CN112225821A

CN112225821A - 一种具有抗肿瘤作用的多肽及其应用

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Publication number: CN112225821A
Application number: CN202011130905.2A
Authority: CN
Inventors: 王中山; 张梦
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Qinhuangdao Fuyingguan Technology Co ltd
Priority date: 2020-10-21
Filing date: 2020-10-21
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2040-10-21
Also published as: CN112225821B

Abstract

本发明公开了一种具有抗肿瘤作用的多肽及其应用，该多肽名称为TAT‑TβRIII‑1，为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽。本发明提供的多肽TAT‑TβRIII‑1来源于III型TGF‑β受体(TβRIII)羧基末端，TβRIII通过羧基末端与β‑arrestin2相互作用抑制肿瘤细胞迁移和侵袭，多种癌组织中TβRIII表达显著下调，而TAT‑TβRIII‑1能够代替TβRIII与β‑arrestin2发生相互作用，进而抑制肿瘤细胞迁移和侵袭。本发明的多肽TAT‑TβRIII‑1在癌症治疗中具有临床应用潜力。

Description

一种具有抗肿瘤作用的多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有抗肿瘤作用的多肽及其应用。

背景技术

膜蛋白受体家族蛋白是最常见的癌症治疗靶点，也成为研究癌症机制和临床治疗的重要途径。III型TGF-β受体(TβRIII)在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌等组织中表达显著降低，其低表达与病人的疾病进展、临床分期、较差预后等密切相关。

体外研究发现，增加或者恢复TβRIII的表达能够降低癌细胞的活动性和侵袭能力。同时将降低机体内癌细胞血管形成、侵袭和转移的能力。显然，TβRIII是癌细胞运动性的抑制蛋白。而干扰支架蛋白β-arrestin2的表达后，TβRIII抑制细胞迁移的能力受到显著抑制，癌细胞恢复迁移性，说明β-arrestin2是TβRIII抑制癌细胞迁移过程的重要参与者。

研究显示，TβRIII通过和β-arrestin2相互作用，进而激活Cdc42影响肌动蛋白细胞骨架，降低定向持久性，从而抑制癌细胞和正常上皮细胞的随机迁移。

由于TβRIII与β-arrestin2的相互作用是抑制肿瘤迁移所必需的，而多种癌细胞内TβRIII的表达显著降低，无法充分和β-arrestin2相互作用，激活相应信号通路。而TβRIII生物信息学分析表明，该蛋白质仅羧基末端区域位于细胞内，可能是参与β-arrestin2相互作用的关键。

基于此，研究和开发重塑TβRIII和β-arrestin2相互作用的药物，将具有很好的抗癌作用，具有临床应用前景。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种具有抗肿瘤作用的多肽，能够进入细胞内靶向结合β-arrestin2，从而重塑TβRIII和β-arrestin2的相互作用。

为实现上述目的，本发明提供一种具有抗肿瘤作用的多肽，名称为TAT-TβRIII-1，为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽。

其中，序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列由53个氨基酸残基组成，序列1中第1-11位氨基酸残基组成具有穿透细胞膜作用的区域，该区域和12-53位氨基酸前后位置可以互换，并可以被具有相同作用的其他序列替换；序列1中第12-53位氨基酸残基构成能够和β-arrestin2蛋白质相互作用的区域。

本发明的第二个目的是提供编码所述多肽的核酸分子。

为实现上述目的，本发明所提供的编码所述多肽的核酸分子，为SEQ ID NO：2所示的DNA分子。

其中，序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的长度为162bp，其编码氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO：1所示的多肽片段。

