CN105722530A

CN105722530A - 用于紧密连接屏障调节的设计肽

Info

Publication number: CN105722530A
Application number: CN201480052086.0A
Authority: CN
Inventors: B·L·米勒; A·德贝内德托; L·A·贝克; E·A·安德森
Original assignee: University of Rochester
Current assignee: University of Rochester
Priority date: 2013-08-16
Filing date: 2014-08-18
Publication date: 2016-06-29
Anticipated expiration: 2034-08-18
Also published as: EP3033108B1; US9757428B2; EP3033108A2; CN105722530B; ES2864667T3; WO2015024022A2; WO2015024022A3; WO2015024022A9; US20160199440A1; EP3033108A4

Abstract

根据本文例示的方面，提供一种短暂地破坏紧密连接内的claudin-1的试剂。所述试剂包括含有至少40％的极性、不带电氨基酸残基和自组装β折叠二级结构的肽。根据本文例示的方面，还提供一种经上皮药物和疫苗制剂，以及分离肽、药物组合物和经皮递送装置。本文还描述破坏上皮屏障的方法和施用本文所述的经上皮制剂的方法。

Description

用于紧密连接屏障调节的设计肽

本申请要求2013年8月16日提交的美国临时专利申请序列第61/866,818号的权益，该申请据此以引用的方式整体并入。

本发明是在授权号5T32AR007472-25下借助美国国家卫生研究院的支持进行的。美国政府对本发明具有一定权利。

技术领域

本文公开了适用于破坏上皮屏障的分离肽，经上皮药物或疫苗制剂，用于递送这些制剂的药物递送媒介物，以及使用这些制剂来破坏上皮屏障的方法。

背景

完整得上皮屏障(例如皮肤)对于健康至关重要，用于从身体排除外源化学物、抗原以及病原体(DeBenedetto等人,“SkinBarrierDisruption:ARequirementforAllergenSensitization？,”J.Invest.Dermatol.132:949–963(2012)；O’Neill等人,“TightJunctionProteinsandtheEpidermis,”Exp.Dermatol.20:88–91(2011)；Kubo等人,“EpidermalBarrierDysfunctionandCutaneousSensitizationinAtopicDiseases,”J.Clin.Invest.122:440–447(2012))。同样地，其妨碍治疗剂和疫苗的经皮递送。为了解决这个问题，已经进行了持续且大量的努力来开发细胞穿透肽以促进经皮递送(Milletti,“Cell-PenetratingPeptides:Classes,Origin,andCurrentLandscape,”DrugDiscov.Today17:850–860(2012)；Stanzl等人,“FifteenYearsofCell-Penetrating,Guanidinium-RichMolecularTransporters:BasicScience,ResearchTools,andClinicalApplications,”Acc.Chem.Res.46(12):2944-54(2013))。虽然这种努力已经产生了许多显著成就，但一种替代策略是可逆地弱化细胞之间的相互作用，由此使得能够进行细胞旁路递送而不使用细胞穿透肽。

上皮细胞层中的细胞旁路屏障经由紧密连接(“TJ”)密封。在皮肤中，TJ形成于颗粒层(“SG”)中(Yoshida等人,“FunctionalTightJunctionBarrierLocalizesintheSecondLayeroftheStratumGranulosumofHumanEpidermis,”J.Dermatol.Sci.71(2):89-99(2013))且甚至可存留于角质层(“SC”)中(Haftek等人,“CompartmentalizationoftheHumanStratumCorneumbyPersistentTightJunction-LikeStructures,”Exp.Dermatol.20:617–621(2011)；Sugawara等人,“TightJunctionDysfunctionintheStratumGranulosumLeadstoAberrantStratumCorneumBarrierFunctioninClaudin-1-DeficientMice,”J.Dermatol.Sci.70(1):12-18(2013))。TJ和SC一致用于形成表皮屏障。

TJ在上皮细胞周围的赤道带中形成蛋白组装链。Claudin桥接胞质面上的肌动蛋白细胞骨架(经由TJ斑中的闭锁小带蛋白)，跨越质膜，且与邻近细胞上的claudin相互作用。迄今已经鉴定了至少23种哺乳动物claudin(VanItallie等人,“ClaudinInteractionsInandOutoftheTightJunction,”TissueBarriers1(3):e25247(2013))。Claudin为四跨膜蛋白(tetraspannin)，具有两个细胞外环和一个长的细胞质C端结构域。在细胞表面处，claudin经由其细胞外结构域形成二聚体，所述细胞外结构域与对面细胞膜上的那些组装，从而形成包埋于两个细胞膜中的链(Kaufmann等人,“VisualizationandQuantitativeAnalysisofReconstitutedTightJunctionsUsingLocalizationMicroscopy,”PLoSONE7:e31128(2012))。这些链的数目和特征决定了细胞旁路屏障的强度。Claudin家族成员的差异表达为各组织屏障(肠对皮肤对血脑屏障)制定渗透性特征(Anderson等人,“PhysiologyandFunctionoftheTightJunction,”ColdSpringHarbPerspectBiol.1(2):a002584–a002584(2009))。包括封闭蛋白(“Ocln”)、tricellulin以及JAM-A的其它几种膜蛋白也参与TJ复合物且有助于屏障功能和调控(Kirschner等人,“ContributionofTightJunctionProteinstoIon,Macromolecule,andWaterBarrierinKeratinocytes,”J.Invest.Dermatol.133:1161–1169(2013)；Cording等人,“InTightJunctions,ClaudinsRegulatetheInteractionsBetweenOccludin,TricellulinandMarveld3,Which,Inversely,ModulateClaudinOligomerization,”J.CellSci.126:554–564(2013))。

Claudin1(“Cldn1”)在肺上皮、表皮角化细胞和填充表皮的树突细胞中高度表达(Kast等人,“TheBroadSpectrumofInterepithelialJunctionsinSkinandLung,”J.AllergyClin.Immunol.130:544-546(2012)；Kubo等人,“ExternalAntigenUptakebyLangerhansCellsWithReorganizationofEpidermalTightJunctionBarriers,”J.Exper.Med.206:2937–2946(2009))。增加的Cldn1体外表达会增强细胞旁路渗透性屏障(Pfeiffer等人,“Claudin-1InducedSealingofBlood–BrainBarrierTightJunctionsAmelioratesChronicExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis,”ActaNeuropathol.122:601–614(2011)；Inai等人,“Claudin-lContributestotheEpithelialBarrierFunctioninMDCKCells,”EuropeanJ.CellBiol.78:1–7(1999))。在人类中，遗传性Cldn1缺乏在新生儿鱼鳞病-少毛症-硬化性胆管炎综合征中已有报道，其导致严重的鱼鳞病和新生儿胆汁淤积(Hadj-Rabia等人,“Claudin-1GeneMutationsinNeonatalSclerosingCholangitisAssociatedWithIchthyosis:ATightJunctionDisease,”Gastroenterology127:1386–1390(2004))。缺乏Cldn1的小鼠在出生一日内由于脱水而死，表明该蛋白为皮肤屏障所必需的(Yoshida等人,“FunctionalTightJunctionBarrierLocalizesintheSecondLayeroftheStratumGranulosumofHumanEpidermis,”J.Dermatol.Sci.71(2):89-99(2013)；Furuse等人,“Claudin-BasedTightJunctionsareCrucialfortheMammalianEpidermalBarrier:ALessonFromClaudin-1-DeficientMice,”J.CellBiol.156:1099–1111(2002))。类似地，患有异位性皮炎(“AD”)的患者在其非病灶性皮肤中具有较大的经表皮水分损失和细胞旁路渗透性，并且还具有显著降低的Cldn1表达(DeBenedetto,“TightJunctionDefectsinPatientsWithAtopicDermatitis,”J.AllergyClin.Immunol.127:773–786.e7(2010))。

几个研究组已经显示源于TJ蛋白(claudin和Ocln)的细胞外环的序列的合成肽在高浓度下破坏屏障功能(Wong等人,“ASyntheticPeptideCorrespondingtotheExtracellularDomainofOccludinPerturbstheTightJunctionPermeabilityBarrier,”J.CellBiol.136:399–409(1997)；Mrsny等人,“AKeyClaudinExtracellularLoopDomainIsCriticalforEpithelialBarrierIntegrity,”Am.J.Path.172:905–915(2008)；Baumgartner等人,“Ad-PeptideAnalogoftheSecondExtracellularLoopofClaudin-3and-4LeadstoMislocalizedClaudinandCellularApoptosisinMammaryEpithelialCells,”Chem.Biol.&DrugDes.77:124–136(2011)；Zwanziger等人,“APeptidomimeticTightJunctionModulatortoImproveRegionalAnalgesia,”Mol.Pharm.9:1785–1794(2012))。来自claudin3和4的第二细胞外环的肽诱导封闭蛋白的错误定位和细胞凋亡(Baumgartner等人,“Ad-PeptideAnalogoftheSecondExtracellularLoopofClaudin-3and-4LeadstoMislocalizedClaudinandCellularApoptosisinMammaryEpithelialCells,”Chem.Biol.&DrugDes.77:124–136(2011)；Beeman等人,“OccludinIsRequiredforApoptosisWhenClaudin–ClaudinInteractionsareDisrupted,”CellDeathDis.3:e273(2012))。在T84(可移植人类肿瘤)细胞中，显示25μM大鼠Cldn1(53-80)肽的应用抑制钙诱导TJ形成，并且200μM能够破坏完整TJ(Mrsny等人,“AKeyClaudinExtracellularLoopDomainIsCriticalforEpithelialBarrierIntegrity,”Am.J.Path.172:905–915(2008))。TJ破坏不需要半胱氨酸。大鼠Cldn1(53-81,C54,64S)肽在体内200-300μM下破坏Caco-2、HEK-293以及大鼠神经周TJ屏障(Zwanziger等人,“APeptidomimeticTightJunctionModulatortoImproveRegionalAnalgesia,”Mol.Pharm.9:1785–1794(2012))。Zwanziger等人指出，这种肽当用SDS溶解时具有β折叠结构，如圆二色性所证明。大鼠Cldn1(53-81,C54,64S)肽与Cldn1共定位并且由近汇合HEK-293细胞内化(Zwanziger等人,“Claudin-DerivedPeptidesareInternalizedViaSpecificEndocytosisPathways,”Ann.NYAcad.Sci.1257:29–37(2012))。

在这些先前研究中需要相对高浓度的测试肽来诱导TJ外观的改变并且增加细胞旁路渗透性。先前尚未鉴定出能够在低或亚微摩尔浓度下破坏TJ的claudin衍生肽。除了对claudin-1第二环结构域和其氨基酸序列的认识，迄今尚未鉴定出负责破坏的结构特征。

此外，大和/或亲水性治疗剂或抗原的经上皮(包括经皮)递送由于例如皮肤和粘膜的双重屏障功能而不简便。小分子药物的小子集由于其小尺寸和疏水性可经由跨细胞转运容易地横经上皮细胞屏障。较大或较多亲水性分子不会自发地横跨细胞膜并且会被细胞旁路紧密连接屏障排除在外。将使药物和无针疫苗的非侵入性递送成为可能的可逆、受控屏障破坏对于不会容易地横跨细胞膜的基于肽/蛋白的治疗剂或抗原是特别合乎需要的。

本文公开针对克服本领域中的这些和其它限制的肽和制剂。

概述

根据本文例示的方面，提供一种短暂地破坏紧密连接内的claudin-1的试剂。所述试剂包括含有至少40％的极性、不带电氨基酸残基和自组装β折叠二级结构的肽。

根据本文例示的其它方面，提供一种短暂地破坏紧密连接中的claudin-1的试剂。所述试剂包括含有至少40％的极性、不带电氨基酸残基和自组装β折叠二级结构的肽。所述肽不由氨基酸序列SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLNSTLQATR(SEQIDNO:1)、SCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLNSTLQAT(SEQIDNO:2)、SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLSSTLQAT(SEQIDNO:3)或SCVSQSTGQ[I/V]QCKVFDSLLNLSSTLQAT(SEQIDNO:4)组成。

根据本文例示的其它方面，提供一种经上皮药物制剂。所述经上皮药物制剂包含药学上适合的载体；有效量的治疗剂；以及如本文所述的短暂地破坏紧密连接内的claudin-1的试剂。

根据本文例示的其它方面，提供一种经上皮疫苗制剂。所述经上皮疫苗制剂包含药学上适合的载体；有效量的存在于所述载体中的抗原或抗原编码核酸分子，和任选地一种或多种佐剂；以及如本文所述的短暂地破坏紧密连接内的claudin-1的试剂。

根据本文例示的其它方面，提供一种分离肽，其包含氨基酸序列SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLSSTLQATR(SEQIDNO:5)、SILTGVSTLDQSLKQLSNFSQAVSTQSSR(SEQIDNO:6)、GGMSCVSQSTGQIQCKV(SEQIDNO:7)、SCVSQSTGQIQCKV(SEQIDNO:8)、RRGSCVSQSGRR(SEQIDNO:9)、ISGVQCCQTKQSS(SEQIDNO:10)、RRGVCSSSQGRR(SEQIDNO:11)、LWMSSVSQSTGQIQSKVFDS(SEQIDNO:12)、MSSVSQSTGQIQSKVFDS(SEQIDNO:13)、MSSVSQSTGQIQSKV(SEQIDNO:14)、MSSVSQST(SEQIDNO:15)、ISMSQQVSQSGVSDKFST(SEQIDNO:16)、SIMSGKQSSVQSQVT(SEQIDNO:17)、VSMSSTSQ(SEQIDNO:18)、VSSSSQ(SEQIDNO:19)、SILTGVST(SEQIDNO:20)、SSVSQSTG(SEQIDNO:21)、GQIQSKVG(SEQIDNO:22)、LNLSSTLQG(SEQIDNO:23)、NSVVQSTG(SEQIDNO:24)、GQMQSKVG(SEQIDNO:25)或SCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLSSTLQATR(SEQIDNO:26)。

根据本文例示的其它方面，提供一种药物组合物，其包含如本文所述的分离肽和药学上适合的载体。

根据本文例示的其它方面，提供一种经皮贴片，其包含(i)如本文所述的短暂地破坏紧密连接内的claudin-1的试剂，(ii)如本文所述的经上皮药物制剂，或(iii)如本文所述的经上皮疫苗制剂。

根据本文例示的其它方面，提供一种破坏上皮屏障的方法。所述方法包括向上皮位点施加一定量的如本文所述的短暂地破坏紧密连接内的claudin-1的试剂，其中所述施加有效破坏存在于所述位点处的上皮细胞中的claudin-1，并且由此破坏在所述上皮位点处的屏障形成。

