JP2023518977A

JP2023518977A - 溶解性ドメイン融合構築物、チェックポイント阻害剤、およびそれらを作出し、使用する方法

Info

Publication number: JP2023518977A
Application number: JP2022558089A
Authority: JP
Inventors: キャロラロイシュナー，; ヘクターアリラ，; アニルスード，; マークキム，
Original assignee: エー２８セラピューティクスインコーポレイテッド
Priority date: 2020-03-26
Filing date: 2021-03-26
Publication date: 2023-05-09
Also published as: MX2022011778A; CN115768455A; EP4125986A1; AU2021244606A1; CA3176255A1; KR20230005180A; WO2021195553A1; BR112022018994A2

Abstract

本発明は、融合構築物およびチェックポイント阻害剤、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を使用する方法、ならびに腫瘍、がん、新生物および悪性腫瘍などの、望ましくないもしくは異所性の細胞増殖または過剰増殖障害を処置する方法に関する。ひとつには、溶解性ドメインと結合性部分とを含む融合構築物が本発明で提供される。細胞と溶解性ドメインの接触により、細胞膜の妨害が引き起こされ、その結果、細胞死がもたらされると考えられる。

Description

関連出願
本特許出願は、２０２０年３月２６日に出願された「溶解性ドメイン融合構築物、チェックポイント阻害剤、およびそれらを作出し、使用する方法」という表題の米国仮特許出願第６３／０００，３２２号の優先権を主張するものである。前述の特許出願の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

技術分野
本発明は、融合構築物およびチェックポイント阻害剤、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を使用する方法、ならびに、非転移性および転移性新生物、がん、腫瘍および悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）などの、望ましくないもしくは異所性の細胞増殖または過剰増殖障害を処置する方法に関する。

緒言
がん患者の５年生存率に関して、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵がん、黒色腫、膀胱がんおよび子宮体がんを有する患者が遠隔転移性疾患と診断された場合、生存するのはたった２～４０％であることを考慮すると、原発腫瘍および転移を処置するための新しい治療薬の開発の必要性は明白である。

概要
ひとつには、溶解性ドメインと結合性部分とを含む融合構築物が本発明で提供される。細胞と溶解性ドメインの接触により、細胞膜の妨害が引き起こされ、その結果、細胞死がもたらされると考えられる。結合性部分により、非転移性および転移性新生物、がん、腫瘍および悪性腫瘍などの、望ましくないまたは異所性増殖細胞または過剰増殖細胞を含めた細胞が、溶解性ドメインによる破壊の標的とされる。多数の非転移性および転移性新生物細胞、がん細胞、腫瘍細胞および悪性細胞が受容体またはリガンドを過剰発現する。例えば、多くの非転移性および転移性新生物、がん、腫瘍および悪性腫瘍が、融合構築物の結合性部分として使用することができる、ホルモン（例えば、黄体形成ホルモン／絨毛膜ゴナドトロピン（ＬＨ／ＣＧ）、または黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨなど））、増殖因子、サイトカイン、抗体などに対する受容体を発現する。

融合構築物を、結合性部分が結合する部位を発現する任意の細胞または細胞集団を標的とするように設計することができる。リガンド、抗体およびその断片、増殖因子、サイトカインなどの結合性部分を溶解性ドメインと連結して、受容体、抗原、抗体、リガンドなどを発現するまたは含有する細胞の標的化死滅をもたらし、それにより、細胞増殖または成長を低減させるまたは阻害することができる。

融合構築物は、標的細胞を死滅させるために細胞の分裂を必要とするものではない。さらに、融合構築物は、比較的小さなサイズにすることができるので、免疫原性にならない可能性が高い。さらに、融合構築物は、多剤耐性細胞を死滅させるものである。

一部の態様では、融合構築物とチェックポイント阻害剤の組合せを用いて新生物疾患およびがんを処置する方法が本明細書に提示される。

一部の態様では、細胞の増殖を低減させるまたは阻害するための医薬の製造における、融合構築物とチェックポイント阻害剤の組合せの使用が提供される。

本明細書に提示されるデータから、融合構築物をチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用することにより、相乗的な抗がん効果がもたらされることが実証される。一部の態様では、細胞の増殖を低減させるまたは阻害する方法であって、細胞に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、細胞の増殖を低減させるまたは阻害するために十分な量で接触させるステップを含み、融合構築物が、第１のドメインと第２のドメインとを含み、第１のドメインが、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２８アミノ酸の配列、または、Ｋ残基の１つもしくは複数がＦ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、Ｆ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ａ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、もしくはＡ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ｆ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２５アミノ酸の配列からなり、第２のドメインが、結合性部分を含む、方法が本明細書に提示される。一部の実施形態では、融合構築物の第１のドメインは、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）、ならびに、Ｋ残基の１つもしくは複数がＦ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、Ｆ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ａ残基またはＬ残基のいずれかで置換されているか、またはＡ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ｆ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるアミノ酸配列からなる。

一部の実施形態では、融合構築物の結合性部分は、受容体、リガンド、または抗原に結合する。ある特定の実施形態では、受容体、リガンド、または抗原は、細胞（例えば、標的細胞）上に発現されるものである。ある特定の実施形態では、リガンドは、受容体アゴニストまたはアンタゴニストを含む。

ある特定の実施形態では、細胞は、過剰増殖細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、新生物細胞、腫瘍細胞、がん細胞または悪性細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、乳房細胞、卵巣細胞、子宮細胞、子宮頸部細胞、前立腺細胞、精巣細胞、副腎細胞、下垂体細胞または子宮内膜細胞である。

ある特定の実施形態では、細胞は、受容体、リガンド、または抗原を発現する。ある特定の実施形態では、細胞は、ホルモンまたはホルモン受容体を発現する。ある特定の実施形態では、細胞は、性もしくは性腺ステロイドホルモンまたは性もしくは性腺ステロイドホルモン受容体を発現する。

ある特定の実施形態では、細胞は、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ、ヤツメウナギＩＩＩ黄体形成ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモンベータ鎖、黄体形成ホルモン、絨毛膜ゴナドトロピン、絨毛膜ゴナドトロピンベータサブユニット、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ドーパミン、ソマトスタチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、グルココルチコイド、エストロゲン、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プロゲステロン、アンドロゲン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ビタミンＨ、葉酸塩、トランスフェリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、エンドセリン、ボンベシン、成長ホルモン、血管作用性小腸ペプチド、ラクトフェリン、インテグリン、神経増殖因子、ＣＤ－８、ＣＤ－３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＲＯＲ１、ＩＧＦ－１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＡ１２５（残留上皮性卵巣がん）、可溶性インターロイキン２（ＩＬ－２）受容体、ＲＡＧＥ－１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、メランＡ／ＭＡＲＴ－１、糖タンパク質（ｇｐ）７５、ｇｐ１００、ベータカテニン、ＰＲＡＭＥ、ＭＵＭ－１、ＺＦＰ１６１、ユビキチン－１、ＨＯＸ－Ｂ６、ＹＢ－１、オステオネクチン、ＩＬＦ３、葉酸またはその誘導体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーメンバー、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ（リンホトキシン、ＬＴ）、ＴＲＡＩＬ、Ｆａｓ、ＬＩＧＨＴ、４１ＢＢ、トランスフォーミング増殖因子アルファ、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インスリン、セルロプラスミン、ＨＩＶ－ｔａｔ、ＲＧＤ配列モチーフを含むペプチドもしくはタンパク質、単糖、二糖、オリゴ糖、シアル酸、ガラクトース、マンノース、フコース、またはアセチルノイラミン酸、またはこれらの類似体に結合する受容体を発現する。

ある特定の実施形態では、細胞は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）に結合する受容体を発現する。ある特定の実施形態では、インテグリンは、アルファ－５ベータ３またはアルファ－５ベータ１インテグリンから選択される。ある特定の実施形態では、細胞は、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ、ヤツメウナギＩＩＩ黄体形成ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモンベータ鎖、黄体形成ホルモン、絨毛膜ゴナドトロピン、絨毛膜ゴナドトロピンベータサブユニット、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ドーパミン、ソマトスタチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、グルココルチコイド、エストロゲン、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プロゲステロン、アンドロゲン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ビタミンＨ、葉酸塩、トランスフェリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、エンドセリン、ボンベシン、血管作用性小腸ペプチド、ラクトフェリン、インテグリン、神経増殖因子、ＣＤ－８、ＣＤ－３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＲＯＲ１、ＩＧＦ－１癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＡ１２５（残留上皮性卵巣がん）、可溶性インターロイキン２（ＩＬ－２）受容体、ＲＡＧＥ－１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、メランＡ／ＭＡＲＴ－１、糖タンパク質（ｇｐ）７５、ｇｐ１００、ベータカテニン、ＰＲＡＭＥ、ＭＵＭ－１、ＺＦＰ１６１、ユビキリン－１、ＨＯＸ－Ｂ６、ＹＢ－１、オステオネクチン、およびＩＬＦ３に結合する受容体を発現する。

ある特定の実施形態では、結合性部分は、リガンド、受容体または抗体を含む。ある特定の実施形態では、結合性部分は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸または炭水化物を含む。ある特定の実施形態では、結合性部分は、ホルモン受容体に結合するホルモン、ホルモン類似体、ホルモンもしくはホルモン類似体の断片、ホルモン受容体、またはホルモンもしくはホルモン受容体に結合する作用剤である。ある特定の実施形態では、結合性部分は、直鎖状または環状構造を有する。

ある特定の実施形態では、結合性部分は、ホルモンまたはホルモン受容体に結合する。ある特定の実施形態では、ホルモンは、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ヤツメウナギＩＩＩ黄体形成ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモンベータ鎖、黄体形成ホルモン、絨毛膜ゴナドトロピン、絨毛膜ゴナドトロピンベータサブユニット、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ドーパミン、ソマトスタチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、グルココルチコイド、エストロゲン、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プロゲステロン、またはアンドロゲンから選択される。ある特定の実施形態では、ホルモン類似体は、ミフェプリストン、フルタミド、リュープロン、ゾラデックス、スプレリン、シナテルトリプトレリン（ｓｙｎａｔｅｌｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）、ブセレリン、セトロレリクス、ガニレリクス、アバレリクス、アンチド、テベレリクス（ｔｅｖｅｒｅｌｉｘ）およびデガレリクス（Ｆｅ２００４８６）から選択される。

ある特定の実施形態では、細胞は、受容体、リガンドまたは抗原を発現し、ペプチドの結合性部分は、細胞によって発現される受容体、リガンド、または抗原に結合する。ある特定の実施形態では、細胞は、過剰増殖細胞である。

一部の態様では、過剰増殖障害を有する対象を処置する方法であって、対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、過剰増殖障害を処置するために十分な量で投与するステップを含み、融合構築物が、第１のドメインと第２のドメインとを含み、第１のドメインが、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２８アミノ酸の配列、または、Ｋ残基の１つもしくは複数がＦ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、Ｆ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ａ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、もしくはＡ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ｆ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２５アミノ酸の配列からなり、第２のドメインが、結合性部分を含む、方法が本明細書に提示される。一部の実施形態では、対象は、新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍を有し、過剰増殖障害を処置するために十分な量は、新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍の増殖を低減させるまたは阻害するために十分な量である。

一部の態様では、過剰増殖障害を処置するための医薬の製造における、融合構築物とチェックポイント阻害剤の組合せの使用が提供される。

一部の態様では、新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の他の部位への転移、または原発新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍から遠位の他の部位における転移性新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の形成もしくは定着を低減させるまたは阻害する方法であって、対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の他の部位への転移、または原発新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍から遠位の他の部位における転移性新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の形成もしくは定着を低減させるまたは阻害するために十分な量で投与するステップを含み、融合構築物が、第１のドメインと第２のドメインとを含み、第１のドメインが、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２８アミノ酸の配列、または、Ｋ残基の１つもしくは複数がＦ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、Ｆ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ａ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、もしくはＡ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ｆ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２５アミノ酸の配列からなり、第２のドメインが、結合性部分を含む、方法が本明細書に提示される。

一部の態様では、新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の他の部位への転移、または原発新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍から遠位の他の部位における転移性新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の形成もしくは定着を低減させるまたは阻害するための医薬の製造における、融合構築物とチェックポイント阻害剤の組合せの使用が提供される。

一部の実施形態では、新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍は、転移性、非転移性または良性である。一部の実施形態では、新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍は、固形細胞塊を含む。一部の実施形態では、新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍は、造血細胞を含む。

一部の実施形態では、新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍は、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、腺腫、腺癌、黒色腫、神経膠腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、中皮腫、網内系、リンパ性または造血性新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍を含む。一部の実施形態では、肉腫は、リンパ肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫または線維肉腫を含む。

一部の実施形態では、造血性新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍は、骨髄腫、リンパ腫または白血病を含む。一部の実施形態では、新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍は、肺、甲状腺、頭部もしくは頸部、上咽頭、のど、鼻もしくは副鼻腔、脳、脊椎、乳房、副腎、下垂体、甲状腺、リンパ液、胃腸（口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸（小腸）、結腸、直腸）、泌尿生殖器（子宮、卵巣、子宮頸部、子宮内膜、膀胱、精巣、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、肝臓、骨、骨髄、リンパ液、血液、筋肉、または皮膚の新生物、眼の黒色腫、腫瘍、またはがんを含む。

一部の実施形態では、肺の新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍は、小細胞肺がんまたは非小細胞肺がんを含む。一部の実施形態では、新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍は、幹細胞の新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍を含む。

一部の実施形態では、方法により、新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍の再発または増悪が阻害されるまたは低減する。

一部の実施形態では、本明細書の方法は、抗細胞増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗がんまたは免疫増強処置または治療を施行するステップをさらに含む。一部の実施形態では、処置または治療は、外科的切除、放射線療法、電離または化学放射線療法、化学療法、免疫療法、局所もしくは局部温熱療法（ハイパーサミア）、またはワクチン接種を含む。一部の実施形態では、処置または治療は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物抽出物、植物アルカロイド、ニトロソ尿素、ホルモン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体を投与することを含む。一部の実施形態では、処置または治療は、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、プレドニゾロン、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、ブスルファン、メトトレキセート、６－メルカプトプリン、チオグアニン、５－フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ＡＺＴ、５－アザシチジン（５－ＡＺＣ）および５－アザシチジン関連化合物、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、ヒドロキシウレア、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、オキシプラチン（ｏｘｉｐｌａｔｉｎ）、ミトタン、プロカルバジン、ダカルバジン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ジブロモマンニトール、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、テニポシド、ゲムシタビン、またはペメトレキセドを投与することを含む。一部の実施形態では、処置または治療は、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞を投与することを含む。一部の実施形態では、処置または治療は、抗体、細胞増殖因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカインまたはケモカインを投与することを含む。一部の実施形態では、処置または治療は、ＩＬ－２、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、ＴＮＦβ、ＭＩＰ－１（α、β、またはγ）、ＭＩＰ－２、ＭＩＰ－（２、３α、３βまたは５）、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ－１、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、ＭＣＰ－４、エオタキシン、エオタキシン－２、Ｉ－３０９／ＴＣＡ３、ＡＴＡＣ、ＨＣＣ－１、ＨＣＣ－２、ＨＣＣ－３、ＬＡＲＣ／ＭＩＰ－３α、ＰＡＲＣ、ＴＡＲＣ、ＣＫβ、ＣＫβ６、ＣＫβ７、ＣＫβ８、ＣＫβ９、ＣＫβ１１、ＣＫβ１２、Ｃ１０、ＩＬ－８、ＧＲＯ α、ＧＲＯβ、ＥＮＡ－７８、ＧＣＰ－２、ＰＢＰ／ＣＴＡＰＩＩＩβ－ＴＧ／ＮＡＰ－２、Ｍｉｇ、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ－１、またはリンホタクチンを投与することを含む。一部の実施形態では、処置または治療は、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤を投与することを含み、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤の非限定的な例としては、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、タラゾパリブ、ベリパリブ、ＢＧＢ－２９０、ＣＥＰ９７２２、Ｅ７０１６、イニパリブおよび３－アミノベンズアミドが挙げられる。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法において、融合構築物を、抗細胞増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗がんまたは免疫増強処置または治療の施行前、それと実質的に同時発生的に、またはその後に投与する。一部の実施形態では、融合構築物を、チェックポイント阻害剤の投与前、それと実質的に同時発生的に、またはその後に投与する。

本発明の方法の一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。

一部の実施形態では、対象は、外科的切除、化学療法、免疫療法、電離または化学放射線療法、局所もしくは局部温熱療法（ハイパーサミア）、またはワクチン接種を受けたことがある。一部の実施形態では、対象は、外科的切除、化学療法、免疫療法、電離または化学放射線療法、局所もしくは局部温熱療法（ハイパーサミア）、またはワクチン接種の候補である。

一部の実施形態では、対象は、外科的切除、化学療法、免疫療法、電離または化学放射線療法、局所もしくは局部温熱療法（ハイパーサミア）、またはワクチン接種の候補ではない。一部の実施形態では、処置により、新生物、腫瘍、がんもしくは悪性細胞の質量、体積、サイズもしくは細胞数の部分的なもしくは完全な破壊、新生物、腫瘍、がんもしくは悪性細胞の壊死、溶解もしくはアポトーシスの刺激、誘導もしくは増大、新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の体積サイズ、細胞質量の低減、新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の体積、質量、サイズもしくは細胞数の増悪もしくは増大の阻害もしくは防止、または寿命の延長がもたらされる。一部の実施形態では、処置により、新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍に付随するまたはそれによって引き起こされる有害な症状または合併症の重症度、持続時間または頻度の軽減または減少がもたらされる。一部の実施形態では、処置により、疼痛、不快感、悪心、衰弱または嗜眠の軽減または減少がもたらされる。一部の実施形態では、処置により、エネルギーの増大、食欲、移動性の改善または心理学的ウェルビーイングがもたらされる。

一部の態様では、良性前立腺肥大症を軽減または処置する方法であって、動物に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、良性前立腺肥大症を処置するために十分な量で投与するステップを含み、融合構築物が、第１のドメインと第２のドメインとを含み、第１のドメインが、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２８アミノ酸の配列、または、Ｋ残基の１つもしくは複数がＦ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、Ｆ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ａ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、もしくはＡ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ｆ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２５アミノ酸の配列からなり、第２のドメインが、結合性部分を含む、方法が本明細書に提示される。

一部の態様では、良性前立腺肥大症を低減させるまたは処置するための医薬の製造における、融合構築物とチェックポイント阻害剤の組合せの使用が提供される。

一部の実施形態では、融合構築物は、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－ＧＳＧＧＳ－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－ＡＳＡＡＳ－βＣＧ－ａｌａ、またはＰｈｏｒ１４－βＣＧ－ａｌａよりも、ＩＣ５０値が低いことによって確認される通り、大きな抗細胞増殖活性を有する。一部の実施形態では、融合構築物は、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－ＧＳＧＧＳ－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－ＡＳＡＡＳ－βＣＧ－ａｌａ、またはＰｈｏｒ１４－βＣＧ－ａｌａよりも小さいＩＣ５０／（ＨＡ５０、溶血活性）比を有する。一部の実施形態では、融合構築物は、約０．０２未満、約０．０１未満、または約０．００５未満のＩＣ５０／（ＨＡ５０、溶血活性）比を有する。

一部の実施形態では、結合性部分は、直鎖状または環状構造を有する。

一部の実施形態では、第１のドメインまたは第２のドメインは、約１～１０、１０～２０、１５～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００またはそれよりも多くのアミノ酸のアミノ酸配列からなるまたはそれを含む。

一部の実施形態では、第１のドメインは、約１５アミノ酸から約２０アミノ酸までの配列からなる。一部の実施形態では、第１のドメインは、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸を有する配列からなる。

一部の実施形態では、第２のドメインは、ＳＹＡＶＡＬＳＡＱＡＡＬＡＲＲと記載されるアミノ酸配列からなるまたはそれを含む。一部の実施形態では、第２のドメインは、ＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧと記載されるアミノ酸配列からなるまたはそれを含む。

一部の実施形態では、第１のドメイン（例えば、溶解性ドメイン）は、第２のドメイン（例えば、結合性部分を含むドメイン）に対してＮＨ２末端側に位置する。一部の実施形態では、第２のドメイン（例えば、結合性部分を含むドメイン）は、第１のドメイン（例えば、溶解性ドメイン）に対してＮＨ２末端側に位置する。

一部の実施形態では、第１のドメインまたは第２のドメインは、１つまたは複数のＤ－アミノ酸を有する。一部の実施形態では、第１のドメインは、任意のＫ、ＦまたはＡ残基にＤ－アミノ酸を有する。

一部の実施形態では、第１のドメインは、両親媒性アルファヘリックスを形成する。一部の実施形態では、第１のドメインと第２のドメインは、共有結合によって接合している。一部の実施形態では、第１のドメインと第２のドメインは、ペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーによって接合している。一部の実施形態では、第１のドメインと第２のドメインは、１個から２５個までのアミノ酸残基を有するペプチド配列、または直鎖状炭素鎖によって接合している。一部の実施形態では、第１のドメインと第２のドメインは、１つまたは複数のＡ、ＳまたはＧアミノ酸残基を含むペプチド配列によって接合している。一部の実施形態では、第１のドメインと第２のドメインは、ＧＳＧＧＳ（配列番号１０）、ＡＳＡＡＳ（配列番号１１）、またはＣＣＣＣＣＣを含む、またはそれからなるペプチド配列によって接合している。一部の実施形態では、融合構築物は、第３の、第４の、第５の、第６のまたは第７のドメインを含む。一部の実施形態では、融合構築物は、単離または精製されたものである。一部の実施形態では、融合構築物は、混合物を含む。

一部の態様では、細胞の増殖を低減させるまたは阻害する方法であって、細胞に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、細胞の増殖を低減させるまたは阻害するために十分な量で接触させるステップを含み、融合構築物が、第１の溶解性ドメインと第２のドメインとを含み、第１の溶解性ドメインが、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）またはペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）からなり、第２のドメインが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＬＨＲＨ断片、またはＬＨＲＨ類似体を含む、方法が本明細書に提示される。

一部の態様では、過剰増殖障害を有する対象を処置する方法であって、対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、過剰増殖障害を処置するために十分な量で投与するステップを含み、融合構築物が、第１の溶解性ドメインと第２のドメインとを含み、第１の溶解性ドメインが、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）からなり、第２のドメインが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＬＨＲＨ断片、またはＬＨＲＨ類似体を含む、方法が本明細書に提示される。

一部の態様では、新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の他の部位への転移、または原発新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍から遠位の他の部位における転移性新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の形成もしくは定着を低減させるまたは阻害する方法であって、対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の他の部位への転移、または原発新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍から遠位の他の部位における転移性新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の形成もしくは定着を低減させるまたは阻害するために十分な量で投与するステップを含み、融合構築物が、第１の溶解性ドメインと第２のドメインとを含み、第１の溶解性ドメインが、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）からなり、第２のドメインが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＬＨＲＨ断片、またはＬＨＲＨ類似体を含む、方法が本明細書に提示される。

一部の態様では、良性前立腺肥大症を軽減または処置する方法であって、動物に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、良性前立腺肥大症を処置するために十分な量で投与するステップを含み、融合構築物が、第１の溶解性ドメインと第２のドメインとを含み、第１の溶解性ドメインが、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）からなり、第２のドメインが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＬＨＲＨ断片、またはＬＨＲＨ類似体を含む、方法が本明細書に提示される。

一部の実施形態では、融合構築物の第２のドメインは、ＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧと記載されるアミノ酸配列（配列番号９）からなるまたはそれを含む。

一部の実施形態では、融合構築物は、単離または精製されたものである。一部の実施形態では、融合構築物は、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－（配列番号１０）－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－（配列番号１１）－βＣＧ－ａｌａ、またはＰｈｏｒ１４－βＣＧ－ａｌａよりも、ＩＣ５０値が低いことによって確認される通り、大きな抗細胞増殖活性を有する。一部の実施形態では、融合構築物は、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－（配列番号１０）－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－（配列番号１１）－βＣＧ－ａｌａ、またはＰｈｏｒ１４－βＣＧ－ａｌａよりも小さなＩＣ５０／ＨＡ５０（溶血活性）比を有する。一部の実施形態では、融合構築物は、約０．０２未満、約０．０１未満、または約０．００５未満のＩＣ５０／ＨＡ５０（溶血活性）比を有する。一部の実施形態では、第１の溶解性ドメインは、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）からなる。一部の実施形態では、第１の溶解性ドメインは、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）からなる。

一部の実施形態では、ＬＨＲＨ類似体は、リュープロン（ロイプロリド）を含む。一部の実施形態では、ＬＨＲＨ類似体は、ゾラデックス（ゴセレリン）を含む。一部の実施形態では、ＬＨＲＨ類似体は、スプレリン（ヒストレリン）を含む。一部の実施形態では、ＬＨＲＨ類似体は、トリプトレリンを含む。一部の実施形態では、ＬＨＲＨ類似体は、ブセレリンを含む。一部の実施形態では、ＬＨＲＨ類似体は、セトロレリクスを含む。一部の実施形態では、ＬＨＲＨ類似体は、ガニレリクスを含む。一部の実施形態では、ＬＨＲＨ類似体は、アバレリクスを含む。一部の実施形態では、ＬＨＲＨ類似体は、アンチドを含む。一部の実施形態では、ＬＨＲＨ類似体は、テベレリクスを含む。一部の実施形態では、ＬＨＲＨ類似体は、デガレリクス（Ｆｅ２００４８６）を含む。一部の実施形態では、非ペプチドリンカーは、直鎖状炭素鎖リンカーを含む。一部の実施形態では、非ペプチドリンカーは、直鎖状６炭素鎖リンカーを含む。

一部の実施形態では、組成物または混合物に融合構築物およびチェックポイント阻害剤が含まれる。

一部の実施形態では、過剰増殖障害またはがんは、卵巣がんまたは乳がんである。

一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ１またはＣＤ２７４としても公知）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）または細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）の阻害剤またはアンタゴニストである。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質）、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン（Ｉｇ）含有抑制因子）、ＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）、ＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有タンパク質３）、ＩＤＯ（インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ）、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４／ＯＸ４０受容体）、または抗ＮＫＧ２Ａ（例えば、モナリズマブ）の阻害剤である。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、低分子化合物（ｓｍａｌｌｃｏｍｐｏｕｎｄ）阻害剤である。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。

一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１に結合するアンタゴニスト抗体である。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体（例えば、クローン１０Ｆ．９Ｇ２）である。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、ニボルマブおよびペムブロリズマブからなる群から選択される。

方法に従って処置可能な対象として哺乳動物が挙げられる。特定の実施形態では、対象はヒトである。

図１は、ＬＨＲＨ－Ｐｈｏｒ２１が、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａよりも急速にがん細胞を死滅させることを示す。ヒト黒色腫細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ、種々の継代数）を、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａまたはＬＨＲＨ－Ｐｈｏｒ２１と一緒にインキュベートした。

図２は、溶解性ドメインに２１アミノ酸（Ｐｈｏｒ２１）を有するβＣＧ－ａｌａ融合構築物、１８アミノ酸（Ｐｈｏｒ１８（３３８９８３）＝ＣＬＩＰ７１）を有するβＣＧ－ａｌａ融合構築物および１５アミノ酸（Ｐｈｏｒ１５）を有するβＣＧ－ａｌａ融合構築物の、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａと比較した、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞に対する細胞傷害性（マイクロモル濃度ＩＣ_５０）を示す。

図３は、βＣＧ－ａｌａおよびＬＨＲＨ融合構築物のＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞に対する細胞傷害性（マイクロモル濃度ＩＣ_５０）を示す。ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞に対する毒性がＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａよりも高い融合構築物が図の右側に列挙されている。

図４は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）融合構築物のＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞に対する細胞傷害性（マイクロモル濃度ＩＣ_５０）を示す。融合構築物は、３２３０３３＝Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ、３３７４７９＝ＬＨＲＨ－Ｐｈｏｒ２１、３３７４８０＝Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ、３３８６１１＝Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ、３３８６１２＝Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ、３３８６１３＝Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（ＥＰ－１００）、３３９３８５＝Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ、および３３９３４７＝Ｐｈｏｒ１８－リュープロンである。

図５は、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａと比較した、βＣＧ－ａｌａおよびＬＨＲＨ融合構築物のヒト赤血球に対する急性溶血活性（マイクロモル濃度ＨＡ_５０）を示す。ＬＨＲＨ－Ｐｈｏｒ２１、Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨおよびＰｈｏｒ１８－リュープロン（ＱＨＷＳＹ（Ｄ－Ｌｅｕ）ＬＲＰＮＥｔ＝リュープロン）以外は全ての融合構築物がＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａよりも有意に低い溶血活性を有した。

図６は、細胞傷害性および溶血活性の比較を示す。矢印で示されているペプチドは、細胞に対する毒性がＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａよりも高い。

図７は、処置スケジュールの概略である。

図８Ａ～８Ｊは、３種のβＣＧコンジュゲートを用いた処置中および試験終点の腫瘍の状態を、コンジュゲートしていないＰｈｏｒ２１、コンジュゲートしていないＰｈｏｒ１８（３３８９８３）＝（ＣＬＩＰ７１）および（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３コンジュゲート（３３８９８４）と比較した要約である。融合構築物コード、３３＝Ｐｈｏｒ２１β－ＣＧ－ａｌａ；７６＝Ｐｈｏｒ１８－βＣＧ－ａｌａ；８１＝Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ；８５＝Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ；４７＝Ｐｈｏｒ１８－リュープロン；１３＝Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ；１１＝Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ；１２＝Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ；７１＝Ｐｈｏｒ１５－βＣＧ－ａｌａ；および７４＝Ｐｈｏｒ１５－Ｃ_６－βＣＧ－ａｌａの後に、試験に使用した構築物の量が続く。同上。同上。同上。同上。同上。

図９Ａ～９Ｈは、３０日までの示されている期間における、Ａ）Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ（３３）；Ｂ）Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ（１１）；Ｃ）Ｐｈｏｒ１８－リュープロン（４７）；Ｄ）Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ（１２）；Ｅ）Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（１３）；Ｆ）（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３－ＬＨＲＨ；Ｇ）Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（８５）についての生理食塩水およびベースライン値と比較した処置群の腫瘍体積；ならびにＨ）ベースラインとの比較を示す。同上。同上。同上。

図１０Ａ～１０Ｅは、５種のＬＨＲＨコンジュゲートを用いた場合の、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａと比較した、試験終点の腫瘍の状態の要約をＡ）腫瘍重量、Ｂ）ベースラインと比較した腫瘍重量の変化、Ｃ）生腫瘍細胞の総数、Ｄ）ベースラインと比較した生腫瘍細胞の総数の変化、およびＥ）体重について示す。３３８６１４＝（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３ＬＨＲＨ、３３８６１２＝Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ、３３８６１３＝Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ、および３３９３８５＝Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ。同上。同上。

図１１は、示されている量のドキソルビシンの存在下で漸増濃度のＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａと一緒にインキュベートした、多剤耐性である卵巣がん細胞（ＯＶＣＡＲ３）、および最高ドキソルビシン濃度における組合せによる細胞死滅の２００倍の強化を示す。

図１２は、ＬＨＲＨとＰｈｏｒ２１の融合構築物およびβＣＧとＰｈｏｒ２１の融合構築物を用いた場合の、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞と比較したＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞およびＴＭ４細胞に対する細胞傷害性を示す。ＴＭ４細胞はＬＨＲＨ受容体陰性であり、ＣＨＯ細胞はＣＧ受容体陰性であり、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞はＬＨＲＨ受容体およびＣＧ受容体の両方を発現する。

図１３Ａは、ＬＨＲＨ標的化リガンドとコンジュゲートした溶解性ペプチドを含む例示的な融合構築物（ＥＰ－１００＝３３８６１３＝Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ）を使用した標的化膜破壊による迅速な死滅の図解を示す。図１３Ｂは、ＥＰ－１００の構造の漫画図を示す。同上。

図１４Ａ～１４Ｆは、マウス卵巣がん細胞における黄体形成ホルモン放出ホルモン受容体（ＬＨＲＨ－Ｒ）の示差的な発現およびＥＰ－１００（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ）の細胞傷害効果を示す。図１４Ａおよび１４Ｂは、ＥＰ－１００をＩＣ_５０で用いた処置の７２時間後の細胞生存率を示す。図１４Ｃ～１４Ｆは、マウス卵巣がん細胞におけるＬＨＲＨ－Ｒ発現のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルを示す。

図１５Ａ～１５Ｅは、ＬＨＲＨ－Ｒが、がん細胞におけるＥＰ－１００（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ）媒介性細胞傷害性のために必須であることを実証する。図１５Ａは、ＬＨＲＨ－Ｒを標的とする種々のｓｉＲＮＡを１００ｎＭでトランスフェクトしたＩＤ８細胞を示す。非特異的ｓｉＲＮＡ（ＮＳｓｉＲＮＡ）を対照として使用した。１μＭのＥＰ－１００の存在下で（図１５Ｂ）、および種々の濃度のＥＰ－１００の存在下で（図１５Ｃ）２４時間（ｈｒ）培養したＩＤ８がん細胞およびＬＨＲＨ－ＲｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＩＤ８がん細胞の生存率が示されている。種々の濃度のＥＰ－１００、酢酸リュープロリド、またはＣＬＩＰ－７１の存在下でのＩＤ８がん細胞の生存率（図１５Ｄ）およびＩＧ１０がん細胞の生存率（図１５Ｅ）も示されている。同上。同上。

