CN104338120A - 重组人角质细胞生长因子-2喷雾制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组人角质细胞生长因子-2喷雾制剂及其制备方法。所述的重组人角质细胞生长因子-2喷雾制剂，其特征在于，含有重组人角质细胞生长因子-2，雾化后粒径小于5um的微粒大于80％。本发明的KGF-2喷雾制剂稳定好，雾化颗粒粒径符合2010版药典规定，雾化前后KGF-2总含量无明显差异，对KGF-2活性无影响，通过此喷雾制剂重组人角质细胞生长因子-2(简称KGF-2)可直接达到肺部迅速发挥药效，降低全身毒性，能提高生物利用度，具有高经济效益。

Description

重组人角质细胞生长因子-2喷雾制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及重组人角质细胞生长因子-2(KGF-2)的喷雾制剂的研究，属于药物剂型技术领域。 

背景技术

吸入疗法历史悠久，现代吸入疗法可追溯至上世纪50年代。1956年由Riker实验室开发上市首个压力定量吸入剂，Medihaler-EpiTM含肾上腺素，Medihaler-IsoTM含异内肾上腺素。由于肺部具有巨大的肺泡表面积、丰富的毛细血管和极小的转运距离，药物经肺吸收后可迅速发挥药效，并可避免首过效应，因而吸入治疗被WHO和多国政府推荐为哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)等呼吸道疾病的首选疗法。雾化吸入剂足将药物的水溶液或混悬液经雾化器分散成悬浮于气体中的液滴或固体微粒，通过吸入的方式沉积丁呼吸道和(或)肺部，目前，广泛用于治疗多种呼吸道疾病，特别是哮喘或COPD的儿童和老年患者，以及不适用其他吸入制剂者。雾化吸入剂所使用的雾化器类犁较多，包括喷射雾化器、超声雾化器和振动筛雾化器等，此外一些新型的雾化器也在研究或处于临床试验中。 

人角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor-2，KGF-2)又叫做成纤维细胞生长因子-10(Fibroblast Growth Factor-10，FGF-10)[9]，是1996年发现的一种促进上皮细胞生长的细胞因子。研究表明，KGF-2 mRNA的表达主要是在胚胎的发育过程之中，以及在特定的成年组织如肺、前列腺。在胚胎发育过程中KGF-2是起始肢芽形成并促进其生长的关键性细胞因子。KGF-2[10]由208个氨基酸组成，N端有39个氨基酸的疏水信号肽，成熟蛋白有169个氨基酸(40-208aa)，理论分子量为19.3kDa，KGF-2对酸和热不稳定，对肝素具有较强的亲和作用。其特异性的结合于靶细胞表面的酪氨酸激酶受体FGFR2IIIb(KGFR)、FGFR1而触发信号传导，从而发挥生理作用，刺激上皮细胞再生、分化和迁移(参见图1)。体外活性研究表明，角质细胞生长因子-2(KGF-2)在0.1-5nM(2-100ng/mL)浓度时角质上皮细胞Bal/MK具有显著的促分裂作用，对成纤维细胞NIH3T3无作用。 

重组人角质细胞生长因子-2用于治疗和预防由任何因素造成的急性肺损伤/呼吸窘迫综合征，包括特种医学，如高原性肺损伤，军事医学，运动医学和其他疾病致肺损伤/呼吸窘迫综合征。以上疾病可以是亚临床、轻度、中度、重度和危及生命的肺损伤。研究发现KGF-2通过保持肺泡表面活性物质动态平衡，促进细胞增生和迁移修复肺损伤，它在保护气血屏障完整，维持细胞骨架和细胞间连接稳态，促进肺水清除，降低或避免肺泡-毛细血管应激衰竭中有重要作用。本专利的申请人已获得了重组人角质细胞生长因子-2治疗急性肺损伤/呼吸窘迫综合征的专利授权。 

虽然喷雾制剂是一种常见的剂型，但由于KGF-2本身的特性，目前尚未见KGF-2开发出喷雾制剂，本发明正填补了这项空白。由于KGF-2有一定的粘滞性，制成雾化剂需要考虑溶液的理化特性，pH，稳定性，粘滞性，以及实际雾化后的颗粒直径。只有直径小于3-5微米的颗粒才能到达小的气道，直径小于2.5微米的才能到达肺泡。所以，只有特殊工艺的配方才能达到这一要求。我们成功开发出专门配方的试剂，需要一定的pH，粘度，水份含量，赋形剂等，经雾化后形成直径2-5微米的颗粒，可以到达小气道和肺泡。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组人角质细胞生长因子-2喷雾制剂及其制备方法。 

为了达到上述目的，本发明提供了一种重组人角质细胞生长因子-2喷雾制剂，其特征在于，含有重组人角质细胞生长因子-2，雾化后粒径小于5um的微粒大于80％。 

优选地，所述的重组人角质细胞生长因子-2的浓度为0.2-9mg/ml。 

本发明还提供了上述的重组人角质细胞生长因子-2喷雾制剂的制备方法，其特征在于，使用注射用水、生理盐水、枸椽酸溶液或磷酸盐缓冲液溶解重组人角质细胞生长因子-2得到重组人角质细胞生长因子-2溶液，使用NB-211C雾化器或403C型雾化器，采用压缩空气或高压氧进行雾化，得到重组人角质细胞生长因子-2喷雾制剂。 

