穿膜肽Tat介导的生长因子在透皮转运中的应用
技术领域:
本发明涉及一种穿膜肽Tat介导的透皮转运系统,适用于经皮给药系统和化妆品领域。
背景技术:
进入了21世纪,医学界面临了一个新的问题:如何将药物正确的运送到需施治的部位,使药效得以最大化的发挥。美容界也面临同样的问题,为什么一些号称高科技纳米技术、原料一流且价格不菲的美容膏、美容霜涂抹之后,效果并没有期待中的那么明显?所以近年来医学界关于经皮给药、透皮吸收、缓释等学术的研究空前活跃。近十多年的研究发现免疫缺陷病毒(HIV-1)转录激活因子Tat介导蛋白具有很好的穿膜效果,我们将Tat与生长因子家族的蛋白结合后进行透皮转运的研究,发现该系列融合蛋白在透皮转运中透皮的速率和渗透量显著高于其他的透皮转运系统,而且Tat修饰后的脂质体较未修饰的脂质体也能显著提高活性物的透皮速率和数量,适用于经皮给药系统和化妆品领域。
1988年开始报导免疫缺陷病毒(HIV-1)转录激活因子Tat蛋白具有跨膜功能。1994年,Fawell S等发现Tat蛋白衍生多肽片段可以在数分钟时间内将异源分子导入细胞中。而在过去的十年的时间里,已有多篇报道称,从几百道尔顿的分子到大分子结构如直径达200nm的脂质体,均可由穿膜肽Tat-PTD蛋白介导穿过细胞膜。穿膜肽Tat-PTD蛋白转导具有以下的特点:1.内化不依赖于与受体的结合;2.非能量依赖的细胞内摄作用;3.硫酸肝素(HS)参与内化作用。
Tat肽段可携带不同分子大小、不同结构和理化性质的物质进入到细胞内,因而很难对其穿膜机制作出统一的解释。而可能的穿膜机制有以下几种:
1.直接穿膜
Nagahara等提出,Tat融合蛋白是直接穿膜进入细胞。以一种变性的、高能量的状态存在,当在分子伴侣的帮助下蛋白再折叠时,释放能量以驱动转导进入细胞,或者当分子与膜结合后,分子的动力驱动转导。Becker-Hapak等认为当蛋白处于一个高能量状态时,蛋白转导是最有效的。
2.形成反向微团后穿膜
D.Derossi,S等认为Tat肽段是通过在形成反向微团后直接穿过细胞膜。首先,Tat侧链上碱性基团阳离子部分和膜的阴离子部分(主要是磷脂层的磷酸基)之间的离子作用导致细胞膜的局部出现内陷,促进了细胞膜对肽段的吸收。然后,磷脂重组,形成反向的微团,Tat蛋白就在这个微团所形成的亲水腔内,被释放入细胞质内。但反向微团机理难以用于解释大分子物质,如蛋白或结构更庞大的物质。
3.通过细胞内吞作用穿膜
Sandgren等发现连接于Tat-PTD的DNA和氨基葡聚糖蓄积在大的、酸性的新生细胞质囊泡中,接着被转运至核。Ignatovich等的研究进一步证实了Tat-质粒复合物的摄入是通过胞吞机理。Ferrari等用显微镜观察活细胞,发现融合了GFP的Tat-PTD的内化是通过细胞膜穴样凹陷介导的机制进行的。
发明内容:
本发明的目的在于提供一种穿膜肽Tat介导生长因子家族活性蛋白在透皮转运中的新用途,特别是应用于经皮给药系统和化妆品领域。
它是通过分子克隆常规方法构建出Tat与生长因子家族中一系列活性蛋白及融合蛋白重组表达载体,经不同的层析柱纯化获得融合蛋白,或者将Tat通过化学和(或)物理的方法链接到天然或合成的磷脂中并制备成包裹生长因子的脂质体,形成Tat介导的脂质体透皮转运系统,再辅以适当的药用或化妆品辅料制备成成品用于经皮给药系统或化妆品体系。
本发明的Tat蛋白介导的生长因子家族活性蛋白是由Tat与生长因子家族通过基因重组方式获得的融合蛋白,其特征在于:生长因子家族成员可为aFGF、bFGF、EGF、KGF、TGF等;