図１６Ａ～１６Ｂは、ＥＰ－１００のＴ細胞受容体に対する効果を示す。細胞をＥＰ－１００（１μＭ）の存在下で２４時間培養し、次いで、ＰＤ－Ｌ１発現を決定した。図１６Ａは、ＲＴＰＣＲ分析を示す。図１６Ｂは、ウエスタンブロット分析を示す。

図１７Ａ～１７Ｅは、ＩＤ８卵巣がん細胞異種移植マウスモデルにおける、ＰＤ－Ｌ１抗体の存在下でのＥＰ－１００（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ）を用いた処置の生物学的効果を示す。図１７Ａは、ＥＰ－１００とＰＤ－Ｌ１抗体の組合せを用いた処置のスケジュールを示す。この組合せの、ＩＤ８－ルシフェラーゼを注射したマウスからの定着した腫瘍のサイズに対する効果（図１７Ｂ）を評価した。エラーバーは、標準偏差（ＳＤ）を表す。ＩＤ８－ルシフェラーゼ細胞を腹腔内に接種したマウスを、ビヒクル（対照）、単一作用剤ＰＤ－Ｌ１抗体（２００μｇ／ｋｇを腹腔内に週に２回）、ＥＰ－１００（０．２ｍｇ／ｋｇを静脈内に週に２回）、またはＥＰ－１００とＰＤ－Ｌ１抗体の組合せを用いて処置した。体重（図１７Ｃ）、腫瘍重量（図１７Ｄ）、および腹水（図１７Ｅ）に対する効果が示されている。同上。同上。同上。

図１８Ａ～１８Ｂは、ＩＤ８がん細胞異種移植マウスモデルにおける、ＥＰ－１００（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ）とＰＤ－Ｌ１抗体の組合せを用いた処置後の免疫細胞プロファイルを示す。腫瘍（図１８Ａ）および腹水（図１８Ｂ）に関する免疫プロファイルを、ＩＤ８－ルシフェラーゼがん細胞を用いたＦＡＣＳ分析を使用して評価した。ＣＤ４５^＋細胞画分を腫瘍組織の解離後の生細胞のゲート内に隔離した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞をＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^－ＣＤ８^＋と定義し、ＴｒｅｇをＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋と定義し、ＮＫ細胞をＣＤ４５^＋ＮＫ１と定義し、Ｂ細胞をＣＤ４５^＋／ＣＤ１９^＋と定義し、マクロファージをＣＤ４５^＋／ＣＤ１１ｂ^＋／Ｆ４／８０^＋と定義し、ＤＣをＣＤ４５^＋／ＣＤ１１ｂ^＋／ＣＤ１１ｃと定義し、単球ＭＤＳＣをＣＤ４５^＋ＣＤ３^－ＣＤ１１ｂ^＋Ｌｙ６Ｇ^－Ｌｙ６Ｃ^ｈｉｇｈと定義した。各ドットは１匹のマウスからのデータを表す。同上。同上。同上。同上。

図１９Ａ～１９Ｄは、ＥＰ－１００（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ）で処置したＩＤ８細胞によるサイトカインおよびケモカイン分泌のアレイ解析を示す。アレイ画像は、２時間、４時間、および１２時間の時点で無処置のＩＤ８細胞およびＥＰ－１００で処置したＩＤ８細胞から検出された各サイトカインまたはケモカインのスポットを示す（図１９Ａ）。ＥＰ－１００で処置したＩＤ８細胞の平均画素密度の、対照における平均画素密度に対する比が変化倍率として提示されている（図１９Ｂ）。ＥＰ－１００処置後の種々の時点でのＩＤ８細胞におけるＩＬ－３３分泌（図１９Ｃ）、およびαＰＤ－Ｌ１またはＥＰ－１００とαＰＤ－Ｌ１の組合せによる処置（図１９Ｄ）。同上。同上。

図２０Ａ～２０Ｃは、Ｔ細胞活性化に対するＩＬ－３３の役割を示す。ナイーブＴ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＬＨＲＨ－Ｒ発現（図２０Ａ）。ナイーブＴ細胞および活性化Ｔ細胞に対するＥＰ－１００の細胞傷害効果（図２０Ｂ）。Ｔ細胞活性化に対する条件培地（ＣＭ）の影響（図２０Ｃ）。

図２１は、同系マウスモデルにおける、１５日間にわたる処置の間のＥＭＴ－６乳がん腫瘍の腫瘍体積を示す。処置群にはビヒクル対照、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ、０．５ｍｇ／ｋｇ、抗ＣＴＬＡ４抗体およびＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ＋抗ＣＴＬＡ４抗体が含まれた。

詳細な説明
本明細書のある特定の実施形態では、第１のドメイン溶解性部分と、それと接合または融合した第２のドメイン結合性部分とを含む融合構築物が本明細書に提示される。典型的な配置では、融合構築物の第１のドメインは、溶解性部分を含み、これは、細胞に対して直接的または間接的に毒性であり、それにより、細胞の増殖もしくは生存を低減する、または細胞死、死滅もしくはアポトーシスを刺激する、誘導する、増加させるもしくは増強することができるものである。また、融合構築物の第２のドメインは、結合性部分実体と称される、細胞を標的とする部分を含む。ある特定の実施形態では、本開示の融合構築物を、ある特定のがんを処置するために、チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用することができ、がんの非限定的な例としては、卵巣がんおよび乳がんが挙げられる。

ある特定の実施形態では、融合構築物は、第１の「溶解性」ドメインを含むまたはそれからなり、第２の「標的化」または「結合性」ドメインを含むまたはそれからなる。一実施形態では、融合構築物は、ペプチド配列（リシン＝Ｋ、フェニルアラニン＝Ｆおよびアラニン＝Ａなどのアミノ酸から選択される）、例えば、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡおよびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫを含む１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８残基のＬ－またはＤ－アミノ酸配列からなる第１のドメインと、標的化または結合性部分を含むまたはそれからなる第２のドメインとを含む。別の実施形態では、融合構築物は、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡおよびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるＬ－またはＤ－アミノ酸配列からなる第１のドメインと、標的化または結合性部分を含むまたはそれからなる第２のドメインとを含む。さらなる実施形態では、融合構築物は、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡおよびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるＬ－またはＤ－アミノ酸配列からなる第１のドメインと、第１のドメインとは別個の１～２５個のＬ－またはＤ－アミノ酸の配列（例えば、標的化または結合性部分）からなる第２のドメインとを含むまたはそれからなる。

本明細書で使用される場合、「融合」または「キメラ」という用語およびその文法上の変形は、構築物に関して使用される場合、互いに別個であり、一般には天然では一緒に存在しない２つの異なる分子実体に由来する、それから得られたもしくは単離された、またはそれに基づくもしくはそれに倣ってモデリングされた部分または切片を含有する構築物を意味する。すなわち、例えば、融合構築物の１つの部分は溶解性部分を含むまたはそれからなり、構築物の第２の部分は、結合能を有する部分などの標的化部分を含むまたはそれからなり、第１のドメインおよび第２のドメインはそれぞれ構造的に別個である。融合構築物は、「コンジュゲート」と称することもでき、コンジュゲートは、第１のドメイン溶解性部分と第２のドメイン標的化または結合性部分とを含むまたはそれからなる。

融合構築物の第１のドメインおよびまたは第２のドメインは、アミノ酸配列（ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、レクチン）、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）および炭水化物（糖類、シアル酸、ガラクトース、マンノース、フコース、アセチルノイラミン酸など）を含むまたはそれからなる。「アミノ酸配列」、「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、本明細書では、互換的に使用され、アミド結合または等価物によって共有結合により連結した２つまたはそれよりも多くのアミノ酸または「残基」を指す。アミノ酸配列は、例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、またはＮ、Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）で形成されるものを含めた、非天然および非アミド化学結合によって連結したものであってよい。非アミド結合としては、例えば、ケトメチレン、アミノメチレン、オレフィン、エーテル、チオエーテルなどが挙げられる（例えば、Spatola in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357 (1983), "Peptide and Backbone Modifications," Marcel Decker, NYを参照されたい）。

融合構築物またはキメラの第１のドメインおよび第２のドメインは、Ｌ－アミノ酸配列、Ｄ－アミノ酸配列およびＬ－アミノ酸とＤ－アミノ酸が混在するアミノ酸配列を含む。第１のドメインおよび第２のドメインのアミノ酸配列は、直鎖状または環状構造であり得、別個の部分（例えば、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、などのドメイン）とコンジュゲートして、分子内または分子間ジスルフィド結合を形成し、また、同じもしくは異なるアミノ酸配列、または他の分子とも高次多量体またはオリゴマーを形成する。

融合構築物の例示的な長さは、約５～１５、２０～２５、２５～５０、５０～１００、１００～１５０、１５０～２００、または２００～３００またはそれよりも多くのアミノ酸残基長である。特定の実施形態では、第１のドメインまたは第２のドメインは、約１～１０、１０～２０、１５～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００またはそれよりも多くの残基のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。より詳細な実施形態では、第１のドメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２８またはそれよりも多くの残基のアミノ酸配列からなる。

融合構築物の第１のドメインは、単独で、または第２のドメインと組み合わせて、必要に応じて両親媒性アルファヘリックスを形成する。両親媒性アルファヘリックスは、アルファヘリックスの一方の面に主に親水性のアミノ酸を含有し、他方の面に主に疎水性アミノ酸を含有する。アルファヘリックスは３．６残基ごとに完全なターンをなすので、両親媒性アルファヘリックスのアミノ酸配列では３～４残基ごとに親水性残基と疎水性残基が交互になっている。ＰＮＮＰＮＮＰリピートパターンまたはモチーフは両親媒性アルファヘリックスを形成することが予測され、ここで、Ｐは、正に荷電したアミノ酸残基を表し、Ｎは中性アミノ酸残基を表す。ＰＮＮＰＮＮＰリピートパターンにより、負に荷電した細胞膜への溶解性ペプチドのカチオン性結合性部位および膜相互作用／透過のための疎水性部位がもたらされる。したがって、融合構築物は、両親媒性アルファヘリックスを形成し得る、１つもしくは複数の中断されていないＰＮＮＰＮＮＰリピートパターンもしくはモチーフ、または１つもしくは複数の断続的なＰＮＮＰＮＮＰリピートパターンもしくはモチーフを有する第１のドメインを含む。例えば、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫおよびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫなどの１５または１８残基のアミノ酸配列は、中断されていないＰＮＮＰＮＮＰリピートモチーフおよび断続的なＰＮＮＰＮＮＰリピートモチーフを有する。

標的化または結合性部分などの融合構築物の第２のドメインは、リガンド、抗体（またはその抗原結合性断片）、抗原、インテグリン、インテグリン受容体（例えば、「ＲＧＤ」配列モチーフを含有するタンパク質またはペプチド、および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に存在し得る構成成分、例えば、単糖、二糖またはオリゴ糖、シアル酸、ガラクトース、マンノース、フコース、アセチルノイラミン酸など）、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、ならびに、受容体、抗体、抗原、インテグリン、インテグリン受容体（例えば、「ＲＧＤ」配列モチーフを含有するタンパク質またはペプチド、および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に存在し得る構成成分、例えば、単糖、二糖またはオリゴ糖、シアル酸、ガラクトース、マンノース、フコース、アセチルノイラミン酸など）、増殖因子受容体、サイトカイン受容体、およびケモカイン受容体に結合する標的化および結合性部分を含むまたはそれからなる。

「受容体」は、一般には、細胞上に存在するか（例えば、膜受容体）または細胞内に存在する。受容体は、細胞膜表面に結び付いているまたは細胞膜を横断している。例えば、受容体タンパク質は、必要に応じて細胞質部分または細胞外部分または両方を伴う、細胞膜を横断している膜貫通ドメインを有し得る。したがって、受容体は、細胞外部分、膜貫通部分または細胞質部分を含有する全長のインタクトなネイティブな受容体、ならびに短縮された形態またはその断片（例えば、単独でまたは組合せでの、受容体の細胞外、膜貫通または細胞質部分または部分配列）を包含する。例えば、可溶性受容体は、一般には膜貫通を欠き、必要に応じて、ネイティブな細胞外または細胞質内領域（ネイティブな受容体に存在する場合）の全部または一部も欠き得る。そのような短縮型受容体が形成し得、断片はリガンドに対して少なくとも部分的な結合性を保持し得る。

融合構築物の標的化および結合性部分ドメインは、受容体リガンドと称される、受容体に特異的にまたは非特異的に結合する任意の実体を含むまたはそれからなる。したがって、標的化および結合性部分の非限定的な例として、ホルモン受容体に結合するホルモン、ホルモン類似体、ホルモンまたはホルモン類似体の断片、受容体に結合する増殖因子、増殖因子類似体、増殖因子または増殖因子類似体の断片、ホルモン受容体、ホルモンまたはホルモン受容体に結合するリガンド、ならびに、ホルモン受容体に結合するホルモン、ホルモン類似体、ホルモンまたはホルモン類似体の断片、ホルモン受容体、ホルモンまたはホルモン受容体に結合するリガンド、受容体に結合する増殖因子、増殖因子類似体、増殖因子または増殖因子類似体の断片、増殖因子に結合する増殖因子受容体または増殖因子受容体に結合するリガンドに結合する標的化および結合性部分などが挙げられる。

結合性部分として有用なホルモンの非限定的な例としては、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ、ＬＨＲＨ、ヤツメウナギＩＩＩ黄体形成ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモンベータ鎖、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、絨毛膜ゴナドトロピン（ＣＧ）、絨毛膜ゴナドトロピンベータサブユニット（β－またはベータ－ＣＧ）、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ドーパミン、ソマトスタチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、グルココルチコイド、エストロゲン、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プロゲステロン、アンドロゲンおよびその誘導体が挙げられる。結合性部分として有用な例示的なホルモン受容体としては、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ受容体、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ受容体、ヤツメウナギＩＩＩ黄体形成ホルモン放出ホルモン受容体、黄体形成ホルモン受容体、絨毛膜ゴナドトロピン受容体、メラニン細胞刺激ホルモン受容体、エストラジオール受容体、ドーパミン受容体、ソマトスタチン受容体、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）受容体、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体、成長ホルモン（ＧＨ）受容体、Ｈｅｒ２－ｎｅｕ受容体、グルココルチコイドホルモン受容体、エストロゲン受容体、テストステロン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、これらの組合せ、これらの生物活性部分、およびこれらの類似体が挙げられる。

例示的な増殖因子としては、ＬＨＲＨ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、およびＨｅｒ２－ｎｅｕが挙げられる。例示的な増殖因子受容体としては、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体、成長ホルモン（ＧＨ）受容体、およびＨｅｒ２－ｎｅｕ受容体、ＩＧＦ－１が挙げられる。一部の実施形態では、融合構築物または融合構築物の結合性部分は、その同類の受容体（例えば、ＬＨＲＨ受容体）に結合し得るＬＨＲＨポリペプチド、ＬＨＲＨポリペプチドの生物活性部分またはＬＨＲＨポリペプチドの一部を含む。一部の実施形態では、ＬＨＲＨポリペプチドは、ＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧと記載されるアミノ酸配列（配列番号９）を含む。ＬＨＲＨポリペプチドは、ＬＨＲＨポリペプチドが生物活性および／または受容体結合能を維持する限りは、保存的アミノ酸置換を含んでよい。

標的化または結合性部分の具体的な非限定的な例としては、ＬＨＲＨ、そのＬＨＲＨ機能的（結合性）断片、ＬＨＲＨ類似体、ならびにβＣＧ、そのβＣＧ機能的（結合性）断片およびβＣＧ類似体が挙げられる。ＬＨＲＨは、十分に機能的なリガンドであり、リガンド受容体相互作用を通じて、シグナルトランスダクション経路の活性化などの薬理学的効果を引き出すことができる。βＣＧ－ａｌａは、いかなる薬理学的効果も引き出さずに細胞膜に結合することができる、ｈＣＧの断片である。標的化または結合性部分の具体的な非限定的な例は、以下の内部のまたは以下と記載されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる：βＣＧの断片である、ＳＹＡＶＡＬＳＡＱＡＡＬＡＲＲ；ＳＹＡＶＡＬＳＡＱＡＡＬＡＲＲＡ、およびＬＨＲＨ配列であるＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ。

標的化および結合性部分は、新生物細胞、腫瘍細胞またはがん細胞、および新生物細胞、腫瘍細胞またはがん細胞に関連するリンパ管または血管において排他的にまたは優先的に発現される抗原のリガンドをさらに包含する。そのような抗原は、「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」と都合よく称され、２、３挙げると、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＡ－１２５（残留上皮性卵巣がん）、可溶性インターロイキン２（ＩＬ－２）受容体、ＲＡＧＥ－１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、メランＡ／ＭＡＲＴ－１、糖タンパク質（ｇｐ）７５、ｇｐ１００、ベータカテニン、ＰＲＡＭＥ、ＭＵＭ－１、ＺＦＰ１６１、ユビキリン－１、ＨＯＸ－Ｂ６、ＹＢ－１、オステオネクチン、およびＩＬＦ３、ＩＧＦ－１が含まれる。標的とすることができる他の抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ１５４、免疫グロブリン様受容体など）である。

標的化および結合性部分は、トランスフェリン、葉酸およびその誘導体（例えば、葉酸塩）、ならびに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーメンバーおよびＴＮＦ受容体、例えば、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ（リンホトキシン、ＬＴ）、ＴＲＡＩＬ、Ｆａｓ、ＬＩＧＨＴ、４１ＢＢなどをさらに包含する。

第２のドメインが標的化または結合性ドメインを含むまたはそれからなる融合構築物は、第２のドメインが結合する抗原、受容体もしくはリガンド、インテグリン、抗体もしくは抗原、またはＴＡＡを産生するまたは発現する細胞に結合し得る。細胞の非限定的な例としては、過剰増殖細胞および異所性または望ましくない過剰増殖を示す細胞が挙げられる。特定の非限定的な例では、そのような細胞には、非転移性および転移性新生物細胞、がん細胞、腫瘍細胞および悪性細胞、ならびに播種性新生物細胞、がん細胞、腫瘍細胞および悪性細胞、ならびに休止状態の新生物細胞、がん細胞、腫瘍細胞および悪性細胞が含まれる。抗原、受容体、リガンド、インテグリン、ＴＡＡなどを正常な細胞または非過剰増殖細胞と比べて上昇したレベルで発現する細胞では、そのような細胞に対する選択性がもたらされる。したがって、標的化または結合性部分は、過剰増殖細胞（例えば、非転移性および転移性新生物、がん、腫瘍および悪性腫瘍、ならびに播種性および休止状態の新生物細胞、がん細胞、腫瘍細胞および悪性細胞）において発現されるまたはそれによって産生されるが、正常な細胞または非過剰増殖細胞では検出可能には発現も産生もされないかまたは比較的低いレベルで発現される抗原、受容体、リガンド、インテグリンまたはＴＡＡに結合し、それにより、過剰増殖細胞を優先的に標的とすることができる。抗原、受容体、リガンド、インテグリンまたはＴＡＡを発現する例示的な非限定的な細胞および組織型としては、乳房細胞、卵巣細胞、子宮細胞、子宮頸部細胞、前立腺細胞、精巣細胞、副腎細胞、下垂体細胞、膵臓細胞、肝臓細胞、胃腸細胞、皮膚細胞、筋肉細胞または子宮内膜細胞が挙げられる。

結合性部分のさらなる例として、抗体および抗体断片が挙げられる。「抗体」は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、およびこれらの任意のサブクラスなどの任意のモノクローナルまたはポリクローナル免疫グロブリン分子を指す。ＩｇＧの例示的なサブクラスは、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３およびＩｇＧ_４である。抗体は、Ｂ細胞などの細胞によって産生されるまたはそこで発現されるものを包含する。抗体断片または部分配列は、比較される全長抗体の少なくとも部分的な抗原結合能を保持する全長抗体の一部を指す。例示的な抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド連結したＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、三重特異性（Ｆａｂ_３）、二重特異性（Ｆａｂ_２）、ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）（（Ｖ_Ｌ－Ｖ_Ｈ）_２または（Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ）_２）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）（三価）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）（四価）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（（ｓｃＦｖ－Ｃ_Ｈ３）_２）、二重特異性単鎖Ｆｖ（Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ）、ＩｇＧデルタＣＨ２、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃ、またはインタクトな免疫グロブリンの他の抗原結合性断片が挙げられる。

融合構築物は、アミノ末端に第１のドメインを有し、カルボキシル末端に第２のドメインを有するものを包含する。融合構築物はまた、カルボキシル末端に第１のドメインを有し、アミノ末端に第２のドメインを有するものも包含する。追加的なドメイン（例えば、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、などのドメイン）が存在する場合、第１のドメインは、第２のドメインに対してＮＨ_２末端側に位置する、または第２のドメインは、第１のドメインに対してＮＨ_２末端側に位置する。

本明細書に記載の種々の配列、例えば、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡおよびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫ、または結合性部分などの部分配列およびアミノ酸置換も包含される。特定の実施形態では、第１のドメインまたは第２のドメインの部分配列は、少なくとも５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５またはそれよりも多くのアミノ酸残基を有する。

したがって、本発明は、第１のドメインまたは第２のドメイン、または第１のドメインと第２のドメインの両方の置換、付加または欠失などの改変または変異を包含する。したがって、ペプチド配列である第１のドメインまたは第２のドメインを含む融合構築物に、第１のドメインまたは第２のドメインの活性（溶解性または結合性）を破壊するものでない限りは任意の数の保存的または非保存的アミノ酸置換を組み入れることができる。したがって、例えば、改変された溶解性部分（第１のドメイン）は、改変されていない第１のドメインの細胞死滅またはアポトーシスなどの溶解性活性を少なくとも部分的に保持し得、また、その改変された結合性部分または模倣体は、改変されていない結合性部分の結合活性を少なくとも部分的に保持し得る。

「保存的置換」は、１つのアミノ酸が生物学的に、化学的にまたは構造的に類似した残基によって置き換えられることである。生物学的に類似したとは、置換が、生物活性、例えば溶解性活性に適合するものであることを意味する。構造的に類似したとは、アミノ酸が、例えばアラニン、グリシンおよびセリンなど、同様の長さの側鎖を有すること、または、同様のサイズを有すること、または、例えば両親媒性アルファヘリックスなどの、第１のドメイン、第２のドメインもしくは追加的なドメインの構造が維持されることを意味する。化学的類似性とは、残基が、同じ電荷を有するまたはどちらも親水性であるもしくは疎水性であることを意味する。特定の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１つの疎水性残基による別の疎水性残基の置換、または１つの極性残基による別の極性残基の置換、例えば、アルギニンでのリシンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、またはグルタミンによるアスパラギンの置換、セリンによるトレオニンの置換などが挙げられる。常套的なアッセイを使用して、融合構築物バリアントが、活性、例えば溶解性活性または結合活性を有するかどうかを決定することができる。

特定の例としては、ペプチドである第１のドメインまたは第２のドメインの１つまたは複数のアミノ酸残基（例えば、１～３、３～５、５～１０、１０～２０、またはそれよりも多く）の置換または欠失が挙げられる。改変された融合構築物は、参照配列（例えば、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡもしくはＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫなどの第１のドメイン、または結合性部分などの第２のドメイン）に対して５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、またはそれよりも大きな同一性を有するペプチド配列を有し得る。

特定の実施形態では、融合構築物は、Ｋ残基の１つもしくは複数がＦ残基もしくはＬ残基で置換されているか、Ｆ残基の１つもしくは複数がＫ残基、Ａ残基もしくはＬ残基で置換されているか、またはＡ残基の１つもしくは複数がＫ残基、Ｆ残基もしくはＬ残基で置換されているＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡおよびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるペプチドを含む１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８残基のＬ－またはＤ－アミノ酸配列を含むまたはそれからなるペプチドである第１のドメインを含む。別の特定の実施形態では、融合構築物は、Ｋ残基の１つもしくは複数がＦ残基もしくはＬ残基で置換されているか、Ｆ残基の１つもしくは複数がＫ残基、Ａ残基もしくはＬ残基で置換されているか、またはＡ残基の１つもしくは複数がＫ残基、Ｆ残基もしくはＬ残基で置換されているＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡおよびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるＬ－またはＤ－アミノ酸配列からなるペプチドである第１のドメインと、結合性部分を含むまたはそれからなるペプチドである第２のドメインとを含む。別の特定の実施形態では、融合構築物は、Ｋ残基の１つもしくは複数がＦ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、Ｆ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ａ残基またはＬ残基のいずれかで置換されているか、またはＡ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ｆ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡおよびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるＬ－またはＤ－アミノ酸配列からなるペプチドである第１のドメインと、第１のドメインとは別個の１～２５個のＬ－またはＤ－アミノ酸の配列（例えば、結合性部分）からなるペプチドである第２のドメインとを含むまたはそれからなる。

「同一性」および「相同性」という用語およびその文法上の変形は、２つまたはそれよりも多くの参照実体が同じであることを意味する。したがって、２つのアミノ酸配列が同一である場合、それらは同じアミノ酸配列を有する。「同一性のエリア、領域またはドメイン」とは、２つまたはそれよりも多くの参照実体の一部が同じであることを意味する。したがって、２つのアミノ酸配列が１つまたは複数の配列領域にわたって同一または相同である場合、その２つのアミノ酸配列はこれらの領域において同一性を共有する。「相補的」という用語は、核酸配列に関して使用される場合、参照される領域が１００％相補的であること、すなわち、ミスマッチを伴わずに１００％の塩基対合を示すことを意味する。

構造的におよび機能的に関連するタンパク質間の配列保存の量の変動に起因して、機能または活性（例えば、溶解性または結合性）を保持するために必要な配列同一性の量は、タンパク質、領域およびその領域の機能または活性に依存する。例えば、溶解性ペプチド配列に関しては、複数のＰＮＮＰＮＮＰ配列リピートパターンまたはモチーフが存在し得るが、１つまたは複数の断続的なまたは中断されていないＰＮＮＰＮＮＰ配列リピートパターンまたはモチーフが存在する必要はない。

２つの配列間の同一性の程度は、当技術分野で公知のコンピュータプログラムおよび数学的アルゴリズムを使用して確認することができる。パーセント配列同一性（相同性）を算出するそのようなアルゴリズムでは、一般に、比較する領域にわたって配列ギャップおよびミスマッチを考慮に入れる。例えば、ＢＬＡＳＴ（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）探索アルゴリズム（ＮＣＢＩを通じて公的に入手可能。例えば、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)を参照されたい）は、以下の例示的な検索パラメータを有する：ミスマッチ（Ｍｉｓｍａｔｃｈ）－２；ギャップ開始（ｇａｐｏｐｅｎ）５；ギャップ伸長（ｇａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）２。ポリペプチド配列の比較に関しては、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを、一般には、ＰＡＭ１００、ＰＡＭ２５０、ＢＬＯＳＵＭ６２またはＢＬＯＳＵＭ５０などのスコアリング行列と組み合わせて使用する。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）およびＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムも同一性の程度を定量化するために使用される（Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)；Pearson, Methods Mol Biol. 132: 185 (2000)；およびSmith et al., J. Mol. Biol. 147: 195 (1981)）。Ｄｅｌａｕｎａｙに基づくトポロジーマッピングを使用してタンパク質の構造的な類似性を定量化するためのプログラムも開発されている（Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304: 320 (2003)）。

個々の残基および第１のドメイン、第２のドメインおよび追加的なドメインは、共有結合または非共有結合によって接合し得る。共有結合の非限定的な例は、アミド結合、非天然および非アミド化学結合であり、例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ｎ、Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）が挙げられる。アミド結合の代わりの連結基としては、例えば、ケトメチレン（例えば、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－の代わりに－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ_２－）、アミノメチレン（ＣＨ_２－ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ_２－Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ_２－Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ_４－）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルが挙げられる（例えば、Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. ７, pp 267-357, "Peptide and Backbone Modifications," Marcel Decker, NYを参照されたい）。

第１のドメインと第２のドメインは、互いにすぐ隣で共有結合または非共有結合によって融合または接合していてよい。第１のドメインと第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインの間に位置するヒンジ、スペーサーまたはリンカーなどの介在領域によって隔てられていてよい。一実施形態では、第１のドメインと第２のドメインは炭素鎖によって接合している。多重炭素鎖として、グルタル酸、コハク酸およびアジピン酸などのカルボン酸（例えば、ジカルボン酸）が挙げられる。

別の実施形態では、第１のドメインと第２のドメインは、アミノ酸、第１のドメインと第２のドメインの間に位置するペプチドまたは非ペプチドヒンジ、スペーサーまたはリンカーによって接合している。ペプチドヒンジ、スペーサーまたはリンカー配列は任意の長さであってよいが、一般には、約１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、または４０～５０アミノ酸残基の範囲である。特定の実施形態では、第１のドメインと第２のドメインの間に位置するペプチドヒンジ、スペーサーまたはリンカーは１個から２５個までのＬ－アミノ酸残基もしくはＤ－アミノ酸残基、または１個から６個までのＬ－アミノ酸残基もしくはＤ－アミノ酸残基である。第１のドメインと第２のドメインの間に位置する配列に含まれる特定のアミノ酸残基は、Ｃ、Ａ、ＳまたはＧアミノ酸残基のうちの１つまたは複数を含む。第１のドメインと第２のドメインの間に位置するペプチドの具体的な非限定的な例としては、以下の内部または以下と記載される配列が挙げられる：ＧＳＧＧＳ、ＡＳＡＡＳ、またはＣＣＣＣＣＣ。アミノ酸およびペプチドの誘導体が第１のドメインと第２のドメインの間に位置し得る。アミノ酸誘導体の具体的な非限定的な例は、リシン誘導体、またはα－アミノ－カプロン酸などの６炭素リンカーである。

ヒンジ、スペーサーもしくはリンカー、または第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、などのドメインを有するまたは有さない融合構築物は、天然アミノ酸または合成アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはアミノ酸類似体で完全に構成されるものであり得る、または誘導体化された形態を含み得る。種々の実施形態では、融合構築物は、第１のドメインまたは第２のドメイン内に、１つまたは複数の、Ｌ－アミノ酸が置換されたＤ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸とＬ－アミノ酸の混合、または全体がＤ－アミノ酸残基で構成された配列を含む。

融合構築物は、一般には以下の３つの構造的な基に由来する非天然の構造的な構成要素の任意の組合せを含有し得る：ａ）天然のアミド結合（「ペプチド結合」）連結以外の残基連結基；ｂ）天然に存在するアミノ酸残基の代わりの非天然残基；またはｃ）二次構造模倣を誘導する、すなわち、二次構造、例えば、アルファヘリックスコンフォメーションを誘導するまたは安定化する残基。融合構築物は、分子のアミノ末端とカルボキシ末端の間の末端間のアミド結合、または分子内または分子間ジスルフィド結合（複数可）などの環状構造を含む。融合構築物はｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで修飾され得、例えば、翻訳後修飾として、例えば、糖または炭水化物残基、リン酸基、脂肪酸、脂質などが挙げられる。

付加の特定の例として、第３の、第４の、第５の、第６のまたは第７のドメインが挙げられる。したがって、第１のドメインおよび第２のドメインを有する融合構築物は、共有結合により連結した、別個のまたは相補的な機能または活性を付与する１つまたは複数の追加的なドメイン（第３の、第４の、第５の、第６の、第７のなど）を含む。例示的な追加的なドメインとしては、例えば、固定化された金属に対する精製を可能にする、ポリヒスチジントラクト（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅｔｒａｃｔ）およびヒスチジントリプトファンモジュールなどの金属キレート化ペプチド；固定化された免疫グロブリンに対する精製を可能にするプロテインＡドメイン；およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製系（ＩｍｍｕｎｅｘＣｏｒｐ、ＳｅａｔｔｌｅＷＡ）に利用されるドメインを含めた、単離を容易にするドメインが挙げられる。精製ドメインと融合構築物の間への、第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼなどの切断可能な配列の必要に応じた組み入れを使用して、精製を容易にすることができる。例えば、発現ベクターは、６つのヒスチジン残基、続いてチオレドキシンおよびエンテロキナーゼ切断部位と連結した融合構築物コード核酸配列を含み得る。ヒスチジン残基により融合構築物の検出および精製が容易になると同時に、エンテロキナーゼ切断部位により構築物を残りのタンパク質から精製するための手段がもたらされる（例えば、Kroll、DNA Cell. Biol. 12: 441 (1993)を参照されたい）。

