CN117180312A - iMSCs线粒体在制备治疗骨缺损的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了iMSCs线粒体在制备治疗骨缺损的药物中的应用。本发明在不额外造成患者损伤及痛苦的情况下，利用体外培养的iMSCs分离所得线粒体辅助治疗大面积骨缺损，以更便捷、安全的方法加速骨组织的愈合，为患者术后早期负重及功能锻炼提供条件，提高患者的生活质量。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及诱导性间充质干细胞(iMSCs线粒)体在制备治疗骨缺损的药物中的应用。
背景技术
大范围骨缺损是骨科中常见的疾病，其常见的病因包括创伤、骨感染、骨肿瘤切除术以及先天骨骼系统畸形等。由于治疗周期长，对机体造成的损害大，目前骨缺损仍然是临床实践中的主要挑战之一。
对于骨缺损的治疗，目前临床上仍然存在争议。手术治疗是治疗骨缺损最有效的方法，如使用骨移植，Masquelet技术，Ilizarov技术等。然而，手术治疗后，较高的并发症和再手术率阻碍着患者的肢体功能康复。因此，临床上亟需应用其他的辅助治疗手段更好的治疗骨缺损。目前，已有报道利用骨髓浓缩液(Bone MarrowAspirate Concentrate)、富血小板血浆(PRP)、BMP蛋白等辅助治疗骨缺损。然而这些方法需要采集患者自身的骨髓以及外周血，额外增加了患者的痛苦和损伤。此外，对于BMAC，EVEL 1临床证据等级为minimal，而尚无临床证据支持单独使用PRP或与其他骨移植物联合使用来治疗骨缺损。有报道指出，BMP使用相关的疗效有限，且报告的并发症显着增加。目前也有实验研究表明，运用组织工程技术制备复合型的支架用以修复骨缺损也取得了一定的成果，但由于其制备工艺复杂，差异性打，转化率低，目前用于临床仍存在一些障碍，需要继续进行研究解决存在的问题。
血管广泛分布在骨骼中，对于骨髓稳态维至关重要，已被证明在控制骨骼发育、骨折及伤口愈合方面发挥着关键作用，并为骨髓中造血细胞和免疫细胞的分化和成熟提供了微环境，是治疗骨缺损的重要靶点之一。
线粒体在过去三十年一直被视为医学的治疗靶点。靶向线粒体缺陷的研究非常丰富，提示其具有巨大的潜力。近年来，线粒体移植用于修复组织功能的引起了学界的极大兴趣。到目前为止，线粒体移植的应用范围已扩大到各种疾病模型，包括缺血再灌注损伤、神经退行性疾病、肾损伤、ARDS等，但在治疗骨缺损中未有相关报道。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了iMSCs线粒体在制备治疗骨缺损的药物中的应用，更安全、便捷的辅助骨缺损的临床治疗。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供iMSCs线粒体在制备治疗骨缺损的药物中的应用。
进一步地，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
进一步地，上述药物的剂型为注射液。
本发明的第二方面是提供iMSCs线粒体在制备促进血管生长的药物中的应用。
进一步地，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
进一步地，上述药物的剂型为注射液。
本发明的第三方面是提供一种治疗骨缺损的线粒体注射液，其制备方法包括如下步骤：
将iMSCs细胞消化后收集，离心，弃去上清液；
加入低渗细胞裂解液，振荡；
加入洋地黄皂苷，置于冰上并进行间歇性涡旋振荡；
加入等渗液，颠倒混匀后离心，取上清转移至新的离心管中，离心，弃去上清，用线粒体储存液重悬沉淀得到该注射液。
进一步地，上述制备方法包括如下步骤：取2×108个iMSCs，胰酶消化后收集于50ml离心管离心，弃去上清，加入10ml低渗细胞裂解液，涡旋振荡10s后置于冰上2min；随后，加入1ml 0.2％洋地黄皂苷，置于冰上5min，每1分钟涡旋振荡5s；随后，加入10ml 2×等渗液，颠倒混匀后700g离心10min，取上清转移至新的离心管中，10000g离心15min，弃去上清，用1ml线粒体储存液重悬沉淀，置于冰上，2-3小时内使用。
本发明的第四方面是提供上述线粒体注射液在制备治疗骨缺损的药物中的应用。
本发明的第五方面是提供上述线粒体注射液在制备促进血管生长的药物中的应用。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明在不额外造成患者损伤及痛苦的情况下，利用体外培养的iMSCs分离所得线粒体辅助治疗大面积骨缺损，以更便捷、安全的方法加速骨组织的愈合，为患者术后早期负重及功能锻炼提供条件，提高患者的生活质量。
附图说明
图1显示了本发明一实施例中线粒体压力测试结果；其中，图A为bEnd.3细胞线粒体压力测试耗氧图，图B-E分别显示了接受了线粒体的bEnd.3细胞具有更高的基础耗氧量、最大耗氧量、ATP生成和储备呼吸能力；
图2显示了本发明一实施例中bEnd.3A/R刺激及线粒体移植后ROS水平流式检测结果；其中，图A及图B显示了A/R处理后的bEnd.3细胞其细胞内ROS含量显著增高，而线粒体移植后其细胞内ROS堆积显著缓解；
