CN114886925A - 羊胎盘提取物在制备预防或治疗癌症恶病质药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于抗肿瘤技术领域,具体涉及羊胎盘全提取物在制备预防或治疗癌症恶病质药物中的应用。本发明意外发现,依据本发明所述方法制备的羊胎盘提取物对小鼠恶病质模型具有显著的治疗作用;其中当以预防形式给药时治疗效果更显著。同时所述羊胎盘提取物安全性良好,可用于制备治疗肿瘤恶病质药物,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于药物治疗技术领域,具体涉及羊胎盘提取物在制备预防或治疗癌症恶病质药物中的应用。
背景技术
癌症恶病质是继发于癌症的一种伴随全身进行性功能障碍和组织萎缩的复杂病症。癌症恶病质以系统性炎症、负向能量和蛋白平衡、一般以体重减轻伴随骨骼肌萎缩、脂肪组织消耗为特征。50-80%的癌症患者会出现恶病质,其中至少20%直接因恶病质而死亡。由于癌症恶病质的复杂性和大量涉及肌肉萎缩的因素,目前全球尚缺乏特效的解决方案。
目前癌症恶病质的治疗手段以药物治疗、营养支持、物理锻炼为主。当前治疗药物主要是孕激素,可以增加患者食欲和体重,但对患者生活质量和生存期没有显著影响。在患者厌食症状明显时,也可以短期应用皮质类固醇治疗,但不能实现长期获益。因此,提供特异性且安全性良好的天然药物对于癌症恶病质的治疗具有重要意义。
羊胎盘提取物是指从羊胎盘中提取的多种活性物质的总称。本发明意外发现,羊胎盘提取物能够改善癌症恶病质小鼠的体重和饮食状况,抑制肿瘤面积,增加脂肪和肌肉含量,具有显著的预防和治疗癌症恶病质的作用,且安全性良好。
发明内容
针对上述技术问题,本发明的目的在于提供一种羊胎盘提取物在制备预防或治疗癌症恶病质药物中的应用,具体包括以下内容:
第一方面,本发明提供了一种羊胎盘提取物在制备预防或治疗癌症恶病质药物中的应用。
优选地,所述羊胎盘提取物的制备方法为:
(1)预处理:去除羊胎盘表面脂质、结缔组织及血块后绞碎得胎盘组织;
(2)抽提:在步骤(1)所述胎盘组织中加入抽提液进行匀浆提取,所述抽提液由生理盐水、蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂组成;
(3)离心、过滤得粗提液;
(4)将步骤(3)得到的粗提液进行超声,然后进行微滤,得微滤液;获得羊胎盘提取物。
优选地,所述步骤(2)中抽提液的组成为:0.86%(m/m)生理盐水、1%(v/v)PMSF、1%(v/v)蛋白磷酸酶抑制剂。
优选地,所述步骤(2)中胎盘组织与抽提液的比例为1g:5ml。
优选地,所述步骤(2)中匀浆参数为:60Hz,30s/次,间隙30s,连续3-5次;匀浆后在4℃,搅拌匀浆液30-60min。
优选地,所述步骤(3)中离心参数为:4℃,10000r,20min.
优选地,所述步骤(4)中超声参数为200Hz,超声5min。
优选地,所述步骤(4)中微虑使用0.45μm水系微孔滤膜和微孔滤膜过滤器进行微滤。
优选地,所述羊胎盘提取物的制备方法为:
(1)预处理:去除羊胎盘表面脂质、结缔组织及血块后绞碎得胎盘组织;
(2)抽提:在步骤(1)所述胎盘组织中加入抽提液进行匀浆提取,所述抽提液由生理盐水、蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂组成;
(3)离心、过滤得粗提液;
(4)将步骤(3)得到的粗提液进行超声,然后进行微滤,得微滤液;
(5)超滤:选择100KD的超滤膜对步骤(4)所述微滤液进行超滤,获得分子量大于100KD的羊胎盘提取物。
优选地,所述步骤(2)中抽提液的组成为:0.86%(m/m)生理盐水、1%(v/v)PMSF、1%(v/v)蛋白磷酸酶抑制剂。
优选地,所述步骤(2)中胎盘组织与抽提液的比例为1g:5ml。
优选地,所述步骤(2)中匀浆参数为:60Hz,30s/次,间隙30s,连续3-5次;匀浆后在4℃,搅拌匀浆液30-60min。
优选地,所述步骤(3)中离心参数为:4℃,10000r,20min.
