CN101780269A - 细胞生长因子治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞生长因子治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病的应用，具体涉及细胞生长因子例如肝细胞生长因子或角质细胞生长因子在制备用于预防和/或治疗溃疡性疾病和/或肺纤维化疾病的药物中的用途。本发明还涉及包含所述细胞生长因子例如肝细胞生长因子或角质细胞生长因子的药物组合物，以及使用所述肝细胞生长因子或角质细胞生长因子在需要的受试者中预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病的方法。根据本发明可以有益地预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病。

Description

细胞生长因子治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病的应用

本申请要求2009年1月21日提交的中国专利申请序列号200910001091.X的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及细胞生长因子预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病的应用，特别是涉及肝细胞生长因子在基因预防和/或治疗溃疡性疾病特别是慢性皮肤溃疡及肺纤维化疾病中的应用，还涉及角质细胞生长因子在基因预防和/或治疗溃疡性疾病及肺纤维化疾病中的应用。

背景技术

皮肤急性创伤一般均能自愈，应用药物或生长因子等措施可使之加速愈合。但对于因各种原因例如血管性疾病、糖尿病、长期局部压迫等所致的慢性创伤，则由于此类创面与急性创面无论血管供应或创面组织结构二者大相径庭，因此甚难愈合，各种措施亦多未能见效，以致慢性溃疡经久不愈，进而严重影响患者的生活质量，甚至危及生命。另外，溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis，UC)是一种慢性溃疡性疾病，是世界卫生组织公认的临床难治性疾病，亦是结肠肿瘤发生的主要危险因子之一，其发病率近年来呈逐年增高趋势。因此，治疗慢性溃疡是目前医学中的一大难题，同时又是极需解决的难题。虽然关于血管生长因子如血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)可促进急性伤口的愈合文献早已多有报导，但因急慢性创面的组织结构，诸多生物成分的功能改变很大，故它们对慢性皮肤溃疡的作用则很有争议，Pufe T等认为慢性溃疡组织尚缺乏其他生长因子，故VEGF亦无法发挥其作用(Pufe T，Paulsen F wt al：J Pathol.2003；200(1)：130-6，The angiogenic peptide vascular endothelial growth factor(VEGF)is expressed in chronic sacral pressure ulcers.)。Nayari F等更明确报导慢性皮肤溃疡情况下，内源性HGF并无效果，归咎于其无生物活性之故(Nayari F，Olson H et al：J.Dermatol.Sci.2005；37(2)：75-85，Hepatocytegrowth factor；expression，concentration and biological activity in chronicleg ulcers)。因此，应用生长因子基因预防和/或治疗溃疡性疾病特别是慢性皮肤溃疡以及溃疡性结肠炎的措施未有探索。

肺纤维化是另一类慢性严重危害人类健康的呼吸系统疾病。其病因、发病机制复杂，也缺乏理想的防治方法，也是一个急需解决的难题。肺纤维化疾病包含的种类颇多，如原因不明肺纤维化疾病(特发性肺纤维化，idiopathicpulmonary fibrosis)、反复感染引起的肺纤维化疾病、辐射引起的肺纤维化疾病、或尘埃引起的肺纤维化疾病(尘肺病，pneumoconiosis)等。曾有报道(Long X，Xiong SD et al.Chin Med J，2007，120(16)：1432-1437.Effectof intramuscular injection of hepatocyte growth factor plasmid DNA withelectroporation on bleomycin-induced lung fibrosis in rats)应用基因重组质粒防治肺纤维化得到一定效果，由于其为电击肌肉注射，表明效率尚低，而且肌肉注射后分泌HGF进入血流，则可分布各个组织，此可能引起诱发肿瘤的危险性，难以在实践中应用。此外，还有尘埃引起的肺纤维化疾病，因其发病机制不同，尚未见应用基因治疗的报道。

因此，寻找溃疡性疾病及肺纤维化疾病的新治疗方法，仍是本领域技术人员努力探索的研究课题。

发明内容

本发明人发现肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)对于溃疡性疾病具有甚为良好的治疗效果。具体地说，本发明发现携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌的制剂可局部应用以转染肝细胞生长因子基因到组织细胞，得以产生HGF蛋白，从而对于溃疡性疾病特别是慢性皮肤溃疡可起到良好的治疗效果。此外，本发明通过肺纤维化动物试验，并应用SPH(携带HGF基因真核表达质粒的减毒沙门氏菌菌株)直接灌入肺内的方法，取得了治疗肺纤维化的实效。此外，本发明还发现，角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor，KGF)在溃疡性疾病特别是慢性皮肤溃疡以及溃疡性结肠炎的预防、治疗和抗复发方面均有效果，并且无诱发肿瘤风险。此外，本发明还通过局部应用携带KGF基因真核表达质粒的减毒沙门氏菌菌株(在本文可缩写为SPK)治疗动物肺纤维化模型，取得了预防和/或治疗肺纤维化的实际效果。本发明基于以上发现而得以完成。

发明概述：

概述地说，本发明提供了细胞生长因子在制备用于预防和/或治疗溃疡性疾病和/或肺纤维化疾病的药物中的用途。根据本发明的上述用途，其中所述的细胞生长因子选自肝细胞生长因子(在下文中，可缩写为HGF)和角质细胞生长因子(在下文中，可缩写为KGF)。根据本发明的上述用途，其为细胞生长因子在制备用于基因预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病的药物中的用途。根据本发明的上述用途，所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病，更特别的是慢性皮肤溃疡以及溃疡性结肠炎例如顽固性溃疡性结肠炎。

进一步地，本发明提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的细胞生长因子和任选的药学可接受的载体。根据本发明的上述药物组合物，其中所述的细胞生长因子选自肝细胞生长因子和角质细胞生长因子。根据本发明的上述药物组合物，所述的药物组合物可用于预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病，特别是用于基因预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病。根据本发明的上述药物组合物，所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病，更特别的是慢性皮肤溃疡以及溃疡性结肠炎例如顽固性溃疡性结肠炎。

再进一步地，本发明提供了一种在需要的受试者中预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病的方法，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的细胞生长因子。根据本发明的上述方法，其中所述的细胞生长因子选自肝细胞生长因子和角质细胞生长因子。根据本发明的上述方法，所述的药物组合物可用于预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病，特别是用于基因预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病。根据本发明的上述方法，所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病，更特别的是慢性皮肤溃疡以及溃疡性结肠炎例如顽固性溃疡性结肠炎。

更概述地说本发明提供了以下项目：

1、细胞生长因子在制备用于预防和/或治疗溃疡性疾病和/或肺纤维化疾病的药物中的用途。

2、项目1的用途，其中所述的细胞生长因子选自肝细胞生长因子和角质细胞生长因子。

3、项目2的用途，其中：

所述的肝细胞生长因子是以携带肝细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌的形式使用，或者以携带肝细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式使用；和/或

所述的角质细胞生长因子是以携带角质细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌的形式使用，或者以携带角质细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式使用。

4、项目2或3的用途，其中：

所述的肝细胞生长因子是人肝细胞生长因子；和/或

所述的角质细胞生长因子是人角质细胞生长因子。

5、项目1至4任一项的用途，其特征在于以下任意一项或多项：

i)所述的重组质粒为pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他携带HGF基因的真核表达质粒；

ii)所述的重组质粒为pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他携带KGF基因的真核表达质粒；

iii)所述的重组腺病毒为Ad-HGF；

iv)所述的重组腺病毒为Ad-KGF；

v)所述的重组减毒沙门氏菌为SPH；

vi)所述的重组减毒沙门氏菌为SPK；

vii)所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病可以为糖尿病，辐射，动脉、静脉狭窄或堵塞，褥疮，慢性粘膜溃疡或其他病因引起的而致局部组织慢性溃疡；所述的溃疡性疾病还可以是溃疡性结肠炎；

viii)所述的肺纤维化疾病可以为原因不明肺纤维化疾病，反复感染引起的肺纤维化疾病，辐射引起的肺纤维化疾病，或尘埃引起的肺纤维化疾病等。

6、一种药物组合物，其包含治疗有效量的细胞生长因子和任选的药学可接受的载体。

7、项目6的药物组合物，其中所述的细胞生长因子选自肝细胞生长因子和角质细胞生长因子。

8、项目7的药物组合物，其中：

所述的肝细胞生长因子是以携带肝细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌形式存在于该药物组合物中，或者以携带肝细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式存在于该药物组合物中；和/或

所述的角质细胞生长因子是以携带角质细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌形式存在于该药物组合物中，或者以携带角质细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式存在于该药物组合物中。

9、项目7或8的药物组合物，其中：

所述的肝细胞生长因子是人肝细胞生长因子；和/或

所述的角质细胞生长因子是人角质细胞生长因子。

10、项目6至9任一项的药物组合物，其特征在于以下任意一项或多项：

i)所述的重组质粒为pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他携带HGF基因的真核表达质粒；

ii)所述的重组质粒为pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他携带KGF基因的真核表达质粒；

iii)所述的重组腺病毒为Ad-HGF；

iv)所述的重组腺病毒为Ad-KGF；

v)所述的重组减毒沙门氏菌为SPH；

vi)所述的重组减毒沙门氏菌为SPK；

vii)所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病可以为糖尿病，辐射，动脉、静脉狭窄或堵塞，褥疮，慢性粘膜溃疡或其他病因引起的而致局部组织慢性溃疡；所述的溃疡性疾病还可以是溃疡性结肠炎；

viii)所述的肺纤维化疾病可以为原因不明肺纤维化疾病，反复感染引起的肺纤维化疾病，辐射引起的肺纤维化疾病，或尘埃引起的肺纤维化疾病等。

11、项目6至10任一项的药物组合物，其可用于预防和/或治疗溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病及肺纤维化疾病。

12、项目6至11任一项的药物组合物，其为粉针剂、注射液、涂抹液、喷雾剂、贴膜剂、搽剂、洗剂、溶液剂、粉末剂、气雾剂、微粒化制剂、微囊剂等。

13、在需要的受试者中预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病的方法，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的细胞生长因子。

14、项目13的方法，其中所述的细胞生长因子选自肝细胞生长因子和角质细胞生长因子。

15、项目14的方法，其中：

所述的肝细胞生长因子是以携带肝细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌的形式使用，或者以携带肝细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式使用；和/或

