KR20230005180A - 용해 도메인 융합 작제물, 체크포인트 억제제, 및 이를 제조하고 사용하는 방법 - Google Patents

용해 도메인 융합 작제물, 체크포인트 억제제, 및 이를 제조하고 사용하는 방법 Download PDF

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헥터 알릴라
아닐 수드
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에이28 테라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 융합 작제물 및 체크포인트 억제제, 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 사용하는 방법, 및 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과다증식성 장애, 예를 들어, 종양, 암, 신생물 및 악성종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

용해 도메인 융합 작제물, 체크포인트 억제제, 및 이를 제조하고 사용하는 방법
관련 출원
[0001] 본 특허 출원은 2020년 3월 26일에 출원된 "용해 도메인 융합 작제물, 체크포인트 억제제, 및 이를 제조하고 사용하는 방법"이라는 명칭의 미국 가특허 출원 번호 63/000,322에 대한 우선권을 주장한다. 상기 특허 출원의 전체 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
기술 분야
[0002] 본 발명은 융합 작제물 및 체크포인트 억제제, 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 사용하는 방법, 및 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과다증식성 장애, 예를 들어, 비-전이성 및 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성종양을 치료하는 방법에 관한 것이다.
도입
[0003] 원발성 종양 및 전이의 치료를 위한 새로운 치료제 개발의 필요성은 암 환자의 5년 생존율을 고려할 때 명백히 분명하다: 폐암, 결장직장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 흑색종, 방광암 및 자궁내막암을 갖는 환자의 경우 원격 전이성 질환으로 진단되면 2 내지 40%만이 생존한다.
개요
[0004] 부분적으로, 용해 도메인 및 결합 모이어티를 포함하는 융합 작제물이 본원에 제공된다. 세포와 용해 도메인의 접촉은 세포막의 파괴를 유발하여 세포 사멸을 초래하는 것으로 여겨진다. 결합 모이어티는 비-전이성 및 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성종양과 같은 바람직하지 않거나 비정상적인 증식 세포 또는 과다증식 세포을 포함하여, 용해 도메인에 의한 파괴를 위해 세포를 표적화한다. 다수의 비-전이성 및 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성 세포가 수용체 또는 리간드를 과발현한다. 예를 들어, 많은 비-전이성 및 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성종양은 융합 작제물의 결합 모이어티로서 사용될 수 있는 호르몬(예를 들어, 황체 형성 호르몬/융모 생식샘 자극 호르몬(LH/CG), 또는 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH 등)), 성장 인자, 사이토카인, 항체 등에 대한 수용체를 발현한다.
[0005] 융합 작제물은 결합 모이어티에 대한 결합 부위를 발현하는 임의의 세포 또는 세포 집단을 표적화하도록 설계될 수 있다. 리간드, 항체 및 이의 단편, 성장 인자, 사이토카인 등과 같은 결합 모이어티는 용해 도메인에 연결되어 수용체, 항원, 항체, 리간드 등을 발현하거나 함유하는 세포의 표적화된 사멸을 제공함으로써 세포 증식 또는 성장을 감소시키거나 억제할 수 있다.
[0006] 융합 작제물은 표적 세포를 사멸시키기 위해 세포를 분열시킬 필요가 없다. 더욱이, 융합 작제물은 비교적 작은 크기로 제조될 수 있기 때문에 면역원성이 아닐 수 있다. 또한, 융합 작제물은 다중-약물 내성 세포를 사멸시킨다.
[0007] 일부 양태에서, 융합 작제물 및 체크포인트 억제제의 조합물로 신생물 장애 및 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
[0008] 일부 양태에서, 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기 위한 약제의 제조에서의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제의 조합물의 용도가 제공된다.
[0009] 본원에 제시된 데이터는 체크포인트 억제제와 조합하여 사용된 융합 작제물이 상승적인 항암 효과를 제공함을 입증한다. 일부 양태에서, 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 융합 작제물은 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 도메인은 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 28개의 아미노산 서열, 또는 K 잔기 중 하나 이상이 임의의 F 또는 L 잔기로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, A 또는 L 잔기로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, F 또는 L 잔기로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 25개의 아미노산 서열로 구성되고; 제2 도메인은 결합 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 융합 작제물의 제1 도메인은 K 잔기 중 하나 이상이 임의의 F 또는 L 잔기로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, A 또는 L 잔기로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, F 또는 L 잔기로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된다.
[0010] 일부 구체예에서, 융합 작제물의 결합 모이어티는 수용체, 리간드 또는 항원에 결합한다. 특정 구체예에서, 수용체, 리간드, 또는 항원은 세포(예를 들어, 표적 세포)에서 발현된다. 특정 구체예에서, 리간드는 수용체 효능제 또는 길항제를 포함한다.
[0011] 특정 구체예에서, 세포는 과다증식 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 신생물, 종양, 암 또는 악성 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 유방, 난소, 자궁, 자궁경부, 전립선, 고환, 부신, 뇌하수체 또는 자궁내막 세포이다.
[0012] 특정 구체예에서, 세포는 수용체, 리간드, 또는 항원을 발현한다. 특정 구체예에서, 세포는 호르몬 또는 호르몬 수용체를 발현한다. 특정 구체예에서, 세포는 성 또는 생식샘 스테로이드 호르몬 또는 성 또는 생식샘 스테로이드 호르몬 수용체를 발현한다.
[0013] 특정 구체예에서, 세포는 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 I, 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 II, 칠성장어 III 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 황체 형성 호르몬 베타 사슬, 황체 형성 호르몬, 융모 생식샘 자극 호르몬, 융모 생식샘 자극 호르몬 베타 서브유닛, 멜라닌세포 자극 호르몬, 에스트라디올, 디에틸스틸베스트롤, 도파민, 소마토스타틴, 난포-자극 호르몬(FSH), 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 프로게스테론, 안드로겐, 표피 성장 인자(EGF), 성장 호르몬(GF), Her2/neu, 비타민 H, 폴레이트, 트랜스페린, 갑상샘 자극 호르몬(TSH), 엔도텔린, 봄베신, 성장 호르몬, 혈관활성 장 펩티드, 락토페린, 인테그린, 신경 성장 인자, CD-8, CD-33, CD19, CD20, CD40, ROR1, IGF-1, 암배아 항원(CEA), 알파-태아단백질(AFP), 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), CA 125(잔존 상피 난소암), 가용성 인터루킨-2(IL-2) 수용체, RAGE-1, 티로시나제, MAGE-1, MAGE-2, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, 당단백질(gp) 75, gp100, 베타-카테닌, PRAME, MUM-1, ZFP161, 유비퀴틴-1, HOX-B6, YB-1, 오스테오넥틴, ILF3, 엽산 또는 이의 유도체, 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리 구성원, TNF-알파, TNF-베타(림포톡신, LT), TRAIL, Fas, LIGHT, 41BB, 형질전환 성장 인자 알파, 형질전환 성장 인자 베타, 인슐린, 세룰로플라스민, HIV-tat, RGD 서열 모티프를 포함하는 펩티드 또는 단백질, 단당류, 이당류, 올리고당류, 시알산, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 또는 아세틸뉴라민산, 또는 이들의 유사체에 결합하는 수용체를 발현한다.
[0014] 특정 구체예에서, 세포는 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH)에 결합하는 수용체를 발현한다. 특정 구체예에서, 인테그린은 알파-5 베타 3 또는 알파-5 베타 1 인테그린으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 세포는 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 I, 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 II, 칠성장어 III 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 황체 형성 호르몬 베타 사슬, 황체 형성 호르몬, 융모 생식샘 자극 호르몬, 융모 생식샘 자극 호르몬 베타 서브유닛, 멜라닌세포 자극 호르몬, 에스트라디올, 디에틸스틸베스트롤, 도파민, 소마토스타틴, 난포-자극 호르몬(FSH), 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 프로게스테론, 안드로겐, 표피 성장 인자(EGF), 성장 호르몬(GF), Her2/neu, 비타민 H, 폴레이트, 트랜스페린, 갑상샘 자극 호르몬(TSH), 엔도텔린, 봄베신, 혈관활성 장 펩티드, 락토페린, 인테그린, 신경 성장 인자, CD-8, CD-33, CD19, CD20, CD40, ROR1, IGF-1, 암배아 항원(CEA), 알파-태아단백질(AFP), 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), CA 125(잔존 상피 난소암), 가용성 인터루킨-2(IL-2) 수용체, RAGE-1, 티로시나제, MAGE-1, MAGE-2, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, 당단백질(gp) 75, gp100, 베타-카테닌, PRAME, MUM-1, ZFP161, 유비퀼린-1, HOX-B6, YB-1, 오스테오넥틴, 및 ILF3에 결합하는 수용체를 발현한다.
[0015] 특정 구체예에서, 결합 모이어티는 리간드, 수용체 또는 항체를 포함한다. 특정 구체예에서, 결합 모이어티는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 핵산 또는 탄수화물을 포함한다. 특정 구체예에서, 결합 모이어티는 호르몬, 호르몬 유사체, 호르몬 수용체에 결합하는 호르몬 또는 호르몬 유사체의 단편, 호르몬 수용체 또는 호르몬 또는 호르몬 수용체에 결합하는 제제이다. 특정 구체예에서, 결합 모이어티는 선형 또는 사이클릭 구조를 갖는다.
[0016] 특정 구체예에서, 결합 모이어티는 호르몬 또는 호르몬 수용체에 결합한다. 특정 구체예에서, 호르몬은 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 I, 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 II, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 칠성장어 III 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 황체 형성 호르몬 베타 사슬, 황체 형성 호르몬, 융모 생식샘 자극 호르몬, 융모 생식샘 자극 호르몬 베타 서브유닛, 멜라닌세포 자극 호르몬, 에스트라디올, 디에틸스틸베스트롤, 도파민, 소마토스타틴, 난포-자극 호르몬(FSH), 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 프로게스테론, 또는 안드로겐으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 호르몬 유사체는 미페프리스톤(mifepristone), 플루타미드(flutamide), 루프론(lupron), 졸라덱스(zoladex), 수프렐린(supprelin), 시나텔 트립토렐린(synatel triptorelin), 부세렐린(buserelin), 세트로렐릭스(cetrorelix), 가니렐릭스(ganirelix), 아바렐릭스(abarelix), 안티데(antide), 테베렐릭스(teverelix) 및 데가렐릭스(degarelix)(Fe200486)로부터 선택된다.
[0017] 특정 구체예에서, 세포는 수용체, 리간드 또는 항원을 발현하고, 펩티드의 결합 모이어티는 세포에 의해 발현된 수용체, 리간드 또는 항원에 결합한다. 특정 구체예에서, 세포는 과다증식 세포이다.
[0018] 일부 양태에서, 과다증식성 장애를 치료하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 과다증식성 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 융합 작제물은 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 도메인은 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 28개의 아미노산 서열, 또는 K 잔기 중 하나 이상이 임의의 F 또는 L 잔기로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, A 또는 L 잔기로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, F 또는 L 잔기로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 25개의 아미노산 서열로 구성되고; 제2 도메인은 결합 모이어티를 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체는 신생물, 종양, 암 또는 악성종양을 갖고, 과다증식성 장애를 치료하기에 충분한 양은 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양이다.
[0019] 일부 양태에서, 과다증식성 장애의 치료를 위한 약제의 제조에서의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제의 조합물의 용도가 제공된다.
[0020] 일부 양태에서, 다른 부위로의 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 전이, 또는 원발성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양으로부터 먼 다른 부위에서 전이성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 다른 부위로의 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 전이, 또는 원발성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양으로부터 먼 다른 부위에서 전이성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 융합 작제물은 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 도메인은 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 28개의 아미노산 서열, 또는 K 잔기 중 하나 이상이 임의의 F 또는 L 잔기로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, A 또는 L 잔기로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, F 또는 L 잔기로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 25개의 아미노산 서열로 구성되고; 제2 도메인은 결합 모이어티를 포함한다.
[0021] 일부 양태에서, 다른 부위로의 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 전이, 또는 원발성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양으로부터 먼 다른 부위에서 전이성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하기 위한 약제의 제조에서의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제의 조합물의 용도가 제공된다.
[0022] 일부 구체예에서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양은 전이성, 비-전이성 또는 양성이다. 일부 구체예에서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양은 고형 세포 덩어리를 포함한다. 일부 구체예에서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양은 조혈 세포를 포함한다.
[0023] 일부 구체예에서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양은 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 샘종, 샘암종, 흑색종, 신경아교종, 아교모세포종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 별아교세포종, 핍지세포종, 중피종, 그물내피, 림프 또는 조혈 신생물, 종양, 암 또는 약성종양을 포함한다. 일부 구체예에서, 육종은 림프육종, 지방육종, 골육종, 연골육종, 평활근육종, 횡문근육종 또는 섬유육종을 포함한다.
[0024] 일부 구체예에서, 조혈 신생물, 종양, 암 또는 악성종양은 골수종, 림프종 또는 백혈병을 포함한다. 일부 구체예에서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양은 폐, 갑상선, 두경부, 비인두, 인후, 코 또는 부비동, 뇌, 척추, 유방, 부신, 뇌하수체, 갑상선, 림프, 위장관(입, 식도, 위, 십이지장, 회장, 공장(소장), 결장, 직장), 비뇨생식기(자궁, 난소, 자궁경부, 자궁내막, 방광, 고환, 음경, 전립선), 신장, 췌장, 간, 뼈, 골수, 림프, 혈액, 근육, 또는 피부 신생물, 눈의 흑색종, 종양 또는 암을 포함한다.
[0025] 일부 구체예에서, 폐 신생물, 종양, 암 또는 악성종양은 소세포 폐암 또는 비-소세포 폐암을 포함한다. 일부 구체예에서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양은 줄기 세포 신생물, 종양, 암 또는 악성종양을 포함한다.
[0026] 일부 구체예에서, 상기 방법은 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 재발 또는 진행을 억제하거나 감소시킨다.
[0027] 일부 구체예에서, 본원의 방법은 항-세포 증식, 항-신생물, 항-종양, 항암 또는 면역-향상 치료 또는 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 치료 또는 요법은 외과적 절제, 방사선 요법, 이온화 또는 화학적 방사선 요법, 화학 요법, 면역 요법, 국소 또는 지역 열(온열요법) 요법, 또는 백신 접종을 포함한다. 일부 구체예에서, 치료 또는 요법은 알킬화제, 항-대사 산물, 식물 추출물, 식물 알칼로이드, 니트로소우레아, 호르몬, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 치료 또는 요법은 사이클로포스파미드, 아자티오프린, 사이클로스포린 A, 프레드니솔론, 멜팔란, 클로람부실, 메클로레타민, 부술판, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 티오구아닌, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드, AZT, 5-아자시티딘(5-AZC) 및 5-아자시티딘 관련 화합물, 블레오마이신, 악티노마이신 D, 미트라마이신, 미토마이신 C, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙토조토신, 하이드록시우레아, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 옥시플라틴, 미토탄, 프로카르바진, 다카르바진, 탁솔, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 독소루비신, 디브로모만니톨, 이리노테칸, 토포테칸, 에토포시드, 테니포시드, 젬시타빈 또는 페메트렉시드를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 치료 또는 요법은 림프구, 형질 세포, 대식세포, 수지상 세포, NK 세포 또는 B-세포를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 치료 또는 요법은 항체, 세포 성장 인자, 세포 생존 인자, 세포 분화 인자, 사이토카인 또는 케모카인을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 치료 또는 요법은 IL-2, IL-1α, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-7, 과립구-대식세포-콜로니 자극 인자(GMCSF), IFN-γ, IL-12, TNF-α, TNFβ, MIP-1(α, β, 또는 γ) MIP-2, MIP-(2, 3α, 3β 또는 5), RANTES, SDF-1, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, 에오탁신, 에오탁신-2, I-309/TCA3, ATAC, HCC-1, HCC-2, HCC-3, LARC/MIP-3α, PARC, TARC, CKβ, CKβ6, CKβ7, CKβ8, CKβ9, CKβ11, CKβ12, C10, IL-8, GROα, GROβ, ENA-78, GCP-2, PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2, Mig, PBSF/SDF-1, 또는 림포탁틴을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 치료 또는 요법은 폴리 ADP 리보스 중합효소(PARP) 억제제를 투여하는 것을 포함하고, 이의 비제한적인 예는 올라파립(olaparib), 루카파립(rucaparib), 니라파립(niraparib), 탈라조파립(talazoparib), 벨리파립(veliparib), BGB-290, CEP 9722, E7016, 이니파립(iniparib) 및 3-아미노벤즈아미드를 포함한다.
[0028] 일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법에서, 융합 작제물은 항-세포 증식, 항-신생물, 항-종양, 항암 또는 면역-향상 치료 또는 요법의 투여 전에, 실질적으로 동시에 또는 투여 후에 투여된다. 일부 구체예에서, 융합 작제물은 체크포인트 억제제의 투여 전에, 실질적으로 동시에 또는 투여 후에 투여된다.
[0029] 본원의 방법의 일부 구체예에서, 대상체는 포유 동물이다. 일부 구체예에서, 대상체는 인간이다.
[0030] 일부 구체예에서, 대상체는 외과적 절제, 화학 요법, 면역 요법, 이온화 또는 화학적 방사선 요법, 국소 또는 지역 열(온열요법) 요법, 또는 백신 접종을 받았다. 일부 구체예에서, 대상체는 외과적 절제, 화학 요법, 면역 요법, 이온화 또는 화학적 방사선 요법, 국소 또는 지역 열(온열요법) 요법, 또는 백신 접종을 위한 후보이다.
[0031] 일부 구체예에서, 대상체는 외과적 절제, 화학 요법, 면역 요법, 이온화 또는 화학적 방사선 요법, 국소 또는 지역 열(온열요법) 요법, 또는 백신 접종을 위한 후보가 아니다. 일부 구체예에서, 치료는 신생물, 종양, 암 또는 악성 세포 질량, 부피, 크기 또는 세포 수의 부분적 또는 완전한 파괴, 신생물, 종양, 암 또는 악성 세포 괴사, 용해 또는 아폽토시스의 자극, 유도 또는 증가, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 부피 크기, 세포 질량의 감소, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 부피, 질량, 크기 또는 세포 수의 진행 또는 증가의 억제 또는 예방, 또는 수명 연장을 초래한다. 일부 구체예에서, 치료는 신생물, 종양, 암 또는 악성종양과 관련되거나 이에 의해 야기되는 부작용 또는 합병증의 중증도, 기간 또는 빈도를 감소시키거나 저하시킨다. 일부 구체예에서, 치료는 통증, 불편함, 욕지기, 쇠약 또는 무기력을 감소시키거나 저하시킨다. 일부 구체예에서, 치료는 증가된 에너지, 식욕, 개선된 움직임 또는 심리적 안녕을 초래한다.
[0032] 일부 양태에서, 양성 전립선 비대증을 치료하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 양성 전립선 비대증을 감소시키거나 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 융합 작제물은 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 도메인은 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 28개의 아미노산 서열, 또는 K 잔기 중 하나 이상이 임의의 F 또는 L 잔기로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, A 또는 L 잔기로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, F 또는 L 잔기로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 25개의 아미노산 서열로 구성되고; 제2 도메인은 결합 모이어티를 포한다.
[0033] 일부 양태에서, 양성 전립선 비대증을 감소시키거나 치료하기 위한 약제의 제조에서의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제의 조합물의 용도가 제공된다.
[0034] 일부 구체예에서, 융합 작제물은 더 낮은 IC50 값에 의해 확인되는 바와 같이, Phor21-βCG-ala, Phor21-GSGGS-βCG-ala, Phor21-ASAAS-βCG-ala, 또는 Phor14-βCG-ala보다 더 큰 항-세포 증식 활성을 갖는다. 일부 구체예에서, 융합 작제물은 Phor21-βCG-ala, Phor21-GSGGS-βCG-ala, Phor21-ASAAS-βCG-ala, 또는 Phor14-βCG-ala보다 더 작은 IC50/(HA50, 용혈 활성) 비율을 갖는다. 일부 구체예에서, 융합 작제물은 약 0.02, 0.01, 또는 0.005 미만의 IC50/(HA50, 용혈 활성) 비율을 갖는다.
[0035] 일부 구체예에서, 결합 모이어티는 선형 또는 사이클릭 구조를 갖는다.
[0036] 일부 구체예에서, 제1 또는 제2 도메인은 약 1 내지 10개, 10 내지 20개, 15 내지 20개, 20 내지 30개, 30 내지 40개, 40 내지 50개, 60 내지 70개, 70 내지 80개, 80 내지 90개, 90 내지 100개 이상의 아미노산의 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함한다.
[0037] 일부 구체예에서, 제1 도메인은 약 15 내지 약 20개 아미노산의 서열로 구성된다. 일부 구체예에서, 제1 도메인은 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산을 갖는 서열로 구성된다.
[0038] 일부 구체예에서, 제2 도메인은 SYAVALSAQAALARR로 제시된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 도메인은 QHWSYGLRPG로 제시된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함한다.
[0039] 일부 구체예에서, 제1 도메인(예를 들어, 용해 도메인)은 제2 도메인(예를 들어, 결합 모이어티를 포함하는 도메인)에 대해 NH2-말단에 위치한다. 일부 구체예에서, 제2 도메인(예를 들어, 결합 모이어티를 포함하는 도메인)은 제1 도메인(예를 들어, 용해 도메인)에 대해 NH2-말단에 위치한다.
[0040] 일부 구체예에서, 제1 도메인 또는 제2 도메인은 하나 이상의 D-아미노산을 갖는다. 일부 구체예에서, 제1 도메인은 임의의 K, F 또는 A 잔기에 D-아미노산을 갖는다.
[0041] 일부 구체예에서, 제1 도메인은 양친매성 알파-나선을 형성한다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 도메인은 공유 결합에 의해 연결된다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 도메인은 펩티드 또는 비-펩티드 링커에 의해 연결된다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 도메인은 1 내지 25개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 서열, 또는 선형 탄소 사슬에 의해 연결된다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 도메인은 하나 이상의 A, S 또는 G 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 서열에 의해 연결된다. 일부 구체예에서, 제1 및 제2 도메인은 GSGGS(SEQ. ID NO. 10), ASAAS(SEQ. ID NO.11), 또는 CCCCCC를 포함하거나 이로 구성된 펩티드 서열에 의해 연결된다. 일부 구체예에서, 융합 작제물은 제3, 제4, 제5, 제6 또는 제7 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 융합 작제물은 분리되거나 정제된다. 일부 구체예에서, 융합 작제물은 혼합물을 포함한다.
[0042] 일부 양태에서, 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 융합 작제물은 제1 용해 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 용해 도메인은 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1) 또는 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4)로 구성되고; 제2 도메인은 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), LHRH 단편, 또는 LHRH 유사체를 포함한다.
[0043] 일부 양태에서, 과다증식성 장애를 치료하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 과다증식성 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 융합 작제물은 제1 용해 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 용해 도메인은 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로 구성되고; 제2 도메인은 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), LHRH 단편, 또는 LHRH 유사체를 포함한다.
[0044] 일부 양태에서, 다른 부위로의 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 전이, 또는 원발성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양으로부터 먼 다른 부위에서 전이성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 다른 부위로의 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 전이, 또는 원발성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양으로부터 먼 다른 부위에서 전이성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 융합 작제물은 제1 용해 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 용해 도메인은 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로 구성되고; 제2 도메인은 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), LHRH 단편, 또는 LHRH 유사체를 포함한다.
[0045] 일부 양태에서, 양성 전립성 비대증을 치료하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 양성 전립성 비대증을 감소시키거나 치료하는 방법이 본원에 제공되고, 여기서 융합 작제물은 제1 용해 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 용해 도메인은 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로 구성되고; 제2 도메인은 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), LHRH 단편, 또는 LHRH 유사체를 포함한다.
[0046] 일부 구체예에서, 융합 작제물의 제2 도메인은 다음과 같이 제시된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함한다: QHWSYGLRPG(SEQ. ID NO.9).
[0047] 일부 구체예에서, 융합 작제물은 분리되거나 정제된다. 일부 구체예에서, 융합 작제물은 더 낮은 IC50 값에 의해 확인되는 바와 같이, Phor21-βCG-ala, Phor21-(SEQ. ID NO.10)-βCG-ala, Phor21-(SEQ. ID NO.11)-βCG-ala, 또는 Phor14-βCG-ala보다 더 큰 항-세포 증식 활성을 갖는다. 일부 구체예에서, 융합 작제물은 Phor21-βCG-ala, Phor21-(SEQ. ID NO. 10)-βCG-ala, Phor21-(SEQ. ID NO.11)-βCG-ala, 또는 Phor14-βCG-ala보다 더 작은 IC50/HA50(용혈 활성) 비율을 갖는다. 일부 구체예에서, 융합 작제물은 약 0.02, 0.01, 또는 0.005 미만의 IC50/HA50(용혈 활성) 비율을 갖는다. 일부 구체예에서, 제1 용해 도메인은 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1)로 구성된다. 일부 구체예에서, 제1 용해 도메인은 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4)로 구성된다.
[0048] 일부 구체예에서, LHRH 유사체는 루프론(류프롤리드)을 포함한다. 일부 구체예에서, LHRH 유사체는 졸라덱스(고세렐린(goserelin))을 포함한다. 일부 구체예에서, LHRH 유사체는 수프렐린(히스트렐린(histrelin))을 포함한다. 일부 구체예에서, LHRH 유사체는 트립토렐린(triptorelin)을 포함한다. 일부 구체예에서, LHRH 유사체는 부세렐린을 포함한다. 일부 구체예에서, LHRH 유사체는 세트로렐릭스를 포함한다. 일부 구체예에서, LHRH 유사체는 가니렐릭스를 포함한다. 일부 구체예에서, LHRH 유사체는 아바렐릭스를 포함한다. 일부 구체예에서, LHRH 유사체는 안티데를 포함한다. 일부 구체예에서, LHRH 유사체는 테베렐릭스를 포함한다. 일부 구체예에서, LHRH 유사체는 데가렐릭스(Fe200486)를 포함한다. 일부 구체예에서, 비-펩티드 링커는 선형 탄소 사슬 링커를 포함한다. 일부 구체예에서, 비-펩티드 링커는 선형의 6개 탄소 사슬 링커를 포함한다.
[0049] 일부 구체예에서, 조성물 또는 혼합물은 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 포함한다.
[0050] 일부 구체예에서, 과다증식 장애 또는 암은 난소암 또는 유방암이다.
[0051] 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1, B7-H1 또는 CD274로도 알려짐), 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1) 또는 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4)의 억제제 또는 길항제이다. 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 GITR(글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 단백질), VISTA(V-도메인 면역글로불린(Ig)-함유 T-세포 활성화 억제제), TIGIT(Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체), LAG-3(림프구-활성화 유전자 3), TIM3(T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인-함유 단백질 3), IDO(인돌아민 2,3 디옥시게나제), OX-40(CD134/OX40 수용체), 또는 항-NKG2A(예를 들어, 모날리주맙(monalizumab))의 억제제이다. 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 소형 화합물 억제제이다. 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 항체(예를 들어, 모노클로날 항체)이다.
[0052] 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 PD-L1 또는 PD-1에 결합하는 길항제 항체이다. 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 항-PD-L1 마우스 모노클로날 항체(예를 들어, 클론 10F.9G2)이다. 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 이필리무맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙, 세미플리맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙으로 구성된 군으로부터 선택된다.
[0053] 방법에 따라 치료할 수 있는 대상체는 포유 동물을 포함한다. 특정 구체예에서, 대상체는 인간이다.
도면의 설명
[0054] 도 1은 LHRH-Phor21이 Phor21-βCG-ala보다 빠르게 암 세포를 사멸시킴을 보여준다. 인간 흑색종 세포(MDA-MB-435S.luc, 다양한 계대 번호)를 Phor21-βCG-ala 또는 LHRH-Phor21과 함께 인큐베이션하였다.
[0055] 도 2는 Phor21-βCG-ala와 비교하여, 용해 도메인에 21개(Phor21), 18개(Phor18(338983) = CLIP71) 및 15개(Phor15) 아미노산을 갖는 βCG-ala 융합 작제물의 MDA-MB-435S.luc 세포에 대한 세포독성(마이크로몰 IC50)을 보여준다.
[0056] 도 3은 βCG-ala 및 LHRH 융합 작제물의 MDA-MB-435S.luc 세포에 대한 세포독성(마이크로몰 IC50)을 보여준다. Phor21-βCG-ala보다 MDA-MB-435S.luc 세포에 더 독성인 융합 작제물이 도면의 오른쪽에 나열되어 있다.
[0057] 도 4는 황체 형성 호르몬-방출 호르몬(LHRH) 융합 작제물의 MDA-MB-435S.luc 세포에 대한 세포독성(마이크로몰 IC50)을 보여준다. 융합 작제물은 다음과 같다: 323033 = Phor21-βCG-ala, 337479 = LHRH-Phor21, 337480 = Phor21-LHRH, 338611 = D-ala-Phor21-LHRH, 338612 = Phor18-ASAAS-LHRH, 338613 = Phor18-LHRH (EP-100), 339385 = D-ala-Phor18-LHRH, 및 339347 = Phor18-루프론.
[0058] 도 5는 Phor21-βCG-ala와 비교하여 인간 적혈구에 대한 βCG-ala 및 LHRH 융합 작제물의 급성 용혈 활성(마이크로몰 HA50)을 보여준다. LHRH-Phor21, Phor21-LHRH 및 Phor18-루프론(QHWSY(D-Leu)LRPNEt = Lupron)을 제외하고, 모든 융합 작제물은 Phor21-βCG-ala보다 유의하게 더 낮은 용혈 활성을 가졌다.
[0059] 도 6은 세포독성과 용혈 활성의 비교를 보여준다. 화살표로 표시된 펩티드는 Phor21-βCG-ala보다 세포에 더 독성이다.
[0060] 도 7은 치료 일정 개요이다.
[0061] 도 8a-8j는 컨쥬게이션되지 않은 Phor21, 컨쥬게이션되지 않은 Phor18(338983)=(CLIP71) 및 (KKKFAFA)3 컨쥬게이트(338984)와 비교하여 3개의 βCG 컨쥬게이트를 사용한 치료 동안 및 연구 종점에서의 종양 상태의 요약이다. 융합 작제물 코드, 33 = Phor21β-CG-ala; 76 = Phor18-βCG-ala; 81 = D-ala-Phor21-βCG-ala; 85 = D-ala-Phor18-LHRH; 47 = Phor18-루프론; 13 = Phor18-LHRH; 11 = D-ala-Phor21-LHRH; 12 = Phor18-ASAAS-LHRH; 71 = Phor15-βCG-ala; 및 74 = Phor15-C6-βCG-ala 뒤에 연구에 사용된 작제물의 양이 온다.
[0062] 도 9a-9h는 30일까지 지정된 기간에 a) Phor21-βCG-ala(33); b) D-ala-Phor21-LHRH(11); c) Phor18-루프론(47); d) Phor18-ASAAS-LHRH(12); E) Phor18-LHRH(13); f) (KKKFAFA)3-LHRH; G) D-ala-Phor18-LHRH(85)에 대한 염수 및 기준선 값과 비교한; 및 h) 기준선과 비교한 치료 그룹의 종양 부피를 보여준다.
[0063] 도 10a-10e는 a) 종양 중량, b) 기준선과 비교한 종양 중량 변화, c) 살아있는 종양 세포의 총 수, d) 기준선과 비교한 살아있는 종양 세포의 총 수의 변화, 및 e) 체중에 대한 Phor21-βCG-ala와 비교하여 5개의 LHRH 컨쥬게이트를 사용한 연구 종점에서의 종양 상태의 요약을 보여준다. 338614 = (KKKFAFA)3 LHRH, 338612 = Phor18-ASAAS-LHRH, 338613 = Phor18-LHRH, 및 339385 = D-ala-Phor18-LHRH.
[0064] 도 11은 지시된 양의 독소루비신의 존재하에 증가하는 농도의 Phor21-βCG-ala와 함께 인큐베이션된 다중-약물 내성인 난소암 세포(OVCAR 3)를 보여주며, 세포의 사멸은 조합에 의해 가장 높은 독소루비신 농도에서 200배 강화되었다.
[0065] 도 12는 LHRH와 Phor21 및 βCG와 Phor21 융합 작제물을 사용한 MDA-MB-435S.luc 세포와 비교하여 CHO(중국 햄스터 난소) 및 TM4 세포의 세포독성을 보여준다. TM4 세포는 LHRH 수용체 음성이고, CHO 세포는 CG 수용체 음성이고, MDA-MB-435S.luc 세포는 LHRH 및 CG 수용체 둘 모두를 발현한다.
[0066] 도 13a는 LHRH 표적화 리간드에 컨쥬게이션된 용해 펩티드를 포함하는 예시적인 융합 작제물(EP-100 = 338613 = Phor18-LHRH)을 사용하여 표적화된 막 파괴에 의한 신속한 사멸의 한 구체예의 예시를 보여준다. 도 13b는 EP-100의 구조를 만화로 나타낸 것이다.
[0067] 도 14A-14F는 뮤린 난소암 세포에서 황체 형성 호르몬-방출 호르몬 수용체(LHRH-R)의 차별적 발현 및 EP-100(Phor18-LHRH)의 세포독성 효과를 보여준다. 도 14A 및 14B는 IC50의 EP-100으로 처리 후 72시간에 세포 생존력을 보여준다. 도 14C-14F는 뮤린 난소암 세포에서 LHRH-R 발현의 mRNA 및 단백질 수준을 보여준다.
[0068] 도 15a-15e는 LHRH-R이 암 세포에서 EP-100(Phor18-LHRH) 매개 세포독성에 필수적임을 입증한다. 도 15a는 LHRH-R을 표적화하는 100 nM의 다양한 siRNA로 형질감염된 ID8 세포를 보여준다. 비특이적 siRNA(NSsiRNA)를 대조군으로 사용하였다. 24시간(hr) 동안 1 μM EP-100(도 15b) 및 다양한 농도의 EP-100(도 15c)의 존재하에 배양된 ID8 암 세포 및 LHRH-R siRNA-형질감염된 ID8 암 세포의 생존력이 도시된다. 다양한 농도의 EP-100, 류프롤리드 아세테이트, 또는 CLIP-71의 존재하에 ID8(도 15d) 및 IG10(도 15e) 암 세포의 생존력이 또한 도시된다.
[0069] 도 16a-16b는 T 세포 수용체에 대한 EP-100의 효과를 보여준다. 세포를 EP-100(1 μM)의 존재하에 24시간 동안 배양한 다음 PD-L1 발현을 결정하였다. 도 16a는 RTPCR 분석을 보여준다. 도 16b는 웨스턴 블롯 분석을 보여준다.