优选地,所述步骤(4)中超声参数为200Hz,超声5min。
优选地,所述步骤(4)中微虑使用0.45μm水系微孔滤膜和微孔滤膜过滤器进行微滤。
优选地,所述羊胎盘提取物加入药学上可接受的载体/辅料制成药学上可接受的任一剂型。
本发明的有益效果是:本发明意外发现,依据本发明所述方法制备的羊胎盘提取物能够改善癌症恶病质小鼠的体重和饮食状况,抑制肿瘤面积,增加脂肪和肌肉含量,具有显著的预防和治疗癌症恶病质的作用,且安全性良好;相较于普通喷雾干燥以及煎煮等工艺制备的羊胎盘提取物,本发明所述方法制备获得的羊胎盘提取物能够显著抑制癌症恶病质,具有显著的治疗效果。
附图说明
图1治疗后各组小鼠去瘤后的体重变化;
图2治疗后各组小鼠肿瘤体积变化;
图3治疗后各组小鼠的附睾脂肪外观变化;
图4治疗后各组小鼠的腓肠肌外观变化;
图5治疗后各组小鼠的骨骼肌质量检测结果;
图6治疗后各组小鼠的腓肠肌HE染色结果;
图7治疗后各组小鼠的腓肠肌HE染色横截面积统计结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1羊胎盘提取物的制备
1.材料与方法
实验材料及器械准备:新鲜羊胎盘、氯化钠、1L蓝盖瓶×2、组织剪、切刀、绞肉机、三角漏斗、吸水纸、烧杯、离心管(提前灭菌);
配制无菌1L 0.86%生理盐水:利用分析天平称取7.74g氯化钠溶于900mL蒸馏水中,溶解后即得,121℃灭菌,放凉备用;
离心管提前121℃灭菌备用;
预冷:将所有用到的器材及生理盐水放入4℃中预冷,并在冰浴下进行后续实验;
将组织剪、切刀、绞肉机等实验器材酒精消毒后提前放入紫外下照射30min灭菌。
2.实验过程
将组织剪、切刀、绞肉机等实验器材酒精消毒后提前放入紫外下照射30min灭菌;打开制冰机,制备充足的冰;
取出无菌保存的羊胎盘,解冻后用预冷后的生理盐水洗净至肉色,去除表面脂质、结缔组织及血块等物质,用吸水纸吸干;
组织样品前处理及耗材准备:将胎盘组织用绞肉机绞碎,绞成肉糜后转移至2mL离心管,每管约0.3-0.4g,分装后将其转移至-80℃预冻过夜;
配制抽提液:0.86%生理盐水+1%PMSF+1%蛋白磷酸酶抑制剂,使用时现用现配,冰上操作;
匀浆:从-80℃冰箱取出预冻后的胎盘组织,按照重量(g):体积(mL)=1:5加入抽提液,利用低温组织匀浆机(频率60Hz,时间30s/次,间隙30s,连续3-5次)进行匀浆;
将匀浆液统一倒入烧杯中,把烧杯放在冰上,在4℃条件下温和的搅拌匀浆液30-60min,以便充分提取活性物质,注意匀浆过程中不要起泡;
离心:搅拌后收集匀浆液,4℃条件下10000r离心20min,除去匀浆中的细胞碎片及其他物质;
过滤:过滤漏斗中铺八层纱布(或加一层玻璃棉)来过滤上清,除去漂浮在表面的脂类物质,小心的拧干纱布以便获得最大量滤液,将其称为粗提液;
超声:将得到的粗提液利用超声破碎仪进行超声,200Hz超声5min,冰上操作;
微滤:使用0.45μm水系微孔滤膜和微孔滤膜过滤器进行微滤,获得微滤液(羊胎盘提取物);
超滤分段:采用氮气加压的超滤装置进行超滤分段,选择100KD的超滤膜,超滤获得分子量大于100KD的羊胎盘提取物;
冻干:将羊胎盘提取物和分子量大于100KD的羊胎盘提取物分别进行冻干,得到冻干粉。
实施例2治疗癌症恶病质活性检测
1.分组
将63只小鼠分为7组,分别为:A健康对照组(HC),9只;B模型组(CC),9只;C羊胎盘全提取物预防组(YTP-P),9只;D羊胎盘全提取物治疗组(YTP-T),9只;E大于100KD分子量段羊胎盘提取物预防组(>100KD-P),9只;F大于100KD分子量段羊胎盘提取物治疗组(>100KD-T),9只;G醋酸甲羟孕酮阳性对照组(MPA-T),9只。