所述的角质细胞生长因子是以携带角质细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌的形式使用，或者以携带角质细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式使用。

16、项目14或15的方法，其中：

所述的肝细胞生长因子是人肝细胞生长因子；和/或

所述的角质细胞生长因子是人角质细胞生长因子。

17、项目13至16任一项的方法，其特征在于以下任意一项或多项：

i)所述的重组质粒为pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他携带HGF基因的真核表达质粒；

ii)所述的重组质粒为pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他携带KGF基因的真核表达质粒；

iii)所述的重组腺病毒为Ad-HGF；

iv)所述的重组腺病毒为Ad-KGF；

v)所述的重组减毒沙门氏菌为SPH；

vi)所述的重组减毒沙门氏菌为SPK；

vii)所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病可以为糖尿病，辐射，动脉、静脉狭窄或堵塞，褥疮，慢性粘膜溃疡或其他病因引起的而致局部组织慢性溃疡；所述的溃疡性疾病还可以是溃疡性结肠炎；

viii)所述的肺纤维化疾病可以为原因不明肺纤维化疾病，反复感染引起的肺纤维化疾病，辐射引起的肺纤维化疾病，或尘埃引起的肺纤维化疾病等。

发明详述：

具体地说，本发明第一方面提供了肝细胞生长因子在制备用于预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病的药物中的用途。具体而言，本发明提供的是肝细胞生长因子在制备用于基因预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病的药物中的用途。所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病，更特别的是慢性皮肤溃疡以及顽固性溃疡性结肠炎。

在本发明第一方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的肝细胞生长因子是以携带肝细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌的形式使用。本发明还可以使用其它的对于人体无毒或减毒的细菌，使这些细菌携带肝细胞生长因子基因后使用，这些细菌包括但不限于双歧杆菌、大肠杆菌等。换言之，本发明所述的肝细胞生长因子是以携带肝细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌的形式使用，或者以携带肝细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式使用。

在本发明第一方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的肝细胞生长因子是人肝细胞生长因子。本发明所述的肝细胞生长因子当然还可以使用鼠或者其它哺乳动物的肝细胞生长因子。但本发明优选的是使用人肝细胞生长因子，包括人肝细胞生长因子的所有分类，例如亚类、亚组、亚群、亚族等。

在本发明第一方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的重组质粒为pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他携带HGF基因的真核表达质粒。

在本发明第一方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的重组腺病毒为Ad-HGF。

在本发明第一方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的重组减毒沙门氏菌为SPH。

在本发明第一方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病可以为糖尿病，辐射，动脉、静脉狭窄或堵塞，褥疮，慢性粘膜溃疡或其他病因引起的而致局部组织慢性溃疡；所述的溃疡性疾病还可以是溃疡性结肠炎。

在本发明第一方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的肺纤维化疾病可以为原因不明肺纤维化疾病，反复感染引起的肺纤维化疾病，辐射引起的肺纤维化疾病，或尘埃引起的肺纤维化疾病等。

本发明第二方面提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的肝细胞生长因子和任选的药学可接受的载体。根据本发明，所述的药物组合物可用于预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病。所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病，更特别的是慢性皮肤溃疡以及溃疡性结肠炎。

在本发明第二方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的肝细胞生长因子是以携带肝细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌形式存在于该药物组合物中，或者以携带肝细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式存在于该药物组合物中。

在本发明第二方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的肝细胞生长因子是人肝细胞生长因子。

在本发明第二方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的重组质粒为pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他携带HGF基因的真核表达质粒。

在本发明第二方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的重组腺病毒为Ad-HGF。

在本发明第二方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的重组减毒沙门氏菌为SPH。

根据本发明第二方面的药物组合物，其可用于预防和/或治疗溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病及肺纤维化疾病。

在本发明第二方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病可以为糖尿病，辐射，动脉、静脉狭窄或堵塞，褥疮，慢性粘膜溃疡或其他病因引起的而致局部组织慢性溃疡。所述的溃疡性疾病还可以是溃疡性结肠炎。

在本发明第二方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的肺纤维化疾病可以为原因不明肺纤维化疾病，反复感染引起的肺纤维化疾病，辐射引起的肺纤维化疾病，或尘埃引起的肺纤维化疾病等。

根据本发明第二方面任一项所述药物组合物，其为粉针剂、注射液、涂抹液、喷雾剂、贴膜剂、搽剂、洗剂、溶液剂、粉末剂、气雾剂、微粒化制剂、微囊剂等。

本发明第三方面提供了一种在需要的受试者中预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病的方法，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的肝细胞生长因子。

在本发明第三方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的肝细胞生长因子是以携带肝细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌的形式使用，或者以携带肝细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式使用。

在本发明第三方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的肝细胞生长因子是人肝细胞生长因子。本发明所述的肝细胞生长因子当然还可以使用鼠或者其它哺乳动物的肝细胞生长因子。但本发明优选的是使用人肝细胞生长因子。

在本发明第三方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的重组质粒为pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他携带HGF基因的真核表达质粒。

在本发明第三方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的重组腺病毒为Ad-HGF。

在本发明第三方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的重组减毒沙门氏菌为SPH。

在本发明第三方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病可以为糖尿病，辐射，动脉、静脉狭窄或堵塞，褥疮，慢性粘膜溃疡或其他病因引起的而致局部组织慢性溃疡。所述的溃疡性疾病还可以是溃疡性结肠炎。

在本发明第三方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的肺纤维化疾病可以为原因不明肺纤维化疾病，反复感染引起的肺纤维化疾病，辐射引起的肺纤维化疾病，或尘埃引起的肺纤维化疾病等。

根据本发明的详细记载，上文或下文所述特别是上文所述本发明的第一方面、第二方面和第三方面针对肝细胞生长因子的任一项或任一实施方面或任一特征，其同样适用于角质细胞生长因子。

在下文中，本发明还提供了角质细胞生长因子的医疗用途。

本发明第四方面提供了角质细胞生长因子在制备用于预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病的药物中的用途。具体而言，本发明提供的是角质细胞生长因子在制备用于基因预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病的药物中的用途。所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病，更特别的是慢性皮肤溃疡以及溃疡性结肠炎。

在本发明第四方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的角质细胞生长因子是以携带角质细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌的形式使用。本发明还可以使用其它的对于人体无毒或减毒的细菌，使这些细菌携带角质细胞生长因子基因后使用，这些细菌包括但不限于双歧杆菌、大肠杆菌等。换言之，本发明所述的角质细胞生长因子是以携带角质细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌的形式使用，或者以携带角质细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式使用。

在本发明第四方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的角质细胞生长因子是人角质细胞生长因子。本发明所述的角质细胞生长因子当然还可以使用鼠或者其它哺乳动物的角质细胞生长因子。但本发明优选的是使用人角质细胞生长因子，包括人角质细胞生长因子的所有分类，例如亚类、亚组、亚群、亚族等。

在本发明第四方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的重组质粒为pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他携带KGF基因的真核表达质粒。

在本发明第四方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的重组腺病毒为Ad-KGF。

在本发明第四方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的重组减毒沙门氏菌为SPK。

在本发明第四方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病可以为糖尿病，辐射，动脉、静脉狭窄或堵塞，褥疮，慢性粘膜溃疡或其他病因引起的而致局部组织慢性溃疡；所述的溃疡性疾病还可以是溃疡性结肠炎。

在本发明第四方面所述用途的一个实施方案中，其中所述的肺纤维化疾病可以为原因不明肺纤维化疾病，反复感染引起的肺纤维化疾病，辐射引起的肺纤维化疾病，或尘埃引起的肺纤维化疾病等。

本发明第五方面提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的角质细胞生长因子和任选的药学可接受的载体。根据本发明，所述的药物组合物可用于预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病。所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病，更特别的是慢性皮肤溃疡以及溃疡性结肠炎。

在本发明第五方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的角质细胞生长因子是以携带角质细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌形式存在于该药物组合物中，或者以携带角质细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式存在于该药物组合物中。

在本发明第五方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的角质细胞生长因子是人角质细胞生长因子。

在本发明第五方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的重组质粒为pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他携带KGF基因的真核表达质粒。

在本发明第五方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的重组腺病毒为Ad-KGF。

在本发明第五方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的重组减毒沙门氏菌为SPK。

根据本发明第五方面的药物组合物，其可用于预防和/或治疗溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病及肺纤维化疾病。

在本发明第五方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病可以为糖尿病，辐射，动脉、静脉狭窄或堵塞，褥疮，慢性粘膜溃疡或其他病因引起的而致局部组织慢性溃疡。所述的溃疡性疾病还可以是溃疡性结肠炎。

在本发明第五方面所述药物组合物的一个实施方案中，其中所述的肺纤维化疾病可以为原因不明肺纤维化疾病，反复感染引起的肺纤维化疾病，辐射引起的肺纤维化疾病，或尘埃引起的肺纤维化疾病等。

根据本发明第五方面任一项所述药物组合物，其为粉针剂、注射液、涂抹液、喷雾剂、贴膜剂、搽剂、洗剂、溶液剂、粉末剂、气雾剂、微粒化制剂、微囊剂等。

本发明第六方面提供了一种在需要的受试者中预防和/或治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病的方法，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的角质细胞生长因子。

在本发明第六方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的角质细胞生长因子是以携带角质细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌的形式使用，或者以携带角质细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式使用。

在本发明第六方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的角质细胞生长因子是人角质细胞生长因子。本发明所述的角质细胞生长因子当然还可以使用鼠或者其它哺乳动物的角质细胞生长因子。但本发明优选的是使用人角质细胞生长因子。

在本发明第六方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的重组质粒为pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他携带KGF基因的真核表达质粒。

在本发明第六方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的重组腺病毒为Ad-KGF。

在本发明第六方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的重组减毒沙门氏菌为SPK。

在本发明第六方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病可以为糖尿病，辐射，动脉、静脉狭窄或堵塞，褥疮，慢性粘膜溃疡或其他病因引起的而致局部组织慢性溃疡。所述的溃疡性疾病还可以是溃疡性结肠炎。

在本发明第六方面所述方法的一个实施方案中，其中所述的肺纤维化疾病可以为原因不明肺纤维化疾病，反复感染引起的肺纤维化疾病，辐射引起的肺纤维化疾病，或尘埃引起的肺纤维化疾病等。