[0070] 도 17a-17e는 ID8 난소암 세포 이종이식 마우스 모델에서 PD-L1 항체의 존재하에 EP-100(Phor18-LHRH)으로 치료한 생물학적 효과를 보여준다. 도 17a는 조합 EP-100 + PD-L1 항체를 사용한 치료 일정을 보여준다. ID8-루시퍼라제를 주사한 마우스로부터 확립된 종양의 크기에 대한 이 조합의 효과를 평가하였다(도 17b). 오차 막대는 표준 편차(SD)를 나타낸다. ID8-루시퍼라제 세포로 복강 내 접종된 마우스를 비히클(대조군), 단일-제제 PD-L1 항체(200 μg/kg 1주일에 2회 복강 내), EP-100(0.2 mg/kg 1주일에 2회 정맥 내), 또는 EP-100 + PD-L1 항체의 조합으로 치료하였다. 체중(도 17c), 종양 중량(도 17d), 및 복수(도 17e)에 대한 효과가 도시된다.
[0071] 도 18a-18b는 ID8 암 세포 이종이식 마우스 모델에서 EP-100(Phor18-LHRH) + PD-L1 항체의 조합으로 치료한 후 면역 세포 프로파일을 보여준다. 종양(도 18a) 및 복수(도 18b)의 면역 프로파일은 ID8-루시퍼라제 암 세포를 사용하여 FACS 분석을 사용하여 평가되었다. CD45+ 세포 분획은 종양 조직의 해리 후 살아있는 세포의 게이트에서 분리되었다. CD8+ T 세포는 CD45+CD3+CD4-CD8+, Treg는 CD45+CD3+CD4+CD25+FoxP3+, NK 세포는 CD45+NK1, B 세포는 CD45+/CD19+, 대식세포는 CD45+/CD11b+/F4/80+, DC는 CD45+/CD11b+/CD11c, 및 단핵구 MDSC는 CD45+CD3-CD11b+Ly6G-Ly6Chigh로서 정의된다. 각 점은 한 마리 마우스의 데이터를 나타낸다.
[0072] 도 19a-19d는 EP-100(Phor18-LHRH)으로 처리된 ID8 세포에 의한 사이토카인 및 케모카인 분비의 어레이 분석을 보여준다. 어레이 이미지는 2, 4 및 12h에 처리되지 않은 및 EP-100-처리된 ID8 세포로부터 검출된 각 사이토카인 또는 케모카인의 스팟을 보여준다(도 19a). EP-100 처리된 ID8 세포에서의 평균 픽셀 밀도 대 대조군에서의 비율은 배수 증가로 제시되었다(도 19b). 다양한 시간에 EP-100 처리 후(도 19c), 및 αPD-L1 또는 αPD-L1와 EP-100 조합 처리(도 19d) 후 ID8 세포에서 IL-33 분비.
[0073] 도 20A-20C는 T 세포 활성화에 대한 IL-33의 역할을 보여준다. 나이브 T 세포 및 CD8+ T 세포에서 LHRH-R 발현(도 20A). 나이브 T 세포 및 활성화된 T 세포에 대한 EP-100 세포독성 효과(도 20B). T 세포 활성화에 대한 조건 배지(CM) 효과(도 20C).
[0074] 도 21은 15일에 걸친 치료 동안 동계 마우스 모델에서 EMT-6 유방암 종양의 종양 부피를 보여준다. 치료 그룹은 비히클 대조군, Phor18-LHRH 0.5 mg/kg, 항-CTLA4 항체 및 Phor18-LHRH+항-CTLA4 항체를 포함하였다.
상세한 설명
[0075] 본원의 특정 구체예에서 제2 도메인 결합 부분에 연결되거나 융합된 제1 도메인 용해 부분을 포함하는 융합 작제물이 본원에 제공된다. 전형적인 구성에서, 융합 작제물 제1 도메인은 세포에 직접 또는 간접적으로 독성인 용해 부분을 포함하며, 이에 의해 세포 증식 또는 생존을 감소시키거나, 세포 죽음, 사멸 또는 아폽토시스를 자극, 유도, 증가 또는 향상시킬 수 있고; 융합 작제물 제2 도메인은 결합 모이어티 실체로 지칭되는 세포를 표적화하는 부분을 포함한다. 개시된 융합 작제물은, 특정 구체예에서, 특정 암을 치료하기 위해 체크포인트 억제제와 조합하여 사용될 수 있으며, 이들의 비제한적인 예는 난소암 및 유방암을 포함한다.
[0076] 특정 구체예에서, 융합 작제물은 제1 "용해" 도메인을 포함하거나 이로 구성되며, 제2 "표적화" 또는 "결합" 도메인을 포함하거나 이로 구성된다. 한 구체예에서, 융합 작제물은 펩티드 서열(아미노산, 예를 들어, 리신=K, 페닐알라닌=F 및 알라닌=A로부터 선택됨), 예를 들어, KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK을 포함하는 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개의 잔기 L- 또는 D-아미노산 서열로 구성된 제1 도메인, 및 표적화 또는 결합 모이어티를 포함하거나 이로 구성된 제2 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 융합 작제물은 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 L- 또는 D-아미노산 서열로 구성된 제1 도메인, 및 표적화 또는 결합 모이어티를 포함하거나 이로 구성된 제2 도메인을 포함한다. 추가의 구체예에서, 융합 작제물은 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 L- 또는 D-아미노산 서열로 구성된 제1 도메인, 및 제1 도메인과 별개인 1-25개의 L- 또는 D-아미노산 서열(예를 들어, 표적화 또는 결합 모이어티)로 구성된 제2 도메인을 포함하거나 이로 구성된다.
[0077] 본원에서 사용되는 용어 "융합" 또는 "키메라" 및 이의 문법적 변형은 작제물과 관련하여 사용될 때, 작제물이 서로 별개이고 전형적으로 자연에서 함께 존재하지 않는 2개의 상이한 분자 실체로부터 유래되거나, 획득 또는 분리되거나, 이를 기반으로 하거나 이후 모델링되는 부분 또는 섹션을 포함하는 것을 의미한다. 즉, 예를 들어, 융합 작제물의 한 부분은 용해 부분을 포함하거나 이로 구성되며, 작제물의 제2 부분은 결합 능력을 갖는 모이어티와 같은 표적화 부분을 포함하거나 이로 구성되며, 제1 및 제2 도메인 각각은 구조적으로 별개이다. 융합 작제물은 또한 "컨쥬게이트"로 지칭될 수 있으며, 여기서 컨쥬게이트는 제1 도메인 용해 부분 및 제2 도메인 표적화 또는 결합 모이어티를 포함하거나 이로 구성된다.
[0078] 융합 작제물의 제1 도메인 및 또는 제2 도메인은 아미노산 서열(펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 렉틴), 핵산(DNA, RNA) 및 탄수화물(당류, 시알산, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 아세틸뉴라민산 등)을 포함하거나 이로 구성된다. 용어 "아미노산 서열", "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 아미드 결합 또는 등가물에 의해 공유 연결된 2개 이상의 아미노산 또는 "잔기"를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 아미노산 서열은, 예를 들어, 글루타르알데히드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 이작용성 말레이미드, 또는 N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC)로 형성된 것들을 포함하는 비-천연 및 비-아미드 화학 결합에 의해 연결될 수 있다. 비-아미드 결합은, 예를 들어, 케토메틸렌, 아미노메틸렌, 올레핀, 에테르, 티오에테르 등을 포함한다(예를 들어, 문헌[Spatola in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357 (1983), "Peptide and Backbone Modifications," Marcel Decker, NY] 참조).
[0079] 융합 작제물 또는 키메라의 제1 및 제2 도메인은 L-아미노산 서열, D-아미노산 서열 및 L-아미노산과 D-아미노산의 혼합물을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 제1 및 제2 도메인의 아미노산 서열은 선형 또는 사이클릭 구조일 수 있고, 별개의 모이어티(예를 들어, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 도메인 등)에 컨쥬게이션될 수 있고, 분자 내 또는 분자 간 디설파이드 결합을 형성할 수 있고, 또한 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 갖는 고차 다량체 또는 올리고머, 또는 다른 분자를 형성할 수 있다.
[0080] 융합 작제물의 예시적인 길이는 약 5 내지 15개, 20 내지 25개, 25 내지 50개, 50 내지 100개, 100 내지 150개, 150 내지 200개, 또는 200 내지 300개 이상의 아미노산 잔기의 길이이다. 특정 구체예에서, 제1 또는 제2 도메인은 약 1 내지 10개, 10 내지 20개, 15 내지 20개, 20 내지 30개, 30 내지 40개, 40 내지 50개, 60 내지 70개, 70 내지 80개, 80 내지 90개, 90 내지 100개 이상의 잔기의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 보다 특정한 구체예에서, 제1 도메인은 15, 16, 17, 18, 19, 20, 28개 이상의 잔기의 아미노산 서열로 구성된다.
[0081] 융합 작제물 제1 도메인은, 단독으로 또는 제2 도메인과 조합하여, 선택적으로 양친매성 알파-나선을 형성한다. 양친매성 알파-나선은 알파-나선의 한쪽에 대부분 친수성 아미노산을 포함하고 다른 쪽은 대부분 소수성 아미노산을 포함한다. 알파 나선은 3.6개 잔기마다 완전한 회전을 하기 때문에, 양친매성 알파 나선의 아미노산 서열은 3 내지 4개의 잔기마다 친수성 잔기와 소수성 잔기가 번갈아 가며 나타난다. PNNPNNP 반복 패턴 또는 모티프가 양친매성 알파-나선을 형성하는 것으로 예측되며, 여기서 P는 양으로 하전된 아미노산 잔기를 나타내고 N은 중성 아미노산 잔기를 나타낸다. PNNPNNP 반복 패턴은 용해 펩티드에 대해 음으로 하전된 세포막에 대한 양이온 결합 부위 및 막 상호작용/침투를 위한 소수성 부위를 제공한다. 따라서, 융합 작제물은 하나 이상의 중단되지 않은 PNNPNNP 반복 패턴 또는 모티프를 갖는 제1 도메인, 또는 양친매성 알파-나선을 형성할 수 있는 하나 이상의 중단된 PNNPNNP 반복 패턴 또는 모티프를 포함한다. 예를 들어, KFAKFAKKFAKFAKK 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAK와 같은 15개 또는 18개 잔기의 아미노산 서열은 중단되지 않은 및 중단된 PNNPNNP 반복 모티프를 갖는다.
[0082] 표적화 또는 결합 모이어티와 같은 융합 작제물 제2 도메인은 리간드, 항체(또는 이의 항원-결합 단편), 항원, 인테그린, 인테그린 수용체(예를 들어, "RGD" 서열 모티프를 함유하는 단백질 또는 펩티드, 및 세포 외 기질(ECM)에 존재할 수 있는 성분, 예를 들어, 단당류, 이당류 또는 올리고당류, 시알산, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 아세틸뉴라민산), 성장 인자, 사이토카인, 케모카인, 및 수용체, 항체, 항원, 인테그린, 인테그린 수용체(예를 들어, "RGD" 서열 모티프를 함유하는 단백질 또는 펩티드, 및 세포 외 매트릭스(ECM)에 존재할 수 있는 성분, 예를 들어, 단당류, 이당류 또는 올리고당류, 시알산, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 아세틸뉴라민산), 성장 인자 수용체, 사이토카인 수용체 및 케모카인 수용체에 결합하는 표적화 및 결합 모이어티를 포함하거나 이로 구성된다.
[0083] "수용체"는 전형적으로 세포 상에 (예를 들어, 막 수용체) 또는 세포 내에 존재한다. 수용체는 세포막 표면과 결합하거나 세포막을 횡단할 수 있다. 예를 들어, 수용체 단백질은 선택적으로 세포질 또는 세포 외인 부분, 또는 둘 모두를 갖는 세포막을 횡단하는 막횡단 도메인을 가질 수 있다. 따라서 수용체는 세포 외, 막횡단 또는 세포질 부분을 함유하는 전장 온전한 천연 수용체뿐만 아니라 이의 트렁케이션된 형태 또는 단편(예를 들어, 수용체의 세포 외, 막횡단 또는 세포질 부분 또는 서브서열 단독, 또는 조합)을 포함한다. 예를 들어, 가용성 수용체는 전형적으로 막횡단이 결여되어 있고, 선택적으로 또한 천연 세포 외 또는 세포질 영역(천연 수용체에 존재하는 경우)의 전부 또는 일부가 결여될 수 있다. 이러한 트렁케이션된 수용체 형태 및 단편은 적어도 리간드에 대한 부분적인 결합을 유지할 수 있다.
[0084] 융합 작제물의 표적화 및 결합 모이어티 도메인은, 특이적으로 또는 비특이적으로, 수용체 리간드로 표시되는 수용체에 결합하는 임의의 실체를 포함하거나 이로 구성된다. 따라서 표적화 및 결합 모이어티의 비제한적인 예는 호르몬, 호르몬 유사체, 호르몬 수용체에 결합하는 호르몬 또는 호르몬 유사체의 단편, 성장 인자, 성장 인자 유사체, 수용체에 결합하는 성장 인자 또는 성장 인자 유사체의 단편, 호르몬 또는 호르몬 수용체에 결합하는 호르몬 수용체 또는 리간드, 및 호르몬, 호르몬 유사체, 호르몬 수용체에 결합하는 호르몬 또는 호르몬 유사체의 단편, 호르몬 또는 호르몬 수용체에 결합하는 호르몬 수용체 또는 리간드, 성장 인자, 성장 인자 유사체, 수용체에 결합하는 성장 인자 또는 성장 인자 유사체의 단편, 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에 결합하는 성장 인자 수용체 또는 리간드 등에 결합하는 표적화 및 결합 모이어티를 포함한다.
[0085] 결합 모이어티로서 유용한 호르몬의 비제한적인 예는 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 I, 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 II, LHRH, 칠성장어 III 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 황체 형성 호르몬 베타 사슬, 황체 형성 호르몬(LH), 융모 생식샘 자극 호르몬(CG), 융모 생식샘 자극 호르몬 베타 서브유닛(β- 또는 베타-CG), 멜라닌세포 자극 호르몬, 에스트라디올, 디에틸스틸베스트롤, 도파민, 소마토스타틴, 난포-자극 호르몬(FSH), 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 프로게스테론, 안드로겐 및 이들의 유도체를 포함한다. 결합 모이어티로서 유용한 예시적인 호르몬 수용체는 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 I 수용체, 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 II 수용체, 칠성장어 III 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 수용체, 황체 형성 호르몬 수용체, 융모 생식샘 자극 호르몬 수용체, 멜라닌세포 자극 호르몬 수용체, 에스트라디올 수용체, 도파민 수용체, 소마토스타틴 수용체, 난포-자극 호르몬(FSH) 수용체, 표피 성장 인자(EGF) 수용체, 성장 호르몬(GH) 수용체, Her2-neu 수용체, 글루코코르티코이드 호르몬 수용체, 에스트로겐 수용체, 테스토스테론 수용체, 프로게스테론 수용체, 안드로겐 수용체, 이들의 조합물, 이들의 생물학적 활성 부분, 및 이들의 유사체를 포함한다.
[0086] 예시적인 성장 인자는 LHRH, 표피 성장 인자(EGF), 성장 호르몬(GH) 및 Her2-neu를 포함한다. 예시적인 성장 인자 수용체는 표피 성장 인자(EGF) 수용체, 성장 호르몬(GH) 수용체, 및 Her2-neu 수용체, IGF-1을 포함한다. 일부 구체예에서, 융합 작제물 또는 융합 작제물의 결합 모이어티는 LHRH 폴리펩티드, LHRH 폴리펩티드의 생물학적 활성 부분 또는 이의 동족 수용체(예를 들어, LHRH 수용체)에 결합할 수 있는 LHRH 폴리펩티드의 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, LHRH 폴리펩티드는 다음과 같이 제시된 아미노산 서열을 포함한다: QHWSYGLRPG(SEQ. ID NO.9). LHRH 폴리펩티드는 LHRH 폴리펩티드가 생물학적 활성 및/또는 수용체 결합 능력을 유지하는 한 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
[0087] 표적화 또는 결합 모이어티의 특정 비제한적인 예는 LHRH, 이의 LHRH 기능성(결합) 단편, LHRH 유사체, 및 βCG, 이의 βCG 기능성(결합) 단편 및 βCG 유사체를 포함한다. LHRH는 완전 기능성 리간드이며, 신호 전달 경로의 활성화와 같은 리간드 수용체 상호작용을 통해 약리학적 효과를 유발할 수 있다. βCG-ala는 어떠한 약리학적 효과도 유발하지 않고 세포막에 결합할 수 있는 hCG의 단편이다. 표적화 또는 결합 모이어티의 특정 비제한적인 예는 하기 내의 또는 하기와 같이 제시된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다: SYAVALSAQAALARR; βCG의 단편인 SYAVALSAQAALARRA, 및 LHRH 서열인 QHWSYGLRPG.
[0088] 표적화 및 결합 모이어티는 신생물, 종양 또는 암 세포, 및 신생물, 종양 또는 암 세포와 관련된 림프 또는 혈관에서 배타적으로 또는 우선적으로 발현되는 리간드에 대한 항원을 추가로 포함한다. 이러한 항원은 "종양 관련 항원" 또는 "TAA"로 편리하게 지칭될 수 있으며, 몇 가지만 말하자면, 암배아 항원(CEA), 알파-태아단백질(AFP), 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), CA-125(잔존 상피 난소암), 가용성 인터루킨-2(IL-2) 수용체, RAGE-1, 티로시나제, MAGE-1, MAGE-2, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, 당단백질(gp) 75, gp100, 베타-카테닌, PRAME, MUM-1, ZFP161, 유비퀼린-1, HOX-B6, YB-1, 오스테오넥틴 및 ILF3, IGF-1을 포함한다. 표적화될 수 있는 다른 항원은 CD19, CD20, CD23, CD27, CD28, CD30, CD33, CD40, CD52, CD56, CD70, CD154, 면역글로불린-유사 수용체 등이다.
[0089] 표적화 및 결합 모이어티는 트랜스페린, 엽산 및 이의 유도체(예를 들어, 폴레이트), 및 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리 구성원 및 TNF 수용체, 예를 들어, TNF-알파, TNF-베타(림포톡신, LT), TRAIL, Fas, LIGHT, 41BB를 추가로 포함한다.
[0090] 제2 도메인이 표적화 또는 결합 도메인을 포함하거나 이로 구성된 융합 작제물은 제 2 도메인이 결합하는 항원, 수용체 또는 리간드, 인테그린, 항체 또는 항원, 또는 TAA를 생산하거나 발현하는 세포에 결합할 수 있다. 세포의 비제한적인 예는 과다증식성 세포 및 비정상적이거나 바람직하지 않은 과다증식을 나타내는 세포를 포함한다. 특정 비제한적인 예에서, 이러한 세포는 비-전이성 및 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성 세포뿐만 아니라 파종된 신생물, 암, 종양 및 악성 세포 및 휴면 신생물, 암, 종양 및 악성 세포를 포함한다. 항원, 수용체, 리간드, 인테그린, TAA 등을 정상 또는 비-과다증식 세포에 비해 상승된 수준으로 발현하는 세포는 이러한 세포에 대한 선택성을 제공한다. 따라서, 표적화 또는 결합 모이어티는 과다증식성 세포(예를 들어, 비-전이성 및 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성종양, 및 파종 및 휴면 신생물, 암, 종양 및 악성 세포)에서 발현되거나 이에 의해 생산되지만, 정상 또는 비-과다증식성 세포에 의해서는 검출 가능하게 발현되지 않거나 비교적 낮은 수준으로 생산되거나 발현되는 항원, 수용체, 리간드, 인테그린 또는 TAA에 결합하여, 과다증식성 세포를 우선적으로 표적화할 수 있다. 항원, 수용체, 리간드, 인테그린 또는 TAA를 발현하는 예시적인 비제한적인 세포 및 조직 유형은 유방, 난소, 자궁, 자궁경부, 전립선, 고환, 부신, 뇌하수체, 췌장, 간, 위장, 피부, 근육 또는 자궁내막 세포를 포함한다.
[0091] 결합 모이어티의 추가 예는 항체 및 항체 단편을 포함한다. "항체"는 IgM, IgG, IgA, IgE, IgD, 및 이들의 임의의 서브부류와 같은 임의의 모노클로날 또는 폴리클로날 면역글로불린 분자를 지칭한다. IgG에 대한 예시적인 서브부류는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4이다. 항체는 B 세포와 같은 세포에 의해 생산되거나 세포 상에서 발현되는 것들을 포함한다. 항체 단편 또는 서브서열은 비교 전장 항체의 적어도 부분적인 항원 결합 능력을 보유하는 전장 항체의 일부를 지칭한다. 예시적인 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, 단일쇄 Fv(scFv), 디설파이드-연결된 Fvs(sdFv), VL, VH, 삼중특이적(Fab3), 이중특이적(Fab2), 디아바디((VL-VH)2 또는 (VH-VL)2), 트리아바디(3가), 테트라바디(4가), 미니바디((scFV-CH3)2), 이중특이적 단일쇄 Fv(Bis-scFv), IgGdeltaCH2, scFv-Fc, (scFv)2-Fc, 또는 온전한 면역글로불린의 다른 항원 결합 단편을 포함한다.
[0092] 융합 작제물은 아미노-말단에 제1 도메인 및 카르복실-말단에 제2 도메인을 갖는 것들을 포함한다. 융합 작제물은 또한 카르복실-말단에 제1 도메인 및 아미노-말단에 제2 도메인을 갖는 것들을 포함한다. 추가 도메인이 존재하는 경우(예를 들어, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 도메인 등), 제1 도메인은 제2 도메인에 대해 NH2-말단에 위치하거나, 제2 도메인은 제1 도메인에 대해 NH2-말단에 위치한다.
[0093] 본원에 제시된 다양한 서열의 서브서열 및 아미노산 치환, 예를 들어, KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, 또는 결합 모이어티가 또한 포함된다. 특정 구체예에서, 제1 또는 제2 도메인의 서브서열은 적어도 5 내지 10개, 10 내지 15개, 15 내지 20개, 20 내지 25개, 25 내지 30개, 30 내지 35개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다.
[0094] 따라서, 본 발명은 제1 또는 제2 도메인, 또는 제1 및 제2 도메인 모두의 치환, 첨가 또는 결실과 같은 변형 또는 변동을 포함한다. 따라서, 펩티드 서열 제1 또는 제2 도메인을 포함하는 융합 작제물은 임의의 수의 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, 단, 이러한 치환은 제1 또는 제2 도메인의 활성(용해 또는 결합)을 파괴하지 않는다. 따라서, 예를 들어, 변형된 용해 부분(제1 도메인)은 변형되지 않은 제1 도메인의 세포 사멸 또는 아폽토시스와 같은 적어도 부분적인 용해 활성을 보유할 수 있고, 변형된 결합 모이어티 또는 이의 모방체는 변형되지 않은 결합 모이어티의 적어도 부분적인 결합 활성을 보유할 수 있다.
[0095] "보존적 치환"은 하나의 아미노산을 생물학적, 화학적 또는 구조적으로 유사한 잔기로 대체하는 것이다. 생물학적으로 유사하다는 것은 그 치환이 생물학적 활성, 예를 들어, 용해 활성과 양립할 수 있음을 의미한다. 구조적으로 유사하다는 것은 아미노산이 유사한 길이를 갖는 측쇄, 예를 들어, 알라닌, 글리신 및 세린을 갖거나, 유사한 크기를 갖거나, 또는 양친매성 알파 나선과 같이, 제1, 제2 또는 추가 도메인의 구조가 유지됨을 의미한다. 화학적 유사성은 잔기가 동일한 전하를 갖거나 둘 모두가 친수성 또는 소수성임을 의미한다. 특정 예는 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기를 다른 것으로 치환하거나, 아르기닌을 리신으로, 글루탐산을 아르파르트산으로, 또는 글루타민을 아스파라긴으로, 세린을 트레오닌으로 치환하는 것 등과 같은 하나의 극성 잔기를 다른 것으로 치환하는 것을 포함한다. 융합 작제물 변이체가 활성, 예를 들어, 용해 활성 또는 결합 활성을 갖는지를 결정하기 위해 일상적인 검정이 사용될 수 있다.
[0096] 특정 예는 펩티드 제1 또는 제2 도메인의 하나 이상의 아미노산(예를 들어, 1-3, 3-5, 5-10, 10-20개 또는 그 초과) 잔기의 치환 또는 결실을 포함한다. 변형된 융합 작제물은 참조 서열(예를 들어, 제1 도메인, 예를 들어, KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 또는 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, 또는 결합 모이어티와 같은 제2 도메인)과 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 이상의 동일성을 갖는 펩티드 서열을 가질 수 있다.
[0097] 특정 구체예에서, 융합 작제물은 K 잔기 중 하나 이상이 F 또는 L 잔기로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 K, A 또는 L 잔기로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 K, F 또는 L 잔기로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개 잔기의 L- 또는 D-아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 펩티드 제1 도메인을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 융합 작제물은 K 잔기 중 하나 이상이 F 또는 L 잔기로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 K, A 또는 L 잔기로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 K, F 또는 L 잔기로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 L- 또는 D-아미노산 서열로 구성된 펩티드 제1 도메인; 및 결합 모이어티를 포함하거나 이로 구성된 펩티드 제2 도메인을 포함한다. 추가의 특정 구체예에서, 융합 작제물은 K 잔기 중 하나 이상이 임의의 F 또는 L 잔기로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, A 또는 L 잔기로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, F 또는 L 잔기로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 L- 또는 D-아미노산 서열로 구성된 펩티드 제1 도메인, 및 제1 도메인과 별개인 1-25개의 L- 또는 D-아미노산 서열(예를 들어, 결합 모이어티)로 구성된 제2 펩티드 도메인을 포함하거나 이로 구성된다.
[0098] 용어 "동일성" 및 "상동성" 및 이의 문법적 변형은 2개 이상의 참조된 실체가 동일함을 의미한다. 따라서, 2개의 아미노산 서열이 동일한 경우, 이들은 동일한 아미노산 서열을 갖는다. "동일성 영역, 지역 또는 도메인"은 2개 이상의 참조된 실체의 일부가 동일함을 의미한다. 따라서, 2개의 아미노산 서열이 하나 이상의 서열 영역에 걸쳐 동일하거나 상동성인 경우, 이들은 이러한 영역에서 동일성을 공유한다. 핵산 서열과 관련하여 사용될 때, 용어 "상보적"은 참조된 영역이 100% 상보적임을 의미하며, 즉, 불일치가 없는 100% 염기 페어링을 나타낸다.
[0099] 구조적으로 및 기능적으로 관련된 단백질 사이의 서열 보존량의 차이로 인해, 기능 또는 활성(예를 들어, 용해 또는 결합)을 유지하는데 필요한 서열 동일성의 양은 단백질, 영역 및 그 영역의 기능 또는 활성에 따라 달라진다. 예를 들어, 용해 펩티드 서열의 경우 다수의 PNNPNNP 서열 반복 패턴 또는 모티프가 존재할 수 있지만, 하나 이상의 중단되거나 중단되지 않은 PNNPNNP 서열 반복 패턴 또는 모티프가 존재할 필요는 없다.
[0100] 두 서열 사이의 동일성의 정도는 당 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램 및 수학적 알고리즘을 사용하여 확인될 수 있다. 서열 동일성(상동성) 퍼센트를 계산하는 이러한 알고리즘은 일반적으로 비교 영역에 대한 서열 갭 및 불일치를 설명한다. 예를 들어, BLAST(예를 들어, BLAST 2.0) 검색 알고리즘(예를 들어, NCBI를 통해 공개적으로 이용 가능함, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990) 참조)은 다음과 같은 예시적인 검색 파라미터를 갖는다: 불일치 -2; 갭 오픈 5; 갭 연장 2. 폴리펩티드 서열 비교를 위해, BLASTP 알고리즘은 일반적으로 PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 또는 BLOSUM 50과 같은 스코어링 매트릭스와 함께 사용된다. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3) 및 SSEARCH 서열 비교 프로그램은 또한 동일성의 정도를 정량화하는데 사용된다(Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185 (2000); and Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195 (1981)). Delaunay-기반 토폴로지 맵핑을 사용하여 단백질 구조적 유사성을 정량화하기 위한 프로그램도 개발되었다(Bostick et al., Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)).
[0101] 개별 잔기 및 제1, 제2 및 추가 도메인은 공유 또는 비공유 결합에 의해 연결될 수 있다. 공유 결합의 비제한적인 예는 아미드 결합, 비-천연 및 비-아미드 화학 결합이며, 이는, 예를 들어, 글루타르알데히드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 이작용성 말레이미드, N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드(DCC) 또는 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIC)를 포함한다. 아미드 결합에 대한 대안적인 연결기는, 예를 들어, 케토메틸렌(예를 들어, -C(=O)-NH-의 경우 -C(=O)-CH2-), 아미노메틸렌(CH2-NH), 에틸렌, 올레핀(CH=CH), 에테르(CH2-O), 티오에테르(CH2-S), 테트라졸(CN4-), 티아졸, 레트로아미드, 티오아미드, 또는 에스테르를 포함한다(예를 들어, 문헌[Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, "Peptide and Backbone Modifications," Marcel Decker, NY] 참조).
[0102] 제1 및 제2 도메인은 공유 또는 비공유 결합에 의해 서로 바로 인접하게 융합되거나 연결될 수 있다. 제1 및 제2 도메인은 제1 및 제2 도메인 사이에 위치하는 힌지, 스페이서 또는 링커와 같은 개재 영역에 의해 분리될 수 있다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 도메인은 탄소 사슬에 의해 연결된다. 다중-탄소 사슬은 글루타르산, 숙신산 및 아디프산과 같은 카르복실산(예를 들어, 디카르복실산)을 포함한다.
[0103] 또 다른 구체예에서, 제1 및 제2 도메인은 제1 및 제2 도메인 사이에 위치하는 아미노산, 펩티드 또는 비펩티드 힌지, 스페이서 또는 링커에 의해 연결된다. 펩티드 힌지, 스페이서 또는 링커 서열은 임의의 길이일 수 있지만, 전형적으로 약 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 또는 40-50개 아미노산 잔기의 범위이다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 도메인 사이에 위치하는 펩티드 힌지, 스페이서 또는 링커는 1 내지 25개의 L- 또는 D-아미노산 잔기, 또는 1 내지 6개의 L- 또는 D-아미노산 잔기이다. 제1 및 제2 도메인 사이에 위치하는 서열에 포함된 특정 아미노산 잔기는 C, A, S 또는 G 아미노산 잔기 또는 그 중 하나 이상을 포함한다. 제1 및 제2 도메인 사이에 위치하는 펩티드의 특정 비제한적인 예는 GSGGS, ASAAS, 또는 CCCCCC로 제시된 서열 또는 그 안의 서열을 포함한다. 아미노산 및 펩티드의 유도체가 제1 및 제2 도메인 사이에 위치할 수 있다. 아미노산 유도체의 특정 비제한적인 예는 리신 유도체, 또는 α-아미노-카프로산과 같은 6개의 탄소 링커이다.
[0104] 힌지, 스페이서 또는 링커, 또는 제3, 제4, 제5, 제6, 제7 도메인 등을 갖거나 갖지 않는 융합 작제물은 전적으로 천연 아미노산 또는 합성, 비-천연 아미노산 또는 아미노산 유사체로 구성될 수 있거나, 유도체화된 형태를 포함할 수 있다. 다양한 구체예에서, 융합 작제물은 제1 또는 제2 도메인에서 L-아미노산으로 치환된 하나 이상의 D-아미노산, D-아미노산과 L-아미노산의 혼합물, 또는 전적으로 D-아미노산 잔기로 구성된 서열을 포함한다.
[0105] 융합 작제물은 비-천연 구조 성분의 임의의 조합을 함유할 수 있으며, 이는 전형적으로 다음 3개의 구조 기로부터 유래된다: a) 천연 아미드 결합("펩티드 결합") 연결 이외의 잔기 연결 기; b) 자연 발생 아미노산 잔기 대신에 비-천연 잔기; 또는 c) 2차 구조적 모방을 유도하는, 즉, 알파 나선 입체형태와 같은 2차 구조를 유도하거나 안정화하는 잔기. 융합 작제물은 분자의 아미노 및 카르복시-말단 사이의 말단-대-말단 아미드 결합 또는 분자 내 또는 분자 간 디설파이트 결합(들)과 같은 사이클릭 구조를 포함한다. 융합 작제물은 시험관 내 또는 생체 내에서 변형될 수 있으며, 예를 들어, 당 또는 탄수화물 잔기, 포스페이트 기, 지방산, 지질 등을 포함하도록 번역 후 변형될 수 있다.
[0106] 추가의 특정 예는 제3, 제4, 제5, 제6 또는 제7 도메인을 포함한다. 따라서, 제1 및 제2 도메인을 갖는 융합 작제물은 별개의 또는 상보적인 기능 또는 활성을 부여하기 위해 공유적으로 연결된 하나 이상의 추가 도메인(제3, 제4, 제5, 제6, 제7 등)을 포함한다. 예시적인 추가 도메인은, 예를 들어, 고정된 금속에 대한 정제를 허용하는 폴리히스티딘 트랙 및 히스티딘 트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이트 펩티드; 고정된 면역글로불린에 대한 정제를 허용하는 단백질 A 도메인; 및 FLAGS 확장/친화성 정제 시스템(Immunex Corp, Seattle WA)에서 사용되는 도메인을 포함하는 분리를 용이하게 하는 도메인을 포함한다. 정제 도메인과 융합 작제물 사이에 인자 Xa 또는 엔테로키나제와 같은 절단 가능한 서열의 선택적인 포함은 정제를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 6개의 히스티딘 잔기에 연결된 융합 작제물-인코딩 핵산 서열에 이어 티오레독신 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함할 수 있다. 히스티딘 잔기는 융합 작제물의 검출 및 정제를 용이하게 하는 반면, 엔테로키나제 절단 부위는 단백질의 나머지로부터 작제물을 정제하기 위한 수단을 제공한다(예를 들어, 문헌[Kroll, DNA Cell. Biol. 12:441 (1993)] 참조).