根据本文例示的其它方面，提供一种向受试者施用经上皮药物制剂的方法。所述方法包括向所述受试者上的上皮位点施加如本文所述的经上皮药物制剂。

根据本文例示的其它方面，提供一种向受试者施用经上皮疫苗制剂的方法。所述方法包括向所述受试者上的上皮位点施加如本文所述的经上皮疫苗制剂。

本文例示的方面利用具有确定生理化学特性的肽来可逆地破坏TJ功能，TJ功能控制上皮细胞中的细胞旁路扩散。这些肽代表新的一类非病原、功能性淀粉状蛋白。如本文所述，TJ破坏性肽的结构和其作用机制通过研究同源人类肽hCldn1(53-81,C54,64S)(SEQIDNO:5)(本文中称为“肽1a”)的生物学和生物物理学特征来检查。已发现，当在表面活性剂存在下溶解时，肽1a在比先前关于Cldn1肽所报告的(Mrsny等人,“AKeyClaudinExtracellularLoopDomainIsCriticalforEpithelialBarrierIntegrity,”Am.J.Path.172:905–915(2008)；Zwanziger等人,“APeptidomimeticTightJunctionModulatortoImproveRegionalAnalgesia,”Mol.Pharm.9:1785–1794(2012)，其据此以引用的方式整体并入)低两个数量级的浓度下破坏培养细胞中的TJ。生物物理学表征表明，肽1a可形成在β折叠二级结构中富含的淀粉状蛋白样原纤维。如本文所述，具有相同氨基酸含量、疏水性以及pI但具有随机序列的先前未知的乱序肽(称为肽2a)也采用β折叠构象，形成原纤维，并且破坏TJ。

如下文实施例中所示，合成基于Cldn1的肽并且分析其结构和生物物理学特性，以及其改变TJ的能力。使用人类支气管上皮细胞系(16HBE)，合成claudin肽和其乱序类似物，两者均在比使用其它Cldn1肽时已被报道的浓度低一个数量级的浓度下以剂量依赖性方式破坏TJ。肽暴露还破坏细胞旁路屏障功能，从而允许大小和范围在荧光素至治疗抗体内的分子扩散，而无细胞毒性的迹象。经上皮电阻(“TER”)在去除所述肽后恢复。肽暴露改变Cldn1和封闭蛋白表达模式，如通过免疫荧光染色所观察。当溶解于表面活性剂中时，Cldn1肽和其相应乱序类似物均自发地形成原纤维。圆二色性和傅里叶变换红外光谱法证明，这些原纤维富含于β折叠二级结构中，并且X射线粉末衍射与交叉β结构一致。这些原纤维结合硫代黄素T(一种被视为对淀粉状蛋白具诊断性的染料)。所述乱序肽至少与所述Cldn1序列一样在屏障破坏中起作用以及采用类似构象的观察结果表明一类全新的淀粉状蛋白形成肽的存在，并且揭露一种用于增强治疗分子的经上皮递送的新策略。

附图简述

图1A-1C为表皮中的TJ以及Claudin-1、肽1以及肽2(其更详细地描述于下文中)的示意图(图1A和1B)，以及显示自组装迹象的其它肽的表格(图1C)。表皮中的TJ、TJ中的Cldn1以及用于本文所述的实验中的肽的示意图显示于图1A-1B中。图1B为显示表皮TJ形成SG中的角化细胞之间的细胞旁路屏障的放大示意图。SC和TJ一致用于形成皮肤屏障；L，朗格汉斯细胞；SS，棘层；SB，基底层；BM，基底膜。Cldn1自组装并且主要通过其在细胞旁路空间中的第一细胞外环与其它TJ蛋白相互作用。Cldn1的C端通过细胞质TJ斑蛋白锚定于肌动蛋白细胞骨架。肽1代表人类Cldn1的第一细胞外环的一半，其中其Cys残基突变为Ser(hCldn1(53-81,C54,64S))(SEQIDNO:5)。肽2为乱序序列(SEQIDNO:6)。R＝H或生物素-N-炔丙基甘氨酸。已经显示自组装迹象并且可根据本文例示的实施方案使用的另外的示例性肽发现于图1C中。

图2A-2B显示16HBE细胞中的TJ蛋白的免疫荧光显微图像。未处理16HBE细胞针对以下染色：Claudin1(Cldn1，绿色)和闭锁小带-1(ZO-1，红色)(图2A)，以及Claudin4(Cldn4，绿色)和封闭蛋白(Ocln，红色)(图2B)。使用以下抗体(Invitrogen)：兔抗Claudin1，#18-7362；小鼠抗Claudin4，#32-9400；兔抗Ocln，#71-1500；小鼠抗ZO-1，#33-9100；小鼠抗Ocln，#33-1500；抗兔#A21206；抗兔#A10042；抗小鼠#A21202；抗小鼠#A10037。比例尺＝25μm。

图3A-3E为描绘针对肽1a(Cldn1肽)和2a(乱序肽)的经上皮电阻(“TER”)和渗透性测定的实验结果的图，其显示屏障功能的剂量依赖性降低。TER(图3A和3B)在肽暴露期间测量。将数据标准化为媒介物对照(n＝8)。图3C显示实验结果，其中在暴露24小时后，钠荧光素或FITC-葡聚糖(FD-40)向基底介质的细胞旁路扩散在30分钟后确定(n＝4)。表面活性剂浓度在不存在(媒介物)和存在所述肽的情况下保持恒定。误差棒代表平均值标准误差(“SEM”)；*指示相对于媒介物的统计显著性(P<0.05，双尾T测试)；并且ND代表无可获得数据。图3D显示实验结果的条线图，证明肽1a(Cldn1肽)和2a(乱序肽)的应用促进治疗性单克隆抗体(168kD)的扩散。在暴露于媒介物或肽(一致的表面活性剂浓度)24小时后，将荧光标记的SynagismAb施加于顶端并且在30分钟或18小时后确定向基底介质的扩散(n＝4)。误差棒代表SEM，并且*指示相对于媒介物的统计显著性(P<0.05，双尾T测试)。图3E显示针对肽1a和2a的18小时扩散后的FITC-葡聚糖渗透性。将PBS中的荧光素葡聚糖(40kD)在暴露于Cldn1肽1a或乱序肽2a(600μg/mLFD-40最终顶端浓度)24h后添加至顶端介质中。孵育18小时后收集基底介质，并且将荧光性标准化为阳性对照(用1％Triton-X100溶解的细胞)。

图4A-4B为描绘针对标记的肽1b和2b的TER和渗透性测定的实验结果的图。图4A中的结果表明标记的肽引起屏障的破坏，如通过降低的TER所测量。显示代表性实验(n＝2)。图4B显示针对标记的肽1b和2b的荧光素渗透性。

图5A-5C为实验结果的条线图。图5A-5B为显示在去除肽后TJ功能在16HBE培养物中恢复的结果的条线图。在暴露于肽1a和2a、4、12(图5A中显示的代表性实验)或24小时的情况下未观察到WST1代谢的改变。(U，未处理介质；V，媒介物；L，溶解的细胞；1a(Cldn1，图的中段，0.024-12μM)；或2a(乱序，图的右段，0.024至12μM))。图5B显示证明在去除肽1a(图的左段，0.024至12μM)或2a(图的右段，0.024至12μM)后屏障功能恢复的结果；亮条线指示在肽暴露后的平均TER值，而暗条线指示在肽洗出和进一步孵育24h后的平均TER值。灰色水平线指示针对媒介物的平均TER值。误差棒代表SEM(n＝4)。图5C显示与通过WST1测定进行的细胞毒性寡聚物(取自130908RM)的研究有关的结果。将肽储备液稀释于温介质中并且不经孵育直接添加至细胞中。在暴露12h后，添加WST1试剂并且用比色法分析细胞代谢活性。淀粉状蛋白寡聚物为短暂折叠中间物，其可通过膜破坏引起毒性，而原纤维为热力学上稳定的。如预期，在用具有充分机会实现平衡的低浓度的新鲜稀释的1a(1.2μM)和2a(200nM)孵育细胞后观察细胞毒性。(暗条线指示肽1a，亮条线指示肽2a。)

图6A-6H显示证明CLDN1肽1a和乱序肽2a破坏16HBE培养物中的TJ的免疫荧光图像。内源Cldn1(绿色)和Ocln(红色)的免疫荧光图像在TJ处重叠(图6A-6D)。标记的(红色)Cldn1肽(1b)和乱序(2b)在暴露4小时后于16HBE培养物中与内源Cldn1(绿色)共定位(图6E-6H)。图像对应于用以下孵育的培养物：图6A和6E，未处理介质；图6B和6F，含有0.006％F-127和0.03％DMSO的媒介物对照；7C和7G，2.4μM1b；或7D和7H，2.4μM2b。比例尺＝25μm。

图7A-7F为显示肽1a(Cldn1)和2a(乱序)在几个小时内形成通过TEM观察长度长达1μm的原纤维和长度长达680μm的针状晶体的图像。显示以下：1a(图7A、7C以及7E)和2a(图7B、7D以及7F)：TEM(图7A-7D)，比例尺＝100nm；晶体(图7E和7F)，比例尺＝100μm。

图8A-8E为显示具有β折叠结构(图8A-8C)的1a(星形)和2a(正方形)的原纤维的结果的图，以及显示标记的肽1b和2b的CD实验(图8D)和FITR光谱(图8E)的结果的图。冻干的原纤维的X射线粉末衍射(图8A)显示的d间距，这是在延伸的β折叠结构中间隔的周期性骨架所特有的。显著的β结构通过圆二色性218nm处的最小值显而易见(图8B)。在FTIR透射光谱中1628cm^-1处的酰胺I峰(图8C)是反平行β折叠所特有的。图8D显示CD实验的结果。标记的肽1b和2b(1μM)的CD。在获取光谱(在1cm路径长度比色皿中)之前48小时将肽稀释于磷酸盐缓冲液中。图8E包括显示标记的肽1b和2b的FTIR光谱的图。

图9显示肽1a晶体的X射线衍射(内部X射线源)。晶体在含有25％甘油的PBS中生长24小时。平面和针状晶体产生相似的衍射图样，其中4.3(左)和反射突出显示。

图10A-10B为显示1和2的硫代黄素T结合的结果的图。室温下在0.12％F-127中制备20x肽储备液并且孵育24小时。将储备液稀释于含有1％含有10μM硫代黄素T的血清的PBS(图10A)或DMEM(图10B)介质中并且在4℃下孵育48小时，接着进行荧光测定。所有测试浓度与媒介物对照(P<0.005,n＝4)相比均显示显著的统计学显著硫代黄素T荧光性。误差棒代表标准偏差。注意Y轴不在相同标度上。

图11A-11F为例示荧光素酶渗透性实验的实验结果的图。小鼠(每组4只小鼠)在麻醉后用单独媒介物(生理盐水中的0.006％PluronicF127)或用不同浓度的肽在鼻腔中进行处理。12或24小时后，施加10微克荧光素酶的溶液。接着将小鼠在各时间点成像以确定保留于鼻腔中的荧光素酶的量。如图11A-11F所示，肽1A的应用导致较大量的荧光素酶从鼻腔失去的趋势，与肽介导的渗透性增加一致。

图12A-12E为显示使用流感血凝素的免疫实验的实验结果的图。小鼠(每组4只小鼠)用单独媒介物(生理盐水中的0.006％PluronicF127)、媒介物加流感血凝素(HA)或媒介物加HA加透化剂(肽1A或2A，或精液源性病毒感染增强子(SEVI))在鼻腔中进行处理。在处理后第18、28以及35天评估血清中针对HA的抗体滴度，并且在处理后第48天在支气管灌洗中确定HA特异性IgG和IgA。血清抗体滴度(图12A-12C)和在支气管灌洗中的HA特异性抗体(图12D和12E)在肽1A或2A存在下均显示增强的趋势，与抗原递送的肽依赖性增加一致。

图13A-13D显示根据本文例示的方面的经皮贴片的一个实施方案的底部透视(图13A)和横断面(图13B、13C以及13D)视图。

详述

本文例示的方面涉及改变在上皮细胞中、尤其在表达claudin-1(“Cldn1”)的那些上皮细胞中的紧密连接(“TJ”)屏障功能的试剂，以及包含所述试剂的组合物和产品，以及其用途。

术语上皮以其通常含义使用并且涉及上皮、覆盖身体的所有自由、开放表面的细胞外层，包括皮(皮肤)和粘膜。术语经上皮是指如药物、疫苗或活性剂的物质通过上皮进入，包括直接局部施用和使用如贴片的支撑材料的施用。

本文所述的肽和组合物还可用于改变血管和血脑屏障的渗透性。

因此，根据本文例示的方面，提供一种短暂地破坏TJ中的claudin-1的试剂。所述试剂包括含有至少40％的极性、不带电氨基酸残基和自组装β折叠二级结构的肽。

在一个实施方案中，所述肽在不存在表面活性剂的情况下在水性介质中具有低溶解度。在另一实施方案中，所述肽在不存在表面活性剂的情况下不溶于水性介质中。

根据本文例示的方面的肽可与TJ内的原生claudin-1缔合或结合。

在一个实施方案中，根据本文例示的方面的肽具有未在claudin-1中天然存在的氨基酸序列。

例如，根据本文例示的方面的肽可为claudin-1氨基酸序列的乱序形式，其中所述claudin-1氨基酸序列包含claudin-1的细胞外环区域的至少6个氨基酸残基。

如本文所用，肽的“乱序”形式是指具有与来源或参考肽(例如，天然存在的claudin-1片段)相同或大体上相同(即，一个或两个取代，视肽长度而定)的氨基酸含量，但具有不同的氨基酸残基的一级序列的肽。

在一个实施方案中，产生乱序肽的claudin-1氨基酸序列为哺乳动物claudin-1蛋白。在一个实施方案中，产生乱序肽的claudin-1氨基酸序列为人类claudin-1蛋白。所述claudin-1氨基酸序列可包含一个或多个半胱氨酸至丝氨酸的取代。

在一个实施方案中，所述乱序肽具有与产生所述乱序肽的肽相同的疏水性和/或pI。

在一个实施方案中，所述乱序肽包含氨基酸序列SILTGVSTLDQSLKQLSNFSQAVSTQSSR(SEQIDNO:6)、ISGVQCCQTKQSS(SEQIDNO:10)、RRGVCSSSQGRR(SEQIDNO:11)、ISMSQQVSQSGVSDKFST(SEQIDNO:16)、SIMSGKQSSVQSQVT(SEQIDNO:17)、VSMSSTSQ(SEQIDNO:18)、VSSSSQ(SEQIDNO:19)或SILTGVST(SEQIDNO:20)。