根据本发明的详细记载，上文或下文所述特别是上文所述本发明的第四方面、第五方面和第六方面针对角质细胞生长因子的任一项或任一实施方面或任一特征，其同样适用于肝细胞生长因子。

下面对本发明作进一步详细的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

本领域技术人员公知，本发明使用的术语“预防”和“治疗”具有它们的一般意义上的含义。

本发明使用的术语“细胞生长因子”是指动物例如哺乳动物例如人的细胞生长因子，例如但不限于肝细胞生长因子和角质细胞生长因子。本发明优选的细胞生长因子是来源于人的细胞生长因子。本领域技术人员清楚，“细胞生长因子”或“人细胞生长因子”具有本领域公知的含义。

本发明使用的术语“肝细胞生长因子”是指哺乳动物例如人的肝细胞生长因子。本发明优选的肝细胞生长因子是人肝细胞生长因子。本领域技术人员清楚，“人肝细胞生长因子”具有本领域公知的含义。

本发明使用的术语“角质细胞生长因子”是指哺乳动物例如人的角质细胞生长因子。本发明优选的角质细胞生长因子是人角质细胞生长因子。本领域技术人员清楚，“人角质细胞生长因子”具有本领域公知的含义。

本发明使用的术语“SPH”是指携带HGF基因真核表达载体的减毒沙门氏菌菌种，其它类似缩写亦有类似含义。本发明的SPH具备亲肺和肠粘膜功能，转染肝细胞生长因子基因效率比质粒要高，且只在局部表达分泌HGF，无进入血流而引起诱发肿瘤的危险的顾虑，因此具有实用的价值。另外，本发明认为HGF尚有调节免疫功能的作用而具有治疗效果，为此，本发明进行溃疡性结肠炎和肺纤维化动物试验，并应用SPH直接应用于肠或肺内方法，取得实效。

本发明使用的术语“SPK”是指携带KGF基因真核表达载体的减毒沙门氏菌菌种。

在本发明中，所述的肝细胞生长因子是以携带肝细胞生长因子基因的重组质粒或重组腺病毒或重组减毒沙门氏菌的形式使用。插入的质粒为卡那抗性的真核表达质粒，例如本发明人自行改构的pcKH及pUDKH；重组腺病毒例如本发明人构建的Ad-HGF；重组减毒沙门氏菌例如本发明人构建的携带HGF基因真核表达质粒的减毒沙门氏菌Ty21a的菌株SPH，其已于2009年1月15日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提交保藏，保藏中心登记入册编号为：CGMCC No.2877，参椐的微生物(株)为：Ty-21a-HGF，建议的分类命名为：沙门氏菌，Salmonella sp.。对于角质细胞生长因子，可以采用与以上肝细胞生长因子所述类似的方式处理。

本发明所述的慢性溃疡是指患者经手术后，或长期局部压迫，或由于全身病变而致局部皮肤(含粘膜)出现慢性溃疡。本发明提供了用于治疗此类溃疡的一种新颖方法，该方法包括将携带人肝细胞生长因子基因或角质细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌(含其它对于人体无毒或减毒菌)，给予慢性溃疡患者从而治疗该疾病。肺纤维化疾病则包含的种类颇多，如原因不明肺纤维化疾病(特发性肺纤维化，idiopathic pulmonaryfibrosis)、反复感染引起的肺纤维化疾病、辐射引起的肺纤维化疾病、或尘埃引起的肺纤维化疾病(尘肺病，pneumoconiosis)等。根据本发明的精神，还提供了治疗上述肺纤维化疾病的方法，该方法包括将携带人肝细胞生长因子基因或角质细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌，给予肺纤维化疾病患者从而治疗该疾病。

本发明的药物组合物中除了肝细胞生长因子或角质细胞生长因子外，根据需要还可含有本领域技术人员已知的制药中常用的药学可接受的载体，例如药用辅助剂，例如赋形剂、稳定剂、防腐剂、载体等，例如生理盐水、葡萄糖溶液、甘露醇、乳糖等。

应用本发明提供的治疗方法比其他的治疗手段更具有科学性，疗效更明确。在目前尚无针对慢性溃疡及肺纤维化疾病的较好临床治疗手段的情况下，本发明提供了一种新的有效治疗方法，本发明的治疗方法比以往的防治手段更具有科学性，疗效更明确。

附图说明

图1描绘了KGF-1基因的PCR扩增，其中：lane1为PCR产物；lane2为Maker2000。

图2描绘了真核表达载体的酶切鉴定，其中：Lane1为pcDNA3.0-KGF质粒；lane2为质粒EcoR I和Xho I双酶切产物；lane3为Maker2000。

图3描绘了重组减毒沙门氏菌TPK的筛选，其中：lane1为质粒EcoR I和Xho I双酶切产物；lane2为Maker2000。

图4用图片描绘了SPK对大鼠慢性难愈合创面修复的影响

图5为SPH治疗组的肺组织肉眼观察结果。

图6为模型对照组的肺组织肉眼观察结果。

图7为SPH治疗组的肺组织学显微观察结果。

图8为模型对照组的肺组织学显微观察结果。

图9-1、图9-2和图9-3分别是模型对照组与pcKH和pcK-KGF治疗组的肺组织肉眼观察结果。

图10-1、图10-2和图10-3分别是模型对照组与pcKH和pcK-KGF治疗组的肺组织学显微观察结果。

图11-1、11-2、11-3、和11-4分别描绘了RT-PCR检测肺表面活性蛋白A/C的表达。其中，图11-1是β-actin凝胶电泳图，图11-2是SP-A凝胶电泳图，图11-3是SP-C凝胶电泳图，图11-4是KGF凝胶电泳图。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。这些实施例描述携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒，或重组腺病毒，或重组减毒沙门氏菌的制备以及对大鼠皮肤溃疡及肺纤维化的治疗作用以进一步阐述本发明。虽然在下文未针对角质细胞生长因子进行相关试验，但是，本领域技术人员根据本发明公开的教导，可以以下文实施例类似的方式实施涉及角质细胞生长因子的相应试验，并且可以获得预期的结果。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

实施例1

(1)携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒pcKH及pUDKH和重组腺病 毒Ad-HGF的构建与制备

(A)pcKH质粒的构建

用常规分子生物学技术，从人胎盘cDNA文库(购自Clontech公司，美国)中通过多聚酶链反应(PCR)(上游引物为5’-ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc-3’[SEQ ID NO.01]，下游引物为5’-tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt-3’[SEQ ID NO.02])分离得到人HGF编码区cDNA(2184bp)，测序并进行综合分析，将测得的人HGF全长cDNA序列与Gene Bank已公布的人HGF全长cDNA序列进行比较分析表明，我们克隆的人HGFcDNA序列与Gene Bank已公布的人HGF全长cDNA序列完全一致。然后将其亚克隆至我们自行改构的真核表达载体pcK的多克隆位点(BamH I，Apa I位点)，获得携带人肝细胞生长因子基因的重组载体pcKH，人肝细胞生长因子基因受CMV启动子调控。pcK是将商业载体pcDNA3(购自Invitrogen公司，美国)的氨卞抗性基因换为卡那霉素抗性基因而改构所得，将pcDNA3载体用SspI(购自Promega)及AvrII(购自Promega)双酶切，切去氨苄基因(约0.6kb)，pEGFP-N1(购自Invitrogen)用AvrII酶切，分别回收大片段(约4.8kb)及小片段(1.1kb的DNA片段，该片段含有完整的卡那霉素基因)用T4DNA连接酶(购自BioLabs)连接，获得卡那霉素抗性的pcDNA3载体，命名为pcK；分别用BamHI(购自Promega)和ApaI(购自Promega)双酶切pcK及pSK-HGF，分别回收大片段及小片段(2.2kb的DNA片段，该片段含有完整的人HGF基因)用T4DNA连接酶连接，获得携带人肝细胞生长因子基因的真核表达载体，含卡那霉素抗性基因，命名为pcKH。用限制性内切酶Not I和Hind III从载体pEGFP-N1(购自Invitrogen公司，美国)上切下EGFP(绿色荧光蛋白)基因序列，并将其克隆至载体pcK的多克隆位点(NotI，Hind III位点)，获得携带EGFP的质粒pcK-GFP，用于质粒转染靶组织效率的观察。

(B)pUDKH质粒的构建

i.用PCR方法从人胎盘cDNA文库(购自Clontech公司，美国)中扩增肝细胞生长因子cDNA。

按文献报道的人肝细胞生长因子HGF cDNA序列设计引物，从人胎盘cDNA文库克隆人肝细胞生长因子基因。测序并进行综合分析，将测得的人HGF全长cDNA序列与Gene Bank已公布的人HGF全长cDNA序列进行比较分析表明，我们克隆的人HGFcDNA序列与Gene Bank已公布的人HGF全长cDNA序列完全一致。PCR产物克隆至pBluescript SK(+)(pSK)载体中，命名为pSK-HGF。

ii.构建带有卡那抗性基因、CMV启动子、多克隆位点和polyA加尾信号的用于插入HGF基因的表达载体(pUDK)。

首先用内切酶Pac I从载体pShuttle-CMV(Stratagene公司，美国)上切下含卡那抗性基因(Kan+)、pBR322复制子区域的片段(-2930bp)，回收、末端补平并去除5’-P；再用内切酶Pvu II和Nru I依次酶切pcDNA3质粒，回收含CMV启动子、多克隆位点和polyA加尾信号的片段(-1080bp)；最后将上述2个片段连接并转化大肠杆菌DH5α感受态，用常规分子生物学方法鉴定阳性重组子。所得质粒命名为pUDK。

iii.构建携带HGF基因的基因治疗用载体pUDKH。

先用内切酶EcoR V酶切pUDK质粒，去除5’-P后回收；再用BamH I和Apa I依次酶切pSK-HGF质粒，回收HGF基因片段(-2200bp)，末端补平后再回收；上述2个片断连接并转化大肠杆菌DH5α感受态，用常规分子生物学方法鉴定阳性重组子，保存菌种。所得质粒命名为pUDKH。HGF的表达装置依次为CMV启动子、人HGF cDNA、BGH polyA信号。用EcoRI，PvuII，KpnI，及HindIII 4种限制性内切酶对构建完成的质粒进行进一步的酶切鉴定，最终结果表明质粒pUDKH构建成功。