融合構築物の活性は、様々な因子の影響を受ける可能性があり、したがって、融合構築物を、これらの因子の１つまたは複数を考慮に入れることによって設計するまたは最適化することができる。そのような因子としては、例えば、細胞に対する毒性に影響を及ぼし得る、融合構築物の長さが挙げられる。特に、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａおよびＰｈｏｒ２１をＰｈｏｒ１４－βＣＧ－ａｌａと比較した場合に、細胞傷害性の増大が観察された。溶解性ペプチドドメインを形成するアルファヘリックスの細胞死滅活性は、へリックスの安定性にも依存する。ヒンジおよびスペーサーは、第１のドメインの膜相互作用およびペプチド溶解性ドメインのヘリックス構造に影響を及ぼし得る。例えば、必要に応じてスペーサーまたはヒンジを含む、２１アミノ酸未満の構築物などの短い融合構築物は、へリックス安定性の増大に起因して細胞傷害性の増大を示し得る。特に、ＡＳＡＡＳおよび６アミノカプロン酸などのスペーサーにより、短い融合構築物よりも毒性が増大する傾向がある。ドメイン内に存在する特定のアミノ酸残基によって部分的に決定される溶解性ペプチドドメインの電荷も細胞死滅効力に影響を及ぼし得る。

結合性部分の溶解性ドメインに対する位置づけ（Ｎ末端側またはＣ末端側）も融合構築物の細胞死滅活性に影響を及ぼし得る。例えば、溶解性ドメインに対してＣ末端側に位置する結合性部分は、溶解性ドメインに対してＮ末端側に位置するよりも大きな細胞死滅活性を有した。

１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸または誘導体を有する融合構築物ペプチドドメインを構築することにより、融合構築物のｉｎｖｉｖｏ半減期を増大させることができる。例えば、Ｄ－アミノ酸を有する（例えば、全て残基のうち最大３０％またはそれよりも多くがＤ－鏡像異性体である）融合構築物は、血清タンパク質分解に対して抵抗性をもち、したがって、より長い時間にわたって活性であり、それにより、ｉｎｖｉｖｏにおける効力が増大し得る。さらに、１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸または誘導体を有する融合構築物ペプチドドメインを構築することにより、溶血活性を低減させることができる。Ｄ－鏡像異性体を有するそのような融合構築物はまた、溶液中で単量体である－著しく凝集しない傾向も強い。

本発明に従って、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－ＧＳＧＧＳ－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－ＡＳＡＡＳ－βＣＧ－ａｌａ、またはＰｈｏｒ１４－βＣＧ－ａｌａのうちの１つまたは複数よりも、細胞に対する細胞傷害性を実現するために必要な融合構築物の量を表すＩＣ_５０値が低いことによって確認される通り、抗細胞増殖活性が高い、融合構築物が提供される。本発明に従って、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－ＧＳＧＧＳ－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－ＡＳＡＡＳ－βＣＧ－ａｌａ、またはＰｈｏｒ１４－βＣＧ－ａｌａよりも、ＩＣ_５０／ＨＡ_５０（溶血活性）比によって表される溶血活性が低い、融合構築物も提供される。本発明に従って、ＩＣ_５０／ＨＡ_５０（溶血活性）比によって表される溶血活性が約０．０２未満、約０．０１未満、または約０．００５未満である、融合構築物がさらに提供される。細胞に対する細胞傷害性および溶血活性を決定するための代表的なアッセイ条件は実施例１に記載されている。

ペプチドおよびペプチド模倣体を、当技術分野で公知の方法を使用して作製および単離することができる。ペプチドの全部または一部を、当技術分野で公知の化学的方法を使用して合成することができる（例えば、Caruthers (1980). Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215; Horn (1980)；およびBanga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PAを参照されたい）。種々の固相技法を使用してペプチド合成を実施することができ（例えば、Roberge Science 269: 202 (1995)；Merrifield, Methods Enzymol. 289: 3 (1997)を参照されたい）、また、例えば、ＡＢＩ４３１ＡＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を製造者の指示に従って使用して自動合成を実現することができる。ペプチドおよびペプチド模倣体はまた、コンビナトリアル方法体系を使用して合成することもできる。合成残基およびポリペプチドが組み入れられた模倣体を、当技術分野で公知の種々の手順および方法体系を使用して合成することができる（例えば、Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman, et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NYを参照されたい）。修飾されたペプチドを化学修飾方法によって作製することができる（例えば、Belousov, Nucleic Acids Res. 25: 3440 (1997)；Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19: 373 (1995)；およびBlommers, Biochemistry 33: 7886 (1994)を参照されたい。

本発明は、さらに、本発明の融合構築物をコードする核酸および融合構築物をコードする核酸を含むベクターを提供する。特定の実施形態では、核酸は、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡおよびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるペプチド配列を含む、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８残基のアミノ酸配列からなる第１のドメインと、標的化または結合性部分を含むまたはそれからなる第２のドメインとを含む融合構築物をコードする。別の実施形態では、核酸は、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡおよびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるアミノ酸配列からなる第１のドメインと、標的化または結合性部分を含むまたはそれからなる第２のドメインとを含む融合構築物をコードする。さらなる実施形態では、核酸は、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡおよびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫから選択されるアミノ酸配列からなる第１のドメインと、第１のドメインとは別個の１～２５アミノ酸の配列（例えば、標的化または結合性部分）からなる第２のドメインとを含むまたはそれからなる融合構築物をコードする。

核酸は、本明細書では、遺伝子、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、プライマー、オリゴヌクレオチドまたはプローブとも称され得、任意の長さの、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドまたは混合ポリリボ－ポリデオキシリボヌクレオチドおよびそれらのα－アノマー型の、天然のまたは修飾されたプリン含有ポリマーおよびピリミジン含有ポリマーを指す。２つまたはそれよりも多くのプリン含有ポリマーおよびピリミジン含有ポリマーは一般にはリン酸エステル結合またはその類似体によって連結している。これらの用語は、互換的に使用され得、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含めた核酸の全形態を指す。核酸は、一本鎖、二本鎖、または三本鎖、直鎖状または環状であり得る。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびアンチセンスを包含する。ＲＮＡ核酸は、スプライシングされたまたはスプライシングされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはアンチセンスであり得る。核酸は、天然に存在する、合成された、ならびにヌクレオチド類似体および誘導体を包含する。

遺伝暗号の縮重の結果として、核酸は、本発明の融合構築物をコードする配列に関して縮重した配列を含む。したがって、融合構築物をコードする縮重核酸配列が提供される。

核酸は、種々の公知の標準のクローニングおよび化学合成方法のいずれかを使用して作製することができ、当業者に公知の部位特異的突然変異誘発または他の組換え技法によって意図的に変更することができる。ポリヌクレオチドの純度を配列決定、ゲル電気泳動、ＵＶ分光測定によって決定することができる。

核酸を、核酸の発現が「発現制御エレメント」の影響を受けるまたはそれによって調節される、本明細書では「発現カセット」と称される核酸構築物に挿入することができる。「発現制御エレメント」という用語は、それが作動可能に連結した核酸配列の発現を調節するまたは発現に影響を及ぼす１つまたは複数の核酸配列エレメントを指す。発現制御エレメントは、必要に応じて、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、遺伝子サイレンサー、タンパク質をコードする遺伝子の前の開始コドン（例えば、ＡＴＧ）などを含み得る。

核酸配列に作動可能に連結した発現制御エレメントは、核酸配列の転写および必要に応じて翻訳を制御する。「作動可能に連結した」という用語は、参照される構成成分が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係性で近位にあることを指す。一般には、発現制御エレメントは、遺伝子の５’末端または３’末端に並置されるが、イントロンであってもよい。

発現制御エレメントは、転写を構成的に活性化するエレメントを含み、それらのエレメントは、誘導性（すなわち、活性化に外部シグナル必要である）であるか、または抑制解除性（すなわち、転写をオフにするためにシグナルが必要である；シグナルが存在しなくなると、転写が活性化もしくは「抑制解除」される）である。本発明の発現カセットには、特定の細胞型または組織に遺伝子発現制御可能性を付与するために十分な制御エレメント（すなわち、組織特異的制御エレメント）も含まれる。一般には、そのようなエレメントは、コード配列の上流または下流（すなわち、コード配列に対して５’側および３’側）に位置する。プロモーターは、一般に、コード配列に対して５’側に位置する。組換えＤＮＡまたは合成の技法によって作製されたプロモーターを使用して本発明のポリヌクレオチドの転写をもたらすことができる。「プロモーター」とは、転写を方向づけるために十分な最小の配列エレメントを意味する。

宿主細胞における増幅のため、および所望の場合には後に続く遺伝子操作のために、核酸をプラスミドに挿入することができる。プラスミドは、宿主細胞において安定に増幅され得る核酸である；プラスミドは、必要に応じて、核酸の発現を駆動するために、発現制御エレメントを含有し得る。本明細書では、ベクターとプラスミドは同義に使用され、宿主細胞における発現のための発現制御エレメントも含み得る。プラスミドおよびベクターは、一般に、少なくとも、細胞における増幅のための複製開始点、およびプロモーターを含有する。したがって、プラスミドおよびベクターは、例えば、核酸をコードする融合構築物の遺伝子操作、融合構築物またはアンチセンス核酸の作製、ならびに宿主細胞および生物体における融合構築物の発現のために有用である。

細菌系プロモーターとして、Ｔ７および誘導性プロモーター、例えば、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ－ｌａｃハイブリッドプロモーター）およびテトラサイクリン応答性プロモーターなどが挙げられる。昆虫細胞系プロモーターとして、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、エクジソン）が挙げられる。哺乳動物細胞の構成的プロモーターとして、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）および他のウイルスプロモーター、または哺乳動物細胞のゲノムに由来する誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネインＩＩＡプロモーター；熱ショックプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来する誘導性プロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；誘導性マウス乳房腫瘍ウイルス長い末端リピート）が挙げられる。あるいは、適当な宿主細胞に融合構築物を導入し、その発現を方向づけるために、レトロウイルスゲノムを遺伝子改変することができる。

発現系は、ｉｎｖｉｖｏにおける使用のために設計されたベクターをさらに含む。特定の非限定的な例として、アデノウイルスベクター（米国特許第５，７００，４７０号および同第５，７３１，１７２号）、アデノ随伴ベクター（米国特許第５，６０４，０９０号）、単純ヘルペスウイルスベクター（米国特許第５，５０１，９７９号）、レトロウイルスベクター（米国特許第５，６２４，８２０号、同第５，６９３，５０８号および同第５，６７４，７０３号）、ＢＰＶベクター（米国特許第５，７１９，０５４号）およびＣＭＶベクター（米国特許第５，５６１，０６３号）が挙げられる。

酵母ベクターは、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む（例えば、Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ch. 13, ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988；Grant et al. Methods in Enzymology, 153: 516 (1987), eds. Wu & Grossman；Bitter Methods in Enzymology, 152: 673 (1987) , eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y.；およびStrathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (1982) eds. Cold Spring Harbor Press, Vols. I and IIを参照されたい）。ＡＤＨもしくはＬＥＵ２などの構成的酵母プロモーターまたはＧＡＬなどの誘導性プロモーターを使用することができる（R. Rothstein In: DNA Cloning, A Practical Approach, Vol.11, Ch. 3, ed. D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986）。外来核酸配列の酵母染色体への、例えば相同組換えによる組込みを容易にするベクターは当技術分野で公知である。一般には、挿入されるポリヌクレオチドがより伝統的なベクターには大きすぎる（例えば、約１２Ｋｂを超える）場合に酵母人工染色体（ＹＡＣ）が使用される。

発現ベクターは、そのベクターを有する細胞を、成長および増大に関して選択することを可能にする、選択圧力に対する耐性を付与する選択マーカーまたは同定可能なマーカー（例えば、ベータガラクトシダーゼ）も含有し得る。あるいは、選択マーカーは、融合構築物をコードする核酸を含有する第１のベクターと共に宿主細胞に同時トランスフェクトされる第２のベクター上にあってもよい。

選択系としては、これだけに限定されないが、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞またはａｐｒｔ細胞に使用することができる、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Wigler et al., Cell 11: 223 (1977)）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026 (1962)）、およびアデニンホスホリボシル転移酵素遺伝子（Lowy et al., Cell 22: 817 (1980)）が挙げられる。さらに、代謝拮抗薬耐性を、メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527 (1981)）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ遺伝子（Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072 (1981)）；アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を付与するネオマイシン遺伝子（Colberre－Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981)）；ピューロマイシン；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシン遺伝子（Santerre et al., Gene 30: 147 (1984)）に関する選択の基礎として使用することができる。追加的な選択可能な遺伝子として、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047 (1988)）；およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤、２－（ジフルオロメチル）－ＤＬ－オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogue (1987) In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory）が挙げられる。

融合構築物を発現する宿主細胞、ならびに融合構築物をコードする核酸および融合構築物をコードする核酸を含むベクターを用いて形質転換した宿主細胞も提供される。一実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。種々の態様では、真核細胞は酵母細胞または哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、霊長類細胞など）である。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、増幅され得る、転写され得る、または発現される融合構築物をコードし得る核酸が導入される細胞である。この用語は、宿主細胞の任意の後代またはサブクローンも包含する。宿主細胞は、融合構築物を発現する細胞および融合構築物を発現しない細胞を包含する。融合構築物を発現しない宿主細胞は、核酸または融合構築物をコードする核酸もしくはアンチセンスを含むベクターを増幅させるために使用することができる。

宿主細胞としては、これだけに限定されないが、細菌および酵母などの微生物；ならびに植物、昆虫および哺乳動物細胞が挙げられる。例えば、組換えバクテリオファージ核酸、プラスミド核酸またはコスミド核酸発現ベクターを用いて形質転換した細菌；組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換した酵母；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を用いて形質転換した植物細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；および組換えウイルス発現ベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）を感染させた動物細胞系、または一過性もしくは安定な増幅もしくは発現のために工学的に操作した、形質転換した動物細胞系が挙げられる。

融合構築物、融合構築物をコードする核酸、ベクター、ならびに融合構築物を発現するまたは融合構築物をコードする核酸およびアンチセンスを用いて形質転換した宿主細胞は、単離され、精製された形態を包含する。「単離された」という用語は、本発明の組成物の修飾語として使用される場合、組成物が人間の手によって作出されたものである、または、天然に存在するｉｎｖｉｖｏ環境から実質的に完全にまたは少なくとも部分的に分離されたものであることを意味する。一般に、単離された組成物は、天然では通常付随する１つまたは複数の物質、例えば、１つまたは複数のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜を実質的に含まない。「単離された」という用語は、多量体／オリゴマー、バリアント、改変もしくは誘導体化形態、または人間の手によって作製された宿主細胞において発現される形態などの、組成物の代替的な物理的形態を排除しない。「単離された」という用語はまた、組合せが存在し、その中のいずれか１つが人間の手によって作製されたものである形態（例えば、医薬製剤および組合せ組成物）も排除しない。

「単離された」組成物は、天然では一般には付随する物質の一部、実質数、大部分または全てを含まない場合、「精製された」ものでもあり得る。したがって、実質的に純粋でもある単離された融合構築物は、例えば、タンパク質ライブラリーのタンパク質またはゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリーの核酸などの、数百万の他の配列の中で存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含まない。「精製された」組成物を、１種または複数種の他の分子と組み合わせることができる。

本発明に従って、融合構築物および組合せ組成物の混合物が提供される。一実施形態では、混合物は、１つまたは複数の融合構築物および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。別の実施形態では、混合物は、１つまたは複数の融合構築物および抗細胞増殖、抗腫瘍、抗がん、または抗新生物処置または作用剤を含む。さらなる実施形態では、混合物は、１つまたは複数の融合構築物および免疫増強作用剤を含む。例えば、薬学的に許容される担体または賦形剤中の１つまたは複数の融合構築物、抗細胞増殖、抗腫瘍、抗がん、または抗新生物処置または作用剤、および免疫増強処置または作用剤のうちの１つまたは複数などの組合せも提供される。

第１の溶解性ドメインと第２の結合性部分ドメインとを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドなどの本発明の融合構築物を使用して、細胞を溶解、細胞死またはアポトーシスの標的とすることができる。そのような細胞を選択的に標的とすることができる。例えば、受容体、リガンド、抗原または抗体を発現する細胞を融合構築物の標的にし、それにより、受容体、リガンド、抗原または抗体をより少なく発現する細胞と比較して優先的に死滅させることができる。

本発明に従って、細胞の増殖を低減させるまたは阻害する方法、および細胞増殖を低減させるまたは阻害する方法が提供される。一実施形態では、方法は、細胞に、融合構築物を、細胞の増殖を低減させるまたは阻害するために十分な量で接触させることを含む。別の実施形態では、方法は、細胞に、融合構築物を、細胞増殖を低減させるまたは阻害するために十分な量で接触させることを含む。

ある１つの過剰増殖細胞の増殖を低減させるまたは阻害する方法、および複数の過剰増殖細胞の増殖を低減させるまたは阻害する方法も提供される。一実施形態では、方法は、ある１つの過剰増殖細胞または複数の過剰増殖細胞に、融合構築物を、増殖を低減させるまたは阻害するために十分な量で接触させることを含む。

非転移性または転移性新生物細胞、がん細胞、腫瘍細胞および悪性細胞の増殖を低減させるまたは阻害する方法がさらに提供される。一実施形態では、方法は、新生物、がん、腫瘍または悪性細胞に、融合構築物を、細胞の増殖を低減させるまたは阻害するために十分な量で接触させることを含む。

休止状態または分裂していない非転移性または転移性新生物細胞、がん細胞、腫瘍細胞および悪性細胞の増殖を低減させるまたは阻害する方法がさらに提供される。一実施形態では、方法は、休止状態または分裂していない新生物、がん、腫瘍または悪性細胞に、融合構築物を、休止状態または分裂していない細胞の増殖を低減させるまたは阻害するために十分な量で接触させることを含む。

受容体、リガンド、抗体または抗原を発現する細胞（例えば、過剰増殖細胞）の増殖を選択的に低減させるまたは阻害する方法がさらに提供される。一実施形態では、方法は、細胞に、融合構築物を、細胞（例えば、過剰増殖細胞）の増殖を低減させるまたは阻害するために十分な量で接触させることを含み、ここで、ペプチドの結合性部分が、細胞によって発現される受容体、リガンド、抗体または抗原に結合する。ある特定の実施形態では、方法は、本明細書に記載の融合構築物を用いて細胞（例えば、過剰増殖細胞、がん細胞）の増殖を低減させるまたは阻害すること、および、細胞にチェックポイント阻害剤を接触させることを含み、ここで、融合構築物およびチェックポイント阻害剤の量は、細胞（例えば、過剰増殖細胞）の増殖を低減させるまたは阻害するために十分な量である。

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、受容体、リガンド、抗体または抗原を発現する新生物細胞、腫瘍細胞、がん細胞または悪性細胞の増殖を選択的に低減させるまたは阻害することを含む。一実施形態では、方法は、細胞に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、新生物細胞、腫瘍細胞、がん細胞または悪性細胞の増殖を低減させるまたは阻害するために十分な量で接触させることを含み、ここで、融合構築物の結合性部分が、細胞によって発現される受容体、リガンド、抗体または抗原に結合する。

「接触させること」という用語は、２つまたはそれよりも多くの実体の間（例えば、融合構築物と細胞の間）の直接的または間接的な結合または相互作用を意味する。接触させることは、本明細書で使用される場合、溶液中、固相中、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ、細胞中およびｉｎｖｉｖｏを包含する。ｉｎｖｉｖｏで接触させることは、投与すること、または投与と称され得る。

非選択的にまたは選択的に増殖を低減させるまたは阻害する標的とする細胞として、融合構築物の結合性部分が結合する任意の分子を発現する細胞が挙げられる。例示的な細胞としては、受容体（例えば、ホルモン受容体、増殖因子受容体、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体）、リガンド（例えば、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン）または抗体もしくは抗原、またはインテグリンもしくはインテグリン受容体（「ＲＧＤ」配列モチーフを含有するペプチド）、または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に存在する構成成分、例えば、単糖、二糖またはオリゴ糖、シアル酸、ガラクトース、マンノース、フコース、アセチルノイラミン酸、「ＲＧＤ」配列モチーフを含有するペプチドなどを発現する細胞が挙げられる。

標的細胞として、性もしくは性腺ステロイドホルモンまたは性もしくは性腺ステロイドホルモン受容体を発現する細胞が挙げられる。標的細胞として、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ、ヤツメウナギＩＩＩ黄体形成ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモン、絨毛膜ゴナドトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ドーパミン、ソマトスタチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、グルココルチコイド、エストロゲン、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プロゲステロン、アンドロゲン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ビタミンＨ、葉酸またはその誘導体（例えば、葉酸塩）、トランスフェリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、エンドセリン、ボンベシン、成長ホルモン、血管作用性小腸ペプチド、ラクトフェリン、インテグリン（例えば、アルファ－５ベータ３またはアルファ－５ベータ１インテグリン）、神経増殖因子、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ１５４、免疫グロブリン様受容体、ＲＯＲ１、ＩＧＦ－１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インスリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、インスリン、セルロプラスミン、またはＨＩＶ－ｔａｔに結合する受容体を発現する細胞も挙げられる。

標的細胞として、性もしくは性腺ステロイドホルモンまたは性もしくは性腺ステロイドホルモン受容体に結合する受容体を発現する細胞がさらに挙げられる。標的細胞として、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ、ヤツメウナギＩＩＩ黄体形成ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモンベータ鎖、黄体形成ホルモン、絨毛膜ゴナドトロピン、絨毛膜ゴナドトロピンベータサブユニット、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ドーパミン、ソマトスタチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、グルココルチコイド、グルココルチコイド、エストロゲン、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プロゲステロン、アンドロゲン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ビタミンＨ、葉酸またはその誘導体（例えば、葉酸塩）、トランスフェリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、エンドセリン、ボンベシン、成長ホルモン、血管作用性小腸ペプチド、ラクトフェリン、インテグリン（例えば、アルファ－５ベータ３またはアルファ－５ベータ１インテグリン）、神経増殖因子、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ１５４、免疫グロブリン様受容体、ＲＯＲ１、ＩＧＦ－１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インスリン、セルロプラスミン、ＨＩＶ－ｔａｔ、またはその類似体（例えば、ミフェプリストン、フルタミド、リュープロン、ゾラデックス、スプレリン、シナテルトリプトレリン、ブセレリン、セトロレリクス、ガニレリクス、アバレリクス、アンチド、テベレリクスまたはデガレリクス（Ｆｅ２００４８６））に結合する受容体を発現する細胞がさらに挙げられる。

非選択的にまたは選択的に増殖を低減させるまたは阻害する標的とする細胞として、「腫瘍関連抗原」、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＡ１２５（残留上皮性卵巣がん）、可溶性インターロイキン２（ＩＬ－２）受容体、ＲＡＧＥ－１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、メランＡ／ＭＡＲＴ－１、糖タンパク質（ｇｐ）７５、ｇｐ１００、ベータカテニン、ＰＲＡＭＥ、ＭＵＭ－１、ＺＦＰ１６１、ユビキリン－１、ＨＯＸ－Ｂ６、ＹＢ－１、オステオネクチン、およびＩＬＦ３などを発現する細胞がさらに挙げられる。非選択的にまたは選択的に増殖を低減させるまたは阻害する標的とする細胞として、トランスフェリン、葉酸およびその誘導体（例えば、葉酸塩）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーメンバー、例えば、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ（リンホトキシン、ＬＴ）、ＴＲＡＩＬ、Ｆａｓ、ＬＩＧＨＴ、および４１ＢＢなど、ならびにこれらの受容体を発現する細胞がさらに挙げられる。

本発明の融合構築物および方法はまた、望ましくないまたは異所性の細胞増殖および過剰増殖障害を処置するためにも適用可能である。したがって、本発明に従って、望ましくないまたは異所性の細胞増殖および過剰増殖障害を処置する方法が提供される。一実施形態では、方法は、対象（処置を必要とする）に、融合構築物を、望ましくないもしくは異所性の細胞増殖または過剰増殖障害を処置するために十分な量で投与することを含む。

「過剰増殖障害」という用語は、任意の望ましくないまたは異所性の細胞の生存（例えば、プログラム細胞死もしくはアポトーシスを受けないこと）、成長または増殖を指す。そのような障害としては、良性過形成、非転移性および転移性新生物、がん、腫瘍および悪性腫瘍が挙げられる。望ましくないまたは異所性の細胞増殖および過剰増殖障害は、対象の任意の細胞、組織、器官に影響を及ぼすものであり得る。望ましくないまたは異所性の細胞増殖および過剰増殖障害は、対象において、局所的に、局部的にまたは全身的に存在するものであり得る。過剰増殖障害は、これだけに限定されないが、乳房、肺（例えば、小細胞または非小細胞）、甲状腺、頭頸部、脳、上咽頭、のど、鼻もしくは副鼻腔、リンパ系、副腎、下垂体、甲状腺、リンパ液、胃腸（口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸（小腸）、結腸、直腸）、泌尿生殖器（子宮、卵巣、膣、子宮頸部、子宮内膜、卵管、膀胱、精巣、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、肝臓、骨、骨髄、リンパ液、血液、筋肉、皮膚、および幹細胞を含めた多数の組織および器官から生じるものであり得、他の二次的な部位、領域または位置に転移する可能性もあり、転移しない可能性もある。

本発明の融合構築物および方法はまた、あらゆる細胞、器官または組織起源の転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物にも適用可能である。そのような障害は、事実上あらゆる細胞または組織型、例えば、癌腫、肉腫、黒色腫、神経、および網内系または造血性新生物疾患（例えば、骨髄腫、リンパ腫または白血病）に影響を及ぼすものであり得る。

本明細書で使用される場合、「新生物」および「腫瘍」という用語は、正常な対応細胞の成長、増殖または生存よりも成長、増殖または生存が大きい細胞または細胞の集団、例えば、細胞増殖または分化障害を指す。腫瘍は、別個の塊または成長が形成された新生物である。「がん」または「悪性腫瘍」は、近接する空間、組織または器官に浸潤し得る新生物または腫瘍を指す。「転移」は、その主要部位から対象内の１つまたは複数の二次的な部位、位置または領域に播種または拡散した新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍を指し、ここで、二次的な部位、位置または領域は原発腫瘍またはがんとは別個である。

新生物、腫瘍、がんおよび悪性細胞（転移性または非転移性）には、休止状態のまたは残留する新生物、腫瘍、がんおよび悪性細胞が含まれる。そのような細胞は、一般には、分裂しない（Ｇ０－Ｇ１静止）残遺腫瘍細胞からなる。これらの細胞は、主要部位において、または播種性新生物細胞、腫瘍細胞、がん細胞もしくは悪性細胞として微小残存病変として持続し得る。これらの休止状態の新生物細胞、腫瘍細胞、がん細胞または悪性細胞は、無症候性のままであるが、これらの休止状態の細胞が増殖すると、重症の症状および死亡が発生し得る。発明の方法を使用して、休止状態の新生物細胞、腫瘍細胞、がん細胞または悪性細胞の増殖を低減させるまたは阻害することができ、それにより今度は、腫瘍もしくはがんの再発、または腫瘍もしくはがんの転移もしくは増悪を阻害するまたは低減させることができる。

本発明に従って、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物を有する対象を処置する方法が提供される。一実施形態では、方法は、対象（処置を必要とする）に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物を処置する（例えば、増殖を低減させるまたは阻害する）ために十分な量で投与することを含む。

転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物は、任意のステージ、例えば、初期または進行したもの、例えば、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶ腫瘍であってよい。転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物は、以前の処置に供されたことがある、または安定化している（進行していない）もしくは寛解の状態にあるものであってよい。

転移に関して、発明の方法を使用して、原発腫瘍もしくはがんの他の部位への転移、または原発腫瘍もしくはがんから遠位の他の部位における転移性腫瘍もしくはがんの形成もしくは定着を低減させるまたは阻害し、それにより、腫瘍もしくはがんの再発または腫瘍もしくはがんの増悪を阻害するまたは低減させることができる。したがって、本発明の方法は、とりわけ、１）転移が潜在的に発生するまたは転移が発生する腫瘍またはがん細胞（例えば、播種性腫瘍細胞、ＤＴＣ）の成長、増殖、移動性または侵襲性を低減させるまたは阻害すること；２）原発腫瘍またはがんから生じる、原発腫瘍またはがんとは別個の１つまたは複数の他の部位、位置または領域への転移の形成または定着を低減させるまたは阻害すること；３）転移が形成されたまたは定着した後の、原発腫瘍またはがんとは別個の１つまたは複数の他の部位、位置または領域における転移の成長または増殖を低減させるまたは阻害すること；および４）転移が形成されたまたは定着した後の追加的な転移の形成または定着を低減させるまたは阻害すること、を含む。

転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物の細胞は、凝集して「固形」細胞塊になったものまたは分散もしくは散在したものであり得る。「固形」腫瘍は、一般には凝集し合わさって塊を形成しているがん、新生物または転移を指す。具体的な非限定的な例としては、黒色腫、乳がん、膵がん、子宮がんおよび卵巣がん、セミノーマを含めた精巣がん、胃がんまたは結腸がん、ヘパトーマ、副腎癌、腎癌および膀胱癌、肺がん、頭頸部がんおよび脳腫瘍／がんなどの内臓腫瘍が挙げられる。

癌腫は、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍を指し、呼吸器系癌、胃腸系癌、泌尿生殖器系癌、精巣癌、乳癌、前立腺癌、内分泌系癌、および黒色腫を包含する。例示的な癌腫としては、子宮、子宮頸部、肺、前立腺、乳房、頭頸部、結腸、膵臓、精巣、副腎、腎臓、食道、胃、肝臓および卵巣から形成されるものが挙げられる。この用語は、癌肉腫も含み、例えば、癌性および肉腫様組織で構成される悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔｔｕｍｏｒ）を含む。腺癌には腺組織の癌腫が含まれる、または腺癌では腫瘍が腺様構造を形成する。

肉腫は、間葉細胞起源の悪性腫瘍（ｍａｌｉｇｎａｎｔｔｕｍｏｒ）を指す。例示的な肉腫としては、例えば、リンパ肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫および線維肉腫が挙げられる。

神経新生物としては、神経膠腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫および乏突起膠細胞腫が挙げられる。

「液性腫瘍」は、一般には固形塊を形成しないので天然に分散または散在している新生物を指す。特定の例としては、網内系または造血系の新生物、例えば、リンパ腫、骨髄腫および白血病などが挙げられる。白血病の非限定的な例としては、急性および慢性のリンパ芽球性骨髄腫、骨髄芽球性骨髄腫および多発性骨髄腫が挙げられる。一般には、そのような疾患は、低分化型の急性白血病、例えば、赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から生じる。具体的な骨髄障害としては、これだけに限定されないが、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が挙げられる。リンパ系腫瘍としては、これだけに限定されないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）が挙げられ、これには、Ｂ系列ＡＬＬおよびＴ系列ＡＬＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）およびワルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が含まれる。具体的な悪性リンパ腫としては、非ホジキンリンパ腫およびバリアント、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病およびリード・シュテルンベルク病が挙げられる。

本明細書に開示される通り、望ましくないもしくは異所性の細胞増殖または過剰増殖障害は、子宮、乳房、膣、子宮頸部および卵管において生じ得る。子宮内膜症は、子宮の細胞が子宮外に成長して卵巣、膀胱または腸などの他の領域に入った場合に生じる。類線維およびポリープは子宮、乳房、膣、子宮頸部および卵管に影響を及ぼし得る。

したがって、本発明に従って、子宮内膜症および類線維またはポリープを処置する方法が提供される。一実施形態では、方法は、対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、子宮内膜症を処置するために十分な量で投与することを含む。別の実施形態では、方法は、対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、類線維またはポリープを処置するために十分な量で投与することを含む。

標的細胞として、繁殖または生殖能力に関与するまたはそのために必要な細胞が挙げられる。したがって、本発明に従って、動物の生殖能力を低減させる方法が提供される。一実施形態では、方法は、対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、生殖能力を低減させるまたは妊娠の可能性を低減させるまたは雄哺乳動物における精子産生を低減させるために十分な量で投与することを含む。

同じく本明細書に開示される通り、望ましくないもしくは異所性の細胞増殖または過剰増殖障害は前立腺において生じ得る。したがって、本発明に従って、良性前立腺肥大症または転移性前立腺新生物を処置する方法が提供される。一実施形態では、方法は、対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、良性前立腺肥大症または転移性前立腺新生物を処置するために十分な量で投与することを含む。