[0107] 융합 작제물 활성은 다양한 인자에 의해 영향을 받을 수 있으므로 융합 작제물은 이러한 인자 중 하나 이상을 고려하여 설계되거나 최적화될 수 있다. 이러한 인자는, 예를 들어, 세포에 대한 독성에 영향을 미칠 수 있는 융합 작제물의 길이를 포함한다. 특히, Phor21-βCG-ala 및 Phor21을 Phor14-βCG-ala와 비교할 때 증가된 세포독성이 관찰되었다. 용해 펩티드 도메인을 형성하는 알파 나선의 세포 사멸 활성은 또한 나선의 안정성에 의존할 수 있다. 힌지 및 스페이서는 제1 도메인의 막 상호작용 및 펩티드 용해 도메인의 나선 구조에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 스페이서 또는 힌지를 선택적으로 포함하는 21개 미만의 아미노산의 작제물과 같은 더 짧은 융합 작제물은 증가된 나선 안정성으로 인해 증가된 세포독성을 나타낼 수 있다. 특히, ASAAS 및 6 아미노카프로산과 스페이서는 더 짧은 융합 작제물의 독성을 증가시키는 경향이 있다. 도메인에 존재하는 특정 아미노산 잔기에 의해 부분적으로 결정되는 용해 펩티드 도메인의 전하는 또한 세포 사멸 효능에 영향을 미친다.
[0108] 용해 도메인(N- 또는 C-말단)에 대한 결합 모이어티의 위치가 또한 융합 작제물의 세포 사멸 활성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 용해 도메인에 대해 C-말단에 위치한 결합 모이어티는 용해 도메인에 대해 N-말단에 위치하는 경우보다 더 큰 세포 사멸 활성을 가졌다.
[0109] 융합 작제물 생체 내 반감기는 하나 이상의 비-자연 발생 아미노산 또는 유도체로 융합 작제물 펩티드 도메인을 작제함으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, D-아미노산을 갖는 융합 작제물(예를 들어, 모든 잔기의 최대 30% 이상이 D-거울상 이성질체임)은 혈청 단백질분해에 대해 내성이 있으며 따라서 더 긴 시간 동안 활성일 수 있고, 이에 따라 생체 내 효능이 증가될 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 비-자연 발생 아미노산 또는 유도체로 융합 작제물 펩티드 도메인을 작제하면 용혈 활성을 감소시킬 수 있다. D-거울상 이성질체를 갖는 이러한 융합 작제물은 또한 용액에서 단량체성인 경향이 더 크다-이들은 유의하게 응집하지 않는다.
[0110] 본 발명에 따르면, 세포 독성을 달성하는데 필요한 융합 작제물의 양을 나타내는 더 낮은 IC50 값에 의해 확인되는 바와 같이, Phor21-βCG-ala, Phor21-GSGGS-βCG-ala, Phor21-ASAAS-βCG-ala, 또는 Phor14-βCG-ala 중 하나 이상보다 더 큰 항-세포 증식 활성을 갖는 융합 작제물이 제공된다. 본 발명에 따르면, IC50/HA50(용혈 활성) 비율로 나타낸 바와 같이, Phor21-βCG-ala, Phor21-GSGGS-βCG-ala, Phor21-ASAAS-βCG-ala, 또는 Phor14-βCG-ala보다 더 작은 용혈 활성을 갖는 융합 작제물이 또한 제공된다. 본 발명에 따르면, IC50/HA50(용혈 활성) 비율로 나타낸 바와 같이, 약 0.02, 0.01, 또는 0.005 미만의 용혈 활성을 갖는 융합 작제물이 추가로 제공된다. 세포독성 및 용혈 활성을 결정하기 위한 대표적인 검정 조건은 실시예 1에 제시되어 있다.
[0111] 펩티드 및 펩티드 모방체는 당 분야에 공지된 방법을 사용하여 생산 및 분리될 수 있다. 펩티드는 당 분야에 공지된 화학적 방법을 사용하여, 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Caruthers (1980). Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215; Horn (1980); and Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA)] 참조). 펩티드 합성은 다양한 고체상 기술을 사용하여 수행될 수 있고(예를 들어, 문헌[Roberge Science 269:202 (1995); Merrifield, Methods Enzymol. 289:3(1997)] 참조) 자동 합성은, 예를 들어, ABI 431A 펩티드 합성기(Perkin Elmer)를 제조업체의 지침에 따라 사용하여 달성될 수 있다. 펩티드 및 펩티드 모방체는 또한 조합 방법론을 사용하여 합성될 수 있다. 모방체를 포함하는 합성 잔기 및 폴리펩티드는 당 분야에 공지된 다양한 절차 및 방법론을 사용하여 합성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman, et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY)] 참조). 변형된 펩티드는 화학적 변형 방법에 의해 생산될 수 있다(예를 들어, 문헌[Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440 (1997); Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19:373 (1995); and Blommers, Biochemistry 33:7886 (1994)] 참조).
[0112] 본 발명은 또한 본 발명의 융합 작제물을 인코딩하는 핵산 및 융합 작제물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 구체예에서, 핵산은 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하는 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28개 잔기의 아미노산 서열로 구성된 제1 도메인, 및 표적화 또는 결합 모이어티를 포함하거나 이로 구성된 제2 도메인을 포함하는 융합 작제물을 인코딩한다. 또 다른 구체예에서, 핵산은 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 제1 도메인, 및 표적화 또는 결합 모이어티를 포함하거나 이로 구성된 제2 도메인을 포함하는 융합 작제물을 인코딩한다. 추가의 구체예에서, 핵산은 KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK로부터 선택된 아미노산 서열로 구성된 제1 도메인, 및 제1 도메인과 별개인 1-25개의 아미노산 서열(예를 들어, 표적화 또는 결합 모이어티)로 구성된 제2 도메인을 포함하거나 이로 구성된 융합 작제물을 인코딩한다.
[0113] 본원에서 유전자, 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드 서열, 프라이머, 올리고뉴클레오티드 또는 프로브로도 지칭될 수 있는 핵산은 임의의 길이의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 또는 혼합 폴리리보-폴리데옥시리보 뉴클레오티드 및 이의 α-아노머 형태의 천연 또는 변형된 퓨린- 및 피리미딘-함유 중합체를 지칭한다. 2개 이상의 퓨린- 및 피리미딘-함유 중합체는 전형적으로 포스포에스테르 결합 또는 이의 유사체에 의해 연결된다. 이 용어는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 모든 형태의 핵산을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 핵산은 단일 가닥, 이중 또는 삼중, 선형 또는 원형일 수 있다. 핵산은 게놈 DNA, cDNA 및 안티센스를 포함한다. RNA 핵산은 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA, tRNA 또는 안티센스일 수 있다. 핵산은 자연 발생, 합성 뿐만 아니라 뉴클레오티드 유사체 및 유도체를 포함한다.
[0114] 유전 코드의 축퇴의 결과로서, 핵산은 본 발명의 융합 작제물을 인코딩하는 서열과 관련하여 축퇴된 서열을 포함한다. 따라서, 융합 작제물을 인코딩하는 축퇴성 핵산 서열이 제공된다.
[0115] 핵산은 임의의 다양한 공지된 표준 클로닝 및 화학적 합성 방법을 사용하여 생산될 수 있고, 부위-지정 돌연변이유발 또는 당업자에게 공지된 다른 재조합 기술에 의해 의도적으로 변경될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 순도는 시퀀싱, 겔 전기영동, UV 분광법을 통해 결정될 수 있다.
[0116] 핵산은 핵산의 발현이 본원에서 "발현 카세트"로 지칭되는 "발현 조절 요소"에 의해 영향을 받거나 조절되는 핵산 작제물에 삽입될 수 있다. 용어 "발현 조절 요소"는 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하거나 영향을 미치는 하나 이상의 핵산 서열 요소를 지칭한다. 발현 조절 요소는 적절한 경우, 프로모터, 인핸서, 전사 종결자, 유전자 침묵제, 단백질-인코딩 유전자 앞의 시작 코돈(예를 들어, ATG) 등을 포함할 수 있다.
[0117] 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 요소는 핵산 서열의 전사 및 적절한 경우, 번역을 제어한다. 용어 "작동 가능하게 연결된"은 언급된 성분이 의도된 방식으로 기능할 수 있는 관계에 있는 병치를 지칭한다. 전형적으로 발현 조절 요소는 유전자의 5' 또는 3' 말단에 병치되지만 인트론일 수도 있다.
[0118] 발현 조절 요소는 유도 가능하거나(즉, 활성화를 위해 외부 신호를 필요로 함) 탈억제 가능한(즉, 전사를 멈추는 신호를 필요로 함; 신호가 더 이상 존재하지 않을 때, 전사는 활성화되거나 "탈억제됨"), 전사를 구성적으로 활성화시키는 요소를 포함한다. 또한, 본 발명의 발현 카세트에는 특정 세포-유형 또는 조직에 대해 유전자 발현이 제어될 수 있기에 충분한 조절 요소(즉, 조직-특이적 조절 요소)가 포함된다. 전형적으로, 이러한 요소는 코딩 서열의 상류 또는 하류(즉, 5' 및 3')에 위치한다. 프로모터는 일반적으로 코딩 서열의 5'에 위치한다. 재조합 DNA 또는 합성 기술에 의해 생산된 프로모터를 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 전사를 제공할 수 있다. "프로모터"는 전사를 지시하기에 충분한 최소 서열 요소를 의미한다.
[0119] 핵산은 숙주 세포로의 증식을 위해 그리고 원하는 경우 후속 유전자 조작을 위해 플라스미드에 삽입될 수 있다. 플라스미드는 숙주 세포에서 안정적으로 증식될 수 있는 핵산이고; 플라스미드는 핵산의 발현을 유도하기 위해 발현 조절 요소를 선택적으로 함유할 수 있다. 벡터는 본원에서 플라스미드와 동의어로 사용되며 숙주 세포에서의 발현을 위한 발현 조절 요소를 또한 포함할 수 있다. 플라스미드 및 벡터는 일반적으로 세포 및 프로모터에서 증식을 위한 적어도 하나의 복제 기점을 포함한다. 따라서, 플라스미드 및 벡터는, 예를 들어, 핵산을 인코딩하는 융합 작제물의 유전적 조작, 융합 작제물 또는 안티센스 핵산의 생산, 및 숙주 세포 및 유기체에서 융합 작제물의 발현에 유용하다.
[0120] 박테리아 시스템 프로모터는 T7 및 유도성 프로모터, 예를 들어, 박테리오파지 λ의 pL, plac, ptrp, ptac(ptrp-lac 하이브리드 프로모터) 및 테트라사이클린 반응성 프로모터를 포함한다. 곤충 세포 시스템 프로모터는 항시적 또는 유도성 프로모터(예를 들어, 엑디손)를 포함한다. 포유 동물 세포 항시적 프로모터는 SV40, RSV, 소 유두종 바이러스(BPV) 및 기타 바이러스 프로모터, 또는 포유 동물 세포의 게놈(예를 들어, 메탈로티오네인 IIA 프로모터; 열 충격 프로모터) 또는 포유 동물 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 유도성 마우스 유선 종양 바이러스 긴 말단 반복)로부터 유래된 유도성 프로모터를 포함한다. 대안적으로, 레트로바이러스 게놈은 적절한 숙주 세포에서 융합 작제물의 발현을 도입하고 지시하기 위해 유전적으로 변형될 수 있다.
[0121] 발현 시스템은 생체 내 사용을 위해 설계된 벡터를 추가로 포함한다. 특정 비제한적인 예는 아데노바이러스 벡터(미국 특허 번호 5,700,470 및 5,731,172), 아데노-관련 벡터(미국 특허 번호 5,604,090), 단순 헤르페스 바이러스 벡터(미국 특허 번호 5,501,979), 레트로바이러스 벡터(미국 특허 번호 5,624,820, 5,693,508 및 5,674,703), BPV 벡터(미국 특허 번호 5,719,054) 및 CMV 벡터(미국 특허 번호 5,561,063)를 포함한다.
[0122] 효모 벡터는 항시적 및 유도성 프로모터를 포함한다(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ch. 13, ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant et al. Methods in Enzymology, 153:516 (1987), eds. Wu & Grossman; Bitter Methods in Enzymology, 152:673 (1987), eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y.; and, Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (1982) eds. Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II)] 참조). ADH 또는 LEU2와 같은 항시적 효모 프로모터 또는 GAL과 같은 유도성 프로모터가 사용될 수 있다(R. Rothstein In: DNA Cloning, A Practical Approach, Vol.11, Ch. 3, ed. D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986). 예를 들어, 상동성 재조합을 통해 외래 핵산 서열의 효모 염색체로의 통합을 촉진하는 벡터는 당 분야에 공지되어 있다. 효모 인공 염색체(YAC)는 전형적으로 삽입된 폴리뉴클레오티드가 보다 통상적인 벡터에 비해 너무 클 때(예를 들어, 약 12 Kb 초과) 사용된다.
[0123] 발현 벡터는 또한 선택적 압력 또는 식별 가능한 마커(예를 들어, 베타-갈락토시다제)에 대한 내성을 부여하는 선택 가능한 마커를 함유할 수 있으며, 이에 의해 벡터를 갖는 세포가 선택되고, 성장되고, 확장될 수 있다. 대안적으로, 선택 가능한 마커는 융합 작제물을 인코딩하는 핵산을 함유하는 제1 벡터와 함께 숙주 세포로 공동 형질감염되는 제2 벡터 상에 있을 수 있다.
[0118] 선택 시스템은 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 유전자(Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자(Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)), 및 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에 사용될 수 있는 아데닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 추가로, 항-대사 산물 내성은 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt 유전자(Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 유전자(Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1(1981)); 푸로마이신; 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 유전자(Santerre et al., Gene 30:147 (1984))에 대한 선택의 기초로서 사용될 수 있다. 추가의 선택 가능한 유전자는 세포가 트립토판 대신 인돌을 이용할 수 있게 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 이용할 수 있게 하는 hisD(Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); 및 오르니틴 디카르복실라제 억제제, 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO에 대한 내성을 부여하는 ODC(오르니틴 데카르복실라제)를 포함한다(McConlogue (1987) In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory).
[0119] 융합 작제물을 발현하는 숙주 세포, 및 융합 작제물을 인코딩하는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포 및 융합 작제물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 또한 제공된다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 다양한 양태에서, 진핵 세포는 효모 또는 포유 동물(예를 들어, 인간, 영장류 등) 세포이다.
[0120] 본원에서 사용되는 "숙주 세포"는 증식, 전사, 또는 인코딩된 융합 작제물이 발현될 수 있는 핵산이 도입된 세포이다. 이 용어는 또한 숙주 세포의 임의의 자손 또는 서브클론을 포함한다. 숙주 세포는 융합 작제물을 발현하는 세포 및 융합 작제물을 발현하지 않는 세포를 포함한다. 융합 작제물을 발현하지 않는 숙주 세포는 핵산 또는 융합 작제물 또는 안티센스를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 증식시키는데 사용된다.
[0121] 숙주 세포는 박테리아 및 효모와 같은 미생물; 및 식물, 곤충 및 포유 동물 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 재조합 박테리오파지 핵산, 플라스미드 핵산 또는 코스미드 핵산 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 및 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스)로 감염된 동물 세포 시스템, 또는 일시적 또는 안정적인 증식 또는 발현을 위해 조작된 형질전환된 동물 세포 시스템.
[0122] 융합 작제물, 융합 작제물을 인코딩하는 핵산, 벡터 및 융합 작제물을 발현하거나 융합 작제물 및 안티센스를 인코딩하는 핵산으로 형질전환된 숙주 세포는 분리 및 정제된 형태를 포함한다. 용어 "분리된"은 본 발명의 조성물의 수식어로 사용될 때, 조성물이 사람의 손에 의해 만들어지거나 자연 발생 생체 내 환경으로부터 실질적으로 완전히 또는 적어도 부분적으로 분리된 것을 의미한다. 일반적으로, 분리된 조성물은 자연에서 이것이 정상적으로 결합하는 하나 이상의 물질, 예를 들어, 하나 이상의 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물, 세포막을 실질적으로 갖지 않는다. 용어 "분리된"은 다량체/올리고머, 변이체, 변형 또는 유도체화된 형태, 또는 사람의 손에 의해 생산된 숙주 세포에서 발현되는 형태와 같은 조성물의 대안적인 물리적 형태를 배제하지 않는다. 용어 "분리된"은 또한 형태 안에 조합물이 존재하고, 그 중 어느 하나가 사람의 손에 생산된 것인 형태(예를 들어, 약학적 제형 및 조합 조성물)를 배제하지 않는다.
[0123] "분리된" 조성물은 또한 자연에서 전형적으로 결합하는 물질의 일부, 실질적인 수, 대부분 또는 전부가 없을 때 "정제된" 것일 수 있다. 따라서, 또한 실질적으로 순수한 분리된 융합 작제물은, 예를 들어, 단백질 라이브러리의 단백질 또는 게놈 또는 cDNA 라이브러리의 핵산과 같은 수백만 개의 다른 서열 사이에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다. "정제된" 조성물은 하나 이상의 다른 분자와 조합될 수 있다.
[0124] 본 발명에 따르면, 융합 작제물 및 조합 조성물의 혼합물이 제공된다. 한 구체예에서, 혼합물은 하나 이상의 융합 작제물 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 혼합물은 하나 이상의 융합 작제물 및 항-세포 증식, 항-종양, 항암, 또는 항-신생물 치료제 또는 제제를 포함한다. 추가 구체예에서, 혼합물은 하나 이상의 융합 작제물 및 면역 향상제를 포함한다. 항-세포 증식, 항-종양, 항암, 또는 항-신생물 치료제 또는 제제, 및 면역 향상 치료제 또는 제제와 함께, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제 중 하나 이상의 융합 작제물과 같은 조합물이 또한 제공된다.
[0125] 본 발명의 융합 작제물, 예를 들어, 제1 용해 도메인 및 제2 결합 모이어티 도메인을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 용해, 세포 사멸 또는 아폽토시스를 위해 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다. 이러한 세포는 선택적으로 표적화될 수 있다. 예를 들어, 수용체, 리간드, 항원 또는 항체를 발현하는 세포는 융합 작제물에 의해 표적화될 수 있고, 이에 따라 수용체, 리간드, 항원 또는 항체를 덜 발현하는 세포에 비해 우선적으로 사멸될 수 있다.
[0126] 본 발명에 따르면, 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법, 및 세포 증식을 감소시키거나 억제하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물과 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 세포 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물과 세포를 접촉시키는 것을 포함한다.
[0127] 또한, 과다증식성 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법, 및 과다증식 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물과 과다증식성 세포 또는 과다증식 세포를 접촉시키는 것을 포함한다.
[0128] 비-전이성 또는 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법이 추가로 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물과 신생물, 암, 종양 또는 악성 세포를 접촉시키는 것을 포함한다.
[0129] 또한 휴면 또는 비-분열 비-전이성 또는 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법이 추가로 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 휴면 또는 비-분열 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물과 휴면 또는 비-분열 신생물, 암, 종양 또는 악성 세포를 접촉시키는 것을 포함한다.
[0130] 또한, 수용체, 리간드, 항체 또는 항원을 발현하는 세포(예를 들어, 과다증식 세포)의 증식을 선택적으로 감소시키거나 억제하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 세포(예를 들어, 과다증식 세포)의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물과 세포를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 펩티드의 결합 모이어티는 세포에 의해 발현된 수용체, 리간드, 항체 또는 항원에 결합한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 본원에 기재된 융합 작제물로 세포(예를 들어, 과다증식 세포, 암 세포)의 증식을 감소시키거나 억제하고 세포를 체크포인트 억제제와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 융합 작제물 및 체크포인트 억제제의 양은 세포(예를 들어, 과다증식 세포)의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분하다.
[0131] 일부 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 수용체, 리간드, 항체 또는 항원을 발현하는 신생물, 종양, 암 또는 악성 세포의 증식을 선택적으로 감소시키거나 억제하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 방법은 신생물, 종양, 암 또는 악성 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 융합 작제물의 결합 모이어티는 세포에 의해 발현된 수용체, 리간드, 항체 또는 항원에 결합한다.
[0132] 용어 "접촉"은 2개 이상의 실체 사이(예를 들어, 융합 작제물과 세포 사이)의 직접 또는 간접 결합 또는 상호작용을 의미한다. 본원에서 사용되는 접촉은 용액 내, 고체상 내, 시험관 내, 생체 외, 세포 내 및 생체 내를 포함한다. 생체 내 접촉은 투여하는 것, 또는 투여로 지칭될 수 있다.
[0133] 증식을, 비선택적으로 또는 선택적으로, 감소시키거나 억제하기 위해 표적화되는 세포는 융합 작제물의 결합 모이어티가 결합하는 임의의 분자를 발현하는 세포를 포함한다. 예시적인 세포는 수용체(예를 들어, 호르몬 수용체, 성장 인자 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체), 리간드(예를 들어, 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 케모카인) 또는 항체 또는 항원, 또는 인테그린 또는 인테그린 수용체("RGD" 서열 모티프를 함유하는 펩티드), 또는 단당류, 이당류 또는 올리고당류, 시알산, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 아세틸뉴라민산, "RGD" 서열 모티프를 함유하는 펩티드 등과 같은 세포 외 매트릭스(ECM)에 존재하는 성분을 발현하는 세포를 포함한다.
[0134] 표적 세포는 성 또는 생식샘 스테로이드 호르몬 또는 성 또는 생식샘 스테로이드 호르몬 수용체를 발현하는 세포를 포함한다. 표적 세포는 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 I, 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 II, 칠성장어 III 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 황체 형성 호르몬, 융모 생식샘 자극 호르몬, 멜라닌세포 자극 호르몬, 에스트라디올, 디에틸스틸베스트롤, 도파민, 소마토스타틴, 난포-자극 호르몬(FSH), 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 프로게스테론, 안드로겐, 표피 성장 인자(EGF), Her2/neu, 비타민 H, 엽산 또는 이의 유도체(예를 들어, 폴레이트), 트랜스페린, 갑상샘 자극 호르몬(TSH), 엔도텔린, 봄베신, 성장 호르몬, 혈관활성 장 펩티드, 락토페린, 인테그린(예를 들어, 알파-5 베타 3 또는 알파-5 베타 1 인테그린), 신경 성장 인자, CD19, CD20, CD23, CD27, CD28, CD30, CD33, CD40, CD52, CD56, CD70, CD154, 면역글로불린-유사 수용체, ROR1, IGF-1, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 형질전환 성장 인자 알파, 형질전환 성장 인자 베타, 인슐린-유사 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 인슐린, 세룰로플라스민, 또는 HIV-tat에 결합하는 수용체를 발현하는 세포를 포함한다.
[0135] 표적 세포는 성 또는 생식샘 스테로이드 호르몬 또는 성 또는 생식샘 스테로이드 호르몬 수용체에 결합하는 수용체를 발현하는 세포를 추가로 포함한다. 또한, 표적 세포는 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 I, 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 II, 칠성장어 III 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 황체 형성 호르몬 베타 사슬, 황체 형성 호르몬, 융모 생식샘 자극 호르몬, 융모 생식샘 자극 호르몬 베타 서브유닛, 멜라닌세포 자극 호르몬, 에스트라디올, 디에틸스틸베스트롤, 도파민, 소마토스타틴, 난포-자극 호르몬(FSH), 글루코코르티코이드, 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 프로게스테론, 안드로겐, 표피 성장 인자(EGF), Her2/neu, 비타민 H, 엽산 또는 이의 유도체(예를 들어, 폴레이트), 트랜스페린, 갑상샘 자극 호르몬(TSH), 엔도텔린, 봄베신, 성장 호르몬, 혈관활성 장 펩티드, 락토페린, 인테그린(예를 들어, 알파-5 베타 3 또는 알파-5 베타 1 인테그린), 신경 성장 인자, CD19, CD20, CD23, CD27, CD28, CD30, CD33, CD40, CD52, CD56, CD70, CD154, 면역글로불린-유사 수용체, ROR1, IGF-1, 암배아 항원(CEA), 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 형질전환 성장 인자 알파, 형질전환 성장 인자 베타, 인슐린, 세룰로플라스민, HIV-tat, 또는 이들의 유사체(예를 들어, 미페프리스톤, 플루타미드, 루프론, 졸라덱스, 수프렐린, 시나텔 트립토렐린, 부세렐린, 세트로렐릭스, 가니렐릭스, 아바렐릭스, 안티데, 테베렐릭스 또는 데가렐릭스(Fe200486))에 결합하는 수용체를 발현하는 세포를 포함한다.
[0136] 증식을, 비선택적으로 또는 선택적으로, 감소시키거나 억제하기 위해 표적화되는 세포는 "종양 관련 항원", 예를 들어, 암배아 항원(CEA), 알파-태아단백질(AFP), 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), CA 125(잔존 상피 난소암), 가용성 인터루킨-2(IL-2) 수용체, RAGE-1, 티로시나제, MAGE-1, MAGE-2, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, 당단백질(gp) 75, gp100, 베타-카테닌, PRAME, MUM-1, ZFP161, 유비퀼린-1, HOX-B6, YB-1, 오스테오넥틴, 및 ILF3을 발현하는 세포를 추가로 포함한다. 증식을, 비선택적으로 또는 선택적으로, 감소시키거나 억제하기 위해 표적화하는 세포는 트랜스페린, 엽산 및 이의 유도체(예를 들어, 폴레이트), 및 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리 구성원 또는 예를 들어, TNF-알파, TNF-베타(림포톡신, LT), TRAIL, Fas, LIGHT, 및 41BB, 및 이에 따른 수용체를 발현하는 세포를 또한 추가로 포함한다.
[0137] 본 발명의 융합 작제물 및 방법은 또한 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식 및 과다증식성 장애를 치료하는데 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식 및 과다증식성 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과다증식성 장애를 치료하기에 충분한 양의 융합 작제물을 (치료를 필요로 하는) 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
[0138] 용어 "과다증식성 장애"는 임의의 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 생존(예를 들어, 프로그램된 세포 사멸 또는 아폽토시스를 겪지 않음), 성장 또는 증식을 지칭한다. 이러한 장애는 양성 과다형성, 비-전이성 및 전이성 신생물, 암, 종양 및 악성종양을 포함한다. 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식 및 과다증식성 장애는 대상체의 임의의 세포, 조직, 기관에 영향을 미칠 수 있다. 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식 및 과다증식성 장애는 국소적으로, 지역적으로 또는 전신적으로 대상체에 존재할 수 있다. 과다증식성 장애는 유방, 폐(예를 들어, 소세포 또는 비-소세포), 갑상선, 두경부, 뇌, 비인두, 인후, 코 또는 부비동, 림프계, 부신, 뇌하수체, 갑상선, 림프, 위장(입, 식도, 위, 십이지장, 회장, 공장(소장), 결장, 직장), 비뇨생식기(자궁, 난소, 질 자궁경부, 자궁내막, 나팔관), 방광, 고환, 음경, 전립선), 신장, 췌장, 간, 뼈, 골수, 림프, 혈액, 근육, 피부 및 줄기 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 조직 및 기관으로부터 발생할 수 있고, 이는 다른 이차 부위, 영역 또는 위치로 전이될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
[0139] 본 발명의 융합 작제물 및 방법은 또한 임의의 세포, 기관 또는 조직 기원의 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물에 적용될 수 있다. 이러한 장애는 사실상 모든 세포 또는 조직 유형, 예를 들어, 암종, 육종, 흑색종, 신경 및 그물내피 또는 조혈 신생물 장애(예를 들어, 골수종, 림프종 또는 백혈병)에 영향을 미칠 수 있다.
[0140] 본원에서 사용되는 용어 "신생물" 및 "종양"은 세포 증식성 또는 분화성 장애와 같이, 정상 대응 세포의 성장, 증식 또는 생존보다 큰 성장, 증식 또는 생존을 갖는 세포 또는 세포 집단을 지칭한다. 종양은 뚜렷한 덩어리 또는 성장을 형성한 신생물이다. "암" 또는 "악성"은 인접한 공간, 조직 또는 기관을 침범할 수 있는 신생물 또는 종양을 지칭한다. "전이"는 원발성 부위로부터 대상체 내의 하나 이상의 이차 부위, 위치 또는 영역으로 파종되거나 확산된 신생물, 종양, 암 또는 악성종양을 지칭하며, 여기서 부위, 위치 또는 영역은 원발성 종양 또는 암과 구별된다.
[0141] 신생물, 종양, 암 및 악성 세포(전이성 또는 비-전이성)는 휴면 또는 잔존 신생물, 종양, 암 및 악성 세포를 포함한다. 이러한 세포는 전형적으로 분열되지 않은(G0-G1 정지) 잔여 종양 세포로 구성된다. 이러한 세포는 원발성 부위에서 또는 미세 잔존 질환으로서 파종된 신생물, 종양, 암 또는 악성 세포로서 지속될 수 있다. 이러한 휴면 신생물, 종양, 암 또는 악성 세포는 증상이 없는 상태로 남아 있지만, 이러한 휴면 세포가 증식하면 심각한 증상과 사망을 일으킬 수 있다. 본 발명의 방법은 휴면 신생물, 종양, 암 또는 악성 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는데 사용될 수 있으며, 이는 차례로 종양 또는 암 재발, 또는 종양 또는 암 전이 또는 진행을 억제하거나 감소시킬 수 있다.
[0142] 본 발명에 따르면, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성 종양 또는 신생물을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물을 치료(예를 들어, 증식을 감소 또는 억제)하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 (치료를 필요로 하는) 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
[0143] 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물은 임의의 단계, 예를 들어, I, II, III, IV 또는 V 기 종양과 같은 초기 또는 진행성일 수 있다. 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물은 이전 치료를 받았거나 안정화(비-진행) 또는 관해 상태일 수 있다.
[0144] 전이의 관점에서, 본 발명의 방법은 다른 부위로의 원발성 종양 또는 암의 전이, 또는 원발성 종양 또는 암으로부터 먼 다른 부위에서 전이성 종양 또는 암의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하여 종양 또는 암 재발 또는 종양 또는 암 진행을 억제하거나 감소시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은, 특히, 1) 잠재적으로 또는 전이를 발생시키는 종양 또는 암 세포(예를 들어, 파종된 종양 세포, DTC)의 성장, 증식, 이동성 또는 침습성을 감소시키거나 억제하고; 2) 원발성 종양 또는 암으로부터 원발성 종양 또는 암과 구별되는 하나 이상의 다른 부위, 위치 또는 영역으로 발생하는 전이의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하고; 3) 전이가 형성되거나 확립된 후 원발성 종양 또는 암과 구별되는 하나 이상의 다른 부위, 위치 또는 영역에서 전이의 성장 또는 증식을 감소시키거나 억제하고; 4) 전이가 형성되거나 확립된 후 추가 전이의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하는 것을 포함한다.
[0145] 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물의 세포는 "고형" 세포 덩어리로 응집되거나 분산되거나 확산될 수 있다. "고형" 종양은 전형적으로 함께 응집하여 덩어리를 형성하는 암, 신생물 또는 전이를 지칭한다. 특정 비제한적인 예는 내장 종양, 예를 들어, 흑색종, 유방암, 췌장암, 자궁암 및 난소암, 고환종을 포함하는 고환암, 위암 또는 결장암, 간암, 부신암, 신장 및 방광 암종, 폐, 두경부암 및 뇌종양/암을 포함한다.
[0146] 상피 또는 내분비 조직의 악성종양을 지칭하는 암종은 호흡기 암종, 위장계 암종, 비뇨생식기 암종, 고환 암종, 유방 암종, 전립선 암종, 내분비계 암종 및 흑색종을 포함한다. 예시적인 암종은 자궁, 자궁경부, 폐, 전립선, 유방, 두경부, 결장, 췌장, 고환, 부신, 신장, 식도, 위, 간 및 난소로부터 형성되는 것들을 포함한다. 상기 용어는 또한, 예를 들어, 암종 및 육종 조직으로 구성된 악성 종양을 포함하는 암육종을 포함한다. 샘암종은 샘조직의 암종을 포함하거나, 종양이 샘 유사 구조를 형성한다.
[0147] 육종은 중간엽 세포 기원의 악성 종양을 지칭한다. 예시적인 육종은, 예를 들어, 림프육종, 지방육종, 골육종, 연골육종, 평활근육종, 횡문근육종 및 섬유육종을 포함한다.
[0148] 신경 신생물은 신경아교종, 아교모세포종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 별아교세포종 및 핍지세포종을 포함한다.
[0149] "액체 종양"은 일반적으로 고체 덩어리를 형성하지 않기 때문에, 자연적으로 분산되거나 확산되는 신생물을 지칭한다. 특정 예는 림프종, 골수종 및 백혈병과 같은 그물내피 또는 조혈계의 신생물을 포함한다. 백혈병의 비제한적인 예는 급성 및 만성 림프모구성, 골수모구성 및 다발성 골수종을 포함한다. 전형적으로, 이러한 질병은, 예를 들어, 적혈모구성 백혈병 및 급성 거대핵모구성 백혈병과 같이 잘 분화되지 않은 급성 백혈병으로부터 발생한다. 특정 골수성 장애는 급성 전골수성 백혈병(APML), 급성 골수성 백혈병(AML) 및 만성 골수성 백혈병(CML)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 림프성 악성종양은 B-계통 ALL 및 T-계통 ALL을 포함하는 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 전림프구성 백혈병(PLL), 털 세포 백혈병(HLL) 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증(WM)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 악성 림프종은 비호지킨 림프종 및 변이체, 말초 T 세포 림프종, 성인 T 세포 백혈병/림프종(ATL), 피부 T-세포 림프종(CTCL), 거대 과립 림프구성 백혈병(LGF), 호지킨병 및 리드-스턴버그병(Reed-Sternberg disease)을 포함한다.
[0150] 본원에 개시된 바와 같이, 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과다증식성 장애는 자궁, 유방, 질, 자궁경부 및 나팔관에서 발생할 수 있다. 자궁내막증은 자궁 세포가 자궁 외부 및 난소, 방광 또는 장과 같은 다른 영역으로 성장할 때 발생한다. 섬유종 및 폴립은 자궁, 유방, 질, 자궁경부 및 나팔관에 영향을 미칠 수 있다.