用HindIII，NotI限制性内切酶从载体pcDNA3-GFP(参见(1))切下GFP(绿色荧光蛋白)基因序列，并将其克隆至载体pUDK的HindIII，NotI多克隆位点，获得携带GFP的质粒，pUDK-GFP用于质粒转染靶组织效率的观察。

以上所有限制性内切酶和DNA连接酶均购自宝生物工程(TaKaRa)公司。

(C)质粒的制备、纯化及质量控制

用本领域的常规技术方法，将pcKH、pUDKH质粒以及pcK-GFP和pUDK-GFP分别转化常规的感受态细菌(例如大肠杆菌DH5α)，然后大规模发酵细菌扩增质粒，离心回收菌体，采用碱变性法提取重组质粒，层析法大规模纯化质粒，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法确定DNA的纯度和含量。获得所需的质粒用于下述实验。

(D)重组腺病毒Ad-HGF的构建与制备

将HGF cDNA克隆至pXCJL1-CMV/pA(含有CMV启动子、PolyA信号以及腺病毒基因组左端序列的穿梭质粒，由美国百特医疗用品公司基因治疗部提供)载体的Hind III和Not I位点之间，从而获得携带人肝细胞生长因子基因表达盒以及腺病毒基因组左端序列的穿梭质粒(pXCJL1-CMV/pA-HGF)。然后用LipofectAMIN(购自GIBCO公司，美国)介导pXCJL1-CMV/PA-HGF和GT4050(含有E1区、E3区及包装信号区缺失的复制缺陷型5型腺病毒基因组的质粒，由美国百特医疗用品公司基因治疗部提供)共转染293细胞(以腺病毒E1基因转化的人胚肾细胞系，ATCC)，当出现明显细胞病变效应(CPE)后，用噬斑分析法筛选单克隆重组腺病毒，PCR法鉴定阳性重组腺病毒，并将其在293细胞中扩增后用氯化铯密度梯度离心法纯化。然后通过测定260nm和280nm光吸收、快速CPE分析及噬斑分析确定病毒的纯度和感染滴度。

Ad-GFP(携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒，由美国百特医疗用品公司基因治疗部提供)，制备同Ad-HGF，用于重组腺病毒转染靶组织效率的观察。

参考以上方法还构建和制备了重组腺病毒Ad-KGF。

(2)携带人角质细胞生长因子(KGF)基因的真核表达载体pcK-KGF的构 建与制备

(A)KGF cDNA的克隆

按文献报道(Rubin JS，et al.Proc Natl Acad Sei USA1989.86：302-306；Finch PW，et al.Science 1989，245(4919)：752-755)的人角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor，KGF)cDNA序列设计引物，在正向引物中引入BamHI酶切位点，反向引物中引入EcoR I酶切位点。正向引物的寡核苷酸序列为5’-CATGGATCCATGAGCTATGATTACATGGAAG-3’[SEQID NO.03]，反向引物的寡核苷酸序列为5’-GTCGAATTCTTAAGTGATTGCCATAGGCAG-3’[SEQ ID NO.04]，从人胎盘cDNA文库(购自Clontech)克隆人角质细胞生长因子(KGF)基因。PCR参数为：94℃预变性5min，94℃40s，55℃40s，72℃60s，循环数为30，72℃延伸10min。PCR产物(图1)用Sanger双脱氧终止法测定人KGF cDNA序列(上海生工生物工程技术服务公司)。将测得的人KGF cDNA序列与文献报道的人KGF cDNA序列进行比较分析表明，本发明克隆的人KGFcDNA序列与文献报道的人KGF cDNA序列完全一致，具体参见后文序列表部分[SEQ ID NO.05]。

(B)携带人角质细胞生长因子基因的真核表达载体pcK-KGF构建

将pcDNA3载体(购自Clontech)用SspI(购自Promega)及AvrII(购自Promega)双酶切，切去氨苄基因(约0.6kb)，pEGFP-N1(购自Invitrogen)用AvrII酶切，分别回收大片段(约4.8kb)及小片段(1.1kb的DNA片段，该片段含有完整的卡那霉素基因)用T4DNA连接酶(购自BioLabs)连接，获得卡那霉素抗性的pcDNA3载体，命名为pcK。分别用BamHI(购自Promega)和EcoR I酶(购自Promega)双酶切pcK及KGF PCR产物，分别回收大片段及小片段(约430bp的DNA片段，该片段为人KGF基因)用T4DNA连接酶连接，获得携带人角质细胞生长因子基因的真核表达载体，含卡那霉素抗性基因，命名为pcK-KGF(图2)。

(C)携带人角质细胞生长因子基因的真核表达载体pcK-KGF的制备

用本领域的常规技术方法，将pcK-KGF质粒转化常规的感受态细菌(例如大肠杆菌DH5α)，然后大规模发酵细菌扩增质粒，离心回收菌体，采用碱变性法提取重组质粒，柱层析法大规模纯化质粒(采用无内毒素质粒大提试剂盒，TIANGEN)，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法确定DNA的纯度和含量。获得所需的质粒用于下述实验。

(3)重组减毒沙门氏菌SPH的构建与制备

(A)HGF cDNA的克隆

按文献报道(Miyazawa K，et al.BBRC，1989，163：967-973；NakamuraT，et al.Progress in Growth Factor Research 1991，3：67-85)的人肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)cDNA序列设计引物，并在正向引物中引入BamHI酶切位点，反向引物中引入SalI酶切位点。正向引物的寡核苷酸序列为5′-ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc-3′[SEQ ID NO.01]，反向引物的寡核苷酸序列为5′-tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt-3′[SEQ IDNO.02]，从人胎盘cDNA文库(购自Clontech)克隆人肝细胞生长因子基因。PCR参数为：94℃60sec，55℃60sec，72℃90sec，循环数为30，72℃延伸7min。PCR产物(图1)克隆至pBluescript SK(pSK)载体(购自Clontech)的BamHI(购自Promega)和SalI酶(购自Promega)酶切位点中，命名为pSK-HGF。

用XhoI酶(购自Promega)酶切pSK-HGF，0.8％琼脂糖(西班牙原装)凝胶电泳分离后，分别回收(凝胶回收试剂盒，购自Promega)大小约3.5kb、1.1kb、0.6kb的DNA片段，将3.5kb片段用T4DNA连接酶(购自BioLabs)自连得到pSK-HGF1，再将1.1kb和0.6kb片段分别插入pSK载体的XhoI酶切位点中，分别命名为pSK-HGF2和pSK-HGF3。测序反应策略是：pSK-HGF1用T3引物作一反应；pSK-HGF2用T3和T7引物分别作一反应；pSK-HGF3用T7引物作一反应。用Sanger双脱氧终止法测定人HGFcDNA序列(上海生工生物工程技术服务公司)。对pSK-HGF1、pSK-HGF2、pSK-HGF3分别用T3、T7引物作四个反应后测序并进行综合分析，将测得的人HGF全长cDNA序列与文献报道的人HGF全长cDNA序列进行比较分析表明，我们克隆的人HGFcDNA序列与文献报道的人HGF全长cDNA序列完全一致。

(B)携带人肝细胞生长因子基因的真核表达载体pcKH构建

将pcDNA3载体(购自Clontech)用SspI(购自Promega)及AvrII(购自Promega)双酶切，切去氨苄基因(约0.6kb)，pEGFP-N1(购自Invitrogen)用AvrII酶切，分别回收大片段(约4.8kb)及小片段(1.1kb的DNA片段，该片段含有完整的卡那霉素基因)用T4DNA连接酶(购自BioLabs)连接，获得卡那霉素抗性的pcDNA3载体，命名为pcK。分别用BamHI(购自Promega)和ApaI(购自Promega)双酶切pcK及pSK-HGF，分别回收大片段及小片段(2.2kb的DNA片段，该片段含有完整的人HGF基因)用T4DNA连接酶连接，获得携带人肝细胞生长因子基因的真核表达载体，含卡那霉素抗性基因，命名为pcKH。

(C)携带HGF基因的减毒沙门氏菌菌株的制备

i.电穿孔转化

将减毒沙门氏菌Ty21a冻存菌液50μL接种于5ml不含抗生素的LB培养液，震荡培养至对数生长中期(菌液A值约0.4)，4℃条件下，4000r.min-1离心收集菌体，用预冷的无菌去离子水洗涤细胞2次，洗涤后的细菌悬于1ml冰预冷的无菌去离子水。用电穿孔法(Multiporator 4308 Eppendorf电转仪)将pcKH、pcK和pcK-GFP(携带绿色荧光蛋白的真核表达载体，用于示踪观察转染效率，发明人研究室保存)质粒各0.2μg转化200μL预处理的减毒沙门氏菌。电穿孔条件：电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω，放电时间0.5s。加入SOC培养基1ml，37℃轻柔震荡培养45min，涂布于含卡那霉素(100mg.L^-1)固体LB培养基平皿，37℃培养16h后各挑取2个菌落进行鉴定。

ii.阳性工程菌的筛选

从培养板各挑取2个单菌落，分别接种于3mL含卡那霉素的LB培养液中，37℃震摇培养。转入pcKH的减毒沙门氏菌菌株的筛选通过卡那霉素抗性、PCR(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV及目的基因HGF)及提取质粒后BamHI/ApaI双酶切鉴定；转入pcK的减毒沙门氏菌菌株的筛选通过卡那霉素抗性及PCR筛选(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV)；转入pcK-GFP的减毒沙门氏菌菌株的筛选通过卡那霉素抗性及PCR筛选(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV及在荧光显微镜下观察GFP)。扩增真核表达启动子CMV的引物为：上游5′-ccc agt aca tga cct tatggg-3′[SEQ ID NO.06]，下游5′-gga gac ttg gaa atc ccc gt-3′[SEQ IDNO.07]，PCR参数为：94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，循环数为30，72℃延伸5min。扩增HGF的引物为：上游5′-ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc-3′[SEQ ID NO.01]，下游5′-tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt-3′[SEQ ID NO.02]，PCR参数为：94℃60sec，55℃60sec，72℃90sec，循环数为30，72℃延伸7min。

iii工程菌SPH的制备

将携带HGF基因真核表达载体的减毒沙门氏菌菌种(SPH)接种于含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中，35～37℃8％CO₂培养箱中培养24h做为一代菌种，将一代菌种接种至含完全培养基的克氏瓶中扩大培养做为二代菌种，并在无菌条件下取一代菌种和二代菌种样涂片，革兰氏染色后显微镜下可见呈革兰氏阴性杆菌，长链多，菌形一致。将二代克氏瓶菌种刮于100mL灭菌生理盐水菌种瓶中，比浊结果为1.7×10¹⁰个/mL，30L发酵罐发酵12h后3000r/min离心20min，收集菌体73g，加入70mL脱脂牛奶充分混匀，置于不锈钢盘中冷冻干燥，制备成无菌干粉约26g。

