tratamento revelaram que em nenhum caso os tratamentos afetaram a função hepática, renal ou cardíaca. A contagem de plaquetas e contagem de WBC e RBC estavam dentro da faixa normal, sugerindo que o tratamento destrói especificamente aos tumores e não causou anemia na referida concentração e não afetou quaisquer outras funções corporais vitais observáveis. Níveis de potássio elevados de 1,5 vezes em comparação com os controlos de solução salina foram observados em murganhos injetados com Phorl8-Lupron, Phorl8-LHRH e D-ala-Phor21-LHRH. Os constructos de fusão foram bem tolerados sem nenhum efeito secundário a longo prazo.
Com base nos dados sobre eficácia de tumor in vivo supracitados, Phorl8-ASAAS-L HRH (338612) e D-ala-Phorl 8-LHRH (339385) são significativamente mais potentes que a referência Phor21-pCG-ala em relação à redução de peso do tumor (p<0,05) e destruição de células tumorais viáveis (p<0,04). Foram igualmente eficazes como Phor21-3CG-ala D-ala-Phor21-LHRH e Phorl8-LHRH. Ambos os constructos de fusão não causaram hemólise in vivo ou outros efeitos secundários. É possível que a eficácia de Phorl8-ASAAS-LHRH (338612) e D-ala-Phorl8-LHRH (339385) pudesse ser maior com múltiplas injeções mesmo na dose mais baixa.
Exemplo 4
Esse exemplo descreve estudos de especificidade e expressão de recetor in vitro e in vivo. A densidade de expressão de recetor de LH tanto antes como após o tratamento será analisada para determinar se o tratamento resulta em regulação decrescente de expressão de recetor. A imunocitoquímica em comparação com ensaios Western Blot e RIA para quantificação. A determinação de recetor de LH e LHRH em células MDA-MB-435S.luc, e células CHO e TM4 com a utilização de IHC com lâminas de câmara e técnicas de Western Blot. 0 mesmo número de passagem de cada linhagem de células será testado quanto à sensibilidade a péptido litico CG e péptido litico LHRH. A especificidade de constructos de fusão de recetor de LH foi analisada em células MDA-MB-435S.luc (recetores tanto de LHRH como de CG) , TM4 (sem recetores de LHRH) e CHO (sem recetores de CG) . Os dados de IC50 mostram uma redução significativa em sensibilidade em células TM4 para LHRH-Phor21 (10,9 μΜ) , enquanto as células CHO mostram baixa sensibilidade a Phor21-3CG-ala (24,6 μΜ) em comparação com células MDA-MD-435S.luc (2,3 μΜ) (Figura 12) . A expressão de recetor in vivo é medida em conjunto com o tratamento com constructo de fusão. A expressão de recetor in vivo é medida no começo e no final do tratamento com constructo de fusão tratamento.
Exemplo 5
Esse exemplo descreve o tratamento de combinação com constructos de fusão e um agente quimioterápico.
Os estudos preliminares de linhagens celulares de cancro de ovário (células OVCAR-3, resistente a múltiplos fármacos) incubadas por 48 h com Phor21-pCG-ala e
doxorrubicina foram realizados. A viabilidade celular foi determinada como redução de s formazano. Uma diminuição de IC50 com tratamento com doxorrubicina decrescente em incubação simultânea com Phor21-pCG-ala. A diminuição é de 10 μΜ a 0,9 a 0,3 a 0,05 μΜ em concentrações de doxorrubicina de 0, 0,5, 2 e 10 pg/ml. (Figura 11) . O tratamento com Phor21^CG-ala potencializou a resposta à doxorrubicina. Os dados mostraram que Phor21-pCG-ala é mais eficaz (13 vezes) quando as células são coincubadas com doxorrubicina. 0 pré-tratamento de células de cancro com doxorrubicina ou cisplatina, seguido por tratamento com constructos de fusão de LH ou LHRH na presença e na ausência de LH ou LHRH, mostrará se a citotoxicidade das células ao constructo é alterada. A eficácia in vivo de tratamento de combinação foi testada num modelo de tumor de xenoenxerto (MDA-MB-435S). Os murganhos são tratados com uma combinação de um constructo de fusão e um fármaco quimioterápico e comparados com controlos adequados. Os murganhos foram tratados de acordo com o cronograma padrão utilizado para o fármaco e são tratados uma vez por semana por 3 semanas com o constructo de fusão.
Os conjugados de fusões têm uma alta margem de segurança que considera parâmetros tais como atividade hemolitica, dose tolerada máxima (MTD) (até 16 a 25 mg/kg) em comparação com a dose eficaz antitumor (0,02 ou 0,01 mg/kg). A margem de segurança para Phor21-pCG-ala é 16 enquanto um valor de 800 pode ser atingido para Phorl8^CG-ala e Phorl 8-LHRH. Em comparação, a margem de segurança para Phorl 8-Lupron é apenas 8. O Quadro 6 abaixo é um sumário dos conjugados de acordo com vários critérios.
Código de classificação:
Pontos alocados: 123 Atividade in vitro lx 2x 3x HA50 < 50 50 a 100 > 100 IC50 /HA50 <0,03 <0, 006 <0,004 Eficácia in vivo Em comparação a 33 igual melhor MTD comparado A 33 igual melhor 1) IC50 de 33 foi 2,31 μΜ, valores expressos como IC50 de 33/IC50 de péptido. 2) Atividade hemolitica expressa como HA50 [μΜ] . 3) O desempenho in vivo refere-se à significância em redução de peso tumoral e redução de célula tumoral viva vs valores de linha de base em comparação com os mesmos parâmetros de péptido 33. 4) Dose injetada resultando em 66,6% de sobrevivência (aguda e 8 a 14 dias após a injeção). Códigos de péptido: 33 = Phor2^CG-ala 76 = Phorl8-pCG-ala 81 = D ala Phor2l-pCG-ala
85 = D ala Phorl8-LHRH 47 = Phorl8-Lupron
13 = Phorl8-LHRH
11 = D ala Phor21-LHRH
12 = Phorl8-ASAAS-LHRH 71 = Phorl5-pCG-ala 74 = Phorl5-C6-pCG-ala Exemplo 6
Esse exemplo descreve estudos cinéticos in vitro do péptido KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG (Phorl8-LHRH (338613)) em várias linhagens celulares de cancro.