优选地，所述的重组人角质细胞生长因子-2溶液中还含有稳定剂。 

更优选地，所述的稳定剂为EDTA、蔗糖和甘露醇中的至少一种。 

优选地，所述的重组人角质细胞生长因子-2溶液中还含有氯化钠。所述的氯化钠用于调整渗透压。 

所述重组人角质细胞生长因子-2(KGF-2)具有生物活性，对来源于内胚层、中胚层和外胚层的细胞，如上皮细胞、真皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞，干细胞等有调节、修复和再生作用。 

所述喷雾剂主要用于任何因素造成的肺损伤和/或肺水肿，包括发生在任何年龄段，如成人、儿童等的亚临床、轻度、中度、重度和危及生命的肺部损伤，急性、亚急性和慢性的肺部损伤，特种医学疾病致肺部损伤，如航空、航天、航海、潜水等，特殊地理气候致肺部损伤，如极地、冷环境、热环境等，军事医学疾病致肺部损伤，如核辐射、爆炸与投射物及其他(激光、振动、电磁辐射、声损伤等)和宇宙保障等，运动医学疾病致肺部损伤，如跑步、游泳等，化学中毒、生物危害、人兽接触、特殊作业、灾难意外等致肺部损伤，误吸(如腐蚀性液体或气体)、溺水、感染、(如细菌、病毒、真菌、分支杆菌、立克次体、卡氏肺孢子虫等)、炎症、药物和化学品致肺部损伤，创伤，败血症、脏器出血、反复输血、心肺分流、血栓栓塞、全身各器官病变致肺部损伤，弥漫性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜、溶血尿毒综合症、热射病和其他血管炎症性综合症致肺部损伤，代谢性疾病、酸碱平衡紊乱、尿毒症、脏器移植、肿瘤及并发症致肺部损伤，尤其是肺损伤/急性呼吸窘迫综合征、高原性肺水肿、高氧致肺损伤、化疗药物引起的肺损伤和肺移植后原发性肺功能不全，以及呼吸道损伤。 

与现有技术相比，本发明的有益效果是： 

本发明的KGF-2喷雾制剂稳定好，雾化颗粒粒径符合2010版药典规定，雾化前后KGF-2总含量无明显差异，通过此喷雾制剂重组人角质细胞生长因子-2(简称KGF-2)可直接达到肺部迅速发挥药效，降低全身毒性，能提高生物利用度，具有高经济效益。 

附图说明

图1为高压氧条件下KGF-2经西恩牌NB-211C雾化粒径分布图。 

图2为高压氧条件下KGF-2经鱼跃牌403C雾化粒径分布图。 

图3为KGF-2最大喷雾浓度粒径分布图； 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

实施例1 

KGF-2通过西恩牌NB-211C雾化器雾化： 

由上海新生源医药集团有限公司提供的重组人角质细胞生长因子-2样品，1mg KGF-2样品添加氯化钠：0.85mg、EDTA：0.286mg、甘露醇：15mg、蔗糖：35mg。用注射器抽取注射用水5ml，注入KGF-2药物瓶中，振摇使溶解，再将瓶中药液用注射器全部抽至配件A2的瓶中；接通雾化器，开启雾化器开关，至雾化喷雾稳定在压力0.2Mpa条件下1分钟后开始粒度检测，采用Winner311XP喷雾激光粒度分析仪仪器检测果压缩空气及高压氧雾化后粒径小于5um的分别为87.4％(如图1所示)、82.6％，大于中国2010版药典规定的80％要求。 

雾化前后pH、蛋白含量无发生明显变化，如下表。 

无论是所选压缩空气还是高压氧，肉眼观测未见明显液滴，雾化情况较好。无论是所选压缩空气还是高压氧，均可使雾化粒度达到预期要求，雾化前后pH、蛋白含量无发生明显变化。 

实施例2 

KGF-2通过鱼跃牌403C型雾化器雾化： 

由上海新生源医药研究有限公司提供的重组人角质细胞生长因子-2样品，1mg KGF-2样品中添加氯化钠：0.85mg、EDTA：0.286mg、甘露醇：15mg、蔗糖：35mg得到混合物。用注射器抽取注射用水3ml，注入KGF-2药物瓶中，振摇使溶 解，再将瓶中药液用注射器全部抽至配件A2的瓶中；接通雾化器，开启雾化器开关，至雾化喷雾稳定在压力0.2Mpa条件下1分钟后开始粒度检测，采用Winner311XP喷雾激光粒度分析仪仪器检测果压缩空气及高压氧雾化后粒径小于5um的分别为92.4％、92.8％(如图2所示)，大于中国2010版药典规定的80％要求。 