图3显示了本发明一实施例中线粒体对血管内皮细胞增殖能力的影响结果；其中，图A显示了不同处理组的bEnd.3细胞随着时间变化的细胞增殖情况，图B显示了不同处理组的bEnd.3细胞在第3天的细胞增殖统计图；
图4显示了本发明一实施例中线粒体对血管内皮细胞迁移能力的影响结果；其中，图A显示了不同处理组的bEnd.3细胞的细胞迁移图片，图B显示了不同处理组的bEnd.3细胞的划痕愈合面积的统计图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1
本实施例提供一种线粒体注射液，其制备方法包括如下步骤：
iMSCs复苏及培养：取冻存于液氮中的iMSCs，37℃的水浴锅中迅速解冻，置于已放入干细胞专用完全培养基(以下简称全培)的离心管中充分混匀，400g离心3min，全培重悬计数，以2×105/皿种入10cm皿中。每隔2天换液一次，融合至80％左右常规传代。
线粒体注射液制备：取2×108个iMSCs，胰酶消化后收集于50ml离心管离心，弃去上清，加入10ml低渗细胞裂解液，涡旋振荡10s后置于冰上2min；随后，加入1ml 0.2％洋地黄皂苷，置于冰上5min，每1分钟涡旋振荡5s；随后，加入10ml 2×等渗液，颠倒混匀后700g离心10min，取上清转移至新的离心管中，10000g离心15min，弃去上清，用1ml线粒体储存液重悬沉淀，置于冰上，2-3小时内使用。
该线粒体注射液用于治疗骨缺损，在手术结束时将线粒体注射液注射于已妥善固定的骨缺损处后常规缝合伤口即可。
实施例2
本实施例验证骨细胞线粒体对血管内皮细胞的影响，具体的实验步骤和结果如下：
骨细胞线粒体改善血管内皮细胞功能：我们体外培养了小鼠骨细胞系MLO-Y4。待其生长至80％融合时，我们通过市售线粒体提取试剂盒(Thermo，Cat No.89874)提取了MLO-Y4的线粒体并以30：1的供/受体细胞比移植入小鼠血管内皮细胞系bEnd.3中并继续培养24小时。随后，我们通过Seahorse细胞能量代谢仪以及线粒体压力测试试剂盒检测了受体细胞的能量代谢情况。我们发现，与未经处理的对照组bEnd.3相比，接受了线粒体的bEnd.3的基础耗氧、最大耗氧、ATP生成等显著升高(图1)，提示线粒体提高了bEnd.3的氧化磷酸化水平。
随后，我们对应激组bEnd.3细胞(2/2μM A/R)加入含鱼藤酮和抗霉素A各2μM的培养基刺激2小时，使得bEnd.3细胞处于氧化应激状态，对照组bEnd.3(Ctrl)加入等量培养基，刺激后更换新鲜培养基，对线粒体治疗组细胞(2/2μMA/R+Mito)以30：1的供/受体细胞比移植线粒体并继续培养24小时。通过活性氧(ROS)染色以及流式检测，我们发现A/R显著增加了bEnd.3细胞的ROS水平，然而线粒体移植后其ROS水平显著下降(图2)，提示线粒体挽救了bEnd.3细胞的氧化应激。
为了验证线粒体对血管内皮细胞增殖能力的影响，我们对对照组、A/R刺激以及A/R后移植不同比例的线粒体(3：1或30：1)的bEnd.3细胞进行CCK-8检测，发现线粒体剂量依赖性的缓解了A/R导致的细胞增殖的抑制(图3)。
为了验证线粒体对血管内皮细胞迁移能力的影响，我们将对照组(Ctrl)、鱼藤酮及抗霉素A各2μM刺激2小时(2/2μMA/R)以及A/R刺激后移植不同比例的线粒体(2/2μMA/R+3：1Mito或2/2μMA/R+30：1Mito)的bEnd.3细胞接种到12孔板中培养至90％汇合，随后用无菌移液器尖端制造一划痕，然后用PBS洗掉脱落的细胞，在0小时和24小时后对伤口进行观察，发现线粒体剂量依赖性的缓解了A/R导致的细胞迁移的抑制(图4)。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.iMSCs线粒体在制备治疗骨缺损的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射液。
4.iMSCs线粒体在制备促进血管生长的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射液。
7.一种治疗骨缺损的线粒体注射液，其特征在于，所述线粒体注射液的制备方法包括如下步骤：
将iMSCs细胞消化后收集，离心，弃去上清液；
加入低渗细胞裂解液，振荡；
加入洋地黄皂苷，置于冰上并进行间歇性涡旋振荡；
加入等渗液，颠倒混匀后离心，取上清转移至新的离心管中，离心，弃去上清，用线粒体储存液重悬沉淀得到该注射液。
8.根据权利要求7所述的线粒体注射液，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：取2×108个iMSCs，胰酶消化后收集于50ml离心管离心，弃去上清，加入10ml低渗细胞裂解液，涡旋振荡10s后置于冰上2min；随后，加入1ml 0.2％洋地黄皂苷，置于冰上5min，每1分钟涡旋振荡5s；随后，加入10ml 2×等渗液，颠倒混匀后700g离心10min，取上清转移至新的离心管中，10000g离心15min，弃去上清，用1ml线粒体储存液重悬沉淀，置于冰上，2-3小时内使用。
9.如权利要求7-8任一项所述的线粒体注射液在制备治疗骨缺损的药物中的应用。
10.如权利要求7-8任一项所述的线粒体注射液在制备促进血管生长的药物中的应用。
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