(4)重组减毒沙门氏菌SPK的构建与制备

(A)KGF cDNA的克隆

按文献报道(Rubin JS，et al.Proc Natl Acad Sei USA1989.86：302-306；Finch PW，et al.Science 1989，245(4919)：752-755)的人角质细胞生长因子(Keratinocyte Growth Factor，KGF)cDNA序列设计引物，在正向引物中引入BamHI酶切位点，反向引物中引入EcoR I酶切位点。正向引物的寡核苷酸序列为5’-CATGGATCCATGAGCTATGATTACATGGAAG-3’[SEQID NO.03]，反向引物的寡核苷酸序列为5’-GTCGAATTCTTAAGTGATTGCCATAGGCAG-3’[SEQ ID NO.04]，从人胎盘cDNA文库(购自Clontech)克隆人角质细胞生长因子(KGF)基因。PCR参数为：94℃预变性5min，94℃40s，55℃40s，72℃60s，循环数为30，72℃延伸10min。PCR产物(图1)用Sanger双脱氧终止法测定人KGF cDNA序列(上海生工生物工程技术服务公司)。将测得的人KGF cDNA序列与文献报道的人KGF cDNA序列进行比较分析表明，本发明克隆的人KGFcDNA序列与文献报道的人KGF cDNA序列完全一致，具体参见后文序列表部分[SEQ ID NO.05]。

(B)携带人角质细胞生长因子基因的真核表达载体pcK-KGF构建

将pcDNA3载体(购自Clontech)用SspI(购自Promega)及AvrII(购自Promega)双酶切，切去氨苄基因(约0.6kb)，pEGFP-N1(购自Invitrogen)用AvrII酶切，分别回收大片段(约4.8kb)及小片段(1.1kb的DNA片段，该片段含有完整的卡那霉素基因)用T4DNA连接酶(购自BioLabs)连接，获得卡那霉素抗性的pcDNA3载体，命名为pcK。分别用BamHI(购自Promega)和EcoR I酶(购自Promega)双酶切pcK及KGF PCR产物，分别回收大片段及小片段(约430bp的DNA片段，该片段为人KGF基因)用T4DNA连接酶连接，获得携带人角质细胞生长因子基因的真核表达载体，含卡那霉素抗性基因，命名为pcK-KGF(图2)。

(C)携带KGF基因的减毒沙门氏菌菌株的筛选与制备

i.电穿孔转化

将减毒沙门氏菌Ty21a冻存菌液50μL接种于5ml不含抗生素的LB培养液，震荡培养至对数生长中期(菌液A值约0.4)，4℃条件下，4000r.min^-1离心收集菌体，用预冷的无菌去离子水洗涤细胞2次，洗涤后的细菌悬于1ml冰预冷的无菌去离子水。用电穿孔法(Multiporator 4308 Eppendorf电转仪)将pcK-KGF质粒0.2μg转化200μL预处理的减毒沙门氏菌。电穿孔条件：电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω，放电时间0.5s。加入SOC培养基1ml，37℃轻柔震荡培养45min，涂布于含卡那霉素(100mg.L^-1)固体LB培养基平皿，37℃培养16h后各挑取2个菌落进行鉴定。

ii.阳性工程菌菌株SPK的筛选

从培养板各挑取2个单菌落，分别接种于3mL含卡那霉素的LB培养液中，37℃震摇培养。转入pcK-KGF的减毒沙门氏菌菌株的筛选通过卡那霉素抗性、PCR(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV及目的基因KGF)及提取质粒后BamHI/EcoR I双酶切鉴定(图3)；扩增真核表达启动子CMV的引物为：上游5′-ccc agt aca tga cct tat ggg-3′[SEQ ID NO.06]，下游5′-gga gac ttg gaa atc ccc gt-3′[SEQ ID NO.07]，PCR参数为：94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，循环数为30，72℃延伸5min。扩增KGF的引物为：上游5′-CATGGATCCATGAGCTATGATTACATGGAAG-3′[SEQID NO.03]，下游5′-GTCGAATTCTTAAGTGATTGCCATAGGCAG-3′[SEQ ID NO.04]，PCR参数为：94℃60sec，55℃60sec，72℃90sec，循环数为30，72℃延伸7min。筛选的阳性工程菌株命名为SPK。

iii.工程菌SPK的制备

将携带KGF基因真核表达载体的减毒沙门氏菌菌种(SPK)接种于含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中，35～37℃8％CO₂培养箱中培养24h做为一代菌种，将一代菌种接种至含完全培养基的克氏瓶中扩大培养做为二代菌种，并在无菌条件下取一代菌种和二代菌种样涂片，革兰氏染色后显微镜下可见呈革兰氏阴性杆菌，长链多，菌形一致。将二代克氏瓶菌种刮于100mL灭菌生理盐水菌种瓶中，比浊结果为1.7×10¹⁰个/mL，30L发酵罐发酵12-14h后4000r/min离心20min，收集菌体70g，加入70mL脱脂牛奶充分混匀，置于不锈钢盘中冷冻干燥，制备成无菌干粉约20g。

实施例2：HGF重组质粒pcKH及重组减毒沙门氏菌SPH治疗大鼠皮 肤急慢性溃疡的效果观察

(一)SPH对Wistar大鼠急性创面修复的影响

(1)实验动物及模型：

军事医学科学院实验动物中心提供的Wistar大鼠7只，雄性，体重220～240克。实验前一周购入，自由饮水与摄食，实验当日禁食，在麻醉条件下背部净毛，面积7×5cm，待消毒后用特制致伤器(打孔器，直径1.8cm)在大鼠背部脊柱两侧各旁开1.5cm处各压一痕迹，用剪刀沿痕迹剪去全层皮肤，形成两个圆形创面，止血后备用。

(2)SPH应用方法：

将Wistar大鼠7只随机分为二组并编号，1～7号的左侧创面为第一组(生理盐水组)，右侧创面为第二组(SPH组)。第一组给予生理盐水0.1ml/创面，第二组给予SPH 30mg/创面。伤后给予油纱覆盖再用无菌纱布绕胸部包扎，松紧适宜(以不影响呼吸为准)，SPH胶囊每三天换药一次，至伤后14天。每次换药将纱布揭开，创面无菌处理后，用注射器将生理盐水均匀滴注于相应创面，棉签蘸胶囊粉剂均匀涂于创面，用无菌纱布包扎后单笼喂养。

(3)评价指标与方法：

创面照相，透明膜描记称量法记录伤后0、3、7、14天创面面积；伤后3天处死一只大鼠，14天后全部处死其余14只大鼠，取创面组织，经福尔马林固定后常规染色，重点观察创面肉芽组织生长(包括毛细血管生长，胶原沉积)与再上皮化变化，以评价修复结果。

(4)实验结果

(A)创面面积：

经不同治疗方法处理的创面面积随时间延长而逐渐缩小；SPH组创面在治疗后3天、7天和14天均较生理盐水组者为小，结果见表1。

表1不同治疗方法处理后各时间点创面面积比较(cm²，x±s)

伤后天数	生理盐水组	SPH组
			0	2.58±0.12	2.37±0.22
3	2.34±0.11	2.25±0.10
			7	1.35±0.27	0.94±0.30
14	0.22±0.17	0.11±0.06

(B)组织学检查

切片经HE染色，伤后3天见生理盐水组和SPH组创面均有极少量肉芽组织生成，但SPH组肉芽多于生理盐水组。伤后14天，创面接近愈合，SPH组愈合情况好于生理盐水组。

(C)实验结论

本实验观察到SPH对Wistar大鼠创面修复有促进作用，表现在促进创面肉芽组织生长，加速创面再上皮化。

(二)SPH与pcKH对大鼠慢性难愈合创面修复的影响

(1)实验动物及模型：

甘肃省中医学院实验动物中心提供的Wistar大鼠9只，雄性，体重200～220克。用高脂饲料加小剂量STZ腹腔注射建立实验性2型糖尿病大鼠慢性难愈合创面模型，血糖水平持续高于22mmol/L时，实验当日禁食，在麻醉条件下背部净毛，面积7×5cm，待消毒后用特制致伤器(打孔器，直径1.5cm)在大鼠背部压一痕迹，用剪刀沿痕迹剪去全层皮肤，形成一个圆形创面，止血后备用。

(2)SPH与pcKH的应用：

将模型大鼠随机分为三组：SPH组、pcKH组和对照组，每组3只。在创口制备好即刻，每个创面分别给予0.03g SPH和相当0.03g SPH提取的质粒量的pcKH及同体积的PBS溶液。每次换药将纱布揭开，创面无菌处理后，用注射器将生理盐水均匀滴注于相应创面，棉签蘸胶囊粉剂均匀涂于创面，用无菌纱布包扎后单笼喂养。三日一次，共3次。

(3)大体观察创口愈合速度：

基因转移后每两天检测创口的横径和纵径。结果SPH组创口愈合速度明显快于pcKH及对照组。创口横径和纵径测量值也表明SPH组创口愈合速度明显快于pcKH及对照组，结果见表2、表3。

表2不同治疗方法处理后各时间点创面横径(a)和纵径(b)比较(cm，x±s)

表3不同治疗方法处理后各组平均愈合天数比较(x±s)

分组	平均愈合天数
		对照	36.67±3.40
pcKH	28.33±1.25
		SPH	21.33±1.25

(4)组织学检查：

伤口愈合后取创面皮肤组织，经福尔马林固定后常规染色，重点观察创面肉芽组织生长与再上皮化变化，以评价修复结果。结果切片经HE染色后，可见SPH组创面愈合情况好于pcKH及对照组，pcKH组愈合情况好于对照组，主要表现在上皮化组织SPH组平整且增生不明显，可见较多新生的小血管，对照组愈合面凹凸不平且增生非常显著，少见血管形成，pcKH组介于SPH组与对照组之间。表明SPH组治愈伤口的作用明显优于pcKH组及对照组而且修复的皮肤组织很为正常，其可抑制瘢痕组织形成。