2.喂养
动物购进后适应性饲养1周,自由饮食(常规饲料成分:蛋白质20%-50%,脂肪5%-10%,粗纤维3%-5%),环境明暗交替各12h,每天观察小鼠精神、活动状态、毛发以及其他一般状况,每天监测小鼠体质量、食物摄入量及饮水量。
3.造模
将培养瓶中处于指数生长期的小鼠结肠腺癌(CT 26)细胞,用0.25%胰酶-EDTA消化细胞1-1.5min,镜下见细胞完全脱离瓶壁分离成单个细胞,加10%FBS完全培养液终止消化,将消化后的细胞悬液,予PBS洗涤三次并予台盼蓝染色计数,以台盼蓝测定细胞活力在95%以上备用,洗涤后离心,利用PBS将细胞沉淀调整细胞悬液浓度约为1×107/ml,接种前可暂时放在冰上储存,然后将悬液用一次性注射器,接种于D-G组小鼠左前侧腋窝皮下(每只0.1ml,即1×106/只),每次吸取细胞准备接种时,一定要先混匀。形成皮下移植瘤。所有操作均在无菌条件下进行。接种肿瘤细胞后,每天监测小鼠体重、肿瘤大小、摄食量、活动状态、毛发等一般状态的变化。
4.观察指标
所有小鼠接种肿瘤后自由饮食,每天观察小鼠精神、活动状态、毛发以及其他一般状况,每天监测小鼠体质量、食物摄入量及饮水量。从可以触及皮下肿瘤开始监测肿瘤体积,肿瘤体积的估计采用公式V=0.52*a×b2(a、b分别为肿瘤的长度与宽度)。肿瘤质量通过公式M=V×F(F为实验结束时肿瘤实际质量与体积的比值),每天利用体质量减去瘤质量来估算去瘤体质量。所有测量均在每天同一时间进行。当荷瘤小鼠摄食量减少,出现颈背部毛发毛糙,毛色发暗,活动迟缓等表现,并且体重较健康对照组下降5%或者是肿瘤体积达到2000mm3时,即进入恶病质期。
5.治疗
一般接种肿瘤后3-5天会长出瘤结节,两周或者15-20天以内出现恶病质现象。待可以触及皮下肿瘤开始,预防组开始给药,C组小鼠给予每天一次羊胎盘全提取物800mg/kg剂量进行灌胃,E组小鼠给予每天一次大于100KD分子量段羊胎盘提取物800mg/kg剂量进行灌胃,灌胃量0.2ml;一直给药给到治疗组给药结束,一起处死。
待接种肿瘤的小鼠均进入恶病质状态后对照组、给药组及阳性药组开始治疗。A、B组小鼠给予每天一次生理盐水0.2ml灌胃治疗;D组小鼠给予每天一次羊胎盘全提取物800mg/kg剂量进行灌胃,F组小鼠给予每天一次大于100KD分子量段羊胎盘提取物800mg/kg剂量进行灌胃,灌胃量0.2ml;G组小鼠按照每天一次150mg.kg-1醋酸甲羟孕酮的灌胃剂量进行灌胃治疗,灌胃液体量均为0.2ml。以上治疗连续进行12天。
阳性药醋酸甲羟孕酮(纯度99%以上)的灌胃剂量为150mg.kg-1.d-1
6.标本采集
形态等生理指标:毛发(拍照)、精神、摄食量、饮水量、活动状态、体重(称)。
血清:小鼠摘眼球取血,室温静置3-4h,低温离心机于4°离心,以3000rpm离心30min取血清冻存于-80℃或者-20℃冰箱。
骨骼肌及内脏组织:腓肠肌形态及质量、肌纤维横切面积(HE染色)-处死小鼠开腹腔拍照观察脏器及附睾脂肪变化,随后,取心、肝、脾、肺、肾脏、附睾脂肪和腓肠肌称重,生理盐水清洗表面血污,滤纸吸干表面水分,每组随机选取三只新鲜小鼠腓肠肌固定于10%中性福尔马林,剩余腓肠肌及附睾脂肪立即采用液氮速冻,转移至-80℃冰箱保存。
肿瘤组织:脱颈椎处死后剥离出整个瘤体称重(精确到0.0001g)并记录,取新鲜无坏死组织后切成0.5㎝3小块置10%中性甲醛中保存备用。剩余分装至冻存管,液氮速冻后转移至-80℃冰箱保存。