抗細胞増殖活性または効果がある任意の組成物、処置、プロトコール、治療またはレジメンを融合構築物と組み合わせることができるまたは本発明の方法において組み合わせて使用することができる。したがって、本発明の融合構築物および方法は、抗増殖、抗腫瘍、抗がん、抗新生物および抗転移処置、プロトコールおよび治療を含み、腫瘍、がん、悪性もしくは新生成長、増悪、転移、増殖もしくは生存、または悪化などの過剰増殖障害をｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏにおいて阻害する、減少させる、遅らせる、緩徐化する、低減させるまたは防止する任意の他の組成物、処置、プロトコールまたは治療レジメンを含む。抗増殖（例えば、腫瘍）治療の特定の非限定的な例としては、化学療法、免疫療法、放射線療法（電離または化学）、局所温熱療法（ハイパーサミア）、外科的切除およびワクチン接種が挙げられる。融合構築物は、抗細胞増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗がん、抗転移または免疫増強処置または治療の施行前、それと実質的に同時発生的に、またはその後に投与することができる。一部の実施形態では、融合構築物を、チェックポイント阻害剤の投与前、それと実質的に同時発生的に、またはその後に投与する。融合構築物を、抗細胞増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗がん、抗転移または免疫増強処置または治療を含む組合せ組成物として投与することができる。融合構築物を、チェックポイント阻害剤を含む組合せ組成物として投与することができる。

抗増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗がんおよび抗転移組成物、治療、プロトコールまたは処置としては、細胞周期進行もしくは細胞増殖を防止する、妨害する、中断する、阻害するもしくは遅延させる；アポトーシスもしくは細胞死を刺激するもしくは増強する、核酸もしくはタンパク質合成もしくは代謝を阻害する、細胞分裂を阻害する、または、細胞生存、もしくは必要な細胞生存因子、増殖因子もしくはシグナル伝達経路（細胞外もしくは細胞内）の産生もしくは利用を減少させる、低減させるもしくは阻害するものが挙げられる。抗細胞増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗がんおよび抗転移活性を有する化学薬剤クラスの非限定的な例としては、アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物抽出物、植物アルカロイド、ニトロソ尿素、ホルモン、ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体が挙げられる。抗細胞増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗がんおよび抗転移活性を有する薬物の特定の例としては、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、プレドニゾロン、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、ブスルファン、メトトレキセート、６－メルカプトプリン、チオグアニン、５－フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ＡＺＴ、５－アザシチジン（５－ＡＺＣ）および５－アザシチジン関連化合物、例えば、デシタビン（５－アザ－２'デオキシシチジン）、シタラビン、１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシル－５－アザシトシンおよびジヒドロ－５－アザシチジンなど、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、ヒドロキシウレア、シスプラチン、ミトタン、プロカルバジン、ダカルバジン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシンおよびジブロモマンニトールなどが挙げられる。

融合構築物および方法と共に適用可能な追加的な作用剤は当技術分野で公知であり、それらを使用することができる。例えば、抗体、細胞増殖因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカインおよびケモカインなどの生物学的製剤を投与することができる。モノクローナル抗体の非限定的な例としては、とりわけ、本発明による融合構築物と組み合わせて使用することができる、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）、イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ）などが挙げられる。融合構築物と共に使用するために適用可能な他のターゲティングされる薬物は、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、ボルテゾミブ（bortzomib）（Ｖｅｌｃａｄｅ）、ラパチニブ（タイケルブ（Ｔｙｋｅｒｂ））、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、ソラフェニブ（Ｎｅｖａｘａｒ）、ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ）などである。細胞増殖因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカインおよびケモカインの非限定的な例としては、ＩＬ－２、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、ＴＮＦβ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ－１、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、ＭＣＰ－４、エオタキシン、エオタキシン－２、Ｉ－３０９／ＴＣＡ３、ＡＴＡＣ、ＨＣＣ－１、ＨＣＣ－２、ＨＣＣ－３、ＬＡＲＣ／ＭＩＰ－３α、ＰＡＲＣ、ＴＡＲＣ、ＣＫβ、ＣＫβ６、ＣＫβ７、ＣＫβ８、ＣＫβ９、ＣＫβ１１、ＣＫβ１２、Ｃ１０、ＩＬ－８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＥＮＡ－７８、ＧＣＰ－２、ＰＢＰ／ＣＴＡＰＩＩＩβ－ＴＧ／ＮＡＰ－２、Ｍｉｇ、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ－１およびリンホタクチンが挙げられる。

追加的な非限定的な例としては、細胞に基づく治療を含む、免疫増強処置および治療が挙げられる。特に、免疫増強処置および治療は、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞を投与することを含む。

転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物を処置する方法、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物を有するまたは有するリスクがあることに起因して処置を必要とする対象を処置する方法、および抗増殖、抗腫瘍、抗がん、抗新生物または抗悪性腫瘍治療の効果を増大させる、または改善する方法が提供される。それぞれの実施形態において、方法は、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物を有するまたはそのリスクがある対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物を処置するために十分な量で投与すること；対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、対象を処置するために十分な量で投与すること；ならびに、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物治療を受けているまたは受けたことがある対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、抗増殖、抗腫瘍、抗がん、抗新生物または抗悪性腫瘍治療の効果を増大させるために十分な量で投与すること、を含む。

一部の実施形態では、融合構築物を対象にチェックポイント阻害剤の投与前に、それと同時にまたはその後に投与する。

チェックポイントは、刺激されると、がんに対する免疫応答または炎症反応を、耐容性を促進することによって、またはＴ細胞炎症活性を抑制することによって弱め得るまたは阻害し得る、免疫系の重要な調節因子である。公知のチェックポイント受容体としては、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ－４）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１６４１０を参照されたい）ならびにＰＣＤ１およびＣＤ２７９としても公知のプログラム細胞死１（ＰＤ－１）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ１５１１６を参照されたい）が挙げられ、これらはどちらも、細胞傷害性Ｔ細胞上に発現される。プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１、ＣＤ２７４とも称される；例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫ：Ｑ９ＮＺＱ７を参照されたい）は、ＰＤ－１に結合するチェックポイントリガンドである。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質）、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶドメイン免疫グロブリン（Ｉｇ）含有抑制因子）、ＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）、ＬＡＧ－３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有タンパク質３）、ＩＤＯ（インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ）、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４／ＯＸ４０受容体）、または抗ＮＫＧ２Ａ（例えば、モナリズマブ）の阻害剤である。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、低分子化合物阻害剤である。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。

一部のがんは、免疫チェックポイント受容体を刺激することによって免疫系を回避する。チェックポイント阻害剤治療は、阻害性チェックポイントを遮断し、それにより、Ｔ細胞の免疫系機能および抗がん活性を回復させようとするものである。

適切なチェックポイント阻害剤を本明細書に記載の方法に使用することができる。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、融合タンパク質または他の生物学的製剤である。一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、低分子化合物を含む。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、チェックポイント受容体を通じたシグナルトランスダクションを阻害する、遮断する、好転させる、または抑制する抗体または化合物である。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４とその同類のリガンドのうちの１つの結合を阻害する、遮断する、好転させる、または抑制する抗体または化合物であり、その非限定的な例としては、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）およびＢ７関連タンパク質（ＩＣＯＳリガンド、ＣＤ２７５）が挙げられる。ある特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１とその同類のリガンドのうちの１つの結合を阻害する、遮断する、好転させる、または抑制する抗体または化合物であり、その非限定的な例としては、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２が挙げられる。

一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１のアンタゴニスト、ＰＤ－１のアンタゴニストまたはＣＴＬＡ－４のアンタゴニストである。一部の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１のアンタゴニストは、ＰＤ－Ｌ１に結合し、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の結合を阻害する、および／またはＰＤ－Ｌ１のその受容体であるＰＤ－１を通じたシグナル伝達を阻害する、抗体である。一部の実施形態では、ＰＤ－１のアンタゴニストは、ＰＤ－１に結合し、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の結合を阻害する、および／またはＰＤ－１によるシグナル伝達を阻害する、抗体である。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ－４のアンタゴニストは、ＣＴＬＡ－４に結合し、ＣＤ８０および／もしくはＣＤ８６とＣＴＬＡ－４の結合を阻害する、ならびに／またはＣＴＬＡ－４によるシグナル伝達を阻害する、抗体である。本明細書に記載の方法のために使用することができるチェックポイント阻害剤の非限定的な例としては、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、ニボルマブおよびペムブロリズマブが挙げられる。

本発明の方法は、望ましくないもしくは異所性の細胞増殖または過剰増殖障害、疾患または状態が存在し始めたエビデンス（例えば、１つまたは複数の症状）の前に（すなわち、予防法）、それと同時にまたはその後に実施することができる。融合構築物を望ましくないもしくは異所性の細胞増殖または過剰増殖障害のある１つの症状が発症する前に、それと同時にまたはその直後に投与することにより、対象における望ましくないもしくは異所性の細胞増殖または過剰増殖障害、疾患または状態の１つまたは複数の症状の出現、頻度、重症度、増悪、または持続時間を減少させることができる。さらに、融合構築物を望ましくないもしくは異所性の細胞増殖または過剰増殖障害、疾患または状態の１つまたは複数の症状が発症する前に、それと同時にまたはその直後に投与することにより、対象内の他の部位、領域、組織もしくは器官への過剰増殖細胞の拡散または播種（例えば、転移）、または対象内の他の部位、領域、組織もしくは器官への過剰増殖細胞の定着（例えば、転移）を阻害する、減少させるまたは防止することができる。

本発明の融合構築物および方法、例えば処置方法により、検出可能なまたは測定可能な治療的利益または改善を対象にもたらすことができる。治療的利益または改善は、対象に対する任意の測定可能なもしくは検出可能な、客観的もしくは主観的な、一過性の、一時的な、もしくはより長い期間にわたる利益、または、対象の組織、器官、細胞もしくは細胞集団における状態、障害もしくは疾患、有害な症状、必然的結果もしくは根本原因の程度を問わない改善である。治療的利益および改善としては、これだけに限定されないが、障害、疾患もしくは状態に付随する１つもしくは複数の症状もしくは合併症、または障害、疾患もしくは状態の根本原因もしくは結果として生じる影響の出現、頻度、重症度、増悪、または持続時間を低減または減少させることが挙げられる。したがって、本発明の融合構築物および方法は、対象に治療的利益または改善をもたらすことを含む。

治療的利益または改善が所望のアウトカムである本発明の方法では、本発明の融合構築物を、十分なまたは有効な量で、それを必要とする対象に投与することができる。「十分な量」または「有効な量」とは、単回投薬または複数回投薬で、単独でまたは１種もしくは複数種の他の組成物（化学療法薬または免疫賦活薬などの治療剤）、処置、プロトコール、もしくは治療レジメン作用剤との組合せで、対象における任意の持続時間（長期または短期）の検出可能な応答、対象における所望のアウトカムまたは対象に対する任意の測定可能なまたは検出可能な程度のもしくは任意の持続時間にわたる（例えば、数時間、数日間、数カ月間、数年間、または治癒）利益をもたらす量を指す。処置（例えば、治療的利益または改善をもたらすための）に関する「十分な量」または「有効な量」の用量は、一般には、障害、疾患もしくは状態、または障害、疾患もしくは状態の１つ、複数もしくは全ての有害な症状、必然的結果もしくは合併症を、測定可能な程度まで好転させるために効果的な量であるが、障害、疾患もしくは状態または症状の増悪または悪化を低減させるまたは阻害することも十分なアウトカムとみなされる。

「好転させる」という用語は、対象の状態の検出可能な客観的または主観的な改善を意味する。検出可能な改善としては、障害、疾患もしくは状態によって引き起こされるもしくはそれに付随する症状の出現、頻度、重症度、増悪、もしくは持続時間の主観的もしくは客観的な低減、障害、疾患もしくは状態の根本原因もしくは必然的結果の改善、または障害、疾患もしくは状態の逆転が挙げられる。

したがって、処置により、障害、疾患もしくは状態、もしくは付随する症状もしくは必然的結果、もしくは根本原因の阻害、低減もしくは防止；障害、疾患、状態、症状もしくは必然的結果、もしくは根本原因の増悪もしくは悪化の阻害、低減もしくは防止；または障害、疾患、状態、もしくは症状のさらなる悪変もしくは１つもしくは複数の追加的な症状の出現がもたらされ得る。したがって、上首尾の処置アウトカムは、対象における「治療効果」もしくは「利益」、または状態、障害、疾患もしくは症状の１つもしくは複数の症状もしくは根本原因もしくは必然的結果の出現、頻度、重症度、増悪、もしくは持続時間の阻害、低減もしくは防止を導くものである。したがって、状態、障害、疾患または症状の１つまたは複数の根本原因に影響を及ぼす処置方法が有益であると考えられる。障害もしくは状態を安定化することまたは障害もしくは状態の増悪もしくは悪化を阻害することも上首尾の処置アウトカムである。

したがって、治療的利益または改善は、状態、障害または疾患に付随する症状、合併症、必然的結果または根本原因の任意の１つ、大多数または全ての完全な消失を必要とするものではない。したがって、対象の状態の増分の改善、または出現、頻度、重症度、増悪、もしくは持続時間の部分的な低減、または１つもしくは複数の付随する有害な症状もしくは合併症もしくは必然的結果もしくは根本原因、障害もしくは疾患の生理的、生化学的もしくは細胞的顕在化もしくは特徴のうちの１つもしくは複数の悪化もしくは増悪の阻害もしくは逆転（例えば、状態、障害もしくは疾患の１つもしくは複数の症状もしくは合併症の安定化）が短いまたは長い持続時間（数時間、数日間、数週間、数カ月間など）にわたって存在する場合、十分なエンドポイントが実現される。

特定の実施形態では、処置する方法により、転移性もしくは非転移性腫瘍、がん、悪性もしくは新生細胞の質量、体積、サイズもしくは細胞数の部分的なもしくは完全な破壊がもたらされる；転移性もしくは非転移性腫瘍、がん、悪性もしくは新生細胞の壊死、溶解もしくはアポトーシスの刺激、誘導もしくは増大がもたらされる；転移性もしくは非転移性腫瘍、がん、悪性もしくは新生物の体積、サイズ、細胞質量の低減がもたらされる；転移性もしくは非転移性腫瘍、がん、悪性もしくは新生物の体積、質量、サイズもしくは細胞数の増悪もしくは増大の阻害もしくは防止がもたらされる；対象内の他の（二次的な）部位、領域、組織もしくは器官への過剰増殖細胞（例えば、転移）の拡散もしくは播種の阻害もしくは減少、もしくは対象内の他の（二次的な）部位、領域、組織もしくは器官における過剰増殖細胞（例えば、転移）の定着がもたらされる；または対象の寿命の延長がもたらされる。追加的な特定の実施形態では、処置する方法により、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物に付随するまたはそれによって引き起こされる有害な症状または合併症の重症度、持続時間または頻度の軽減または減少がもたらされる。

十分な量または有効な量は、単回投与で提供することができるが、そうする必要はなく、また、単独でまたは別の組成物（例えば、化学療法剤または免疫増強剤もしくは賦活剤）、処置、プロトコールまたは治療レジメンと組み合わせて投与することができるが、そうする必要はない。例えば、対象に対する必要性、処置される障害、疾患もしくは状態の状態または処置の副作用によって示される通り、量を比例して増加させることができる。さらに、十分な量または有効な量は、単回投薬または複数回投薬で第２の組成物（例えば、化学療法剤または免疫賦活剤）、処置、プロトコールまたは治療レジメンを伴わずに与薬される場合には、所与の対象において効果的または十分であるとみなされるように、そのような用量に加えて追加的な用量、量もしくは持続時間、または追加的な組成物（例えば、化学療法剤もしくは免疫賦活剤）、処置、プロトコールもしくは治療レジメンを含めることができるので、十分または効果的である必要はない。十分であるとみなされる量には、別の処置、治療レジメンまたはプロトコールの使用の低減をもたらす量も含まれる。

十分な量または有効な量は、予防的または治療的に処置される対象みなそれぞれにおいて効果的である必要もなく、所与の群または集団内の処置される対象の大半において効果的である必要もない。処置または治療方法について典型的である通り、一部の対象が所与の処置、治療レジメンまたはプロトコールに対してより大きなまたはより小さな応答を示す。十分な量または有効な量は、群または母集団ではなく特定の対象における充足または効果を指す。そのような量は、望ましくないもしくは異所性の細胞増殖または過剰増殖障害（例えば、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物）の型またはステージなどの、処置される状態、所望の治療効果、ならびに個々の対象（例えば、対象内での生物学的利用能、性別、年齢など）に一部依存する。

過剰増殖障害（例えば、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物）などの望ましくないまたは異所性の細胞増殖に対する治療的利益または改善の特定の非限定的な例としては、細胞のサイズ、質量または体積の低減、細胞のサイズ、質量または体積の増大の阻害、悪化または増悪の緩徐化または阻害、細胞の壊死、溶解またはアポトーシスの刺激、新生物または腫瘍の悪性度または転移の低減または阻害、死亡率の低下、および対象の寿命の延長が挙げられる。したがって、細胞のサイズ、質量、体積の増大の阻害または遅延または転移の阻害または遅延（安定化）により、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物の完全な消失が生じていないにもかかわらず、たとえ数日間、数週間、または数カ月間だけであっても、寿命が増大し得る（死亡率が低下し得る）。低減または減少させることができる過剰増殖障害（例えば、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物）に付随する有害な症状および合併症としては、例えば、疼痛、悪心、不快感、食欲不振、嗜眠および衰弱が挙げられる。したがって、過剰増殖障害（例えば、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物）などの望ましくないまたは異所性の細胞増殖の症状の出現、頻度、重症度、増悪、または持続時間の低減、例えば、主観的感覚の改善（例えば、エネルギーの増大、食欲、悪心の低減、移動性の改善または心理学的ウェルビーイングなど）は、全て治療的利益または改善の例である。

例えば、融合構築物の十分なまたは有効な量は、投与した場合に、過剰増殖障害（例えば、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物）などの望ましくないまたは異所性の細胞増殖を処置するために必要な化学療法薬、放射線または免疫療法の減少をもたらす治療効果を有するものとみなされる。

「対象」という用語は、動物、一般には哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、マカク）、飼育動物（イヌおよびネコ）、家畜（ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）および実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）を指す。対象は、融合構築物をｉｎｖｉｖｏで分析するための動物疾患モデル、例えば、過剰増殖障害（例えば、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物）などの望ましくないまたは異所性の細胞増殖の動物モデルを包含する。

処置に適した対象としては、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性または新生細胞を有するまたは有するリスクがある対象、抗増殖（例えば、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物）治療を受ける、ならびに、腫瘍が寛解の状態にある対象を含めた、当該治療を受けているまたは受けたことがある対象が挙げられる。「リスクがある」対象は、一般には、望ましくないまたは異所性の細胞増殖、過形成（例えば、腫瘍）の発生に関連する危険因子を有する。

リスクがあるまたは候補対象の特定の例としては、融合構築物が結合し得る受容体、リガンド、抗原または抗体を発現する細胞を有する対象であって、特に、壊死、溶解、死滅または破壊の標的とされる細胞が非標的細胞よりも多数または多量の受容体、リガンド、抗原または抗体を発現する、対象が挙げられる。そのような細胞を選択的にまたは優先的に壊死、溶解または死滅の標的とすることができる。

リスクがある対象には、外科的切除、化学療法、免疫療法、電離または化学放射線療法、局所もしくは局部温熱療法（ハイパーサミア）、またはワクチン接種の候補である対象および受けたことがある対象も含まれる。したがって、本発明は、例えば、安定または寛解の期間後の転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物の再出現または再成長に起因して、転移性もしくは非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍もしくは新生物、または転移性もしくは非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍もしくは新生物に付随する合併症のリスクがある対象の処置に適用可能である。

危険因子としては、性別、生活様式（食事、喫煙）、職業（医学および臨床職員、農業および畜産従事者）、環境因子（発がん物質への曝露）、家族歴（自己免疫障害、糖尿病など）、遺伝的素因などが挙げられる。例えば、黒色腫が発生するリスクがある対象としては、過剰な日光曝露（紫外線放射）、白い肌、多数の母斑（形成異常母斑）、患者の表現型、家族歴、または以前の黒色腫歴が挙げられる。したがって、がんが発生するリスクがある対象を、生活様式、職業、環境因子、家族歴、および腫瘍関連遺伝子、遺伝子欠失または遺伝子突然変異についての遺伝学的スクリーニングによって同定することができる。例えば、乳がんが発生するリスクがある対象はＢｒｃａ１を欠く。結腸がんが発生するリスクがある対象は、低年齢または高頻度のポリープ形成、または腫瘍抑制因子遺伝子の欠失もしくは突然変異、例えば、大腸腺腫症（ＡＰＣ）を有する。

他の処置から除外された対象も、対象に含まれる。例えば、ある特定の対象は、外科的切除、化学療法、免疫療法、電離または化学放射線療法、局所もしくは局部温熱療法（ハイパーサミア）、またはワクチン接種に関しては良い候補でない可能性がある。したがって、本発明による処置の候補対象には、外科的切除、化学療法、免疫療法、電離または化学放射線療法、局所もしくは局部温熱療法（ハイパーサミア）、またはワクチン接種の候補ではない対象が含まれる。

融合構築物は、単位用量または単位剤形として製剤化することができる。特定の実施形態では、融合構築物は、望ましくないもしくは異所性の細胞増殖または過剰増殖障害を有する対象を処置するために有効な量のものである。追加的な特定の実施形態では、融合構築物は、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物を有する対象を処置するために有効な量のものである。さらなる特定の実施形態では、融合構築物は、対象の生殖能力を低減させるために有効な量のものである。例示的な単位用量は、約２５～２５０ｎｇ、２５０～５００ｎｇ、５００～１０００ｎｇ、１０００～２５００ｎｇまたは２５００～５０００ｎｇ、５０００～２５，０００ｎｇ、５０００～５０，０００ｎｇ；および約２５～２５０μｇ、２５０～５００μｇ、５００～１０００μｇ、１０００～２５００μｇまたは２５００～５０００μｇ、５０００～２５，０００μｇ、５０００～５０，０００μｇにわたる。

本明細書に記載の方法に関して、適切な治療有効量のチェックポイント阻害剤を細胞と接触させること、または対象もしくは動物に投与することができる。チェックポイント阻害剤の適切な治療有効量の非限定的な例としては、抗体または生物学的製剤については０．１ｎｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、および低分子化合物については０．０１ｐｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、およびこれらの中間の範囲が挙げられる。本発明の方法のために使用される組成物は、一部の実施形態では、チェックポイント阻害剤を含む。一部の実施形態では、組成物は融合構築物を含む。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の融合構築物および適切なチェックポイント阻害剤を含む。

本発明の組成物および方法は、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｖｏで接触させるまたは提供することができる。組成物を、意図された効果がもたらされるように、単回または複数回の投薬量で、例えば、効果的または十分な量で投与することができる。例示的な用量は、毎日連続して、または１日おきに、または断続的に、約２５～２５０ｐｇ／ｋｇ、２５０～５００ｐｇ／ｋｇ、５００～１０００ｐｇ／ｋｇ、１０００～２５００または２５００～５０００ｐｇ／ｋｇ、５０００～２５，０００ｐｇ／ｋｇ、５０００～５０，０００ｐｇ／ｋｇ；約５０～５００ｎｇ／ｋｇ、５００～５０００ｎｇ／ｋｇ、５０００～２５，０００ｎｇ／ｋｇまたは２５，０００～５０，０００ｎｇ／ｋｇ；および約２５～２５０μｇ／ｋｇ、２５０～５００μｇ／ｋｇ、５００～１０００μｇ／ｋｇ、１０００～２５００μｇ／ｋｇまたは２５００～５０００μｇ／ｋｇ、５０００～２５，０００μｇ／ｋｇ、５０００～５０，０００μｇ／ｋｇにわたる。単回投薬または複数回投薬を毎日連続して、１日おきにまたは断続的に施行することができる。

任意の経路によって、全身、局部的または局所投与により、組成物を投与することができ、方法を実施することができる。例えば、融合構築物を全身的に、局部的にまたは局所的に、静脈内に、経口的に（例えば、経口摂取または吸入）、筋肉内に、腹腔内に、皮内に、皮下に、腔内に、頭蓋内に、経皮的に（外用）、非経口的に、例えば、経粘膜的にまたは直腸に投与することができる。医薬製剤を含む本発明の組成物および方法を、（マイクロ）カプセル封入された送達系を介してまたは投与用の埋込物にパッケージングして投与することができる。

一部の実施形態では、融合構築物および／またはチェックポイント阻害剤を医薬組成物中に含める。医薬組成物とは、「薬学的に許容される」および「生理的に許容される」担体、希釈剤または賦形剤を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」および「生理的に許容される」という用語は、担体、希釈剤または賦形剤について言及する場合、医薬投与および製剤の他の構成成分に適合性の溶媒（水性または非水性）、界面活性剤、溶液、乳剤、分散媒、コーティング、等張性および吸収促進または遅延剤を包含する。そのような製剤は、錠剤（コーティングされたまたはコーティングされていない）、カプセル剤（硬または軟）、マイクロビーズ、乳剤、散剤、顆粒剤、結晶、懸濁剤、シロップ剤またはエリキシル剤に含有され得る。

医薬組成物は、特定の投与経路に適合性になるように製剤化することができる。非経口、皮内、または皮下投与用の組成物は、水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤を含み得る。調製物は、微生物成長を防止するための１種または複数種の保存剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸、クエン酸またはリン酸などの緩衝剤、および、塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの、張度を調整するための作用剤）を含有し得る。

注射用の医薬組成物は、滅菌注射液または分散を即時調製するための滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散および滅菌散剤を含む。静脈内投与に関しては、適切な担体として、生理的食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコール）、ならびに適切なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、または界面活性物質を使用することによって、流動性を維持することができる。抗細菌剤および抗真菌剤としては、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールが挙げられる。吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることにより、注射用組成物の吸収を引き延ばすことができる。

追加的な医薬製剤および送達系が当技術分野で公知であり、本発明の方法に適用可能である（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA；The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ；Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993)；およびPoznansky, et al., Drug Delivery Systems, R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. (1980), pp. 253-315を参照されたい）。

本発明は、適切な包装材料で包装された、本明細書に記載の融合構築物、組合せ組成物（例えば、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を含む）ならびにそれらの医薬製剤を含むキットを提供する。キットは、必要に応じて、構成成分の説明または中に含まれる構成成分のｉｎｖｉｔｒｏ、ｉｎｖｉｖｏ、またはｅｘｖｉｖｏにおける使用に関する指示を含むラベルまたは包装への差し込みを含む。例示的な指示としては、細胞の増殖の低減もしくは阻害、過剰増殖細胞などの望ましくないもしくは異所性の細胞の増殖の低減もしくは阻害、転移性もしくは非転移性腫瘍、がん、悪性もしくは新生細胞の増殖の低減もしくは阻害、過剰増殖障害を有する対象の処置、転移性もしくは非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍もしくは新生物を有する対象の処置、または動物の生殖能力の低減に関する指示が挙げられる。

キットは、そのような構成成分の集合、例えば、２つまたはそれよりも多くの融合構築物を、単独で、または別の治療的に有用な組成物（例えば、抗増殖または免疫増強薬）と組み合わせて含有し得る。

「包装材料」という用語は、キットの構成成分が収納される物理的構造を指す。包装材料は、構成成分を滅菌された状態で維持することができるものであり、そのような目的のために一般に使用される材料（例えば、紙、波形繊維、ガラス、プラスチック、箔、アンプル、バイアル、管など）製であってよい。

本発明のキットは、ラベルまたは差し込みを含み得る。ラベルまたは差し込みは、例えば、紙もしくはボール紙の、または構成成分、キットもしくは充填材料（例えば、箱）に別途もしくは添付された、またはキット構成成分を含有するアンプル、管もしくはバイアルに貼付された、「印刷物」を含む。ラベルまたは差し込みは、コンピュータ可読媒体、例えば、ディスク（例えば、フロッピー（登録商標）ディスケット、ハードディスク、ＺＩＰディスク）、光ディスク、例えばＣＤ－ＲＯＭ／ＲＡＭまたはＤＶＤ－ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ、または電気的記憶媒体、例えばＲＡＭおよびＲＯＭ、またはこれらのハイブリッド、例えば磁気／光学記憶媒体、ＦＬＡＳＨ（登録商標）媒体またはメモリ型カードをさらに含み得る。

ラベルまたは差し込みは、中に入っている１つまたは複数の構成成分の識別情報、投与量、作用機序、薬物動態学的性質および薬力学的性質を含めた活性成分（複数可）の臨床的な薬理学的性質を含み得る。ラベルまたは差し込みは、製造者情報、ロット番号、製造者の所在地および日付を識別する情報を含み得る。

ラベルまたは差し込みは、キット構成成分を使用することができる状態、障害、疾患または症状に関する情報を含み得る。ラベルまたは差し込みは、方法、処置プロトコールまたは治療レジメンにおけるキット構成成分の１つまたは複数の使用に関する臨床医または対象に対する指示を含み得る。指示は、投薬量、頻度または持続時間、および本明細書に記載の方法、処置プロトコールまたは治療レジームのいずれかの実施に関する指示を含み得る。例示的な指示としては、望ましくないまたは異所性の細胞増殖、過剰増殖細胞および障害（例えば、転移性または非転移性腫瘍、がん、悪性腫瘍または新生物）の処置に関する指示が挙げられる。したがって、本発明のキットは、処置方法を含めた本明細書に記載の本発明の方法のいずれかの実施に関するラベルまたは指示をさらに含み得る。

ラベルまたは差し込みは、構成成分によりもたらされ得るあらゆる利益、例えば予防的利益または治療的利益に関する情報を含み得る。ラベルまたは差し込みは、潜在的な有害な副作用に関する情報、例えば、特定の組成物の使用が適当ではない状況に関する対象または臨床医に対する警告を含み得る。有害な副作用は、対象が、組成物と適合しない可能性がある１種もしくは複数種の他の薬物適用を受けたことがある、受ける予定である、もしくは現在受けている場合、または対象が、組成物と適合しないと思われる別の処置プロトコールまたは治療レジメンを受けたことがある、受ける予定である、もしくは現在受けている場合にも生じる恐れがあり、したがって、そのような不適合に関する情報を指示に含めることができる。

発明のキットは、他の構成成分をさらに含み得る。キットの各構成成分を個々の容器に封入することができ、種々の容器の全てを単一の包装中に入れることができる。発明のキット、低温での保管用に設計することができる。発明のキットは、本発明の融合構築物を発現する、または融合構築物をコードする核酸を含有する宿主細胞を含有するようにさらに設計することができる。キット中の細胞を、細胞を使用する準備ができるまで適当な保管条件下で維持することができる。例えば、１つまたは複数の細胞を含むキットは、細胞を解凍し、成長させることができるように、適当な細胞保管培地を含有し得る。

特に定義されていなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等である方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料が本明細書に記載されている。

本明細書において引用されている適用、刊行物、特許および他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋ引用およびＡＴＣＣ引用は全て、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含めた本明細書が支配する。

本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「１つの（ａ）融合構築物」または１つの（ａ）「溶解性ドメイン」への言及は、複数のそのような融合構築物または溶解性ドメインを包含する、などである。

本明細書で使用される場合、数値または数値範囲は全て、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、そのような範囲内の整数および範囲内の値または整数の分数を包含する。したがって、例えば、９０～１００％の範囲への言及は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％など、ならびに９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％など、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％などを包含する、などである。

本発明は、一般に、本明細書では、多数の実施形態を記載するために断定的な言葉を使用して開示される。本発明はまた、物質もしくは材料、方法のステップおよび条件、プロトコール、手順、アッセイまたは分析などの特定の主題が完全にまたは部分的に除外された実施形態も具体的に包含する。したがって、本発明は一般に、本発明が何を含まないかに関しては本明細書に表されていないとしても、本発明に明白には含まれない態様もやはり本明細書に開示されている。

本発明の多数の実施形態が記載されている。それにもかかわらず、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく種々の改変を行うことができることが理解されよう。したがって、以下の実施例は、例示するものであり、特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定するものではない。

（実施例１）
最初の試験には、溶解性ペプチド部分とリガンドの間に異なるヒンジ配列を含有し、３０％のＤアミノ酸（Ｄ－鏡像異性体）を含有し、溶解性ペプチド部分と含有されるヒンジ配列またはそれらのＤ－鏡像異性体が１８アミノ酸長および１５アミノ酸長である、２８種の溶解性ドメインペプチドのｉｎｖｉｔｒｏスクリーニングを含めた。２１、１８および１５アミノ酸のＰｈｏｒ２１類似体のためのスペーサーとしてのα－アミノカプロン酸の導入を試験した。試験のために選択されたリガンドには、絨毛膜ゴナドトロピン由来のベータ鎖の結合性部分の１５アミノ酸断片であるβＣＧ－ａｌａ、および完全機能性リガンドであるデカペプチドであるＬＨＲＨが含まれた。
（実施例２）

本実施例には、ヒト乳がん細胞株を使用した細胞毒性（ＩＣ_５０）および溶血活性についてのスクリーニングを記載する。

１８種のβＣＧ－ａｌａコンジュゲート融合構築物および８種のＬＨＲＨコンジュゲート融合構築物について試験し、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａならびにコンジュゲートしていないＰｈｏｒ２１ペプチドおよびＰｈｏｒ１８（３３８９１３）＝ＣＬＩＰ７１ペプチドと比較した。絨毛膜ゴナドトロピン（ＣＧ）および黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）受容体を過剰発現するヒト黒色腫細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃを継代数２４８～２５２で使用してスクリーニングを行った。ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手したＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ細胞株から、Ｐｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ遺伝子および抗体耐性遺伝子を含有するプラスミドＰＲＣ／ＣＭＶ－ｌｕｃをリポフェクションによって安定にトランスフェクトすることにより、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞株を構築した。安定にトランスフェクトされた細胞株をＧ４１８を使用して選択し、ルシフェラーゼ遺伝子の発現が最も高いクローンをそれらのＬＨおよびＬＨＲＨ受容体発現について試験した。

ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞をライボビッツＬ１５培地、１０％ウシ胎仔血清、０．０１ｍｇ／ｍｌのウシインスリン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン中で成長させた。細胞をしっかり閉じたフラスコ内で培養した。９６ウェルプレートを使用し、ウェル当たり細胞１０，０００個でインキュベーションを行った。細胞を、９６ウェルプレートに典型的に播種し、４８時間のインキュベーション後に培地を交換した。各アッセイを０、０．００１、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、５、１０および１００マイクロモル濃度用量の溶解性ペプチド－結合性ドメインコンジュゲートという漸増濃度で行った。各溶解性ペプチド－結合性ドメインコンジュゲートを凍結乾燥形態で準備し、新たに生理食塩水中に溶解させ、細胞に添加した。インキュベーションの持続時間は典型的に２４時間とし、ホルマザン変換アッセイ（ＭＴＴアッセイ）を使用して細胞生存率アッセイを行った。対照はそれぞれ０％および１００％の細胞死についての参照として生理食塩水または０．１％トリトンを含有するものであった。

データを、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｚｍ４（商標）ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｚｍ，Ｉｎｃ）を使用して処理し、解析した。有意性についての統計解析を両側スチューデントｔ検定によって決定した。各試験を、少なくともＮ＝８が実現されるように行った。

融合構築物の長さを増大させることの影響を確認した（Javadpour et al., J Med Chem 39: 3107 (1996)；Javadpour and Barkeley, Biochemistry 36: 9540 (1997)；Leuschner and Hansel, Current Pharmaceutical Design, 10: 2299 (2004)；およびLeuschner and Hansel, Biol Reprod 73: 255 (2005)）。Ｃ末端においてβＣＧ－ａｌａとコンジュゲートした溶解性ペプチドでは、構築物の長さの増大に伴って毒性の増大が示された。種々の長さのペプチドについてのＩＣ_５０は以下の通りであった：１４アミノ酸（Ｐｈｏｒ１４）５．７４、１５アミノ酸（Ｐｈｏｒ１５）１．９２、１８アミノ酸（Ｐｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１）１．０９、２１アミノ酸（Ｐｈｏｒ２１）２．３１および２８アミノ酸（Ｐｈｏｒ２８）１．３６μＭ（表３）。

結合性部分の位置（Ｎ末端またはＣ末端）の影響を確認した。簡単に述べると、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ（Ｃ末端）、βＣＧ－ａｌａＰｈｏｒ２１（Ｎ末端）、ＬＨＲＨ－Ｐｈｏｒ２１（Ｎ末端）およびＰｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ（Ｃ末端）融合構築物を試験した。ペプチドのＩＣ_５０は以下の通りであった：Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａについては２．３μＭ、βＣＧ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１については４．７μＭ、ＬＨＲＨ－Ｐｈｏｒ２１については２．６５μＭ、およびＰｈｏｒ２１－ＬＨＲＨについては１．７１μＭ。データから、βＣＧ－ａｌａおよびＬＨＲＨ結合性部分をＣ末端に位置させると、結合性部分をＮ末端に位置させた場合よりも大きな毒性が示されることが実証される。

ＬＨＲＨ受容体は、多くのヒトがんに存在する（表１参照）。ＬＨＲＨの結合性部分としての活性を結合性部分としてのβＣＧ－ａｌａと比較した。

ＬＨＲＨ－Ｐｈｏｒ２１およびＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａの毒性を、ヒトＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ黒色腫細胞においてｉｎｖｉｔｒｏで、２時間インキュベートした時点または２４時間インキュベートした時点で比較した。データから、ＬＨＲＨ－Ｐｈｏｒ２１ではＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａよりも急速に細胞が死滅し、ＬＨＲＨ－Ｐｈｏｒ２１により２時間以内に細胞死滅が引き出されたことが示される（図１）。
表1

溶解性ドメインと結合性部分の間にヒンジ、スペーサーまたはリンカー配列を導入することにより、細胞死滅に関してＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａよりも効力が大きいペプチドがもたらされる（図２、表２）。Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ融合構築物にヒンジ配列またはスペーサーを導入することにより細胞死滅活性は有意に変化しなかったのに対して、ＡＳＡＡＳのヒンジ配列としての効果により、βＣＧコンジュゲートについて１５アミノ酸を有する溶解性ペプチドの毒性は有意に増大した；この効果は、βＣＧならびにＬＨＲＨコンジュゲートペプチドＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨおよびＰｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨの場合には存在せず、これらはｉｎｖｉｔｒｏで等しく効果的であった（表２、図４）。ヒンジ配列を６炭素スペーサーであるアルファアミノカプロン酸によって置換した場合、同様の効果が観察された（表２）。第２のヒンジ配列内のアラニンをグリシンによって置換した（ＧＳＧＧＳ）結果、有意に低い活性がもたらされ、これにより、グリシンにヘリックスを不安定化させる作用がある可能性があることが示唆される（図２、表２）。
表２：βＣＧ－ａｌａコンジュゲートペプチドのペプチド長の影響

Ｄ－アミノ酸置換の影響を確認するために、融合構築物Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａをＤ鏡像異性体として合成した（以下、Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａと称される）。この融合構築物はＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ黒色腫細胞に対してｉｎｖｉｔｒｏで同等の毒性を示した（Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ、２．３１μＭ、Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ、２．１５μＭ（表３）；Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－βＣＧ－ａｌａの効力はＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ（ＩＣ_５０１．６μＭ）の１．４倍であり、ＬＨＲＨ対応物はＤ－鏡像異性体として有意により効力が強かった（Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨでＩＣ_５００．７５μＭ、Ｄ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨでＩＣ_５０１．４２μＭおよびＰｈｏｒ１８－リュープロンでＩＣ_５０１．９５μＭであったのと比較して、Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ（ＩＣ_５０１．３１μＭ））。

ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ黒色腫細胞に対するβＣＧ－ａｌａおよびＬＨＲＨコンジュゲート溶解性ペプチドのＩＣ_５０値が表３および図３に要約されている。簡単に述べると、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ（２．３１±０．１６）よりもＩＣ_５０が有意に低いペプチドは以下の通りであった：Ｐｈｏｒ２８－βＣＧ－ａｌａ（１．３６±０．０９μＭ；ｐ＜０．０００１）、Ｐｈｏｒ１５－ＡＳＡＡＳ－βＣＧ－ａｌａ（１．４８±０．２４μＭ；ｐ＜０．００５）、Ｐｈｏｒ１５－Ｃ_６－βＣＧ－ａｌａ（１．３１±０．１７μＭ；ｐ＜０．００４）（Ｃ_６＝６アミノカプロン酸）、Ｐｈｏｒ１８－βＣＧ－ａｌａ（１．０９±０．１７μＭ；ｐ＜０．０００１）、Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ（１．３１±０．１μＭ；ｐ＜０．０００１）、Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ（０．７５±０．１μＭ；ｐ＜０．０００１）、Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ（０．８８±０．１２μＭ；ｐ＜０．０００１）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（０．８７±０．１１μＭ；ｐ＜０．０００１）、（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３－ＬＨＲＨ（０．７８±０．２１μＭ；ｐ＜０．０００４）、およびＤ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（１．４２±０．０８μＭ；ｐ＜０．００４）。

ＬＨＲＨ融合構築物は、概してβＣＧ－ａｌａ融合構築物よりも効力が強かった（より毒性が強く、かつ急速に作用する、図１）。簡単に述べると、Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ、Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ、Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨおよびペプチド対照３３８６１４（（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３＝不活性ペプチド）はＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａと比較してヒト乳がん細胞に対する毒性が有意に強かった（ｐ＜０．００３）。ＬＨＲＨ－Ｐｈｏｒ２１以外の全てのＬＨＲＨ融合構築物がほぼ等しく効果的であり、ＬＨＲＨ－Ｐｈｏｒ２１は、結合性部分が溶解性部分に対してＣ末端側に位置する場合、有意に効力が低かった。Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨはＰｈｏｒ２１－ＬＨＲＨと比較して等しく効果的であった；Ｐｈｏｒ１８－リュープロンは毒性がより低かったが、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａと同等であった（図４、表３；リュープロンはＱＨＷＳＹ（Ｄ－Ｌｅｕ）ＬＲＰＮＥｔ）である。

Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ（１．３４±０．１μＭ）よりもＩＣ_５０値が有意に低い融合構築物は以下の通りであった：Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ（０．７５±０．１２μＭ；ｐ＜０．００２）、Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ（０．８８±０．１１μＭ；ｐ＜０．０００１）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（０．８７±０．１２μＭ；ｐ＜０．００４）、および（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３－ＬＨＲＨ（０．７８±０．２１μＭ；ｐ＜０．０４）。同じ融合構築物をβＣＧ－ａｌａ結合性部分とＬＨＲＨ結合性部分の間で比較したところ、全ての場合において、ＬＨＲＨ融合構築物の毒性が、それらのβＣＧ－ａｌａ対応物と比較して有意に強かった。
表３細胞溶解性ペプチドおよびペプチドコンジュゲート－ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞におけるＩＣ_５０およびＨＡ_５０特徴の要約

Ｐｈｏｒ１８－リュープロンおよびＤ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを含めた２１種の融合構築物についての急性溶血活性を試験した。結果が図５および６、ならびに表３に要約されている。

９６ウェルプレートにおいて、ペプチドの段階希釈物を使用し、０．５％ヒトＲＢＣに曝露させて溶血活性を決定した。対照は生理食塩水（ＲＢＣ死なし）または０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（１００％ＲＢＣ溶解）であった。ペプチド濃度は０μＭから１００μＭまでにわたった。２時間のインキュベーションを行った。

シスプラチンと比較した、種々の融合構築物の異なるヒトがん細胞株に対するＩＣ_５０を確認するために、表３の通り融合構築物のＩＣ_５０を評価した。結果を以下に示す：
シスプラチンと比較したヒトがん細胞株におけるIC₅₀ [μM]値

黒色腫細胞株: MDA-MB-435S.luc
乳がん細胞株: MDA-MB-231
卵巣がん細胞株 OVCAR-3, SKOV-3
前立腺がん細胞株: LNCaP
子宮内膜がん細胞株: AN3-CA

データから、概して、試験した融合構築物について、Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ、ＬＨＲＨ－Ｐｈｏｒ２１およびＰｈｏｒ１８－リュープロン以外は溶血活性が非常に低いことが示される。同様の条件下で、以下の融合構築物ではいかなる溶血活性も示されなかった（図５参照）：Ｐｈｏｒ１５－アミノカプロン酸－β－ＣＧ－ａｌａ（３３７４７４）、Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１ β－ＣＧ－ａｌａ（３３７４８１）＞１５０，０００μＭ、Ｐｈｏｒ２１、コンジュゲートしていないＰｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１、（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１（３３８９８２）、Ｐｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１（３３８９８３）、Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３９３８５）および（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３－ＬＨＲＨ（３３８９８４）。Ｄ－アミノ酸鏡像異性体は測定可能な溶血活性を有さなかった。

溶血活性が＜５０μＭの融合構築物は以下の通りであった：Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ（２５μＭ）、ＬＨＲＨ－Ｐｈｏｒ２１（３３μＭ）およびＰｈｏｒ１８－リュープロン（２１μＭ）。

溶血活性が＞１００μＭの融合構築物は以下の通りであった：Ｐｈｏｒ１８－β－ＣＧ－ａｌａ（３３７４７６）、およびＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）。

溶血活性が５０～１００μＭの融合構築物は以下の通りであった：（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３－ＬＨＲＨ（９５μＭ）、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａとＰｈｏｒ２１－ＡＳＡＡＳ－βＣＧ－ａｌａのＨＡ_５０は同様に７０μＭであった。

溶血活性が４００～１３００μＭの融合構築物は以下の通りであった：Ｐｈｏｒ１４－βＣＧ－ａｌａ（３３７４６４）、Ｐｈｏｒ１８ＧＳＧＧＳ β－ＣＧ－ａｌａ（３３７４６７）、Ｐｈｏｒ１８ＡＳＡＡＳ β－ＣＧ－ａｌａ、（３３７４７０）、Ｐｈｏｒ１５ＡＳＡＡＳ β－ＣＧ－ａｌａ（３３７４７１）、Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ（３３８６１１）、およびＰｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ（３３８６１２）。

臨床的に意味のある基準は、細胞毒性（ＩＣ_５０）と溶血活性（ＨＡ_５０）の比、またはＩＣ_５０／ＨＡ_５０である（図６、表３）。大多数の融合構築物について測定されたＨＡ_５０値の数分の１である１０μＭの融合構築物という最大濃度を使用してｉｎｖｉｖｏ試験を実施した。

Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１、Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ、Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８およびＰｈｏｒ１８とのＬＨＲＨコンジュゲートのＩＣ_５０／ＨＡ_５０比は０．００１～０．００６と非常に低かった（Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａの０．０３と比較して）。ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞に対する毒性はＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａと比較して有意に高い：Ｄ－ａｌａ）Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨの毒性はＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａの３倍であり、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨおよびＰｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨの効力は２倍であり、Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨの効力は１．５倍である（図６）。

要約すると、毒性の増大および低溶血活性（ＩＣ_５０／ＨＡ_５０比）の基準によって評価した融合構築物は以下の通りであった：Ｐｈｏｒ１８－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ１５－ＡＳＡＡＳ－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ１５－Ｃ_６－βＣＧ－ａｌａ、Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ、Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ、およびＤ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ。
（実施例３）

本実施例では、種々の型および用量のβＣＧ融合構築物およびＬＨＲＨ融合構築物を用いた、黒色腫のマウス異種移植モデルにおけるｉｎｖｉｖｏ試験を記載する。

雌Ｎｕ／ＮｕマウスにＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ／ＭａｔｒｉｇｅｌＨＣ懸濁液（細胞１×１０^６個）を皮下注射した。処置スケジュールが図７に示されている。簡単に述べると、処置を腫瘍細胞の注射後１３日目に開始し、１９日目および２５日目に継続した。処置は以下の通りであった：生理食塩水対照、Ｐｈｏｒ２１（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｐｈｏｒ１８（５ｍｇ／ｋｇ）、（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３ペプチド－βＣＧ－ａｌａ（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ（０．０１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）、Ｐｈｏｒ１８－βＣＧ－ａｌａ（０．０１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）、Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ（０．０１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇ）、ベースライン、群当たり８～１２匹のマウス、１４群。週１回の注射のための用量は体重１ｋｇ当たり５ｍｇ、１ｍｇおよび０．０１ｍｇであり、ボーラス単回注射として与えた。

マウスの全ての群で注射に対する十分な忍容性が示された。３３７４７６を５ｍｇ／ｋｇ用量で用いた各注射時にマウスが１匹だけ死亡した。死亡は急性事象であった。他の処置群のマウスは全て生存した。注射後１０分よりも後に注射の結果として死亡したマウスはいなかった。

細胞溶解性ペプチド注射の原発腫瘍に対する効果が図８に例示されている。簡単に述べると、図８Ａ～８Ｃは、個々のペプチドそれぞれについての試験の過程中の腫瘍体積を示す。図８Ｄ～８Ｇは、剖検時の腫瘍の特徴：腫瘍体積（Ｄ）、腫瘍重量（Ｅ）、生腫瘍細胞（Ｆ）、腫瘍の状態（Ｇ）を示す。

処置の有効性を、処置開始時の測定値と試験の最後における測定値を比較した差異として算出した（図８Ｈ～８Ｉ）。図８Ｊは、剖検時のマウスの体重を示す。試験の最後に、腫瘍をルシフェラーゼ活性について測定した際に腫瘍における細胞の生存率を決定した。

βＣＧをリガンドとして含有するペプチドを用いて処置した全ての動物において腫瘍体積が有意に減少した（ＩＩ、Ａ）、０．０１ｍｇ／ｋｇでベースライン（３２３０３３以外）と、ならびに（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１およびコンジュゲートしていないＰｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１対照と比較してｐ＜０．０５。異種移植片の体積を低減させることに関して効果的でなかった（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１およびＰｈｏｒ１８以外は全ての処置群において生理食塩水対照と比較して腫瘍体積が有意に低減した。

βＣＧコンジュゲートペプチドを用いた全ての処置群において、生理食塩水または（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３ペプチドを用いて処置した動物と比較して、腫瘍重量も有意に減少した（ｐ＜０．００１）。ルシフェラーゼ活性によって測定される腫瘍細胞生存率は腫瘍重量および腫瘍体積に関して観察された変化とよく相関した。

ベースライン値と比較した腫瘍重量または生存可能な腫瘍細胞の低減として測定される処置の有効性に関して、３２３０３３および３３７４７６について濃度依存的な処置応答が示された。３３７４８１では、０．０１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの投薬量で腫瘍細胞量および生腫瘍細胞の低減が一貫して示された。３２３０３３は、５ｍｇ／ｋｇと比較して、１ｍｇ／ｋｇ用量で最も効果的であったが（これは以前の実験ですでに観察されていた）、適用した最低用量でのみ生理食塩水対照と有意に異なった。融合構築物３３７４７６および３３７４８１は、５ｍｇ／ｋｇおよび０．０１ｍｇ／ｋｇで、腫瘍細胞量を低減させることに関して３２３０３３と比較して有意に効果が高く（ｐ＜０．０００１）生存可能な腫瘍細胞がベースライン値を下回った（ｐ＜０．００４）。融合構築物３３７４８１では濃度依存性は示されず、全ての試験した構築物のうちで最も効果が高かった。

融合構築物３３７４７６および３３７４８１を用いて処置したマウスにおいて嚢胞性腫瘍が見出され、これは、８０～９０％に生じたが、１ｍｇ／ｋｇの３２３０３３による処置群ではたった３０％であった（異種移植モデルにおいて嚢胞形成は見られていない。嚢胞は、液体で満たされた被膜からなった）。急速に成長している腫瘍において細胞が急速に死滅すると嚢胞性腫瘍が生じることが、明らかではないが、仮定される。嚢胞はＰｈｏｒ２１で処置した前立腺腫瘍異種移植片に存在した。

処置群についての血液化学および全血球計算値の結果から、いずれの場合においても処置による肝機能、腎機能、心機能への影響はないことが明らかになった。血小板計数、ＷＢＣおよびＲＢＣ計数は正常範囲内に入り、これにより、処置が腫瘍細胞を特異的に死滅させるものであり、与えられた濃度で貧血を引き起こすこともなく、他の観察可能な生命維持に必要な体機能のいずれにも影響を及ぼさないことが明らかになった。融合構築物は、忍容性が良好であり、長期にわたる副作用は認められなかった。

前述のｉｎｖｉｖｏ腫瘍有効性データに基づいて、Ｐｈｏｒ１８－βＣＧ－ａｌａ（３３７４７６）およびＤ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ（３３７４８１）は、ベースライン値と比較した腫瘍重量の低減（ｐ＜０．０００１）および生存可能な腫瘍細胞の破壊（ｐ＜０．００４）に関して、参照Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ（３２３０３３）よりも有意に効力が強い。どちらの融合構築物でもｉｎｖｉｖｏにおける溶血は引き起こされず、また、使用した最高用量（５ｍｇ／ｋｇ）で持続的な副作用は示されなかった。Ｐｈｏｒ１８－βＣＧ－ａｌａの腫瘍に対する有効性が、最低用量であっても、複数回注射で大きくなる可能性がある。

ＬＨＲＨ融合構築物に関して、乳がんのマウス異種移植モデルを使用した。簡単に述べると、Ｎｕ／Ｎｕ雌マウス、非近交種、５週齢（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）に、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ懸濁液（細胞１×１０^６個）を皮下注射した。処置を腫瘍細胞の注射後２１日目に開始し、２６日目および２９日目に継続した。週１回の融合構築物注射のための用量は、体重１ｋｇ当たり２ｍｇ、０．２ｍｇおよび０．０２ｍｇであり、ボーラス単回注射として与えた。全てのマウスに対して腫瘍細胞の注射の３４日後に剖検を行った－処置開始時に８匹のマウスを屠殺することにより、腫瘍重量のベースライン値を得た。原発腫瘍、肝臓、腎臓、膵臓、心臓、肺、および脾臓を採取し、組織学的評価のためにホルマリン中に調製した。腫瘍重量を剖検時に記録し、腫瘍の一部をルシフェラーゼアッセイ決定のために－８０℃で凍結させた。

処置群には、生理食塩水対照、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ－３２３０３３（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ）、Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ－３３８６１１（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ）、（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３ＬＨＲＨ－３３８６１４（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ－３３８６１３（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ）、Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ－３３８６１２（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ）、Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ－３３９３８５（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ）、ならびにＰｈｏｒ１８－リュープロン－３３９３４７（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ）、ベースライン、群当たり１２匹のマウスを含めた。

全ての群で注射に対する十分な忍容性が示された。Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ、２ｍｇ／ｋｇ用量の２回目および３回目の注射中にマウスが２匹だけ死亡した（これらのマウスは同じケージであった）。死亡は急性事象であった。他の処置群のマウスは全て生存した。注射後１０分よりも後に注射の結果として死亡したマウスはいなかった。

図９は、融合構築物注射の原発腫瘍に対する効果を、個々の構築物それぞれについての試験の過程中の体積測定として要約する。全ての群において、（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３－ＬＨＲＨコンジュゲートを用いて処置したマウス、または指数関数的な腫瘍成長が観察された生理食塩水対照に関して以外は、処置の間に腫瘍体積が減少した。処置後３０日の後に記録された腫瘍体積に関しては全ての融合構築物についてベースラインと比較して低減（ｐ＜０．０１）が示され、Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨを用いた処置群およびＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを用いた処置群において最小の腫瘍体積が記録された。

剖検時の腫瘍の特徴が図１０に要約されている：（Ａ）腫瘍重量、（Ｂ）ベースラインと比較した腫瘍重量の変化、（Ｃ）生腫瘍細胞の総数、（Ｄ）ベースラインと比較した総生腫瘍細胞の変化、および（Ｅ）ベースライン時および剖検時の体重。試験の最後に、腫瘍をルシフェラーゼ活性について測定した際に腫瘍細胞の生存率を決定した。処置の有効性を、処置開始時の測定値と試験の最後における測定値を比較した差異として算出した（図１０Ｂおよび１０Ｄ）。

腫瘍重量および生腫瘍細胞の総数は、全ての処置群における全ての動物において、０．０２ｍｇ／ｋｇの最低用量であっても、ＬＨＲＨコンジュゲートを与えた場合、生理食塩水対照および（ＫＫＫＦＡＦＡ）_３－ＬＨＲＨコンジュゲートペプチドと比較して有意に減少した（ｐ＜０．０００１）。総腫瘍重量は、ＬＨＲＨを含有するペプチドを２ｍｇ／ｋｇで用いて、ならびにＤ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（Ａ）については０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇで用いて処置した全ての動物において、ベースラインと比較して有意に減少した（ｐ＜０．０５）。

以下の濃度では、ベースラインと同様の腫瘍重量がもたらされた：Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ－３２３０３３）、０．０２ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０７）および０．２ｍｇ／ｋｇ（ｐ＜０．０６）；Ｐｈｏｒ１８－リュープロン、０．２ｍｇ／ｋｇおよび０．０２ｍｇ／ｋｇの投薬量、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ、０．２ｍｇ／ｋｇ、およびＤ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ、０．２ｍｇ／ｋｇ。総腫瘍重量について０．０２ｍｇ／ｋｇ用量のＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａと比較した場合、Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨおよびＤ－ａｌａＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨが０．０２ｍｇ／ｋｇの投薬量で優れた（ｐ＜０．０５）。

生腫瘍細胞の数を決定し、図１０Ｃに生腫瘍細胞の総数としてプロットし、図１０Ｄにベースラインと比較した生腫瘍細胞の変化としてプロットした。ルシフェラーゼ活性によって測定される細胞生存率は、生腫瘍細胞の低減が観察されたＰｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨおよびＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ以外は、腫瘍重量および腫瘍体積に関して観察された変化と相関した。Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３９３８５）を用いた処置およびＰｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ（３３８６１２）を用いた処置は、２ｍｇ／ｋｇ用量でＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａよりも優れた（ｐ＜０．０４）。

ベースライン値と比較した腫瘍重量または生存可能な腫瘍細胞の低減として測定される処置の有効性について、腫瘍重量および生腫瘍細胞に関してＤ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ以外の全ての融合構築物について濃度依存的な処置応答が示された。Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨでは、０．０２ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇの投薬量で腫瘍重量および生腫瘍細胞の低減が一貫して示された。本実験において最も効果的な融合構築物は、生腫瘍細胞の数および腫瘍重量を低減させることに関しては２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ（３３８６１２）およびＤ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３９３８５）であった。Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨおよびＤ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨは、２ｍｇ／ｋｇおよび０．０２ｍｇ／ｋｇ用量のＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａと比較して優れた（ｐ＜０．０５）。Ｐｈｏｒ１８－リュープロンは腫瘍重量および生腫瘍細胞を低減させることに関して効果が最も低かった。

処置群についての血液化学および全血球計算値の結果から、いずれの場合においても処置による肝機能、腎機能、心機能への影響はないことが明らかになった。血小板計数、ＷＢＣおよびＲＢＣ計数は正常範囲内に入り、これにより、処置が腫瘍を特異的に破壊するものであり、与えられた濃度で貧血を引き起こすこともなく、他の観察可能な生命維持に必要な体機能のいずれにも影響を及ぼさないことが示唆された。Ｐｈｏｒ１８－リュープロン、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨおよびＤ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨを注射したマウスにおいて、生理食塩水対照と比較して１．５倍のカリウムレベルの上昇が観察された。融合構築物は忍容性が良好であり、長期にわたる副作用は認められなかった。

前述のｉｎｖｉｖｏ腫瘍有効性データに基づいて、Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ（３３８６１２）、およびＤ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３９３８５）は、腫瘍重量の低減（ｐ＜０．０５）および生存可能な腫瘍細胞の破壊（ｐ＜０．０４）に関して、参照Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａよりも有意に効力が強い。Ｄ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ、およびＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨはＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａと等しく効果的であった。どちらの融合構築物でもｉｎｖｉｖｏにおける溶血も他の副作用も引き起こされなかった。Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ（３３８６１２）、およびＤ－ａｌａ－Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３９３８５）の有効性は、最低用量であっても、複数回注射で大きくなる可能性がある。
（実施例４）

本実施例では、ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ受容体発現および特異性試験を記載する。

処置の前後の両方のＬＨ受容体の発現密度を分析して、処置により受容体発現のダウンレギュレーションがもたらされるかどうかを決定する。数量化のための、ウエスタンブロットアッセイおよびＲＩＡと比較した免疫細胞化学。チャンバースライドを用いたＩＨＣ、およびウエスタンブロット技法を使用したＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞、ＣＨＯ細胞およびＴＭ４細胞におけるＬＨおよびＬＨＲＨ受容体の決定。同じ継代数の各細胞株を溶解性ペプチドＣＧおよび溶解性ペプチドＬＨＲＨに対する感受性について試験する。

ＬＨ受容体融合構築物の特異性をＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞（ＬＨＲＨ受容体とＣＧ受容体の両方をもつ）、ＴＭ４細胞（ＬＨＲＨ受容体をもたない）およびＣＨＯ細胞（ＣＧ受容体をもたない）において分析した。ＩＣ_５０データから、ＴＭ４細胞のＬＨＲＨ－Ｐｈｏｒ２１に対する感受性の有意な低減（１０．９μＭ）が示され、一方、ＣＨＯ細胞では、ＭＤＡ－ＭＤ－４３５Ｓ．ｌｕｃ細胞（２．３μＭ）と比較した場合にＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａに対して低い感受性（２４．６μＭ）が示される（図１２）。

ｉｎｖｉｖｏ受容体発現を融合構築物による処置と関連付けて測定する。ｉｎｖｉｖｏ受容体発現を融合構築物による処置の開始時および終了時に測定する。
（実施例５）

本実施例では、融合構築物と化学療法剤を用いた併用処置を記載する。

卵巣がん細胞株（ＯＶＣＡＲ－３細胞、多剤耐性）をＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａおよびドキソルビシンと一緒に４８時間インキュベートする予備試験を実施した。細胞生存率をホルマザンの低減として決定した。Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａとの同時インキュベーションでのドキソルビシン処置を増大させるにつれＩＣ_５０が減少した。減少は、ドキソルビシン濃度０μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌで、１０μＭから０．９μＭまで、０．３μＭまで、０．０５μＭまでであった（図１１）。Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａを用いた処置により、ドキソルビシンに対する応答が強化された。データから、細胞をドキソルビシンと共インキュベートした場合にＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａの効果がより大きい（１３倍）ことが示された。

がん細胞をドキソルビシンまたはシスプラチンで前処置し、その後、ＬＨまたはＬＨＲＨの存在下、および非存在下でＬＨまたはＬＨＲＨ融合構築物で処置することにより、構築物の細胞に対する細胞傷害性が変更されるかどうかが示される。

併用処置のｉｎｖｉｖｏ有効性を異種移植片腫瘍モデル（ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ）において試験した。マウスを、融合構築物と化学療法薬の組合せを用いて処置し、適当な対照と比較した。マウスを、化学療法薬に使用される標準のスケジュールに従って処置し、また、融合構築物を用いて週に１回、３週間にわたって処置した。

融合コンジュゲートは、溶血活性、抗腫瘍有効用量（０．０２ｍｇ／ｋｇまたは０．０１ｍｇ／ｋｇ）と比較した最大耐量（ＭＴＤ）（最大１６～２５ｍｇ／ｋｇ）などのパラメータを考慮すると、高い安全域を有する。Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａの安全域は１６であるが、一方、Ｐｈｏｒ１８－βＣＧ－ａｌａおよびＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨに関しては８００という値に到達し得る。比較して、Ｐｈｏｒ１８－リュープロンの安全域はたったの８である。
以下の表4は種々の基準に従ったコンジュゲートの要約である。

評点コード：
割り当てられる点：１２３
ｉｎｖｉｔｒｏ活性１× ２× ３×
ＨＡ_５０＜５０５０～１００＞１００
ＩＣ_５０／ＨＡ_５０＜０．０３＜０．００６＜０．００４
ｉｎｖｉｖｏ有効性
３３との比較同等より良好
３３と比較したＭＴＤ同等より良好
１）３３のＩＣ_５０は２．３１μＭであった、３３のＩＣ_５０／ペプチドのＩＣ_５０として表わされる値。
２）ＨＡ_５０［μＭ］として表される溶血活性。
３）ｉｎｖｉｖｏ性能は、ペプチド３３の同じパラメータと比較した、ベースライン値に対する腫瘍重量の低減および生腫瘍細胞の低減に関する有意性を指す。
４）６６．６％生存（短時間および注射の８～１４日後）をもたらす注射用量。
ペプチドコード：
３３＝Ｐｈｏｒ２１βＣＧ－ａｌａ
７６＝Ｐｈｏｒ１８－βＣＧ－ａｌａ
８１＝ＤａｌａＰｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ
８５＝ＤａｌａＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ
４７＝Ｐｈｏｒ１８－リュープロン
１３＝Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ
１１＝ＤａｌａＰｈｏｒ２１－ＬＨＲＨ
１２＝Ｐｈｏｒ１８－ＡＳＡＡＳ－ＬＨＲＨ
７１＝Ｐｈｏｒ１５－βＣＧ－ａｌａ
７４＝Ｐｈｏｒ１５－Ｃ６－βＣＧ－ａｌａ
（実施例６）

本実施例では、種々のがん細胞株におけるペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３））のｉｎｖｉｔｒｏカイネティクス試験を記載する。

標準の化学療法薬は、ＤＮＡインターカレーション、微小管相互作用によって相互作用するものである、またはシグナルトランスダクション経路の阻害剤である。したがって、それらの作用機序により、標的細胞を破壊するために必要な時間枠が決定される。ドキソルビシンについての、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓなどのヒト黒色腫細胞を破壊するためのカイネティクスは４時間という迅速さであることが報告されており、他の標準治療による処置ではいっそう長くかかり得る。がん細胞の破壊の最も一般的な作用機序はアポトーシスでる。可逆的プロセスとして、および多剤耐性（ＭＤＲ）の出現、ＭＤＲがん細胞において薬物分子を移出するＰｇｐポンプの作用に起因して、標準治療による処置は効果的でない可能性がある。

化学療法薬とは対照的に、直接膜作用ではがん細胞を数分以内に破壊することができる。カチオン性溶解性ペプチドなどの膜活性化合物には、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）（ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ）が含まれる。

細胞傷害性のカイネティクスを決定するために、ＬＨＲＨ標的受容体を種々のレベルで発現する種々の細胞株において、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を使用し、ターゲティングされない溶解性ペプチド部分Ｐｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１（３３８９８３）と比較して、詳細な時間経過試験を行った。非がん細胞株の膜は、外膜のホスファチジン酸含有量が多いがん細胞株とは対照的に、中性であり、細胞溶解性ペプチドに対して抵抗性をもつ。