本发明所述的Tat蛋白介导的生长因子家族活性蛋白在透皮转运中可以皮肤适用的任何形式存在,其特征在于:皮肤适用的形式可以为冻干粉针、溶液剂、凝胶剂、喷雾剂、乳剂、膏剂和霜剂等;
本发明所述的Tat与生长因子家族蛋白形成的融合蛋白在透皮转运中应用时,可将融合蛋白包裹于脂质体内;
本发明所述的Tat蛋白介导的生长因子家族活性蛋白在透皮转运中应用时,可将Tat通过化学和(或)物理的方法链接到天然或合成的磷脂中并制备成包裹生长因子的脂质体,即以Tat对脂质体进行修饰,其特征在于:所选用的磷脂可以是天然的或合成的磷脂;
本发明所述的Tat修饰的包含有生长因子家族活性蛋白的脂质体在透皮转运中可以皮肤适用的任何形式存在,其特征在于:皮肤适用的形式可以为冻干粉针、溶液剂、凝胶剂、喷雾剂、乳剂、膏剂和霜剂等。
本发明具有以下优点:
Tat与生长因子家族的蛋白构成的系列融合蛋白在透皮转运中透皮的速率和渗透量显著高于其他的透皮转运系统,而且Tat修饰后的脂质体较未修饰的脂质体也能显著提高活性物的透皮速率和数量,适用于经皮给药系统和化妆品领域。
具体实施方式:
实施例一:
表达和纯化含HIV-1的反式激活蛋白Tat蛋白转导结构域(Tat-protein transductiondomain,Tat-PTD49-57)(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg)与人表皮细胞生长因子的融合蛋白Tat-EGF。采用PCR方法获得编码Tat-EGF融合蛋白的基因片段,并在3’端添加6×His标签。将扩增产物用限制性内切酶BamH I以及Nde I处理后与同样酶切处理的大肠杆菌表达质粒pET-3c(Novagen,co.Ltd.,USA)相连,并转化至大肠杆菌DH5α(Novagen,co.Ltd.,USA)中,氨苄青霉素(终浓度100ug/ml)筛选阳性克隆。抽提经测序鉴定正确的重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中(Novagen,co.Ltd.,USA),利用氨苄青霉素抗性(终浓度100ug/ml)筛选出转化子。在37℃,经IPTG(终浓度为1mmol/L)诱导4小时后,收获融合蛋白并使用Ni-NTA柱及肝素亲和层析联用的方法进行分离纯化,最终可以获得纯度大于98%的Tat-EGF融合蛋白。将此融合蛋白加入冻干保护剂后冻干得到冻干粉,用于透皮转运。
实施例二
取透明质酸0.1g溶于约80ml双蒸水中,再加入肝素钠(为Tat-EGF融合蛋白质量的1/4),PEG 4000.2g,搅拌均匀后高压灭菌(0.1Mpa,121℃15分钟),冷却至室温。将实施例一中得到的纯度达98%以上的Tat-EGF融合蛋白,经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后溶液加入上述混合液中,调pH 6.8,加灭菌双蒸水至100ml。
实施例三
取水溶性壳聚糖0.1g溶于适量的冰醋酸(约1ml)中,加入约50ml双蒸水中,调pH 6,再加入EDTA-2Na 0.1g,PEG 400 0.2g,溶解后再加入羟苯甲酯和羟苯乙酯各0.01g(先以适量水加热溶解),搅拌均匀后高压灭菌(0.1Mpa,121℃15分钟),冷却至室温。将实施例一中得到的纯度达98%以上的Tat-EGF融合蛋白,0.22μm微孔滤膜过滤除菌后溶液加入上述混合液中,调pH 6.8,加灭菌双蒸水至100ml。分装于喷雾剂瓶中。
实施例四
(1)将磷脂与胆固醇混匀后,加无水乙醇溶解得脂质溶液,蒸发,制成脂质薄膜;