7.检测指标
形态等生理指标:毛发(拍照)、精神、摄食量、饮水量、活动状态、体重(称);
骨骼肌:腓肠肌形态拍照,称重备用,冻存;HE染色;WB检测相关蛋白的变化;
内脏:拍照观察脏器及附睾脂肪变化;心、肝、脾、肺、肾脏、附睾脂肪取出后称重;附睾脂肪冻存备用;
肿瘤:重量,体积,大小拍照。
8.结果
(1)形态等生理指标检测结果
相较于健康对照组(HC),模型组(CC)小鼠的毛发状态变差,光泽暗淡,发黄;而相较于模型组(CC),羊胎盘全提取物预防组(YTP-P)、D羊胎盘全提取物治疗组(YTP-T)、大于100KD分子量段羊胎盘提取物预防组(>100KD-P)、大于100KD分子量段羊胎盘提取物治疗组(>100KD-T)和醋酸甲羟孕酮阳性对照组(MPA-T)小鼠的毛发状态有所恢复,其中羊胎盘全提取物预防组(YTP-P)和大于100KD分子量段羊胎盘提取物预防组组小鼠的毛发状态以恢复至健康对照组水平。
相较于健康对照组(HC),模型组(CC)小鼠的活动迟缓,无力;而相较于模型组(CC),羊胎盘全提取物预防组(YTP-P)、羊胎盘全提取物治疗组(YTP-T)、大于100KD分子量段羊胎盘提取物预防组(>100KD-P)、大于100KD分子量段羊胎盘提取物治疗组(>100KD-T)小鼠的活动状态恢复至健康对照组水平。
结果如图1所示,相较于处理前,模型组(CC)小鼠去瘤体质量呈下降趋势,而各给药组小鼠去瘤体质量上升;其中相较于处理前,模型组(CC)、羊胎盘全提取物预防组(YTP-P)、羊胎盘全提取物治疗组(YTP-T)、大于100KD分子量段羊胎盘提取物预防组(>100KD-P)、大于100KD分子量段羊胎盘提取物治疗组(>100KD-T)以及醋酸甲羟孕酮阳性对照组(MPA-T)小鼠去瘤体质量的增长率分别为-5.81%、8.14%、5.57%、2.24%、1.58%、0.36%:说明本发明所述的羊胎盘提取物能够显著增加癌症恶病质小鼠的体重增长。
(2)肿瘤体积
结果如图2和表1所示:
表1治疗后各组小鼠的肿瘤体积
组别 | 肿瘤质量(g) |
模型组(CC) | 5.09±3.56 |
羊胎盘全提取物预防组(YTP-P) | 1.93±2.40 |
羊胎盘全提取物治疗组(YTP-T) | 4.43±2.75 |
大于100KD分子量段羊胎盘提取物预防组(>100KD-P) | 3.27±2.54 |
大于100KD分子量段羊胎盘提取物治疗组(>100KD-T) | 4.01±3.19 |
醋酸甲羟孕酮阳性对照组(MPA-T) | 6.39±4.18 |
相较于模型组(CC)小鼠,羊胎盘全提取物预防组(YTP-P)、羊胎盘全提取物治疗组(YTP-T)、大于100KD分子量段羊胎盘提取物预防组(>100KD-P)、大于100KD分子量段羊胎盘提取物治疗组(>100KD-T)小鼠的肿瘤体积显著降低,且羊胎盘全提取物预防组(YTP-P)效果最显著;而醋酸甲羟孕酮阳性对照组(MPA-T)小鼠肿瘤体积显著增加。说明,本发明所述的羊胎盘及其不同分子量段的提取物能够抑制癌症恶病质中肿瘤生长的作用,且活性强于阳性药。
(3)附睾脂肪