試験した黒色腫細胞株は、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ（エストロゲン受容体アルファ陰性）、乳がん細胞株ＭＣＦ－７およびＴ４７Ｄ（エストロゲン受容体アルファ陽性）、卵巣がん細胞株（ＯＶＣＡＲ－３およびＳＫＯＶ－３）、前立腺がん（ＬＮＣａＰ）、非悪性乳房上皮細胞株ＭＣＦ－１０Ａおよびマウス線維芽細胞株ＮＩＨ：３Ｔ３であった。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）の有効性におけるＬＨＲＨ受容体標的化の役割も評価した。

細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり細胞１０，０００個の密度で播種した。４８時間後に、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）（ＡＰＣ３３８６１３、Ｌｏｔ＃Ｐ０８０４０１）またはＰｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１（ＡＰＣ３３８９８３、Ｌｏｔ＃Ｗ０８０３３Ｃ１）を０．０００１μＭ、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、５０μＭおよび１００μＭの濃度で添加することによって処置を開始した。対照は、それぞれ０％細胞死および１００％細胞死についての参照としてＵＳＰ生理食塩水または０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（商標）を含有するものであった。２分後、５分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、６時間後、２４および４８時間後に培養培地を取り出すことによってインキュベーションを終結させた。細胞生存率をホルマザン変換アッセイ（ＭＴＴアッセイ、（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ＡｑｕｅｏｕｓＯｎｅ、Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ３５８２）によって評価した。ホルマザン変換を、室温で、ＢｉｏＲａｄＢｅｎｃｈｍａｒｋＰｌｕｓマイクロプレート二波長分光光度計を４９０／６３０ｎｍで使用して決定した。

データを、１００％細胞死を表すＴｒｉｔｏｎＸ－１００（商標）を含有するウェルにおける吸収の０％細胞死を表す生理食塩水を含有するウェルにおける吸収に対する分率として算出した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍｖｅｒｓｉｏｎ５．０１ｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏＣａｌｉｆｏｒｎｉａＵＳＡを使用し、シグモイド用量反応用のプログラムに従い、不定の傾きを用い、制約値０％および１００％を使用して、細胞傷害性をＩＣ_５０として決定した。２つの９６ウェルプレートの個々のセットのそれぞれの４ウェルを比較し、解析した。有意性についての統計解析を両側スチューデントｔ検定によって決定した。

ＭＤＡ－ＭＢ４３５Ｓ細胞（ｐ２５０）に対しては、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）では１時間のインキュベーション後に最大の有効性が示されたが、一方、ＣＬＩＰ７１とのインキュベーションでは、インキュベーション時間の増大と共にＩＣ_５０値１００、１０９、１７１、１４５、１４８、８６、５４．５、５５．１（２４時間）、および３［μＭ］（４８時間）（ｐ＜０．００５）がもたらされた。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、コンジュゲートしていない溶解性ペプチドＣＬＩＰ７１（＞１００μＭ）と比較して速効性作用剤である（０．５時間後に１．２μＭおよび１時間後に０．６μＭ）。

ＭＣＦ－７細胞（ｐ１５２）に対しては、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）では１時間のインキュベーション後に最大の有効性が示されたが、一方、ＣＬＩＰ７１とのインキュベーションでは、インキュベーション時間の増大に伴ってＩＣ_５０値９２、９５、５０および２２［μＭ］（ｐ＜０．００５）がもたらされた。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、コンジュゲートしていないＣＬＩＰ７１と比較して速効性作用剤である（３．４～１．８μＭ）。

ＯＶＣＡＲ－３細胞（ｐ４７）に対しては、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）では１時間のインキュベーション後に最大の有効性が示されたが、一方、コンジュゲートしていないＰｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１との３３通りのインキュベーションではインキュベーション時間の増大に伴ってＩＣ_５０値３３７、１２６、８５．５、５２．５、２２．９および２３．１［μＭ］がもたらされた（ｐ＜０．００５）。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、速効性作用剤であり、インキュベーション時間の増大に伴うＩＣ５０値は６．７、５．６、５．３、１．６、１．５、０．５および０．５［μＭ］である（ｐ＜０．００５）。迅速なカイネティクスデータから、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）とＣＬＩＰ７１が異なる作用機序によって細胞を死滅させ、薬物の有効性を増大させることが示唆される。

ＳＫＯＶ－３細胞（ｐ４０）に対しては、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）では２４時間のインキュベーション後に最大の有効性（１１．５μＭ）が示されたが、一方、ＣＬＩＰ７１とのインキュベーションでは、インキュベーション時間の増大に伴ってＩＣ_５０値８６、９６、５３および５０［μＭ］（ｐ＜０．００５）がもたらされた。ＳＫＯＶ－３細胞は機能的なＬＨＲＨ受容体を提示しないので、これらの細胞に関してはＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は適当な標的ではない。

Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を用いて処置した、黒色腫細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－４３５）および乳がん細胞（ＭＣＦ－７）およびＯＶＣＡＲ－３などの、機能的なＬＨＲＨ受容体を提示する全ての細胞株で０．５～１時間のインキュベーション以内に最大の効果（μＭ単位のＩＣ_５０）が実証された。対照的に、ＣＬＩＰ７１＝Ｐｈｏｒ１８の最大の効果を得るためには２４時間のインキュベーションが必要であった。Ｔ４７Ｄ、ＬＮＣａＰなどの、機能的なＬＨＲＨ受容体を提示する細胞株について同様の結果が得られた。機能的なＬＨＲＨ受容体を提示しない細胞株（ＳＫＯＶ－３およびＨＥＫ１Ａ）に対しては、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）とＣＬＩＰ７１＝Ｐｈｏｒ１８により２４時間のインキュベーション後に同様の毒性が示され、ＩＣ_５０値はそれぞれ１０．３μＭ、１１．８μＭであった。非がん性細胞株３Ｔ３はＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）およびＣＬＩＰ７１＝Ｐｈｏｒ１８に対して高度に抵抗性であり、ＩＣ_５０値はＣＬＩＰ７１については＞４０μＭ、およびＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）については＞１０μＭであった。

これらの結果から、ＬＨＲＨによるターゲティングによりＣＬＩＰ７１＝Ｐｈｏｒ１８の有効性が増強されること、および非がん細胞株が細胞溶解性カチオン性ペプチドによる破壊に対する抵抗性をもつことが示される。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、１時間未満での受容体標的化機構を通じたがん細胞の破壊に関して注目すべき効力を示す。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は数分以内に効果的になり、有効性に関して細胞内取り込みならびに代謝経路および増殖機構への干渉に依存する標準の化学療法に優る利点を有する。さらに、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、多剤耐性がん細胞に対して作用することができる。
（実施例７）

本実施例は、ｉｎｖｉｔｒｏにおける、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３））の乳がん細胞に対する可能性のある作用機序を示すデータを含む。

ｉｎｖｉｔｒｏにおける可能性のある作用機序を実証するために、ＬＨＲＨ受容体を過剰発現するヒト黒色腫細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－４３５に対して蛍光顕微鏡による試験を行った。簡単に述べると、ヒト黒色腫細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、継代＃２５２）を培養皿に播種した。ＥＰ－１００を添加する前に以下のマーカーを導入した：ＤＲＡＱ５（商標）（ＡｌｅｘｉｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）－青色－を核染色のために使用し、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）ＲｅｄＣＭＸＲｏｓ（Ｍ７５１２）（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．ＯＲ）をインタクトなミトコンドリアを可視化するために適用した。細胞膜をコムギ胚芽ａｌｅｘａｆｌｕｏｒｇｒｅｅｎコンジュゲート（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．ＯＲ）で染色した。

細胞に、まず、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ色素を製造者の推奨に従って負荷した。生理食塩水中に復元させたＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を最終濃度１０μＭで添加し、５～１０分間インキュベートした。生理食塩水のみを伴う培養皿が対照としての機能を果たした。上清を除去し、残りの細胞を蛍光顕微鏡イメージングのために調製した。

ｉｎｖｉｔｒｏにおける、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）への曝露後の、黒色腫細胞上に機能的なＬＨＲＨ受容体を提示するＭＤＡ－ＭＢ－４３５の蛍光顕微鏡による評価により、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）（１０μＭ）への曝露の５分後に原形質膜が崩壊したことが明らかになった。これらの観察から、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）により、数分以内に原形質膜が破壊され、それにより細胞死が導かれることが示唆された。

２μＭのＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）ＦＩＴＣと一緒に３０分間インキュベートした培養物中のＳＫＯＶ－３細胞（ｐ４１）およびＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ細胞（ｐ２５０）の蛍光顕微鏡による評価により、ＳＫＯＶ－３細胞では細胞内取り込みが存在せず、膜小疱形成が起こらず、ミトコンドリア色素が保持されることが明らかになった。対照的に、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ細胞では、３０分以内のＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）ＦＩＴＣの細胞内取り込み、ならびに広範囲にわたる膜小疱形成が目に見え、それにより、外膜の小胞形成およびミトコンドリア色素の退色が導かれた。これらの観察から、数分以内に細胞死が起こることが示唆される。

Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、機能的なＬＨＲＨ受容体を提示する細胞を数分以内に破壊した。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、がん細胞を、外側の原形質膜を崩壊させ、それにより壊死を導くことによって破壊した。作用機序から、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）と機能的な標的を提示する細胞の原形質膜の迅速な相互作用が強く示唆される。ＬＨＲＨ受容体については陰性の細胞は標的とされず、インタクトなままであった。

これらのデータから、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）の抗がん薬としての高い特異性および有効性が示された。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は数分以内に効果的になり、有効性のために細胞内取り込みならびに代謝経路および増殖機構への干渉を必要とする標準の化学療法に優る大きな利点を有した。さらに、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は多剤耐性がん細胞に対して作用することができた。
（実施例８）

本実施例は、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３））が異種移植モデルにおけるがんに対して効果的であることを実証する試験を含む。

ヒト黒色腫異種移植片：ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ．ｌｕｃ（ｓ．ｃ．）、ヒト乳がん異種移植片ＭＣＦ－７（エストロゲン受容体アルファ陽性）、ヒト卵巣がん異種移植片：ＯＶＣＡＲ－３、（ｓ．ｃ．）、ヒト前立腺がん異種移植片：ＰＣ－３（アンドロゲン受容体陰性）を担持するヌードマウスにおいて、単独療法、または標準治療による処置との併用療法としてｉｎｖｉｖｏ有効性試験を行った。生理食塩水（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇ）に溶解させたＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を、外側尾静脈に単回のボーラス注射として、週に１回または２回、３週間にわたって注射した。

ＭＣＦ－７乳がん異種移植モデルにおいてＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）併用療法を行った。

最後の注射の１週間後にマウスを屠殺し、化学パネルのために血液を採取し、腫瘍重量および体重を記録した。腫瘍の一部を組織学的評価のためにＰＢＳ緩衝１０％ホルマリン中に固定した。種々のｉｎｖｉｖｏ異種移植片試験を表５に要約する。
表5:異種移植試験

単回投薬レジメンでＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ異種移植片の重量を低減させるために必要な最小の効果的な用量を決定するために、Ｎｕ／Ｎｕ雌マウス、非近交種、５週齢（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）の肩甲骨間領域に、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ（継代＃２４９）／Ｍａｔｒｉｇｅｌ懸濁液（細胞２．４×１０^６個／マウス）を注射した（ｓ．ｃ．）［Leuschner 2006］。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）（ＩＤ：３３８６１３ｌｏｔ＃Ｐ０８０４０１）（０．００００２ｍｇ／ｋｇ、０．０００２ｍｇ／ｋｇ、０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇ）ならびにコンジュゲートしていないＰｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１（ＡＰＣ３３８９８３、Ｌｏｔ＃Ｗ０８０３３Ｃ１）プラスＬＨＲＨ（０．２／０．１２２ｍｇ／ｋｇ、（［Ｄ－Ｔｒｐ６］－ＬＨＲＨ；ＳｉｇｍａＬ９７６１、ｌｏｔ＃０３７Ｋ１１０３）を投薬前にＵＳＰ生理食塩水中に復元した。外側尾静脈を介した単回のボーラス静脈内注射として、１週間に１回、３週間にわたって投薬を行った。

各群は１６匹のマウスからなり、週に１回、３週間にわたって注射を行った。ある１つのマウス１６匹の群を処置開始時に屠殺してベースラインとして機能させた。生理食塩水注射が対照群としての機能を果たした。試験全体を通じて、腫瘍体積を週２回記録した。

処置を、腫瘍細胞の注射後１６日目、腫瘍が定着した時に開始し、２３日目および３０日目に継続した。残りのマウス全てに対して腫瘍細胞の注射の３７日後に剖検を行った。

処置応答を、生理食塩水対照およびターゲティングされないＣＬＩＰ７１による処置と比較した、剖検時の腫瘍重量および腫瘍重量の変化によって決定した。原発腫瘍を採取し、秤量し、組織学的評価のために１０％ＰＢＳ緩衝ホルマリンを用いたホルマリン固定として調製した。データセットの統計学的評価をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｚｍ４で行い、有意性をウィルコクソン符号順位検定によって算出した。

生理食塩水対照およびＣＬＩＰ７１プラスＬＨＲＨを用いて処置したマウスでは腫瘍体積および腫瘍重量が増大した。０．０００２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を用いて処置したマウスでは、腫瘍体積および腫瘍重量が生理食塩水対照と比較して有意に低減した。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を０．００２ｍｇ／ｋｇという低さの用量で用いた処置により、ベースラインと比較して腫瘍体積および腫瘍重量が有意に低減した（ｐ＜０．０００２）。

処置したマウスからの、ヘマトキシリン／エオシンを用いて染色したＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ異種移植マウス由来の腫瘍切片の組織学的評価により、生理食塩水対照、およびＣＬＩＰ７１／ＬＨＲＨを用いて処置したマウスでは、生存可能な腫瘍細胞が示される。対照的に、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を０．０００２ｍｇ／ｋｇという低さの用量で用いて処置したマウス由来の腫瘍では有意な壊死が明らかであった。ターゲティングされないカチオン性溶解性ペプチドＣＬＩＰ７１では、腫瘍重量は減少せず、腫瘍組織も破壊されなかった。

Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、０．００２ｍｇ／ｋｇという低さでＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ異種移植片の腫瘍重量を低減させ、それにより、処置した腫瘍組織の壊死を導くことに関して効果が高かった。細胞溶解性ペプチドを用いたターゲティングされない処置は効果的ではない。

複数回投薬レジメンでＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ異種移植片の重量を低減させるために必要な最小の効果的な用量を決定するために、上記の通り、Ｎｕ／Ｎｕ雌マウス、非近交種、８週齢（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）の肩甲骨間領域に、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ（継代＃２５３）／Ｍａｔｒｉｇｅｌ懸濁液（細胞２×１０^６個／マウス）を注射した（ｓ．ｃ．）。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）（ＩＤ：３３８６１３ｌｏｔ＃Ｐ０８０４０１）（０．００２ｍｇ／ｋｇ、および０．２ｍｇ／ｋｇ）を投薬前にＵＳＰ生理食塩水中に復元した。腫瘍細胞の接種後１５日目、１６日目、１７日目、２０日目、２１日目、２２日目、２３日目、２７日目、２８日目、２９日目、３０日目、３３日目、３４日目、３５日目、３６日目、３７日目、３８日目、４０日目、４１日目、４２日目に外側尾静脈を介した単回のボーラス静脈内注射として投薬を行った。生理食塩水注射が対照群としての機能を果たした。

各処置群１６匹のマウスからなった。試験全体を通じて、腫瘍体積を週２回記録した。腫瘍細胞の注射後４５日目に最終的な剖検を行った。大多数のマウスにおいて尾静脈の閉塞に起因して注射を再開した。試験終点において体重、腫瘍重量を決定し、リン酸緩衝剤１０％ホルマリン中に固定した。

複数回静脈内注射を使用したＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を用いた処置により、どちらの用量レベルでも腫瘍退縮がもたらされた。どちらの処置群においても腫瘍を有さないマウスが観察され、０．００２ｍｇ／ｋｇを受けた群では２３匹のうち６匹であり、０．２ｍｇ／ｋｇを受けた群では２０匹のうち１匹であった。残留した塊は、一般にはＭａｔｒｉｇｅｌからなった。０．２ｍｇ／ｋｇ群のマウス１匹が処置に応答しなかった。

尾部における壊死は観察されず、尾部の発赤は存在しなかった。試験期間全体にわたって体重は処置の影響を受けなかった。

生存は処置したマウスでは１００％であった。対照的に、生理食塩水対照群の８匹のマウスを、腫瘍体積が２，５００ｍｍ^３を超えたことが理由で腫瘍細胞の注射後３０日目（試験終点より前）に屠殺した。

０．００２ｍｇ／ｋｇおよび０．２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を複数回注射レジメンで用いて処置したマウス由来のＨ＆Ｅ染色した腫瘍の組織学的検査により、処置したマウスにおける腫瘍細胞の根絶が示された。対照的に、生理食塩水対照マウスには生存可能な腫瘍細胞が存在した。

Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）により、腫瘍重量が有意に破壊され、低減し、処置したマウスの寿命が延長された。当該処置は、体重にも器官検査にもいかなる目に見える影響も及ぼさなかった。
（実施例９）

本実施例は、乳がん、卵巣がんおよび前立腺がん異種移植モデルにおけるペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３））有効性試験の記載を含む。

本明細書に記載のｉｎｖｉｔｒｏ試験により、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）が速効性作用剤であり、がん細胞を、接触して数分以内に死滅させることが実証された。標的化処置の最初の相におけるＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）の黒色腫異種移植片に対する有効性を決定するために、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）の単回注射後の黒色腫異種移植モデルにおけるＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を通じた細胞破壊のカイネティクスを試験した。

簡単に述べると、実施例１０に記載の通り、Ｎｕ／Ｎｕ雌マウス、非近交種、５週齢（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）の肩甲骨間領域に、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ（継代＃２４９）／Ｍａｔｒｉｇｅｌ懸濁液（細胞２．４×１０^６個／マウス）を注射した（ｓ．ｃ．）。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）（ＩＤ：３３８６１３ｌｏｔ＃Ｐ０８０４０１）（０．２ｍｇ／ｋｇ、および２ｍｇ／ｋｇ）を投薬前にＵＳＰ生理食塩水中に復元した。外側尾静脈を介した単回のボーラス静脈内注射として投薬を行った。

Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）または生理食塩水を用いた処置の１時間後、２時間後および１６時間後にマウスを屠殺した。試験終点において体重、腫瘍重量を決定し、腫瘍をリン酸緩衝剤１０％ホルマリン中に固定した。

腫瘍由来のＨ＆Ｅ染色した切片からの組織学的評価により、生理食塩水処置したマウスでは多数の有糸分裂像を伴う生存可能な腫瘍細胞が示された。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を用いた処置では、０．２ｍｇ／ｋｇ用量および２ｍｇ／ｋｇ用量のどちらでも、注射後１時間という速さでＭＤＡ－ＭＢ－４３５Ｓ異種移植片由来の腫瘍の破壊が示された。

Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）により、投薬の１時間後という早期に腫瘍が破壊され、これにより、壊死を通じて細胞死を引き起こす速効性作用機序が示唆される。これらのデータから、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）が、腫瘍細胞が提示するＬＨＲＨ受容体との膜接触を通じて作用することが確認される。

ヒト疾患と似ている卵巣がん異種移植片に対するＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）の有効性を決定するために、単回投薬および複数回投薬試験を行った。機能的なＬＨＲＨ受容体を提示するＯＶＣＡＲ－３ヒト卵巣がん細胞株の異種移植モデルを本試験に使用した。ＯＶＣＡＲ－３は、成長が遅い異種移植モデルであり、腫瘍マーカー（がん抗原１２５、またはＣＡ１２５）を分泌する。その分泌は、処置応答として使用され得、また、薬物活性の評価基準である。

この異種移植試験の目的は、卵巣がんモデルにおけるＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を試験すること、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）が、単回の週１回の注射として、多剤耐性、成長が遅い腫瘍モデルにおいてｉｎｖｉｖｏで効果的であるかどうかを決定することであった。簡単に述べると、Ｎｕ／Ｎｕ雌マウス、近交系、５週齢（Ｈａｒｌａｎ－ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ）に、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ－３細胞／Ｍａｔｒｉｇｅｌ懸濁液を皮下注射した（細胞４．６×１０^６個／マウス）。処置を、腫瘍細胞の注射後３３日目、腫瘍が定着した時に開始し、４１日目および４７日目に継続した。３回の週１回の注射の用量は体重１ｋｇ当たり０．０２ｍｇ、０．２ｍｇおよび２ｍｇであり、外側尾静脈を介した単回のボーラス静脈内注射として週に１回、３週間にわたって、３３日目、４１日目および４７日目に投与した。５２日目に剖検を行った。データは平均±ＳＥＭとして表される。矢印は投薬を示す。

処置群には、生理食塩水対照（Ｎ＝１０）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）（３３８６１３、Ｖ０９１０８Ｘ１）（０．０２（Ｎ＝１０）、０．２（Ｎ＝１０）、および２ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝９））、ならびにコンジュゲートしていないＰｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１（ＡＰＣ３３８９８３、Ｌｏｔ＃Ｖ０４００４Ｘ１）（２ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝１０））、生理食塩水中シスプラチン／ＣＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃａｔ２３２１２０、Ｄ０００５４９５）（１０ｍｇ／ｋｇ、３ｑｄ（Ｎ＝１０））、ベースライン（Ｎ＝９）を含めた。

ある１つの腫瘍担持マウス９匹の群を３３日目に屠殺し、ベースライン群として機能させた。腫瘍細胞の注射の５１～５２日後に全てのマウスの剖検を行った。腫瘍体積および体重を試験の間、週２回記録しただけでなく、全体的な獣医師によるマウスの検査も行った。

原発腫瘍、肝臓、腎臓、膵臓、心臓、肺、および脾臓を採取し、ホルマリン中に固定し、組織学的評価のために調製した。腫瘍重量を剖検時に測定し、ＬＨ／ＣＧおよびＬＨＲＨ受容体アッセイ決定のために腫瘍の一部を－８０℃で凍結させた。

薬物活性についてのバイオマーカーとして、剖検時に個々のマウスそれぞれから採取した血清中のＣＡ１２５を、卵巣がん抗原ＣＡ１２５の定量的決定のための酵素結合免疫測定法（ＡｓｓａｙｋｉｔＧｅｎｗａｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、カタログ番号４０－０５２－１１５００９、＃ＢＣ－１０１３、製造者に従って）を使用して決定した。

ホルマリン固定した腫瘍からＬＨＲＨ受容体レベルを評価した。双方向顕微鏡（ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ）に機能的に接続されたＶｅｎｔａｎａＩｍａｇｅＡｎａｌｙｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（ＶＩＡＳ）付属コンピュータ支援画像解析システムを用いて定量的免疫ペルオキシダーゼ画像解析を行った。形態計測分析および比色定量分析を含む、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体を数量化するためのプログラムを用いて定量的分析を行った。受容体の状態の結果を、以下の基準の下で、ＬＨＲＨ受容体の陽性染色を示す細胞のパーセンテージとして報告した：０；非免疫反応性、１＋：１～２５％陽性、２＋：２６～５０％陽性、３＋：５１～７５％陽性細胞。

全てのマウス群で注射に対する十分な忍容性が示された。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を２ｍｇ／ｋｇ用量で用いた最初の注射中に１匹のマウスが死亡した。死亡は急性事象であり、手順上のものであり、処置に関連するものではなかった。他の処置群のマウスは全て生存した。注射後１０分よりも後に注射の結果として死亡したマウスはいなかった。

Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を用いた処置の間に腫瘍体積が減少した。対照的に、ＣＬＩＰ７１を用いて処置したマウス、シスプラチンを用いて処置したマウスについて、または生理食塩水対照では、腫瘍成長が観察された。体重１ｋｇ当たり０．２ｍｇという低さの濃度のＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）で、腫瘍細胞の注射の４２日後に記録された腫瘍体積にベースラインと比較して低減が示された（ｐ＜０．００１）。

剖検時の腫瘍の特徴（腫瘍重量の中央値およびベースラインと比較した腫瘍重量の変化の中央値）を決定した。２ｍｇ／ｋｇおよび０．２ｍｇ／ｋｇの投薬量のＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）の群について、生理食塩水対照およびコンジュゲートしていないＰｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１と比較した腫瘍重量の低減（ｐ＜０．０５）が得られた。０．２ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）の群では腫瘍を有さないマウスが見出された。処置開始時と比較した腫瘍退縮として測定される処置応答は、０．２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を用いて処置したマウスにおいて最大であった（ベースラインに対してｐ＜０．０３）。シスプラチンおよびコンジュゲートしていないＰｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１は腫瘍重量を低減させることに関して効果的ではなかった。

生理食塩水対照で処置したマウス、ＣＬＩＰ７１で処置したマウスおよびシスプラチンで処置したマウスでは、不変の腫瘍成長が示された。ＣＡ１２５の血清中レベルは腫瘍重量に対応した（ｒ^２＝０．６６）。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）処置したマウスでは、生理食塩水対照と比較してＣＡ１２５分泌が低減し、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を０．２ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇで用いて処置したマウスにおいて最大であった（ｐ＜０．０００２）。

ＯＶＣＡＲ－３異種移植片を担持するマウスから０．０２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を用いた処置後に切除された腫瘍のサイズは、生理食塩水対照と比較して低減しており、壊死性であった。処置された腫瘍では、ＬＨＲＨ受容体レベルの１～２スコア点の低減が示された。ヘマトキシリン／エオシンで染色した腫瘍切片については、０．０２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を用いて処置した群において有意な壊死が示された。シスプラチンまたはＣＬＩＰ７１を用いて処置した、異種移植片を担持するマウスでは腫瘍体積、ＬＨＲＨ受容体レベルの低減は認められず、組織学的評価後に生存可能な腫瘍細胞が示された。

卵巣異種移植モデルにおいて、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を用いた処置により、腫瘍退縮、血漿中のＣＡ１２５腫瘍マーカーの低減、ＬＨＲＨ受容体レベルの低減および壊死が引き起こされた。したがって、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、多剤耐性卵巣がん異種移植片を破壊することに関して効果的である。

前立腺がん異種移植片に対するＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）の有効性を決定するために、急激に成長する異種移植モデルにおいてｉｎｖｉｖｏでのＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）の効果を試験した。ＰＣ－３異種移植片を処置しないことにより、マウスの有意な体重減少が引き起こされる。

簡単に述べると、Ｎｕ／Ｎｕ雄マウス、非近交種、６週齢（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ）に、ＰＣ－３細胞／Ｍａｔｒｉｇｅｌ懸濁液を皮下注射した（細胞１×１０^６個／マウス）。処置を、腫瘍細胞の注射後１５日目、腫瘍が定着した時に開始し、２２日目および２９日目に継続した。３回の週１回の注射の用量は、体重１ｋｇ当たり２ｍｇ、０．２ｍｇおよび０．０２ｍｇであり、外側尾静脈を介したボーラス単回静脈内注射として与えた。処置群には、生理食塩水対照（Ｎ＝１２）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）（ＡＰＣ３３８６１３Ｌｏｔ＃Ｖ０９１０８Ｘ１）（０．００２ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝１２）、０．０２ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝１２）、０．２ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝１２）および２ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝１２）、）、ならびにコンジュゲートしていないＰｈｏｒ１８＝ＣＬＩＰ７１（３３８９８３、Ｌｏｔ＃Ｖ０４００４Ｘ１）（５ｍｇ／ｋｇ（Ｎ＝１２）、ベースライン（Ｎ＝１２）を含めた。

ある１つの腫瘍担持マウス１２匹の群を１５日目に屠殺し、ベースライン群として機能させた。腫瘍細胞の注射の３５日後および３６日後に全てのマウスの剖検を行った。腫瘍体積および体重を試験の間、週２回記録しただけでなく、全体的な獣医師によるマウスの検査も行った。

全ての群で注射に対する十分な忍容性が示され、処置群の全てのマウスが生存した。注射の結果として死亡したマウスはいなかった。

ＰＨｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇの用量で用いた処置の間に腫瘍体積が減少した。ＣＬＩＰ７１を用いて処置したマウスについて、または生理食塩水対照では、腫瘍成長が観察された。体重１ｋｇ当たり０．００２ｍｇという低さの濃度のＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）で、腫瘍細胞の注射の２２日後に記録された腫瘍体積に生理食塩水対照およびＣＬＩＰ７１と比較して低減が示された（ｐ＜０．００１）。生理食塩水対照およびＣＬＩＰ７１による処置群と比較して腫瘍重量が有意に低減した（全てのＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）処置群に関して０．００１）。

ＰＣ－３異種移植片は、ヌードマウスにおいて体重減少を引き起こすことが分かっている。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）で処置したマウスでは、０．００２ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇのＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）を用いて処置した群では、生理食塩水対照およびＣＬＩＰ７１注射と比較して腫瘍体積が減少した。剖検時の腫瘍重量の中央値が生理食塩水対照およびＣＬＩＰ７１と比較して有意に低減した（ｐ＜０．００１）。対照群のマウスは、処置したマウスと比較して、悪液質であり、１０ｇを超える体重減少を受けた。

Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、ＰＣ－３異種移植片における腫瘍成長を抑止すること、および腫瘍負荷に起因する重度の体重減少を防止することに関して効果的である。コンジュゲートしていないＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は効果的ではない。

要するに、前述の試験により、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧ（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３））が、ｉｎｖｉｖｏにおいて、乳がん、卵巣がんおよび前立腺がん異種移植片を破壊することに関して効果的であることが示される。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）により、処置したマウスにおける腫瘍壊死が引き起こされ、壊死は注射の１時間後という早期に明らかになる。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）は、単回の週１回の処置レジメンとして効果的であり、壊死を誘導し、腫瘍重量の低減を引き起こす。複数回の週１回のレジメンとしては、残留する腫瘍細胞の破壊を含めた腫瘍の根絶がより明らかである。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３３８６１３）での処置後に、標的細胞破壊と一致して、ＬＨＲＨ受容体レベルの低減が引き起こされる。
（実施例９）

免疫チェックポイント阻害剤により、多数のがんの処置が改革されたが、そのような治療の有効性は卵巣がんでは限定されている。黄体形成ホルモン放出ホルモン受容体（ＬＨＲＨ－Ｒ）を標的とする合成溶解性ペプチドであるＥＰ－１００の、卵巣がんモデルおよび乳がんモデルにおける免疫治療に対する効果を、チェックポイント阻害剤の存在下または非存在下で分析した。結果が一部、図１４～２１に例示されている。
材料および方法

細胞株－認証された細胞株を供給しているＭＤＡｎｄｅｒｓｏｎＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄＣｅｌｌＬｉｎｅＣｏｒｅＦａｃｉｌｉｔｙからのマウス卵巣がん細胞株ＩＤ８、ＩＧ１０、ＩＦ５、２Ｃ１２およびマウス乳がん細胞株ＥＭＴ－６。

サイトカインアレイ－培養細胞からの上清を、サイトカインを測定するためのバッチ分析のために－２０℃で保管した。マウスサイトカインアレイ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を購入し、実験群において１１１種のサイトカインの分泌を検出するために使用した。これらのＰｒｏｔｅｏｍｅＰｒｏｆｉｌｅｒＡｒｒａｙｓを製造者のプロトコールに従って実施した。

卵巣がん同所性同系マウスモデル－８～１２週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＴａｃｏｎｉｃＦａｒｍｓから購入し、ＩＤ８細胞またはＩＧ１０細胞をマウス当たり０．２ｍＬ当たり細胞２×１０^６個の濃度でＣ５７ＢＬ／６に腹腔内注射した。全てのマウス試験はＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅに承認されたものであり、ＡｍｅｒｉｃａｎＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｆｏｒＡｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓにより定められたガイドラインに従って世話をした。がん細胞の注射後、マウスを４つの処置群にランダムに分けた：１）無処置対照、２）ＰＤ－Ｌ１抗体（２００μｇ／ｋｇを腹腔内に週に２回）、３）ＥＰ－１００（０．２ｍｇ／ｋｇを静脈内に週に２回）および４）ＰＤ－Ｌ１抗体プラスＥＰ－１００。処置をがん細胞の腹腔内注射の１０日後に開始した。

免疫プロファイリングアッセイ－脾細胞および腫瘍由来の単一細胞懸濁液の免疫表現性の分析をフローサイトメトリーによって評価した。ＭＤＳＣの染色のための抗体は、ＣＤ１１ｂ－ＡＰＣ（クローンＭ１／７０；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｌｙ６Ｇ－ＦＩＴＣ（クローン１Ａ８；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＬｙ６Ｃ－ＰＥ（クローンＡＬ－２１；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。Ｔ細胞活性化マーカーとして、細胞を、ＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ７に特異的な抗体（クローンＲＭ４－５；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７に特異的な抗体（クローン５３－６．７；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ６２Ｌ－ＰＥに特異的な抗体（クローンＭＥＬ－１４；ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＤ４４－ＦＩＴＣに特異的な抗体（クローンＩＭ７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でのフローサイトメトリー分析のために、１％ホルマリンを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に固定した。