在一个实施方案中，根据本文例示的方面的试剂包含多种肽并且所述多种肽形成一种或多种原纤维。在一个实施方案中，所述肽中的一者或多者经历自发自组装，成为结构化超分子组装。在另一实施方案中，所述肽中的一者或多者经历共组装，成为结构化淀粉状蛋白原纤维。

根据本文例示的方面的肽的氨基酸序列可包含至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％或至少90％的极性不带电氨基酸残基。

在一个实施方案中，根据本文例示的方面的肽的氨基酸序列包含至少一种疏水性氨基酸残基。在一个实施方案中，所述肽包含至少两种疏水性氨基酸残基。在一个实施方案中，所述肽包含至少25％或至少30％的疏水性氨基酸残基含量。在一个实施方案中，所述肽包含至少31％的疏水性氨基酸残基含量。

根据本文例示的方面的肽的氨基酸序列可包括具有至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个或至少30个氨基酸残基的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述肽包含具有6至30个氨基酸残基的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述肽包含具有6至29个氨基酸残基的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述肽包含具有少于53个氨基酸残基的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述肽不为天然存在的claudin1蛋白的多肽序列。在一个实施方案中，所述肽不为天然存在的claudin1蛋白的细胞外环结构域(例如，第二细胞外环结构域)的多肽序列。在一个实施方案中，所述肽不为天然存在的claudin1蛋白或其细胞外环结构域的多肽序列，所述多肽序列包含一个或多个半胱氨酸至丝氨酸的取代。

在一个实施方案中，所述肽不由氨基酸序列SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLNSTLQATR(SEQIDNO:1)、SCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLNSTLQAT(SEQIDNO:2)、SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLSSTLQAT(SEQIDNO:3)或SCVSQSTGQ[I/V]QCKVFDSLLNLSSTLQAT(SEQIDNO:4)组成。

在一个实施方案中，所述肽不包含氨基酸序列SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLNSTLQATR(SEQIDNO:1)、SCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLNSTLQAT(SEQIDNO:2)、SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLSSTLQAT(SEQIDNO:3)或SCVSQSTGQ[I/V]QCKVFDSLLNLSSTLQAT(SEQIDNO:4)。

根据本文例示的方面的肽可包含氨基酸序列SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLSSTLQATR(SEQIDNO:5)、SILTGVSTLDQSLKQLSNFSQAVSTQSSR(SEQIDNO:6)、GGMSCVSQSTGQIQCKV(SEQIDNO:7)、SCVSQSTGQIQCKV(SEQIDNO:8)、RRGSCVSQSGRR(SEQIDNO:9)、ISGVQCCQTKQSS(SEQIDNO:10)、RRGVCSSSQGRR(SEQIDNO:11)、LWMSSVSQSTGQIQSKVFDS(SEQIDNO:12)、MSSVSQSTGQIQSKVFDS(SEQIDNO:13)、MSSVSQSTGQIQSKV(SEQIDNO:14)、MSSVSQST(SEQIDNO:15)、ISMSQQVSQSGVSDKFST(SEQIDNO:16)、SIMSGKQSSVQSQVT(SEQIDNO:17)、VSMSSTSQ(SEQIDNO:18)、VSSSSQ(SEQIDNO:19)、SILTGVST(SEQIDNO:20)、SSVSQSTG(SEQIDNO:21)、GQIQSKVG(SEQIDNO:22)、LNLSSTLQG(SEQIDNO:23)、NSVVQSTG(SEQIDNO:24)、GQMQSKVG(SEQIDNO:25)或SCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLSSTLQATR(SEQIDNO:26)。根据本文例示的方面的肽可包含GGGMSCVSQSTGQIQCK(SEQIDNO:28)；GGSCVSQS(SEQIDNO:29)；RRGSCVSQSTGQIQCKGRR(SEQIDNO:30)，或RRGISGVQCCQTKQSSGRR)(SEQIDNO:31)。

在一个实施方案中，根据本文例示的方面的肽在N端位置处包含另外的甲硫氨酸氨基酸残基。在一个实施方案中，所述肽包含SEQIDNO:26的修饰形式并且包含氨基酸序列MSCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLSSTLQATR(SEQIDNO:27)。可对SEQIDNO:1-31中任一者进行这种相同修饰。在所述肽的N和/或C末端处的其它修饰被预期，包括例如棕榈酰基-、Nyl-、Npg-或其组合。尽管描述了示例性修饰，但涵盖其它修饰。

本文例示的方面还包括呈分离形式的本文所述的肽。在一个实施方案中，所述分离肽包含氨基酸序列SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLSSTLQATR(SEQIDNO:5)、SILTGVSTLDQSLKQLSNFSQAVSTQSSR(SEQIDNO:6)、GGMSCVSQSTGQIQCKV(SEQIDNO:7)、SCVSQSTGQIQCKV(SEQIDNO:8)、RRGSCVSQSGRR(SEQIDNO:9)、ISGVQCCQTKQSS(SEQIDNO:10)、RRGVCSSSQGRR(SEQIDNO:11)、LWMSSVSQSTGQIQSKVFDS(SEQIDNO:12)、MSSVSQSTGQIQSKVFDS(SEQIDNO:13)、MSSVSQSTGQIQSKV(SEQIDNO:14)、MSSVSQST(SEQIDNO:15)、ISMSQQVSQSGVSDKFST(SEQIDNO:16)、SIMSGKQSSVQSQVT(SEQIDNO:17)、VSMSSTSQ(SEQIDNO:18)、VSSSSQ(SEQIDNO:19)、SILTGVST(SEQIDNO:20)、SSVSQSTG(SEQIDNO:21)、GQIQSKVG(SEQIDNO:22)、LNLSSTLQG(SEQIDNO:23)、NSVVQSTG(SEQIDNO:24)、GQMQSKVG(SEQIDNO:25)或SCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLSSTLQATR(SEQIDNO:26)。在一个实施方案中，所述分离肽包含氨基酸序列GGGMSCVSQSTGQIQCK(SEQIDNO:28)；GGSCVSQS(SEQIDNO:29)；RRGSCVSQSTGQIQCKGRR(SEQIDNO:30)，或RRGISGVQCCQTKQSSGRR)(SEQIDNO:31)。

本文所述的肽(包括分离肽)也可以融合肽的形式呈现，所述融合肽另外包含经由肽键偶合于本发明肽的第二氨基酸序列。所述第二氨基酸序列可为纯化标签，如聚组氨酸(His₆-)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST-)或麦芽糖结合蛋白(MBP-)，其帮助纯化，但可稍后去除，即在回收后从所述肽裂解。蛋白酶特异性裂解位点(即，在可裂解接头序列中)可在所述纯化标签与所需肽之间引入。所需肽产物可进一步纯化以去除裂解的纯化标签。

根据一种方法，本文所述的肽可通过标准肽合成操作来合成。这些操作包括FMOC(9-芴基甲基氧基-羰基)和tBoc(叔丁基氧基-羰基)合成方案，所述方案可在自动化固相肽合成仪器上进行，所述仪器包括不限于AppliedBiosystems431A、433A合成器和PeptideTechnologiesSymphony或大规模Sonata或CEMLiberty自动化固相肽合成器。替代性肽合成仪器的使用也被预期。通过固相合成制备的肽以基本上纯形式加以回收。

本文所述的肽也可通过使用重组表达系统，随后分离且纯化重组制备的肽来制备。一般来说，这涉及将编码核酸分子插入至所述分子的异源(即，通常不存在)表达系统中。可将编码本文所述的肽的一种或多种所需核酸分子插入至载体中。所述异源核酸分子以相对于启动子和任何其它5'和3'调控分子的适当有义(5'—3')取向和正确阅读框插入至所述表达系统或载体中。

编码本文所述的肽的核酸分子可使用例如亚磷酰胺方法和源于保护的2′-脱氧核苷的亚磷酰胺结构单元经由固相合成来制备。为了获得所需寡核苷酸，所述结构单元以产物的序列所需的顺序依序偶合于增长的寡核苷酸链。链组装完成后，将产物从固相释放到溶液，脱除保护基，收集，并且典型地使用HPLC纯化。固相合成的限制适用于制备长度长达约200nt的寡核苷酸，其编码约65个氨基酸或更少氨基酸的肽。合成的寡核苷酸的末端可被设计包含特异性限制酶裂解位点以促进合成的寡核苷酸连接至表达载体中。

关于更长的肽，寡核苷酸可经由固相合成制备随后使用各种技术将合成寡核苷酸序列连接在一起。用于全合成基因的制造的重组技术综述于例如Hughes等人,“ChapterTwelve–GeneSynthesis:MethodsandApplications,”MethodsinEnzymology498:277-309(2011)中，其据此以引用的方式整体并入。

一旦选择了适合的表达载体，即使用本领域中的标准克隆程序将所需核酸序列克隆至所述载体中，如Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringsLaboratory,ColdSpringsHarbor,N.Y.(1989)或Cohen和Boyer的美国专利号4,237,224所述，其据此以引用的方式整体并入。所述载体随后被引入至适合的宿主中。

多种宿主-载体系统可用于重组表达本文所述的肽。首先，载体系统必须与所用的宿主可相容。宿主-载体系统包括不限于以下：用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌；微生物，如含酵母载体的酵母；感染有病毒(例如牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳动物细胞系统；感染有病毒(例如杆状病毒)的昆虫细胞系统；以及被细菌感染的植物细胞。这些载体的表达要素在其强度和特异性方面有差异。视所用的宿主-载体系统而定，多种适合的转录和翻译要素中的任一者可用于进行本文所述的这一方面和其它方面。

当需要实现根据本文例示的方面的肽的异源表达时，则可将编码这些产物的DNA分子递送至细胞中。基本上，此举包括提供编码所需产物的核酸分子，然后在有效使所需产物在细胞中表达的条件下将所述核酸分子引入至细胞中。优选地，此举通过将所述核酸分子插入至表达载体中，接着将其引入至细胞中来实现。

纯化的肽可通过多种方法获得。所述肽可通过常规技术以纯化形式(优选地至少约80％或85％纯，或至少约90％或95％纯)产生。视重组宿主细胞是否制成分泌所述肽至生长培养基中而定(参见Bauer等人的美国专利号6,596,509，其据此以引用的方式整体并入)，所述肽可通过离心(以从含有分泌的肽的上清液中分离细胞组分)然后进行上清液的连续硫酸铵沉淀来分离且纯化。使含有所述肽的部分在适当大小的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中经受凝胶过滤以分离所述肽与其它蛋白。必要时，所述肽部分可通过HPLC进一步纯化。

或者，如果未分泌所关注的肽，其可使用标准分离和纯化方案从重组细胞分离。此举包括破坏细胞(例如，通过超声处理、冷冻、法压壶等)然后从细胞碎片中回收所述肽。可使用上文所述的离心、沉淀以及纯化程序实现纯化。上文所述的纯化标签的使用可简化这一过程。本文所述的肽一经回收，即可用于制备如本文所述的组合物。

无论哪种实施方案，根据本文所述的方面的试剂可经由药物组合物或制剂施用。因此，本文例示的另一方面包括药物组合物或制剂，其包含根据本文例示的方面的一种或多种肽或肽试剂、药学上可接受的载体以及任选地活性剂。

本文所述的肽或肽试剂可以适于破坏上皮细胞中的TJ功能的量存在。例如，所述肽试剂按重量计可以如下的量存在:约0.000001至约25％、约0.000001至约20％、约0.000001至约15％、约0.000001至约10％、约0.000001至约5％、约0.000001至约4％、约0.000001至约3％、约0.000001至约2％、约0.000001至约1％、约0.00001至约25％、约0.00001至约20％、约0.00001至约15％、约0.00001至约10％、约0.00001至约5％、约0.00001至约4％、约0.00001至约3％、约0.00001至约2％、约0.00001至约1％、约0.0001至约25％、约0.0001至约20％、约0.0001至约15％、约0.0001至约10％、约0.0001至约5％、约0.0001至约4％、约0.0001至约3％、约0.0001至约2％、约0.0001至约1％、约0.001至约25％、约0.001至约20％、约0.001至约15％、约0.001至约10％、约0.001至约5％、约0.001至约4％、约0.001至约3％、约0.001至约2％、约0.001至约1％、约0.01至约25％、约0.01至约20％、约0.01至约15％、约0.01至约10％、约0.01至约5％、约0.01至约4％、约0.01至约3％、约0.01至约2％、约0.01至约1％、约0.1至约25％、约0.1至约20％、约0.1至约15％、约0.1至约10％、约0.1至约5％、约0.1至约4％、约0.1至约3％、约0.1至约2％或约0.1至约1％。所述肽试剂可以如下的浓度存在:小于约500μM、小于约400μM、小于约300μM、小于约200μM、小于约100μM、小于约50μM、小于约40μM、小于约30μM、小于约20μM、小于约15μM、小于约10μM、小于约9μM、小于约8μM、小于约7μM、小于约6μM、小于约5μM、小于约4μM、小于约3μM、小于约2μM、小于约1μM、小于约0.9μM、小于约0.8μM、小于约0.7μM、小于约0.6μM、小于约0.5μM、小于约0.4μM、小于约0.3μM、小于约0.2μM、小于约0.1μM、小于约0.09μM、小于约0.08μM、小于约0.07μM、小于约0.06μM、小于约0.05μM、小于约0.04μM、小于约0.03μM、小于约0.02μM或小于约0.01μM。

如本文所用，术语“活性剂”意指意图对个体起作用的试剂。活性剂包括不限于意图用于疾病的诊断、治愈、治疗或预防的治疗剂。术语“药物”和“治疗剂”可互换使用并且意图具有其最广泛解释，即递送至活的生物体以产生所需的、通常有益的效应的任何治疗活性物质。一般来说，这包括在所有主要的治疗领域中的治疗剂，包括但不限于抗感染剂、抗生素、抗病毒剂、镇痛剂、芬太尼、舒芬太尼、丁丙诺啡、镇痛剂组合、麻醉剂、减食欲剂、抗关节炎药、镇喘剂、特布他林、抗惊厥药、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、止泻药、抗组胺剂、抗炎剂、抗偏头痛制剂、抗运动病药物、东莨菪碱、昂丹司琼、止恶心药、抗肿瘤药、抗帕金森病药物、心脏兴奋剂(cardiostimulant)、多巴酚丁胺、止痒剂、抗精神病药、退热剂、抗痉挛药、胃肠和泌尿器官、抗胆碱能药、拟交感神经药、黄嘌呤衍生物、心血管制剂、钙通道阻断剂、硝苯地平、β-阻滞剂、β-激动剂、沙丁胺醇、利托君、抗心律失常药(antiarrythmic)、抗高血压药、阿替洛尔、ACE抑制剂、利尿剂、血管舒张剂、冠状动脉、周围以及脑、中枢神经系统兴奋剂、咳嗽和感冒制剂、减充血剂、诊断剂、激素、甲状旁腺激素、生长激素、胰岛素、催眠剂、免疫抑制剂、肌肉松弛剂、副交感神经阻滞药、拟副交感神经药、抗氧化剂、烟碱、前列腺素、精神兴奋药、镇静剂、安定剂、皮肤作用抗氧化剂、类胡萝卜素、抗坏血酸(维生素C)、维生素E、抗皱剂、类维生素A、视黄醇(维生素A醇)、α-羟基酸、β-羟基酸、水杨酸、组合羟基酸和多羟基酸以及水解和可溶性胶原蛋白、透明质酸、抗脂肪团剂、氨茶碱、皮肤漂白剂、视黄酸、氢醌、过氧化物、植物学制剂或萃取物和其组合。另外的治疗剂包括一种或多种存在于疫苗组合物中的抗原试剂。抗原试剂可包括蛋白或多肽、核酸、脂质、碳水化合物、脂多糖等，其意图诱导针对病原体、感染细胞或特征在于疾病状态的细胞(例如癌细胞)的免疫反应。