Os fármacos quimioterápicos padrão interagem através de intercalação de DNA, interação de microtúbulo ou são inibidores de trajetórias de transdução de sinal. Portanto, seu mecanismo de ação determina o intervalo de tempo necessário para destruir as células-alvo. A cinética para a doxorrubicina in vitro destruir células de cancro de mama humano, tal como MDA-MB-435S, foi relatada como sendo tão rápida quanto 4 horas, e outro padrão de tratamentos de cuidado pode levar ainda mais tempo. 0 mecanismo de ação mais comum na destruição de células de cancro é a apoptose. Como um processo reversível e devido à ocorrência de resistência a múltiplos fármacos (MDR), ação de bombas de Pgp que exportam moléculas de fármaco em células de cancro MDR, o padrão de tratamentos de cuidado pode ser ineficaz.
Em contraste aos fármacos quimioterápicos, a ação direta de membrana pode destruir as células de cancro dentro de minutos. Os compostos ativos em membrana, tais como péptidos líticos catiónicos, incluem Phorl8-LHRH (338613) (KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG).
Para determinar a cinética de citotoxicidade, estudos de curso do tempo detalhados foram conduzidos com a utilização de Phorl8-LHRH (338613) em comparação com a porção química de péptido lítico não direcionada Phor 18 = CLIP71 (338983) em várias linhagens celulares que expressam recetores-alvo de LHRH em vários níveis. As membranas de linhagens celulares não cancerosas são neutras e são resistentes a péptidos citolíticos, em contraste a linhagens celulares de cancro, que têm um alto teor de ácido fosfatídico em sua membrana externa.
As linhagens celulares de cancro de mama estudadas foram MDA-MB-435S (recetor de estrogénio alfa negativo), MCF-7 e T47D (recetor de estrogénio alfa positivo), linhagens celulares de cancro de ovário (OVCAR-3 e SKOV-3), cancro de próstata (LNCaP), a linhagem celular epitelial de mama não maligna MCF-10A e a linhagem celular de fibroblasto de murganho NIH:3T3. 0 papel do direcionamento de recetor de LHRH na eficácia de Phorl8-LHRH (338613) foi também avaliado.
As células forma semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 10.000 células/poço. O tratamento foi iniciado após 48 h adicionando-se Phorl8-LHRH (338613) (APC 338613, Lote n° P080401) ou Phorl8 = CLIP71 (APC 338983, Lote n° WO8033C1) em concentrações de 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 50 e 100 μΜ. Os controlos continham solução salina USP ou 0,1% de TritonX-100™ como referência para morte celular de 0 e 100%, respetivamente. As incubações foram terminadas removendo-se o meio de cultura após 2 minutos, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 6 horas, 24 e 48 horas. A viabilidade celular foi avaliada através de ensaio de conversão de formazano (ensaio MTT, (CellTiter 96 Aqueous One, Promega n° G3582). A conversão de formazano foi determinada com a utilização de um espectrofotômetro de microplaca BioRad Benchmark Plus com comprimentos de onda duplos a 490/630 nm à temperatura ambiente).
Os dados foram calculados como fração de absorção em poços contendo TritonX-100™ que representam 100% de morte celular versus 0% de morte celular em poços contendo solução salina. A citotoxicidade foi determinada como IC50 com a utilização de GraphPad Prism versão 5.01 para Windows, Software GraphPad, San Diego Califórnia EUA, de acordo com o programa para resposta à dose sigmoidal com inclinação variável com a utilização de valores de restrição de 0 e 100%. 4 poços de cada conjunto individual de duas placas de 96 poços foram comparadas e analisadas. A análise estatística para significância foi determinada por um teste T de Student de duas caudas.
Em células MDA-MB 435S (p250), Phorl8-LHRH (338613) exibiu sua eficácia máxima após 1 hora de incubação, enquanto as incubações de CLIP71 resultaram em valores de IC50 de 100, 109, 171, 145, 148, 86, 54,5, 55,1 (24 horas), e 3 [μΜ] (48 horas) (p<0,005) com tempo de incubação crescente. Phorl8-LHRH (338613) é um agente de ação rápida (1,2 μΜ 0,5 horas e 0,6 μΜ após 1 hora) em comparação com o péptido litico não conjugado CLIP71(> 100 μΜ).
Em células MCF-7 (pl52), Phorl8-LHRH (338613) exibiu sua eficácia máxima após 1 hora de incubação, enquanto as incubações de CLIP71 resultaram em valores de IC50 de 92, 95, 50 e 22 [μΜ] (p<0,005) com tempo de incubação crescente. Phorl8-LHRH (338613) é um agente de ação rápida (3,4 a 1,8 μΜ) em comparação com CLIP71 não conjugado.
Em células OVCAR-3 (p47), Phorl8-LHRH (338613) exibiu sua eficácia máxima após 1 hora de incubação, enquanto as 33 incubações de Phorl8 = CLIP71 não conjugado resultaram em valores de IC50 de 337, 126, 85, 5, 52,5, 22, 9 e 23,1 [μΜ] (p<0,005) com tempo de incubação crescente. Phorl8-LHRH (338613) é um agente de ação rápida com valores de IC50 de 6,7, 5,6, 5,3, 1,6, 1,5, 0,5 e 0,5 [μΜ] (p<0, 005) com tempo de incubação crescente. Os dados cinéticos rápidos sugerem que Phorl8-LHRH (338613) e CLIP71 exterminam células por um mecanismo de ação diferente e aumenta a eficácia do fármaco.
Em células SKOV-3 (p40), Phor 18-LHRH (338613) exibiu sua eficácia máxima (11,5 nM) após 24 horas de incubação, enquanto as incubações de CLIP71 resultaram em valores de IC50 de 86, 96, 53 e 50 [μΜ] (p<0,005) com tempo de incubação crescente. Phorl8-LHRH (338613) não é um alvo adequado para células SKOV-3m visto que essas células não apresentam recetores de LHRH funcionais.
Todas as linhagens celulares que apresentam recetores de LHRH funcionais, tais como células de cancro de mama (MDA-MB-435 e MCF-7) e OVCAR-3 tratadas com Phor 18-LHRH (338613) demonstraram o efeito máximo (IC50 em μΜ) dentro de 0,5 a 1 hora de incubação. Em contraste, incubação de 24 horas foi exigida para o efeito máximo de CLIP71. Resultados similares foram obtidos para linhagens celulares que apresentam recetores de LHRH funcionais, tais como T47D, LNCaP. Em linhagens celulares que não apresentam recetores de LHRH funcionais (SKOV-3 e HER IA) , Phor 18-LHRH (338613) e Clip71 mostraram toxicidade similar com valores de IC50 de .10.3 resp 11.8 μΜ após incubações de 24 horas. A linhagem de células não cancerosas 3T3 foi altamente resistente a Phor 18-LHRH (338613) e CLIP71 com valores de IC50 de > 40 μΜ para CLIP-71 e >10 para Phor 18-LHRH (338613).