[0151] 따라서, 본 발명에 따르면, 자궁내막증 및 섬유종 또는 폴립을 치료하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 자궁내막증을 치료하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 방법은 섬유종 또는 폴립을 치료하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
[0152] 표적 세포는 번식 또는 생식에 관여하거나 이에 필요한 세포를 포함한다. 따라서, 본 발명에 따르면, 동물의 생식력을 감소시키는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 생식력을 감소시키거나 임신 가능성을 감소시키거나 수컷 포유 동물에서 정자 생산을 감소시키기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
[0153] 본원에 또한 개시된 바와 같이, 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과다증식성 장애는 전립선에서 발생할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 양성 전립선 비대증 또는 전이성 전립선 신생물을 치료하는 방법이 제공된다. 한 구체예에서, 방법은 양성 전립선 비대증 또는 전이성 전립선 신생물을 치료하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
[0154] 항-세포 증식 활성 또는 효과를 갖는 임의의 조성물, 치료, 프로토콜, 요법 또는 섭생법은 융합 작제물과 조합되거나 본 발명의 방법에서 조합하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합 작제물 및 방법은 항-증식, 항-종양, 항암, 항-신생물 및 항-전이성 치료, 프로토콜 및 요법을 포함하며, 이는 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 성장, 진행, 전이, 증식 또는 생존, 또는 시험관 내 또는 생체 내 악화와 같은 과다증식성 장애를 억제, 감소, 지연, 감속, 감소 또는 예방하는 임의의 다른 조성물, 치료, 프로토콜 또는 치료 요법을 포함한다. 항-증식(예를 들어, 종양) 요법의 특정 비제한적인 예는 화학 요법, 면역 요법, 방사선 요법(이온화 또는 화학적), 국소 열(온열요법) 요법, 외과적 절제 및 백신 접종을 포함한다. 융합 작제물은 항-세포 증식, 항-신생물, 항-종양, 항암, 항-전이성 또는 면역-향상 치료 또는 요법의 투여 전에, 실질적으로 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 융합 작제물은 체크포인트 억제제의 투여 전에, 실질적으로 동시에 또는 투여 후에 투여된다. 융합 작제물은 항-세포 증식, 항-신생물, 항-종양, 항암, 항-전이성 또는 면역-향상 치료 또는 요법을 포함하는 조합 조성물로서 투여될 수 있다. 융합 작제물은 체크포인트 억제제를 포함하는 조합 조성물로서 투여될 수 있다.
[0155] 항-증식, 항-신생물, 항-종양, 항암 및 항-전이성 조성물, 요법, 프로토콜 또는 치료는 세포 주기 진행 또는 세포 증식을 예방, 파괴, 중단, 억제 또는 지연시키거나; 아폽토시스 또는 세포 사멸을 자극 또는 향상시키거나, 핵산 또는 단백질 합성 또는 대사를 억제하거나, 세포 분열을 억제하거나, 세포 생존, 또는 필요한 세포 생존 인자, 성장 인자 또는 신호전달 경로(세포 외 또는 세포 내)의 생산 또는 이용을 감소시키거나 억제하는 것들을 포함한다. 항-세포 증식, 항-신생물, 항-종양, 항암 및 항-전이 활성을 갖는 화학 제제 부류의 비제한적인 예는 알킬화제, 항-대사 산물, 식물 추출물, 식물 알칼로이드, 니트로소우레아, 호르몬, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 항-세포 증식, 항-신생물, 항-종양, 항암 및 항-전이 활성을 갖는 약물의 특정 예는 사이클로포스파미드, 아자티오프린, 사이클로스포린 A, 프레드니솔론, 멜팔란, 클로람부실, 메클로레타민, 부술판, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 티오구아닌, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드, AZT, 5-아자시티딘(5-AZC) 및 5-아자시티딘 관련 화합물, 예를 들어, 데시타빈(5-아자-2'데옥시시티딘), 시타라빈, 1-베타-D-아라비노푸라노실-5-아자시토신 및 디하이드로-5-아자시티딘, 블레오마이신, 악티노마이신 D, 미트라마이신, 미토마이신 C, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙토조토신, 하이드록시우레아, 시스플라틴, 미토탄, 프로카르바진, 다카르바진, 탁솔, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 독소루비신 및 디브로모만니톨 등을 포함한다.
[0156] 융합 작제물 및 방법과 함께 적용 가능한 추가 제제는 당 분야에 공지되어 있으며 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체, 세포 성장 인자, 세포 생존 인자, 세포 분화 인자, 사이토카인 및 케모카인과 같은 생물학적 물질이 투여될 수 있다. 모노클로날 항체의 비제한적인 예는 특히 본 발명에 따른 융합 작제물과 조합하여 사용될 수 있는 리툭시맙(Rituxan®), 트라스투주맙(Herceptin), 베바시주맙(Avastin), 세툭시맙(Erbitux), 알렘투주맙(Campath), 파니투무맙(Vectibix), 이브리투모맙 티욱세탄(Zevalin), 토시투모맙(Bexxar) 등을 포함한다. 융합 작제물과 함께 사용하기 위해 적용 가능한 다른 표적화 약물은 이마티닙(Gleevec), 제피티닙(Iressa), 보르트조밉(Velcade), 라파티닙(Tykerb), 수니티 닙(Sutent), 소라페닙(Nevaxar), 닐로티닙(Tasigna) 등이다. 세포 성장 인자, 세포 생존 인자, 세포 분화 인자, 사이토카인 및 케모카인의 비제한적인 예는 IL-2, IL-1α, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-7, 과립구-대식세포-콜로니 자극 인자(GMCSF), IFN-γ, IL-12, TNF-α, TNFβ, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, SDF-1, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, 에오탁신, 에오탁신-2, I-309/TCA3, ATAC, HCC-1, HCC-2, HCC-3, LARC/MIP-3α, PARC, TARC, CKβ, CKβ6, CKβ7, CKβ8, CKβ9, CKβ11, CKβ12, C10, IL-8, GROα, GROβ, ENA-78, GCP-2, PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2, Mig, PBSF/SDF-1 및 림포탁틴을 포함한다.
[0157] 추가의 비제한적인 예는 세포 기반 요법을 포함하는 면역-향상 치료 및 요법을 포함한다. 특히, 면역-향상 치료 및 요법은 림프구, 형질 세포, 대식세포, 수지상 세포, NK 세포 및 B-세포를 투여하는 것을 포함한다.
[0158] 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물을 치료하는 방법, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물을 갖거나 가질 위험이 있는 치료가 필요한 대상체를 치료하는 방법, 및 효과를 증가시키거나 항-증식, 항-종양, 항암, 항-신생물 또는 항-악성종양 요법을 개선시키는 방법이 제공된다. 각각의 구체예에서, 방법은 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물을 갖거나 가질 위험이 있는 대상체에게 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물을 치료하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 투여하고; 대상체를 치료하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하고; 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 요법을 받고 있거나 받은 대상체에게 항-증식, 항-종양, 항암, 항-신생물 또는 항-악성종양 요법의 효과를 증가시키기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 투여하는 것을 포함한다.
[0159] 일부 구체예에서, 융합 작제물은 체크포인트 억제제를 투여하기 전에, 동시에 또는 투여한 후에 대상체에게 투여된다.
[0160] 체크포인트는 자극을 받았을 때 내성을 촉진하거나 T 세포 염증 활성을 억제함으로써 암에 대한 면역 반응 또는 염증 반응을 약화시키거나 억제할 수 있는 면역계의 주요 조절자이다. 알려진 체크포인트 수용체는 세포독성 T-림프구 관련 단백질 4(CTLA4 또는 CTLA-4)(예를 들어, UniProtKB: P16410 참조) 및 PCD1 및 CD279로도 알려진 프로그램된 세포 사멸 1(PD-1)(예를 들어, UniProtKB: Q15116 참조)을 포함하고, 둘 모두는 세포독성 T-세포에서 발현된다. 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1 또는 PD-L1, CD274라고도 함; 예를 들어, UniProtK:Q9NZQ7 참조)은 PD-1에 결합하는 체크포인트 리간드이다. 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 GITR(글루코코르티코이드-유도 TNFR-관련 단백질), VISTA(V-도메인 면역글로불린(Ig)-함유 T-세포 활성화 억제제), TIGIT(Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체), LAG-3(림프구-활성화 유전자 3), TIM3(T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인-함유 단백질 3), IDO(인돌아민 2,3 디옥시게나제), OX-40(CD134/OX40 수용체), 또는 항-NKG2A(예를 들어, 모날리주맙)의 억제제이다. 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 소형 화합물 억제제이다. 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 항체(예를 들어, 모노클로날 항체)이다.
[0161] 일부 암은 면역 체크포인트 수용체를 자극함으로써 면역 체계를 회피한다. 체크포인트 억제제 요법은 억제성 체크포인트를 차단하여 T-세포의 면역계 기능 및 항암 활성을 회복시키려고 시도한다.
[0162] 적합한 체크포인트 억제제가 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 체크포인트 억제제는 항체(예를 들어, 모노클로날 항체)이다. 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 융합 단백질 또는 다른 생물학적 물질이다. 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 소형 화합물을 포함한다. 특정 구체예에서, 체크포인트 억제제는 체크포인트 수용체를 통한 신호 전달을 억제, 차단, 완화 또는 저해하는 항체 또는 화합물이다. 특정 구체예에서, 체크포인트 억제제는 CTLA4의 동족 리간드 중 하나에 대한 CTLA4의 결합을 억제, 차단, 완화 또는 저해하는 항체 또는 화합물이며, 이의 비제한적인 예는 CD86(B7-2), CD80(B7-1) 및 B7-관련 단백질(ICOS 리간드, CD275)을 포함한다. 특정 구체예에서, 체크포인트 억제제는 PD-1의 동족 리간드 중 하나에 대한 PD-1의 결합을 억제, 차단, 완화 또는 저해하는 항체 또는 화합물이며, 이의 비제한적인 예는 PD-L1 또는 PD-L2를 포함한다.
[0163] 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제는 PD-L1의 길항제, PD-1의 길항제 또는 CTLA-4의 길항제이다. 일부 구체예에서, PD-L1의 길항제는 PD-L1에 결합하여 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 억제하고/거나, PD-L1이 이의 수용체 PD-1을 통해 신호전달하는 것을 억제하는 항체이다. 일부 구체예에서, PD-1의 길항제는 PD-1에 결합하여 PD-1에 대한 PD-L1의 결합을 억제하고/거나, PD-1이 신호전달하는 것을 억제하는 항체이다. 일부 구체예에서, CTLA-4의 길항제는 CTLA-4에 결합하여 CTLA-4에 대한 CD80 및/또는 CD86의 결합을 억제하고/거나, CTLA-4가 신호전달하는 것을 억제하는 항체이다. 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있는 체크포인트 억제제의 비제한적인 예는 이필리무맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙, 세미플리맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙을 포함한다.
[0164] 본 발명의 방법은 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과다증식성 장애, 질병 또는 질환의 증거(예를 들어, 하나 이상의 증상)가 시작되기 전에(즉, 예방), 동시에 또는 후에 실시될 수 있다. 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과다증식성 장애의 증상이 발생하기 전에, 동시에 또는 직후에 융합 작제물을 투여하는 것은 대상체에서 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과다증식성 장애, 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 기간을 감소시킬 수 있다. 또한, 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과다증식성 장애, 질병 또는 질환의 하나 이상의 증상이 발생하기 전에, 동시에 또는 직후에 융합 작제물을 투여하는 것은 대상체의 다른 부위, 영역, 조직 또는 기관으로의 과다증식 세포의 확산 또는 파종(예를 들어, 전이), 또는 대상체의 다른 부위, 영역, 조직 또는 기관에서 과다증식 세포의 확립(예를 들어, 전이)을 억제, 감소 또는 예방할 수 있다.
[0165] 본 발명의 융합 작제물 및 방법, 예를 들어, 치료 방법은 대상체에게 검출 가능하거나 측정 가능한 치료 이점 또는 개선을 제공할 수 있다. 치료 이점 또는 개선은 대상체에 대한 임의의 측정 가능하거나 검출 가능한, 객관적 또는 주관적, 일과성, 일시적 또는 장기적 이점, 또는 대상체의 조직, 기관, 세포 또는 세포 집단에서 임의의 정도의 질환, 장애 또는 질병, 부작용, 결과 또는 기저 원인의 개선이다. 치료 이점 및 개선은 장애, 질병 또는 질환과 관련된 하나 이상의 증상 또는 합병증의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 기간, 또는 장애, 질병 또는 질환의 기저 원인 또는 결과적인 영향을 감소 또는 저하시키는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명의 융합 작제물 및 방법은 대상체에게 치료 이점 또는 개선을 제공하는 것을 포함한다.
[0166] 치료 이점 또는 개선이 원하는 결과인 본 발명의 방법에서, 본 발명의 융합 작제물은 이를 필요로 하는 대상체에게 충분하거나 유효한 양으로 투여될 수 있다. "충분한 양" 또는 "유효한 양"은 단일 또는 다중 용량으로, 단독으로 또는 하나 이상의 다른 조성물(치료제, 예를 들어, 화학 요법 또는 면역 자극 약물), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법 제제와 조합하여, 임의의 기간(장기 또는 단기)의 검출 가능한 반응, 임의의 기간 동안(예를 들어, 수 시간, 수 일, 수 개월, 수 년 또는 치료되는 동안) 또는 임의의 측정 가능하거나 검출 가능한 정도의 원하는 결과를 대상체에서 또는 이익을 대상체에게 제공하는 양을 지칭한다. 치료를 위한(예를 들어, 치료 이점 또는 개선을 제공하기 위한) 용량 또는 "충분한 양" 또는 "유효한 양"은, 비록 장애, 질병 또는 질환 또는 증상의 진행 또는 악화를 감소시키거나 억제하는 것이 만족스러운 결과로 간주되지만, 전형적으로 장애, 질병 또는 질환, 또는 장애, 질병 또는 질환의 하나, 다수 또는 모든 부작용, 결과 또는 합병증을 측정 가능한 정도로 개선하는데 효과적이다.
[0167] 용어 "개선하다"는 대상체의 상태에서 검출 가능한 객관적 또는 주관적 개선을 의미한다. 검출 가능한 개선은 장애, 질병 또는 질환에 의해 야기되거나 이와 관련된 증상의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 기간의 주관적 또는 객관적 감소, 장애, 질병 또는 질환의 기저 원인 또는 결과의 개선, 또는 장애, 질병 또는 질환의 역전을 포함한다.
[0168] 따라서, 치료는 장애, 질병 또는 질환, 또는 관련 증상 또는 결과, 또는 기저 원인을 억제, 감소 또는 예방할 수 있거나; 장애, 질병, 질환, 증상 또는 결과, 또는 기저 원인의 진행 또는 악화; 또는 장애, 질병, 질환, 또는 증상의 하나 이상의 추가 증상의 추가 악화 또는 발생을 억제, 감소 또는 예방할 수 있다. 따라서, 성공적인 치료 결과는 "치료 효과" 또는 "이점"을 초래하거나, 대상체에서 질환, 장애, 질병 또는 증상의 하나 이상의 증상 또는 기저 원인 또는 결과의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 기간을 억제, 감소 또는 예방한다. 따라서, 질환, 장애, 질병 또는 증상의 하나 이상의 기저 원인에 영향을 미치는 치료 방법은 유익한 것으로 간주된다. 장애 또는 질환의 진행 또는 악화를 안정화 또는 억제하는 것도 성공적인 치료 결과이다.
[0169] 따라서, 치료 이점 또는 개선은 질환, 장애 또는 질병과 관련된 임의의 하나, 대부분 또는 모든 증상, 합병증, 결과 또는 기저 원인의 완전한 제거일 필요는 없다. 따라서, 짧거나 긴 기간(수 시간, 수 일, 수 주, 수 개월 등)에 걸쳐 대상체의 상태가 점진적으로 개선되거나, 하나 이상의 관련 부작용 또는 합병증 또는 결과 또는 기저 원인의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 기간이 부분적으로 감소하거나, 장애 또는 질병의 하나 이상의 생리학적, 생화학적 또는 세포적 징후 또는 특징의 악화 또는 진행이 억제 또는 역전될 때(예를 들어, 질환, 장애 또는 질병의 하나 이상의 증상 또는 합병증의 안정화) 만족스러운 종점이 달성된다.
[0170] 특정 구체예에서, 치료 방법은 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 세포 질량, 부피, 크기 또는 세포 수의 부분적 또는 완전한 파괴를 초래하거나; 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 세포 괴사, 용해 또는 아폽토시스를 자극, 유도 또는 증가시키거나; 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 부피, 크기, 세포 질량을 감소시키거나; 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 부피, 질량, 크기 또는 세포 수의 진행 또는 증가를 억제 또는 예방하거나; 대상체의 다른(이차) 부위, 영역, 조직 또는 기관으로의 과다증식 세포의 확산 또는 파종(예를 들어, 전이), 또는 대상체의 다른(이차) 부위, 영역, 조직 또는 기관에서 과다증식 세포의 확립(예를 들어, 전이)를 억제 또는 감소시키거나; 대상체의 수명을 연장시킨다. 추가의 특정 구체예에서, 치료 방법은 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물과 관련되거나 이에 의해 야기되는 부작용 또는 합병증의 중증도, 기간 또는 빈도를 감소시키거나 저하시킨다.
[0171] 충분한 양 또는 유효한 양은 단일 투여로 제공될 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없으며, 단독으로 또는 다른 조성물(예를 들어, 화학요법제 또는 면역 향상제 또는 자극제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법과 함께 투여될 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들어, 양은 대상체의 필요성, 치료되는 장애, 질병 또는 질환의 상태 또는 치료의 부작용에 의해 지시되는 바에 따라 비례적으로 증가될 수 있다. 또한, 추가 용량, 이러한 용량 이상 및 미만의 양 또는 기간, 또는 추가 조성물(예를 들어, 화학요법제 또는 면역 자극제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법이 주어진 대상체에서 효과적이거나 충분한 것으로 간주되기 위해 포함될 수 있으므로, 충분한 양 또는 유효한 양은 제2 조성물(예를 들어, 화학요법제 또는 면역 자극제), 치료, 프로토콜 또는 치료 요법 없이 단일 또는 다중 용량으로 제공되는 경우 효과적이거나 충분할 필요는 없다. 충분한 것으로 간주되는 양은 또한 또 다른 치료, 치료 요법 또는 프로토콜의 사용을 감소시키는 양을 포함한다.
[0172] 충분한 양 또는 유효한 양은, 예방적으로 또는 치료적으로, 치료되는 각각의 및 모든 대상체에서, 또는 주어진 그룹 또는 집단의 대부분의 치료 대상체에서 효과적일 필요는 없다. 치료 또는 치료 방법에 대해 전형적인 것과 같이, 일부 대상체는 주어진 치료, 치료 요법 또는 프로토콜에 대해 더 크거나 더 작은 반응을 나타낼 것이다. 충분한 양 또는 유효한 양은 그룹 또는 일반 집단이 아닌 특정 대상체에서의 충분성 또는 유효성을 지칭한다. 이러한 양은 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과다증식 장애(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물)의 유형 또는 단계, 원하는 치료 효과뿐만 아니라 개별 대상체(예를 들어, 대상체 내 생체이용률, 성별, 연령 등)와 같은 치료되는 조건에 따라 부분적으로 좌우될 것이다.
[0173] 과다증식성 장애(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물)와 같은 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식에 대한 치료 이점 또는 개선의 특정 비제한적인 예는 세포 크기, 질량 또는 부피의 감소, 세포 크기, 질량 또는 부피의 증가 억제, 악화 또는 진행의 지연 또는 억제, 세포 괴사, 용해 또는 아폽토시스의 자극, 신생물 또는 종양 악성종양 또는 전이의 감소 또는 억제, 사망률 감소, 및 대상체의 수명 연장을 포함한다. 따라서, 세포 크기, 질량, 부피 또는 전이의 증가를 억제하거나 지연(안정화)시키는 것은 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물의 완전한 제거가 발생하지 않았음에도 불구하고, 단지 수 일, 수 주 또는 수 개월 동안이라도 수명을 증가시킬 수 있다(사망률 감소). 감소되거나 저하될 수 있는 과다증식성 장애(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물)와 관련된 부작용 및 합병증은, 예를 들어, 통증, 욕지기, 불편함, 식욕 부진, 무기력 및 쇠약을 포함한다. 따라서, 과다증식성 장애(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물)와 같은 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식의 증상의 발생, 빈도, 중증도, 진행 또는 기간의 감소, 예를 들어, 주관적인 느낌의 개선(예를 들어, 증가된 에너지, 식욕, 욕지기 감소, 개선된 움직임 또는 심리적 안녕 등)은 모두 치료 이점 또는 개선의 예이다.
[0174] 예를 들어, 투여로 인해 과다증식성 장애(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물)와 같은 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식의 치료에 필요한 화학 요법 약물, 방사선 또는 면역 요법이 덜 요구되는 경우, 충분한 양 또는 유효한 양의 융합 작제물은 치료 효과를 갖는 것으로 간주된다.
[0175] 용어 "대상체"는 동물, 전형적으로 포유 동물, 예를 들어, 인간, 비인간 영장류(원숭이, 긴팔 원숭이, 침팬지, 오랑우탄, 마카크), 가축(개 및 고양이), 농장 동물(말, 소, 염소, 양, 돼지) 및 실험 동물(마우스, 래트, 토끼, 기니피그)을 지칭한다. 대상체는 생체 내 융합 작제물의 분석을 위한 동물 질병 모델, 예를 들어, 과다증식성 장애(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물)와 같은 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식의 동물 모델을 포함한다.
[0176] 치료에 적합한 대상체는 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 세포를 갖거나 가질 위험이 있는 대상체뿐만 아니라 종양이 관해 상태에 있는 대상체를 포함하여, 항-증식성(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물) 요법을 받고 있거나 받은 대상체를 포함한다. "위험이 있는" 대상체는 전형적으로 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식, 과다형성(예를 들어, 종양)의 발달과 관련된 위험 인자를 갖는다.
[0177] 위험이 있거나 후보인 대상체의 특정 예는 융합 작제물이 결합할 수 있는 수용체, 리간드, 항원 또는 항체를 발현하는 세포를 갖는 대상체로서, 특히 괴사, 용해, 사멸 또는 파괴를 위해 표적화된 세포가 비-표적 세포보다 더 많은 수 또는 양의 수용체, 리간드, 항원 또는 항체를 발현하는 대상체를 포함한다. 이러한 세포는 괴사, 용해 또는 사멸을 위해 선택적으로 또는 우선적으로 표적화될 수 있다.
[0178] 위험이 있는 대상체는 또한 외과적 절제, 화학 요법, 면역 요법, 이온화 또는 화학적 방사선 요법, 국소 또는 지역 열(온열요법) 요법, 또는 백신 접종을 위한 후보인 대상체 및 받은 대상체를 포함한다. 따라서, 본 발명은, 예를 들어, 안정 또는 관해 기간 후 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 재발 또는 재성장으로 인해, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물, 또는 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물과 관련된 합병증의 위험이 있는 대상체를 치료하는데 적용 가능하다.
[0179] 위험 인자는 성별, 생활 방식(식이 요법, 흡연), 직업(의료 및 임상 종사자, 농업 및 축산 종사자), 환경 요인(발암원 노출), 가족력(자가면역 질환, 당뇨병 등), 유전적 소인 등을 포함한다. 예를 들어, 흑색종이 발생할 위험이 있는 대상체는 과도한 태양 노출(자외선), 고운 피부, 많은 수의 모반(이형성 모반), 환자 표현형, 가족력 또는 이전 흑색종의 병력을 포함한다. 따라서, 암 발생 위험이 있는 대상체는 생활 방식, 직업, 환경 요인, 가족력, 및 종양 관련 유전자, 유전자 결실 또는 유전자 돌연변이에 대한 유전적 스크린에 의해 식별될 수 있다. 예를 들어, 유방암 발생 위험이 있는 대상체는 Brca1이 결여되어 있다. 결장암 발생 위험이 있는 대상체는, 예를 들어, 조기 또는 고빈도 폴립 형성, 또는 결실되거나 돌연변이된 종양 억제 유전자, 예를 들어, 선종성 결장폴립증(APC)을 갖는다.
[0180] 대상체는 또한 다른 치료에서 배제된 대상체들을 포함한다. 예를 들어, 특정 대상체는 외과적 절제, 화학 요법, 면역 요법, 이온화 또는 화학적 방사선 요법, 국소 또는 지역 열(온열요법) 요법, 또는 백신 접종에 적합한 후보가 아닐 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 치료를 위한 후보 대상체는 외과적 절제, 화학 요법, 면역 요법, 이온화 또는 화학적 방사선 요법, 국소 또는 지역 열(온열고열) 요법, 또는 백신 접종을 위한 후보가 아닌 대상체를 포함한다.
[0181] 융합 작제물은 단위 용량 또는 단위 투여 형태로 제형화될 수 있다. 특정 구체예에서, 융합 작제물은 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식 또는 과다증식성 장애를 갖는 대상체를 치료하는데 효과적인 양이다. 추가의 특정 구체예에서, 융합 작제물은 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물을 갖는 대상체를 치료하는데 효과적인 양이다. 추가의 특정 구체예에서, 융합 작제물은 대상체의 생식력을 감소시키는데 효과적인 양이다. 예시적인 단위 용량은 약 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 또는 2500-5000, 5000-25,000, 5000-50,000 ng; 및 약 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 또는 2500-5000, 5000-25,000, 5000-50,000 μg의 범위이다.
[0182] 본원에 기재된 방법을 위해, 적절한 치료적 유효량의 체크포인트 억제제를 세포와 접촉시키거나 대상체 또는 동물에게 투여할 수 있다. 체크포인트 억제제의 적합한 치료적 유효량의 비제한적인 예는 항체 또는 생물학적 물질의 경우 0.1 ng/kg 내지 100 mg/kg 및 소형 화합물의 경우 0.01 pg/kg 내지 100 mg/kg, 및 이의 중간 범위를 포함한다. 본원의 방법에 사용되는 조성물은, 일부 구체예에서, 체크포인트 억제제를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 융합 작제물을 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 본원에 기재된 융합 작제물 및 적합한 체크포인트 억제제를 포함한다.
[0183] 본 발명의 조성물 및 방법은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 접촉되거나 제공될 수 있다. 조성물은 단일 또는 다중 투여량으로서, 예를 들어, 유효하거나 충분한 양으로 의도된 효과를 제공하도록 투여될 수 있다. 예시적인 용량은 연속 일에, 또는 격일로 또는 간헐적으로 약 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 또는 2500-5000, 5000-25,000, 5000-50,000 pg/kg; 약 50-500, 500-5000, 5000-25,000 또는 25,000-50,000 ng/kg; 및 약 25-250, 250-500, 500-1000, 1000-2500 또는 2500-5000, 5000-25,000, 5000-50,000 μg/kg의 범위이다. 단일 또는 다중 용량은 연속 일, 격일 또는 간헐적으로 투여될 수 있다.
[0184] 조성물은 투여될 수 있고, 방법은 임의의 경로에 의해 전신적, 지역적 또는 국소적 투여를 통해 실행될 수 있다. 예를 들어, 융합 작제물은 전신, 지역 또는 국소, 정맥 내, 경구(예를 들어, 섭취 또는 흡입), 근육 내, 복강 내, 피내, 피하, 강내, 두개 내, 경피(국소), 비경구, 예를 들어, 경점막 또는 직장으로 투여될 수 있다. 약학적 제형을 포함하는 본 발명의 조성물 및 방법은 (마이크로)캡슐화된 전달 시스템을 통해 투여되거나 투여를 위해 임플란트에 패키징될 수 있다.
[0185] 일부 구체예에서, 융합 작제물 및/또는 체크포인트 억제제는 약학적 조성물에 포함된다. 약학적 조성물은 "약학적으로 허용되는" 및 "생리학적으로 허용되는" 담체, 희석제 또는 부형제를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는" 및 "생리학적으로 허용되는"이란 담체, 희석제 또는 부형제를 언급할 때 약학적 투여 및 제형의 다른 성분과 양립 가능한, 용매(수성 또는 비-수성), 세제, 용액, 에멀젼, 분산 매질, 코팅, 등장성 및 흡수 촉진 또는 지연제를 포함한다. 이러한 제형은 정제(코팅되거나 코팅되지 않음), 캡슐(경질 또는 연질), 마이크로비드, 에멀젼, 분말, 과립, 결정, 현탁액, 시럽 또는 엘릭서에 포함될 수 있다.
[0186] 약학적 조성물은 특정 투여 경로에 적합하도록 제형화될 수 있다. 비경구, 피내 또는 피하 투여용 조성물은 물, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매와 같은 멸균 희석제를 포함할 수 있다. 제조물은 미생물 성장을 방지하기 위해 하나 이상의 보존제(예를 들어, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 소듐 클로라이드 또는 덱스트로스와 같은 긴장성 조정제)를 포함할 수 있다.
[0187] 주사용 약학적 조성물은 멸균된 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충된 염수(PBS)를 포함한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 또는 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 항균제 및 항진균제는, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 및 티메로살을 포함한다. 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시키면 주사용 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
[0188] 추가의 약학적 제형 및 전달 시스템은 당 분야에 공지되어 있고 본 발명의 방법에서 적용 가능하다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993); and Poznansky, et al., Drug Delivery Systems, R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. (1980), pp. 253-315)] 참조).
[0189] 본 발명은 적절한 패키징 재료에 패키징된 본원에 기재된 융합 작제물, 조합 조성물(예를 들어, 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 포함함) 및 이의 약학적 제형을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 선택적으로 그 안의 성분의 설명 또는 성분의 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외 사용을 위한 설명서를 포함하는 라벨 또는 패키징 삽입물을 포함한다. 예시적인 설명서는 세포의 증식을 감소 또는 억제하거나, 과다증식 세포와 같은 바람직하지 않거나 비정상적인 세포의 증식을 감소 또는 억제하거나, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물 세포의 증식을 감소 또는 억제하거나, 과다증식성 장애를 갖는 대상체를 치료하거나, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물을 갖는 대상체를 치료하거나, 동물의 생식력을 감소시키기 위한 지침을 포함한다.
[0190] 키트는 이러한 성분의 집합, 예를 들어, 2개 이상의 융합 작제물을 단독으로 또는 다른 치료적으로 유용한 조성물(예를 들어, 항-증식 또는 면역-향상 약물)과 조합하여 포함할 수 있다.
[0191] 용어 "패키징 재료"는 키트의 성분을 수용하는 물리적 구조를 지칭한다. 패키징 재료는 성분을 멸균 상태로 유지할 수 있으며, 이러한 목적으로 일반적으로 사용되는 재료(예를 들어, 종이, 골판지 섬유, 유리, 플라스틱, 호일, 앰플, 바이알, 튜브 등)로 제조될 수 있다.
[0192] 본 발명의 키트는 라벨 또는 삽입물을 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 "인쇄물", 예를 들어, 종이 또는 판지이거나, 성분, 키트 또는 패키징 물질(예를 들어, 상자)과 별도이거나 이에 부착되거나, 키트 성분을 함유하는 앰플, 튜브 또는 바이알에 부착된 것을 포함한다. 라벨 또는 삽입물은 추가로 컴퓨터 판독 가능한 매체, 예를 들어, 디스크(예를 들어, 플로피 디스켓, 하드 디스크, ZIP 디스크), 광학 디스크, 예를 들어, CD- 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, 자기 테입, 또는 전기 저장 매체, 예를 들어, RAM 및 ROM 또는 이들의 하이브리드, 예를 들어, 자기/광학 저장 매체, FLASH 매체 또는 메모리 유형 카드를 포함할 수 있다.
[0193] 라벨 또는 삽입물은 그 안의 하나 이상의 성분, 용량, 작용 메커니즘, 약동학 및 약력학을 포함하는 활성 성분(들)의 임상 약리학의 식별 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 제조업체 정보, 로트 번호, 제조업체 위치 및 날짜를 식별하는 정보를 포함할 수 있다.
[0194] 라벨 또는 삽입물은 키트 성분이 사용될 수 있는 질환, 장애, 질병 또는 증상에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 방법, 치료 프로토콜 또는 치료 요법에서 키트 성분 중 하나 이상을 사용하기 위한 임상의 또는 대상체를 위한 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 투여량, 빈도 또는 기간, 및 본원에 기재된 임의의 방법, 치료 프로토콜 또는 치료 요법을 실행하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 예시적인 설명서는 바람직하지 않거나 비정상적인 세포 증식, 과다증식 세포 및 장애(예를 들어, 전이성 또는 비-전이성 종양, 암, 악성종양 또는 신생물)를 치료하기 위한 지침을 포함한다. 따라서, 본 발명의 키트는 치료 방법을 포함하여 본원에 기재된 본 발명의 임의의 방법을 실행하기 위한 라벨 또는 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
[0195] 라벨 또는 삽입물은 예방적 또는 치료적 이점과 같은 성분이 제공할 수 있는 모든 이점에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물은 특정 조성물을 사용하는 것이 적절하지 않은 상황에 대해 대상체 또는 임상의에게 경고하는 것과 같은 잠재적인 부작용에 대한 정보를 포함할 수 있다. 부작용은 또한 대상체가 조성물과 양립할 수 없는 하나 이상의 다른 약물을 복용해 왔거나, 복용할 것이거나 또는 현재 복용 중일 때, 또는 대상체가 조성물과 양립할 수 없는 다른 치료 프로토콜 또는 치료 요법을 받았거나, 받을 예정이거나, 현재 받고 있을 때 발생할 수 있으므로, 설명서는 이러한 비호환성에 관한 정보를 포함할 수 있다.
[0196] 본 발명의 키트는 추가로 다른 성분을 포함할 수 있다. 키트의 각 성분은 개별 용기 내에 포함될 수 있고, 다양한 용기 모두는 단일 패키지 내에 있을 수 있다. 본 발명의 키트는 저온 보관을 위해 설계될 수 있다. 본 발명의 키트는 본 발명의 융합 작제물을 발현하는 숙주 세포를 함유하거나 융합 작제물을 인코딩하는 핵산을 함유하도록 추가로 설계될 수 있다. 키트의 세포는 세포를 사용할 준비가 될 때까지 적절한 저장 조건에서 유지될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 세포를 포함하는 키트는 세포가 해동되고 성장할 수 있도록 적절한 세포 저장 배지를 함유할 수 있다.
[0197] 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질이 본원에 기재된다.
[0198] 본원에 인용된 모든 출원, 공보, 특허 및 다른 참고 문헌, GenBank 인용 및 ATCC 인용은 그 전체가 참조로 포함된다. 상충의 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.
[0199] 본원에서 사용되는 단수 형태는 문맥상 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "융합 작제물" 또는 "용해 도메인"에 대한 언급은 복수의 이러한 융합 작제물 또는 용해 도메인 등을 포함한다.
[0200] 본원에서 사용되는 모든 수치 값 또는 수치 범위는 문맥상 명백히 달리 지시하지 않는 한 이러한 범위 내의 정수 및 범위 내의 값 또는 정수의 분수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 90-100%의 범위에 대한 언급은 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97% 등 뿐만 아니라 91.1%, 91.2%, 91.3%, 91.4%, 91.5% 등, 92.1%, 92.2%, 92.3%, 92.4%, 92.5% 등을 포함한다.