术语“药学上可接受的载体”是指任何适合的佐剂、载体、赋形剂或稳定剂，并且可呈固体或液体形式，如片剂、胶囊、粉末、溶液、混悬液或乳液。在根据本文例示的方面的某些实施方案中，载体可呈洗剂、乳膏、凝胶、乳液、软膏、溶液、混悬液、泡沫或糊剂的形式。

在一个实施方案中，载体包括水包油乳液。在一个实施方案中，载体包括缓血酸胺乙醇(tromethaneethanol)、聚乙二醇、甘油、丙二醇、丙烯酸酯、卡波普、纯化水、苄醇、十六烷醇、柠檬酸、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、油醇、鲸蜡硬脂醇硫酸酯钠、氢氧化钠、十八烷醇、白凡士林、矿物油、碳酸丙二酯、白蜡、石蜡或其任何组合。

根据本文例示的方面的组合物和/或载体也可呈包含表面活性剂的水溶液的形式，尤其当改变TJ屏障功能的试剂不可溶或仅仅部分可溶于水性载体中时。根据本文例示的方面的适合表面活性剂包括例如非离子表面活性剂多元醇。在一个实施方案中，所述表面活性剂为F-127。可使用其它已知的表面活性剂或增溶剂添加剂。实例包括但不限于增溶剂，如Tween20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯)、Tween40(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单棕榈酸酯)、Tween80(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯)、F-127、F-68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)、PEG(聚乙二醇)、非离子表面活性剂如聚山梨醇酯20或80或泊洛沙姆184或188、多元醇、其它嵌段共聚物，以及螯合剂，如EDTA和EGTA。

根据本文例示的方面的组合物也可包括专用于递送至肺上皮的肺表面活性剂制剂。例如，可经过改性以根据本文例示的方面使用的适合制剂包括WO2013/120058和WO2008/011559中所述的那些，所述专利据此以引用的方式整体并入。所述组合物可容易地形成脂质体囊泡，所述囊泡可用于向患者递送本文所述的所有类别的试剂。所述组合物的施用可为用于递送治疗剂至靶组织的任何适合方法，包括吸入、气道滴注、烟雾化、雾化、鼻内滴注、经口或鼻饲滴注、腹膜内注射或血管内注射。靶组织可为肺组织或全身组织。欲递送的一种或多种试剂可为任何药物或治疗剂，包括本文所述的那些。

本文所述的表面活性剂和/或添加剂可以单独使用或按重量计以如下的量组合使用：例如约0.001至约5.0％、约0.001至约4.0％、约0.001至约3.0％、约0.001至约2.0％、约0.001至约1.0％、约0.005至约5.0％、约0.005至约4.0％、约0.005至约3.0％、约0.005至约2.0％、约0.005至约1.0％、约0.01至约5.0％、约0.01至约4.0％、约0.01至约3.0％、约0.01至约2.0％、约0.01至约1.0％、约0.025至约5.0％、约0.025至约4.0％、约0.025至约3.0％、约0.025至约2.0％、约0.025至约1.0％、约0.05至约5.0％、约0.05至约4.0％、约0.05至约3.0％、约0.05至约2.0％或约0.05至约1.0％。在一个实施方案中，所述组合物包含约0.12％的表面活性剂(例如F-127)。在一个实施方案中，所述组合物包含约0.006％的表面活性剂(例如F-127)。

根据本文例示的方面的组合物可包含如上文所述的适合的载体。所述药物组合物可配制用于局部(如上文关于经上皮、经皮或经粘膜制剂所述)或通过任何其它适合的手段施用。例如，所述组合物可配制用于经口、肠胃外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、通过鼻内滴注、通过植入、通过腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病灶内、经皮或通过施加于粘膜施用。所述制剂可便利地以单位剂型呈现并且可通过药剂学领域中众所周知的任何方法来制备。载体可按重量计以例如约10至约99％、约20至约99％、约30至约99％、约40至约99％、约50至约99％、约60至约99％、约70至约99％、约80至约99％、约90至约99％的量存在。

本文所述的组合物包含如本文所述的肽连同药学上可接受的载体、表面活性剂中的一者或多者，以及任选地一种或多种如上文所述的治疗剂。例如，载体可按重量计以40-99％的量存在，表面活性剂可按重量计以所述组合物的多达5％的量存在，并且所述肽可按重量计以所述组合物的约0.000001至约25％的量存在。

典型地，组合物将含有按重量计约0.01至约90百分比(例如，多达约1、5、10、20、30、40、50、60、70、80或90百分比)的活性剂，连同佐剂、载体和/或赋形剂。例如，治疗剂可按重量计以如下的量存在：约0.01至约90％、约0.01至约80％、约0.01至约70％、约0.01至约60％、约0.01至约50％、约0.01至约40％、约0.01至约30％、约0.01至约20％、约0.01至约10％或约0.01至约5％、0.1至约90％、约0.1至约80％、约0.1至约70％、约0.1至约60％、约0.1至约50％、约0.1至约40％、约0.1至约30％、约0.1至约20％、约0.1至约10％或约0.1至约5％。

虽然个体需要可变化，但各组分的有效量的最佳范围的确定在本领域的技能内。治疗剂的典型剂量包含约0.01至约100mg/kg·体重。其它剂量可包含约0.1至约100mg/kg·体重或约1至约100mg/kg·体重。关于施用所述试剂的治疗方案也可由本领域普通技术人员容易地确定。即，施用频率和剂量的大小可通过常规最优化确立，优选地同时将任何副作用降至最低。

根据本文例示的方面的组合物和/或载体可包括人工囊泡。所述人工囊泡可为本领域技术人员已知的任何适合的人工囊泡。在根据本文例示的方面的某些实施方案中，所述人工囊泡可为微粒、纳米粒子等。所述人工囊泡将为本领域技术人员已知并且可包括任何适合的材料(例如BSA、聚合物微凝胶硅石)。在一个实施方案中，所述人工囊泡为脂质体或胶束。

脂质体为包含一个或多个封装水相的同心排序的脂质双层的囊泡。其通常不会渗漏，但如果膜中存在洞或孔隙，如果膜溶解或降解，或如果膜温度增加至相变温度，则可变为渗漏的。目前经由脂质体进行药物递送的方法需要脂质体载体最终变为可渗透的并且在靶位点处释放封装的药物。这可例如以被动方式实现，其中脂质体双层通过体内各种试剂的作用随时间降解。每种脂质体组合物将在循环中或体内其它位点处具有特征半衰期并且因此，通过控制所述脂质体组合物的半衰期，可略微调控所述双层降解的速率。

与被动药物释放形成对比，主动药物释放涉及使用试剂来诱导脂质体囊泡中的渗透性改变。可构建脂质体膜，使得当在脂质体膜附近环境变为酸性时，其变得不稳定(参见例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7851(1987)；Biochemistry28:908(1989)，其中每一者均据此以引用的方式整体并入)。例如当脂质体被靶细胞内吞时，其可被发送至将使所述脂质体不稳定并导致药物释放的酸性核内体。

或者，可对脂质体膜进行化学改性，使得酶作为涂层放置于所述膜上，所述酶慢慢地使脂质体不稳定。由于药物释放的控制取决于最初放置于所述膜中的酶的浓度，并无真实有效方式来调节或改变药物释放以实现“按需”药物递送。关于pH敏感性脂质体存在相同问题，因为只要脂质体囊泡与靶细胞接触，其就将被吞没并且pH的降低将导致药物释放。

不同类型的脂质体可根据Bangham等人,J.Mol.Biol.13:238-252(1965)；Hsu等人的美国专利号5,653,996；Lee等人的美国专利号5,643,599；Holland等人的美国专利号5,885,613；Dzau等人的美国专利号5,631,237；以及Loughrey等人的美国专利号5,059,421制备，所述专利中的每一者均据此以引用的方式整体并入。

如同脂质体，胶束也已被用于药物递送领域中。文献中已经描述多种不同的胶束制剂用于递送蛋白或多肽，并且已经描述适用于递送核酸的其它胶束制剂。任何适合的胶束制剂均适用于本文例示的治疗蛋白或多肽或核酸方面的递送。示例性胶束包括不限于描述于例如Choi等人的美国专利号6,210,717；和Kosak的美国专利号6,835,718中的那些，所述专利中的每一者均据此以引用的方式整体并入。

本文例示的另一方面为经上皮(例如经皮或经粘膜)药物制剂。所述药物制剂包含药学上可接受的载体；有效量的治疗剂；以及根据本文例示的方面的短暂地破坏紧密连接内的claudin-1的试剂。

本文例示的方面也可用于多肽和蛋白药物以及其它大分子药物的受控递送。这些大分子物质典型地具有至少约300道尔顿的分子量，并且更典型地在约300至40,000道尔顿范围内的分子量。在一个实施方案中，治疗剂大小为至少300道尔顿。在另一实施方案中，治疗剂大小为至少500道尔顿。在又一实施方案中，治疗剂大小为不小于300道尔顿。

在这一大小范围内的肽、蛋白和大分子的特定实例包括不限于LHRH、LHRH类似物(如布舍瑞林、戈那瑞林、那法瑞林和亮丙瑞林)、GHRH、GHRF、胰岛素、促胰岛激素(insulotropin)、肝素、降钙素、奥曲肽、内啡肽、TRH、NT-36(化学名称：N＝[[(s)-4-氧代-2-氮杂环丁基]羰基]-L-组氨酰基-L-脯氨酰胺)、立普雷辛(liprecin)、垂体激素(例如HGH、HMG、HCG、乙酸去氨加压素等)、卵泡类黄体素、αANF、生长因子(如生长因子释放因子(GFRF)、βMSH、生长激素抑制素、心房利尿钠肽、缓激肽、生长激素、血小板源生长因子)、天冬酰胺酶、硫酸博莱霉素、木瓜凝乳蛋白酶、胆囊收缩素、绒毛膜促性腺激素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、表皮生长因子、促红细胞生成素、依前列醇(血小板聚集抑制剂)、促卵泡激素、胰高血糖素、水蛭肽和水蛭素的其它类似物、透明质酸酶、干扰素、胰岛素样生长因子、白细胞介素-1、白细胞介素-2、尿促性素(尿促卵泡素(FSH)和LH)、催产素、链激酶、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、尿激酶、加压素、去氨加压素、ACTH类似物、ANP、ANP清除抑制剂、血管紧张素II拮抗剂、抗利尿激素激动剂、抗利尿激素拮抗剂、缓激肽拮抗剂、CD4、西利酶(ceredase)、CSF、脑啡肽、FAB片段、IgE肽抑制因子、IGF-1、神经肽Y、神经营养因子、寡脱氧核苷酸和其类似物(如反义RNA、反义DNA和抗基因核酸)、阿片肽、集落刺激因子、甲状旁腺激素和激动剂、甲状旁腺激素拮抗剂、前列腺素拮抗剂、喷替吉肽、蛋白C、蛋白S、雷莫拉宁、肾素抑制剂、胸腺素α-1、溶血栓药、TNF、疫苗、加压素拮抗剂类似物、α-1抗胰蛋白酶(重组)以及TGF-β。

相应地，本文例示的另一方面涉及一种施用如本文所述的药物组合物的方法。所述方法涉及向受试者上的上皮位点施加如本文所述的药物组合物。还预期一种向受试者施用经上皮药物制剂的方法。所述方法涉及向受试者上的上皮位点施加根据本文例示的方面的经上皮药物制剂。

或者，所述药物组合物可为疫苗。在一个实施方案中，所述疫苗为经上皮疫苗制剂，其将受益于在疫苗递送位点处的TJ破坏。所述经上皮疫苗制剂可为适用于施用于任何上皮位点的制剂，所述位点包括皮(例如经皮制剂)和粘膜。在一个实施方案中，所述经上皮疫苗制剂为经皮疫苗制剂。所述经皮疫苗通常以由使用者佩戴的贴片的形式呈现，由此来自疫苗接受者的身体的水分允许穿过皮肤(即，在施加位点处)递送活性剂。

本文例示的方面的经上皮疫苗制剂可包含药学上适合的载体；有效量的存在于所述载体中的抗原或抗原编码核酸分子，任选地一种或多种佐剂；以及根据本文例示的方面的短暂地破坏紧密连接内的claudin-1功能的试剂。所述制剂在经上皮递送媒介物中提供，如本领域已知的。

在例如表皮表面处的疫苗接种可通过用根据本文例示的方面的试剂靶向表皮中的朗格汉斯细胞来实现。类似策略已被用于用claudin-4特异性肽靶向粘膜表面中的M细胞(Lo等人,“MCellTargetingbyaClaudin4TargetingPeptideCanEnhanceMucosalIgAResponses,”BMCBiotech.12:7(2012)，其据此以引用的方式整体并入)。

任何适合的抗原或抗原编码核酸分子或其组合均可用于本文例示的方面的疫苗制剂中。疫苗抗原的示例性种类包括不限于过敏原、源于病原体的免疫原性亚单元、病毒样颗粒、减毒病毒颗粒或缀合至免疫原性多肽的糖蛋白或糖脂。抗原编码核酸分子可呈裸DNA或表达载体以及感染性转化载体的形式。

在某些实施方案中，抗原(例如过敏原)偶合于佐剂。

多种已知的经上皮疫苗制剂可被改性以包含改变上皮细胞中的TJ屏障功能的试剂。

一种可被改性的示例性经皮疫苗制剂描述于Lisziewicz等人的美国专利号6,420,176中，所述专利据此以引用的方式整体并入。例如，载体可包括糖、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺衍生物和脂质体连同其衍生物中的一者或多者。这种类型的一种优选载体为甘露糖基化聚乙烯亚胺。DermaVir经皮递送系统被认为采用这些类型的载体。