Esses resultados indicam que o direcionamento de LHRH intensifica a eficácia de CLIP71 e que as linhagens de células não cancerosas são resistentes à destruição por péptidos catiónicos citoliticos. Phorl8-LH (338613) mostra potência notável na destruição de células de cancro através de um mecanismo direcionado a recetor dentro de menos de 1 hora. Phorl8-LHRH (338613) é eficaz dentro de minutos e tem vantagens em relação à quimioterapia padrão que depende da absorção intracelular e interferência com trajetórias metabólicas e mecanismo de proliferação para eficácia. Além disso, Phorl8-LHRH (338613) tem capacidade para atuar sobre células de cancro resistência a múltiplos fármacos.
Exemplo 7
Esse exemplo inclui dados que indicam um mecanismo de ação provável de péptido KFAKF AKKF AKF AKKF AKQHW S Y GLRP G (Phorl8-LHRH (338613)) em células de cancro de mama in vitro.
Para demonstrar um possível mecanismo de ação in vitro, um estudo microscópico de fluorescência foi conduzido na linhagem de células de cancro de mama humano MDA-MB-435 que superexpressam recetores de LHRH. Em resumo, células de cancro de mama humanas (MDA-MB-435, passagem n° 252) foram semeadas em placas de cultura. Os marcadores a seguir foram introduzidos antes da adição de EP100: DRAQ5™ (Alexis Corporation) - azul - foi utilizado para coloração do núcleo e MitoTracker® Red CMXRos (M7512) (Molecular Probes, Inc. ou) foram aplicados para visualizar as mitocôndrias intactas. As membranas celulares foram coloridas com conjugados verdes alexa fluor de germe de trigo (Molecular Probes, Inc. OR).
As células foram carregadas primeiramente com corante Mitotracker, de acordo com a recomendação do fabricante. Phorl8-LHRH (338613) reconstituído em solução salina foi adicionado a uma concentração final de 10 μΜ e incubado por 5 a 10 minutos. As placas de cultura com solução salina apenas serviram como controlos. O sobrenadante foi removido, e as células remanescentes preparadas para imaginologia por microscopia fluorescente.
Uma avaliação por microscopia fluorescente de MDA-MB-435 que apresenta células de cancro de mama com recetores de LHRH funcionais in vitro após exposição a Phorl8-LHRH (338613) revelou desintegração da membrana plasmática após 5 minutos de exposição a Phorl8-LHRH (338613) (10 μΜ) . Essas observações sugeriram que Phorl8-LHRH (338613) destruiu a membrana plasmática, levando à morte da célula dentro de minutos.
Uma avaliação por microscopia florescente de células SKOV-3 (p 41) e MDA-MB-435S (p 250) em culturas incubadas por 30 minutos com 2 μΜ de Phorl8-LHRH (338613) FITC revelou que em células SKOV-3 a absorção intracelular estava ausente, a formação de bolhas na membrana não ocorreu e o corante mitocondrial foi retido. Em contraste, em células MDA-MB-435S, a absorção intracelular de Phor 18- LHRH (338613) FITC foi visível dentro de 30 minutos, assim como formação de bolhas extensiva na membrana, levando à formação de vesículas da membrana externa e desbotamento do corante mitocondrial. Essas observações sugerem que a morte celular ocorreu dentro de minutos.
Dentro de minutos, Phorl8-LHRH (338613) destruiu as células que apresentam recetores de LHRH funcionais. Phorl8-LHRH (338613) destruiu células de cancro através da desintegração da membrana plasmática externa, levando à necrose. O mecanismo de ação sugere fortemente uma interação rápida de Phorl8-LHRH (338613) com a membrana plasmática de células que apresentam o alvo funcional. As células que foram negativas para recetores de LHRH não foram um alvo e permaneceram intactas.
Esses dados mostraram alta especificidade e eficácia de Phor 18-LHRH (338613) como um fármaco anticancro. Phorl8-LHRH (338613) foi eficaz dentro de minutos e teve grandes vantagens em relação à quimioterapia padrão que exige absorção intracelular e interferência com trajetórias metabólicas e mecanismo de proliferação para eficácia. Além disso, Phor 18-LHRH (338613) teve capacidade para atuar sobre células de cancro resistência a múltiplos fármacos. Exemplo 8
Esse exemplo inclui estudos que demonstram que o péptido KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG (Phorl8-LHRH (338613)) foi eficaz contra cancro em modelos de xenoenxerto.
Estudos de eficácia in vivo foram conduzidos como monoterapia ou uma terapia de combinação com padrão de tratamentos de cuidado em murganhos pelados que portam xenoenxertos de cancro de mama humano: MDA-MB-435S.luc (s.c.), MCF-7 (recetor de estrogénio alfa positivo), xenoenxertos de cancro de ovário humano: OVCAR-3, (s.c.), xenoenxertos de cancro de próstata humano: PC-3 (recetor de androgénio negativo). Phorl8-LHRH (338613) dissolvido em solução salina (0,02, 0,2 e 2 mg/kg) foi injetado uma ou duas vez por semana por 3 semanas como uma injeção de bolus única na veia caudal lateral.
Terapias de combinação com PHOR 18-LHRH (338613) foram conduzidas num modelo de xenoenxerto de cancro de mama MCF-7.
Os murganhos foram sacrificados uma semana após a última injeção e sangue recolhido para painel de guimica, pesos de tumor e pesos corporais foram registados. Parte dos tumores foi ficada em formalina a 10% tamponada com PBS para avaliação histológica. Os vários estudos de xenoenxerto in vivo são sumarizados no Quadro 7.