[0201] 본 발명은 다수의 구체예를 설명하기 위해 긍정 언어를 사용하여 본원에서 일반적으로 개시된다. 본 발명은 또한 구체적으로 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜, 절차, 검정 또는 분석과 같은 특정 주제가 완전히 또는 부분적으로 배제된 구체예를 포함한다. 따라서, 본 발명이 본 발명에 포함되지 않은 사항에 관하여 본원에 일반적으로 명시하고 있지는 않지만, 그럼에도 불구하고 본 발명에서 명백하게 포함되지 않은 양태는 본원에 개시된 것이다.
[0202] 본 발명의 많은 구체예가 개시되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 하기 실시예는 청구 범위에 기재된 본 발명의 범위를 예시하기 위한 것이며 제한하려는 것이 아니다.
실시예
실시예 1
[0203] 초기 연구는 용해 펩티드 모이어티와 리간드 사이에 상이한 힌지 서열을 함유하고; 30%의 D 아미노산(D-거울상 이성질체)을 포함하고, 용해 펩티드 모이어티의 경우 길이가 18 및 15개 아미노산이고, 힌지 서열 또는 이들의 D-거울상 이성질체를 포함하는 28개의 용해 도메인 펩티드의 시험관 내 스크리닝을 포함하였다. 21, 18 및 15개 아미노산 Phor21 유사체에 대한 스페이서로서 α-아미노카프로산의 도입을 연구하였다. 연구를 위해 선택된 리간드는 융모 생식샘 자극 호르몬으로부터의 베타 사슬의 결합 모이어티의 15개 아미노산 단편인 βCG-ala, 및 완전한 기능을 하는 리간드를 나타내는 데카펩티드인 LHRH를 포함하였다.
실시예 2
[0204] 이 실시예는 인간 유방암 세포주를 사용하여 세포 독성(IC50) 및 용혈 활성에 대한 스크리닝을 설명한다.
[0205] 18개의 βCG-ala 및 8개의 LHRH 컨쥬게이션된 융합 작제물을 연구하고 Phor21-βCG-ala 및 컨쥬게이션되지 않은 Phor21 및 Phor18(338913) = CLIP71 펩티드와 비교하였다. 융모 생식샘 자극 호르몬(CG) 및 황체 형성 호르몬-방출 호르몬(LHRH) 수용체를 과다 발현하는 인간 흑색종 세포주 MDA-MB-435S.luc를 사용하여 계대 번호 248-252에서 스크리닝하였다. MDA-MB-435S.luc 세포주는 리포펙션에 의해 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시퍼라제 유전자 및 항체 내성 유전자를 함유하는 플라스미드 PRC/CMV-luc로의 안정적인 형질감염에 의해 American Type Cell Culture Collection으로부터 수득된 MDA-MB-435S 세포주로부터 작제되었다. G418을 사용하여 안정하게 형질감염된 세포주를 선택하고, 루시퍼라제 유전자에 대해 가장 높은 발현을 갖는 클론을 이들의 LH 및 LHRH 수용체 발현에 대해 시험하였다.
[0206] MDA-MB-435S.luc 세포를 Leibovitz의 L 15 배지, 10% 소 태아 혈청, 0.01 mg/ml 소 인슐린, 100 IU/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신에서 성장시켰다. 세포를 밀폐된 플라스크에서 배양하였다. 인큐베이션은 96 웰 플레이트를 사용하여 웰 당 10,000개 세포로 수행되었다. 세포를 전형적으로 96 웰 플레이트에 접종하고 48시간의 인큐베이션 후에 배지를 교체하였다. 각각의 검정은 용해 펩티드-결합 도메인 컨쥬게이트의 0, 0.001, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10 및 100 마이크로몰 용량의 증가하는 농도에서 수행되었다. 각각의 용해 펩티드-결합 도메인 컨쥬게이트는 동결건조된 형태로 제공되고 염수에 새로 용해되고 세포에 첨가되었다. 인큐베이션 기간은 전형적으로 24시간이었고, 세포 생존력 검정은 포르마잔 전환 검정(MTT 검정)을 사용하여 수행되었다. 대조군은 각각 0% 및 100% 세포 사멸에 대한 참조로서 염수 또는 0.1% 트리톤을 함유하였다.
[0207] Graph Pad Prizm 4™ 소프트웨어(Graph Pad Prizm, Inc)를 사용하여 데이터를 처리하고 분석하였다. 유의성에 대한 통계적 분석은 양측 스튜던트 T-테스트에 의해 결정되었다. 각 연구는 적어도 8 중 N을 달성하기 위해 수행되었다.
[0208] 융합 작제물의 길이를 증가시키는 효과가 확인되었다(Javadpour et al., J Med Chem 39:3107 (1996); Javadpour and Barkeley, Biochemistry 36:9540 (1997); Leuschner and Hansel, Current Pharmaceutical Design, 10:2299 (2004); and Leuschner and Hansel, Biol Reprod 73:255 (2005)). C-말단에서 βCG-ala에 컨쥬게이션된 용해 펩티드는 작제물의 길이가 증가함에 따라 증가하는 독성을 나타내었다. 다양한 길이의 펩티드에 대한 IC50은 다음과 같았다: 14개 아미노산(Phor14) 5.74, 15개 아미노산(Phor15) 1.92, 18개 아미노산(Phor18 = CLIP71) 1.09, 21개 아미노산(Phor21) 2.31 및 28개 아미노산(Phor28) 1.36 μM(표 3).
[0209] 결합 모이어티의 위치(N- 또는 C-말단)의 효과를 확인하였다. 간단히 말해서, Phor21-βCG-ala(C-말단), βCG-ala Phor21(N-말단), LHRH-Phor21(N-말단) 및 Phor21-LHRH(C-말단) 융합 작제물을 연구하였다. 펩티드의 IC50은 Phor21-βCG-ala에 대해 2.3μM, βCG-ala-Phor21에 대해 4.7μM, LHRH-Phor21에 대해 2.65μM, 및 Phor21-LHRH에 대해 1.71μM였다. 데이터는 βCG-ala 및 LHRH 결합 모이어티의 C-말단 위치가 결합 모이어티가 N-말단에 위치하는 경우보다 더 큰 독성을 나타냄을 입증한다.
[0210] LHRH-수용체는 많은 인간 암에 존재한다(표 1 참조). 결합 모이어티로서 LHRH의 활성을 결합 모이어티로서 βCG-ala와 비교하였다.
[0211] LHRH-Phor21 및 Phor21-βCG-ala의 독성은 2시간 또는 24시간 인큐베이션에서 시험관 내 인간 MDA-MB-435S.luc 흑색종 세포에서 비교되었다. 데이터는 LHRH-Phor21이 Phor21-βCG-ala보다 빠르게 세포를 사멸시켰음을 나타내며, LHRH-Phor21은 2시간 이내에 세포 사멸을 유도한다(도 1).
표 1
Figure pct00001
[0212] 용해 도메인과 결합 모이어티 사이에 힌지, 스페이서 또는 링커 서열의 도입은 세포 사멸에서 Phor21-βCG-ala보다 더 큰 효능을 갖는 펩티드를 생성시켰다. (도 2, 표 2). Phor21-βCG-ala 융합 작제물에서 힌지 서열 또는 스페이서의 도입은 세포 사멸 활성을 유의하게 변화시키지 않았지만, 힌지 서열로서의 ASAAS의 효과는 βCG-컨쥬게이트에 대해 15개 아미노산을 갖는 용해 펩티드의 독성을 유의하게 증가시켰다; 이 효과는 시험관 내에서 동등하게 효과적인 βCG 및 LHRH 컨쥬게이션된 펩티드 Phor18-LHRH 및 Phor18-ASAAS-LHRH의 경우에는 없었다(표 2, 도 4). 힌지 서열이 6개의 탄소 스페이서, 알파 아미노 카프로산으로 치환되었을 때 유사한 효과가 관찰되었다(표 2). 제2 힌지 서열(GSGGS)에서 글리신에 의한 알라닌의 치환은 상당히 더 낮은 활성을 초래하였고, 이는 글리신이 나선 불안정화 효과를 가질 수 있음을 시사한다. (도 2, 표 2).
표 2: βCG-ala 컨쥬게이션된 펩티드의 펩티드 길이의 효과
Figure pct00002
[0213] D-아미노산 치환의 효과를 확인하기 위해, 융합 작제물 Phor21-βCG-ala를 D 거울상 이성질체로 합성하였다(이하 D-ala-Phor21-βCG-ala로서 지칭됨). 이 융합 작제물은 시험관 내 MDA-MB-435S.luc 흑색종 세포와 유사한 독성을 나타내었다(Phor21-βCG-ala 2.31 μM, D-ala-Phor21-βCG-ala 2.15 μM(표 3); D-ala-Phor18-βCG-ala는 Phor21-βCG-ala보다 1.4배 더 강력하였고(IC50 1.6 μM), LHRH 대응물은 0.75 μM의 IC50을 갖는 D-ala-Phor21-LHRH, 1.42 μM의 IC50을 갖는 D-Phor18-LHRH 및 1.95 μM의 IC50을 갖는 Phor18-루프론과 비교하여 D-거울상 이성질체(Phor21-LHRH(1.31 μM의 IC50))로서 유의하게 더 강력하였다.
[0214] MDA-MB-435S.luc 흑색종 세포에서 βCG-ala 및 LHRH-컨쥬게이션된 용해 펩티드에 대한 IC50-값은 표 3 및 도 3에 요약되어 있다. 간단히 말해서, Phor21-βCG-ala(2.31±0.16)보다 유의하게 더 낮은 IC50을 갖는 펩티드는 다음과 같았다: Phor28-βCG-ala(1.36±0.09 μM; p<0.0001), Phor15-ASAAS-βCG-ala(1.48±0.24 μM; p<0.005), Phor15-C6-βCG-ala(1.31±0.17 μM; p<0.004)(C6 = 6 아미노카프로산), Phor18-βCG-ala(1.09±0.17 μM; p<0.0001), Phor21-LHRH(1.31±0.1 μM; p<0.0001), D-ala-Phor21-LHRH(0.75±0.1 μM; p<0.0001), Phor18-ASAAS-LHRH(0.88±0.12 μM; p<0.0001), Phor18-LHRH(0.87±0.11 μM; p<0.0001), (KKKFAFA)3-LHRH(0.78±0.21 μM; p<0.0004), 및 D-ala-Phor18-LHRH(1.42±0.08 μM; p<0.004).
[0215] LHRH 융합 작제물은 일반적으로 βCG-ala 융합 작제물보다 더 강력하였다(더 독성이며 더 빠르게 작용함, 도 1). 간단히 말해서, Phor21-LHRH, D-ala-Phor21-LHRH, Phor18-ASAAS-LHRH, Phor18-LHRH 및 펩티드 대조군 338614((KKKFAFA)3 = 비활성 펩티드))는 Phor21-βCG-ala에 비해 인간 유방암 세포에 유의하게 더 독성이었다(p<0.003). 모든 LHRH 융합 작제물은 결합 모이어티가 용해 부분에 대해 C 말단에 위치할 때 상당히 덜 강력했던 LHRH-Phor21을 제외하고는 거의 동일하게 효과적이었다. D-ala-Phor18-LHRH는 Phor21-LHRH에 비해 동일하게 효과적이었다; Phor18-루프론은 덜 독성이었지만 Phor21-βCG-ala와 비슷하였다. (도 4, 표 3; 루프론은 QHWSY(D-Leu)LRPNEt이다).
[0216] Phor21-LHRH(1.34±0.1 μM)보다 유의하게 더 낮은 IC50-값을 갖는 융합 작제물은 다음과 같았다: D-ala-Phor21-LHRH(0.75±0.12 μM; p<0.002), Phor18-ASAAS-LHRH(0.88±0.11 μM; p<0.0001), Phor18-LHRH(0.87±0.12 μM; p<0.004), 및 (KKKFAFA)3-LHRH(0.78±0.21 μM; p<0.04). 동일한 융합 작제물이 βCG-ala 및 LHRH 결합 모이어티 사이에서 비교될 때, 모든 경우에 LHRH 융합 작제물은 이들의 βCG-ala 대응물에 비해 상당히 더 독성이었다.
표 3: 세포용해 펩티드 및 펩티드 컨쥬게이트 - MDA-MB-435S.luc 세포에서 IC50 및 HA50 특성의 요약
Figure pct00003
Figure pct00004
[0217] Phor18-루프론 및 D-ala-Phor18-LHRH를 포함하는 21개의 융합 작제물에 대한 급성 용혈 활성이 연구되었다. 결과는 도 5 및 6, 및 표 3에 요약되어 있다.
[0218] 용혈 활성은 0.5% 인간 RBC에 노출된 펩티드의 연속 희석을 사용하여 96 웰 플레이트에서 결정되었다. 대조군은 염수(RBC 사멸 없음) 또는 0.1% Triton X 100(100% RBC 용해)이었다. 펩티드 농도는 0 내지 100 μM 범위였다. 인큐베이션은 2시간 동안 수행되었다.
[0219] 시스플라틴과 비교하여 상이한 인간 암 세포주에서 다양한 융합 작제물의 IC50을 확인하기 위해, 융합 작제물의 IC50을 표 3에서와 같이 평가하였다. 결과는 하기에 제시되어 있다:
시스플라틴과 비교한 인간 암 세포주에서 IC 50 [μM] 값
Figure pct00005
흑색종 세포주: MDA-MB-435S.luc
유방암 세포주: MDA-MB-231
난소암 세포주: OVCAR-3, SKOV-3
전립선암 세포주: LNCaP
자궁내막암 세포주: AN3-CA
[0220] 일반적으로 데이터는 Phor21-LHRH, LHRH-Phor21 및 Phor18-루프론을 제외하고, 연구된 융합 작제물에 대해 매우 낮은 용혈 활성을 나타낸다. 유사한 조건에서 다음 융합 작제물은 어떠한 용혈 활성도 나타내지 않았다(도 5 참조): Phor15-아미노카프로산-β-CG-ala(337474), D-ala-Phor21 β-CG-ala(337481) > 150,000 μM, Phor21, 컨쥬게이션되지 않은 Phor18 = CLIP71, (KKKFAFA)3-βCG-ala, Phor21(338982), Phor18 = CLIP71(338983), D-ala-Phor18-LHRH(339385) 및 (KKKFAFA)3-LHRH(338984). D-아미노산 거울상 이성질체는 측정 가능한 용혈 활성을 갖지 않았다.
[0221] 용혈 활성이 < 50 μM인 융합 작제물은 다음과 같았다: Phor21-LHRH(25 μM), LHRH-Phor21(33 μM) 및 Phor18-루프론(21 μM).
[0222] 용혈 활성이 > 100 μM인 융합 작제물은 다음과 같았다: Phor18-β-CG-ala(337476), 및 Phor18-LHRH(338613).
[0223] 50-100 μM의 용혈 활성을 갖는 융합 작제물은 다음과 같았다: (KKKFAFA)3-LHRH(95 μM), Phor21-βCG-ala 및 Phor21-ASAAS-βCG-ala는 70 μM의 유사한 HA50을 가졌다.
[0224] 400-1300 μM의 용혈 활성을 갖는 융합 작제물은 다음과 같았다: Phor14-βCG-ala(337464), Phor18 GSGGS β-CG-ala(337467), Phor18 ASAAS β-CG-ala(337470), Phor15 ASAAS β-CG-ala(337471), D-ala-Phor21-LHRH(338611), 및 Phor18-ASAAS-LHRH(338612).
[0225] 임상적으로 중요한 기준은 세포 독성(IC50)과 용혈 활성(HA50)의 비율, 또는 IC50/HA50이다(도 6, 표 3). 대부분의 융합 작제물에 대해 측정된 HA50 값보다 낮은 몇 가지 요인인 10 μM 융합 작제물의 최대 농도를 사용하여 생체 내 연구를 수행하였다.
[0226] D-ala-Phor21, Phor18-ASAAS, D-ala-Phor18 및 Phor18을 갖는 LHRH-컨쥬게이트는 0.001-0.006의 매우 낮은 IC50/HA50 비율을 가졌다(Phor21-βCG-ala 0.03과 비교). MDA-MB-435S.luc 세포에 대한 독성은 Phor21-βCG-ala에 비해 유의하게 높다: D-ala) Phor21-LHRH는 Phor21-βCG-ala보다 3배 더 독성이고, Phor18-LHRH 및 Phor18-ASAAS-LHRH는 2배 더 강력하며, D-ala-Phor18-LHRH는 1.5 더 강력하다(도 6).
[0227] 요약하면, 증가된 독성 및 더 적은 용혈 활성(IC50/HA50 비율)의 기준에 의해 평가된 융합 작제물은 다음과 같을 것이다: Phor18-βCG-ala, Phor18-ASAAS-βCG-ala, Phor15-ASAAS-βCG-ala, Phor15-C6-βCG-ala, D-ala-Phor21-LHRH, Phor18-LHRH, Phor18-ASAAS-LHRH, 및 D-ala-Phor18-LHRH.
실시예 3
[0228] 이 실시예는 다양한 유형 및 용량의 βCG- 및 LHRH-융합 작제물을 사용한 흑색종의 마우스 이종이식 모델에서의 생체 내 연구를 설명한다.
[0229] 암컷 Nu/Nu 마우스에 MDA-MB-435S.luc/Matrigel HC 현탁액(1x106개 세포)을 피하 주사하였다. 치료 일정은 도 7에 제시되어 있다. 간단히 말해서, 치료는 종양 세포 주사 후 13일에 시작되었고 19일 및 25일에 계속되었다. 치료는 다음과 같았다: 염수 대조군, Phor21(5 mg/kg), Phor18(5 mg/kg), (KKKFAFA)3 펩티드-βCG-ala(5 mg/kg), Phor21-βCG-ala(0.01, 1 및 5 mg/kg), Phor18-βCG-ala(0.01, 1 및 5 mg/kg), D-ala-Phor21-βCG-ala(0.01, 1 및 5 mg/kg), 기준선 그룹 당 8-12마리 마우스, 14개 그룹. 매주 주사를 위한 용량은 볼루스 단일 주사로서 제공된 5, 1 및 0.01 mg/kg 체중이었다.
[0230] 모든 그룹의 마우스는 주사를 잘 견뎠다. 5 mg/kg 용량의 337476을 사용한 각 주사에서 한 마리의 마우스만이 죽었다. 죽음은 급성 사건이었다. 다른 치료 그룹의 모든 마우스는 생존하였다. 주사 후 10분 이후에 주사의 결과로 죽은 마우스는 없었다.
[0231] 원발성 종양에 대한 세포용해 펩티드 주사의 효과는 도 8에 예시되어 있다. 간단히 말해서, 도 8a-8c는 각각의 개별 펩티드에 대한 연구 과정 동안 종양 부피를 보여준다. 도 8d-8g는 부검시 종양 특성을 보여준다: 종양 부피(D), 종양 중량(E), 살아있는 종양 세포(F), 종양 상태(G).
[0232] 치료 효능은 연구 종료시 측정값과 비교하여 치료 시작시 측정값 사이의 차이로서 계산되었다(도 8h-8i). 도 8j는 부검시 마우스의 체중을 보여준다. 종양에서 세포의 생존력은 종양이 루시퍼라제 활성에 대해 측정될 때 연구의 종료시에 결정되었다.
[0233] 0.01 mg/kg에서 기준선(323033 제외) 및 (KKKFAFA)3-βCG-ala, Phor21 및 컨쥬게이션되지 않은 Phor18 = CLIP71 대조군과 비교하여 βCG를 리간드로 함유하는 펩티드(II, A)로 치료된 모든 동물에서 종양 부피가 유의하게 감소하였다, p<0.05. 종양 부피는 이종이식편 부피 감소에 효과적이지 않은 (KKKFAFA)3-βCG-ala, Phor21 및 Phor18을 제외한 모든 치료 그룹에서 염수 대조군과 비교하여 유의하게 감소하였다.
[0234] 종양 중량은 또한 염수 또는 (KKKFAFA)3 펩티드로 치료된 동물과 비교할 때 βCG 컨쥬게이션된 펩티드를 사용한 모든 치료 그룹에서 유의하게 감소하였다(p<0.001). 루시퍼라제 활성에 의해 측정된 종양 세포 생존력은 관찰된 종양 중량 및 종양 부피의 변화와 잘 연관되었다.
[0235] 기준선 값과 비교하여 종양 중량 또는 생존 가능한 종양 세포의 감소로서 측정된 치료 효능은 323033 및 337476에 대해 농도 의존적 치료 반응을 나타내었다. 337481은 0.01, 1 및 5 mg/kg 투여량에서 종양 부하 및 살아있는 종양 세포의 일관된 감소를 나타내었다. 323033은 5 mg/kg에 비해 1 mg/kg 용량에서 가장 효과적이었으나(이전 실험에서 이미 관찰되었음), 단지 적용된 가장 낮은 용량에서 염수 대조군과 유의하게 다르다. 융합 작제물 337476 및 337481은 323033(p<0.0001)과 비교하여 5 및 0.01 mg/kg에서 종양 부하 및 생존 가능한 종양 세포(p<0.004)를 기준선 값 아래로 감소시키는데 훨씬 더 효과적이다. 융합 작제물 337481은 농도 의존성을 나타내지 않으며 모든 시험된 작제물 중에서 가장 효과적이었다.
[0236] 낭성 종양은 융합 작제물 337476 및 337481로 치료된 마우스에서 발견되었으며, 이는 80-90%로 발생했지만 1 mg/kg 323033 치료 그룹에서는 30%에 불과했다. (이 이종이식 모델에서는 낭종 형성이 관찰되지 않았다. 낭종은 액체로 채워진 캡슐로 구성되었다.) 명확하지는 않지만 빠르게 성장하는 종양에서 세포가 빠르게 사멸될 때 낭성 종양이 발생하는 것으로 가정되었다. 낭종은 Phor21로 처리된 전립선 종양 이종이식편에 존재하였다.
[0237] 치료 그룹에 대한 혈액 화학 및 완전한 혈구 수 결과는 어떠한 경우에도 치료가 간, 신장, 심장 기능에 영향을 미치지 않았음을 나타내었다. 혈소판 수, WBC 및 RBC 수는 정상 범위 내에 있었으며, 이는 치료가 종양 세포를 특이적으로 사멸시키고, 주어진 농도에서 빈혈을 유발하지 않았고 임의의 다른 관찰 가능한 생체 기능에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 융합 작제물은 장기적인 부작용 없이 잘 관용되었다.
[0238] 상기 생체 내 종양 효능 데이터에 기초하여, Phor18-βCG-ala(337476) 및 D-ala-Phor21-βCG-ala(337481)는 기준선 값과 비교하여 종양 중량 감소(p<0.0001) 및 생존 가능한 종양 세포의 파괴(p<0.004)에 대해 참조 Phor21-βCG-ala(323033)보다 훨씬 더 강력하다. 두 융합 작제물 모두는 생체 내에서 용혈을 일으키지 않았고 사용된 최고 용량(5 mg/kg)에서 지속적인 부작용을 나타내지 않았다. Phor18-βCG-ala의 종양 효능은 최저 용량에서도 다중 주사로 더 커질 수 있다.
[0239] LHRH 융합 작제물의 경우, 유방암에 대한 마우스 이종이식 모델을 사용하였다. 간단히 말해서, 5주령의 무작위교배계 주 Nu/Nu 암컷 마우스(Charles River)에 MDA-MB-435S.luc/Matrigel 현탁액(1x106개 세포)을 피하 주사하였다. 치료는 종양 세포 주사 후 21일에 시작되었고 26일 및 29일에 계속되었다. 매주 융합 작제물 주사를 위한 용량은 볼루스 단일 주사로서 제공된 2, 0.2 및 0.02 mg/kg 체중이었다. 모든 마우스는 종양 세포 주사 후 34일에 부검되었다 - 종양 중량에 대한 기준선 값은 치료 시작시 8마리의 마우스를 희생시킴으로써 수득되었다. 원발성 종양, 간, 신장, 췌장, 심장, 폐 및 비장을 수집하고 포르말린에서 조직학적 평가를 위해 준비하였다. 부검시에 종양 중량을 기록하고, 종양의 일부를 루시퍼라제 검정 결정을 위해 -80℃에서 동결시켰다.
[0240] 치료 그룹은 염수 대조군, Phor21-βCG-ala - 323033(0.02, 0.2 및 2 mg/kg), D-ala-Phor21-LHRH - 338611(0.02, 0.2 및 2 mg/kg), (KKKFAFA)3 LHRH - 338614(5 mg/kg), Phor18-LHRH - 338613(0.02, 0.2 및 2 mg/kg), Phor18-ASAAS-LHRH - 338612(0.02, 0.2 및 2 mg/kg), D-ala-Phor18-LHRH - 339385(0.02, 0.2 및 2 mg/kg), 및 Phor18-루프론 - 339347(0.02, 0.2 및 2 mg/kg), 기준선 그룹 당 12마리 마우스를 포함하였다.
[0241] 모든 그룹은 주사를 잘 견뎠다. 2 mg/kg 용량의 Phor18-ASAAS-LHRH로 2차 및 3차 주사하는 동안 2마리의 마우스만이 죽었다(이들 마우스는 동일한 케이지에서 나왔다). 죽음은 급성 사건이었다. 다른 치료 그룹의 모든 마우스는 생존하였다. 주사 후 10분 이후에 주사의 결과로 죽은 마우스는 없었다.
[0242] 도 9는 각각의 개별 작제물에 대한 연구 과정 동안 부피 측정값으로서 원발성 종양에 대한 융합 작제물 주사의 효과를 요약한다. 지수적 종양 성장이 관찰된 (KKKFAFA)3-LHRH 컨쥬게이트로 치료된 마우스 또는 염수 대조군을 제외하고는 모든 그룹에서 치료 동안 종양 부피가 감소하였다. 치료 후 30일 후에 기록된 종양 부피는 모든 융합 작제물에 대해 기준선과 비교하여 감소(p<0.01)를 보여주며, 가장 작은 종양 부피는 Phor18-ASAAS-LHRH 및 Phor18-LHRH를 사용한 치료 그룹에서 기록되었다.
[0243] 부검시 종양의 특성은 도 10에 요약되어 있다: (A) 종양 중량, (B) 기준선과 비교한 종양 중량의 변화, (C) 살아있는 종양 세포의 총 수, (D) 기준선과 비교한 총 살아있는 종양 세포의 변화, 및 (E) 기준선 및 부검시의 체중. 종양 세포의 생존력은 종양이 루시퍼라제 활성에 대해 측정될 때 연구의 종료시에 결정되었다. 치료 효능은 연구 종료시 측정값과 비교하여 치료 시작시 측정값 사이의 차이로서 계산되었다(도 10b 및 10d).
[0244] 염수 대조군 및 (KKKFAFA)3-LHRH 컨쥬게이션된 펩티드와 비교하여(p<0.0001) LHRH 컨쥬게이트가 제공되었을 때 0.02 mg/kg의 최저 용량에서도 모든 치료 그룹의 모든 동물에서 종양 중량 및 살아있는 종양 세포의 총 수가 유의하게 감소하였다. 총 종양 중량은 LHRH를 함유하는 2 mg/kg 펩티드 및 D-ala-Phor18-LHRH에 대해 0.02, 0.2 및 2 mg/kg으로 치료된 모든 동물에서 기준선에 비해 유의하게 감소하였다(a), (p <0.05).
[0245] 다음 농도는 기준선과 유사한 종양 중량을 초래하였다: 0.02 mg/kg(p<0.07) 및 0.2(p<0.06)의 Phor21-βCG-ala - 323033); 0.2 및 0.02 mg/kg 투여량의 Phor18-루프론, 0.2 mg/kg의 Phor18-LHRH, 및 0.2 mg/kg의 D-ala-Phor21-LHRH. 총 종양 중량을 0.02 mg/kg 용량의 Phor21-βCG-ala와 비교할 때, Phor18-ASAAS-LHRH 및 D-ala Phor18-LHRH는 0.02 mg/kg 투여량에서 우수하였다(p<0.05).
[0246] 살아있는 종양 세포의 수는 도 10c에서 살아있는 종양 세포의 총 수로서 그리고 도 10d에서 기준선과 비교하여 살아있는 종양 세포의 변화로서 결정되고 플롯팅되었다. 루시퍼라제 활성에 의해 측정된 세포 생존력은 살아있는 종양 세포의 감소가 관찰된 Phor18-ASAAS-LHRH 및 Phor18-LHRH를 제외하고 종양 중량 및 종양 부피에서 관찰된 변화와 상관 관계가 있었다. D-ala-Phor18-LHRH(339385) 및 Phor18-ASAAS-LHRH(338612)를 사용한 치료는 2 mg/kg 용량에서 Phor21-βCG-ala보다 우수하였다(p<0.04).
[0247] 기준선 값과 비교하여 종양 중량 또는 생존 가능한 종양 세포의 감소로서 측정된 치료 효능은 종양 중량 및 살아있는 종양 세포와 관련하여 D-ala-Phor21-LHRH를 제외한 모든 융합 작제물에 대해 농도 의존적 치료 반응을 나타내었다. D-ala-Phor18-LHRH는 0.02, 2 및 2 mg/kg 투여량에서 종양 중량 및 살아있는 종양 세포의 일관된 감소를 나타내었다. 이 실험에서 가장 효과적인 융합 작제물은 2 mg/kg에서 살아있는 종양 세포 및 종양 중량을 감소시키는데 있어서 Phor18-ASAAS-LHRH(338612) 및 D-ala-Phor18-LHRH(339385)였다. Phor18-ASAAS-LHRH 및 D-ala-Phor18-LHRH는 2 및 0.02 mg/kg 용량의 Phor21-βCG-ala에 비해 우수하였다(p<0.05). Phor18-루프론은 종양 중량 및 살아있는 종양 세포를 감소시키는데 가장 효과적이지 않았다.
[0248] 치료 그룹에 대한 혈액 화학 및 완전한 혈구 수 결과는 어떠한 경우에도 치료가 간, 신장, 심장 기능에 영향을 미치지 않았음을 나타내었다. 혈소판 수, WBC 및 RBC 수는 정상 범위 내에 있었으며, 이는 치료가 종양을 특이적으로 파괴하고, 주어진 농도에서 빈혈을 유발하지 않았고 임의의 다른 관찰 가능한 생체 기능에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. Phor18-루프론, Phor18-LHRH 및 D-ala-Phor21-LHRH를 주사한 마우스에서 염수 대조군과 비교하여 1.5배의 상승된 포타슘 수준이 관찰되었다. 융합 작제물은 장기적인 부작용 없이 잘 관용되었다.
[0249] 상기 생체 내 종양 효능 데이터에 기초하여, Phor18-ASAAS-L HRH(338612) 및 D-ala-Phor18-LHRH(339385)는 종양 중량 감소(p<0.05) 및 생존 가능한 종양 세포의 파괴(p<0.04)에 대해 참조 Phor21-βCG-ala보다 훨씬 더 강력하다. Phor21-βCG-ala와 동등하게 효과적인 것은 D-ala-Phor21-LHRH 및 Phor18-LHRH였다. 두 융합 작제물 모두는 생체 내 용혈 또는 다른 부작용을 일으키지 않았다. Phor18-ASAAS-LHRH(338612) 및 D-ala-Phor18-LHRH(339385)의 효능은 최저 용량에서도 다중 주사로 더 커질 수 있다.
실시예 4
[0250] 이 실시예는 시험관 내 및 생체 내 수용체 발현 및 특이성 연구를 설명한다.
[0251] LH 수용체 발현 밀도는 치료가 수용체 발현의 하향 조절을 초래하는지 결정하기 위해 치료 전후에 모두 분석될 것이다. 정량화를 위한 웨스턴 블롯 검정 및 RIA와 비교한 면역세포화학. 챔버 슬라이드가 있는 IHC 및 웨스턴 블롯 기술을 사용한 MDA-MB-435S.luc 세포, CHO 및 TM4 세포에서의 LH 및 LHRH 수용체 결정. 용해 펩티드 CG 및 용해 펩티드 LHRH에 대한 민감도에 대해 각 세포주의 동일한 계대 수를 시험할 것이다.
[0252] LH 수용체 융합 작제물의 특이성은 MDA-MB-435S.luc(LHRH 및 CG 수용체 둘 모두), TM4(LHRH 수용체 없음) 및 CHO(CG 수용체 없음) 세포에서 분석되었다. IC50 데이터는 LHRH-Phor21(10.9 μM)에 대해 TM4 세포에서 민감도의 상당한 감소를 나타내는 반면, CHO 세포는 MDA-MD-435S.luc 세포(2.3 μM)와 비교할 때 Phor21-βCG-ala(24.6 μM)에 대해 낮은 민감도를 나타낸다(도 12).
[0253] 생체 내 수용체 발현은 융합 작제물 치료와 관련하여 측정된다. 생체 내 수용체 발현은 융합 작제물 치료의 시작 및 종료시에 측정된다.
실시예 5
[0254] 이 실시예는 융합 작제물 및 화학요법제를 사용한 조합 치료를 설명한다.
[0255] Phor21-βCG-ala 및 독소루비신과 함께 48시간 동안 인큐베이션된 난소암 세포주(OVCAR-3 세포, 다중 약물 내성)의 예비 연구를 수행하였다. 세포 생존력은 포르마잔 감소로 결정되었다. Phor21-βCG-ala와의 동시 인큐베이션에서 증가하는 독소루비신 처리에 따른 IC50의 감소. 감소는 0, 0.5, 2 및 10 μg/ml의 독소루비신 농도에서 10 μM에서 0.9 내지 0.3 내지 0.05 μM이다. (도 11). Phor21-βCG-ala로의 치료는 독소루비신에 대한 반응을 강화시켰다. 데이터는 세포가 독소루비신과 공동-인큐베이션될 때 Phor21-βCG-ala가 더 효과적이라는 것을 보여주었다(13배).
[0256] 독소루비신 또는 시스플라틴으로 암 세포를 전처리한 후, LH 또는 LHRH의 존재 및 부재하에 LH 또는 LHRH 융합 작제물로 처리하면 작제물에 대한 세포의 세포독성이 변경되는지 여부를 알 수 있다.
[0257] 조합 치료의 생체 내 효능을 이종이식 종양 모델(MDA-MB-435S)에서 시험하였다. 마우스를 융합 작제물 및 화학요법 약물의 조합으로 치료하고 적절한 대조군과 비교한다. 마우스를 약물에 사용된 표준 일정에 따라 치료하고, 융합 작제물로 3주 동안 주 1회 치료하였다.
[0258] 융합 컨쥬게이트는 항-종양 유효 용량(0.02 또는 0.01 mg/kg)과 비교하여 용혈 활성, 최대 허용 용량(MTD)(최대 16-25 mg/kg)과 같은 파라미터를 고려할 때 높은 안전성 한계를 갖는다. Phor21-βCG-ala의 안전성 한계는 16인 반면, Phor18-βCG-ala 및 Phor18-LHRH의 경우 800의 값에 도달할 수 있다. 이에 비해 Phor18-루프론의 안전성 한계는 8에 불과하다.