另一种可被改性的示例性经皮疫苗制剂描述于Buschle等人的美国专利号6,869,607中，所述专利据此以引用的方式整体并入。例如，载体可包括基本上不含无机盐离子并且包含一种或多种能够使疫苗等渗或低渗的水溶性或水可乳化物质(例如麦芽糖、果糖、半乳糖、蔗糖、糖醇、脂质；或其组合)以及佐剂的溶液或乳液，所述佐剂为任选用糖基改性的聚阳离子(例如聚赖氨酸或聚精氨酸)。根据一个实施方案，所述佐剂可为聚阳离子和免疫刺激CpG或非CpG寡脱氧核苷酸的组合。这种佐剂的一种形式为Intercell佐剂IC31。

又一种可被改性的示例性疫苗制剂描述于Rose的美国专利号7,247,433中，所述专利据此以引用的方式整体并入。例如，HPV病毒样颗粒可与药学上可接受的载体一起并且以或不以大肠杆菌LTR192G作为佐剂的的情况下施用。

如上所述，根据本文例示的方面的制剂(包括疫苗制剂)可经由吸入、气道滴注、烟雾化、雾化、鼻内滴注、经口或鼻饲滴注、腹膜内注射或血管内注射递送。根据本文例示的方面的疫苗制剂的肺递送可根据本领域技术人员已知的技术进行(参见例如Lu等人,“PulmonaryVaccineDelivery,”ExpertRev.Vaccines6(2):213-226(2007)，其据此以引用的方式整体并入)。可被改性的示例性疫苗制剂描述于美国专利申请公布号2013/0183336中，所述公布据此以引用的方式整体并入。用于递送根据本文例示的方面的疫苗制剂的适合装置包括例如喷雾器(参见例如美国专利申请公布号2013/0032140，其据此以引用的方式整体并入)。

如上所述，根据本文例示的方面的所述疫苗制剂可包含表面活性剂。除上文所述的那些，根据本文例示的方面使用的适合表面活性剂包括适合用于适用于肺递送的疫苗制剂的那些(参见例如Lu等人,“PulmonaryVaccineDelivery,”ExpertRev.Vaccines6(2):213-226(2007)，WO2013/120058和WO2008/011559，其据此以引用的方式整体并入)。

相应地，本文例示的方面的另一方面涉及一种向受试者施用经上皮疫苗制剂的方法。所述方法涉及向所述受试者上的上皮位点施加本文例示的方面的经上皮疫苗制剂。

欲根据本文例示的方面处理的上皮(例如皮肤)区域取决于用于递送的预期目的。例如，对于经皮药物或疫苗递送，所述药物或疫苗可施用于如上臂、背部等的皮肤区域。所述药物或疫苗也可经由如本文所述的其它途径施用。

本文例示的方面的又一方面涉及一种经皮递送装置或贴片。所述经皮药物递送装置包括根据本文例示的方面的试剂或经皮疫苗或药物制剂。在一个实施方案中，所述经皮贴片包括背衬材料、与所述背衬材料的第一部分接触的粘合剂材料；以及包含所述试剂或经皮疫苗或药物制剂的药物存储材料，其中所述药物存储材料与所述背衬材料的第二部分接触。在一个实施方案中，所述贴片还包括欲在应用于皮肤后撤除的可去除衬垫材料。

经皮贴片领域中已知的任何适合的背衬材料(如透气材料)均可根据本文例示的方面使用。所述背衬为柔性的，以使得所述器件与皮肤相符。示例性背衬材料包括用于压敏性胶带的常规柔性背衬材料，如聚乙烯(尤其低密度聚乙烯、线性低密度聚乙烯、高密度聚乙烯)、聚酯、聚对苯二甲酸乙二酯、随机取向的尼龙纤维、聚丙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚氨酯、人造丝等。分层背衬也适合，如聚乙烯-铝-聚乙烯复合物。所述背衬对于所述药物存储材料的成分应大体上为惰性的。

适用于本文例示的方面的粘合剂为任何皮肤病学上可接受的粘合剂。皮肤病学上可接受的粘合剂的实例包括但不限于丙烯酸树脂、天然和合成橡胶、乙烯乙酸乙烯酯、聚(α-烯烃)、乙烯醚、有机硅、其共聚物以及其混合物。在一个实施方案中，第一粘合剂层包括有机硅粘合剂(例如可购自Dow的BIO-PSA7-4302有机硅粘合剂)。

所述经皮贴片可任选地包括一种或多种用于存储或处置目的的离型衬垫。多种适合的离型衬垫为本领域中已知的。离型衬垫可由可任选地被金属化的聚合物材料制成。适合的聚合物材料的实例包括但不限于聚氨酯、聚乙酸乙烯酯、聚偏二氯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚对苯二甲酸丁二酯、纸和其组合。在某些实施方案中，离型衬垫经过硅化处理。在其它实施方案中，离型衬垫涂覆有含氟聚合物，如涂覆有含氟聚合物的PET(例如来自3M^TM的SCOTCHPAK^TM9744)。

所述药物存储材料可为适合用作经皮贴片中的药物存储材料或储器的任何皮肤病学上可接受的材料。例如，所述药物存储材料可为聚合物。聚合物的实例包括微孔聚烯烃膜(例如来自SOLUTECH^TM的)、丙烯腈膜、聚乙基萘、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚酰亚胺、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、乙烯-乙酸乙烯酯(EVA)、其共聚物以及其混合物。在一个实施方案中，所述聚合物为EVA。在另一实施方案中，所述聚合物为具有按重量计在约4％至约19％范围内的乙酸乙烯酯含量的EVA。在一个优选实施方案中，所述聚合物为具有按重量计约9％的乙酸乙烯酯含量的EVA。所述药物存储材料也可包括用于贴附于其它组分的可热密封材料。例如，所述可热密封可渗透层可为EVA膜，如可购自3M^TM的COTRAN^TM9702。

现在参见图13A至13D，图13A为根据本文例示的方面的经皮贴片的一个实施方案的透视图。图13B为图13A的经皮贴片10沿轴C的横断面。在一个实施方案中，经皮贴片10包括背衬12、粘合剂材料14以及药物存储材料16。另外，经皮贴片10可任选地包括可去除衬垫18，其在应用于皮肤后撤除，如图13C中所示。图13D为图13A的经皮贴片10沿轴D的横断面视图。

还预期包括根据本文例示的方面的组合物的其它递送装置。所述装置包括适用于经由吸入、气道滴注、烟雾化、雾化、鼻内滴注、经口或鼻饲滴注、腹膜内注射或血管内注射递送根据本文例示的方面的组合物的那些。示例性装置包括吸入器或喷雾器(参见例如美国专利申请公布号2013/0032140，其据此以引用的方式整体并入)。

本文例示的另一方面涉及一种破坏上皮屏障的方法。所述方法涉及向上皮位点施加有效破坏存在于所述位点处的角化细胞中的claudin-1的量的根据本文例示的方面的试剂，由此破坏在所述上皮位点处的屏障形成。还预期通过向上皮位点施加本文所述的药物组合物，由此破坏在所述上皮位点处的屏障形成来破坏上皮屏障的方法。

实施例

提供以下实施例来例示本文要求保护的主题的实施方案，但绝不意图限制其范围。

用于实施例的材料和方法

材料

TentagelRinkAmide树脂，RappPolymere；Fmoc氨基酸和激活剂，P3Biosystems或AdvancedChemtech；无水DMF和哌啶，AlfaAesar；DIPEA，TCIAmerica；细胞培养基、EdU试剂盒以及荧光标记试剂来自LifeTechnologies(Gibco,Invitrogen)；抗体，Invitrogen；WST1，ClonClontech；Transwells，Corning；生物素、炔丙基胺、KBr、Pluronic以及所有其它试剂均来自Sigma。

肽合成：

使用标准固相Fmoc肽合成方法。肽1(R-SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLSSTLQATR-NH₂)(SEQIDNO:5)和相应乱序序列肽2(R-SILTGVSTLDQSLKQLSNFSQAVSTQSSR-NH₂)(SEQIDNO:6)由自由N端(a)或用于后续标记的生物素-N-炔丙基甘氨酸标签(b)合成。TentagelRinkAmide树脂(0.25mmol/g，90μm网孔大小，RappPolymere)在室温下手动装载(5eq.Fmoc-R，4.9eq.HBTU，10eq.DIPEA，双重偶合)。Aβ₄₀在TentagelWang(0.3mmol/g，90μm网孔大小，RappPolymere)上合成并且FKFE₂(FKFEFKFE-NH₂)在聚苯乙烯MBHARink酰胺树脂(0.2mmol/g，90μm网孔大小，Adv.Chemtech)上合成。在LibertyCEM微波合成器上在β-分支残基后使用双重或三重偶合并且以HBTU(对于肽2)或HATU(对于肽1)作为激活剂进行Fmoc固相肽合成。对于未标记肽，去除末端Fmoc并且N端保留无保护。对于标记肽，通过亚单体类肽合成添加Nyl：用于标记肽的树脂用无胺DMF洗涤，用20eq.溴乙酸和24eq.二异丙基碳化二亚胺溴乙酰化20分钟，用无胺DMF和DCM洗涤，并且用炔丙基胺(20eq.)置换溴。生物素使用2.5eq.生物素、2.45eq.HATU、5eq.DIPEA在5:4:1NMP/DMF/DMSO中进行双重偶合。

肽用70％三氟乙酸/28％DCM/1％三异丙基硅烷/1％H₂O裂解1小时，树脂用纯TFA洗涤并且用裂解混合物汇集。通过旋转蒸发去除TFA并且通过醚沉淀收集肽。肽存储于-80℃下直至纯化。肽压片溶解于最少量的DMSO中然后于55℃在7.2M胍HCl(≥25％DMSO)中通过超声处理变性20分钟。变性粗产物在55℃下孵育直至使用含有0.1％TFA的H₂O/乙腈梯度进行高压液相色谱(“HPLC”)纯化(55℃下在ShimadzuLD-6AHPLC上的Waters半制备型C18柱)。评估纯度的分析HPLC(55℃下使用ShimadzuLC-2010AHPLC的C18柱)仅能够在纯化后即刻获得。肽为≥90％纯。进行1a和1b以及2a和2b的分析HPLC。虽然1a和2a在纯化后即刻通过分析HPLC获得单峰，但两种肽均无法在Pluronic中制备后通过分析HPLC检测到。这种行为是自组装肽所特有的，所述自组装肽自发地形成过大而无法进入分析C18柱的结构。自组装材料的可靠解聚无法通过用于其它淀粉状蛋白的标准方法实现，如TFA/HFIP或NaOH(LeVine“Alzheimer’sβ-PeptideOligomerFormationatPhysiologicConcentrations,”Anal.Biochem.335:81–90(2004)；Teplow,“PreparationofAmyloidβ-ProteinforStructuralandFunctionalStudies,”MethodsinEnzymologyAmyloid,Prions,andOtherProteinAggregates,PartC.ElsevierAcademicPress,Boston,第20–33页,(2006)；Zhao等人,“Amyloid-βPeptideIsaSubstrateoftheHuman20SProteasome,”ACSChem.Neurosci.1:655–660(2010)；Cao等人,“EstertoAmideSwitchPeptidesProvideaSimpleMethodforPreparingMonomericIsletAmyloidPolypeptideunderPhysiologicallyRelevantConditionsandFacilitateInvestigationsofAmyloidFormation,”J.Am.Chem.Soc.132:4052–4053(2010)，其据此以引用的方式整体并入)。肽1a和2a仅含有单一苯丙氨酸(ε_257.5＝195cm^-1/M)，并且Pluronic的使用妨碍了在214nm下通过UV分光光度法的分析。因此，在溶解后通过BCA测定确定肽浓度。

通过基质辅助激光解吸附/电离-飞行时间(“MALDI-TOF”)质谱法(在BrukerAutoflexIII上使用α-氰基-4-羟基肉桂酸基质和线性、正离子模式)确定质量。纯化的肽经冻干用于存储。肽1a的MALDI-MS测量出单一同位素质量3080.59和观测质量((m+1)/z)3085.42。肽2a的MALDI-MS测量出单一同位素质量3080.59和观测质量((m+1)/z)3084.80。标记的肽1b的MALDI-MS测量出单一同位素质量3401.71和观测质量((m+1)/z)3405.10。标记的肽2b的MALDI-MS测量出单一同位素质量3401.71和观测质量((m+1)/z)3407.22。

在使用之前，肽原纤维在含有0.12％Pluronic的无菌、滤过的磷酸盐缓冲生理盐水中于55℃通过超声处理20分钟制备。通过BCA测定(Pierce)确定肽浓度。在0.12％pluronicF-127/PBS中制备20倍肽储备液，接着稀释20倍于含有1％热灭活胎牛血清的磷酸盐缓冲液、PBS或DMEM中并且在37℃下孵育18-24小时，然后进行细胞暴露或生物物理分析，从而关于媒介物和肽样品维持恒定表面活性剂浓度(0.006％F127)。

圆二色性(CD)

在含有0.12％F-127的10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中制备2mM肽储备液。这些储备液用1mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释至100μM和1μM并且在25℃下孵育3天。在AvivCD分光光度计上于25℃下石英比色皿中使用2.0nm带宽每2.0nm步进扫描4s获得光谱。数据未平滑化。

傅里叶变换红外光谱法(FTIR)和X射线衍射(XRD)

肽原纤维(100μM)于37℃下在PBS中孵育1周，通过离心收集，用2mMHCl洗涤并且冻干平行样。对于FTIR，制备KBr压片并且在ShimadzuFTIR分光计上使用2cm^-1分辨率进行512次扫描。扣除背景并且将光谱标准化，未应用平滑化。在CornellCenterforMaterialsResearch在BrukerX8APEXIIX射线衍射仪上进行粉末衍射研究。

透射电子显微镜(TEM)和肽晶体

将10μL含120μM成熟原纤维的PBS施加于200目碳涂覆的铜网5分钟。网用蒸馏水洗涤三次以去除过量盐并且用10μL滤过的5％乙酸铀酰染色5分钟。在每一步骤后通过毛细管作用去除过量溶液并且在使用前将网干燥。使用Hitachi7650透射电子显微镜以高对比度模式使用80kV的加速电压将原纤维成像。肽晶体于4℃下在含有具有25％甘油和0.02-0.04％Pluronic的PBS的倒置液滴中生长。

硫代黄素T

肽储备液在0.12％Pluronic中制备并且在室温下平衡48小时。将这些储备液稀释20倍于含有1％血清的PBS或DMEM中的10μM硫代黄素T中并且在4℃下存储24小时。在Greinerμ-透明底部384孔板中在TecanM1000荧光读板仪(λ_ex＝450nm并且λ_em＝482nm，具有10nm狭缝宽度)上测量荧光性。