Quadro 7: Estudos de Xenoenxerto
Peso de Tumor Peso de Tumor Modelo de _ y _ Mediano vs Mediano vs
Xenoenxerto uraçao e Linha de base Solução servaçoes
Tratamento p<005 salina í<0,05
Necrose em _ tumores 1x3 OVCAR-3 semanas, 0,2 mg/kg 0,2,2 mg/kg trata^ os, 2q d redução de
recetores de LHRH MDA-MB- lx3semanas „ „„ „ mn/Vn 0,2 e 2 Necrose e 435S.luc ,22 d ' ' mg/kg redução de MDA-MB- lx3semanas , ,, recetores de
435S.luc , 22 d 0,002 mg/kg 0,0002 mg/kg LHRH _ Ix3semanas 0,002, 0,02, C J ,21 d 0,2 mg/kg Necrose em tumores 2x 3 ' 0,02 mg/kg tratados 0,02 MCF-7 semanas, atraso de e 0,2 19 d crescimento
Para determinar a dose eficaz mínima necessária para reduzir os pesos de xenoenxerto MDA-MB-435S num regime de dose única, murganhos fêmeas Nu/Nu, estirpe não consanguínea, 5 semanas de vida (Charles River), foram injetados (s.c.) na região interescapular com uma suspensão de MDA-MB-435S (passagem n° 249)/Matrigel (2,4 x 106 células/murganho) [Leuschner 2006]. Phorl8-LHRH (338613) (ID: 338613 lote n° P080401) (0,00002, 0,0002, 0,002, 0,02, 0,2 e 1 mg/kg) e Phorl8 = CLIP71 não conjugado (APC 338983, lote n° WO8033C1) mais LHRH (0,2/0,122 mg/kg, ([D-Trp6]-LHRH; Sigma L9761, lote n° 037K1103) foram reconstituídos em solução salina USP antes da dosagem. As doses foram dadas como uma injeção intravenosa de bolus única por meio da veia caudal lateral uma vez por semana por 3 semanas.
Cada grupo consistiu em 16 murganhos, que foram injetados uma vez por semana por 3 semanas. Um grupo de 16 murganhos foi sacrificado no momento do tratamento para servir como linha de base. As injeções de solução salina serviram como grupos de controlo. Durante todo o estudo, os volumes do tumor foram registados duas vezes por semana. 0 tratamento foi iniciado no dia 16 após a injeção de célula tumoral, quando os tumores foram estabelecidos, e continuou nos dias 23 e 30. Todos os murganhos remanescentes foram necropsiados 37 dias após a injeção de célula tumoral. A resposta ao tratamento foi determinada por pesos do tumor e alteração em peso do tumor na necropsia em comparação com os controlos de solução salina e tratamento com CLIP71 não direcionado. Os tumores primários foram recolhidos, pesados e preparados para avaliação histológica em fixação em formalina com formalina tamponada a 10%. A avaliação estatística de conjuntos de dados foi conduzida em GraphPad Prizm 4 e a significância calculada por teste dos postos sinalizados de Wilcoxon.
Os volumes do tumor e os pesos do tumor aumentaram em controlos de solução salina e murganhos tratados com clip71 mais LHRH. Os volumes do tumor e os pesos do tumor foram reduzidos significativamente em comparação com controlos de solução salina em murganhos tratados com 0,0002 mg/kg de Phorl8-LHRH (338613) . O tratamento com doses de Phorl8-LHRH (338613) tão baixas quanto 0,002 mg/kg reduziu significativamente o volume do tumor e o peso do tumor em comparação com a linha de base (p<0,0002). A avaliação histológica de secções do tumor de murganhos com xenoenxerto de MDA-MB-435S coloridos com hematoxilina/eosina de murganhos tratados mostra as células tumorais viáveis em controlo de solução salina e murganhos tratados com CLIP71/LHRH. Em contraste, necrose significativa foi evidente em tumores de murganhos tratados com Phorl8-LHRH (338613) em doses tão baixas como 0,0002 mg/kg. O péptido litico catiónico não direcionado CLIP71 não aumentou os pesos do tumor ou destruiu o tecido tumoral.
Phorl8-LHRH (338613) foi altamente eficaz na redução dos pesos do tumor de xenoenxertos de MDA-MB-4355 tão baixos como 0,002 mg/kg, levando à necrose em tecidos tumorais tratados. O tratamento não direcionado com péptidos citoliticos é ineficaz. A fim de determinar a dose eficaz minima necessária para reduzir os pesos de xenoenxerto MDA-MB-435S num regime de múltiplas doses, murganhos fêmeas Nu/Nu, estirpe não consanguínea, 8 semanas de vida (Charles River), foram injetados (s.c.) na região interescapular com uma suspensão de MDA-MB-435S (passagem n° 253)/Matrigel (2 x 106 células/murganho) conforme descrito anteriormente acima. Phorl8-LHRH (338613) (ID: 338613 lote n° P080401) (0,002 e 0,2 mg/kg) foram reconstituídos em solução salina USP antes da dosagem. As doses foram dadas como uma injeção intravenosa de bolus única por meio da veia caudal lateral nos dias 15, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42 após a inoculação de células tumorais. As injeções de solução salina serviram como grupos de controlo.
Cada grupo de tratamento consistiu em 16 murganhos. Durante todo o estudo, os volumes do tumor foram registados duas vezes por semana. A necropsia final foi conduzida no dia 45 após a injeção de célula tumoral. As injeções foram retomadas devido à oclusão da veia causal na maioria dos murganhos. No ponto final do estudo, o peso corporal e os pesos do tumor foram determinados e fixados em formalina a 10% tamponada com fosfato. 0 tratamento com horl8-LHRH (338613) com a utilização de múltiplas injeções intravenosas resultou em regeneração do tumor em ambos os níveis de dose. Os murganhos sem tumor foram observados em ambos os grupos de tratamento como 6/23 no grupo que recebeu 0,0 02 mg/kg e 1/20 a 0,2 mg/kg. As massas residuais tipicamente consistiram em Matrigel. Um murganho não respondeu ao tratamento no grupo de 0,2 mg/kg.
Nenhuma necrose nas caudas foi observado, nenhuma vermelhidão das caudas esteva presente. Os pesos corporais não foram afetados pelo tratamento durante todo o período do estudo. A sobrevida foi de 100% em murganhos tratados. Em contraste, 8 murganhos no grupo de controlo de solução salina foram sacrificados no dia 30 após a injeção de célula tumoral (antes do ponto final do estudo) devido ao facto de que o volume do tumor excedeu 2,500 mm3. O exame histológico de tumores coloridos com H&amp;E de murganhos tratados com 0,002 e 0,2 mg/kg de Phorl8-LHRH (338613) em regime de múltiplas injeções mostrou a erradicação de células tumorais em murganhos tratados. Em contraste, células tumorais viáveis estavam presentes em murganhos de controlo de solução salina.