하기 표 4는 다양한 기준에 따른 컨쥬게이트의 요약이다.
Figure pct00006
등급 코드:
할당된 포인트: 1 2 3
시험관 내 활성 1x 2x 3x
HA50 < 50 50-100 > 100
IC50/HA50 <0.03 <0.006 <0.004
생체 내 효능
33 동등물에 비해 양호
MTD 비교
33 동등물에 비해 양호
1) 33의 IC50은 2.31 μM이고, 값은 33의 IC50/IC50 펩티드로 표시된다.
2) 용혈 활성은 HA50 [μM]으로 표시된다.
3) 생체 내 성능은 펩티드 33의 동일한 파라미터와 비교하여 종양 중량 감소 및 살아있는 종양 세포 감소 대 기준선 값에서의 유의성을 지칭한다.
4) 66.6%의 생존을 초래하는 주사 용량(급성 및 주사 후 8-14일).
펩티드 코드:
33 = Phor21βCG-ala
76 = Phor18-βCG-ala
81 = D ala Phor21-βCG-ala
85 = D ala Phor18-LHRH
47 = Phor18-루프론
13 = Phor18-LHRH
11 = D ala Phor21-LHRH
12 = Phor18-ASAAS-LHRH
71 = Phor15-βCG-ala
74 = Phor15-C6-βCG-ala
실시예 6
[0259] 이 실시예는 다양한 암 세포주에서 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH (338613))의 시험관 내 동역학 연구를 설명한다.
[0260] 표준 화학요법 약물은 DNA 삽입, 미세소관 상호작용을 통해 상호작용하거나 신호 전달 경로의 억제제이다. 따라서, 이들의 작용 메커니즘은 표적 세포를 파괴하는데 필요한 시간 프레임을 결정한다. MDA-MB-435S와 같은 인간 흑색종 세포를 파괴하기 위한 시험관 내 독소루비신의 동역학은 4시간만큼 빠른 것으로보고되었고, 다른 표준 치료법은 더 오래 걸릴 수 있다. 암 세포를 파괴하는 가장 일반적인 작용 메터니즘은 아폽토시스이다. 가역적 과정으로서 및 다중-약물 내성(MDR)의 발생, MDR 암 세포에서 약물 분자를 내보내는 Pgp 펌프의 작용으로 인해, 표준 치료법은 효과가 없을 수 있다.
[0261] 화학요법 약물과 달리, 직접적인 막 작용은 몇 분 내에 암 세포를 파괴할 수 있다. 양이온성 용해 펩티드와 같은 막 활성 화합물은 Phor18-LHRH(338613)(KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG)를 포함한다.
[0262] 세포독성의 동역학을 결정하기 위해, 다양한 수준의 LHRH 표적 수용체를 발현하는 다양한 세포주에서 표적화되지 않은 용해 펩티드 모이어티 Phor18 = CLIP71(338983)과 비교하여 Phor18-LHRH(338613)를 사용한 상세한 시간 과정 연구를 수행하였다. 비-암성 세포주의 막은 외막에 높은 포스파티드산 함량을 갖는 암 세포주와 달리 중성이고 세포용해 펩티드에 내성이 있다.
[0263] 연구된 흑색종 세포주는 MDA-MB-435S(에스트로겐 수용체 알파 음성), 유방암 세포주 MCF-7 및 T47D(에스트로겐 수용체 알파 양성), 난소암 세포주(OVCAR-3 및 SKOV-3), 전립선암(LNCaP), 비-악성 유방 상피 세포주 MCF-10A 및 마우스 섬유모세포 세포주 NIH:3T3이었다. Phor18-LHRH(338613)의 효능에서 LHRH 수용체 표적화의 역할도 평가되었다.
[0264] 세포를 10,000개 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 5, 10, 50 및 100 μM 농도의 Phor18-LHRH(338613)(APC 338613, Lot # P080401) 또는 Phor18 = CLIP71(APC 338983, Lot # W08033C1)을 첨가하여 48시간 후에 치료를 개시하였다. 대조군은 각각 0% 및 100% 세포 사멸에 대한 참조로서 USP 염수 또는 0.1% TritonX-100™을 함유하였다. 2분, 5분, 15분, 30분, 1시간, 2시간, 6시간, 24 및 48시간 후에 배양 배지를 제거함으로써 인큐베이션을 종료하였다. 세포 생존력은 포르마잔 전환 검정(MTT 검정, (CellTiter 96 Aqueous One, Promega # G3582)을 통해 평가되었다. 포르마잔 전환은 BioRad Benchmark Plus 마이크로플레이트 분광광도계 이중 파장(실온에서 490/630 nm)을 사용하여 결정되었다.
[0265] 데이터는 염수 함유 웰에서 0% 세포 사멸에 대한 100% 세포 사멸을 나타내는 TritonX-100™ 함유 웰에서의 흡수율로 계산되었다. 0 및 100%의 제한 값을 사용하는 가변 기울기를 갖는 시그모이드 용량 반응에 대한 프로그램에 따라 Windows 용 GraphPad Prism 버전 5.01, GraphPad Software, San Diego USA를 사용하여 세포독성을 IC50으로 결정하였다. 2개의 96 웰 플레이트의 각 개별 세트의 4개 웰을 비교하고 분석하였다. 유의성에 대한 통계적 분석은 양측 스튜던트 T-테스트에 의해 결정되었다.
[0266] MDA-MB 435S 세포(p250)에서 Phor18-LHRH(338613)는 1시간의 인큐베이션 후 최대 효능을 나타낸 반면, CLIP71 인큐베이션은 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 100, 109, 171, 145, 148, 86, 54.5, 55.1(24시간), 및 3 [μM](48시간)(p<0.005)의 IC50 값을 나타내었다. Phor18-LHRH(338613)는 컨쥬게이션되지 않은 용해 펩티드 CLIP71(>100 μM)에 비해 속효성 제제(1.2 μM 0.5시간 및 0.6 μM 1시간 후)이다.
[0267] MCF-7 세포(p152)에서 Phor18-LHRH(338613)는 1시간의 인큐베이션 후 최대 효능을 나타낸 반면, CLIP71 인큐베이션은 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 92, 95, 50 및 22 [μM](p<0.005)의 IC50 값을 나타내었다. Phor18-LHRH(338613)는 컨쥬게이션되지 않은 CLIP71에 비해 속효성 제제(3.4-1.8 μM)이다.
[0268] OVCAR-3 세포(p47)에서 Phor18-LHRH(338613)는 1시간의 인큐베이션 후 최대 효능을 나타낸 반면, 컨쥬게이션되지 않은 Phor18 = CLIP71(33 인큐베이션)은 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 337, 126, 85.5, 52.5, 22.9 및 23.1 [μM](p<0.005)의 IC50 값을 나타내었다. Phor18-LHRH(338613)는 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 6.7, 5.6, 5.3, 1.6, 1.5, 0.5 및 0.5 [μM](p<0.005)의 IC50 값을 갖는 속효성 제제이다. 빠른 역학적 데이터는 Phor18-LHRH(338613) 및 CLIP71이 상이한 작용 메커니즘에 의해 세포를 사멸시키고 약물의 효능을 증가시킨다는 것을 시사한다.
[0269] SKOV-3 세포(p40)에서 Phor18-LHRH(338613)는 24시간의 인큐베이션 후 최대 효능(11.5 μM)을 나타낸 반면, CLIP71 인큐베이션은 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 86, 96, 53 및 50 [μM](p<0.005)의 IC50 값을 나타내었다. Phor18-LHRH(338613)는 SKOV-3 세포가 기능적 LHRH 수용체를 제공하지 않기 때문에 SKOV-3 세포에 대한 적절한 표적이 아니다.
[0270] Phor18-LHRH(338613)로 처리된 흑색종 세포(MDA-MB-435) 및 유방암 세포(MCF-7) 및 OVCAR-3과 같은 기능적 LHRH 수용체를 제시하는 모든 세포주는 0.5-1시간의 인큐베이션 이내에 최대 효과(μM 단위의 IC50)를 나타내었다. 대조적으로, CLIP71=Phor18의 최대 효과를 위해 24시간 인큐베이션이 필요하였다. T47D, LNCaP와 같은 기능적 LHRH 수용체를 제시하는 세포주에 대해서도 유사한 결과가 얻어졌다. 기능적 LHRH 수용체를 제시하지 않는 세포주(SKOV-3 및 HEK 1A)에서, Phor18-LHRH(338613) 및 CLIP71=Phor18은 24시간 인큐베이션 후 .10.3 resp 11.8 μM의 IC50 값을 가지며 유사한 독성을 나타내었다. 비-암성 세포주 3T3은 Phor18-LHRH(338613) 및 CLIP71=Phor18에 대해 매우 내성이었고, IC50 값은 CLIP71에 대해 > 40 μM이고 Phor18-LHRH(338613)에 대해 > 10 μM이었다.
[0271] 이러한 결과는 LHRH 표적화가 CLIP71=Phor18의 효능을 향상시키고 비-암성 세포주가 세포용해 양이온성 펩티드에 의한 파괴에 내성이 있음을 나타낸다. Phor18-LHRH(338613)는 1시간 미만 내에 수용체 표적화 메커니즘을 통해 암 세포를 파괴하는 놀라운 효능을 보여준다. Phor18-LHRH(338613)는 몇 분 이내에 효과적이며, 효능을 위해 세포 내 흡수 및 대사 경로 및 증식 기계와의 간섭에 의존하는 표준 화학 요법에 비해 이점을 갖는다. 또한, Phor18-LHRH(338613)는 다중-약물 내성 암 세포에 작용할 수 있다.
실시예 7
[0272] 이 실시예는 시험관 내 유방암 세포에 대한 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH (338613))의 가능한 작용 메커니즘을 나타내는 데이터를 포함한다.
[0273] 시험관 내에서 가능한 작용 메커니즘을 입증하기 위해, LHRH 수용체를 과다 발현하는 인간 흑색종 세포주 MDA-MB-435에서 형광 현미경 연구를 수행하였다. 간단히 말해서, 인간 흑색종 세포(MDA-MB-435, 계대 # 252)를 배양 디쉬에 시딩하였다. EP-100을 첨가하기 전에 다음 마커를 도입하였다: DRAQ5™(Alexis Corporation)-blue-는 핵의 염색을 위해 사용되었고 MitoTracker® Red CMXRos(M7512)(Molecular Probes, Inc. OR)는 온전한 미토콘드리아를 시각화하기 위해 적용되었다. 세포막을 밀 배아 알렉사 플루오르 그린 컨쥬게이트(Molecular Probes, Inc. OR)로 염색하였다.
[0274] 제조업체의 권장 사항에 따라 세포에 먼저 Mitotracker 염료를 로딩하였다. 염수에서 재구성된 Phor18-LHRH(338613)를 최종 농도 10 μM로 첨가하고 5-10분 동안 인큐베이션하였다. 염수만을 갖는 배양 디쉬를 대조군으로 제공하였다. 상청액을 제거하고, 나머지 세포를 형광 현미경 이미징을 위해 준비하였다.
[0275] Phor18-LHRH(338613)에 노출된 후 시험관 내 흑색종 세포에 기능적 LHRH 수용체를 제시하는 MDA-MB-435의 형광 현미경 평가는 Phor18-LHRH(338613)(10 μM)에 5분 노출된 후 형질막의 붕괴를 나타내었다. 이러한 관찰은 Phor18-LHRH(338613)가 형질막을 파괴하여, 몇 분 내에 세포를 사멸시킨다는 것을 시사한다.
[0276] 2 μM Phor18-LHRH(338613) FITC와 함께 30분 동안 인큐베이션된 배양물에서 SKOV-3(p 41) 및 MDA-MB-435S(p 250) 세포의 형광 현미경 평가는 SKOV-3 세포에서 세포 내 흡수가 없었고, 막 수포화가 발생하지 않았고, 미토콘드리아 염료가 유지되었음을 나타내었다. 대조적으로, MDA-MB-435S 세포에서 Phor18-LHRH(338613) FITC의 세포 내 흡수는 30분 이내에 가시적이었고 또한 외막의 소포 형성 및 미토콘드리아 염료의 퇴색으로 이어지는 광범위한 막 수포화를 보였다. 이러한 관찰은 세포 사멸이 몇 분 내에 발생하였음을 시사한다.
[0277] 몇 분 내에, Phor18-LHRH(338613)는 기능적 LHRH 수용체를 제시하는 세포를 파괴하였다. Phor18-LHRH(338613)는 외부 형질막을 붕괴하여 괴사를 유도함으로써 암 세포를 파괴하였다. 작용 메커니즘은 기능적 표적을 제시하는 세포의 형질막과 Phor18-LHRH(338613)의 빠른 상호작용을 강력하게 시사한다. LHRH 수용체에 대해 음성인 세포는 표적이 아니었고 온전하게 유지되었다.
[0278] 이러한 데이터는 항암 약물로서 Phor18-LHRH(338613)의 높은 특이성 및 효능을 보여주었다. Phor18-LHRH(338613)는 몇 분 이내에 효과적이었고, 효능을 위해 세포 내 흡수 및 대사 경로 및 증식 기계와의 간섭을 필요로 하는 표준 화학 요법에 비해 큰 이점을 가졌다. 또한, Phor18-LHRH(338613)는 다중-약물 내성 암 세포에 작용할 수 있었다.
실시예 8
[0279] 이 실시예는 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH (338613))가 이종이식 모델에서 암에 대해 효과적이었음을 입증하는 연구를 포함한다.
[0280] 생체 내 효능 연구는 인간 흑색종 이종이식편: MDA-MB-435S.luc(s.c.), 인간 유방암 이종이식편 MCF-7(에스트로겐 수용체 알파 양성), 인간 난소암 이종이식편: OVCAR-3, (s.c.), 인간 전립선암 이종이식편: PC-3(안드로겐 수용체 음성)을 갖는 누드 마우스에서 단일 요법, 또는 표준 치료법과의 조합 요법으로서 수행되었다. 염수(0.02, 0.2 및 2 mg/kg)에 용해된 Phor18-LHRH(338613)를 측면 꼬리 정맥에 단일 볼루스 주사로서 3주 동안 주 1회 또는 2회 주사하였다.
[0281] MCF-7 유방암 이종이식 모델에서 Phor18-LHRH(338613) 조합 요법을 수행하였다.
[0282] 마지막 주사 1주일 후에 마우스를 희생시키고 화학 패널을 위해 혈액을 수집하고, 종양 중량 및 체중을 기록하였다. 종양의 일부를 조직학적 평가를 위해 PBS 완충된 10% 포르말린에 고정시켰다. 다양한 생체 내 이종이식 연구가 표 5에 요약되어 있다.
표 5: 이종이식 연구
Figure pct00007
[0283] 단일 용량 요법에서 MDA-MB-435S 이종이식편 중량을 감소시키는데 필요한 최소 유효 용량을 결정하기 위해, 5주령의 무작위교배계 주 Nu/Nu 암컷 마우스(Charles River)에 MDA-MB-435S(계대 # 249)/Matrigel 현탁액(2.4x106개 세포/마우스)[Leuschner 2006]을 어깨사이 부위에 주사하였다(s.c.). Phor18-LHRH(338613)(ID: 338613 lot# P080401)(0.00002, 0.0002, 0.002, 0.02, 0.2 및 1 mg/kg) 및 컨쥬게이션되지 않은 Phor18 = CLIP71(APC 338983, Lot # W08033C1) + LHRH(0.2/0.122 mg/kg, ([D-Trp6]-LHRH; Sigma L9761, lot # 037K1103)를 투여 전에 USP 염수에서 재구성하였다. 용량은 3주 동안 주당 1회 측면 꼬리 정맥을 통해 단일 볼루스 정맥 내 주사로서 제공되었다.
[0284] 각 그룹은 16마리의 마우스로 구성되었으며, 3주 동안 주 1회 주사되었다. 기준선으로 제공하기 위해 치료 시작시에 16마리의 마우스 그룹을 희생시켰다. 염수 주사는 대조군으로 사용되었다. 전체 연구 동안 종양 부피는 매주 2회 기록되었다.
[0285] 치료는 종양이 확립되었을 때 종양 세포 주사 후 16일에 시작되었고 23일 및 30일에 계속되었다. 나머지 모든 마우스는 종양 세포 주사 후 37일에 부검되었다.
[0286] 치료 반응은 염수 대조군 및 표적화되지 않은 CLIP71 치료와 비교하여 부검시 종양 중량 및 종양 중량 변화에 의해 결정되었다. 원발성 종양을 수집하고, 칭량하고, 10% PBS 완충된 포르말린을 사용한 포르말린 고정에서 조직학적 평가를 위해 준비하였다. GraphPad Prizm 4에서 데이터 세트의 통계적 평가를 수행하고 Wilcoxon 부호-순위 테스트에 의해 유의성을 계산하였다.
[0287] 염수 대조군 및 CLIP71 + LHRH로 치료된 마우스에서 종양 부피 및 종양 중량이 증가하였다. 종양 부피 및 종양 중량은 0.0002 mg/kg Phor18-LHRH(338613)로 치료된 마우스에서 염수 대조군과 비교하여 유의하게 감소하였다. 0.002 mg/kg만큼 낮은 용량의 Phor18-LHRH(338613)를 사용한 치료는 기준선에 비해 종양 부피 및 종양 중량을 유의하게 감소시켰다(p<0.0002).
[0288] 치료된 마우스로부터 헤마톡실린/에오신으로 염색된 MDA-MB-435S 이종이식된 마우스로부터의 종양 섹션의 조직학적 평가는 염수 대조군 및 CLIP71/LHRH로 치료된 마우스에서 생존 가능한 종양 세포를 보여준다. 대조적으로, 0.0002 mg/kg만큼 낮은 용량의 Phor18-LHRH(338613)로 치료된 마우스의 종양에서 유의한 괴사가 분명하였다. 표적화되지 않은 양이온성 용해 펩티드 CLIP71은 종양 중량을 감소시키거나 종양 조직을 파괴하지 않았다.
[0289] 0.002 mg/kg만큼 낮은 Phor18-LHRH(338613)는 MDA-MB-435S 이종이식편의 종양 중량을 감소시키는데 매우 효과적이었고 치료된 종양 조직에서 괴사를 초래하였다. 세포용해 펩티드를 사용한 표적화되지 않은 치료는 효과적이지 않다.
[0290] 다중 용량 요법에서 MDA-MB-435S 이종이식편 중량을 감소시키는데 필요한 최소 유효 용량을 결정하기 위해, 8주령의 무작위교배계 주 Nu/Nu 암컷 마우스(Charles River)에 전술한 바와 같이 MDA-MB-435S(계대 # 253)/Matrigel 현탁액(2x106개 세포/마우스)을 어깨사이 부위에 주사하였다(s.c.). Phor18-LHRH(338613)(ID: 338613 lot# P080401)(0.002 및 0.2 mg/kg)를 투여 전에 USP 염수에서 재구성하였다. 용량은 종양 세포 접종 후 15, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42일에 측면 꼬리 정맥을 통해 단일 볼루스 정맥 내 주사로서 제공되었다. 염수 주사는 대조군으로 사용되었다.
[0291] 각 치료 그룹은 16마리의 마우스로 구성되었다. 전체 연구 동안 종양 부피는 매주 2회 기록되었다. 종양 세포 주입 후 45일에 최종 부검을 수행하였다. 대부분의 마우스에서 꼬리 정맥의 폐색으로 인해 주사를 다시 시작하였다. 연구 종점 체중에서, 종양 중량을 결정하고 인산염 완충된 10% 포르말린에 고정시켰다.
[0292] 다중 정맥 내 주사를 사용한 hor18-LHRH(338613)로의 치료는 두 용량 수준 모두에서 종양 퇴행을 초래하였다. 종양이 없는 마우스는 두 치료 그룹에서 0.002 mg/kg을 수용한 그룹에서 6/23 및 0.2 mg/kg에서 1/20으로 관찰되었다. 잔류 질량은 전형적으로 Matrigel로 구성되었다. 한 마리의 마우스는 0.2 mg/kg 그룹의 치료에 반응하지 않았다.
[0293] 꼬리의 괴사는 관찰되지 않았고, 꼬리의 붉어짐도 없었다. 체중은 전체 연구 기간 동안 치료에 의해 영향을 받지 않았다.
[0294] 치료된 마우스의 생존율은 100%였다. 대조적으로, 염수 대조군의 8마리 마우스는 종양 부피가 2,500 mm3를 초과하기 때문에 종양 세포 주사 후 30일에 희생되었다(연구 종점 이전).
[0295] 다중 주사 요법에서 0.002 및 0.2 mg/kg Phor18-LHRH(338613)로 치료된 마우스로부터의 H&E 염색된 종양의 조직학적 검사는 치료된 마우스에서 종양 세포의 근절을 보여주었다. 대조적으로, 생존 가능한 종양 세포가 염수 대조군 마우스에 존재하였다.
[0296] Phor18-LHRH(338613)는 종양 중량을 상당히 파괴하고 감소시켰으며 치료된 마우스의 수명을 연장시켰다. 치료는 체중 또는 장기 검사에 어떠한 가시적인 영향도 미치지 않았다.
실시예 9
[0297] 이 실시예는 유방암, 난소암 및 전립선암 이종이식 모델에서 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH (338613)) 효능 연구의 설명을 포함한다.
[0298] 본원에 기재된 시험관 내 연구는 Phor18-LHRH(338613)가 접촉 후 몇 분 내에 암 세포를 사멸시키는 속효성 제제임을 입증하였다. 표적화된 치료의 초기 단계에서 흑색종 이종이식편에 대한 Phor18-LHRH(338613)의 효능을 결정하기 위해, Phor18-LHRH(338613)의 단일 주사 후 흑색종 이종이식 모델에서 Phor18-LHRH(338613)를 통한 세포 파괴의 동역학을 연구하였다.
[0299] 간단히 말해서, 5주령의 무작위교배계 주 Nu/Nu 암컷 마우스(Charles River)에 실시예 10에 기재된 바와 같이 MDA-MB-435S(계대 # 249)/Matrigel 현탁액(2.4x106개 세포/마우스)을 어깨사이 부위에 주사하였다(s.c.). Phor18-LHRH(338613)(ID: 338613 lot# P080401)(0.2 및 2 mg/kg)를 투여 전에 USP 염수에서 재구성하였다. 용량은 측면 꼬리 정맥을 통해 단일 볼루스 정맥 내 주사로서 제공되었다.
[0300] Phor18-LHRH(338613) 또는 염수로 치료한 후 1, 2 및 16시간에 마우스를 희생시켰다. 연구 종점 체중에서, 종양 중량을 결정하고, 종양을 인산염 완충된 10% 포르말린에 고정시켰다.
[0301] 종양으로부터 H&E 염색된 섹션으로부터의 조직학적 평가는 염수 치료된 마우스에서 다중 유사분열 수치를 갖는 생존 가능한 종양 세포를 보여주었다. 0.2 및 2 mg/kg 용량의 Phor18-LHRH(338613)를 사용한 치료 모두는 주사 후 1시간만큼 빠르게 MDA-MB-435S 이종이식편으로부터 종양의 파괴를 나타내었다.
[0302] Phor18-LHRH(338613)는 투여 후 1시간 이내에 종양을 파괴하였으며, 이는 괴사를 통해 세포 사멸을 일으키는 빠른 작용 메커니즘을 시사한다. 이러한 데이터는 Phor18-LHRH(338613)가 LHRH 수용체 제시 종양 세포에 대한 막 접촉을 통해 작용한다는 것을 확인시켜 준다.
[0303] 인간 질병과 유사한 난소암 이종이식편에 대한 Phor18-LHRH(338613)의 효능을 결정하기 위해, 단일 및 다중 용량 연구가 수행되었다. 기능적 LHRH 수용체를 제시하는 OVCAR-3 인간 난소암 세포주의 이종이식 모델을 이 연구에서 사용하였다. OVCAR-3은 느리게 성장하는 이종이식 모델을 나타내며 종양 마커(암 항원 125 또는 CA125)를 분비한다. 이의 분비는 치료 반응으로 사용될 수 있으며 약물 활성의 척도이다.
[0304] 이 이종이식 연구의 목적은 난소암 모델에서 Phor18-LHRH(338613)를 시험하여, Phor18-LHRH(338613)가 단일 주당 주사로서 다중-약물 내성, 느리게 성장하는 종양 모델에서 생체 내 효과적인지 여부를 결정하는 것이었다. 간단히 말해서, 5주령의 무작위교배계 주 Nu/Nu 암컷 마우스(Harlan-Sprague Dawley)에 NIH:OVCAR-3 세포/Matrigel 현탁액(4.6x106개 세포/마우스)을 피하 주사하였다. 치료는 종양이 확립되었을 때 종양 세포 주사 후 33일에 시작되었고 41일 및 47일에 계속되었다. 3회 매주 주사에 대한 용량은 0.02, 0.2 및 2 mg/kg 체중이었고, 33일, 41일 및 47일에 3주 동안 주 1회 측면 꼬리 정맥을 통해 투여되는 단일 볼루스 정맥 내 주사로 제공되었다. 부검은 52일에 수행되었다. 데이터는 평균±SD로 제시된다. 화살표는 투여를 보여준다.
[0305] 치료 그룹은 염수 대조군(N=10), Phor18-LHRH(338613)(338613, V09108X1)(0.02(N=10), 0.2(N=10), 및 2 mg/kg(N=9)), 및 컨쥬게이션되지 않은 Phor18=CLIP71(APC 338983, Lot # V04004X1)(2 mg/kg (N=10)), 염수 중 시스플라틴/CP(Calbiochem, Cat 232120, D0005495)(10 mg/kg, 3qd(N=10)), 기준선(N=9)을 포함하였다.
[0306] 9마리의 종양 보유 마우스의 그룹을 33일에 희생시키고 기준선 그룹으로 제공하였다. 모든 마우스는 종양 세포 주사 후 51-52일에 부검되었다. 연구 동안 종양 부피 및 체중을 매주 2회 기록하고, 마우스의 전체 수의적 검사를 수행하였다.
[0307] 원발성 종양, 간, 신장, 췌장, 심장, 폐 및 비장을 수집하고, 포르말린에 고정하고 조직학적 평가를 위해 준비하였다. 종양 중량은 부검시에 측정되었고, 종양의 일부는 LH/CG 및 LHRH 수용체 검정 결정을 위해 -80℃에서 동결되었다.
[0308] 약물 활성에 대한 바이오마커로서, CA125는 난소암 항원 CA125의 정량적 결정을 위해 Enzyme Linked Immunoassay를 사용하여 부검시 각각의 개별 마우스로부터 수집된 혈청에서 결정되었다(Assay kit Genway, Biotech, Inc. San Diego, CA, Catalog # 40-052-115009, # BC-1013, 제조업체에 따름).
[0309] LHRH 수용체 수준은 포르말린 고정된 종양으로부터 평가되었다. 정량적 면역퍼옥시다제 이미지 분석은 인터랙티브 현미경(Axio Imager)에 기능적으로 연결된 Ventana Image Analysis System(VIAS) 부속 컴퓨터 보조 이미지 분석 시스템으로 수행되었다. 정량 분석은 형태 및 비색 분석을 포함하는 Her2/neu 수용체의 정량화를 위한 프로그램으로 수행되었다. 수용체 상태 결과는 다음 기준에 따라 LHRH 수용체의 양성 염색을 나타내는 세포의 백분율로 보고되었다: 0 비-면역활성, 1+: 1-25% 양성, 2+: 26-50% 양성, 3+: 51-75% 양성 세포.
[0310] 모든 마우스 그룹은 주사를 잘 견뎠다. 2 mg/kg 용량의 Phor18-LHRH(338613)를 처음 주사하는 동안 한 마리의 마우스가 사망하였다. 사망은 급성 사건이었고 절차적이며 치료와 관련이 없었다. 다른 치료 그룹의 모든 마우스는 생존하였다. 주사 후 10분 이후에 주사의 결과로 죽은 마우스는 없었다.
[0311] Phor18-LHRH(338613)로 치료하는 동안 종양 부피가 감소하였다. 대조적으로, CLIP71, 시스플라틴 또는 염수 대조군으로 치료된 마우스의 경우, 종양 성장이 관찰되었다. 종양 세포 주사 후 42일 후에 기록된 종양 부피는 0.2 mg/kg 체중만큼 낮은 Phor18-LHRH(338613)의 농도에서 기준선과 비교하여 감소(p<0.001)를 나타내었다.
[0312] 부검시 종양의 특성(중앙 종양 중량 및 기준선과 비교하여 중앙 종양 중량의 변화)을 결정하였다. 염수 대조군 및 컨쥬게이션되지 않은 Phor18=CLIP71(p<0.05)과 비교하여 감소된 종양은 Phor18-LHRH(338613)의 2 및 0.2 mg/kg 투여량에 대한 그룹에서 수득되었다. 종양이 없는 마우스는 Phor18-LHRH(338613)의 0.2 및 2 mg/kg 그룹에서 발견되었다. 치료 시작과 비교하여 종양 퇴행으로 측정된 치료 반응은 0.2 mg/kg의 Phor18-LHRH(338613)로 치료된 마우스에서 가장 컸다(p<0.03 vs 기준선). 시스플라틴 및 컨쥬게이션되지 않은 Phor18=CLIP 71은 종양 중량 감소에 효과적이지 않았다.
[0313] 염수 대조군, CLIP71 및 시스플라틴 치료된 마우스는 꾸준한 종양 성장을 나타내었다. CA125에 대한 혈청 수준은 종양 중량에 해당한다(r2 = 0.66). CA125 분비는 Phor18-LHRH(338613) 치료된 마우스에서 감소되었고, 염수 대조군과 비교하여 0.2 및 2 mg/kg의 Phor18-LHRH(338613)로 치료된 마우스에서 가장 컸다(p<0.0002).
[0314] 0.02 mg/kg Phor18-LHRH(338613)로 치료한 후 OVCAR-3 이종이식편 보유 마우스로부터 절제된 종양의 크기는 염수 대조군과 비교하여 감소되고 괴사되었다. 치료된 종양은 1-2 점수 포인트만큼 LHRH 수용체 수준의 감소를 나타내었다. 헤마톡실린/에오신으로 염색된 종양 섹션은 0.02 mg/kg Phor18-LHRH(338613)로 치료된 그룹에서 유의한 괴사를 보였다. 시스플라틴 또는 CLIP71로 치료된 이종이식편 보유 마우스는 종양 부피, LHRH 수용체 수준의 감소가 없으며 조직학적 평가 후 생존 가능한 종양 세포를 나타내었다.
[0315] Phor18-LHRH(338613)로의 치료는 난소 이종이식 모델에서 종양 퇴행, 혈장에서 CA125 종양 마커의 감소, LHRH 수용체 수준의 감소 및 괴사를 유발하였다. 따라서 Phor18-LHRH(338613)는 다중-약물 내성 난소암 이종이식편을 파괴하는데 효과적이다.
[0316] 전립선암 이종이식편에 대한 Phor18-LHRH(338613)의 효능을 결정하기 위해, 빠르게 공격적으로 성장하는 이종이식 모델에서 생체 내 Phor18-LHRH(338613)의 효과를 연구하였다. 치료되지 않은 PC-3 이종이식편은 마우스에서 상당한 체중 감소를 유발한다.
[0317] 간단히 말해서, 6주령의 무작위교배계 주 Nu/Nu 수컷 마우스(Charles River)에 PC-3 세포/Matrigel 현탁액(1x106개 세포/마우스)을 피하 주사하였다. 치료는 종양이 확립되었을 때 종양 세포 주사 후 15일에 시작되었고 22일 및 29일에 계속되었다. 3회 매주 주사에 대한 용량은 2, 0.2 및 0.02 mg/kg 체중이었고, 이는 측면 꼬리 정맥을 통한 볼루스 단일 정맥 내 주사로 제공되었다. 치료 그룹은 염수 대조군(N=12), Phor18-LHRH(338613)(APC 338613 Lot # V09108X1)(0.002(N=12), 0.02(N=12), 0.2(N=12) 및 2 mg/kg(N=12)), 및 컨쥬게이션되지 않은 Phor18 = CLIP71(338983, Lot # V04004X1)(5 mg/kg(N=12), 기준선(N=12)을 포함하였다.
[0318] 12마리의 종양 보유 마우스의 그룹을 15일에 희생시키고 기준선 그룹으로 제공하였다. 모든 마우스는 종양 세포 주사 후 35일 및 36일에 부검되었다. 연구 동안 종양 부피 및 체중을 매주 2회 기록하고, 마우스의 전체 수의적 검사를 수행하였다.
[0319] 원발성 종양, 간, 신장, 췌장, 심장, 폐 및 비장을 수집하고, 포르말린에 고정하고 조직학적 평가를 위해 준비하였다. 종양 중량은 부검시에 측정되었고, 종양의 일부는 LH/CG 및 LHRH 수용체 검정을 위해 -80℃에서 동결되었다.
[0320] 모든 그룹은 주사를 잘 견뎠고 처리 그룹의 모든 마우스는 생존하였다. 주사의 결과로 죽은 마우스는 없었다.
[0321] 0.002, 0.02, 0.2 및 2 mg/kg의 용량의 PHor18-LHRH(338613)로 치료하는 동안 종양 부피가 감소하였다. CLIP71 또는 염수 대조군으로 치료된 마우스의 경우, 종양 성장이 관찰되었다. 종양 세포 주사 후 22일 후에 기록된 종양 부피는 0.002 mg/kg 체중만큼 낮은 농도의 Phor18-LHRH(338613)에서 염수 대조군 및 CLIP71과 비교하여 감소(p<0.001)를 나타내었다. 종양 중량은 염수 대조군 및 CLIP71 치료 그룹에 비해 유의하게 감소하였다(모든 Phor18-LHRH(338613) 치료 그룹에서 0.001).
[0322] PC-3 이종이식편은 누드 마우스에서 체중 감소를 일으키는 것으로 알려져 있다. Phor18-LHRH(338613) 치료된 마우스에서, 종양 부피는 염수 대조군 및 CLIP71 주사에 비해 0.002, 0.02, 0.2 및 2 mg/kg Phor18-LHRH(338613)로 치료된 그룹에서 감소하였다. 부검시 중앙 종양 중량은 염수 대조군 및 CLIP71과 비교하여 유의하게 감소하였다(p<0.001). 대조군의 마우스는 악액질이었고 치료된 마우스와 비교하여 10 g 초과의 체중 감소를 겪었다.
[0323] Phor18-LHRH(338613)는 PC-3 이종이식편에서 종양 성장을 억제하고 종양 부담으로 인한 심각한 체중 감소를 예방하는데 효과적이다. 컨쥬게이션되지 않은 Phor18-LHRH(338613)는 효과적이지 않다.