本发明的第三个目的是提供含有所述多肽的编码核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。

本发明的第四个目的是提供所述多肽和/或所述核酸分子在制备抑制肿瘤细胞迁移和/或抑制肿瘤细胞侵袭药物中的应用。

所述肿瘤包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌等TβRIII表达缺失的癌症组织。

本发明还提供一种抑制肿瘤细胞迁移和/或抑制肿瘤细胞侵袭药物，其活性成分为所述的多肽和/或所述的核酸分子。

所述药物的给药方式包括腹腔注射、瘤内注射、皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射等。

本发明提供的多肽TAT-TβRIII-1来源于TβRIII羧基末端，所述多肽TAT-TβRIII-1能够与β-arrestin2相结合，替代表达缺失的TβRIII和β-arrestin2之间发生相互作用，从而继续发挥TβRIII的功能，通过β-arrestin2抑制肿瘤细胞迁移和侵袭等症状。本发明的多肽TAT-TβRIII-1在卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌等癌症治疗中具有临床应用潜力。

附图说明

图1为肽段序列对卵巢癌细胞SKOV3迁移和侵袭的抑制(通过Trans-well实验)：A：TAT-TβRIII-1多肽对卵巢癌细胞SKOV3迁移的抑制作用检测；B：TAT-TβRIII-1多肽对卵巢癌细胞SKOV3侵袭的抑制作用检测。

图2为肽段序列对肾癌细胞OSRC-2迁移和侵袭的抑制(通过Trans-well实验)：A：TAT-TβRIII-1多肽对肾癌细胞OSRC-2迁移的抑制作用检测；B：TAT-TβRIII-1多肽对肾癌细胞OSRC-2侵袭的抑制作用检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。本实施例中的定量实验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规的分子生物学方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中卵巢癌SKOV3细胞和肾癌OSRC-2细胞等来源于ATCC(美国模式培养物集存库)。

实施例1具有穿膜活性的多肽TAT-TβRIII-1的获得

提取SKOV3细胞总RNA，反转录得到cDNA，以cDNA为模板通过PCR获得TβRIII羧基末端多肽的核酸序列，其上游引物：5'CCATCTCGAGATGTACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTTCTCACACAGGGGAGACAGCAGG3'(SEQ ID NO.3)，下游引物5'CGTCGGATCCGGCCGTGCTGCTGCTGGAG3'(SEQ ID NO.4)，在上游引物中插入TAT编码序列，在上游和下游引物中分别加入XhoI和BamHI酶切位点，通过酶切连接法，构建表达载体pWaldo-TAT-TβRIII-1，转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株，筛选重组子。

接种重组子菌株于200mLLB培养基中，37℃培养过夜，转种50mL过夜培养物至1LLB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀ 0.5～0.6之间，加入终浓度0.2mM的IPTG诱导蛋白质表达，24℃继续培养20h，6000g离心15min收集细胞用于蛋白质纯化。

将细胞悬浮于120mL裂解缓冲液中(20mM Tris-HCl,pH 7.5；300mM NaCl和5％甘油)，加入60μg/mL溶菌酶，200U DnaseI和100mM PMSF，800bar破碎细胞，10,000rpm，4℃离心30min去除细胞碎片；将上清过镍柱，冲洗缓冲液(20mM Tris-HCL，pH 7.5，300mM NaCl，5％甘油，30mM咪唑)洗100ml去除杂蛋白，洗脱缓冲液(20mM Tris-HCL，pH7.5，300mM NaCl，5％甘油和300mM咪唑)洗脱，收集蛋白质，通过分子筛柱子(缓冲液：20mM Tris-HCL，pH7.5，300mM NaCl，5％甘油)进一步纯化，可获得较高纯度的TAT-TβRIII-1多肽和GFP融合蛋白。

为了进一步获得TAT-TβRIII-1多肽，蛋白质样品中加入100μL浓度为5mg/mL的TEV(烟草花叶病毒)蛋白酶，4℃酶切过夜，样品重新通过镍柱，将没有酶切完全的融合蛋白和酶切后的GFP组分去掉。最终收集的TAT-TβRIII-1多肽样品，通过截留分子量1,000的浓缩管，浓缩至5mg/mL左右，用于功能研究。纯化的多肽TAT-TβRIII-1氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2多肽TAT-TβRIII-1对卵巢癌细胞的迁移和侵袭的抑制