Phorl8-LHRH (338613) destruiu e reduziu os pesos do tumor significativamente e estenderam o tempo de vida de murganhos tratados. Os tratamentos não tiveram quaisquer efeitos visíveis sobre o peso corporal ou o exame do órgão. Exemplo 9
Esse exemplo inclui uma descrição dos estudos de eficácia de péptido KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG (Phorl8-LHRH (338613)) em modelos de xenoenxerto de cancro de mama, ovário e próstata.
Os estudos in vitro descritos no presente documento demonstraram que Phorl8-LHRH (338613) é um agente de ação rápida, exterminando células de cancro dentro de minutos de contacto. Para determinar a eficácia de Phorl8-LHRH (338613) em xenoenxertos de cancro de mama na fase inicial de tratamento direcionado, a cinética de destruição celular através de Phor 18-LHRH (338613) num modelo de xenoenxerto de cancro de mama após uma injeção única de Phorl8-LHRH (338613) foi estudada
Em resumo, murganhos fêmeas Nu/Nu, estirpe não consanguínea, 5 semanas de vida (Charles River), foram injetados (s.c.) na região interescapular com uma suspensão de MDA-MB-435S (passagem n° 249)/Matrigel (2,4 x 105 células/murganho) conforme descrito no Exemplo 10. Phorl8-LHRH (338613) (ID: 338613 lote n° P080401) (0,2 e 2 mg/kg) foram reconstituídos em solução salina USP antes da dosagem. As doses foram dadas como uma injeção intravenosa de bolus única por meio da veia caudal lateral.
Os murganhos foram sacrificados 1, 2 e 16 horas após o tratamento com Phor 18-LHRH (338613) ou solução salina. No ponto final do estudo, o peso corporal e os pesos do tumor foram determinados e os tumores foram fixados em formalina a 10% tamponada com fosfato. A avaliação histológica de secções coloridas com H&amp;E de tumores mostrou células tumorais viáveis com múltiplas figuras mitóticas em murganhos tratados com solução salina. 0 tratamento com Phorl8-LHRH (338613) em ambas as doses de 0,2 e 2 mg/kg mostrou a destruição de tumores de xenoenxertos de MDA-MB-435S tão rapidamente quanto 1 hora após a injeção.
Phorl8-LHRH (338613) destruiu tumores são precocemente quanto 1 h após a dosagem, sugerindo um mecanismo de ação rápido que causa a morte celular através de necrose. Esses dados confirmam que Phorl8-LHRH (338613) atua através de seu contacto de membrana com células tumorais que apresentam recetor de LHRH.
Para determinar a eficácia de Phorl8-LHRH (338613) sobre xenoenxertos de cancro de ovário que se assemelham à doença humana, estudos de dose única ou múltipla foram conduzidos. 0 modelo de xenoenxerto da linhagem de células de cancro de ovário humano OVCAR-3 que apresenta recetores de LHRH funcionais foi utilizado nesse estudo. OVCAR-3 representa um modelo de xenoenxerto de crescimento lento e secreta o marcador tumoral (antígeno de cancro 125, ou CA125). Sua secreção pode ser utilizada como resposta ao tratamento e é uma medida de atividade do fármaco. 0 propósito desse estudo de xenoenxerto foi testar Phor 18-LHRH (338613) num modelo de cancro de ovário, para determinar se Phorl8-LHRH (338613) é eficaz in vivo em resistência a múltiplos fármacos, modelos tumorais de crescimento lento como injeções semanais únicas. Em resumo, murganhos fêmeas Nu/Nu, estirpe consanguínea, 5 semanas de vida (Harlan-Sprague Dawley), foram injetados por via subcutânea com uma suspensão de células NIH:OVCAR-3/Matrigel (4,6 x 106 células/murganho). 0 tratamento foi iniciado no dia 33 após a injeção de célula tumoral, quando os tumores foram estabelecidos, e continuou nos dias 41 e 47. As doses para as 3 injeções semanais foram 0,02, 0,2 e 2 mg/kg de peso corporal, dadas como uma injeção intravenosa de bolus única por meio da veia caudal lateral administrada uma vez por semana por três semanas nos dias 33, 41 e 47. As necropsias foram conduzidas no dia 52. Os dados são apresentados como média SEM. As setas mostram a dosagem.
Os grupos de tratamento incluíram controlo de solução salina (N=10), Phorl8-LHRH (338613) (338613, V09108X1) (0,02 (N=l0) , 0,2 (N=l0) , e 2 mg/kg (N=9) , ) e Phorl8 = CLIP71 não conjugado (APC 338983, Lote n° V04004X1) (2 mg/kg (N=10)), Cisplatina/CP em solução salina (Calbiochem,
Cat 232120, D0005495,) (10 mg/kg, 3qd (N=10),), linha de base (N=9) .
Um grupo de 9 murganhos portadores de tumor foi sacrificado no dia 33 e serviu como grupo de linha de base. Todos os murganhos foram necropsiados 51 a 52 dias após a injeção de célula tumoral. Os volumes do tumor e os pesos corporais foram registados duas vezes por semana durante o estudo, assim como um exame veterinário geral de murganho foi conduzido.
Tumores primários, fígado, rim, pâncreas, coração, pulmão e baço, foram recolhidos, fixados em formalina e preparados para avaliação histológica. Os pesos do tumor foram medidos na necropsia, parte dos tumores foi congelada a -80 °C para determinação de ensaio de LH/CG e LHRH.
Como um biomarcador para atividade de fármaco, CA125 foi determinado em soro, recolhido de cada murganho individual na necropsia com a utilização de um Imunoensaio Ligado a Enzima para determinação quantitativa de antígeno de cancro de ovário CA125 (Assay kit Genway, Biotech, Inc. San Diego, CA, catálogo n° 40-052-115009, n° BC-1013 de acordo com o fabricante).
Os níveis de recetor de LHRH foram avaliados a partir de tumores fixados em formalina. A análise de imagens de imunoperoxidase quantitativa foi conduzida com o sistema de análise de imagens auxiliado por computador adjuntivo Ventana Image Analysis System (VIAS) funcionalmente ligado a um microscópio interativo (Axio Imager). A análise quantitativa foi conduzida com o programa para quantificação de recetor de Her2/neu que incluiu análise morfométrica e calorimétrica. Os resultados de situação de recetor foram relatados como percentagem de células que mostram coloração positivo dos recetores de LHRH sob os seguintes critérios: 0 não imunorreativo, 1+: 1 a 25% positivo, 2+: 26 a 50% positivo, 3+: 51 a 75% de células positivas.