[0324] 요약하면, 상기 연구는 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG(Phor18-LHRH(338613))가 유방암, 난소암 및 전립선암 이종이식편을 파괴하는데 생체 내에서 효과적이라는 것을 나타낸다. Phor18-LHRH(338613)는 치료된 마우스에서 종양 괴사를 야기하고, 괴사는 주사 후 1시간 이내에 분명하게 나타난다. Phor18-LHRH(338613)는 괴사를 유도하고 종양 중량을 감소시키는 단일 매주 치료 요법으로서 효과적이다. 다수의 매주 요법으로서, 종양의 근절은 잔존 종양 세포의 파괴를 포함하여 더욱 분명하게 나타난다. Phor18-LHRH(338613)는 표적 세포 파괴와 일관되게, 치료 후 LHRH 수용체 수준을 감소시킨다.
실시예 9
[0325] 면역 체크포인트 억제제가 여러 암의 치료에 진보를 가져 왔지만, 이러한 요법은 난소암에서 제한된 효능을 가졌다. 황체 형성 방출 호르몬 수용체(LHRH-R)를 표적화하는 합성 용해 펩티드, EP-100이 난소 및 유방암 모델에서 면역 요법에 미치는 영향을 체크포인트 억제제의 존재 또는 부재하에 분석하였다. 결과는 부분적으로 도 14-21에 예시되어 있다.
물질 및 방법
[0326] 세포주 - 인증된 세포주를 공급하는 MD Anderson Characterized Cell Line Core Facility의 뮤린 난소암 세포주 ID8, IG10, IF5, 2C12 및 뮤린 유방암 세포주 EMT-6.
[0327] 사이토카인 어레이 - 배치 분석을 위해 배양된 세포로부터의 상청액을 -20℃에서 저장하여 사이토카인을 측정하였다. 마우스 사이토카인 어레이(R & D Systems, Inc.)를 구입하여 실험 그룹에서 111개의 사이토카인 분비를 검출하는데 사용하였다. 이러한 Proteome Profiler 어레이는 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었다.
[0328] 난소암 동소성 동계 마우스 모델 - 8-12주령 암컷 C57BL/6 마우스를 Taconic Farms에서 구입하였고, ID8 또는 IG10 세포를 마우스 당 2x106개 세포/0.2 mL의 농도로 C57BL/6의 복강 내 주사하였다. 모든 마우스 연구는 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았으며 American Association for Accreditation of Laboratory Animals에서 정한 지침에 따라 관리되었다. 암 세포 주사 후, 마우스를 무작위로 4개의 치료 그룹으로 나누었다: 1) 치료되지 않은 대조군, 2) PD-L1 항체(주 2회 200 μg/kg 복강 내), 3) EP-100(주 2회 0.2 mg/kg 정맥 내) 및 4) PD-L1 항체 + EP-100. 치료는 암 세포를 복강 내 주사한지 10일 후에 시작되었다.
[0329] 면역 프로파일링 검정 - 비장 세포 및 종양으로부터의 단일 세포 현탁액의 면역표현형 분석을 유세포 분석에 의해 평가하였다. MDSC에 대해 염색할 Ab는 CD11b-APC(클론 M1/70; BD Biosciences), Ly6G-FITC(클론 1A8; BD Biosciences) 및 Ly6C-PE(클론 AL-21; BD Biosciences)였다. T-세포 활성화 마커의 경우, 세포를 CD4-PE-Cy7(클론 RM4-5; BD Biosciences), CD8-PE-Cy7(클론 53-6.7; BD Biosciences), CD62L-PE(클론 MEL-14; BD Biosciences) 및 CD44-FITC(클론 IM7; Biolegend)에 특이적인 Ab로 염색하였다. 세포를 얼음에서 30분 동안 인큐베이션하고, 세척하고, LSRII 유세포 분석기(BD Biosciences)에서 유세포 분석을 위해 1% 포르말린을 함유하는 인산염 완충된 염수(PBS)에 고정시켰다.
[0330] 결과는 (1) EP-100이 낮은 마이크로-몰 수준에서 LHRH-R-발현 암 세포를 빠르게 사멸시키고; (2) EP-100 치료가 IL-1α, IL-33, CCL20, VEGF 및 LDLR 수준 및 CD8+ T 세포 활성화를 상당히 증가시키고; (3) EP-100이 생체 내에서 유리한 종양 용해 환경을 유도하고; (4) 체크포인트 억제제와 조합된 EP-100이 생체 내 상승 효과를 가지며 증가된 종양 용해(CD8+ T, NK DC 및 Mφ) 및 감소된 면역 억제 집단(Treg, B 및 mMDC)을 입증하고; (5) EP-100-유도된 IL33이 CD8+ 세포 활성화에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.
뮤린 유방암 세포주 EMT-6에서 단일 제제 효능 Phor18-LHRH
[0331] 지수적으로 성장하는 뮤린 암 세포주(EMT-6; 삼중 음성 뮤린 유방암 세포주, 계대 5)를 Charles River, Wilmington MA에서 수득하고 10% 소 태아 혈청 및 2 mM 글루타민, 100 단위/mL 페니실린 G 소듐, 100 μg/mL 스트렙토마이신 설페이트, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 및 25 μg/mL 젠타마이신이 보충된 Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)의 냉동 스톡으로부터 증식시켰다. 세포 배양은 5% CO2 및 95% 공기의 분위기에서 37℃의 가습 인큐베이터에서 조직 배양 플라스크에서 유지되었다. 세포를 세포 해리 완충액을 사용하여 방출하고, 2,000개 세포/웰의 밀도로 불투명한 96 웰 플레이트에 시딩하고 24시간 동안 완전한 배양 배지에서 인큐베이션하였다.
[0332] 2개의 서로 다른 플레이트에서 4중으로(N=8) 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 1.85, 5.5, 16.6, 50 및 100 μM의 농도의 Phor18-LHRH(APC 338613, Lot # W01107C1) 또는 컨쥬게이션되지 않은 Phor18(APC 338983, SY09076C)을 첨가하여 치료를 개시하였다. 대조군은 각각 0 및 100% 세포 사멸에 대한 참조로서 USP 염수 또는 0.1% TritonX-100™으로 처리되었다. 4 및 8시간의 인큐베이션 후에 세포 생존력 검정(Promega, CellTiter Glo™, Promega # G7572, lot # 326282)에서 세포 생존력을 측정하였다. IC50 값으로서의 시험관 내 독성은 Windows 용 GraphPad Prism 버전 5.00, GraphPad Software, San Diego California USA를 사용하여 결정되었다.
[0333] 마우스 유암 세포주인 EMT-6은 낮은 마이크로몰 수준의 Phor18-LHRH에 민감하였고, 세포주에 대한 표적화된(Phor18-LHRH) 및 표적화되지 않은 용해 펩티드(Phor18) 노출의 분리에서 입증된 바와 같이 LHRH 수용체를 통해 특이적으로 표적화되었다(표 6). 마우스 유선 세포주인 EMT-6은 Phor18-LHRH에 대해 4 및 8시간 후에 5.8±0.2 및 5.7±0.1 μM의 IC50 값을 가졌다. Phor18은 4시간 후에 독성이 없었고, 8시간 후에 55.8±1.6 μM의 IC50 값에 도달하였다.
[0334] EMT-6 마우스 유선 세포주는 Phor18-LHRH에 민감하고 특히 낮은 마이크로몰 수준에서 사멸되었다. 이 세포주는 Phor18-LHRH 및 체크포인트 억제제의 조합에 대한 생체 내 연구에 적합한 것으로 결정되었다.
표 6: EMT-6 세포주에서 4 및 8시간 시점에 Phor18-LHRH 및 Phor18의 세포독성
Figure pct00008
뮤린 난소암 세포주에서 단일 제제 효능 Phor18-LHRH
[0335] 뮤린 난소암 세포주(ID8, IG10, IF5, 및 2C12)를 10% 소 태아 혈청을 갖는 RPMI 1640 배지에서 성장시켰다. 세포를 전형적으로 96 웰 플레이트에 시딩하고(웰 당 3000개 세포), 48시간의 인큐베이션 후에 배지를 교체하였다. 각각의 검정은 Phor18-LHRH(EP-100)의 0, 0.39, 0.78, 1.56, 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50, 및 100 마이크로몰 용량의 증가하는 농도에서 수행되었다. 동결건조된 형태로 제공되는 Phor18-LHRH를 염수에 용해시키고 세포에 첨가하였다. 인큐베이션 기간은 37℃에서 24시간이었다. 발광측정 검정(Promega, CellTiter-0Glo 2.0, G9243)을 사용하여 24시간 후에 세포 생존력을 평가하였다. 대조군은 각각 0% 및 100% 세포 사멸에 대한 참조로서 염수 또는 0.1% 트리톤을 함유하였다.
[0336] Windows 용 GraphPad Prism 버전 7.00(GraphPad Software, San Diego California)을 사용하여 데이터를 처리하고 분석하였다. 유의성에 대한 통계적 분석은 양측 스튜던트 T-테스트에 의해 결정되었다. 각 연구는 적어도 6 중 3을 달성하기 위해 수행되었다.
[0337] 시험관 내 활성은 Hill 방정식(Graph Pad Prizm 소프트웨어)을 사용하여 계산된 시험된 각 세포주, 시점 및 화합물에 대한 IC50 값으로 표현되었다.
[0338] 단일 제제 Phor18-LHRH 활성에 대한 결과는 표 7에 요약되어 있다. IC50 값으로 측정된 시험관 내 활성은 난소암 세포주에 대해 낮은 마이크로몰 범위에 있었다: ID8 세포주는 1.37, IG10 세포주는 1.03, 및 IF5 세포주는 1.01 μM의 IC50 값을 가졌다.
표 7: 뮤린 난소암 세포주에서 Phor18-LHRH의 시험관 내 활성
Figure pct00009
결론
[0339] 마우스 난소암 세포주는 Phor18-LHRH에 민감하고 특히 낮은 마이크로몰 수준에서 사멸되었다. 이들 세포주는 동계 모델에서 Phor18-LHRH 및 체크포인트 억제제의 조합에 적합한 것으로 결정되었다.
뮤린 난소암 세포에서 LHRH-R의 발현 및 EP-100(Phor18-LHRH)의 세포독성 효과
[0340] 암 세포에 대한 EP-100의 직접적인 효과를 확인하기 위해, 뮤린 난소암 세포주를 시험관 내 실험에 사용하였다. 세포주에서 EP-100의 절반-최대 억제 농도(IC50)는 치료 72시간 후 1.0 내지 1.3 μM의 범위였다(도 14A 및 14B). RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 사용한 뮤린 난소암 세포에서 LHRH-R의 발현 수준. 도 14C에 도시된 바와 같이, LHRH-R은 ID8, IG10, IF5, 2C12, 및 3B11 세포에서 고도로 발현되었다. 이전 연구는 LHRH-R이 주로 세포막에서 발현된다는 것을 시사했기 때문에, 세포 분획화 및 면역형광 분석이 수행되었다. 실제로, LHRH-R은 주로 암 세포의 막에서 발현되었다(도 14D 및 14E). 인간 SKOV3ip1 난소암 세포 및 무한증식 뮤린 3T3 섬유모세포를 음성 대조군으로 사용하였다.
EP-100(Phor18-LHRH)을 통한 LHRH-R 표적화의 특이성
[0341] 항-종양 EP-100 효능이 LHRH-R 발현에 특이적인지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자는 siRNA를 사용하여 LHRH-R을 침묵시켰다(도 15a). 도 15b 및 15c에 도시된 바와 같이, LHRH-R이 침묵된 세포는 EP-100으로의 처리 후 생존 가능한 반면, 비-특이적 siRNA로 처리된 대조군 세포는 사멸되었다. 또한, LHRH 리간드가 결여된 CLIP-71 또는 류프롤리드 아세테이트 단독에 의한 처리는 세포독성 효과를 갖지 않았다(도 15d 및 15e). 이러한 데이터는 뮤린 난소암 세포가 EP-100에 민감하고 특히 LHRH-R을 통해 낮은 마이크로몰 수준에서 사멸되었음을 입증한다.
[0342] 결론적으로, EP-100의 활성은 난소암 세포주 표면에서 LHRH 수용체의 발현에 의존적이고 매우 특이적이었다.
시험관 내 PD-L1 발현에 대한 EP-100(Phor18-LHRH)의 효과
[0343] 면역 활성화에서 EP-100의 잠재적인 역할을 결정하기 위해, 뮤린 난소암 세포에서 PD-L1 발현에 대한 효과를 EP-100의 존재하에 결정하였다. 도 16a 및 16b에 도시된 바와 같이, PD-L1 mRNA 및 단백질 수준은 모두 EP-100으로 처리한 후 ID8 및 IG10 세포에서 증가되었다. PD-L1 mRNA는 0.5 μM만큼 낮은 EP-100으로 4시간 동안 처리했을 때 증가하였고, PD-L1 단백질은 처리 6시간 후에 증가하였다.
[0344] 결론적으로, EP-100은 난소 종양 세포에서 PD-L1 수준을 증가시켰다.
EP-100(Phor18-LHRH) 및 체크포인트 억제제 αPD-L1 단독 및 조합의 생체 내 효능
[0345] 생체 내 연구는 면역적격 C57BL/6 마우스에서 동소성 ID8 뮤린 난소 암종 동계 모델에서의 종양 성장 억제(TGI)에 대한 시험 물품 Phor18-LHRH 단독 및 체크포인트 억제제 αPD-L1(마우스 모노클로날 항체 클론 10F.9G2, Bio X Cell, New Hampshire, USA)과 조합시의 효능을 평가하도록 설계되었다.
[0346] C57BL/6 암컷 마우스에 루시퍼라제 표지된 ID8(ID8-L) 뮤린 난소암 세포주(1x106개 세포)를 동소 주사하였다. 발광 이미징 시스템을 사용하여 마우스를 종양 흡수에 대해 모니터링하였다. 치료는 종양 세포 주사 후 7일에 시작되었고 9, 12, 16, 19, 22, 및 26일에 계속되었다(도 17a). 동결건조된 Phor18-LHRH 및 αPD-L1(BioXcell, 클론 10F.9G2)을 염수에 용해시켰다. 치료는 염수 대조군, Phor18-LHRH(0.2 mg/kg, 정맥 내 주사), αPD-L1 (200 μg/마우스, 복강 내 주사), 및 Phor18-LHRH 및 αPD-L1의 조합이었다. 각각의 치료 그룹 및 대조군은 10마리의 마우스로 구성되었다. 28일 부검시에, 복수 액을 제거하고 측정하고, 종양을 제거하고 칭량하였다.
[0347] 다음 방법으로 샘플을 처리하여 복수(N=3) 및 종양 조직(N=3)에 대해 면역 세포 프로파일링을 수행하고 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 분석하였다(표 8 참조). 세포를 얼음에서 30분 동안 인큐베이션하고, 세척하고, LSRII 유세포 분석기에서 유세포 분석을 위해 1% 포르말린을 함유하는 인산염 완충된 염수에 고정시켰다.
표 8: 면역 세포 집단 및 이들의 마커
Figure pct00010
[0348] Wilcoxon signed Rank 테스트 분석 및 ANOVA를 사용하여 치료 그룹 간의 유의성을 평가하였다.
체중
[0349] 모든 그룹의 마우스는 주사를 잘 견뎠다. 대조군 및 치료 그룹의 모든 마우스는 생존하였다. 3주의 치료 기간 동안 체중은 영향을 받지 않았다(도 17c).
종양 부피
[0350] 매주 생물발광 이미지는 대조군(연구 종료시 9.2 ± 1.2 x 104에서 180.5 ± 24.3 x 104), 단일 제제 항-PD-L1 항체 그룹(9.2 ± 1.2 x 104에서 118.7 ± 28.7 x 104) 및 더 낮은 속도로, 단일-제제 EP-100 그룹(9.2 ± 1.2 x 104에서 88.6 ± 21.5 x 104)에서 종양의 발광 계수의 꾸준한 증가를 보여주었다. 보고된 모든 값은 달리 표시되지 않는 한 평균±표준 편차(SD)이다. 조합된 EP-100 + 항-PD-L1 항체는 치료 시작 후 1주일인 14일까지 종양 성장을 지연시켰으며, 종양은 연구 종료시에 9.2 ± 1.2 x 104에서 30.7 ± 4.3 x 104(p<0.002)로 증가하였다.
종양 중량
[0351] 원발성 종양에 대한 Phor18-LHRH 및 α-PD-L1의 효과는 도 17d에 예시되어 있다. 부검시 종양 중량은 단일 제제 Phor18-LHRH(0.49±0.07 g, 평균±SEM, N=10, p<0.002) 또는 α-PD-L1(0.54±0.06 g, 평균±SEM, N=10, p<0.002)(도 17d) 및 Phor18-LHRH+α-PD-L1의 조합(0.29±0.03 g 평균±SEM, N=10)(p<0.0009 vs 대조군, p<0.02 vs 단일 제제)으로 치료된 그룹에서 대조군(평균±SEM, 1.06±0.08 g)에 비해 감소하였다. 종양 성장 억제는 Phor18-LHRH의 경우 60.1% 및 α-PD-L1 치료된 마우스의 경우 60.1%로 중간 정도의 효능을 보인 반면, 조합 그룹(Phor18-LHRH+α-PD-L1)은 86.9%의 종양 성장 억제(TGI)를 가지며 높은 정도의 효능을 보였다.
복수 부피
[0352] 연구 종점에서 각 마우스에 대해 복수 부피를 결정하였다. 비히클 대조군은 복수 부피가 12.26±0.6 ml 평균±SEM, N=10인 반면, 단일 제제 α-PD-L1은 더 낮은 복수 부피 10.2±0.6 ml(평균±SEM, N=10, p<0.01 vs 대조군)을 가졌고, 추가로 감소된 복수 부피는 Phor18-LHRH 치료된 동물에서 측정되었다(8.0±0.7 ml, 평균±SEM, N=10, p<0.004)(도 17e). 조합 치료는 5.6±0.4로 가장 낮은 복수 부피를 초래하였다(평균±SEM, N=10, p<0.0001 vs 대조군, p<0.0006 vs Phor18-LHRH 및 α-PD-L1). 복수 부피의 상대적인 감소는 α-PD-L1 치료 그룹에서 15%, 및 Phor18-LHRH 치료 그룹에서 35.5%였다. 가장 높은 감소는 조합 그룹에서 58.4%로 측정되었다.
[0353] 결론적으로, Phor18-LHRH는 단일 제제로서 종양 부피, 종양 중량 및 복수 부피를 감소시켰다. 종양 부피 감소, 종양 중량 및 복수 부피에 대한 가장 큰 효과는 생체 내 상승 효과를 나타내는 Phor18-LHRH 및 α-PD-L1의 조합에 의해서였다.
종양 및 복수의 면역 프로파일
[0354] 종양의 면역 프로파일은 FACS 분석을 사용하여 평가되었다(도 18). 값은 ANOVA(분산 분석)에 의해 평가된 유의성 값과 함께 평균±SEM으로 제공된다. 살아있는 세포의 CD45+ 세포 분획은 대조군 종양에서 8.16±1.3%였고 α-PD-L1(12.83±1.18%, p=0.75 vs 대조군), Phor18-LHRH(26.1±5.2%, p<0.03 vs 대조군)에서 증가하였는데 이는 조합 그룹(22.5±5.8, p=0.08 vs 대조군)과 다르지 않았다. 다음 하위집단은 CD45+ 세포의 %로 제공된다. CD8+ T 세포는 대조군의 2.6±0.4%에 비해 α-PD-L1(10.7±0.8%, p<0.003 vs 대조군), Phor18-LHRH(15.5±0.8%, p<0.0001 vs 대조군) 및 조합 그룹(14.7±1.7%, p<0.0002 vs 대조군; p<0.01 vs Phor18-LHRH)에서 유의하게 증가하였다. 조절 T 세포(Treg)는 대조군(1.14±0.09%)에서 가장 높았고 α-PD-L1(0.91±0.13%, p=0.41 vs 대조군), Phor18-LHRH(0.95±0.15%, p=0.53 vs 대조군)로 치료된 종양에서 감소하였고 조합 그룹(0.23±0.01%, p<0.0012 vs 대조군; p<0.005 vs Phor18-LHRH)에서 최대 감소를 나타내었다. 자연 살해(NK) 세포는 대조군 종양에서 3.76±0.13%였고, α-PD-L1 치료 그룹에서 8.16±0.31%(p=0.066 vs 대조군), Phor18-LHRH에서 10.67±1.4%(p<0.0075 vs 대조군)로 증가하였으며 조합 그룹에서 14.27±1.8%(p<0.005 vs 대조군)에 도달하였다. 대식세포는 대조군에서 1.6±0.05%였고, α-PD-L1(6.64±0.2%, p<0.001 vs 대조군), Phor18-LHRH(10.1±0.13%, p<0.0001 vs 대조군; p<0.01 vs α-PD-L1)로 치료된 종양에서 증가하였다. 조합 그룹은 11.36±1.2%로 Phor18-LHRH 그룹과 유사한 값을 가졌다(p<0.0001 vs 대조군). B 세포는 각각의 치료 그룹에서 유의성에 도달하지 못하며 감소하였고, 대조군(12.14±0.9%)에 비해 α-PD-L1(10.9±0.16%, p=0.87 vs 대조군), Phor18-LHRH(10.1±2.4%, p=0.61 vs 대조군)였고 조합 그룹(7.3±0.76%, p=0.09 vs 대조군)에 대해 가장 낮았다. 수지상 세포(DC)는 α-PD-L1(3.01±0.18%, p<0.009 vs 대조군)로 치료된 종양에서 대조군(1.88±0.03%)으로부터 증가한 반면, Phor18-LHRH 그룹(5.12±0.34%, p<0.0001 vs 대조군)에서 가장 높은 증가가 측정되었고, 이는 조합 그룹(5.43±0.4%, p<0.0001 vs 대조군)과 유사하였다. 단핵구 골수성 억제인자 세포(mMDSC)는 α-PD-L1(1.01±0.1%, p<0.015 vs 대조군), Phor18-LHRH(1.015±0.15%, p<0.022 vs 대조군)로 치료된 종양에서 대조군(1.5±0.006%)으로부터 감소하였고 조합 그룹(0.38±0.03%, p<0.0001 vs 대조군; p<0.002 vs α-PD-L1)에서 추가로 감소하였다. 조절 T 세포에 대한 CD8+ T 세포의 비율은 대조군(2.27±0.26)에서 가장 낮았고 α-PD-L1로 치료된 종양에서 11.01±2.2(p=0.26 vs 대조군)로 증가하였으며 Phor18-LHRH 그룹에서 15.5±2.5로 8배 증가(p<0.001 vs 대조군)에 도달한 반면, 가장 높은 비율은 30배만큼 증가한 조합 그룹에서 측정되었다(65.2±1.4, p<0.0009 vs 대조군).
[0355] 결론적으로, Phor18-LHRH는 CD8+ T 세포, 자연 살해 세포 및 수지상 세포를 단일 제제로서 활성화시켰다. 조절 T 세포는 Phor18-LHRH에 의해 낮아졌다. Phor18-LHRH와 항-PD-L1 체크포인트 억제제의 조합은 조절 T 세포를 추가로 감소시켰다. Phor18-LHRH는 유리한 종양 용해 환경을 생성하고 종양 용해의 억제와 관련된 면역 세포를 감소시켰다.
[0356] 복수의 면역 프로파일은 FACS 분석을 사용하여 평가되었다(도 18b). 값은 ANOVA(분산 분석)에 의해 평가된 유의성 값과 함께 평균±SEM으로 제공된다. 살아있는 세포의 CD45+ 세포 분획은 대조군에서 10.5±1.8%였고, α-PD-L1(13.4±2.7%, p=0.73 vs 대조군), Phor18-LHRH(15.6±2.1%, p=0.4 vs 대조군)에서 증가하였으며 이는 조합 그룹(18.2±3.1, p=0.13 vs 대조군)에서와 유사하였다. 다음 하위집단은 CD45+ 세포의 %로 제공된다. CD8+ T 세포는 대조군의 1.9±0.3% 및 α-PD-L1(2.8±0.3%, p=0.96 vs 대조군)으로 치료된 그룹에 비해 Phor18-LHRH(8.9±2.4%, p<0.05 vs 대조군) 및 조합 그룹(9.9±2.5%, p<0.02 vs 대조군)으로부터의 복수에서 유의하게 증가하였다. 조절 T 세포(Treg)는 대조군(0.76±0.08%)에서 가장 높았고 α-PD-L1(0.56±0.05%, p=0.12 vs 대조군), Phor18-LHRH(0.5±0.05%, p<0.04 vs 대조군)로 치료된 그룹으로부터의 복수에서 감소하였고 조합 그룹(0.2±0.05%, p<0.0005 vs 대조군; p<0.02 vs Phor18-LHRH)에서 최대 감소를 나타내었다. 자연 살해(NK) 세포는 대조군에서 10.3±0.8%였고, α-PD-L1 치료 그룹에서 12.6±0.9%(p=0.5 vs 대조군), Phor18-LHRH에서 10.2±0.08%(p=0.9 vs 대조군)로 증가하였으며 조합 그룹에서 14.8±2.3%(p=0.1 vs 대조군)에 도달하였다. 대식세포는 대조군에서 23.8±5.1%였고 α-PD-L1(16.8±0.8%,p=0.12 vs 대조군)로 치료된 그룹으로부터의 복수에서 감소하였으며, Phor18-LHRH(25.6±0.7%, p=0.93 vs 대조군)에서 대조군과 유사하였다. 조합 그룹은 18.11±0.5%로 α-PD-L1 그룹과 유사한 값을 가졌다(p=0.34 vs 대조군). B 세포는 각각의 치료 그룹에서 유의성에 도달하지 못하며 수치적으로 감소하였고, 대조군(9.8±1.8%)에 비해 α-PD-L1(3.3±0.2%, p<0.0028 vs 대조군), Phor18-LHRH(1.5±0.14%, p<0.0006 vs 대조군)였고 조합 그룹(2.1±12%, p=0.0009 vs 대조군)에 대해 유사하였다. 수지상 세포(DC)는 α-PD-L1(15.8±1.1%, p=0.13 vs 대조군)로 치료된 그룹, 및 Phor18-LHRH 그룹(15.1±0.2%, p<0.04 vs 대조군)의 복수에서 대조군(18.5±1.1%)으로부터 증가하였고, 조합 그룹(12.7±0.1%, p<0.003 vs 대조군)에 대해 더 낮았다. 단핵구 골수성 억제인자 세포(mMDSC)는 α-PD-L1(0.18±0.02%, p<0.003 vs 대조군), Phor18-LHRH(0.21±0.01%, p<0.0005 vs 대조군)로 치료된 종양에서 대조군(0.62±0.08%)으로부터 감소하였고 조합 그룹(0.19±0.01%, p<0.0003 vs 대조군)에서 추가로 감소하였다. 조절 T 세포에 대한 CD8+ T 세포의 비율은 대조군(2.6±0.6)에서 가장 낮았고 α-PD-L1로 치료된 그룹에서 5.07±0.8(p=0.9 vs 대조군)로 증가하였으며, Phor18-LHRH 그룹에서 17.32±4.1로 7배 증가(p<0.007 vs 대조군)에 도달한 반면 가장 높은 비율은 23배만큼 증가한 조합 그룹에서 측정되었다(60.8±25.7, p<0.03 vs 대조군; p<0.04 vs α-PD-L1).
[0357] 이러한 데이터는 Phor18-LHRH가 Treg, B, mMDSC 세포와 같은 면역 억제 세포를 억제하면서, CD8T 세포, NK 세포, 수지상 세포 대식세포의 증가에 의해 지시된 바와 같이 종양 용해에 유리한 환경을 촉진한다는 것을 나타낸다.
[0358] 요약하면, 동계 뮤린 난소암 모델(ID8)에서 Phor18-LHRH 및 체크포인트 억제제, α-PD-L1의 조합은 살아있는 종양 크기의 감소(Phor18-LHRH + α-PD-L1 (8.5배) > Phor18-LHRH (2.1배) > α-PD-L1 (1.5배)), 종양 중량의 감소(Phor18-LHRH + α-PD-L1 (5.3배) > α-PD-L1 = Phor18-LHRH (3배)) 및 복수의 감소(Phor18-LHRH + α-PD-L1 (2.2배) > Phor18-LHRH (1.5배))에서 단일 제제에 비해 더 효과적이었고 단일 제제 α-PD-L1의 경우 1.2배 감소로 변화가 거의 없었다. 이 효과는 이펙터 CD8+ T 세포, NK 세포, 수지상 세포(DC) 및 대식세포를 증가시키면서 Treg, B 및 마우스 MDC 세포와 같은 면역억제 집단을 감소시킴으로써 종양 용해에 대한 미세환경을 유리하게 변화시킨 Phor18-LHRH를 통한 면역 조절에 의해 유도되었다. 단일 제제 Phor18-LHRH는 CD8T/Treg 비율을 8배 증가시켰지만 실질적으로 더 큰 증가는 23-30배 증가를 초래한 α-PD-L1과 조합된 Phor18-LHRH으로 관찰되었다.
결론
[0359] 체크포인트 억제제 α-PD-L1과 조합된 EP-100(Phor18-LHRH)은 치료 반응을 개선하고, 억제 인자를 감소시키면서 종양 용해 인자를 증가시킴으로써 면역 체계를 조절하며, 난소암 환자에서 사용될 수 있다.
난소암에 대한 또 다른 뮤린 모델에서 EP-100(Phor18-LHRH) 및 체크포인트 억제제 αPD-L1 단독 및 조합의 생체 내 효능.
[0360] 이 생체 내 연구는 면역적격 C57BL/6 마우스에서 동소성 IG10 뮤린 난소 암종 동계 모델에서 종양 성장 억제(TGI)에 대한 Phor18-LHRH 단독 및 체크포인트 억제제 αPD-L1(10F.9G2)과 조합시의 효능을 평가하도록 설계되었다.
[0361] C57BL/6 암컷 마우스에 루시퍼라제 표지된 IG10 뮤린 난소암 세포주(1x106개 세포)를 동소 주사하였다. 발광 이미징 시스템을 사용하여 마우스를 종양 흡수에 대해 모니터링하였다. 치료는 종양 세포 주사 후 10일에 시작되었고 9, 12, 16, 19, 22, 및 26일에 계속되었다. 동결건조된 Phor18-LHRH 및 αPD-L1(BioXcell, 클론 10F.9G2)을 염수에 용해시켰다. 치료는 염수 대조군, Phor18-LHRH(0.2 mg/kg, 정맥 내 주사), αPD-L1 (200 μg/마우스, 복강 내 주사), 및 Phor18-LHRH 및 αPD-L1의 조합이었다. 각각의 치료 그룹 및 대조군은 10마리의 마우스로 구성되었다. 28일 부검시에, 복수 액을 제거하고 측정하고, 종양을 제거하고 칭량하였다.
[0362] Wilcoxon signed Rank 테스트 분석 및 ANOVA를 사용하여 치료 그룹 간의 유의성을 평가하였다.
체중
[0363] 모든 그룹의 마우스는 주사를 잘 견뎠다. 대조군 및 치료 그룹의 모든 마우스는 생존하였다. 3주의 치료 기간 동안 체중은 영향을 받지 않았다(데이터는 제시되지 않음).
종양 중량
[0364] 원발성 IG10 종양에 대한 Phor18-LHRH 및 α-PD-L1의 효과는 하기에 기술되어 있다. 부검시 종양 중량은 단일 제제 Phor18-LHRH(0.45±0.08 g, 평균±SEM, N=10, p<0.02) 또는 α-PD-L1(0.625±0.08 g, 평균±SEM, N=10, p<0.01) 및 조합 Phor18-LHRH+ α-PD-L1(0.26±0.1 g 평균±SEM, N=10(p<0.0001 vs 대조군, p= 0.07 vs Phor18-LHRH, p<0.03 vs PD-L1))으로 치료된 그룹에서 대조군(평균±SEM, 1.04±0.09 g)에 비해 감소하였다. 종양 성장 억제는 α-PD-L1에 대해 40%로 낮은 효능을 나타내었고, Phor18-LHRH 치료된 마우스에 대해 53.6%로 중간 효능을 보인 반면, 조합 그룹(Phor18-LHRH+α-PD-L1)은 75.4%의 종양 성장 억제를 가지며 높은 효능을 나타내었다.
복수 부피
[0365] 복수 부피는 난소암에서 질병의 중증도를 나타내는 지표이다. 연구 종점에서 각 마우스에 대해 복수 부피를 결정하였다. 비히클 대조군은 복수 부피가 9.06±1.3 ml(평균±SEM, N=10)인 반면, 단일 제제 α-PD-L1은 더 낮은 복수 부피 7.3±0.5 ml(평균±SEM, N=10, p= 0.3 vs 대조군)를 가졌고, 추가로 감소된 복수 부피는 Phor18-LHRH 치료된 동물에서 측정되었다(3.6±0.7 ml, 평균±SEM, N=10, p<0.006). 조합 치료는 3.4±0.5(평균±SEM, N=10, p<0.015 vs 대조군, p<0.015 vs α-PD-L1)로 Phor18-LHRH 치료 그룹과 유사한 부피의 복수를 초래하였다. 복수 부피의 상대적인 감소는 α-PD-L1 치료 그룹에서 18.8%였다. 가장 높은 감소는 Phor18-LHRH 치료된 그룹(60.2%) 및 조합 그룹에서 62.4%로 측정되었다.
[0366] 결론적으로, Phor18-LHRH는 단일 제제로서 종양 중량 및 복수 부피를 감소시켰다. 종양 중량 및 복수 부피에 대한 가장 큰 효과는 Phor18-LHRH 및 α-PD-L1의 조합이었으며, 이는 두 번째 뮤린 난소암 모델에서 확인된 생체 내 상승 효과를 나타낸다.