結果から、（１）ＥＰ－１００が、ＬＨＲＨ－Ｒを発現するがん細胞を低マイクロモル濃度レベルで急速に死滅させること；（２）ＥＰ－１００処置により、ＩＬ－１α、ＩＬ－３３、ＣＣＬ２０、ＶＥＧＦおよびＬＤＬＲレベルならびにＣＤ８＋Ｔ細胞活性化が有意に増大すること；（３）ＥＰ－１００により、ｉｎｖｉｖｏで好都合な腫瘍溶解環境が誘導されること；（４）ＥＰ－１００とチェックポイント阻害剤の組合せが、ｉｎｖｉｖｏにおいて相乗効果を有し、腫瘍溶解の増大（ＣＤ８＋Ｔ、ＮＫＤＣおよびＭΦ）ならびに免疫阻害集団（Ｔｒｅｇ、ＢおよびｍＭＤＣ）の減少が実証されること；ならびに（５）ＥＰ－１００により誘導されるＩＬ３３がＣＤ８^＋細胞活性化において主要な役割を果たすことが示される。
単一作用剤の有効性マウス乳がん細胞株ＥＭＴ－６におけるＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ

指数関数的に成長しているマウスがん細胞株（ＥＭＴ－６；トリプルネガティブマウス乳がん細胞株、継代５）をＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ、ＷｉｌｍｉｎｇｔｏｎＭＡから入手し、１０％ウシ胎仔血清および２ｍＭのグルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、および２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを補充したＥａｇｌｅ’ｓＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）中、凍結ストックから増幅させた。細胞培養物を組織培養フラスコ中、加湿インキュベーター内、３７℃、５％ＣＯ_２および９５％空気の雰囲気中で維持した。細胞解離緩衝剤を使用して細胞を放出させ、不透明な９６ウェルプレートにウェル当たり細胞２，０００個の密度で播種し、完全培養培地中で２４時間インキュベートした。

Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（ＡＰＣ３３８６１３、Ｌｏｔ＃Ｗ０１１０７Ｃ１）またはコンジュゲートしていないＰｈｏｒ１８（ＡＰＣ３３８９８３、ＳＹ０９０７６Ｃ）を０．０２μＭ、０．０６μＭ、０．２μＭ、０．６μＭ、１．８５μＭ、５．５μＭ、１６．６μＭ、５０μＭおよび１００μＭの濃度で、２つの異なるプレートに４連で（Ｎ＝８）添加することによって処置を開始した。対照は、それぞれ０％細胞死および１００％細胞死についての参照としてＵＳＰ生理食塩水または０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（商標）で処置した。４時間のインキュベーション後および８時間のインキュベーション後に細胞生存率を細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７２、ｌｏｔ＃３２６２８２）で測定した。ｉｎｖｉｔｒｏ毒性をＩＣ_５０値として、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍｖｅｒｓｉｏｎ５．００ｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏＣａｌｉｆｏｒｎｉａＵＳＡを使用して決定した。

マウス乳がん細胞株ＥＭＴ－６は、低マイクロモル濃度レベルのＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨに対して感受性をもち、ターゲティングされる（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ）とターゲティングされない溶解性ペプチド（Ｐｈｏｒ１８）の細胞株への曝露についての分離で実証される通り、ＬＨＲＨ受容体を通じて特異的に標的とされた（表６）。マウス乳がん細胞株ＥＭＴ－６に対するＩＣ_５０値は、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨについては４時間後および８時間後に５．８±０．２および５．７±０．１μＭであった。Ｐｈｏｒ１８は４時間後には毒性にならず、８時間後にＩＣ_５０値５５．８±１．６μＭに達した。

ＥＭＴ－６マウス乳房細胞株は、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨに対して感受性をもち、低マイクロモル濃度レベルで特異的に死滅した。この細胞株を、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨとチェックポイント阻害剤の組合せについてのｉｎｖｉｖｏ試験に適するものと決定した。
表6: EMT-6細胞株における4時間および8時間の時点でのPhor18-LHRHおよびPhor18の細胞傷害性

単一作用剤の有効性マウス卵巣がん細胞株におけるＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ

マウス卵巣がん細胞株（ＩＤ８、ＩＧ１０、ＩＦ５、および２Ｃ１２）を、１０％ウシ胎仔血清を伴うＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。細胞を９６ウェルプレートに典型的に播種し（ウェル当たり細胞３０００個）、培地を４８時間のインキュベーション後に交換した。各アッセイを０、０．３９、０．７８、１．５６、３．１２、６．２５、１２．５、２５、５０、および１００マイクロモル濃度用量という漸増濃度のＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（ＥＰ－１００）で行った。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを生理食塩水中に溶解させた凍結乾燥形態で準備し、細胞に添加した。インキュベーションの持続時間は３７℃で２４時間であった。２４時間後にルミノメトリックアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－０Ｇｌｏ２．０、Ｇ９２４３）を使用して細胞生存率を評価した。対照は、それぞれ０％細胞死および１００％細胞死についての参照として生理食塩水または０．１％トリトンを含有するものであった。

ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍｖｅｒｓｉｏｎ７．００ｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、ＳａｎＤｉｅｇｏＣａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してデータを処理し、解析した。有意性についての統計解析を両側スチューデントｔ検定によって決定した。各試験を、少なくとも６のうち３が実現されるように行った。

各細胞株、時点および試験した化合物についてのｉｎｖｉｔｒｏ活性を、Ｈｉｌｌ方程式（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｚｍｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して算出したＩＣ_５０値として表した。

単一作用剤Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ活性についての結果を表７に要約する。ＩＣ_５０値として測定されるｉｎｖｉｔｒｏ活性は、卵巣がん細胞株に対しては低マイクロモル濃度範囲内であった：ＩＤ８細胞株に対するＩＣ_５０値は１．３７μＭであり、ＩＧ１０細胞株に対するＩＣ_５０値は１．０３μＭであり、ＩＦ５細胞株に対するＩＣ_５０値は１．０１μＭであった。
表7:マウス卵巣がん細胞株におけるPhor18-LHRHのin vitro活性

結論

マウス卵巣がん細胞株は、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨに対して感受性であり、低マイクロモル濃度レベルで特異的に死滅した。これらの細胞株を、同系モデルにおけるＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨとチェックポイント阻害剤の組合せに適するものと決定した。
マウス卵巣がん細胞におけるＬＨＲＨ－Ｒの発現およびＥＰ－１００（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ）の細胞傷害効果

ＥＰ－１００のがん細胞に対する直接的な効果を同定するために、マウス卵巣がん細胞株をｉｎｖｉｔｒｏ実験に使用した。当該細胞株におけるＥＰ－１００の半数阻害濃度（ＩＣ_５０）は処置の７２時間後に１．０μＭから１．３μＭまでにわたった（図１４Ａおよび１４Ｂ）。ＲＴ－ＰＣＲおよびウエスタンブロット分析を使用したマウス卵巣がん細胞におけるＬＨＲＨ－Ｒの発現のレベル。図１４Ｃに示されている通り、ＬＨＲＨ－ＲはＩＤ８細胞、ＩＧ１０細胞、ＩＦ５細胞、２Ｃ１２細胞、および３Ｂ１１細胞において高度に発現した。以前の試験により、ＬＨＲＨ－Ｒが主に細胞膜上に発現されることが示唆されたので、細胞分画および免疫蛍光分析を実施した。実際に、ＬＨＲＨ－Ｒはがん細胞の膜に主に発現された（図１４Ｄおよび１４Ｅ）。ヒトＳＫＯＶ３ｉｐ１卵巣がん細胞および不死化マウス３Ｔ３線維芽細胞を陰性対照として使用した。
ＥＰ－１００（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ）によるＬＨＲＨ－Ｒ標的化の特異性

抗腫瘍ＥＰ－１００の有効性がＬＨＲＨ－Ｒ発現に特異的であるかどうかを決定するために、ｓｉＲＮＡを使用したＬＨＲＨ－Ｒのサイレンシングを行った（図１５Ａ）。図１５Ｂおよび１５Ｃに示されている通り、ＬＨＲＨ－Ｒがサイレンシングされた細胞はＥＰ－１００を用いた処置後に生存可能なままであったが、一方、非特異的ｓｉＲＮＡで処置した対照細胞は死滅した。さらに、ＬＨＲＨリガンドを欠くＣＬＩＰ－７１または酢酸リュープロリド単独を用いた処置には細胞傷害効果がなかった（図１５Ｄおよび１５Ｅ）。これらのデータから、マウス卵巣がん細胞がＥＰ－１００に対して感受性をもち、低マイクロモル濃度レベルでＬＨＲＨ－Ｒを通じて特異的に死滅したことが実証される。

結論：ＥＰ－１００の活性は、卵巣がん細胞株の表面上のＬＨＲＨ受容体の発現に依存的かつ高度に特異的であった。
ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＥＰ－１００（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ）のＰＤ－Ｌ１発現に対する効果

ＥＰ－１００の免疫活性化における潜在的な役割を決定するために、マウス卵巣がん細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現に対する効果をＥＰ－１００の存在下で決定した。図１６Ａおよび１６Ｂに示されている通り、ＩＤ８細胞およびＩＧ１０細胞におけるＰＤ－Ｌ１のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルがＥＰ－１００を用いた処置後にどちらも上昇した。ＰＤ－Ｌ１ｍＲＮＡは０．５μＭのＥＰ－１００という低さで４時間の処置で上昇し、ＰＤ－Ｌ１タンパク質は６時間の処置後に上昇した。

結論：ＥＰ－１００により卵巣腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１レベルが上昇した。
ＥＰ－１００（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ）とチェックポイント阻害剤αＰＤ－Ｌ１の単独でおよび組合せでのｉｎｖｉｖｏ有効性

試験物Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ単独でおよびチェックポイント阻害剤αＰＤ－Ｌ１（マウスモノクローナル抗体クローン１０Ｆ．９Ｇ２、ＢｉｏＸＣｅｌｌ、ＮｅｗＨａｍｐｓｈｉｒｅ、ＵＳＡ）との組合せでの、免疫適格性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける同所性ＩＤ８マウス卵巣癌同系モデルにおける腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）についての有効性を評価するために、ｉｎｖｉｖｏ試験を設計した。

雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ルシフェラーゼ標識されたＩＤ８（ＩＤ８－Ｌ）マウス卵巣がん細胞株（細胞１×１０^６個）を同所性に注射した。マウスを腫瘍取り込みについて発光イメージングシステムを使用してモニタリングした。処置を腫瘍細胞の注射後７日目に開始し、９日目、１２日目、１６日目、１９日目、２２日目、および２６日目に継続した（図１７Ａ）。凍結乾燥したＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨおよびαＰＤ－Ｌ１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、クローン１０Ｆ．９Ｇ２）を生理食塩水中に溶解させた。処置は以下の通りであった：生理食塩水対照、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（０．２ｍｇ／ｋｇ、静脈内注射）、αＰＤ－Ｌ１（２００μｇ／マウス、腹腔内注射）、およびＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨとαＰＤ－Ｌ１の組合せ。各処置群および対照群は１０匹のマウスからなった。２８日目の剖検時に、腹水を取り出して測定し、また、腫瘍を取り出して秤量した。

腹水（Ｎ＝３）および腫瘍組織（Ｎ＝３）に対して、試料を以下の方法によって処理し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって分析することにより、免疫細胞プロファイリングを行った。表８参照。細胞を氷上で３０分間インキュベートし、洗浄し、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターでのフローサイトメトリー分析のために、１％ホルマリンを含有するリン酸緩衝食塩水中に固定した。
表8:免疫細胞集団およびそれらのマーカー

処置群間の有意性を、ウィルコクソン符号順位検定解析およびＡＮＯＶＡを使用して評価した。
体重

マウスの全ての群で注射に対する十分な忍容性が示された。対照群および処置群の全てのマウスが生存した。体重は、３週間の処置期間の間、影響を受けなかった（図１７Ｃ）。
腫瘍体積

週１回の生物発光イメージングにより、腫瘍の発光計数の不変の増大が、対照群（９．２±１．２×１０^４から試験の最後の１８０．５±２４．３×１０^４まで）、単一作用剤抗ＰＤ－Ｌ１抗体群（９．２±１．２×１０^４から１１８．７±２８．７×１０^４まで）、および、低速度で、単一作用剤ＥＰ－１００群（９．２±１．２×１０^４から８８．６±２１．５×１０^４まで）において示された。別段の指定のない限り、報告された全ての値は平均±標準偏差（ＳＤ）である。ＥＰ－１００と抗ＰＤ－Ｌ１抗体の組合せにより、処置開始の１週間後の１４日目まで腫瘍成長が遅延し、腫瘍は９．２±１．２×１０^４から試験の最後の３０．７±４．３×１０^４まで増大した（ｐ＜０．００２）。
腫瘍重量

Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨおよびα－ＰＤ－Ｌ１の原発腫瘍に対する効果が図１７Ｄに例示されている。剖検時の腫瘍重量が、対照（平均±ＳＥＭ、１．０６±０．０８ｇ）と比較して、単一作用剤Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（０．４９±０．０７ｇ、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１０、ｐ＜０．００２）またはα－ＰＤ－Ｌ１（０．５４±０．０６、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１０、ｐ＜０．００２）を用いて処置した群において（図１７Ｄ）、およびＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨとα－ＰＤ－Ｌ１の組合せについて（０．２９±０．０３ｇ、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１０（対照に対してｐ＜０．０００９、単一作用剤に対してｐ＜０．０２）、低減した。腫瘍成長阻害に関しては中程度の有効性が示され、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨで処置したマウスについて６０．１％およびα－ＰＤ－Ｌ１で処置したマウスについて６０．１％であったが、一方、組合せ群（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ＋α－ＰＤ－Ｌ１）ではある程度の高い有効性が示され、８６．９％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）であった。
腹水体積

試験終点で各マウスについて腹水体積を決定した。ビヒクル対照の腹水体積は１２．２６±０．６ｍｌ、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１０であったが、一方、単一作用剤α－ＰＤ－Ｌ１の腹水体積はより少なく、１０．２±０．６ｍｌ（平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１０、対照に対してｐ＜０．０１）であり、一方、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨで処置した動物ではさらに低減した腹水体積が測定された（８．０±０．７ｍｌ、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１０、ｐ＜０．００４）（図１７Ｅ）。併用処置の結果、最低体積の腹水がもたらされ、５．６±０．４、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１０、対照に対してｐ＜０．０００１、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨおよびα－ＰＤ－Ｌ１に対してｐ＜０．０００６であった。腹水体積の相対的な低減はα－ＰＤ－Ｌ１処置群では１５％であり、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ処置群では３５．５％であった。併用群で最も高い低減が測定され、５８．４％であった。

結論として、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨは、単一作用剤として腫瘍体積、腫瘍重量および腹水体積を低減させた。腫瘍体積低減、腫瘍重量および腹水体積に対する最大の効果はＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨとα－ＰＤ－Ｌ１の組合せを用いた場合に得られ、これにより、ｉｎｖｉｖｏにおける相乗効果が示される。
腫瘍および腹水における免疫プロファイル

腫瘍における免疫プロファイルを、ＦＡＣＳ分析を使用して評価した（図１８）。値は、ＡＮＯＶＡ（分散分析）によって評価された有意性値を用いた平均±ＳＥＭとして示される。生細胞のＣＤ４５＋細胞画分は、対照腫瘍では８．１６±１．３％であり、α－ＰＤ－Ｌ１（１２．８３±１．１８％、対照に対してｐ＝０．７５）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（２６．１±５．２％、対照に対してｐ＜０．０３）では増大し、これは、併用群と異ならなかった（２２．５±５．８、対照に対してｐ＝０．０８）。以下の下位集団をＣＤ４５＋細胞に対する％として示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照における２．６±０．４％と比較して、α－ＰＤ－Ｌ１を用いて処置した腫瘍（１０．７±０．８％、対照に対してｐ＜０．００３）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを用いて処置した腫瘍（１５．５±０．８％、対照に対してｐ＜０．０００１）および併用群（１４．７±１．７％、対照に対してｐ＜０．０００２；Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨに対してｐ＜０．０１）において有意に増加した。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は対照群（１．１４±０．０９％）において最も高く、α－ＰＤ－Ｌ１を用いて処置した腫瘍では低減し（０．９１±０．１３％、対照に対してｐ＝０．４１）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを用いて処置した腫瘍では低減し（０．９５±０．１５％、対照に対してｐ＝０．５３）、併用群において最大の減少が示された（０．２３±０．０１％、対照に対してｐ＜０．００１２；Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨに対してｐ＜０．００５）。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、対照腫瘍では３．７６±０．１３％であり、α－ＰＤ－Ｌ１処置群では８．１６±０．３１％まで増加し（対照に対してｐ＝０．０６６）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨでは１０．６７±１．４％まで増加し（対照に対してｐ＜０．００７５）、併用群では１４．２７±１．８％に達した（対照に対してｐ＜０．００５）。マクロファージは、対照では１．６±０．０５％であり、α－ＰＤ－Ｌ１を用いて処置した腫瘍では増加し（６．６４±０．２％、対照に対してｐ＜０．００１）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを用いて処置した腫瘍では増加した（１０．１±０．１３％、対照に対してｐ＜０．０００１；α－ＰＤ－Ｌ１に対してｐ＜０．０１）。併用群の値はＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ群と同様であり、１１．３６±１．２％であった（対照に対してｐ＜０．０００１）。Ｂ細胞は、処置群のそれぞれにおいて有意性には到達せずに減少し、対照（１２．１４±０．９％）と比較して、α－ＰＤ－Ｌ１（１０．９±０．１６％、対照に対してｐ＝０．８７）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（１０．１±２．４％、対照に対してｐ＝０．６１）であり、併用群では最低であった（７．３±０．７６％、対照に対してｐ＝０．０９）。樹状細胞（ＤＣ）は、対照（１．８８±０．０３％）から、α－ＰＤ－Ｌ１を用いて処置した腫瘍で増加し（３．０１±０．１８％、対照に対してｐ＜０．００９）、一方、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ群で最高の増加が測定され（５．１２±０．３４％、対照に対してｐ＜０．０００１）、これは、併用群と同様であった（５．４３±０．４％、対照に対してｐ＜０．０００１）。単球骨髄性サプレッサー細胞（ｍＭＤＳＣ）は、対照（１．５±０．００６％）から、α－ＰＤ－Ｌ１を用いて処置した腫瘍において減少し（１．０１±０．１％、対照に対してｐ＜０．０１５）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを用いて処置した腫瘍において減少し（１．０１５±０．１５％、対照に対してｐ＜０．０２２）、併用群ではさらに減少した（０．３８±０．０３％、対照に対してｐ＜０．０００１；α－ＰＤ－Ｌ１に対してｐ＜０．００２）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の調節性Ｔ細胞に対する比は対照群で最低であり（２．２７±０．２６）、α－ＰＤ－Ｌ１を用いて処置した腫瘍では１１．０１±２．２まで増大し（対照に対してｐ＝０．２６）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ群では８倍の増大に達し、１５．５±２．５であったが（対照に対してｐ＜０．００１）、一方、併用群において最高の比が測定され、３０倍の増大であった（６５．２±１．４、対照に対してｐ＜０．０００９）。

結論として、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨは、単一作用剤として、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞および樹状細胞を活性化させた。調節性Ｔ細胞はＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨによって減少した。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨと抗ＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害剤の組合せにより、調節性Ｔ細胞がさらに低減した。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨにより、好都合な腫瘍溶解環境が生じ、腫瘍溶解の阻害に関連する免疫細胞が低減した。

腹水における免疫プロファイルを、ＦＡＣＳ分析を使用して評価した（図１８Ｂ）。値はＡＮＯＶＡ（分散分析）によって評価された有意性値を用いた平均±ＳＥＭとして示される。生細胞のＣＤ４５＋細胞画分は対照では１０．５±１．８％であり、α－ＰＤ－Ｌ１（１３．４±２．７％、対照に対してｐ＝０．７３）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（１５．６±２．１％、対照に対してｐ＝０．４）では増加し、併用群（１８．２±３．１、対照に対してｐ＝０．１３）と同様であった。以下の下位集団をＣＤ４５＋細胞に対する％として示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、対照における１．９±０．３％およびα－ＰＤ－Ｌ１で処置した群（２．８±０．３％、対照に対してｐ＝０．９６）と比較して、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（８．９±２．４％、対照に対してｐ＜０．０５）および併用群（９．９±２．５％、対照に対してｐ＜０．０２）からの腹水において有意に増加した。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は対照群において最も高く（０．７６±０．０８％）、α－ＰＤ－Ｌ１を用いて処置した群からの腹水（０．５６±０．０５％、対照に対してｐ＝０．１２）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを用いて処置した群からの腹水（０．５±０．０５％、対照に対してｐ＜０．０４）では減少し、併用群で最大の減少が示された（０．２±０．０５％、対照に対してｐ＜０．０００５；Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨに対してｐ＜０．０２）。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、対照群では１０．３±０．８％であり、α－ＰＤ－Ｌ１処置群では１２．６±０．９％まで増加し（対照に対してｐ＝０．５）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨでは１０．２±０．０８％であり（対照に対してｐ＝０．９）、併用群では１４．８±２．３％に達した（対照に対してｐ＝０．１）。マクロファージは、対照では２３．８±５．１％であり、α－ＰＤ－Ｌ１を用いて処置した群からの腹水では減少し（１６．８±０．８％、対照に対してｐ＝０．１２）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨでは対照と同様であった（２５．６±０．７％、対照に対してｐ＝０．９３）。併用群の値もα－ＰＤ－Ｌ１群と同様であり、１８．１１±０．５％であった（対照に対してｐ＝０．３４）。Ｂ細胞は、処置群のそれぞれにおいて有意性に到達せずに数値的に減少し、対照（９．８±１．８％）と比較して、α－ＰＤ－Ｌ１（３．３±０．２％、対照に対してｐ＜０．００２８）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（１．５±０．１４％、対照に対してｐ＜０．０００６）であり、併用群についても同様であった（２．１±１２％、対照に対してｐ＝０．０００９）。樹状細胞（ＤＣ）は、対照（１８．５±１．１％）から、α－ＰＤ－Ｌ１（１５．８±１．１％、対照に対してｐ＝０．１３）、およびＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ群（１５．１±０．２％、対照に対してｐ＜０．０４）を用いて処置した群の腹水において増加し、併用群ではより減少した（１２．７±０．１％、対照に対してｐ＜０．００３）。単球骨髄性サプレッサー細胞（ｍＭＤＳＣ）は、対照（０．６２±０．０８％）から、α－ＰＤ－Ｌ１を用いて処置した腫瘍において減少し（０．１８±０．０２％、対照に対してｐ＜０．００３）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを用いて処置した腫瘍において減少し（０．２１±０．０１％、対照に対してｐ＜０．０００５）、併用群ではさらに減少した（０．１９±０．０１％、対照に対してｐ＜０．０００３）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の調節性Ｔ細胞に対する比は、対照群において最低であり（２．６±０．６）、α－ＰＤ－Ｌ１を用いて処置した群では５．０７±０．８まで増加し（対照に対してｐ＝０．９）、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ群では７倍の増加に達し、１７．３２±４．１（対照に対してｐ＜０．００７）であり、一方、併用群において最高の比が測定され、２３倍の増加であった（６０．８±２５．７、対照に対してｐ＜０．０３；α－ＰＤ－Ｌ１に対してｐ＜０．０４）。

これらのデータから、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨにより、ＣＤ８Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージが増加し、一方でＴｒｅｇ細胞、Ｂ細胞、ｍＭＤＳＣ細胞などの免疫阻害性細胞が抑制されたことによって示される通り、腫瘍溶解に好都合である環境が促進されることが示される。

要約すると、同系マウス卵巣がんモデル（ＩＤ８）におけるＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨとチェックポイント阻害剤であるα－ＰＤ－Ｌ１の組合せは、単一作用剤と比較して、生腫瘍サイズの低減（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ＋α－ＰＤ－Ｌ１（８．５分の１）＞Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（２．１分の１）＞α－ＰＤ－Ｌ１（１．５分の１））、腫瘍重量の低減（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ＋α－ＰＤ－Ｌ１（５．３分の１）＞α－ＰＤ－Ｌ１＝Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（３分の１）および腹水の低減（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ＋α－ＰＤ－Ｌ１（２．２分の１）＞Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（１．５分の１）に関してより効果的であり、単一作用剤α－ＰＤ－Ｌ１についての変化はわずかで、１．２分の１への低減であった。この効果は、エフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞（ＤＣ）およびマクロファージを増加させ、一方でＴｒｅｇ細胞、Ｂ細胞およびマウスＭＤＣ細胞などの免疫抑制性集団を低減させることによって微小環境を腫瘍溶解に向かって好都合に変化させる、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨによる免疫モジュレーションによって駆動された。単一作用剤Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨによりＣＤ８Ｔ／Ｔｒｅｇ比が８倍に増大したが、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨをα－ＰＤ－Ｌ１と組み合わせて用いた場合に実質的により大きな増大が観察され、２３～３０倍の増大がもたらされた。
結論

ＥＰ－１００（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ）とチェックポイント阻害剤であるα－ＰＤ－Ｌ１の組合せにより、処置応答が改善され、阻害因子が低減する一方で腫瘍溶解因子が増加することによって免疫系がモジュレートされ、この組合せを卵巣がん患者に使用することができる。
卵巣がんの別のマウスモデルにおけるＥＰ－１００（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ）およびチェックポイント阻害剤であるαＰＤ－Ｌ１の単独でおよび組合せでのｉｎｖｉｖｏ有効性。

本ｉｎｖｉｖｏ試験は、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨの単独でおよびチェックポイント阻害剤であるαＰＤ－Ｌ１（１０Ｆ．９Ｇ２）との組合せでの、免疫適格性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける同所性ＩＧ１０マウス卵巣癌同系モデルにおける腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）に対する有効性を評価するために設計された。

雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ルシフェラーゼ標識されたＩＧ１０マウス卵巣がん細胞株（細胞１×１０^６個）を同所性に注射した。マウスを、腫瘍取り込みについて発光イメージングシステムを使用してモニタリングした。処置を腫瘍細胞の注射後１０日目に開始し、９日目、１２日目、１６日目、１９日目、２２日目、および２６日目に継続した。凍結乾燥したＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨおよびαＰＤ－Ｌ１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、クローン１０Ｆ．９Ｇ２）を生理食塩水中に溶解させた。処置は以下の通りであった：生理食塩水対照、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（０．２ｍｇ／ｋｇ、静脈内注射）、αＰＤ－Ｌ１（２００μｇ／マウス、腹腔内注射）、およびＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨとαＰＤ－Ｌ１の組合せ。各処置群および対照群は１０匹のマウスからなった。２８日目の剖検時に、腹水を取り出して測定し、また、腫瘍を取り出して秤量した。

マウスの全ての群で注射に対する十分な忍容性が示された。対照群および処置群の全てのマウスが生存した。体重は、３週間の処置期間の間、影響を受けなかった（データは示していない）。
腫瘍重量

Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨおよびα－ＰＤ－Ｌ１の原発ＩＧ１０腫瘍に対する効果を以下に記載する。剖検時の腫瘍重量は対照（平均±ＳＥＭ、１．０４±０．０９ｇ）と比較して、単一作用剤Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ（０．４５±０．０８ｇ、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１０、ｐ＜０．０２）またはα－ＰＤ－Ｌ１（０．６２５±０．０８、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１０、ｐ＜０．０１）を用いて処置した群において、およびＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨとα－ＰＤ－Ｌ１の組合せ（０．２６±０．１ｇ、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１０（対照に対してｐ＜０．０００１、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨに対してｐ＝０．０７、ＰＤ－Ｌ１に対してｐ＜０．０３））について、低減した。腫瘍成長阻害に関してはα－ＰＤ－Ｌ１で処置したマウスでは４０％の低い有効性が示され、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨで処置したマウスでは５３．６％の中程度の有効性が示されたが、一方、併用群（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ＋α－ＰＤ－Ｌ１）では高い有効性が示され、７５．４％の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）であった。
腹水体積

腹水体積は、卵巣がんに関する疾患重症度の指標である。腹水体積を試験終点で各マウスについて決定した。ビヒクル対照の腹水体積は９．０６±１．３ｍｌ、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１０であったが、一方、単一作用剤α－ＰＤ－Ｌ１では腹水体積がより低く、７．３±０．５ｍｌであり（平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１０、対照に対してｐ＝０．３）、一方、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨで処置した動物ではさらに低減した腹水体積が測定された（３．６±０．７ｍｌ、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１０、ｐ＜０．００６）。併用処置により、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ処置群と腹水と同様の体積がもたらされ、３．４±０．５、平均±ＳＥＭ、Ｎ＝１０、対照に対してｐ＜０．０１５、α－ＰＤ－Ｌ１に対してｐ＜０．０１５であった。腹水体積の相対的な低減はα－ＰＤ－Ｌ１処置群では１８．８％であった。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ処置群（６０．２％）および併用群（６２．４％）において最も高い低減が測定された。

結論として、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨは、単一作用剤として、腫瘍重量および腹水体積を低減させた。腫瘍重量および腹水体積に対する最大の効果はＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨとα－ＰＤ－Ｌ１の組合せで得られ、これにより、第２のマウス卵巣がんモデルにおいて確認されたｉｎｖｉｖｏにおける相乗効果が示される。
ＥＰ－１００（Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ）のサイトカインおよびケモカインに対する効果

ＥＰ－１００のサイトカインおよびケモカインに対する効果を、ＩＤ８卵巣がん細胞におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化に関するプロテオームプロファイラーマウスサイトカインアレイを使用して分析した。図１９Ａに示されている通り、ＥＰ－１００により、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ＣＸＣＬ１０、ＩＬ１α、ＣＣＬ２０、ＶＥＧＦ、ＩＬ３３、およびＬＤＬ受容体を含めた種々の分子の分泌が増加した。ＬＩＦおよびＣＸＣＬ１０分泌は、ＥＰ－１００を用いて４時間処置した後に減少した。ＬＤＬ受容体分泌はＥＰ－１００により、２時間時点および１２時間時点で増加し、一方、ＩＬ１α、ＣＣＬ２０、ＶＥＧＦ、およびＩＬ３３はＥＰ－１００処置後に分泌された（図１９Ｂ）。サイトカインの中で、ＩＬ３３により腫瘍成長が阻害され、腫瘍微小環境が改変された。ＲＴ－ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡを使用して、ＥＰ－１００によるＩＬ３３の誘導を分析した。ＩＬ３３ｍＲＮＡ発現がＥＰ－１００処置後の３０分のうちに増大し、ＥＰ－１００処置の２時間後に分泌が増加し、この効果は１２時間まで継続した（図１９Ｃおよび１９Ｄ）。しかし、ＩＬ３３を標的とするｓｉＲＮＡを使用したＩＬ３３のサイレンシングは、ＩＤ８細胞およびＩＧ１０細胞における細胞アポトーシスにも生存率にも影響を及ぼさなかった。ｉｎｖｉｔｒｏにおいてＩＬ３３分泌はＥＰ－１００によって増加したが、抗ＰＤ－Ｌ１抗体では増加しなかった（図１９Ｄ）。腫瘍微小環境におけるＩＬ３３の役割を決定するために、ｉｎｖｉｔｒｏにおけるＩＬ３３のＴ細胞分化に対する効果を試験した。ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞をマウス腎臓から単離し、ＣＤ３およびＣＤ２８、およびマウスＩＬ－２含有培地中で５日間さらに培養して、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を分化させた。ＬＨＲＨ－ＲｍＲＮＡ発現およびＥＰ－１００に誘導される細胞傷害効果はナイーブＴ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞のどちらにおいてもＩＤ８細胞におけるものよりも低かった（図２０Ａおよび２０Ｂ）。ＥＰ－１００で処置した細胞由来の条件培地（ＣＭ）を用いて処置した細胞では、対照よりもＣＤ８^＋Ｔ細胞の割合が有意に高いが（１７．３±１．１対１２．３±１．１、ｐ＝０．０４）、ＩＬ３３－サイレンシングされたＩＤ８細胞由来のＣＭではＴ細胞活性化に対する有意な効果が認められない（図２０Ｃ）ことが見出された。

結論として、ＥＰ－１００により、腫瘍微小環境への免疫細胞の誘引に影響を及ぼすサイトカインおよびケモカインが誘導された。サイトカインＩＬ３３はＥＰ－１００とのインキュベーション後に顕著に増加し、腫瘍の免疫原性の増大に関連付けられる。
ｉｎｖｉｖｏ有効性マウス乳がんモデルにおける腫瘍成長遅延試験

試験物Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨの、単独でおよびチェックポイント阻害剤である抗ＣＴＬＡ－４抗体９Ｈ１０（抗ＣＴＬＡ－４）との組合せでの、免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＥＭＴ－６マウス乳癌同系モデルにおける腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）に対する有効性を評価するために、ｉｎｖｉｖｏ試験を設計した。