Todos os grupos de murganhos toleraram as injeções bem. Um murganho morreu durante a primeira injeção com Phor 18-LHRH (338613) na dose de 2 mg/kg. A morte foi um evento agudo e foi procedimental e não relacionada com o tratamento. Todos os murganhos em outros grupos de tratamento sobreviveram. Nenhum murganho morreu como consequência de injeção depois de 10 minutos após a injeção.
Os volumes do tumor diminuíram durante o tratamento com Phor 18-LHRH (338613). Em contraste, para murganhos tratados com o CLIP71, cisplatina ou em controlos de solução salina, o crescimento do tumor foi observado. Os volumes do tumor registados após 42 dias após a injeção de célula tumoral mostraram reduções (p<0,001) em comparação com a linha de base em concentrações de Phorl8-LHRH (338613) tão baixas quanto 0,2 mg/kg de peso corporal.
As caracteristicas dos tumores na necropsia (pesos de tumor medianos e alterações de pesos de tumor medianos em comparação com a linha de base) foram determinadas. Os
pesos de tumor reduzidos comparados aos controlos de solução salina e Phor 18 = CLIP71 não conjugados (p<0,05) foram obtidos nos grupos para 2 e 0,2 mg/kg de dosagens de Phorl8-LHRH (338613) . Os murganhos sem tumor foram encontrados nos grupos 0,2 e 2 mg/kg de Phor 18-LHRH (338613). A resposta ao tratamento medida como regressão tumoral em comparação com o início do tratamento foi maior em murganhos tratados com Phorl8-LHRH (338613) a 0,2 mg/kg (p<0,03 vs linha de base). Cisplatina e Phorl8 = CLIP 71 não conjugado não foram eficazes na redução de pesos do tumor.
Murganhos tratados com controlos de solução salina, CLIP71 e cisplatina mostraram crescimento tumoral estável. Os níveis séricos para CA125 corresponderam aos pesos do tumor (r2= 0,66) . A secreção de CA125 foi reduzida em murganhos tratados com Phorl8-LHRH (338613) e comparada com controlos de solução salina foi maior em murganhos tratados com Phorl8-LHRH (338613) a 0,2 e 2 mg/kg (p<0,0002).
Os tamanhos de tumor excisado de murganhos portadores de xenoenxerto de OVCAR-3 após o tratamento com 0,02 mg/kg de Phorl8-LHRH (338613) foram reduzidos e necróticos em comparação com controlos de solução salina. Os tumores tratados mostraram uma redução de níveis de recetor de LHRH em 1 a 2 pontos na pontuação. As secções de tumor coloridas com hematoxilina/eosina mostraram necrose significativa em grupos tratados com 0,02 mg/kg de Phorl8-LHRH (338613). Os murganhos portadores de xenoenxerto tratados com Cisplatina ou CLIP71 não têm redução em volume do tumor, níveis de recetor de LHRH e mostraram células tumorais viáveis após a avaliação histológica. O tratamento com Phorl8-LHRH (338613) causou regressão do tumor, redução de marcador tumoral CA125 em plasma, redução de niveis de recetor de LHRH e necrose em modelo de xenoenxerto de ovário. Phorl8-LHRH (338613) é, portanto, eficaz na destruição de xenoenxertos de cancro de ovário resistentes a múltiplos fármacos.
Para determinar a eficácia de Phor 18-LHRH (338613) sobre xenoenxertos de cancro de próstata, o efeito de Phorl8-LHRH (338613) in vivo num modelo de xenoenxerto de crescimento agressivo rápido foi estudado. Os xenoenxertos de PC-3 não tratados causaram perda de peso significativa nos murganhos.
Em resumo, murganhos Nu/Nu machos, estirpe não consanguínea, 6 semanas de vida (Charles River) foram injetados por via subcutânea com uma suspensão de células PC-3/Matrigel (1 x 106 células/murganho). O tratamento foi iniciado no dia 15 após a injeção de célula tumoral, quando os tumores foram estabelecidos, e continuou nos dias 22 e 29. As doses para as 3 injeções semanais foram 2, 0,2 e 0,02 mg/kg de peso corporal, dadas como uma injeção intravenosa única de bolus por meio da veia caudal lateral.
Os grupos de tratamento incluíram controlo de solução salina (N=12), Phorl8-LHRH (338613) (APC 338613 Lote n° V09108X1) (0,002 (N=12), 0,02 (N=12), 0,2 (N=12) e 2 mg/kg (N=12),), e Phorl8 = CLIP71 não conjugado (338983, Lote n° V04004X1) (5 mg/kg (N=12), linha de base (N=12).
Um grupo de 12 murganhos portadores de tumor foi sacrificado no dia 15 e serviu como grupo de linha de base. Todos os murganhos foram necropsiados 35 e 36 dias após a injeção de célula tumoral. Os volumes do tumor e os pesos corporais foram registados duas vezes por semana durante o estudo, assim como um exame veterinário geral de murganho foi conduzido.
Tumores primários, fígado, rim, pâncreas, coração, pulmão e baço, foram recolhidos, fixados em formalina e preparados para avaliação histológica. Os pesos do tumor foram medidos na necropsia, parte dos tumores foi congelada a -80 °C para determinação de ensaio de LH/CG e LHRH.
Todos os grupos toleraram as injeções e todos os murganhos nos grupos de tratamento sobreviveram. Nenhum murganho morreu como uma consequência da injeção.
Os volumes do tumor diminuíram durante o tratamento com PHorl8-LHRH (338613) em doses de 0,002, 0,02, 0,2 e 2 mg/kg. Para murganhos tratados com o CLIP71 ou em controlos de solução salina, o crescimento do tumor foi observado. Os volumes do tumor registados após 22 dias após a injeção de célula tumoral mostraram reduções (p<0,001) em comparação com controlos de solução salina e CLIP71 em concentrações de Phorl8-LHRH (338613) tão baixas quanto 0,002 mg/kg de peso corporal. Os pesos do tumor foram significativamente reduzidos em comparação com controlos de solução salina e grupos de tratamento com CLIP-71 (0,001 em todos os grupos tratados com Phor 18-LHRH (338613)).