사이토카인 및 케모카인에 대한 EP-100(Phor18-LHRH)의 효과
[0367] 사이토카인 및 케모카인에 대한 EP-100의 효과는 ID8 난소암 세포에서 CD8+ T 세포 활성화에서 프로테옴 프로파일러 뮤린 사이토카인 어레이를 사용하여 분석되었다. 도 19a에 도시된 바와 같이, EP-100은 백혈병 억제 인자(LIF), CXCL10, IL1α, CCL20, VEGF, IL33, 및 LDL 수용체를 포함하는 다양한 분자의 분비를 증가시켰다. LIF 및 CXCL10 분비는 EP-100으로 4시간 동안 처리한 후 감소하였다. LDL 수용체 분비는 2시간 및 12시간에 EP-100에 의해 증가된 반면, IL1α, CCL20, VEGF, 및 IL33은 EP-100 처리 후에 분비되었다(도 19b). 사이토카인 중에서, IL33은 종양 성장을 억제하고 종양 미세환경을 변형시켰다. RT-PCR 및 ELISA를 사용하여 EP-100을 통한 IL33의 유도를 분석하였다. IL33 mRNA 발현은 EP-100 처리 30분 후에 증가하였고, 분비는 EP-100 처리 2시간 후에 증가하였고, 이 효과는 12시간 동안 지속되었다(도 19c 및 19d). 그러나, IL33을 표적화하는 siRNA를 사용한 IL33의 침묵은 ID8 및 IG10 세포에서 세포 아폽토시스 또는 생존력에 영향을 미치지 않았다. IL33 분비는 EP-100에 의해 증가되었지만, 시험관 내 항-PD-L1 항체에 의해 증가되지 않았다(도 19d). 종양 미세환경에서 IL33 역할을 결정하기 위해, 본 발명자는 시험관 내 T 세포 분화에 대한 IL33 효과를 시험하였다. 본 발명자는 마우스 신장으로부터 나이브 CD4+ T 세포를 분리하고, CD3 및 CD28, 및 마우스 IL-2 함유 배지에서 5일 동안 분화된 CD8+ T 세포로 추가로 배양하였다. LHRH-R mRNA 발현 및 EP-100-유도된 세포독성 효과는 ID8 세포에서보다 나이브 T 세포 및 CD8+ T 세포 둘 모두에서 더 낮았다(도 20A 및 20B). 본 발명자는 CD8+ T 세포의 비율이 대조군에서보다 EP-100-처리된 세포로부터의 조건 배지(CM)로 처리된 세포에서 유의하게 더 높음을 발견하였다(17.3 ± 1.1 vs. 12.3 ± 1.1, p = 0.04); 그러나, IL33-침묵된 ID8 세포로부터의 CM은 T 세포 활성화에 유의한 영향을 미치지 않았다(도 20C).
[0368] 결론적으로, EP-100은 종양 미세환경으로의 면역 세포 유인에 영향을 미치는 사이토카인 및 케모카인을 유도하였다. 사이토카인 IL33은 EP-100 인큐베이션 후에 현저하게 증가되었고 종양의 증가된 면역원성과 관련이 있다.
뮤린 유방암 모델에서 생체 내 효능 종양 성장 지연 연구
[0369] 생체 내 연구는 면역적격 BALB/c 마우스에서 EMT-6 뮤린 유선 암종 동계 모델에서 종양 성장 지연(TGD)에 대한 시험 물품 Phor18-LHRH 단독 및 체크포인트 억제제 항-CTLA-4 항체 9H10(항-CTLA-4)과의 조합시에 효능을 평가하도록 설계되었다.
[0370] 본 연구는 EMT-6 종양 세포(평균 부피: 61-85 mm3)가 이식된 암컷 BALB/c 마우스의 6개의 효능 그룹(n = 10) 및 3개의 샘플링 그룹(n = 5)으로 구성되었다. 달리 언급되지 않는 한, 투여는 연구의 1일(D)에 개시되었다. Phor18-LHRH는 총 8회 투여(q.o.d. x 8) 동안 격일로 1회 0.4 μg/동물 또는 10 μg/동물로 정맥 내(i.v.) 전달되었다; 이어서, D17에 시작하여, Phor18-LHRH를 20 μg/동물 또는 60 μg/동물로 종료시까지 q.o.d. 투여하였다(17일에 시작). 항-CTLA-4를 2일에 100 μg/동물 및 5 및 8일에 50 μg/동물로 i.p. 투여하였다.
[0371] 그룹 1 마우스는 대조군으로 작용하고 i.v. 염수(비히클), qod x 종료시까지 수용하였다. 그룹 2는 항-CTLA-4를 수용하였다. 그룹 3은 0.4 μg/동물 qod x 8에 이어서 종료시까지 20 μg/동물 qod로 Phor18-LHRH를 수용하였다(17일에 시작). 그룹 4는 10 μg/동물 q.o.d. x 8에 이어서 종료시까지 60 μg/동물 qod로 Phor18-LHRH를 수용하였다(17일에 시작). 그룹 5는 항-CTLA-4와 조합하여 0.4 μg/동물 q.o.d. x 8에 이어서 종료시까지 20 μg/동물 qod로 Phor18-LHRH를 수용하였다(17일에 시작). 그룹 6은 항-CTLA-4와 조합하여 10 μg/동물 qod x 8에 이어서 종료시까지 60 μg/동물 qod로 Phor18-LHRH를 수용하였다(17일에 시작).
[0372] 연구 종점은 2000 mm3의 종양 부피 또는 45일 중 먼저 도래한 것이다. 종양 부피 종점에 도달하면 개별 동물이 연구에서 나가는 D45까지 매주 2회 종양 측정을 수행하였다.
[0373] 효능은 종양 성장 지연(TGD), 치료된 마우스 대 대조군 마우스에서의 종점 도달 중앙 시간(TTE)의 증가, 및 로그랭크 분석을 사용한 생존 곡선의 비교로부터 결정되었다. 반응은 추가로 연구 생존자 수, 부분 회귀(PR) 및 완전 회귀(CR) 반응, 및 생존 차이의 로그랭크 유의성에 기초하여 평가되었다. 다양한 치료의 내성은 체중(BW) 측정 및 임상 증상 및 치료-관련(TR) 부작용에 대한 빈번한 관찰에 의해 평가되었다.
[0374] 각각 5마리의 동물로 구성된 4개의 샘플링 그룹이 이 연구에 포함되었다: 염수 대조군, 0.5 mg/kg 용량의 Phor18-LHRH 단독, Phor18-LHRH + 항-CTLA4. 이들 그룹의 동물을 17일에 희생시키고, 종양을 절제하고, 포르말린 고정시키고, 파라핀을 포매하여 종양의 조직학적 평가를 위한 H&E 염색된 섹션을 수득하였다. 분석을 위해 종양 샘플을 수집하고 병리학적 평가를 위해 헤마톡실린 & 에오신으로 염색하였다.
[0375] 대조군 1의 모든 10개의 종양은 16.5일의 중앙 TTE로 부피 종점에 도달하여, 45일 연구에서 최대 T-C가 28.5일(173% TGD)로 설정되었다. 대조군 TTE는 15.8 내지 17.9일의 범위이며 매우 민감한 검정을 생성한다. 항-CTLA-4 단일 요법은 적당하지만 유의한 58%의 TGD와 관련된 26.1일의 중앙 TTE를 생성하였다(P<0.001, 로그랭크). 0.4 μg 및 20 μg/동물의 Phor18-LHRH로의 치료는 유의하지 않은 6% TGD와 관련된 17.5일의 중앙 TTE를 발생시켰다. 10 μg 및 60 μg/동물의 Phor18-LHRH로의 치료는 유의하지 않은 5% TGD와 관련된 17.4일의 중앙 TTE를 발생시켰다. 0.4 μg 및 20 μg/동물의 Phor18-LHRH 및 항-CTLA-4의 조합 요법은 30.6일의 중앙 TTE 또는 85% TGD를 생성하였다. 조합 요법의 생존 연장은 대조군 및 Phor18-LHRH-치료된 동물 둘 모두와 비교할 때 유의하였으나(두 비교 모두에 대해 P<0.001, 로그랭크), 항-CTLA-4 단독으로 치료된 동물에 비해 유의하지 않았다.
[0376] 10 μg 및 60 μg/동물의 Phor18-LHRH 및 항-CTLA-4의 조합 요법은 27.5일의 중앙 TTE 또는 67% TGD를 생성하였다. 한 마리의 동물이 죽은 것으로 밝혀졌으며 이는 알 수 없는 원인(NTRu)으로 인한 것으로 확인되었다. D45에 무시할 수 있는 종양 부피를 갖는 한 마리의 동물이 있었다; 이 동물은 CR을 가졌고 종양이-없는-생존자(TFS)로 간주되었다. 조합 요법의 생존 연장은 대조군 및 Phor18-LHRH-치료된 동물 둘 모두와 비교할 때 유의하였으나(두 비교 모두에 대해 P<0.001, 로그랭크), 항-CTLA-4 단독으로 치료된 동물에 비해 유의하지 않았다.
[0377] 15일에, 10 μg 및 60 μg/동물의 Phor18-LHRH 및 항-CTLA-4의 조합은 항-CTLA4 단독(60.2%)에 비해 더 큰 종양 성장 억제(TGI 84.9%)를 나타내었다. 종양 부피는 15일에 조합 그룹(p = 0.02)에서 유의하게 더 낮았다(도 21).
[0378] 17일에 희생된 5마리 동물로부터의 종양의 조직학적 평가는 Phor18-LHRH의 존재가 염증성 면역 세포 침윤 및 괴사를 야기하였음을 보여주며, 이는 Phor18-LHRH가 항-CTLA4와 조합될 때 증가하여 광범위한 괴사 및 세포 침윤을 나타내었다.
[0379] 결론적으로, 항-CTLA4와 조합된 Phor18-LHRH는 단일 제제 치료와 비교하여 15일까지 상승적인 종양 성장 억제를 나타내었다. 조합 그룹에서 생존이 증가하였다. Phor18-LHRH 및 항-CTLA4로 치료된 마우스의 종양은 Phor18-LHRH 단독에 비해 상당한 면역 세포 침윤의 증가를 나타내었다. 이러한 결과는 체크포인트 억제제와 조합된 Phor18-LHRH가 면역 반응에 대해 종양 미세환경을 상당히 조절하였음을 나타낸다.

Claims (128)

  1. 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법으로서, 여기서 융합 작제물이 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 도메인이 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 28개의 아미노산 서열, 또는 K 잔기 중 하나 이상이 임의의 F 또는 L 잔기로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, A 또는 L 잔기로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, F 또는 L 잔기로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 25개의 아미노산 서열로 구성되고; 제2 도메인이 결합 모이어티를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 도메인이 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 아미노산 서열; 또는 K 잔기 중 하나 이상이 임의의 F 또는 L 잔기로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, A 또는 L 잔기로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, F 또는 L 잔기로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 결합 모이어티가 수용체, 리간드 또는 항원에 결합하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 수용체, 리간드 또는 항원이 세포 상에서 발현되는 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 리간드가 수용체 효능제 또는 길항제를 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 과다증식 세포인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 세포가 신생물, 종양, 암 또는 악성 세포인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 세포가 유방, 난소, 자궁, 자궁경부, 전립선, 고환, 부신, 뇌하수체 또는 자궁내막 세포인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 수용체, 리간드 또는 항원을 발현하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 호르몬 또는 호르몬 수용체를 발현하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 성 또는 생식샘 스테로이드 호르몬 또는 성 또는 생식샘 스테로이드 호르몬 수용체를 발현하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 I, 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 II, 칠성장어 III 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 황체 형성 호르몬 베타 사슬, 황체 형성 호르몬, 융모 생식샘 자극 호르몬, 융모 생식샘 자극 호르몬 베타 서브유닛, 멜라닌세포 자극 호르몬, 에스트라디올, 디에틸스틸베스트롤, 도파민, 소마토스타틴, 난포-자극 호르몬(FSH), 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 프로게스테론, 안드로겐, 표피 성장 인자(EGF), 성장 호르몬(GF), Her2/neu, 비타민 H, 폴레이트, 트랜스페린, 갑상샘 자극 호르몬(TSH), 엔도텔린, 봄베신, 성장 호르몬, 혈관활성 장 펩티드, 락토페린, 인테그린, 신경 성장 인자, CD-8, CD-33, CD19, CD20, CD40, ROR1, IGF-1, 암배아 항원(CEA), 알파-태아단백질(AFP), 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), CA 125(잔존 상피 난소암), 가용성 인터루킨-2(IL-2) 수용체, RAGE-1, 티로시나제, MAGE-1, MAGE-2, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, 당단백질(gp) 75, gp100, 베타-카테닌, PRAME, MUM-1, ZFP161, 유비퀴틴-1, HOX-B6, YB-1, 오스테오넥틴, ILF3, 엽산 또는 이의 유도체, 종양 괴사 인자(TNF) 패밀리 구성원, TNF-알파, TNF-베타(림포톡신, LT), TRAIL, Fas, LIGHT, 41BB, 형질전환 성장 인자 알파, 형질전환 성장 인자 베타, 인슐린, 세룰로플라스민, HIV-tat, RGD 서열 모티프를 포함하는 펩티드 또는 단백질, 단당류, 이당류, 올리고당류, 시알산, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 또는 아세틸뉴라민산, 또는 이들의 유사체에 결합하는 수용체를 발현하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH)에 결합하는 수용체를 발현하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 인테그린이 알파-5 베타 3 또는 알파-5 베타 1 인테그린으로부터 선택되는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 I, 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 II, 칠성장어 III 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 황체 형성 호르몬 베타 사슬, 황체 형성 호르몬, 융모 생식샘 자극 호르몬, 융모 생식샘 자극 호르몬 베타 서브유닛, 멜라닌세포 자극 호르몬, 에스트라디올, 디에틸스틸베스트롤, 도파민, 소마토스타틴, 난포-자극 호르몬(FSH), 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 프로게스테론, 안드로겐, 표피 성장 인자(EGF), 성장 호르몬(GF), Her2/neu, 비타민 H, 폴레이트, 트랜스페린, 갑상샘 자극 호르몬(TSH), 엔도텔린, 봄베신, 혈관활성 장 펩티드, 락토페린, 인테그린, 신경 성장 인자, CD-8, CD-33, CD19, CD20, CD40, ROR1, IGF-1, 암배아 항원(CEA), 알파-태아단백질(AFP), 전립선 특이적 항원(PSA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), CA 125(잔존 상피 난소암), 가용성 인터루킨-2(IL-2) 수용체, RAGE-1, 티로시나제, MAGE-1, MAGE-2, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, 당단백질(gp) 75, gp100, 베타-카테닌, PRAME, MUM-1, ZFP161, 유비퀼린-1, HOX-B6, YB-1, 오스테오넥틴, 또는 ILF3에 결합하는 수용체를 발현하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티가 리간드, 수용체 또는 항체를 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티가 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 핵산 또는 탄수화물을 포함하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티가 호르몬, 호르몬 유사체, 호르몬 수용체에 결합하는 호르몬 유사체, 호르몬의 단편, 호르몬 수용체, 또는 호르몬 또는 호르몬 수용체에 결합하는 제제인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티가 선형 또는 사이클릭 구조를 갖는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티가 호르몬 또는 호르몬 수용체에 결합하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 호르몬이 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 I, 생식샘 자극 호르몬-방출 호르몬 II, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 칠성장어 III 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 황체 형성 호르몬 베타 사슬, 황체 형성 호르몬, 융모 생식샘 자극 호르몬, 융모 생식샘 자극 호르몬 베타 서브유닛, 멜라닌세포 자극 호르몬, 에스트라디올, 디에틸스틸베스트롤, 도파민, 소마토스타틴, 난포-자극 호르몬(FSH), 글루코코르티코이드, 에스트로겐, 테스토스테론, 안드로스텐디온, 디하이드로테스토스테론, 데하이드로에피안드로스테론, 프로게스테론, 또는 안드로겐으로부터 선택되는 방법.
  22. 제18항에 있어서, 호르몬 유사체가 미페프리스톤(mifepristone), 플루타미드(flutamide), 루프론(lupron), 졸라덱스(zoladex), 수프렐린(supprelin), 시나텔 트립토렐린(synatel triptorelin), 부세렐린(buserelin), 세트로렐릭스(cetrorelix), 가니렐릭스(ganirelix), 아바렐릭스(abarelix), 안티데(antide), 테베렐릭스(teverelix) 및 데가렐릭스(degarelix)(Fe200486)로부터 선택되는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 수용체, 리간드 또는 항원을 발현하고, 펩티드의 결합 모이어티가 세포에 의해 발현된 수용체, 리간드 또는 항원에 결합하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 세포가 과다증식 세포인 방법.
  25. 과다증식성 장애를 치료하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 과다증식성 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    여기서 융합 작제물이 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 도메인이 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 28개의 아미노산 서열, 또는 K 잔기 중 하나 이상이 임의의 F 또는 L 잔기로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, A 또는 L 잔기로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, F 또는 L 잔기로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 25개의 아미노산 서열로 구성되고; 제2 도메인이 결합 모이어티를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 대상체가 신생물, 종양, 암 또는 악성종양을 갖고, 과다증식성 장애를 치료하기에 충분한 양이 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양인 방법.
  27. 다른 부위로의 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 전이, 또는 원발성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양으로부터 먼 다른 부위에서 전이성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 다른 부위로의 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 전이, 또는 원발성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양으로부터 먼 다른 부위에서 전이성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하는 방법으로서,
    여기서 융합 작제물이 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 도메인이 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 28개의 아미노산 서열, 또는 K 잔기 중 하나 이상이 임의의 F 또는 L 잔기로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, A 또는 L 잔기로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, F 또는 L 잔기로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 25개의 아미노산 서열로 구성되고; 제2 도메인이 결합 모이어티를 포함하는, 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 전이성, 비-전이성 또는 양성인 방법.
  29. 제26항 또는 제27항에 있어서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 고형 세포 덩어리를 포함하는 방법.
  30. 제26항 또는 제27항에 있어서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 조혈 세포를 포함하는 방법.
  31. 제26항 또는 제27항에 있어서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 샘종, 샘암종, 흑색종, 신경아교종, 아교모세포종, 수막종, 신경모세포종, 망막모세포종, 별아교세포종, 핍지세포종, 중피종, 그물내피, 림프 또는 조혈 신생물, 종양, 암 또는 약성종양을 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 육종이 림프육종, 지방육종, 골육종, 연골육종, 평활근육종, 횡문근육종 또는 섬유육종을 포함하는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 조혈 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 골수종, 림프종 또는 백혈병을 포함하는 방법.
  34. 제26항 또는 제27항에 있어서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 폐, 갑상선, 두경부, 비인두, 인후, 코 또는 부비동, 뇌, 척추, 유방, 부신, 뇌하수체, 갑상선, 림프, 위장관(입, 식도, 위, 십이지장, 회장, 공장(소장), 결장, 직장), 비뇨생식기(자궁, 난소, 자궁경부, 자궁내막, 방광, 고환, 음경, 전립선), 신장, 췌장, 간, 뼈, 골수, 림프, 혈액, 근육, 또는 피부 신생물, 안구 흑색종, 종양 또는 암을 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 폐 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 난소암 또는 흑색종을 포함하는 방법.
  36. 제26항 또는 제27항에 있어서, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양이 줄기 세포 신생물, 종양, 암 또는 악성종양을 포함하는 방법.
  37. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 방법이 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 재발 또는 진행을 억제하거나 감소시키는 방법.
  38. 제26항 또는 제27항에 있어서, 항-세포 증식, 항-신생물, 항-종양, 항암 또는 면역-향상 치료 또는 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 치료 또는 요법이 외과적 절제, 방사선 요법, 이온화 또는 화학적 방사선 요법, 화학 요법, 면역 요법, 국소 또는 지역 열(온열요법) 요법, 또는 백신 접종을 포함하는 방법.
  40. 제38항에 있어서, 치료 또는 요법이 알킬화제, 항-대사 산물, 식물 추출물, 식물 알칼로이드, 니트로소우레아, 호르몬, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  41. 제38항에 있어서, 치료 또는 요법이 사이클로포스파미드, 아자티오프린, 사이클로스포린 A, 프레드니솔론, 멜팔란, 클로람부실, 메클로레타민, 부술판, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 티오구아닌, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드, AZT, 5-아자시티딘(5-AZC) 및 5-아자시티딘 관련 화합물, 블레오마이신, 악티노마이신 D, 미트라마이신, 미토마이신 C, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙토조토신, 하이드록시우레아, 시스플라틴, 미토탄, 프로카르바진, 다카르바진, 탁솔, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 독소루비신, 디브로모만니톨 또는 PARP 억제제를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  42. 제38항에 있어서, 치료 또는 요법이 림프구, 형질 세포, 대식세포, 수지상 세포, NK 세포 또는 B-세포를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  43. 제38항에 있어서, 치료 또는 요법이 항체, 세포 성장 인자, 세포 생존 인자, 세포 분화 인자, 사이토카인 또는 케모카인을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  44. 제38항에 있어서, 치료 또는 요법이 IL-2, IL-1α, IL-1β, IL-3, IL-6, IL-7, 과립구-대식세포-콜로니 자극 인자(GMCSF), IFN-γ, IL-12, TNF-α, TNFβ, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, SDF-1, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, 에오탁신, 에오탁신-2, I-309/TCA3, ATAC, HCC-1, HCC-2, HCC-3, LARC/MIP-3α, PARC, TARC, CKβ, CKβ6, CKβ7, CKβ8, CKβ9, CKβ11, CKβ12, C10, IL-8, GROα, GROβ, ENA-78, GCP-2, PBP/CTAPIIIβ-TG/NAP-2, Mig, PBSF/SDF-1, 또는 림포탁틴을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  45. 제38항에 있어서, 융합 작제물이 항-세포 증식, 항-신생물, 항-종양, 항암 또는 면역-향상 치료 또는 요법의 투여 전에, 실질적으로 동시에 또는 투여 후에 투여되는 방법.
  46. 제25항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 외과적 절제, 화학 요법, 면역 요법, 이온화 또는 화학적 방사선 요법, 국소 또는 지역 열(온열요법) 요법, 또는 백신 접종을 받은 방법.
  47. 제25항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 외과적 절제, 화학 요법, 면역 요법, 이온화 또는 화학적 방사선 요법, 국소 또는 지역 열(온열요법) 요법, 또는 백신 접종을 위한 후보인 방법.
  48. 제25항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 외과적 절제, 화학 요법, 면역 요법, 이온화 또는 화학적 방사선 요법, 국소 또는 지역 열(온열요법) 요법, 또는 백신 접종을 위한 후보가 아닌 방법.
  49. 제25항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 신생물, 종양, 암 또는 악성 세포 질량, 부피, 크기 또는 세포 수의 부분적 또는 완전한 파괴, 신생물, 종양, 암 또는 악성 세포 괴사, 용해 또는 아폽토시스의 자극, 유도 또는 증가, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 부피 크기, 세포 질량의 감소, 신생물, 종양, 암 또는 악성종양 부피, 질량, 크기 또는 세포 수의 진행 또는 증가의 억제 또는 예방, 또는 수명 연장을 초래하는 방법.
  50. 제25항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 신생물, 종양, 암 또는 악성종양과 관련되거나 이에 의해 야기되는 부작용 또는 합병증의 중증도, 기간 또는 빈도를 감소시키거나 저하시키는 방법.
  51. 제25항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 통증, 불편함, 욕지기, 쇠약 또는 무기력을 감소시키거나 저하시키는 방법.
  52. 제25항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 증가된 에너지, 식욕, 개선된 움직임 또는 심리적 안녕을 초래하는 방법.
  53. 제25항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유 동물인 방법.
  54. 제25항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  55. 양성 전립선 비대증을 치료하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 양성 전립선 비대증을 감소시키거나 치료하는 방법으로서,
    여기서 융합 작제물이 제1 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 도메인이 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 28개의 아미노산 서열, 또는 K 잔기 중 하나 이상이 임의의 F 또는 L 잔기로 치환되거나, F 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, A 또는 L 잔기로 치환되거나, A 잔기 중 하나 이상이 임의의 K, F 또는 L 잔기로 치환된 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKF(SEQ. ID NO.2), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 및 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로부터 선택된 펩티드를 포함하는 12 내지 25개의 아미노산 서열로 구성되고; 제2 도메인이 결합 모이어티를 포함하는, 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 작제물이 더 낮은 IC50 값에 의해 확인되는 바와 같이, Phor21-βCG-ala, Phor21-GSGGS-βCG-ala, Phor21-ASAAS-βCG-ala, 또는 Phor14-βCG-ala보다 더 큰 항-세포 증식 활성을 갖는 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 작제물이 Phor21-βCG-ala, Phor21-GSGGS-βCG-ala, Phor21-ASAAS-βCG-ala, 또는 Phor14-βCG-ala보다 더 작은 IC50/(HA50, 용혈 활성) 비율을 갖는 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 작제물이 약 0.02, 0.01, 또는 0.005 미만의 IC50/(HA50, 용혈 활성) 비율을 갖는 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 모이어티가 선형 또는 사이클릭 구조를 갖는 방법.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 도메인이 약 1 내지 10개, 10 내지 20개, 15 내지 20개, 20 내지 30개, 30 내지 40개, 40 내지 50개, 60 내지 70개, 70 내지 80개, 80 내지 90개, 90 내지 100개 이상의 아미노산의 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하는 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 도메인이 약 15 내지 약 20개 아미노산의 서열로 구성되는 방법.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 도메인이 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산을 갖는 서열로 구성되는 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 도메인이 SYAVALSAQAALARR로 제시된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하는 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 도메인이 QHWSYGLRPG로 제시된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하는 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 도메인이 제2 도메인에 대해 NH2-말단에 위치하는 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 도메인이 제1 도메인에 대해 NH2-말단에 위치하는 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 도메인 또는 제2 도메인이 하나 이상의 D-아미노산을 갖는 방법.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 도메인이 임의의 K, F 또는 A 잔기에 D-아미노산을 갖는 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 도메인이 양친매성 알파-나선을 형성하는 방법.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 도메인이 공유 결합에 의해 연결되는 방법.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 도메인이 펩티드 또는 비-펩티드 링커에 의해 연결되는 방법.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 도메인이 1 내지 25개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 서열, 또는 선형 탄소 사슬에 의해 연결되는 방법.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 도메인이 하나 이상의 A, S 또는 G 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 서열에 의해 연결되는 방법.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 도메인이 GSGGS, ASAAS, 또는 CCCCCC를 포함하거나 이로 구성된 펩티드 서열에 의해 연결되는 방법.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 제3, 제4, 제5, 제6 또는 제7 도메인을 추가로 포함하는 방법.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 작제물이 분리되거나 정제되는 방법.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 작제물이 혼합물을 포함하는 방법.
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 체크포인트 억제제가 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1), 프로그램된 세포 사멸 1(PD-1) 또는 CTLA-4의 억제제 또는 길항제인 방법.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-L1, PD-1 또는 CTLA-4에 결합하는 길항제 항체인 방법.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 체크포인트 억제제가 이필리무맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙, 세미플리맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 작제물이 체크포인트 억제제의 투여 전에, 실질적으로 동시에 또는 투여 후에 투여되는 방법.
  82. 세포의 증식을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포의 증식을 감소시키거나 억제하는 방법으로서,
    여기서 융합 작제물이 제1 용해 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 용해 도메인이 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 또는 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로 구성되고; 제2 도메인이 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), LHRH 단편, 또는 LHRH 유사체를 포함하는, 방법.
  83. 과다증식성 장애를 치료하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 과다증식성 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서,
    여기서 융합 작제물이 제1 용해 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 용해 도메인이 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 또는 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로 구성되고; 제2 도메인이 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), LHRH 단편, 또는 LHRH 유사체를 포함하는, 방법.
  84. 다른 부위로의 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 전이, 또는 원발성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양으로부터 먼 다른 부위에서 전이성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 다른 부위로의 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 전이, 또는 원발성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양으로부터 먼 다른 부위에서 전이성 신생물, 종양, 암 또는 악성종양의 형성 또는 확립을 감소시키거나 억제하는 방법으로서,
    여기서 융합 작제물이 제1 용해 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 용해 도메인이 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 또는 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로 구성되고; 제2 도메인이 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), LHRH 단편, 또는 LHRH 유사체를 포함하는, 방법.
  85. 양성 전립선 비대증을 치료하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 양성 전립선 비대증을 감소시키거나 치료하는 방법으로서,
    여기서 융합 작제물이 제1 용해 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 용해 도메인이 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 또는 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로 구성되고; 제2 도메인이 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), LHRH 단편, 또는 LHRH 유사체를 포함하는, 방법.
  86. 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 도메인이 QHWSYGLRPG(SEQ. ID NO.9)로 제시된 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하는 방법.
  87. 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용해 도메인이 제2 도메인에 대해 NH2-말단에 위치하는 방법.
  88. 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 도메인이 제1 용해 도메인에 대해 NH2-말단에 위치하는 방법.
  89. 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용해 도메인 또는 제2 도메인이 하나 이상의 D-아미노산을 갖는 방법.
  90. 제82항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용해 도메인이 임의의 K, F 또는 A 잔기에 D-아미노산을 갖는 방법.
  91. 제82항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용해 도메인이 양친매성 알파-나선을 형성하는 방법.
  92. 제82항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용해 및 제2 도메인이 공유 결합에 의해 연결되는 방법.
  93. 제82항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용해 및 제2 도메인이 펩티드 또는 비-펩티드 링커에 의해 연결되는 방법.
  94. 제82항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 링커가 1 내지 25개의 아미노산 잔기의 길이를 갖는 방법.
  95. 제82항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용해 및 제2 도메인이 하나 이상의 A, S 또는 G 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드 링커에 의해 연결되는 방법.
  96. 제82항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용해 및 제2 도메인이 GSGGS(SEQ. ID NO. 10) 또는 ASAAS(SEQ. ID NO.11)를 포함하거나 이로 구성된 펩티드 링커에 의해 연결되는 방법.
  97. 제82항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 작제물이 분리되거나 정제되는 방법.
  98. 제82항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 작제물이 더 낮은 IC50 값에 의해 확인되는 바와 같이 Phor21-βCG-ala, Phor21-(SEQ. ID NO.10)-βCG-ala, Phor21-(SEQ. ID NO.11)-βCG-ala, 또는 Phor14-βCG-ala보다 더 큰 항-세포 증식 활성을 갖는 방법.
  99. 제82항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 작제물이 Phor21-βCG-ala, Phor21-(SEQ. ID NO. 10)-βCG-ala, Phor21-(SEQ. ID NO.11)-βCG-ala, 또는 Phor14-βCG-ala보다 더 작은 IC50/HA50(용혈 활성) 비율을 갖는 방법.
  100. 제82항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 작제물이 약 0.02, 0.01, 또는 0.005 미만의 IC50/HA50(용혈 활성) 비율을 갖는 방법.
  101. 제82항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용해 도메인이 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1)로 구성된 방법.
  102. 제82항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용해 도메인이 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4)로 구성된 방법.
  103. 제82항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, LHRH 유사체가 루프론(류프롤리드)을 포함하는 방법.
  104. 제82항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, LHRH 유사체가 졸라덱스(고세렐린)를 포함하는 방법.
  105. 제82항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, LHRH 유사체가 수프렐린(히스트렐린)을 포함하는 방법.
  106. 제82항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, LHRH 유사체가 트립토렐린을 포함하는 방법.
  107. 제82항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, LHRH 유사체가 부세렐린을 포함하는 방법.
  108. 제80항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, LHRH 유사체가 세트로렐릭스를 포함하는 방법.
  109. 제82항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, LHRH 유사체가 가니렐릭스를 포함하는 방법.
  110. 제82항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, LHRH 유사체가 아바렐릭스를 포함하는 방법.
  111. 제82항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, LHRH 유사체가 안티데를 포함하는 방법.
  112. 제82항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, LHRH 유사체가 테베렐릭스를 포함하는 방법.
  113. 제82항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, LHRH 유사체가 데가렐릭스(Fe200486)를 포함하는 방법.
  114. 제82항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 비-펩티드 링커가 선형 탄소 사슬 링커를 포함하는 방법.
  115. 제82항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 비-펩티드 링커가 선형의 6개 탄소 사슬 링커를 포함하는 방법.
  116. 제82항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 또는 혼합물이 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 포함하는 방법.
  117. 제82항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 알킬화제, 항-대사 산물, 식물 추출물, 식물 알칼로이드, 니트로소우레아, 호르몬, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체를 투여하거나 세포와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  118. 제82항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 사이클로포스파미드, 아자티오프린, 사이클로스포린 A, 프레드니솔론, 멜팔란, 클로람부실, 메클로레타민, 부술판, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 티오구아닌, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드, AZT, 5-아자시티딘(5-AZC), 블레오마이신, 악티노마이신 D, 미트라마이신, 미토마이신 C, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙토조토신, 하이드록시우레아, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥시플라틴, 미토탄, 프로카르바진, 다카르바진, 탁솔(파클리탁셀), 빈블라스틴, 빈크리스틴, 독소루비신, 디브로모만니톨, 이리노테칸, 토포테칸, 에토포시드, 테니포시드, 젬시타빈, 페메트렉시드, 또는 PARP 억제제를 투여하거나 세포와 접촉시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  119. 제82항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 세포, 과다증식 장애 또는 암이 난소암, 유방암, 흑색종 또는 간세포 암종인 방법.
  120. 제82항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-L1, PD-1 또는 CTLA-4의 억제제 또는 길항제인 방법.
  121. 제82항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-L1, PD-1 또는 CTLA-4에 결합하는 길항제 항체인 방법.
  122. 제82항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 체크포인트 억제제가 이필리무맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙, 세미플리맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  123. 난소암 또는 유방암을 치료하기에 충분한 양의 융합 작제물 및 체크포인트 억제제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    여기서 융합 작제물이 제1 용해 도메인 및 제2 도메인을 포함하고, 여기서 제1 용해 도메인이 펩티드 KFAKFAKKFAKFAKK(SEQ. ID NO.1), KFAKFAKKFAKFAKKFA(SEQ. ID NO.3), KFAKFAKKFAKFAKKFAK(SEQ. ID NO.4), KFAKFAKKFAKFAKKFAKF(SEQ. ID NO.5) 또는 KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA(SEQ. ID NO.6)로 구성되고; 제2 도메인이 황체 형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), LHRH 단편, 또는 LHRH 유사체를 포함하고,
    여기서 체크포인트 억제제가 PD-L1, PD-1 또는 CTLA-4의 길항제를 포함하고, 여기서 암이 난소암, 유방암, 흑색종 및 간세포 암종으로부터 선택되는, 방법.
  124. 제123항에 있어서, 융합 작제물이 아미노산 서열 KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG를 포함하는 방법.
  125. 제123항 또는 제124항에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-L1에 결합하는 길항제 항체를 포함하는 방법.
  126. 제123항 또는 제124항에 있어서, 체크포인트 억제제가 CTLA-4에 결합하는 길항제 항체를 포함하는 방법.
  127. 제123항 또는 제124항에 있어서, 체크포인트 억제제가 PD-1에 결합하는 길항제 항체를 포함하는 방법.
  128. 제123항 또는 제124항에 있어서, 체크포인트 억제제가 이필리무맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙, 세미플리맙, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.


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