细胞培养

人类支气管上皮细胞(16HBE)于含有10％热灭活胎牛血清、10mMHEPES、青霉素、链霉素以及两性霉素的DMEM中在胶原蛋白涂覆的聚苯乙烯上生长，每2-3天更换新鲜培养基。细胞以所指示的密度涂板并且生长持续所指示的时期。将肽稀释20倍于含有1％热灭活胎牛血清的DMEM(含有2mML-谷氨酰胺但缺乏酚红的Gibco#31053)中并且在37℃下孵育18小时，然后暴露。PluronicF-127浓度(在细胞培养基中0.006％)在媒介物对照与含肽样品之间一致。使细胞适应相同培养基18小时，然后肽暴露。

功能测定：

关于经上皮电阻(TER)和渗透性实验(其结果分别显示于图4A-4B中)，细胞以75,000个/0.33cm²细胞小室(transwell)(CorningTW，0.4μM孔隙，聚酯)的密度涂板并且生长5-6天，然后适应/肽暴露。TER测量值由筷子电极使用WorldPrecisionInstruments伏欧计获取，并且表述为所测量的(细胞电阻-不具有细胞的TW插入物的电阻)/TW插入物的表面积。TER在肽暴露前(时间＝0)以及在其后所指示的时间点测量。在24小时测量后，对照TW用1％TritonX-100溶解。关于渗透性通量测定，将1/10体积的0.2％荧光素钠或40kDFITC-葡聚糖(600μg/mL最终顶端浓度)与标记的Synagis单克隆抗体的混合物添加至顶端腔室中并且在37℃下将细胞孵育30分钟或18小时。Synagis单克隆抗体用-琥珀酰亚胺酯根据制造商的说明书进行标记，使用离心过滤去除未反应的荧光团，并且标记的抗体再悬浮于含有FITC标记的40kD葡聚糖的PBS中。基底介质中的荧光性在TecanM1000荧光读板仪中使用Greinerμ-透明底部384孔板(对于荧光素和FITC-葡聚糖，λ_ex＝494nm并且λ_em＝512nm，且对于λ_ex＝578nm并且λ_em＝605nm，使用10nm狭缝宽度)读数。结果在图3E中示出。误差表示为平均值的标准误差，并且相对于媒介物对照的显著性使用双尾t测试指示其中P<0.05。关于TER和荧光素渗透性实验，n＝8。关于肽洗出和FD-40和标记的单克隆抗体(“AF-mAb”)渗透性后的屏障恢复，n＝4。

细胞毒性：

关于细胞毒性测量，细胞以7,500个/孔的密度在96孔板中涂板并且生长一天，随后在含有1％热灭活胎牛血清的DMEM中适应。细胞暴露于媒介物或肽4、12或24小时。对照细胞用1％TritonX-100溶解15分钟，作为阴性对照。将10xWST1储备液(Clontech)添加至各孔中，并且在37℃下将细胞孵育12分钟。去除培养基并且在PerkinElmerUV/Vis读板仪上立即对WST1吸光度读数(WST1A₄₅₀–背景A₆₂₀)。误差表示为平均值的标准误差，并且指示相对于未处理对照的显著性(P<0.05)。关于细胞毒性实验，n＝4。呈现代表性数据。

免疫荧光：

关于免疫组织化学标记，细胞以1.2x10⁵个细胞/1.2cm²盖玻片的密度在12孔板中涂板并且在含有10％热灭活胎牛血清的DMEM中培养4-5天。在肽暴露前一天，培养基更换为DMEM/1％血清。细胞在37℃下暴露于肽4或12小时。盖玻片用含钙的PBS(Gibco)洗涤三次，固定于冷甲醇中并且用1％牛血清白蛋白阻断，接着染色。使用ClickItEdU试剂盒根据制造商的说明书(省略细胞暴露于EdU)使荧光团结合于炔丙基甘氨酸标记的肽。关于免疫荧光染色，细胞用第一抗体(1:500多克隆抗claudin1抗体和1:400单克隆抗封闭蛋白)孵育1小时，用PBS洗涤并且用抗兔和抗小鼠第二抗体(1:1000)染色。所使用的Cldn1抗体识别C端的表位并且不与肽交叉反应。盖玻片安装于含DAPI的Vectastain中并且在OlympusBX60荧光显微镜上成像。使用SPOT软件在无进一步数字操作下获取Cldn1和Ocln图像。

实施例1-上皮细胞中的结构化肽的表征和紧密连接的破坏

为了洞察TJ破坏性肽的结构和其作用机制，检查同源人类肽hCldn1(53-81,C54,64S)(SEQIDNO:5)(本文中称为“1a”或肽“1a”)的生物学和生物物理学特征。已发现，当在表面活性剂存在下溶解时，1a在比先前关于Cldn1肽所报道(Mrsny等人,“AKeyClaudinExtracellularLoopDomainIsCriticalforEpithelialBarrierIntegrity,”Am.J.Path.172:905–915(2008)；Zwanziger等人,“APeptidomimeticTightJunctionModulatortoImproveRegionalAnalgesia,”Mol.Pharm.9:1785–1794(2012)，其据此以引用的方式整体并入)的浓度低两个数量级的浓度下破坏培养细胞中的TJ。生物物理学表征表明，1a可形成在β折叠二级结构中富含的淀粉状蛋白样原纤维。相对于1a具有相同氨基酸含量、疏水性以及pI但具有随机序列的先前未知的乱序肽(本文中称为“2a”或肽“2a”)也采用β折叠构象，形成原纤维，并且破坏TJ。

当直接在缓冲液或细胞培养基中制备时，肽1a(参见图1A-1B)未良好表现。自支撑有机凝胶形成于二甲亚砜中。尽管乱序肽2a最初被指定为阴性对照，但这种肽显示与1a类似的物理行为，在单独缓冲液中形成聚集体并且还在DMSO中形成有机凝胶。筛选一系列表面活性剂来促进稳定肽结构的形成以改进处理显露出，纳入0.12％F-127(Khattak等人,“PluronicF127asaCellEncapsulationMaterial:UtilizationofMembrane-StabilizingAgents,”TissueEng.11:974–983(2005)，其据此以引用的方式整体并入)允许缓冲液或细胞培养基中1a或2a的溶解和随后稀释而无可见沉淀。

人类支气管上皮细胞(16HBE)用于对TJ屏障功能建模。16HBE细胞产生TJ屏障(在10％热灭活小牛血清中经上皮电阻TER＝800-1500Ω*cm²)，所述屏障持续14天。16HBE细胞用作比原代人类角化细胞更稳固的上皮TJ屏障模型，其实现不同程度的终末分化(例如TJ屏障功能)并且这在24小时内衰退。在用于肽暴露的低血清培养基中，16HBE细胞实现350–500Ω*cm²TER，其稳定达3-4天。通过免疫荧光染色持续地观察到Cldn1、Cldn4、Ocln以及ZO-1的细胞表面表达(图2A-2B)。

肽在顶端施加于完整TJ屏障以对局部应用建模。肽1a和2a均显示16HBETJ的剂量依赖性屏障破坏(图3A-3C)。在低达240nM的1a浓度下截至24小时或在12μM1a下截至8小时观察到TER的统计学显著(P<0.05)降低。用2.4μM1a孵育24小时后TER的65.9±6.9％下降与标记探针的渗透性的4.1±0.9倍(荧光素，0.4kDa)和11.2±0.9倍(FITC-葡聚糖，40kDa(“FD-40”))增加一致。12μM1a将对荧光素和FD-40的渗透性分别增强6.7±1.3倍和16.8±1.9倍。

具有相同大小、pI以及氨基酸组成但具有独特序列的乱序肽2a也以剂量依赖性方式破坏TJ屏障。暴露于2.4μM2a24小时使TER降低80±2.4％，并且相应地荧光素渗透性增加5.6±0.4倍和FD-40渗透性增加25.3±1.6倍。暴露于12μM2a引起几乎完全的TJ破坏，在24小时暴露后TER降低92±1.6％、荧光素渗透性增加16.4±2.2倍和FD-40渗透性增加30.5±3.0倍。这一结果证明对于TJ破坏而言乱序肽与基于Cldn1的序列1a一样有效。

先前报道描述了双侧应用100-300μM同源大鼠Cldn1肽以实现类似的TER和荧光素渗透效应(Mrsny等人,“AKeyClaudinExtracellularLoopDomainIsCriticalforEpithelialBarrierIntegrity,”Am.J.Path.172:905–915(2008)；Zwanziger等人,“APeptidomimeticTightJunctionModulatortoImproveRegionalAnalgesia,”Mol.Pharm.9:1785–1794(2012)，其据此以引用的方式整体并入)。在这些实验中观察到的增加的效力有可能归因于肽构象的差异，所述差异可能由肽处理方法引起。本文所述的方案使基于肽的屏障破坏方法进入更实际的浓度范围。

标记的治疗抗体(Synagis,168kD)的渗透也通过肽介导的TJ破坏增强(图3D)。抗体渗透分别由2.4和12μM肽1a增强2.5±0.2倍和3.2±0.4倍。此外，使用肽2a观察到略微更佳的渗透，其中使用2.4和12μM分别增强4.9±0.4倍和5.6±0.9倍。

添加至媒介物中以确保肽进入溶液中的Pluronic表面活性剂不会破坏TJ，如通过对TER的效应的缺乏或渗透性测定所证明(“媒介物”，图3A-3D和4A)。在相同浓度范围内测试的无关肽(2-12μM单体Aβ₄₀或(FKFE)₂)也不会降低TER。为了确保屏障破坏不是归因于细胞毒性效应，使近汇合培养物暴露于肽或媒介物1、4、12(图5A中所示的代表性实验)或24小时。在任何肽浓度或暴露时间下均未见WST1代谢的统计学显著差异。在洗出肽或媒介物后，TER值逐渐增加，表明16HBE培养物恢复屏障功能(图5B)。合起来，这些结果表明TJ破坏为肽特异性的并且对16HBE培养物不具细胞毒性。

使用免疫荧光染色，注意到肽1a和2a诱导TJ蛋白定位的类似改变(图6A-6H)。Cldn1和Ocln的特征性蜂巢图案化在未处理或媒介物处理的细胞中明显。观察到Cldn1和Ocln定位在暴露于1a或2a后12小时被扰乱(图6C和6D)。在细胞周边处的TJ染色受到的破坏与聚集体和/或弥漫性Cldn1染色一致。这些错误定位的Cldn1和Ocln的区域的大小和数目随肽浓度增加。这些图像证实，TJ网络在具有紊乱Cldn1定位的区域中受到破坏。

为了洞察TJ破坏的机制，合成标记的肽1b和2b。肽1b和2b用含有N-炔丙基甘氨酸残基的N-末端标签构建，以用于在肽暴露后通过铜催化的环加成进行生物正交标记。认为如与荧光团的直接加成相比，这种方法将最不可能改变肽的自组装特征。

曾预期标记的肽在细胞边界处结合于TJ结构并且共定位于特征性蜂巢图案中(类似于Mrsny等人关于大鼠Cldn1(53-80)所观察到的图案(Mrsny等人,“AKeyClaudinExtracellularLoopDomainIsCriticalforEpithelialBarrierIntegrity,”Am.J.Path.172:905–915(2008)，其据此以引用的方式整体并入)。或者，其可与Cldn1共定位于指示内吞作用的点状染色图案中，如由Zwanziger等人所观察到的(Zwanziger等人,“Claudin-DerivedPeptidesareInternalizedViaSpecificEndocytosisPathways,”Ann.NYAcad.Sci.1257:29–37(2012)，其据此以引用的方式整体并入)，Zwanziger等人报道了TAMRA标记的大鼠Cldn1(53-81,C54,64S)在暴露的第一个小时内通过网格蛋白介导的吸收和巨胞饮的组合被内吞。相反，1b和2b即使在低达240nM的浓度下均形成与细胞缔合的多分散性、μm级聚集体。在早期时间点很少乃至观察不到共定位肽和细胞Cldn1的点状染色。在4小时孵育后，与肽共定位的一些细胞Cldn1聚集。在多种情形中，在围绕标记肽群集的细胞周边处的细胞Cldn1蜂巢图案中观察到间隙(图6G和6H)，强有力地指示TJ破坏。可以推断，所观察到的对屏障功能的肽依赖性效应由Cldn1定位的改变而非直接地插入完整TJ结构中的肽引起。针对这些结果，1a和2a和其自组装结构的生物物理学特性的进一步表征得到保证。肽1a和2a均自发地在PBS(具有0.006％的最终F-127浓度)中形成原纤维。1a的原纤维(图7A和7C)为均一的，8.2±0.7nm宽而无明显扭曲，并且频繁地聚集成对齐的束。2a的原纤维为4.1±0.4nm宽(图7B和7D)，但采用不同形态，具有略微扭曲并且形成两股或多股的扭曲束和这些扭曲束的网样阵列。在两种制剂中通过TEM均观察到长达1μm的原纤维。

当在PBS或含有作为冷冻保护剂的甘油的PBS中稀释至200-300μM时，1a的晶体在几个小时内形成(图7E)。观察到针状和片状晶型。1a的晶体在X射线源中生成具有和反射的原纤维衍射图案(图9)，但衍射性能不足以进行高分辨率结构确定。关于1a和2a，X射线粉末衍射(XRD，图8A)生成相似的图案。均显示d-间距，这是延伸的β折叠所特有的，而肽2a具有另外的反射，指示交叉β结构。1a样品的有限结晶度排除了这种反射的分辨率。2a中另外的反射指示交叉β结构中的周期性扭曲(Inouye等人,“StructureofCoreDomainofFibril-FormingPHF/TauFragments,”Biophys.J.90:1774–1789(2006)，其据此以引用的方式整体并入)，与通过TEM观察到的原纤维一致。

当肽1a和2a溶解于F-127中并且稀释于PBS中时，通过圆二色性(CD)观察其显著二级结构(图8B)。在220nm处的最小值可指示多种二级结构单元的存在，如α/β或β折叠/β转角，而非严格α-螺旋构象(其最小值预期在210和222nm处)或排外地β折叠构象(预期最小值215-218nm)。在低达1μM(表示所用的分光计的检测极限)的浓度下关于1a和2a均观察到类似的圆二色性光谱(图8D)。这一结果意指这些肽以其单体形式结构化，或临界浓度(C_r)极低(为了比较，Aβ₄₂的C_r为约1μM(Hu等人,“AmyloidSeedsFormedbyCellularUptake,Concentration,andAggregationoftheAmyloid-BetaPeptide,”Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.106:20324–20329(2009)，其据此以引用的方式整体并入))。相信肽1和2的示例性阈浓度为<1μM；肽1a在240nM下的功能活性指示其C_r可能甚至更低。由表面活性剂或膜提供的两亲环境可能在结构形成中起作用。与水溶性原纤维相比，表面活性剂可显著地改变原纤维平衡和超微结构特征。