(5)实验结论：

本实验观察到SPH对Wistar大鼠慢性难愈合慢性创面修复有促进作用，表现在促进创面快速修复，加速创面再上皮化，促进肉芽组织生长，促进局部血管形成，抑制瘢痕增生形成。

(三)Ad-HGF对大鼠慢性难愈合创面修复的影响

(1)实验动物及模型：同上一试验。

(2)Ad-HGF应用：

将模型大鼠随机分为二组：Ad-HGF组、对照组，每组5只。在创口制备好即刻，每个创面分别给予相当8x10⁸pfu的Ad-HGF药液及同体积的PBS溶液一次。

(3)大体观察创口愈合速度：

基因转移后不同时间(0、3、7、10、14、21天)检测创口面积。结果Ad-HGF组创口愈合速度明显快对照组。结果见表4-1、表4-2。

表4-1Ad-HGF对大鼠溃疡创面面积的影响

注：^＊与对照组比：^＊p＜0.05，^＊＊p＜0.01，^＊＊＊p＜0.001。

表4-2Ad-HGF对大鼠溃疡创面愈合率的影响

注：(1)^＊与对照组比：^＊p＜0.05，^＊＊p＜0.01，^＊＊＊p＜0.001

(4)实验结论：

本实验观察到Ad-HGF对Wistar大鼠慢性难愈合慢性创面修复有促进作用，表现在促进创面快速修复，创面愈合率高。

发明人还发现，重组腺病毒Ad-KGF也具有与上述Ad-HGF类似的令人满意的结果。

(四)SPK对大鼠慢性难愈合创面修复的影响

(1)实验动物及模型：同上一试验。

(2)SPK应用：

将模型大鼠随机分为六组：对照组、SPK不同剂量组，每组5只。在创口制备好即刻，每个创面分别给予15，30，60，120ug的SPK溶液和及同体积的PBS溶液。三日一次，共3次。

(3)大体观察创口愈合速度：

基因转移后不同时间(0、3、7、10、14、21天)检测创口面积。结果SPK组创口愈合速度明显快对照组。结果见表5、表6。

表5SPK对大鼠溃疡创面面积的影响

注：^＊与对照组比：^＊p＜0.05，^＊＊p＜0.01，^＊＊＊p＜0.001。

表6SPK对大鼠溃疡创面愈合率的影响

注：^＊与对照组比：^＊p＜0.05，^＊＊p＜0.01，^＊＊＊p＜0.001

(4)组织学检查：

伤后7，14和21天组织病理学观察，结果显示：伤后7天多数对照组皮肤缺损表面可见薄层坏死组织和变性坏死的炎细胞，少量肉芽组织增生，偶见毛细血管，未见表皮再生现象(图4，照片1)，而SPK组见有大量肉芽组织，毛细血管较多(图4，照片4)；伤后14天对照组皮肤缺损处肉芽组织增生不良，伴有水肿，缺损边缘可见表皮再生，但层次较薄，伴有坏死(图4，照片2)，而SPK组皮肤缺损处肉芽组织已经转变成纤维结缔组织，层次较厚，毛细血管丰富，缺损边缘可见表皮明显再生，并向缺损处伸展覆盖(图4，照片5)；伤后21天对照组皮肤缺损处肉芽组织已转变成纤维结缔组织，层次较厚，伴有水肿，缺损边缘可见表皮明显再生，并向缺损处伸展覆盖(图4，照片3)，组织结构尚不完整，而SPK组皮肤缺损处肉芽组织已经转变成纤维结缔组织，层次较厚，除个别动物外，多数动物创伤处表皮缺损已完全愈合(图4，照片6)。各照片详细说明如下：

照片1.对照鼠伤后7天：皮肤缺损表面可见较多不规则坏死组织和大量变性坏死的炎细胞，未见肉芽组织增生和表皮再生现象。

照片2.对照鼠伤后14天：皮肤缺损处肉芽组织增生不良，伴有水肿，缺损边缘可见表皮再生，层次较薄，伴有坏死，

照片3.对照鼠伤后21天：皮肤缺损处肉芽组织已经转变成纤维结缔组织，层次较厚，缺损边缘可见表皮明显再生并向缺损处大幅度伸展覆盖，

照片4.SPK治疗鼠伤后7天：皮肤缺损处肉芽组织增生，层次较厚，伴有水肿，缺损边缘可见表皮再生并向缺损处伸展覆盖，

照片5.SPK治疗鼠伤后14天：皮肤缺损处肉芽组织已经转变成纤维结缔组织，层次较厚，缺损边缘可见表皮明显再生并向缺损处大幅度伸展覆盖，

照片6.SPK治疗鼠伤后21天：皮肤缺损处肉芽组织向纤维结缔组织转变，层次较厚，缺损边缘可见表皮明显再生并向缺损处伸展覆盖。

(5)实验结论：

本实验观察到SPK对Wistar大鼠慢性难愈合慢性创面修复有促进作用，表现在促进创面快速修复，创面愈合率高，创面表皮明显再生并向缺损处伸展覆盖。

实施例3：重组减毒沙门氏菌SPH治疗大鼠溃疡性结肠炎的效果观察

(1)实验动物及模型：

Wistar健康大鼠50只，体重220～250g，清洁级，由甘肃中医学院动物中心(SPF)提供。50只Wistar大鼠实验前禁食不禁水48h，随机取40只第0d大鼠吸入乙醚麻醉，仰卧位，将一根聚乙烯管(直径约2mm)经肛门插入肠道，深度8cm，将30mg(150mg/kg)TNBS与50％乙醇等体积溶液(V/V)注入肠道，保持肛门高位5min，防止液体流出，余10只大鼠以等量生理盐水取代TNBS灌肠液灌肠，其余过程均相同。

(2)动物分组及治疗：

将TNBS灌肠的40只大鼠随机分为4组：SP(携带空质粒pcK的减毒沙门氏菌菌株)治疗组、SPH(携带HGF基因真核表达质粒pcKH的减毒沙门氏菌菌株)治疗组、SPG(携带绿色荧光蛋白基因(GFP)质粒的的减毒沙门氏菌菌株)观察组、模型对照组，生理盐水灌肠大鼠设为正常对照组，每组10只。灌肠后第3d开始灌胃治疗，隔日一次，每只0.5ml菌液。将SP、SPH、SPG菌液分别接种于含卡那霉素的LB培养基中振荡过夜，9h后收集菌体，PBS洗涤后，用100g/L NaHCO₃溶液悬浮，调整细菌数为2×10⁹cfu/mL，立即灌胃。模型对照组和正常对照组给予同体积100g/L NaHCO₃。

(3)大体观察：

正常对照组大鼠肠管黏膜皱襞纹理清晰，未见糜烂及溃疡；模型对照组及SP治疗组大鼠肠管变粗，肠壁部分甚至膨胀巨大变薄，肠管黏膜坏死组织、溃疡及糜烂面的上面有黑黄色膜状物附着，其附近黏膜充血、水肿明显；SPH治疗组大鼠肠壁与正常大鼠接近，尤其是6次灌胃治疗后。

(4)组织学观察：

光镜下观察大鼠结肠组织可见，正常对照组粘膜、腺体结构清晰，粘膜下血管丰富；模型对照组粘膜糜烂、剥脱程度较重，溃疡数量多，溃疡面大，黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润，腺体破坏，组织坏死，未见明显增生现象(B1)；SP治疗组与模型对照组相比无明显差别(C1)；SPH治疗组结肠黏膜炎症充血、水肿、炎性细胞浸润程度减轻，溃疡面明显缩小或完全愈合，肠腺增生，溃疡底部可见黏膜下层有新生肉芽组织增生，毛细血管增生明显(D1)。

(5)实验结论：

本实验观察到SPH对Wistar大鼠溃疡性结肠炎难愈合创面修复有促进作用，表现在能明显减轻TNBS诱发溃疡性结肠炎模型大鼠的症状及炎症，对已形成的粘膜损伤及溃疡有促修复作用，促进局部血管形成。

实施例4：重组减毒沙门氏菌SPH治疗大鼠肺纤维化的效果观察

(1)实验动物及模型：

Wistar健康大鼠12只，体重180～200g，由甘肃中医学院动物中心(SPF)提供。BLM由天津太河制药有限公司提供，用时以生理盐水稀释为4mg/mL；携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门氏菌(SPH)由兰州军区兰州总医院实验中心提供。将W istar大鼠在实验环境训养1周后，用乙醚麻醉，仰卧固定于鼠台上，充分暴露喉头，颈部剪毛碘伏消毒后逐层分离并暴露气管，1ml注射器经气管软骨环间隙朝向肺部刺入气管，然后缓慢注入0.5mL(2mg)博莱霉素生理盐水溶液(10mg·kg-1)，并继续向气管内推注空气0.5mL后，立即将大鼠直立，旋转，使药液在双肺内均匀分布并冲散到末端气体交换单位。大鼠造模一周后，将12只体质状态基本一致的随机分为2组：SPH治疗组(6只)、模型对照组(6只)。

(2)实验动物处理：

同造模时所用方法SPH治疗组滴入1×10⁹cfu的SPH 0.2mL，继续滴入生理盐水0.3mL，推入少量空气，将大鼠直立，旋转，使药液在双肺内均匀分布；SP治疗组滴入1×10⁹cfu的SPH 0.2mL，继续滴入生理盐水0.3mL，推入少量空气，将大鼠直立，旋转，使药液在双肺内均匀分布；模型对照组仅滴入生理盐水0.5mL。

(3)气管肺泡原位灌洗：

给药30d后，颈椎脱臼处死动物，固定板上，无菌条件下进行气管肺泡原位灌洗，方法：剪毛、消毒后切开颈部皮肤，充分暴露气管后，用输液管前端细的部分剪去针头后，大致从气管3-4软骨环之间插入，5ml注射器注入3ml生理盐水反复洗肺两次，同时轻揉肺部，吸出肺泡灌洗液(TALF)，回收率45～60％，1000rpm离心五分钟，上清待测总蛋白，留0.5ml混匀后进行细胞分类计数。