治疗后各组小鼠附睾脂肪结果如图3和表2所示,A健康对照组(HC)小鼠附睾脂肪呈正常水平,脂肪含量为429.98±88.98mg;B模型组(CC)小鼠基本看不到附睾脂肪,脂肪质量显著降低至204.04±83.61mg;相较于B模型组(CC),C羊胎盘全提取物预防组(YTP-P)、D羊胎盘全提取物治疗组(YTP-T)、E大于100KD分子量段羊胎盘提取物预防组(>100KD-P)、F大于100KD分子量段羊胎盘提取物治疗组(>100KD-T)小鼠的脂肪含量均升高,脂肪含量分别为316.04±106.51mg、264.98±104.45mg、351.60±103.08mg、225.60±140.91mg;而G醋酸甲羟孕酮阳性对照组(MPA-T)脂肪含量显著降低,仅为138.56±105.85mg。
并且,模型组(CC)小鼠心脏、肾脏、骨骼肌质量显著减少,肝脏、脾脏体积及质量增加,表现为典型的癌症恶病质;而本发明所述的羊胎盘提取物预防治疗后均有所改善。说明,本发明所述的羊胎盘提取物能够预防和治疗癌症恶病质。
表2治疗后各组小鼠内脏指标检测结果(mg)
组别 | 心脏 | 肝脏 | 脾脏 | 肺 | 肾脏 | 胸腺 | 脂肪 |
A | 157.38±30.30 | 1207.33±202.56 | 99.00±16.35 | 148.20±27.78 | 392.33±42.22 | 71.27±12.30 | 729.98±88.98 |
B | 128.26±17.29<sup>*</sup> | 133.074±229.79 | 314.44±79.95<sup>***</sup> | 158.35±18.20 | 319.65±24.06*** | 24.61±13.46*** | 204.07±83.61*** |
C | 135.96±7.66 | 1283.28±230.68 | 188.99±113.80<sup>*</sup> | 157.30±19.16 | 373.78±44.20** | 42.61±14.46* | 316.04±106.51* |
D | 129.88±17.39 | 1296.90±286.77 | 232.29±106.88 | 165.94±24.68 | 338.61±32.68 | 39.79±13.89* | 264.98±104.45 |
E | 138.10±9.25 | 1327.54±193.96 | 221.73±116.90 | 169.00±35.29 | 344.76±11.43 | 62.69±15.35*** | 351.60±103.05* |
F | 136.09±21.65 | 1177.45±198.96 | 199.50±56.60<sup>*</sup> | 151.15±42.09 | 328.83±40.52 | 30.26±18.09 | 225.60±140.91 |
G | 136.04±19.23 | 1234.58±195.65 | 257.24±123.41 | 159.13±49.13 | 330.73±52.29 | 31.97±21.63 | 138.56±105.85 |
(4)腓肠肌含量
治疗后各组小鼠腓肠肌结果如图4-5,A健康对照组(HC)小鼠腓肠肌呈正常水平,腓肠肌质量为284.20±35.63mg;B模型组(CC)小鼠腓肠肌(骨骼肌)明显萎缩,腓肠肌质量显著降低至234.86±45.98mg;相较于B模型组(CC),C羊胎盘全提取物预防组(YTP-P)、D羊胎盘全提取物治疗组(YTP-T)、E大于100KD分子量段羊胎盘提取物预防组(>100KD-P)、F大于100KD分子量段羊胎盘提取物治疗组(>100KD-T)小鼠的肌肉萎缩明显改善,腓肠肌质量均升高,腓肠肌质量分别为272.86±20.94mg、257.35±20.60mg、252.28±25.89mg、240.90±83.86mg;而G醋酸甲羟孕酮阳性对照组(MPA-T)肌肉萎缩改善不明显,腓肠肌质量为232.08±33.31mg。