作为确认β折叠结构的另一条证据，1a和2a的冻干原纤维的FTIR光谱几乎完全相同(图8C)，在1664cm^-1和1628cm^-1处具有峰。解耦合骨架羰基在FTIR光谱的酰胺I区中典型地在1650cm^-1周围显示峰。从1650cm^-1至1628cm^-1的位移指示羰基氧通过其在延伸的β折叠中的取向而振动偶合(Zandomeneghi等人,“FTIRRevealsStructuralDifferencesBetweenNativeβ-SheetProteinsandAmyloidFibrils,”Prot.Sci.13:3314–3321(2009)；Shivu等人,“Distinctβ-SheetStructureinProteinAggregatesDeterminedbyATR-FTIRSpectroscopy,”Biochem.52(31):5176–5183(2013)，其据此以引用的方式整体并入)。关于反平行β折叠有时在1694cm^-1周围观察到峰，但这个峰并不明显。在1544cm^-1处的酰胺II峰支持有序二级结构的存在。标记的肽1b和2b的FTIR光谱显示于图8E中。

硫代黄素T结合可指示交叉β构象的存在(Biancalana等人,“MolecularMechanismofThioflavin-TBindingtoAmyloidFibrils,”BiochimicaetBiophysicaActa1804:1405–1412(2010)，其据此以引用的方式整体并入。肽原纤维在稀释于缓冲液或细胞培养基中时结合硫代黄素T。肽1a和2a(已经在0.12％F-127中制备)均在稀释后即刻显示最大荧光性，因此原纤维形成的动力学无法确定。硫代黄素T结合在低达240nM的肽浓度下为统计学显著的(P<0.005)。2a原纤维显示比1a原纤维大一个数量级的硫代黄素T荧光性，指示原纤维填充的形态学差异。全面考虑，1a和2a的生物物理学表征的结果强有力地表明这些肽原纤维具有与淀粉状蛋白一致的交叉β结构。1a和2a的硫代黄素T结合显示于图10A-10B中。

与淀粉状蛋白暴露相关的细胞毒性由细胞毒性寡聚物形成(Laganowsky等人,“AtomicViewofaToxicAmyloidSmallOligomer,”Science335:1228–1231(2012)，其据此以引用的方式整体并入)或细胞中基本亚稳蛋白的隔离(Olzscha等人,“Amyloid-LikeAggregatesSequesterNumerousMetastableProteinswithEssentialCellularFunctions,”Cell144(1):67–78(2011)，其据此以引用的方式整体并入)引起。通过允许肽自组装以在施加于细胞前实现平衡而在细胞暴露期间小心限制短暂寡聚物形成(Cecchi等人,“TheAmyloid-CellMembraneSystem.TheInterplayBetweentheBiophysicalFeaturesofOligomers/FibrilsandCellMembraneDefinesAmyloidToxicity,”Biophys.Chem.182:30-43(2013)，其据此以引用的方式整体并入)。采取这一预防措施是因为新鲜稀释的肽原纤维诱导显著细胞毒性，与其它淀粉状蛋白寡聚物的细胞毒性一致(参见图5C)(Doran等人,“TurnNucleationPerturbsAmyloidβSelf-AssemblyandCytotoxicity,”J.Mol.Biol.421:315-328(2012)，其据此以引用的方式整体并入)。在用于处于平衡状态下的肽1a和2a的功能浓度范围和时程内相对于媒介物对照未观察到这些细胞毒性效应(图5A-5B)。得出结论为肽暴露的功能效应不是归因于坏死性细胞死亡或对细胞自动调节的不当应力。

在淀粉状蛋白自组装中，β折叠构象由骨架和侧链相互作用的组合：疏水性、芳族和氢键形成所驱动。在原纤维的核心中，在两个β折叠的界面处的侧链互相交叉以形成立体拉链(Sawaya等人,“AtomicStructuresofAmyloidCross-βSpinesRevealVariedStericZippers,”Nature447:453–457(2007)；Nelson等人,“StructureoftheCross-βSpineofAmyloid-LikeFibrils,”Nature435:773–778(2005)，其据此以引用的方式整体并入)，所述拉链平行于原纤维轴。肽1a和2a具有55％的极性、不带电(S、Q、T以及N)和31％的疏水性残基。1a和2a的自组装有可能通过在这个界面处的侧链氢键稳定化。所述交叉β构象进一步通过一条平行于原纤维轴的疏水性残基表征(Biancalana等人,“MinimalistDesignofWater-SolubleCross-βArchitecture,”Proc.Acad.Nat’l.Sci.U.S.A.107:3469–3474(2010)，其据此以引用的方式整体并入)。淀粉状蛋白倾向序列的短区段可驱动自组装(Tsolis等人,“AConsensusMethodforthePredictionof‘Aggregation-Prone’PeptidesinGlobularProteins,”PLoSONE8:e54175(2013)；Teng等人,“ShortProteinSegmentsCanDriveaNon-FibrillizingProteinIntotheAmyloidState,”Prot.Eng.Des.Sel.22:531–536(2009)，其据此以引用的方式整体并入)。PEPFOLD建模(Thevenet等人,“PEP-FOLD:AnUpdatedDeNovoStructurePredictionServerforBothLinearandDisulfideBondedCyclicPeptides,”NucleicAcidsRes.40:W288–W293(2012)，其据此以引用的方式整体并入)预测了Cldn1肽的半胱氨酸环(残基53-65)中的β发夹结构，其中疏水性残基(I和V)在所述发夹的一个面对齐，其可能驱动交叉β填充。使用AMYLPRED2方法的回顾性分析(Tsolis等人,“AConsensusMethodforthePredictionof‘Aggregation-Prone’PeptidesinGlobularProteins,”PLoSONE8:e54175(2013)，其据此以引用的方式整体并入)披露了肽2a中的短区段(SEQIDNO:6)ILTGVST，预测所述区段为淀粉状蛋白倾向的。几种其它乱序序列在DMSO中也显示有机胶凝(参见图1C，以及基于CLDN1的棕榈酰基-Nyl-GGGMSCVSQSTGQIQCK-NH₂(SEQIDNO:28)；棕榈酰基-Nyl-GGSCVSQS-NH₂(SEQIDNO:29)；Npg-Nyl-RRGSCVSQSTGQIQCKGRR-NH₂(SEQIDNO:30)(Npg＝N-(亚乙基二氧基)₂)乙基氨基甘氨酸)；乱序Npg-Nyl-RRGISGVQCCQTKQSSGRR)(SEQIDNO:31)。肽2a因此代表自组装成淀粉状蛋白样原纤维的一系列极性、不带电序列中的一员。因为乱序肽2a与Cldn1共定位并且诱导与1a等价的功能效应，所以渗透增强活性不为序列特异性的。肽2a自组装并且具有相同氨基酸含量。所述数据并未表明其是否为肽原纤维本身的β折叠结构或为在两亲交叉β结构上形成图案的氢键供体/受体的表示，所述氢键供体/受体介导与Cldn1的缔合和紧密连接的破坏。Aβ₄₂改变血管上皮细胞的屏障功能，从而诱导Cldn5定位的改变(Marco等人,“AmyloidBeta-Peptide1-42AltersTightJunctionProteinDistributioninBrainMicrovesselEndothelialCells,”Neurosci.Lett.401:219-224(2006)，其据此以引用的方式整体并入)。一种有趣的可能性是淀粉状蛋白诱导的TJ组分的错误定位可能提供破坏TJ功能的一般机制并且这可能与包括阿尔兹海默病在内的多种人类疾病相关。发现2.4μMAβ₄₂破坏TJ，但比肽1a和2a程度小。

孤立存在的1a序列在表面活性剂存在下自组装成β折叠结构。淀粉状蛋白样原纤维表示针对这些合成肽的热力学有利的折叠状态，但不意指淀粉状蛋白为完整Cldn1蛋白的天然构象。没有证据表明claudin或其它TJ蛋白参与全身性淀粉样变性。然而，发现功能性淀粉状蛋白遍及原核生物和真核生物王国(Otzen等人,“WeFindThemHere,WeFindThemThere:FunctionalBacterialAmyloid,”CellMol.LifeSci.65:910–927(2007)，其据此以引用的方式整体并入)。例如，水生微生物的浮力细胞器(Bayro等人,“AnAmyloidOrganelle,Solid-StateNMREvidenceforCross-βAssemblyofGasVesicles,”J.Biol.Chem.287:3479–3484(2012)，其据此以引用的方式整体并入)以两亲淀粉状蛋白为内衬，从而提供气密性屏障。Cldn1自发地在细胞表面处自组装(Sasaki等人,“DynamicBehaviorofPairedClaudinStrandsWithinApposingPlasmaMembranes,”Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.100:3971–3976(2003)，其据此以引用的方式整体并入)，并且TJ的组织和调控通过蛋白-蛋白相互作用的复杂相互影响来介导(Rodgers等人,“EpithelialBarrierAssemblyRequiresCoordinatedActivityofMultipleDomainsoftheTightJunctionProteinZO-1,”J.CellSci.126:1565–1575(2013)，其据此以引用的方式整体并入)。原生Cldn1可能在细胞外蛋白-蛋白界面处具有显著β折叠特征，但将需要解决确定全长和/或膜结合Cldn1的结构的挑战性问题以便提出这种推测。

数据证明这些肽结合于Cldn1或密切接近Cldn1并且看起来改变Cldn1的细胞转运。相信这种改变的Cldn1定位引起TJ破坏，并且允许如抗体般大的分子通过培养物中的屏障。相对于先前随着非人类同系物公开的结果，如1a和2a的结构化肽改进的功效证明，其β折叠构象可结合Cldn1，虽然不清楚结合是发生在细胞表面处还是在内吞再循环期间。使用表面活性剂或膜用于肽结构可能为有利的。例如，可如本文所述将具有治疗性有效载荷或疫苗抗原的Cldn1肽配制至脂质体或胶束载体。

已经显示自组装迹象并且可根据本文例示的实施方案使用的另外的示例性肽见于图1C中

实施例2-使用紧密连接破坏性肽用于递送荧光素酶和疫苗抗原

如下进行荧光素酶渗透性实验。小鼠(每组4只小鼠)在麻醉后用单独媒介物(生理盐水中的0.006％PluronicF127)或用不同浓度的肽在鼻腔中进行处理。12或24小时后，施加10微克荧光素酶的溶液。接着在各时间点将小鼠成像以确定保留于鼻腔中的荧光素酶的量。如图11A-11F所示，肽1A的应用导致较大量的荧光素酶从鼻腔失去的趋势，与肽介导的渗透性增加一致。

如下用流感血凝素进行免疫实验。小鼠(每组4只小鼠)用单独媒介物(生理盐水中的0.006％PluronicF127)、媒介物加流感血凝素(HA)或媒介物加HA加透化剂(肽1A或2A，或精液源性病毒感染增强子(SEVI))在鼻腔中进行处理。在处理后第18、28以及35天评估血清中针对HA的抗体滴度，并且在处理后第48天在支气管灌洗中确定HA特异性IgG和IgA。血清抗体滴度(图12A-12C)和在支气管灌洗中的HA特异性抗体(图12D和12E)在肽1A或2A存在下均显示增强的趋势，与抗原递送的肽依赖性增加一致。

重要的是，在荧光素酶递送和抗原递送实验中的每一者中，在所测试的肽的最高剂量下(100微摩尔浓度)均未观察到毒性。

应了解，上文所公开的和其它特征和功能或其替代选择的变体可组合至多种其它的不同系统或应用中。本领域技术人员可随后进行其中各种目前无法预料或未曾预期的替代、修改、变化或改进，其也意图由以下权利要求书涵盖。

Claims

1.一种经上皮药物制剂，其包含：

药学上适合的载体；

有效量的治疗剂；以及

短暂地破坏紧密连接内的claudin-1的试剂，其中所述试剂包含包括至少40％的极性、不带电氨基酸残基和自组装β折叠二级结构的肽。

2.根据权利要求1所述的经上皮药物制剂，其中所述肽不由氨基酸序列SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLNSTLQATR(SEQIDNO:1)、SCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLNSTLQAT(SEQIDNO:2)、SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLSSTLQAT(SEQIDNO:3)或SCVSQSTGQ[I/V]QCKVFDSLLNLSSTLQAT(SEQIDNO:4)组成。

3.根据权利要求1所述的经上皮药物制剂，其中所述药物制剂为经皮或经粘膜药物制剂。

4.根据权利要求1所述的经上皮药物制剂，其中所述经上皮药物制剂包含多种所述肽并且其中所述多种肽形成一种或多种原纤维。

5.根据权利要求1所述的经上皮药物制剂，其中所述肽的氨基酸序列包含至少50％的极性、不带电氨基酸残基。

6.根据权利要求5所述的经上皮药物制剂，其中所述肽的氨基酸序列包含至少60％的极性、不带电氨基酸残基。

7.根据权利要求1所述的经上皮药物制剂，其中所述肽包含具有至少6个氨基酸残基的氨基酸序列。

8.根据权利要求1所述的经上皮药物制剂，其中所述肽包含具有少于53个氨基酸残基的氨基酸序列。

9.根据权利要求1所述的经上皮药物制剂，其中所述肽包含具有6至30个氨基酸残基的氨基酸序列。

10.根据权利要求9所述的经上皮药物制剂，其中所述肽包含氨基酸序列SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLSSTLQATR(SEQIDNO:5)、SILTGVSTLDQSLKQLSNFSQAVSTQSSR(SEQIDNO:6)、GGMSCVSQSTGQIQCKV(SEQIDNO:7)、SCVSQSTGQIQCKV(SEQIDNO:8)、RRGSCVSQSGRR(SEQIDNO:9)、ISGVQCCQTKQSS(SEQIDNO:10)、RRGVCSSSQGRR(SEQIDNO:11)、LWMSSVSQSTGQIQSKVFDS(SEQIDNO:12)、MSSVSQSTGQIQSKVFDS(SEQIDNO:13)、MSSVSQSTGQIQSKV(SEQIDNO:14)、MSSVSQST(SEQIDNO:15)、ISMSQQVSQSGVSDKFST(SEQIDNO:16)、SIMSGKQSSVQSQVT(SEQIDNO:17)、VSMSSTSQ(SEQIDNO:18)、VSSSSQ(SEQIDNO:19)、SILTGVST(SEQIDNO:20)、SSVSQSTG(SEQIDNO:21)、GQIQSKVG(SEQIDNO:22)、LNLSSTLQG(SEQIDNO:23)、NSVVQSTG(SEQIDNO:24)、GQMQSKVG(SEQIDNO:25)或SCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLSSTLQATR(SEQIDNO:26)。