改用生理盐水、0.01M枸椽酸或磷酸盐缓冲液(pH6.5)溶解上述混合物，采用相同方法进行雾化，雾化前后pH、蛋白含量无发生明显变化，如下表。 

无论是所选压缩空气还是高压氧，溶剂用注射用水或生理盐水或枸椽酸或磷酸缓冲液，肉眼观测未见明显液滴，雾化情况较好。均可使雾化粒度达到预期要求，雾化前后pH、蛋白含量无发生明显变化。 

实施例3 

KGF-2最大雾化浓度的确定： 

取样品若干瓶，用注射器吸取1ml注射用水，加入1瓶KGF-2中振摇，使溶解，溶解后，用注射器将里面的溶液吸取，注入另一瓶中，振摇使溶解，依次进行，至无法溶解为止，上述各溶解后的溶液分别按采用鱼跃牌403C雾化器及其 配件(压力0.2Mpa)，照仪器说明书中的检查雾化效果项下的方法进行检查，将符合要求浓度的选项重新配样再进行粒度及雾化前后质量一致性检查，所得结果如下表1所示。 

(1)供试品制备方法： 

供试品1：取KGF-2冻干后样品2瓶、每瓶1mg，总共加水2ml使溶解，合并2瓶溶液至一个容器中，得含KGF-2溶度为1mg/ml溶度备用； 

供试品2：取KGF-2冻干后样品6瓶、每瓶1mg，总共加水2ml使溶解，合并6瓶溶液至一个容器中，得含KGF-2溶度为3mg/ml溶度备用； 

供试品3：取KGF-2冻干后样品10瓶、每瓶1mg，总共加水2ml使溶解，合并10瓶溶液至一个容器中，得含KGF-2溶度为5mg/ml溶度备用； 

供试品4：取KGF-2冻干后样品14瓶、每瓶1mg，总共加水2ml使溶解，合并14瓶溶液至一个容器中，得含KGF-2溶度为7mg/ml溶度备用； 

供试品5：取KGF-2冻干后样品18瓶、每瓶1mg，总共加水2ml使溶解，合并18瓶溶液至一个容器中，得含KGF-2溶度为9mg/ml溶度备用； 

0.1mg/ml标准蛋白：取结晶牛胰岛素1mg，加10ml超纯水，得含0.1mg/ml标准蛋白溶液。 

雾化时按上述肉眼观测雾化效果项下方法进行试验，试验时去掉雾化器样瓶顶端的档板，全部收集雾化后的溶液，检测各项指标。 

(2)雾化前后溶液的检查方法 

①性状：肉眼观测外观等。 

②pH值：按药典2010年版三部附录，pH值测定法，测定溶液pH值。 

③蛋白浓度：照药典2010年版三部Lorry法及KGF-2蛋白含量Lorry法标准检验方法操作，测定蛋白浓度。 

(3)实验方法 

A、蛋白标准曲线的绘制，雾化前后质量一致性实验结果浓度检查项下的蛋白标准曲线绘制方法)如表1所示。 

表1：蛋白标准曲线绘制表： 

上述各溶液在酶标仪上655nm处比色(测吸收度)结果见上表。 

经标准蛋白浓度对吸收度作回归，回归方程为：Y＝0.2524X-0.0114，回归系数为：0.9999(线性范围为0.01-0.1mg/ml)。 

B、样品检测：分别取雾化前后的样品将其稀释至1mg/ml左右，再分别补充水至200ul，照Lorry法标准检验方法操作，结果如表2和表3所示： 

表2  雾化前样品检测结果 

表3  雾化后样品检测结果 

表2、表3表明雾化前后蛋白含量无明显变化。 

雾化前后一致性结果实验结果见表4所示。 

表4、最大雾化浓度试验及雾化效果、粒径、质量一致性检查 

根据上述试验结果，9mg/ml时溶液已不完全澄清，雾化仍能得到≤5um粒子大于80％(如图3所示)，雾化前后样品质量没有发生太大的变化。 

Claims (6)

1.一种重组人角质细胞生长因子-2喷雾制剂，其特征在于，含有重组人角质细胞生长因子-2，雾化后粒径小于5um的微粒大于80％。

2.如权利要求1所述的重组人角质细胞生长因子-2喷雾制剂，其特征在于，所述的重组人角质细胞生长因子-2的浓度为0.2-9mg/ml。

3.权利要求1或2所述的重组人角质细胞生长因子-2喷雾制剂的制备方法，其特征在于，使用注射用水、生理盐水、枸椽酸溶液或磷酸盐缓冲液溶解重组人角质细胞生长因子-2得到重组人角质细胞生长因子-2溶液，使用NB-211C雾化器或403C型雾化器，采用压缩空气或高压氧进行雾化，得到重组人角质细胞生长因子-2喷雾制剂。

4.如权利要求3所述的重组人角质细胞生长因子-2喷雾制剂的制备方法，其特征在于，所述的重组人角质细胞生长因子-2溶液中还含有稳定剂。

5.如权利要求4所述的重组人角质细胞生长因子-2喷雾制剂的制备方法，其特征在于，所述的稳定剂为EDTA、蔗糖和甘露醇中的至少一种。

6.如权利要求3所述的重组人角质细胞生长因子-2喷雾制剂的制备方法，其特征在于，所述的重组人角质细胞生长因子-2溶液中还含有氯化钠。