Os xenoenxertos de PC-3 são conhecidos por causar uma perda de peso em murganhos pelados. Em murganhos tratados com Phorl8-LHRH (338613) , os volumes de tumor diminuíram em grupos tratados com 0,002, 0,02, 0,2 e 2 mg/kg de Phorl8-LHRH (338613) em comparação com controlos de solução salina e injeções de CLIP71. Os pesos de tumor medianos na necropsia foram significativamente reduzidos em comparação com controlos de solução salina e CLIP71 (p<0,001). Os murganhos em grupos de controlo foram caquéticos e sofreram uma perda de peso de mais de 10 g em comparação com os murganhos tratados.
Phorl8-LHRH (338613) é eficaz na parada do crescimento do tumor em xenoenxertos de PC-3 e prevenção de perda de peso grave devido à carga tumoral. Phorl8-LHRH (338613) não conjugado é ineficaz.
Em suma, os estudos anteriores indicam que o péptido KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHW S Y GLRP G (Phorl8-LHRH (338613)) é eficaz in vivo na destruição de xenoenxertos de cancro de mama, cancro de ovário e cancro de próstata. Phor 18-LHRH (338613) causa necrose tumoral em murganhos tratados, com a necrose sendo evidente tão precocemente quanto 1 hora após a injeção. Phor 18-LHRH (338613) é eficaz como um regime de tratamento semanal único que induz a necrose e causa redução de peso do tumor. Como um regime semanal múltiplo, a erradicação de tumores é mais evidente, incluindo a destruição de células tumorais residuais. Phor 18-LHRH (338613) causa a redução em niveis de recetor de LHRH após o tratamento, consistente com a destruição de célula-alvo.
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
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Claims (40)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Constructo de fusão que compreende um primeiro domínio e um segundo domínio, em que o referido primeiro domínio consiste numa sequência de 15 a 20 aminoácidos com uma sequência de aminoácidos selecionada de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA; ou uma sequência de 15 a 20 aminoácidos com uma sequência de aminoácidos selecionada de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF e KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA que tem um dos resíduos K substituídos por qualquer um de um resíduo F ou L, um dos resíduos F substituído por qualquer um de um resíduo K, A ou L, ou um dos resíduos A substituído por qualquer um de um resíduo K, F ou L; e em que o referido segundo dominio compreende uma porção química de ligação.
  2. 2. Constructo de fusão, de acordo com a reivindicação 1, em que o referido primeiro domínio consiste numa sequência de 15 ou 18 aminoácidos que inclui um péptido selecionado de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAK, ou uma sequência de 15 ou 18 aminoácidos que inclui um péptido selecionado de KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA e KFAKFAKKFAKFAKKFAK, que tem um dos resíduos K substituído por qualquer um de um resíduo F ou L, um dos resíduos F substituído por qualquer um de um resíduo K, A ou L, ou um dos resíduos A substituído por qualquer um de um resíduo K, F ou L.
  3. 3. Constructo de fusão, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que a dita porção química de ligação liga-se a (a) um recetor, ligando ou antígeno; ou (b) um recetor, um ligando ou um antígeno expresso numa célula.
  4. 4. Constructo de fusão, de acordo com a reivindicação 3, em que o referido ligando compreende um agonista ou um antagonista de recetor.
  5. 5. Constructo de fusão, de acordo com a reivindicação 3(b), em que a dita célula é uma célula hiperproliferativa.
  6. 6. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a dita porção química de ligação compreende (a) um ligando, um recetor ou um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, ou (b) um péptido, um polipéptido, uma proteína, um ácido nucleico ou um hidrato de carbono.
  7. 7. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a dita porção química de ligação é uma hormona, um análogo de hormona, um fragmento de uma hormona ou um análogo de hormona que se liga a um recetor de hormona, um recetor de hormona ou um agente que se liga a uma hormona ou a um recetor de hormona.
  8. 8. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o referido segundo domínio consiste ou compreende uma sequência de aminoácidos de 1 a 10, 10 a 20, 15 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100 ou mais aminoácidos.
  9. 9. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o referido segundo domínio consiste ou compreende uma sequência de aminoácidos apresentada como: (a) SYAVALSAQAALARR, OU (b) QHWSYGLRPG.
  10. 10. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o referido primeiro domínio está posicionado na terminação NH2 em relação ao referido segundo domínio ou o referido segundo domínio está posicionado na terminação NH2 em relação ao referido primeiro domínio.
  11. 11. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o referido primeiro domínio ou o referido segundo domínio tem um ou mais D-aminoácidos.
  12. 12. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o referido primeiro domínio forma uma alfa-hélice anfipática.
  13. 13. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que os referidos primeiro e segundo domínios são unidos por (a) uma ligação covalente; ou (b) sequência de péptidos que tem de 1 a 25 resíduos de aminoácido ou uma cadeia carbónica linear.
  14. 14. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o referido constructo de fusão tem uma razão IC50 / (HA50, atividade hemolítica) menor que cerca de 0,02, 0,01 ou 0,005.
  15. 15. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, em que a dita porção química de ligação compreende uma hormona de libertação de gonadotrofina I, uma hormona de libertação de gonadotrofina II, hormona de libertação de hormona luteinizante III de lampreia, cadeia beta de hormona luteinizante, hormona luteinizante (LH), gonadotrofina coriónica (CG), subunidade beta de gonadotrofina coriónica (β- ou beta-CG), hormona estimulante de melanócito, estradiol, dietilstilbesterol, dopamina, somatostatina, hormona estimulante de foliculo (FSH), um glicocorticoide, um estrogénio, testosterona, androstenediona, di-hidrotestosterona, desidroepiandrosterona, uma progesterona ou um androgénio.
  16. 16. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que o referido primeiro dominio consiste num péptido, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, ou um péptido, KFAKFAKKFAKFAKK, que tem um dos residuos K substituído por qualquer um de um resíduo F ou L, um dos resíduos F substituído por qualquer um de um resíduo K, A ou L ou um dos resíduos A substituído por qualquer um de um resíduo K, F ou L.
  17. 17. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou 16, em que o referido primeiro domínio consiste num péptido, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, ou um péptido, KFAKFAKKFAKFAKK.
  18. 18. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, 16 ou 17, em que o referido segundo domínio compreende hormona de libertação de hormona luteinizante (LHRH), um fragmento de ligação do mesmo ou um análogo de LHRH.