(2)脂质薄膜水溶液水合,震荡,或将(2)中的脂质溶液直接与水溶液震荡混合,制成脂质分散水溶液;
(3)将脂质分散水溶液经超声、乳化、过滤;
(4)调节脂质分散水溶液pH值至6.8,与实施例一中的Tat-EGF融合蛋白孵育,滤膜过滤,得Tat-EGF融合蛋脂质体溶液;
(5)将(4)中的脂质体溶液加入冻干保护剂后冻干,用于透皮转运。
实施例五
取卡波姆2g,丙二醇4g,对羟基苯甲酸甲酯0.5g,右旋糖苷2g,上述原料混合后呈酸性,为了保证蛋白不变性,加入三乙醇胺1g,调pH值,加水溶解至100g,混合均匀,然后在0.1Mpa,121℃条件下高压灭菌15分钟,冷却至室温,制成基质部分,在基质中实施例二中得到的Tat-EGF脂质体溶液,同时缓慢搅拌均匀,制成脂质体凝胶剂,用于透皮转运。
实施例六
取800ml注射用水,边搅拌边加入泊洛沙姆200g,在4℃充分溶胀形成溶液,加入甘油50g、乙醇50g和对羟基苯甲酸乙酯2g,混合均匀,然后在0.1Mpa,121℃条件下高压灭菌15分钟,冷却至4℃,制成基质部分,将Tat-EGF溶液和肝素钠按3∶1的比例混合均匀,过滤除菌后加入到灭菌后的凝胶基质中,加入灭菌后注射用水至1000g,缓慢搅拌混合均匀,制成Tat-EGF温敏型凝胶剂。
实施例七
甲基纤维素 0.6g
羧甲基纤维素钠 0.3g
甘油 1.5g
苯甲醇 1滴
Tat-KGF脂质体溶液 1ml
蒸馏水 11.85ml
将甘油、苯甲醇溶于处方量蒸馏水中,将约1/2量倒入甲基纤维素,与羧甲基纤维素钠的混合物中,放置,让其溶胀并搅拌至呈凝胶状,再将Tat-KGF脂质体溶液和剩余的已冷却的水溶液,搅拌即得Tat-KGF脂质体软膏体。
Tat-EGF的经皮扩散实验
1、125I标记EGF原液(暨大生物医药中心,0.96mg/ml)和Tat-EGF原液(暨大生物医药中心,0.39mg/ml),标记后的EGF和Tat-EGF按照实施例五制备成脂质体凝胶剂进行经皮扩散实验。
2、昆明小鼠(SPF级)60只,雌性各半,随机分为6组,每组10只(药物都用生理盐水灭菌稀释成0.039mg/ml)。分别为生理盐水组,空白脂质体基质组,125I-EGF原液组,125I-Tat-EGF原液,125I-EGF脂质体组,125I-Tat-EGF脂质体组。
3、剪去小鼠腹部鼠毛,面积为6cm×5cm,将碘标记的药物涂抹于去毛表面,开始计时,6h后乙醚麻醉处死,剥离腹部去毛皮肤,剔尽皮下组织和脂肪,生理盐水冲洗干净,纱布吸去水分,制得完整小鼠腹部皮肤。用脱脂棉球小心拭去表皮层面残留的药物制剂,用注射用NaCl溶液,分3次冲洗皮肤表面,用纱布拭干。剪取有效扩散面积以内皮肤,立即称重,剪碎,放入匀浆器内,加NaCl溶液进行匀浆,离心(8000r/m in),用NaCl溶液反复洗沉淀,离心,合并上清液。空白皮肤如上处理作为空白对照,液闪仪测定放射性,换算成药物含量。
4、6h后在皮肤内药物含量:生理盐水组和空白脂质体基质组未能测到放射性,125I-EGF原液组(25.24±12.60)%,125I-Tat-EGF原液(43.38±16.39)%,125I-EGF脂质体组(38.91±16.40)%,125I-Tat-EGF脂质体组(56.78±20.84)%。125I-Tat-EGF原液组与125I-EGF原液组比较有显著性差异(P<0.01);125I-Tat-EGF脂质体组与125I-EGF脂质体组比较有显著性差异(P<0.01)。表明Tat-EGF和Tat-EGF脂质体能成功的将EGF通过表皮进入到皮肤深层。