(4)肺组织观察：

对各组肺组织大体进行肉眼观察；并在灌洗完后，用眼科剪取左右肺各一叶，固定于4％甲醛溶液18h后，行HE染色。

(5)实验结果：

(A)肺组织大体观察：

模型组及SP治疗组大鼠肺脏颜色灰暗，光泽差，表面粗糙不平，质地较硬，体积增大，仔细观察可见散在的灶状出血点；SPH治疗组双肺表面颜色略暗，粗糙程度明显低于模型组，出血点等病灶较少，质地较软。SPH治疗组和模型对照组的肺组织肉眼观察结果分别参见图5和图6。

(B)细胞分类计数：

离心后吸去多余上清留0.5ml的TALF混匀后进行细胞分类计数，SPH治疗组中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞绝对值(计数值)均较模型组低，中性粒细胞相对值也较低，而淋巴细胞相对值较模型组高，且差异均极显著(P＜0.01)，结果见表7。

表7各组细胞分类计数

注：与模型对照组比较，①P＜0.01，②P＜0.01，N：中性粒细胞，L：淋巴细胞，E：噬酸性粒细

(C)肺组织学观察结果：

HE染色镜检，模型组肺实质病变严重，实变和纤维化程度重，胶原沉积及纤维化区域较多、多灶性，有纤维化早期改变，多见淋巴炎性细胞浸润；SPH治疗组与模型组比较支气管周围也有灶性炎症、个别区域肺泡间隔增厚，纤维细胞、上皮细胞增生，却程度均较模型组轻。SPH治疗组和模型对照组的肺组织学显微观察结果分别见图7和图8。

(D)实验结论：

本实验观察到SPH对Wistar大鼠有显著降低炎性细胞，减少肺组织中胶原形成，从而有抑制肺纤维化形成的的作用。

实施例5：重组减毒沙门氏菌SPK治疗大鼠溃疡性结肠炎的效果观察

(1)实验动物及模型：

Wistar健康大鼠40只，体重220～250g，清洁级，由甘肃中医学院动物中心(SPF)提供。40只Wistar大鼠实验前禁食不禁水48h，随机取30只第0d大鼠吸入乙醚麻醉，仰卧位，将一根聚乙烯管(直径约2mm)经肛门插入肠道，深度8cm，将2ml 5％的乙酸溶液注入肠道，保持肛门高位5min，防止液体流出，余10只大鼠以等量生理盐水取代乙酸溶液灌肠液灌肠，其余过程均相同。

(2)动物分组及治疗：

将模型大鼠随机分为3组：SP(携带空质粒pcK的减毒沙门氏菌菌株)治疗组、SPK(携带KGF基因真核表达质粒pcK-KGF的减毒沙门氏菌菌株)治疗组和模型对照组，生理盐水灌肠大鼠设为正常对照组，每组10只。灌肠后第3d开始灌胃治疗，隔日一次，每只0.5ml菌液。将SP及SPK菌液分别接种于含卡那霉素的LB培养基中振荡过夜，9h后收集菌体，PBS洗涤后，用100g/L NaHCO₃溶液悬浮，调整细菌数为2×10⁹cfu/mL，立即灌胃。模型对照组和正常对照组给予同体积100g/L NaHCO₃。

(3)大体观察：

正常对照组大鼠肠管黏膜皱襞纹理清晰，未见糜烂及溃疡；模型对照组及SP治疗组大鼠肠管变粗，肠壁部分甚至膨胀巨大变薄，肠壁外周粘连严重，肠管黏膜可见明显溃疡及糜烂面，其附近黏膜充血、水肿明显；SPK治疗组大鼠肠壁与正常大鼠接近，尤其是6次灌胃治疗后。

(4)组织学观察：

光镜下观察大鼠结肠组织可见，正常对照组粘膜、腺体结构清晰，粘膜下血管丰富；模型对照组粘膜糜烂、剥脱程度较重，溃疡面大，黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润，腺体破坏，组织坏死，未见明显增生现象(B2)；SP治疗组与模型对照组相比无明显差别(C2)；SPK治疗组结肠黏膜炎症充血、水肿、炎性细胞浸润程度减轻，溃疡面明显缩小或完全愈合，肠腺增生，溃疡底部可见黏膜下层有新生肉芽组织增生，毛细血管增生明显(D2)。

(5)实验结论：

本实验观察到SPK对Wistar大鼠溃疡性结肠炎难愈合创面修复有促进作用，表现在能明显减轻乙酸诱发溃疡性结肠炎模型大鼠的症状，对已形成的粘膜损伤及溃疡有促修复作用，促进局部血管形成。

实施例6：SPK、SPH与pcK-KGF、pcKH对大鼠放射性难愈合创面修 复的影响

(1)动物模型制备

15只Wistar雌性大鼠，4-6周，体重200-250g，购于甘肃中医学院动物中心。乙醚麻醉大鼠，减去背部体毛，碘伏消毒，于背部脊柱左右两侧手术制备直径约为1.5cm的皮肤切口，深达皮下。然后以412cGy的X射线局部照射切口部位，制成辐射创伤模型。

(2)SPK、SPH与pcK-KGF、pcKH应用：

将15只大鼠随机分成5组，每组3只，分别为SPK组(10⁸cfu SPK菌/伤口)；pcK-KGF组(20μg pcK-KGF质粒/伤口)；SPH组(10⁸cfu SPH菌/伤口)；pcKH组(20μg pcKH质粒/伤口)；对照组(100μL生理盐水/伤口)。X射线照射后立即给药，隔日一次，共三次。每天观测并记录切口的愈合情况。

(3)大体观察创口愈合速度：

基因转移后每两天检测创口的横径和纵径，计算创口面积。结果转基因组创面较对照组创面愈合速度明显快，尤其是携带KGF基因的两组(pcK-KGF组和SPK组)结果更明显(见表8)。如表8所示，KGF组的创伤愈合速度比对照组明显加快，图示HGF代表pcKH质粒，KGF代表pcK-KGF质粒。

表8不同治疗方法处理后各组平均愈合天数比较(x±s)

分组	平均愈合天数
		对照	33.02±3.08

分组	平均愈合天数
		pcKH	25.13±2.26
SPH	23.65±4.42
		pcK-KGF	18.61±1.89
SPK	20.25±1.44

(4)组织学检查：

伤口愈合后取创面皮肤组织，经福尔马林固定后常规染色，重点观察创面肉芽组织生长与再上皮化变化，以评价修复结果。结果切片经HE染色后，可见转基因组创面较对照组创面愈合好，尤其是pcK-KGF组和SPK组更为显著。主要表现在上皮化组织pcK-KGF组和SPK组平整且增生不明显，可见较多新生的小血管，对照组愈合面凹凸不平且增生非常显著，少见血管形成，pcKH组与SPH组介于二者之间。

(5)实验结论：

本实验观察到SPK、SPH与pcK-KGF、pcKH对Wistar大鼠辐射性难愈合慢性创面修复有促进作用，表现在促进创面快速修复，加速创面再上皮化，促进肉芽组织生长，促进局部血管形成。

另外，发明人还发现，重组腺病毒Ad-KGF和Ad-HGF在上述实施例3、4、5、6中进行试验也获得了与上述实施例3、4、5、6类似的令人满意的结果。

实施例7：pcK-KGF、pcKH对大鼠肺纤维化的治疗作用

(1)动物模型制备：

Wistar健康大鼠18只，体重180～250g，由甘肃中医学院提供。将Wistar大鼠在实验环境中训养1周后，用乙醚麻醉，仰卧固定于鼠台上，充分暴露喉头，颈部剪毛碘伏消毒后逐层分离并暴露气管，1ml注射器经气管软骨环间隙朝向肺部刺入气管，然后缓慢注入0.5mL博莱霉素生理盐水溶液(10mg/kg)，并继续向气管内推注空气0.5mL后，立即将大鼠直立，旋转，使药液在双肺内均匀分布并冲散到末端气体交换单位。大鼠造模一周后，将18只体质状态基本一致的随机分为3组：pcK-KGF治疗组(6只)、pcKH治疗组(6只)，模型对照组(6只)。

(2)pcK-KGF与pcKH应用：

同造模时所用方法，pcK-KGF治疗组滴入20μg pcK-KGF质粒(溶于0.2ml生理盐水中)，继续滴入生理盐水0.3mL，推入少量空气，将大鼠直立，旋转，使药液在双肺内均匀分布；pcKH治疗组滴入20μg pcKH质粒(溶于0.2ml生理盐水中)，继续滴入生理盐水0.3mL，推入少量空气，将大鼠直立，旋转，使药液在双肺内均匀分布；模型对照组仅滴入生理盐水0.5mL。

(3)肺组织大体观察：

模型组大鼠肺脏颜色灰暗，光泽差，表面粗糙不平，质地较硬，仔细观察可见散在的灶状出血点；pcKH和pcK-KGF治疗组双肺表面颜色略暗，粗糙程度明显低于模型组，出血点等病灶较少，质地较软。模型对照组与pcKH和pcK-KGF治疗组的肺组织肉眼观察结果分别参见图9-1、图9-2和图9-3。

(4)肺组织学观察：

对各组肺组织大体进行肉眼观察；并在灌洗完后，用眼科剪取左右肺各一叶，固定于4％甲醛溶液，HE染色。

HE染色镜检，模型组肺实质病变严重，纤维化样区域较多、多灶性，有纤维化早期改变，多见淋巴炎性细胞浸润；pcKH和pcK-KGF治疗组与模型组比较支气管周围也有灶性炎症、个别区域肺泡间隔增厚，纤维细胞、上皮细胞增生，却程度均较模型组轻。模型对照组与pcKH和pcK-KGF治疗组的肺组织学显微观察结果分别见图10-1、图10-2和图10-3。

(5)肺组织RNA的提取

每组各取0.1g左右的肺组织，加入液氮后研磨至粉状，转移到经DEPC处理的离心管中。加入1ml RNAiso Reagent裂解夜室温静置5min，加入1/5体积(0.2ml)的氯仿，颠倒混匀，室温静置5min。12000rpm 4℃离心15min，取上层水相转移至新的离心管中加入与上清液等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，室温静置20min。12000rpm 4℃离心10min，弃去上清液，加入1ml 4℃预冷的75％乙醇洗涤沉淀，12000rpm 4℃离心5min，弃去上清液，待乙醇干燥后，加入50μl DEPC水溶解RNA，-70℃保存。