上述结果说明,本发明所述的羊胎盘提取物能够预防和治疗癌症恶病质。
(5)HE染色
HE染色结果如图6和7所示,光镜下观察发现,相较于A健康对照组(HC),B模型组(CC)小鼠腓肠肌肌纤维间隙增加,肌纤维形态不规则,边缘变钝,横截面积明显减小,而各治疗组肌纤维形态较前者有不同程度的改善,其中C羊胎盘全提取物预防组(YTP-P)组改善效果最显著,治疗效果良好。
综上所述,本发明所述的羊胎盘提取物能够预防和治疗癌症恶病质,能够改善癌症恶病质小鼠的体重和饮食状况,抑制肿瘤面积,增加脂肪和肌肉含量,具有显著的预防和治疗癌症恶病质的作用,且安全性良好。
Claims (10)
1.羊胎盘提取物在制备预防或治疗癌症恶病质药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述羊胎盘提取物的制备方法为:
(1)预处理:去除羊胎盘表面脂质、结缔组织及血块后绞碎得胎盘组织;
(2)抽提:在步骤(1)所述胎盘组织中加入抽提液进行匀浆提取,所述抽提液由生理盐水、蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂组成;
(3)离心、过滤得粗提液;
(4)将步骤(3)得到的粗提液进行超声,然后进行微滤,得微滤液;获得羊胎盘提取物。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述羊胎盘提取物的制备方法为:
(1)预处理:去除羊胎盘表面脂质、结缔组织及血块后绞碎得胎盘组织;
(2)抽提:在步骤(1)所述胎盘组织中加入抽提液进行匀浆提取,所述抽提液由生理盐水、蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂组成;
(3)离心、过滤得粗提液;
(4)将步骤(3)得到的粗提液进行超声,然后进行微滤,得微滤液;
(5)超滤:选择100KD的超滤膜对步骤(4)所述微滤液进行超滤,获得分子量大于100KD的羊胎盘提取物。
4.如权利要求2或3所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中抽提液的组成为:0.86%(m/m)生理盐水、1%(v/v)PMSF、1%(v/v)蛋白磷酸酶抑制剂。
5.如权利要求2或3所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中胎盘组织与抽提液的比例为1g:5ml。
6.如权利要求2或3所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中匀浆参数为:60Hz,30s/次,间隙30s,连续3-5次;匀浆后在4℃,搅拌匀浆液30-60min。
7.如权利要求2或3所述的应用,其特征在于,所述步骤(3)中离心参数为:4℃,10000r,20min。
8.如权利要求2或3所述的应用,其特征在于,所述步骤(4)中超声参数为200Hz,超声5min。
9.如权利要求2或3所述的应用,其特征在于,所述步骤(4)中微虑使用0.45μm水系微孔滤膜和微孔滤膜过滤器进行微滤。
10.如权利要求1-9任一所述的应用,其特征在于,所述羊胎盘提取物加入药学上可接受的载体/辅料制成药学上可接受的任一剂型。
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