细胞迁移和侵袭：SKOV3细胞迁移和侵袭检测使用24孔transwell细胞培养小室，小室内放置有8μm孔的聚碳酸酯滤膜。培养细胞加入0.2mg/mL TAT-TβRIII-1多肽处理2h，加入胰蛋白酶消化并重新悬浮于RPMI-1640培养基，使其终浓度为2×10⁵个/ml。500μL10％FBS/RPMI-1640培养基或者500μL SDF-1溶液加入到培养小室底层，100μL细胞悬液加入到滤膜上层。

侵袭实验则先在Transwell小室中铺上无血清的RPMI-1640培养基1:1稀释的Matrigel胶50μL，37℃孵育2h后接种细胞悬液400μL。

恒温培养箱中静置培养24h后，用湿棉签轻轻擦去Matrigel凝胶和聚碳酸酯膜表面的细胞，以无水乙醇固定滤膜，0.1％结晶紫染色15min，PBS清洗，倒置显微镜20倍放大视野下随机取5个不重复视野，计数每个视野穿过Transwell小室底部膜的细胞数。

给予多肽后细胞生存状态和细胞形态未发现明显异常。如图1A、图1B所示，TAT-TβRIII-1能够明显抑制卵巢癌SKOV3细胞的迁移和侵袭。

实施例3多肽TAT-TβRIII-1对肾癌细胞的迁移和侵袭的抑制

细胞迁移和侵袭：OSRC-2细胞迁移和侵袭检测使用24孔transwell细胞培养小室，小室内放置有8μm孔的聚碳酸酯滤膜。培养细胞加入0.2mg/mL TAT-TβRIII-1多肽处理2h，加入胰蛋白酶消化并重新悬浮于RPMI-1640培养基，使其终浓度为2×10⁵个/ml。500μL10％FBS/RPMI-1640培养基或者500μL SDF-1溶液加入到培养小室底层，100μL细胞悬液加入到滤膜上层。

给予多肽后细胞生存状态和细胞形态未发现明显异常。如图2A、图2B所示，TAT-TβRIII-1能够明显抑制肾癌OSRC-2细胞的迁移和侵袭。

综上所述：本发明所述多肽TAT-TβRIII-1能够替代TβRIII和β-arrestin2发生相互作用，从而通过β-arrestin2信号通路抑制相关癌细胞迁移、侵袭。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 一种具有抗肿瘤作用的多肽及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 53

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ser His Thr Gly Glu

1 5 10 15

Thr Ala Gly Arg Gln Gln Val Pro Thr Ser Pro Pro Ala Ser Glu Asn

20 25 30

Ser Ser Ala Ala His Ser Ile Gly Ser Thr Gln Ser Thr Pro Cys Ser

35 40 45

Ser Ser Ser Thr Ala

50

<210> 2

<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacggtcgta aaaaacgtcg tcagcgtcgt cgttctcaca caggggagac agcaggaagg 60

cagcaagtcc ccacctcccc gccagcctcg gaaaacagca gtgctgccca cagcatcggc 120

agcacgcaga gcacgccttg ctccagcagc agcacggcct ag 162

<210> 3

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccatctcgag atgtacggtc gtaaaaaacg tcgtcagcgt cgtcgttctc acacagggga 60

gacagcagg 69

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtcggatcc ggccgtgctg ctgctggag 29

Claims

1.一种具有抗肿瘤作用的多肽，其特征在于，名称为TAT-TβRIII-1，为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽。

2.编码权利要求1所述的多肽的核酸分子，其特征在于，为SEQ ID NO：2所示的DNA分子。

3.含有权利要求2所述的核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。

4.权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子在制备抑制肿瘤细胞迁移和/或抑制肿瘤细胞侵袭药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌。

6.一种抑制肿瘤细胞迁移和/或抑制肿瘤细胞侵袭药物，其活性成分为权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物的给药方式包括：腹腔注射、瘤内注射、皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。