本試験は、ＥＭＴ－６腫瘍細胞（平均体積：６１～８５ｍｍ^３）が埋め込まれた雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの６つの有効性群（ｎ＝１０）および３つの試料採取群（ｎ＝５）からなった。特に断りのない限り、投薬を試験１日目（Ｄ１）に開始した。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを０．４μｇ／動物または１０μｇ／動物のいずれかで静脈内（ｉ．ｖ．）に、２日に１回、合計８回の投薬（ｑ．ｏ．ｄ．×８）で送達した；その後、Ｄ１７から開始して、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨをｑ．ｏ．ｄ．で終了まで（１７日目に開始）、２０μｇ／動物または６０μｇ／動物のいずれかで投与した。抗ＣＴＬＡ－４を２日目に１００μｇ／動物で、ならびに５日目および８日目に５０μｇ／動物でｉ．ｐ．投与した。

群１マウスは対照としての機能を果たし、ｉ．ｖ．生理食塩水（ビヒクル）を、ｑｏｄで終了まで受けた。群２は抗ＣＴＬＡ－４を受けた。群３はＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを０．４μｇ／動物、ｑｏｄ×８で受け、その後、２０μｇ／動物、ｑｏｄで終了まで受けた（１７日目に開始）。群４は、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを１０μｇ／動物、ｑ．ｏ．ｄ．×８で受け、その後、６０μｇ／動物、ｑｏｄで終了まで受けた（１７日目に開始）。群５は、抗ＣＴＬＡ－４と組み合わせて、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを０．４μｇ／動物、ｑ．ｏ．ｄ．×８で受け、その後、２０μｇ／動物、ｑｏｄで終了まで受けた（１７日目に開始）。群６は、抗ＣＴＬＡ－４と組み合わせて、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを１０μｇ／動物、ｑｏｄ×８で受け、その後、６０μｇ／動物、ｑｏｄで終了まで受けた（１７日目に開始）。

試験終点は、腫瘍体積２０００ｍｍ^３または４５日間のいずれか最初に達した方であった。腫瘍測定を週２回、Ｄ４５まで行い、個々の動物は腫瘍体積終点に到達すると試験から離脱した。

処置したマウスにおける、対照マウスに対する、腫瘍成長遅延（ＴＧＤ）、終点までの時間の中央値の増大（ＴＴＥ）から、およびログランク解析を使用した生存曲線の比較から、有効性を決定した。応答を、試験生存動物の数、部分的な退縮（ＰＲ）および完全な退縮（ＣＲ）応答、ならびに生存数の差異のログランク有意性に基づいてさらに評価した。種々の処置の忍容性を、体重（ＢＷ）測定値ならびに臨床症状および処置に関連する（ＴＲ）副作用の頻繁な観察によって評価した。

４つの試料採取群は、５匹の動物からなり、それぞれを本試験に含めた：生理食塩水対照、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ単独で０．５ｍｇ／ｋｇ用量、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ＋抗ＣＴＬＡ４。これらの群の動物を１７日目に屠殺し、腫瘍を切除し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋して、腫瘍の組織学的評価のためのＨ＆Ｅ染色切片を得た。腫瘍試料を分析のために採取し、病理学的評価のためにヘマトキシリン＆エオシンで染色した。

対照群１における１０の腫瘍全てが体積終点に到達し、ＴＴＥ中央値は１６．５日であり、４５日の試験において２８．５日の最大Ｔ－Ｃ（１７３％ＴＧＤ）が確立された。対照ＴＴＥは１５．８日から１７．９日までにわたり、高感度のアッセイがもたらされた。抗ＣＴＬＡ－４単独療法ではＴＴＥ中央値２６．１日がもたらされ、穏当であるが有意な５８％ＴＧＤ（ｐ＜０．００１、ログランク）が付随した。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを０．４μｇ／動物および２０μｇ／動物で用いた処置では、ＴＴＥ中央値１７．５日がもたらされ、有意ではない６％ＴＧＤが付随した。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを１０μｇ／動物および６０μｇ／動物で用いた処置では、ＴＴＥ中央値１７．４日がもたらされ、有意ではない５％ＴＧＤが付随した。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを０．４μｇ／動物および２０μｇ／動物で用い、ならびに抗ＣＴＬＡ－４を用いた併用療法では、ＴＴＥ中央値３０．６日または８５％ＴＧＤがもたらされた。併用療法による生存の延長は、対照およびＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨで処置した動物のどちらと比較した場合も有意であったが（両方の比較についてｐ＜０．００１、ログランク）、抗ＣＴＬＡ－４単独で処置した動物と比較した場合には有意ではなかった。

Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ、１０μｇ／動物および６０μｇ／動物と抗ＣＴＬＡ－４の併用療法では、ＴＴＥ中央値２７．５日または６７％ＴＧＤがもたらされた。１匹の動物の死亡が見出され、これは原因不明（ＮＴＲｕ）であると判定された。Ｄ４５に１匹の動物では腫瘍体積が無視できるものであった；この動物はＣＲを有し、腫瘍を有さない生存動物（ＴＦＳ）であるとみなされた。併用療法による生存の延長は、対照およびＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨで処置した動物のどちらと比較した場合にも有意であったが（両方の比較についてｐ＜０．００１、ログランク）、抗ＣＴＬＡ－４単独で処置した動物と比較した場合には有意ではなかった。

１５日目に、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ、１０μｇ／動物および６０μｇ／動物と抗ＣＴＬＡ－４の組合せでは、抗ＣＴＬＡ４単独（６０．２％）と比較してより大きな腫瘍成長阻害（ＴＧＩ８４．９％）が示された。１５日目に併用群において腫瘍体積が有意に縮小した（ｐ＝０．０２）（図２１）。

１７日目に屠殺した動物５匹からの腫瘍の組織学的評価により、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨの存在により、炎症性免疫細胞浸潤および壊死が引き起こされ、これが、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨを抗ＣＴＬＡ４と組み合わせた場合に増大し、広範囲にわたる壊死および細胞浸潤が示されることが示された。

結論として、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨと抗ＣＴＬＡ４の組合せにより、単一作用剤による処置と比較して、１５日目までに、相乗的な腫瘍成長阻害が示された。併用群では生存が増大した。Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨおよび抗ＣＴＬＡ４を用いて処置したマウスの腫瘍ではＰｈｏｒ１８－ＬＨＲＨ単独と比較して、免疫細胞浸潤の有意な増大が示された。これらの結果から、Ｐｈｏｒ１８－ＬＨＲＨとチェックポイント阻害剤の組合せにより、腫瘍微小環境が免疫応答に向かって有意にモジュレートされることが示される。

Claims

細胞の増殖を低減させるまたは阻害する方法であって、前記細胞に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、前記細胞の増殖を低減させるまたは阻害するために十分な量で接触させるステップを含み、前記融合構築物が、第１のドメインと第２のドメインとを含み、前記第１のドメインが、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２８アミノ酸の配列、または、Ｋ残基の１つもしくは複数がＦ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、Ｆ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ａ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、もしくはＡ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ｆ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２５アミノ酸の配列からなり、前記第２のドメインが、結合性部分を含む、方法。
前記第１のドメインが、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるアミノ酸配列；または、Ｋ残基の１つもしくは複数がＦ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、Ｆ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ａ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、もしくはＡ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ｆ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の方法。
前記結合性部分が、受容体、リガンド、または抗原に結合する、請求項１または２に記載の方法。
前記受容体、前記リガンド、または前記抗原が、前記細胞上に発現されるものである、請求項３に記載の方法。
前記リガンドが、受容体アゴニストまたはアンタゴニストを含む、請求項３または４に記載の方法。
前記細胞が、過剰増殖細胞である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、新生物細胞、腫瘍細胞、がん細胞または悪性細胞である、請求項６に記載の方法。
前記細胞が、乳房細胞、卵巣細胞、子宮細胞、子宮頸部細胞、前立腺細胞、精巣細胞、副腎細胞、下垂体細胞または子宮内膜細胞である、請求項６に記載の方法。
前記細胞が、受容体、リガンド、または抗原を発現する、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、ホルモンまたはホルモン受容体を発現する、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、性もしくは性腺ステロイドホルモンまたは性もしくは性腺ステロイドホルモン受容体を発現する、請求項１から１０までのいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ、ヤツメウナギＩＩＩ黄体形成ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモンベータ鎖、黄体形成ホルモン、絨毛膜ゴナドトロピン、絨毛膜ゴナドトロピンベータサブユニット、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ドーパミン、ソマトスタチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、グルココルチコイド、エストロゲン、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プロゲステロン、アンドロゲン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ビタミンＨ、葉酸塩、トランスフェリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、エンドセリン、ボンベシン、成長ホルモン、血管作用性小腸ペプチド、ラクトフェリン、インテグリン、神経増殖因子、ＣＤ－８、ＣＤ－３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＲＯＲ１、ＩＧＦ－１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＡ１２５（残留上皮性卵巣がん）、可溶性インターロイキン２（ＩＬ－２）受容体、ＲＡＧＥ－１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、メランＡ／ＭＡＲＴ－１、糖タンパク質（ｇｐ）７５、ｇｐ１００、ベータカテニン、ＰＲＡＭＥ、ＭＵＭ－１、ＺＦＰ１６１、ユビキチン－１、ＨＯＸ－Ｂ６、ＹＢ－１、オステオネクチン、ＩＬＦ３、葉酸またはその誘導体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーメンバー、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ－ベータ（リンホトキシン、ＬＴ）、ＴＲＡＩＬ、Ｆａｓ、ＬＩＧＨＴ、４１ＢＢ、トランスフォーミング増殖因子アルファ、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インスリン、セルロプラスミン、ＨＩＶ－ｔａｔ、ＲＧＤ配列モチーフを含むペプチドもしくはタンパク質、単糖、二糖、オリゴ糖、シアル酸、ガラクトース、マンノース、フコース、またはアセチルノイラミン酸、またはこれらの類似体に結合する受容体を発現する、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）に結合する受容体を発現する、請求項１から１２までのいずれか一項に記載の方法。
前記インテグリンが、アルファ－５ベータ３またはアルファ－５ベータ１インテグリンから選択される、請求項１２に記載の方法。
前記細胞が、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ、ヤツメウナギＩＩＩ黄体形成ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモンベータ鎖、黄体形成ホルモン、絨毛膜ゴナドトロピン、絨毛膜ゴナドトロピンベータサブユニット、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ドーパミン、ソマトスタチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、グルココルチコイド、エストロゲン、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プロゲステロン、アンドロゲン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ビタミンＨ、葉酸塩、トランスフェリン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、エンドセリン、ボンベシン、血管作用性小腸ペプチド、ラクトフェリン、インテグリン、神経増殖因子、ＣＤ－８、ＣＤ－３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＲＯＲ１、ＩＧＦ－１癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＡ１２５（残留上皮性卵巣がん）、可溶性インターロイキン２（ＩＬ－２）受容体、ＲＡＧＥ－１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、メランＡ／ＭＡＲＴ－１、糖タンパク質（ｇｐ）７５、ｇｐ１００、ベータカテニン、ＰＲＡＭＥ、ＭＵＭ－１、ＺＦＰ１６１、ユビキリン－１、ＨＯＸ－Ｂ６、ＹＢ－１、オステオネクチン、またはＩＬＦ３に結合する受容体を発現する、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
前記結合性部分が、リガンド、受容体または抗体を含む、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
前記結合性部分が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸または炭水化物を含む、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
前記結合性部分が、ホルモン、ホルモン類似体、ホルモン受容体に結合するホルモン類似体、ホルモンの断片、ホルモン受容体、またはホルモンもしくはホルモン受容体に結合する作用剤である、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
前記結合性部分が、直鎖状または環状構造を有する、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
前記結合性部分が、ホルモンまたはホルモン受容体に結合する、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
前記ホルモンが、ゴナドトロピン放出ホルモンＩ、ゴナドトロピン放出ホルモンＩＩ、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ヤツメウナギＩＩＩ黄体形成ホルモン放出ホルモン、黄体形成ホルモンベータ鎖、黄体形成ホルモン、絨毛膜ゴナドトロピン、絨毛膜ゴナドトロピンベータサブユニット、メラニン細胞刺激ホルモン、エストラジオール、ジエチルスチルベストロール、ドーパミン、ソマトスタチン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、グルココルチコイド、エストロゲン、テストステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、プロゲステロン、またはアンドロゲンから選択される、請求項２０に記載の方法。
前記ホルモン類似体が、ミフェプリストン、フルタミド、リュープロン、ゾラデックス、スプレリン、シナテルトリプトレリン、ブセレリン、セトロレリクス、ガニレリクス、アバレリクス、アンチド、テベレリクスおよびデガレリクス（Ｆｅ２００４８６）から選択される、請求項１８に記載の方法。
前記細胞が、受容体、リガンドまたは抗原を発現し、前記ペプチドの前記結合性部分が、前記細胞によって発現される前記受容体、リガンド、または抗原に結合する、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の方法。
前記細胞が、過剰増殖細胞である、請求項２３に記載の方法。
過剰増殖障害を有する対象を処置する方法であって、前記対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、前記過剰増殖障害を処置するために十分な量で投与するステップを含み、前記融合構築物が、第１のドメインと第２のドメインとを含み、前記第１のドメインが、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２８アミノ酸の配列、または、Ｋ残基の１つもしくは複数がＦ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、Ｆ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ａ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、もしくはＡ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ｆ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２５アミノ酸の配列からなり、前記第２のドメインが、結合性部分を含む、方法。
前記対象が、新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍を有し、前記過剰増殖障害を処置するために十分な量が、前記新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍の増殖を低減させるまたは阻害するために十分な量である、請求項２５に記載の方法。
新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の他の部位への転移、または原発新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍から遠位の他の部位における転移性新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の形成もしくは定着を低減させるまたは阻害する方法であって、対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、前記新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の他の部位への転移、または前記原発新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍から遠位の他の部位における転移性新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の形成もしくは定着を低減させるまたは阻害するために十分な量で投与するステップを含み、前記融合構築物が、第１のドメインと第２のドメインとを含み、前記第１のドメインが、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２８アミノ酸の配列、または、Ｋ残基の１つもしくは複数がＦ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、Ｆ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ａ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、もしくはＡ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ｆ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２５アミノ酸の配列からなり、前記第２のドメインが、結合性部分を含む、方法。
前記新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍が、転移性、非転移性または良性である、請求項２６または２７に記載の方法。
前記新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍が、固形細胞塊を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
前記新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍が、造血細胞を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
前記新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍が、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、腺腫、腺癌、黒色腫、神経膠腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、乏突起膠細胞腫、中皮腫、網内系、リンパ性または造血性新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
前記肉腫が、リンパ肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫または線維肉腫を含む、請求項３１に記載の方法。
前記造血性新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍が、骨髄腫、リンパ腫または白血病を含む、請求項３１に記載の方法。
前記新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍が、肺、甲状腺、頭部もしくは頸部、上咽頭、のど、鼻もしくは副鼻腔、脳、脊椎、乳房、副腎、下垂体、甲状腺、リンパ液、胃腸（口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸（小腸）、結腸、直腸）、泌尿生殖器（子宮、卵巣、子宮頸部、子宮内膜、膀胱、精巣、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、肝臓、骨、骨髄、リンパ液、血液、筋肉、または皮膚の新生物、眼内黒色腫、腫瘍、またはがんを含む、請求項２６または２７に記載の方法。
前記肺の新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍が、卵巣がんまたは黒色腫を含む、請求項３４に記載の方法。
前記新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍が、幹細胞の新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
前記新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍の再発または増悪を阻害するまたは低減させる、請求項２６または２７に記載の方法。
抗細胞増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗がんまたは免疫増強処置または治療を施行するステップをさらに含む、請求項２６または２７に記載の方法。
前記処置または治療が、外科的切除、放射線療法、電離または化学放射線療法、化学療法、免疫療法、局所もしくは局部温熱療法（ハイパーサミア）、またはワクチン接種を含む、請求項３８に記載の方法。
前記処置または治療が、アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物抽出物、植物アルカロイド、ニトロソ尿素、ホルモン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体を投与することを含む、請求項３８に記載の方法。
前記処置または治療が、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、プレドニゾロン、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、ブスルファン、メトトレキセート、６－メルカプトプリン、チオグアニン、５－フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ＡＺＴ、５－アザシチジン（５－ＡＺＣ）および５－アザシチジン関連化合物、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、ヒドロキシウレア、シスプラチン、ミトタン、プロカルバジン、ダカルバジン、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ジブロモマンニトールまたはＰＡＲＰ阻害剤を投与することを含む、請求項３８に記載の方法。
前記処置または治療が、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞を投与することを含む、請求項３８に記載の方法。
前記処置または治療が、抗体、細胞増殖因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカインまたはケモカインを投与することを含む、請求項３８に記載の方法。
前記処置または治療が、ＩＬ－２、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、ＴＮＦβ、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ－１、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、ＭＣＰ－４、エオタキシン、エオタキシン－２、Ｉ－３０９／ＴＣＡ３、ＡＴＡＣ、ＨＣＣ－１、ＨＣＣ－２、ＨＣＣ－３、ＬＡＲＣ／ＭＩＰ－３α、ＰＡＲＣ、ＴＡＲＣ、ＣＫβ、ＣＫβ６、ＣＫβ７、ＣＫβ８、ＣＫβ９、ＣＫβ１１、ＣＫβ１２、Ｃ１０、ＩＬ－８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＥＮＡ－７８、ＧＣＰ－２、ＰＢＰ／ＣＴＡＰＩＩＩβ－ＴＧ／ＮＡＰ－２、Ｍｉｇ、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ－１、またはリンホタクチンを投与することを含む、請求項３８に記載の方法。
前記融合構築物を、前記抗細胞増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗がんまたは免疫増強処置または治療の施行前、それと実質的に同時発生的に、またはその後に投与する、請求項３８に記載の方法。
前記対象が、外科的切除、化学療法、免疫療法、電離または化学放射線療法、局所もしくは局部温熱療法（ハイパーサミア）、またはワクチン接種を受けたことがある、請求項２５から４５までのいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、外科的切除、化学療法、免疫療法、電離または化学放射線療法、局所もしくは局部温熱療法（ハイパーサミア）、またはワクチン接種の候補である、請求項２５から４５までのいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、外科的切除、化学療法、免疫療法、電離または化学放射線療法、局所もしくは局部温熱療法（ハイパーサミア）、またはワクチン接種の候補ではない、請求項２５から４５までのいずれか一項に記載の方法。
前記処置により、新生物、腫瘍、がんもしくは悪性細胞の質量、体積、サイズもしくは細胞数の部分的なもしくは完全な破壊、新生物、腫瘍、がんもしくは悪性細胞の壊死、溶解もしくはアポトーシスの刺激、誘導もしくは増大、新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の体積サイズ、細胞質量の低減、新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の体積、質量、サイズもしくは細胞数の増悪もしくは増大の阻害もしくは防止、または寿命の延長がもたらされる、請求項２５から４５までのいずれか一項に記載の方法。
前記処置により、前記新生物、腫瘍、がんまたは悪性腫瘍に付随するまたはそれによって引き起こされる有害な症状または合併症の重症度、持続時間または頻度の軽減または減少がもたらされる、請求項２５から４５までのいずれか一項に記載の方法。
前記処置により、疼痛、不快感、悪心、衰弱または嗜眠の軽減または減少がもたらされる、請求項２５から４５までのいずれか一項に記載の方法。
前記処置により、エネルギーの増大、食欲、移動性の改善または心理学的ウェルビーイングがもたらされる、請求項２５から４５までのいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、哺乳動物である、請求項２５から４５までのいずれか一項に記載の方法。
前記対象が、ヒトである、請求項２５から４５までのいずれか一項に記載の方法。
良性前立腺肥大症を軽減または処置する方法であって、動物に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、良性前立腺肥大症を処置するために十分な量で投与するステップを含み、前記融合構築物が、第１のドメインと第２のドメインとを含み、前記第１のドメインが、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２８アミノ酸の配列、または、Ｋ残基の１つもしくは複数がＦ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、Ｆ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ａ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているか、もしくはＡ残基の１つもしくは複数が、Ｋ残基、Ｆ残基もしくはＬ残基のいずれかで置換されているＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ（配列番号２）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）およびＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）から選択されるペプチドを含む１２～２５アミノ酸の配列からなり、前記第２のドメインが、結合性部分を含む、方法。
前記融合構築物が、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－ＧＳＧＧＳ－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－ＡＳＡＡＳ－βＣＧ－ａｌａ、またはＰｈｏｒ１４－βＣＧ－ａｌａよりも、ＩＣ５０値が低いことによって確認される通り、大きな抗細胞増殖活性を有する、請求項１から５５までのいずれか一項に記載の方法。
前記融合構築物が、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－ＧＳＧＧＳ－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－ＡＳＡＡＳ－βＣＧ－ａｌａ、またはＰｈｏｒ１４－βＣＧ－ａｌａよりも小さいＩＣ５０／（ＨＡ５０、溶血活性）比を有する、請求項１から５６までのいずれか一項に記載の方法。
前記融合構築物が、約０．０２未満、約０．０１未満、または約０．００５未満のＩＣ５０／（ＨＡ５０、溶血活性）比を有する、請求項１から５７までのいずれか一項に記載の方法。
前記結合性部分が、直鎖状または環状構造を有する、請求項１から５８までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１のドメインまたは前記第２のドメインが、約１～１０、１０～２０、１５～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００またはそれよりも多くのアミノ酸のアミノ酸配列からなるまたはそれを含む、請求項１から５９までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１のドメインが、約１５アミノ酸から約２０アミノ酸までの配列からなる、請求項１から６０までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１のドメインが、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸を有する配列からなる、請求項１から６１までのいずれか一項に記載の方法。
前記第２のドメインが、ＳＹＡＶＡＬＳＡＱＡＡＬＡＲＲと記載されるアミノ酸配列からなるまたはそれを含む、請求項１から６２までのいずれか一項に記載の方法。
前記第２のドメインが、ＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧと記載されるアミノ酸配列からなるまたはそれを含む、請求項１から６３までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１のドメインが、前記第２のドメインに対してＮＨ_２末端側に位置する、請求項１から６４までのいずれか一項に記載の方法。
前記第２のドメインが、前記第１のドメインに対してＮＨ_２末端側に位置する、請求項１から６５までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１のドメインまたは前記第２のドメインが、１つまたは複数のＤ－アミノ酸を有する、請求項１から６６までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１のドメインが、任意のＫ、ＦまたはＡ残基にＤ－アミノ酸を有する、請求項１から６７までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１のドメインが、両親媒性アルファヘリックスを形成する、請求項１から６８までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１のドメインと前記第２のドメインが、共有結合によって接合している、請求項１から６９までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１のドメインと前記第２のドメインが、ペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーによって接合している、請求項１から７０までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１のドメインと前記第２のドメインが、１個から２５個までのアミノ酸残基を有するペプチド配列、または直鎖状炭素鎖によって接合している、請求項１から７１までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１のドメインと前記第２のドメインが、１つまたは複数のＡ、ＳまたはＧアミノ酸残基を含むペプチド配列によって接合している、請求項１から７２までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１のドメインと前記第２のドメインが、ＧＳＧＧＳ、ＡＳＡＡＳ、またはＣＣＣＣＣＣを含む、またはそれからなるペプチド配列によって接合している、請求項１から７３までのいずれか一項に記載の方法。
第３の、第４の、第５の、第６のまたは第７のドメインをさらに含む、請求項１から７４までのいずれか一項に記載の方法。
前記融合構築物が、単離または精製されたものである、請求項１から７５までのいずれか一項に記載の方法。
前記融合構築物が、混合物を含む、請求項１から７６までのいずれか一項に記載の方法。
前記チェックポイント阻害剤が、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）またはＣＴＬＡ－４の阻害剤またはアンタゴニストである、請求項１から７７までのいずれか一項に記載の方法。
前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４に結合するアンタゴニスト抗体である、請求項１から７８までのいずれか一項に記載の方法。
前記チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、ニボルマブおよびペムブロリズマブからなる群から選択される、請求項１から７９までのいずれか一項に記載の方法。
前記融合構築物を、前記チェックポイント阻害剤の投与前、それと実質的に同時発生的に、またはその後に投与する、請求項１から８０までのいずれか一項に記載の方法。
細胞の増殖を低減させるまたは阻害する方法であって、前記細胞に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、前記細胞の増殖を低減させるまたは阻害するために十分な量で接触させるステップを含み、前記融合構築物が、第１の溶解性ドメインと第２のドメインとを含み、前記第１の溶解性ドメインが、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）またはＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）からなり、前記第２のドメインが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＬＨＲＨ断片、またはＬＨＲＨ類似体を含む、方法。
過剰増殖障害を有する対象を処置する方法であって、前記対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、前記過剰増殖障害を処置するために十分な量で投与するステップを含み、前記融合構築物が、第１の溶解性ドメインと第２のドメインとを含み、前記第１の溶解性ドメインが、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）またはＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）からなり、前記第２のドメインが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＬＨＲＨ断片、またはＬＨＲＨ類似体を含む、方法。
新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の他の部位への転移、または原発新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍から遠位の他の部位における転移性新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の形成もしくは定着を低減させるまたは阻害する方法であって、対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、前記新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の他の部位への転移、または前記原発新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍から遠位の他の部位における転移性新生物、腫瘍、がんもしくは悪性腫瘍の形成もしくは定着を低減させるまたは阻害するために十分な量で投与するステップを含み、前記融合構築物が、第１の溶解性ドメインと第２のドメインとを含み、前記第１の溶解性ドメインが、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）またはＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）からなり、前記第２のドメインが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＬＨＲＨ断片、またはＬＨＲＨ類似体を含む、方法。
良性前立腺肥大症を軽減または処置する方法であって、動物に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、良性前立腺肥大症を処置するために十分な量で投与するステップを含み、前記融合構築物が、第１の溶解性ドメインと第２のドメインとを含み、前記第１の溶解性ドメインが、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）またはＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）からなり、前記第２のドメインが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＬＨＲＨ断片、またはＬＨＲＨ類似体を含む、方法。
前記第２のドメインが、ＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧと記載されるアミノ酸配列（配列番号９）からなるまたはそれを含む、請求項８２から８５までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１の溶解性ドメインが、前記第２のドメインに対してＮＨ_２末端側に位置する、請求項８２から８６までのいずれか一項に記載の方法。
前記第２のドメインが、前記第１の溶解性ドメインに対してＮＨ_２末端側に位置する、請求項８２から８６までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１の溶解性ドメインまたは前記第２のドメインが、１つまたは複数のＤ－アミノ酸を有する、請求項８２から８８までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１の溶解性ドメインが、任意のＫ、ＦまたはＡ残基にＤ－アミノ酸を有する、請求項８２から８９までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１の溶解性ドメインが、両親媒性アルファヘリックスを形成する、請求項８２から９０までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１の溶解性ドメインと前記第２のドメインが、共有結合によって接合している、請求項８２から９１までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１の溶解性ドメインと前記第２のドメインが、ペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーによって接合している、請求項８２から９２までのいずれか一項に記載の方法。
前記ペプチドリンカーが、１個から２５個までのアミノ酸残基の長さを有する、請求項８２から９３までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１の溶解性ドメインと前記第２のドメインが、１つまたは複数のＡ、ＳまたはＧアミノ酸残基を含むペプチドリンカーによって接合している、請求項８２から９４までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１の溶解性ドメインと前記第２のドメインが、ＧＳＧＧＳ（配列番号１０）、またはＡＳＡＡＳ（配列番号１１）を含む、またはそれからなるペプチドリンカーによって接合している、請求項８２から９５までのいずれか一項に記載の方法。
前記融合構築物が、単離または精製されたものである、請求項８２から９６までのいずれか一項に記載の方法。
前記融合構築物が、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－（配列番号１０）－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－（配列番号１１）－βＣＧ－ａｌａ、またはＰｈｏｒ１４－βＣＧ－ａｌａよりも、ＩＣ_５０値が低いことによって確認される通り、大きな抗細胞増殖活性を有する、請求項８２から９７までのいずれか一項に記載の方法。
前記融合構築物が、Ｐｈｏｒ２１－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－（配列番号１０）－βＣＧ－ａｌａ、Ｐｈｏｒ２１－（配列番号１１）－βＣＧ－ａｌａ、またはＰｈｏｒ１４－βＣＧ－ａｌａよりも小さなＩＣ_５０／ＨＡ_５０（溶血活性）比を有する、請求項８２から９８までのいずれか一項に記載の方法。
前記融合構築物が、約０．０２未満、約０．０１未満、または約０．００５未満のＩＣ_５０／ＨＡ_５０（溶血活性）比を有する、請求項８２から９９までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１の溶解性ドメインが、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）からなる、請求項８２から１００までのいずれか一項に記載の方法。
前記第１の溶解性ドメインが、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）からなる、請求項８２から１００までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＬＨＲＨ類似体が、リュープロン（ロイプロリド）を含む、請求項８２から１００までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＬＨＲＨ類似体が、ゾラデックス（ゴセレリン）を含む、請求項８２から１００までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＬＨＲＨ類似体が、スプレリン（ヒストレリン）を含む、請求項８２から１００までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＬＨＲＨ類似体が、トリプトレリンを含む、請求項８２から１００までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＬＨＲＨ類似体が、ブセレリンを含む、請求項８２から１００までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＬＨＲＨ類似体が、セトロレリクスを含む、請求項８０から１００までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＬＨＲＨ類似体が、ガニレリクスを含む、請求項８２から１００までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＬＨＲＨ類似体が、アバレリクスを含む、請求項８２から１００までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＬＨＲＨ類似体が、アンチドを含む、請求項８２から１００までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＬＨＲＨ類似体が、テベレリクスを含む、請求項８２から１００までのいずれか一項に記載の方法。
前記ＬＨＲＨ類似体が、デガレリクス（Ｆｅ２００４８６）を含む、請求項８２から１００までのいずれか一項に記載の方法。
前記非ペプチドリンカーが、直鎖状炭素鎖リンカーを含む、請求項８２から１１３までのいずれか一項に記載の方法。
前記非ペプチドリンカーが、直鎖状６炭素鎖リンカーを含む、請求項８２から１１４までのいずれか一項に記載の方法。
前記融合構築物および前記チェックポイント阻害剤が組成物または混合物に含まれる、請求項８２から１１５までのいずれか一項に記載の方法。
アルキル化剤、代謝拮抗薬、植物抽出物、植物アルカロイド、ニトロソ尿素、ホルモン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体を、前記細胞に接触させる、または、投与するステップをさらに含む、請求項８２から１１６までのいずれか一項に記載の方法。
シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、プレドニゾロン、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、ブスルファン、メトトレキセート、６－メルカプトプリン、チオグアニン、５－フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ＡＺＴ、５－アザシチジン（５－ＡＺＣ）、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、ヒドロキシウレア、シスプラチン、カルボプラチン、オキシプラチン、ミトタン、プロカルバジン、ダカルバジン、タキソール（パクリタキセル）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ジブロモマンニトール、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、テニポシド、ゲムシタビン、ペメトレキセド、またはＰＡＲＰ阻害剤を、前記細胞に接触させる、または、投与するステップをさらに含む、請求項８２から１１７までのいずれか一項に記載の方法。
前記過剰増殖障害またはがんが、卵巣がん、乳がん、黒色腫または肝細胞癌である、請求項８２から１１８までのいずれか一項に記載の方法。
前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４の阻害剤またはアンタゴニストである、請求項８２から１１９までのいずれか一項に記載の方法。
前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４に結合するアンタゴニスト抗体である、請求項８２から１２０までのいずれか一項に記載の方法。
前記チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、ニボルマブおよびペムブロリズマブからなる群から選択される、請求項８２から１２１までのいずれか一項に記載の方法。
対象におけるがんを処置する方法であって、前記対象に、融合構築物およびチェックポイント阻害剤を、卵巣がんまたは乳がんを処置するために十分な量で投与するステップを含み、前記融合構築物が、第１の溶解性ドメインと第２のドメインとを含み、前記第１の溶解性ドメインが、ペプチドＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列番号１）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ（配列番号３）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列番号４）、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ（配列番号５）またはＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列番号６）からなり、前記第２のドメインが、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＬＨＲＨ断片、またはＬＨＲＨ類似体を含み、前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４の阻害剤またはアンタゴニストを含み、前記がんが、卵巣がん、乳がん、黒色腫および肝細胞癌から選択される、方法。
前記融合構築物が、アミノ酸配列ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧを含む、請求項１２３に記載の方法。
前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－Ｌ１に結合するアンタゴニスト抗体を含む、請求項１２３または１２４に記載の方法。
前記チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ－４に結合するアンタゴニスト抗体を含む、請求項１２３または１２４に記載の方法。
前記チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１に結合するアンタゴニスト抗体を含む、請求項１２３から１２４までのいずれか一項に記載の方法。
前記チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、ニボルマブおよびペムブロリズマブからなる群から選択される、請求項１２３から１２４までのいずれか一項に記載の方法。