11.根据权利要求1所述的经上皮药物制剂，其中所述肽为claudin-1氨基酸序列的乱序形式，其中所述claudin-1氨基酸序列包含claudin-1的细胞外环区域的至少6个氨基酸残基。

12.根据权利要求11所述的经上皮药物制剂，其中所述claudin-1氨基酸序列包含一个或多个半胱氨酸至丝氨酸的取代。

13.根据权利要求11所述的经上皮药物制剂，其中所述肽包含氨基酸序列SILTGVSTLDQSLKQLSNFSQAVSTQSSR(SEQIDNO:6)、ISGVQCCQTKQSS(SEQIDNO:10)、RRGVCSSSQGRR(SEQIDNO:11)、ISMSQQVSQSGVSDKFST(SEQIDNO:16)、SIMSGKQSSVQSQVT(SEQIDNO:17)、VSMSSTSQ(SEQIDNO:18)、VSSSSQ(SEQIDNO:19)或SILTGVST(SEQIDNO:20)。

14.根据权利要求1所述的经上皮药物制剂，其中所述试剂由所述肽组成。

15.根据权利要求1所述的经上皮药物制剂，其中所述载体包括表面活性剂。

16.根据权利要求1所述的经上皮药物制剂，其中所述载体包括水包油乳液。

17.根据权利要求1所述的经上皮药物制剂，其中所述载体包括脂质体或胶束。

18.一种人工囊泡，其包含根据权利要求1所述的药物制剂。

19.根据权利要求18所述的人工囊泡，其中所述人工囊泡为脂质体或胶束。

20.根据权利要求1所述的经上皮药物制剂，其中所述治疗剂选自由以下组成的组：抗感染剂、抗生素、抗病毒剂、镇痛剂、芬太尼、舒芬太尼、丁丙诺啡、镇痛剂组合、麻醉剂、减食欲剂、抗关节炎药、镇喘剂、特布他林、抗惊厥药、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、止泻药、抗组胺剂、抗炎剂、抗偏头痛制剂、抗运动病药物、东莨菪碱、昂丹司琼、止恶心药、抗肿瘤药、抗帕金森病药物、心脏兴奋剂、多巴酚丁胺、止痒剂、抗精神病药、退热剂、抗痉挛药、胃肠和泌尿器官、抗胆碱能药、拟交感神经药、黄嘌呤衍生物、心血管制剂、钙通道阻断剂、硝苯地平、β-阻滞剂、β-激动剂、沙丁胺醇、利托君、抗心律失常药、抗高血压药、阿替洛尔、ACE抑制剂、利尿剂、血管舒张剂、冠状动脉、周围以及脑、中枢神经系统兴奋剂、咳嗽和感冒制剂、减充血剂、诊断剂、激素、甲状旁腺激素、生长激素、胰岛素、催眠剂、免疫抑制剂、肌肉松弛剂、副交感神经阻滞药、拟副交感神经药、抗氧化剂、烟碱、前列腺素、精神兴奋药、镇静剂、安定剂、皮肤作用抗氧化剂、类胡萝卜素、抗坏血酸(维生素C)、维生素E、抗皱剂、类维生素A、视黄醇(维生素A醇)、α-羟基酸、β-羟基酸、水杨酸、组合羟基酸和多羟基酸以及水解和可溶性胶原蛋白、保湿剂、透明质酸、抗脂肪团剂、氨茶碱、皮肤漂白剂、视黄酸、氢醌、过氧化物、植物学制剂或萃取物和其组合。

21.根据权利要求1所述的经上皮药物制剂，其中所述治疗剂大于300道尔顿。

22.根据权利要求1所述的经上皮药物制剂，其中所述载体选自由以下组成的组：缓血酸胺乙醇、聚乙二醇、甘油、丙二醇、丙烯酸酯、卡波普、纯化水、苄醇、十六烷醇、柠檬酸、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、油醇、鲸蜡硬脂醇硫酸酯钠、氢氧化钠、十八烷醇、白凡士林、矿物油、碳酸丙二酯、白蜡、石蜡和其任何组合。

23.一种经上皮疫苗制剂，其包含：

药学上适合的载体；

有效量的存在于所述载体中的抗原或抗原编码核酸分子，和任选地一种或多种佐剂；以及

24.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述肽不由氨基酸序列SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLNSTLQATR(SEQIDNO:1)、SCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLNSTLQAT(SEQIDNO:2)、SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLSSTLQAT(SEQIDNO:3)或SCVSQSTGQ[I/V]QCKVFDSLLNLSSTLQAT(SEQIDNO:4)组成。

25.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述疫苗制剂为经皮或经粘膜疫苗制剂。

26.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述经上皮疫苗制剂包含多种所述肽并且其中所述多种肽形成一种或多种原纤维。

27.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述肽的氨基酸序列包含至少50％的极性、不带电氨基酸残基。

28.根据权利要求27所述的经上皮疫苗制剂，其中所述肽的氨基酸序列包含至少60％的极性、不带电氨基酸残基。

29.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述肽包含具有至少6个氨基酸残基的氨基酸序列。

30.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述肽包含具有少于53个氨基酸残基的氨基酸序列。

31.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述肽包含具有6至30个氨基酸残基的氨基酸序列。

32.根据权利要求31所述的经上皮疫苗制剂，其中所述肽包含氨基酸序列SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLSSTLQATR(SEQIDNO:5)、SILTGVSTLDQSLKQLSNFSQAVSTQSSR(SEQIDNO:6)、GGMSCVSQSTGQIQCKV(SEQIDNO:7)、SCVSQSTGQIQCKV(SEQIDNO:8)、RRGSCVSQSGRR(SEQIDNO:9)、ISGVQCCQTKQSS(SEQIDNO:10)、RRGVCSSSQGRR(SEQIDNO:11)、LWMSSVSQSTGQIQSKVFDS(SEQIDNO:12)、MSSVSQSTGQIQSKVFDS(SEQIDNO:13)、MSSVSQSTGQIQSKV(SEQIDNO:14)、MSSVSQST(SEQIDNO:15)、ISMSQQVSQSGVSDKFST(SEQIDNO:16)、SIMSGKQSSVQSQVT(SEQIDNO:17)、VSMSSTSQ(SEQIDNO:18)、VSSSSQ(SEQIDNO:19)、SILTGVST(SEQIDNO:20)、SSVSQSTG(SEQIDNO:21)、GQIQSKVG(SEQIDNO:22)、LNLSSTLQG(SEQIDNO:23)、NSVVQSTG(SEQIDNO:24)、GQMQSKVG(SEQIDNO:25)或SCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLSSTLQATR(SEQIDNO:26)。

33.根据权利要求32所述的经上皮疫苗制剂，其中所述claudin-1氨基酸序列包含一个或多个半胱氨酸至丝氨酸的取代。

34.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述肽为claudin-1氨基酸序列的乱序形式，其中所述claudin-1氨基酸序列包含claudin-1的细胞外环区域的至少6个氨基酸残基。

35.根据权利要求34所述的经上皮疫苗制剂，其中所述肽包含氨基酸序列SILTGVSTLDQSLKQLSNFSQAVSTQSSR(SEQIDNO:6)、ISGVQCCQTKQSS(SEQIDNO:10)、RRGVCSSSQGRR(SEQIDNO:11)、ISMSQQVSQSGVSDKFST(SEQIDNO:16)、SIMSGKQSSVQSQVT(SEQIDNO:17)、VSMSSTSQ(SEQIDNO:18)、VSSSSQ(SEQIDNO:19)或SILTGVST(SEQIDNO:20)。

36.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述试剂由所述肽组成。

37.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述载体包括表面活性剂。

38.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述载体包括水包油乳液。

39.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述载体包括脂质体或胶束。

40.一种人工囊泡，其包含根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂。

41.根据权利要求40所述的人工囊泡，其中所述人工囊泡为脂质体或胶束。

42.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述制剂包含选自以下组的抗原：过敏原、源于病原体的免疫原性亚单元、病毒样颗粒或减毒病毒颗粒。

43.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述制剂包含抗原编码核酸分子。

44.根据权利要求43所述的经上皮疫苗制剂，其中所述抗原选自以下组：过敏原、源于病原体的免疫原性亚单元、病毒样粒子或缀合至免疫原性多肽的糖蛋白或糖脂。

45.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述载体包括糖、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺衍生物和脂质体连同其衍生物中的一者或多者。

46.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述载体为甘露糖基化聚乙烯亚胺。

47.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述载体包括基本上不含无机盐离子并且包含一种或多种能够使所述疫苗等渗或低渗的水溶性或水可乳化物质的溶液或乳液，并且所述佐剂为任选用糖基改性的聚阳离子。

48.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述载体包括溶液或乳液，并且所述佐剂为聚阳离子和免疫刺激CpG或非CpG寡脱氧核苷酸的组合。

49.根据权利要求23所述的经上皮疫苗制剂，其中所述制剂不包含佐剂。

50.一种经皮贴片，其包含如权利要求1所述的经上皮药物制剂或如权利要求23所述的经上皮疫苗制剂。

51.根据权利要求50所述的经皮贴片，其进一步包含

背衬材料；

与所述背衬材料的第一部分接触的粘合剂材料；以及

包含所述经上皮药物或疫苗制剂的药物或疫苗存储材料，其中所述存储材料与所述背衬材料的第二部分接触。

52.如权利要求51所述的药物递送贴片，其中所述治疗剂选自由以下组成的组：抗感染剂、抗生素、抗病毒剂、镇痛剂、芬太尼、舒芬太尼、丁丙诺啡、镇痛剂组合、麻醉剂、减食欲剂、抗关节炎药、镇喘剂、特布他林、抗惊厥药、抗抑郁剂、抗糖尿病剂、止泻药、抗组胺剂、抗炎剂、抗偏头痛制剂、抗运动病药物、东莨菪碱、昂丹司琼、止恶心药、抗肿瘤药、抗帕金森病药物、心脏兴奋剂、多巴酚丁胺、止痒剂、抗精神病药、退热剂、抗痉挛药、胃肠和泌尿器官、抗胆碱能药、拟交感神经药、黄嘌呤衍生物、心血管制剂、钙通道阻断剂、硝苯地平、β-阻滞剂、β-激动剂、沙丁胺醇、利托君、抗心律失常药、抗高血压药、阿替洛尔、ACE抑制剂、利尿剂、血管舒张剂、冠状动脉、周围以及脑、中枢神经系统兴奋剂、咳嗽和感冒制剂、减充血剂、诊断剂、激素、甲状旁腺激素、生长激素、胰岛素、催眠剂、免疫抑制剂、肌肉松弛剂、副交感神经阻滞药、拟副交感神经药、抗氧化剂、烟碱、前列腺素、精神兴奋药、镇静剂、安定剂、皮肤作用抗氧化剂、类胡萝卜素、抗坏血酸(维生素C)、维生素E、抗皱剂、类维生素A、视黄醇(维生素A醇)、α-羟基酸、β-羟基酸、水杨酸、组合羟基酸和多羟基酸以及水解和可溶性胶原蛋白、保湿剂、透明质酸、抗脂肪团剂、氨茶碱、皮肤漂白剂、视黄酸、氢醌、过氧化物、植物学制剂或萃取物和其组合。

53.如权利要求51所述的药物递送贴片，其进一步包含选自由以下组成的组的药学上可接受的载体：缓血酸胺乙醇、聚乙二醇、甘油、丙二醇、丙烯酸酯、卡波普、纯化水、苄醇、十六烷醇、柠檬酸、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、油醇、鲸蜡硬脂醇硫酸酯钠、氢氧化钠、十八烷醇、白凡士林、矿物油、碳酸丙二酯、白蜡、石蜡和其任何组合。

54.一种分离肽，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SSVSQSTGQIQSKVFDSLLNLSSTLQATR(SEQIDNO:5)、SILTGVSTLDQSLKQLSNFSQAVSTQSSR(SEQIDNO:6)、GGMSCVSQSTGQIQCKV(SEQIDNO:7)、SCVSQSTGQIQCKV(SEQIDNO:8)、RRGSCVSQSGRR(SEQIDNO:9)、ISGVQCCQTKQSS(SEQIDNO:10)、RRGVCSSSQGRR(SEQIDNO:11)、LWMSSVSQSTGQIQSKVFDS(SEQIDNO:12)、MSSVSQSTGQIQSKVFDS(SEQIDNO:13)、MSSVSQSTGQIQSKV(SEQIDNO:14)、MSSVSQST(SEQIDNO:15)、ISMSQQVSQSGVSDKFST(SEQIDNO:16)、SIMSGKQSSVQSQVT(SEQIDNO:17)、VSMSSTSQ(SEQIDNO:18)、VSSSSQ(SEQIDNO:19)、SILTGVST(SEQIDNO:20)、SSVSQSTG(SEQIDNO:21)、GQIQSKVG(SEQIDNO:22)、LNLSSTLQG(SEQIDNO:23)、NSVVQSTG(SEQIDNO:24)、GQMQSKVG(SEQIDNO:25)和SCVSQSTGQIQCKVFDSLLNLSSTLQATR(SEQIDNO:26)。

55.一种药物组合物，其包含：

如权利要求54所述的分离肽和药学上适合的载体

56.根据权利要求55所述的药物组合物，其进一步包含：表面活性剂。

57.根据权利要求55所述的药物组合物，其进一步包含：治疗剂。

58.一种破坏上皮屏障的方法，其包括：

向上皮位点施加一定量的根据权利要求55-57中任一项所述的治疗剂，由此破坏在所述上皮位点处的屏障形成。

59.一种破坏上皮屏障的方法，其包括：

向上皮位点施加有效破坏存在于所述位点处的上皮细胞中的claudin-1的量的短暂地破坏紧密连接内的claudin-1的试剂，其中所述试剂包含包括至少40％的极性、不带电氨基酸残基和自组装β折叠二级结构的肽，由此破坏在所述上皮位点处的屏障形成。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述上皮屏障为表皮屏障。

61.根据权利要求59所述的方法，其中所述上皮细胞为角化细胞。

62.根据权利要求59所述的方法，其中所述上皮屏障为粘膜。

63.一种向受试者施用经上皮药物制剂或药物组合物的方法，其包括：

向所述受试者上的上皮位点施加如权利要求1所述的经上皮药物制剂或根据权利要求55-57中任一项所述的药物组合物。

64.一种向受试者施用经上皮疫苗制剂的方法，其包括：

向所述受试者上的上皮位点施加如权利要求23所述的经上皮疫苗制剂。