(6)RT-PCR

按照M-MLV逆转录酶说明书，进行逆转录。反应体系共20μl，RNA样品5μl。反应条件为：42℃，60min；70℃，15min；4℃，5min。

大鼠肺表面活性蛋白A(SP-A)引物为：A15’-CAGTCCTCAGCTTGCAAGGATC-3’[SEQ ID NO.08]，A25’-GCGTTCTCCTCAGGAGTCCTC-3’[SEQ ID NO.09]。PCR反应体系为50μl，反应条件为：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，60s，32个循环；72℃，10min。

大鼠肺表面活性蛋白C(SP-C)引物为：C15’-CCATACTGAGATGGTCCTTGAG-3’[SEQ ID NO.10]，C2 5’-GTCTGGAGCCATCTTCATGATG-3’[SEQ ID NO.11]。PCR反应体系为50μl，反应条件为：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，60s，32个循环；72℃，10min。

β-actin作为阳性对照，其引物为：F15′-TGA CGT GGA CAT CCG CAAAG-3′[SEQ ID NO.12]，F25′-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3′[SEQID NO.13]。PCR反应体系为50μl，反应条件为：94℃，5min；94℃，30s，53℃，30s，72℃，60s，32个循环；72℃，10min。

角质细胞生长因子(KGF)引物为：K15’-CATGGATCCATGAGCTATGATTACATGGAAG-3’[SEQ ID NO.03]，K25’-GTCGAATTCTTAAGTGATTGCCATAGGCAG-3’[SEQ ID NO.04]。PCR反应体系为50μl，反应条件为：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，60s，32个循环；72℃，10min。

PCR产物采用1％的凝胶电泳进行检测。

RT-PCR检测肺表面活性蛋白A/C的表达。结果分别见图11-1、11-2、11-3、和11-4。

如图11-1所示，其为β-actin凝胶电泳图，图中显示，各组均可见205bp处的β-actin条带，并无显著性差异，说明各组RNA无明显差异。图11-1中，Lane1：2000Maker；Lane2：3d pcK-KGF组；Lane3：3d pcKH组；Lane4：3d对照组；Lane5：5d pcK-KGF组；Lane6：5d pcKH组；Lane7：5d对照组；Lane8：7d pcK-KGF组；Lane9：7d pcKH组；Lane10：7d对照组。

如图11-2所示，其为SP-A凝胶电泳图，图中显示，给药处理3天后，各组的SP-A mRNA均处于较低水平，无明显差异。第5天后，pcK-KGF、pcKH组出现145bp的目标条带，SP-A mRNA水平显著增加。第7天后，各组的SP-A mRNA水平均明显提高。图11-2中，Lane1：7d pcK-KGF组；Lane2：7d对照组；Lane3：7d pcKH组；Lane4：5d pcK-KGF组；Lane5：5d对照组；Lane6：5d pcKH组；Lane7：3d pcK-KGF组；Lane8：3d对照组；Lane9：3d pcKH组；Lane10：2000Maker。

如图11-3所示，其为SP-C凝胶电泳图，图中显示，给药处理3天后，各组的SP-C mRNA均处于较低水平，无明显差异。第5天后，只有pcK-KGF组出现199bp的目标条带，其SP-C mRNA水平显著增加。第7天后，各组的SP-C mRNA水平均明显提高，但pcK-KGF组明显高于其他两组。图3SP-C中，Lane1：2000Maker；Lane2：7d pcK-KGF组；Lane3：7d对照组；Lane4：7d pcKH组；Lane5：5d pcK-KGF组；Lane6：5d对照组；Lane7：5d pcKH组；Lane8：3d pcK-KGF组；Lane9：3d对照组；Lane10：3d pcKH组。

如图11-4所示，其为KGF凝胶电泳图，图中显示，给药处理3、5、7天后，与对照组相比，各pcK-KGF组的KGF mRNA水平均明显提高，说明pcK-KGF质粒应用后可观察到明显KGF表达。图11-4中，Lane1：7dpcK-KGF组；Lane2：7d对照组；Lane3：7d pcKHH组；Lane4：5d pcK-KGF组；Lane5：5d对照组；Lane6：5d pcKH组；Lane7：3d pcK-KGF组；Lane8：3d对照组；Lane9：3d pcKH组；Lane10：2000Maker。

(7)实验结论：

本实验观察到pcK-KGF、pcKH可抑制博莱霉素致Wistar大鼠肺纤维化的作用。

实验结果表明重组质粒或重组腺病毒或重组沙门氏菌可有效治疗大鼠急，慢性创面的损伤及肺纤维化损伤。根据以上结果说明，本发明涉及的肝细胞生长因子确实具有治疗大鼠慢性创面愈合及肺纤维化愈合的作用，并且可以预见具有细胞生长因子具有本发明预期的用途。

序列表

<110>北京三有利技术发展有限公司

中国人民解放军兰州军区兰州总医院

<120>细胞生长因子治疗溃疡性疾病和肺纤维化疾病的应用

<130>IDC090022

<160>13

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

ccatcgatgt taacatgtgg gtgaccaaac tc                32

<210>2

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

tgggatccgc ggccgcctat gactgtggta cctt              34

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

catggatcca tgagctatga ttacatggaa g                31

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

gtcgaattct taagtgattg ccataggcag                  30

<210>5

<211>420

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆的人KGFcDNA序列

<400>5

agctatgatt acatggaagg tggtgatatt cgtgtgcgtc gtctgttctg tcgtacccag    60

tggtatctgc gtatcgataa acgtggcaaa gtaaaaggca cccaagaaat gaagaataat    120

tacaatatca tggaaatccg taccgtggca gttggtattg tggcaatcaa aggcgtggaa    180

agcgagttct atctggcaat gaacaaggaa ggtaaactgt atgcaaagaa agaatgcaat    240

gaagattgta acttcaaaga actgattctg gaaaaccatt acaacaccta cgcatctgct    300

aaatggaccc acaacggtgg cgaaatgttt gttgccctga atcaaaaggg cattccggtg    360

cgtggtaaaa aaaccaagaa agaacaaaaa accgcccact ttctgcctat ggcaatcact    420

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

cccagtacat gaccttatgg g            21

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

ggagacttgg aaatccccgt             20

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

cagtcctcag cttgcaagga tc         22

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

gcgttctcct caggagtcct c          21

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

ccatactgag atggtccttg ag                    22

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

gtctggagcc atcttcatga tg                    22

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

tgacgtggac atccgcaaag                       20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

ctggaaggtg gacagcgagg                       20

Claims (12)

1.细胞生长因子在制备用于预防和/或治疗溃疡性疾病和/或肺纤维化疾病的药物中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述的细胞生长因子选自肝细胞生长因子和角质细胞生长因子。

3.权利要求2的用途，其中：

所述的肝细胞生长因子是以携带肝细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌的形式使用，或者以携带肝细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式使用；和/或

所述的角质细胞生长因子是以携带角质细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌的形式使用，或者以携带角质细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式使用。

4.权利要求2或3的用途，其中：

所述的肝细胞生长因子是人肝细胞生长因子；和/或

所述的角质细胞生长因子是人角质细胞生长因子。

5.权利要求1至4任一项的用途，其特征在于以下任意一项或多项：

i)所述的重组质粒为pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他携带HGF基因的真核表达质粒；

ii)所述的重组质粒为pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他携带KGF基因的真核表达质粒；

iii)所述的重组腺病毒为Ad-HGF；

iv)所述的重组腺病毒为Ad-KGF；

v)所述的重组减毒沙门氏菌为SPH；

vi)所述的重组减毒沙门氏菌为SPK；

vii)所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病可以为糖尿病，辐射，动脉、静脉狭窄或堵塞，褥疮，慢性粘膜溃疡或其他病因引起的而致局部组织慢性溃疡；所述的溃疡性疾病还可以是溃疡性结肠炎；

viii)所述的肺纤维化疾病可以为原因不明肺纤维化疾病，反复感染引起的肺纤维化疾病，辐射引起的肺纤维化疾病，或尘埃引起的肺纤维化疾病等。

6.一种药物组合物，其包含治疗有效量的细胞生长因子和任选的药学可接受的载体。

7.权利要求6的药物组合物，其中所述的细胞生长因子选自肝细胞生长因子和角质细胞生长因子。

8.权利要求7的药物组合物，其中：

所述的肝细胞生长因子是以携带肝细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌形式存在于该药物组合物中，或者以携带肝细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式存在于该药物组合物中；和/或

所述的角质细胞生长因子是以携带角质细胞生长因子基因的重组质粒、重组腺病毒、或重组减毒沙门氏菌形式存在于该药物组合物中，或者以携带角质细胞生长因子基因的其它对于人体无毒或减毒细菌例如双歧杆菌、大肠杆菌的形式存在于该药物组合物中。

9.权利要求7或8的药物组合物，其中：

所述的肝细胞生长因子是人肝细胞生长因子；和/或

所述的角质细胞生长因子是人角质细胞生长因子。

10.权利要求6至9任一项的药物组合物，其特征在于以下任意一项或多项：

i)所述的重组质粒为pcDNA3KH(即pcKH)、pUDKH或其他携带HGF基因的真核表达质粒；

ii)所述的重组质粒为pcDNA3K-KGF(即pcK-KGF)或其他携带KGF基因的真核表达质粒；

iii)所述的重组腺病毒为Ad-HGF；

iv)所述的重组腺病毒为Ad-KGF；

v)所述的重组减毒沙门氏菌为SPH；

vi)所述的重组减毒沙门氏菌为SPK；

vii)所述的溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病可以为糖尿病，辐射，动脉、静脉狭窄或堵塞，褥疮，慢性粘膜溃疡或其他病因引起的而致局部组织慢性溃疡；所述的溃疡性疾病还可以是溃疡性结肠炎；

viii)所述的肺纤维化疾病可以为原因不明肺纤维化疾病，反复感染引起的肺纤维化疾病，辐射引起的肺纤维化疾病，或尘埃引起的肺纤维化疾病等。

11.权利要求6至10任一项的药物组合物，其可用于预防和/或治疗溃疡性疾病特别是慢性溃疡性疾病及肺纤维化疾病。

12.权利要求6至11任一项的药物组合物，其为粉针剂、注射液、涂抹液、喷雾剂、贴膜剂、搽剂、洗剂、溶液剂、粉末剂、气雾剂、微粒化制剂、微囊剂等。

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