  19. 19. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, 16 ou 17, em que o referido primeiro dominio consiste num péptido, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, e em que o referido segundo domínio compreende ou consiste em QHWSYGLRPG.
  20. 20. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 ou 16 a 19, em que o referido constructo de fusão consiste em KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHW S Y GLRP G.
  21. 21. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, em que o referido segundo domínio compreende subunidade beta de gonadotrofina coriónica (BCG), um fragmento de ligação da mesma ou um análogo de BCG.
  22. 22. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, 16 ou 17, em que o referido primeiro domínio consiste num péptido, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, e em que 0 referido segundo domínio compreende ou consiste em SYAVALSAQAALARR.
  23. 23. Composição farmacêutica que compreende o constructo de fusão, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22.
  24. 24. Molécula de ácido nucleico que codifica o constructo de fusão, conforme definido na reivindicação 6(b).
  25. 25. Célula que expressa o constructo de fusão, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22.
  26. 26. Método para reduzir ou inibir seletivamente a proliferação de uma célula que expressa um recetor ou um antígeno que compreende colocar a célula em contacto com o constructo de fusão, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22, numa quantidade suficiente para reduzir ou inibir a proliferação da célula, em que a porção química de ligação do referido péptido liga-se ao recetor, ao ligando ou ao antígeno expresso pela célula, contanto que um método para tratamento do corpo humano ou animal por cirurgia ou terapia e um método de diagnóstico praticado no corpo humano ou animal seja excluído.
  27. 27. Método, de acordo com a reivindicação 26, em que a dita célula é uma célula hiperproliferante.
  28. 28. Método, de acordo com a reivindicação 26, em que a dita célula é uma célula neoplástica, tumoral, cancerosa ou maligna.
  29. 29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, em que a célula expressa (a) uma hormona ou um recetor de hormona; (b) uma hormona esteroide sexual ou gonadal ou um recetor de hormona esteroide sexual ou gonadal, ou (c) um recetor que se liga à hormona de libertação de gonadotrofina I, hormona de libertação de gonadotrofina II, hormona de libertação de hormona luteinizante III de lampreia, cadeia beta de hormona luteinizante, hormona luteinizante, gonadotrofina coriónica, subunidade beta de gonadotrofina coriónica, hormona estimulante de melanócito, estradiol, dietilstilbesterol, dopamina, somatostatina, hormona estimulante de folículo (FSH), glicocorticoide, estrogénio, testosterona, androstenediona, di-hidrotestosterona, desidroepiandrosterona, progesterona ou um androgénio, fator de crescimento epidérmico (EGF), hormona de crescimento (GH), Her2/neu, vitamina H, folato, transferrina, hormona estimulante da tireoide (TSH), endotelina, bombesina, péptido intestinal vasoativo, lactoferrina, integrina, fator de crescimento de nervo, CD-
    8, CD-33, CD19, CD20, CD40, R0R1, IGF-1, antígeno carcinoembrionário (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), antígeno específico da próstata (PSA), antígeno de membrana específico da próstata (PSAM), CA 125 (cancro de ovário epitelial residual), recetor de Interleucina-2 (IL-2) solúvel, RAGE-1, tirosinase, MAGE-1, MAGE-2, NY-ESO-1, MelanA/MART-1, glicoproteina(gp) 75, gplOO, beta-catenina, PRAME, MUM-1, ZFP161, Ubiquitina-1, HOX-B6, YB-1, Osteonectina, ILF3, ácido fólico ou um derivado do mesmo, um membro da família de fator de necrose tumoral (TNF), TNF-alfa, TNF-beta (linfotoxina, LT), TRAIL, Fas, LIGHT, 41 BB, fator de transformação do crescimento alfa, fator de transformação do crescimento beta, insulina, ceruloplasmina, HIV-tat, um péptido ou proteína que compreende um motivo de sequência de RGD, um monossacárido, dissacárido, oligossacárido, ácido siálico, galactose, manose, fucose ou ácido acetilneuramínico.
  30. 30. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, para utilização no tratamento de um indivíduo que tem um distúrbio hiperproliferativo.
  31. 31. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, para utilização no tratamento de um indivíduo que tem uma neoplasia, um tumor, um cancro ou uma malignidade.
  32. 32. Constructo de fusão para utilização, de acordo com as reivindicações 30 ou 31, em que a neoplasia, o tumor, o cancro ou a malignidade é (a) metastático, não metastático ou benigno; ou (b) compreende uma massa celular sólida.
  33. 33. Constructo de fusão para utilização, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, em que a neoplasia, o tumor, o cancro ou a malignidade compreende um carcinoma, um sarcoma, um linfoma, uma leucemia, um adenoma, um adenocarcinoma, um melanoma, um glioma, um glioblastoma, um meningioma, um neuroblastoma, um retinoblastoma, um astrocitoma, um oligodendrocitoma, um mesotelioma, uma neoplasia, um tumor, um cancro ou uma malignidade reticuloendotelial, linfática ou hematopoiética.
  34. 34. Constructo de fusão para utilização, de acordo com a reivindicação 33, em que o sarcoma compreende um linfossarcoma, um lipossarcoma, um osteossarcoma, um condrossarcoma, um leiomiossarcoma, um rabdomiossarcoma ou um fibrossarcoma.
  35. 35. Constructo de fusão para utilização, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, em que a neoplasia, o tumor, o cancro ou a malignidade compreende uma neoplasia, um tumor ou um cancro de pulmão, tireoide, cabeça ou pescoço, nasofaringe, garganta, nariz ou seios nasais, cérebro, espinha, mama, glândula adrenal, glândula pituitária, linfa, gastrointestinal (boca, esófago, estômago, duodeno, ileo, jejuno (intestino delgado), cólon, reto), trato geniturinário (útero, ovário, colo do útero, endométrio, bexiga, testículo, pênis, próstata), rim, pâncreas, fígado, osso, medula óssea, sangue, músculo ou pele.
  36. 36. Constructo de fusão para utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, em que o indivíduo é (a) um mamífero; ou (b) um ser humano.
  37. 37. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, para utilização na redução da fertilidade de um animal.
  38. 38. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, para utilização na redução ou tratamento da endometriose de um animal.
  39. 39. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, para utilização na redução ou tratamento da hiperplasia da próstata benigna.
  40. 40. Constructo de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, para utilização na redução ou no tratamento de um fibroide ou um pólipo.
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