CN1869238A - 一种修复溃疡的生物制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种修复溃疡的生物制剂，属于基因工程制药技术领域。即将从人胎盘cDNA文库得到的人肝细胞生长因子基因克隆至自行构建的真核表达载体pcK上，获得人肝细胞生长因子基因的真核表达载体pcKH，并将其转入减毒沙门氏菌Ty－21a菌株，构成携带人肝细胞生长因子基因的减毒沙门氏菌工程菌株，将减毒沙门氏菌工程菌株经过大规模发酵后，收集菌体冻干后，与分散剂和辅料制成分散片或胶囊或喷涂剂等内外用制剂。发明的特点是将人肝细胞生长因子可快速修复溃疡的功能及减毒沙门氏菌作为细胞载体和提高机体免疫的功能相结合，作为制备治疗修复胃溃疡、十二指肠溃疡、口腔溃疡、皮肤溃疡或其它溃疡药物的应用。

Description

一种修复溃疡的生物制剂

技术领域

本发明属于基因工程制药技术领域，具体地说涉及一种携带人肝细胞生长因子基因真核表达载体、将该载体转入减毒沙门氏菌形成的工程菌株、以及利用该工程菌株生产的工程菌制剂及其应用。

背景技术

溃疡是一类常见病，包括胃溃疡、十二指肠溃疡、口腔溃疡、烧烫伤或外伤感染或糖尿病性或局部放疗引起的皮肤难愈合性溃疡等，给患者造成巨大痛苦，也给医疗工作带来巨大负担。胃溃疡流行病学调查表明，人口中约有10％在其一生中患过本病，而且随着社会的不断进步，各种压力增加，生活习惯、神经精神因素等导致的胃溃疡的发病率越来越高，胃溃疡由于病情延绵，病情复杂，病情加重或治疗不及时，还会导致出血、穿孔、幽门梗阻和癌变等后果，严重危害人民健康，所以应予以高度的重视。口腔溃疡是口腔粘膜疾病中最常见的溃疡性损害，可单发或多发于口腔粘膜的任何部位，临床以口腔溃疡反复发作，伴有剧烈自发性灼痛为特点，发病年龄以青壮年为多，而且女性多发于男性。口腔溃疡临床多见于患者唇内侧、舌头、舌腹、颊粘膜、前庭沟及软腭等部位，由于这些地方的粘膜缺乏角化层或角化较差，缺乏对刺激的防护功能，所以咀嚼食物和刷牙等都可以引起创伤而导致溃疡。大多数患者在没有得到有效治疗的情况下，口腔溃疡发病多年以后病情呈逐渐加重趋势，表现为口腔溃疡的发作越来越频繁，溃疡面越来越多，溃疡发作的时间延长，甚至发展到持续不愈的状况。皮肤溃疡是真皮或真皮以下的限局性皮肤缺损，其表面常覆盖有脓液、坏死组织或痂皮，愈后遗有瘢痕，可由感染、外伤、结节、肿瘤的破溃或糖尿病等所致，其大小、形态、深浅、发展过程等也不一致。目前还没有非常有效的方法来促进这些溃疡的快速愈合。

人肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)最初作为一种肝细胞有丝分裂原是从肝部分切除大鼠的血清中分离得到的(Nakamura T，et al.Biochem Biophys Res Commun，1984；122：1450)。随后相继从大鼠血小板、人血浆、人血清、大鼠肝等中分离纯化，分子量为87-105kD(Nakamura T，et al.Proc Natl Acad Sci USA，1986；83：6489；Gohda E，et al.J Clin Invest，1988；81：414；Zarnegar R，et al.Cancer Res，1989；49：3314；Asami O，et al.J Biochem；1991；109：8)。其前体是由728个氨基酸残基组成的单链，经蛋白酶水解作用产生具有生物活性的异二聚体，成熟的HGF蛋白分子由分子量为55-65kD的重链(α链)和分子量为32-36kD的轻链(β链)通过二硫键相连接。其中重链结构中包含4个Krigle结构，Krigle结构是由三个二硫键连成的双环状多肽结构。HGF中的Krigle结构与纤溶酶原具有38％的同源性，但其与HGF功能的关系目前不是十分清楚。HGF的轻链结构与丝氨酸蛋白酶结构相似，然而其与HGF功能的关系还不太了解，但其轻链蛋白序列与HGF的细胞运动作用有关(Nakamura T，et al.Nature，1989；342：440；Mizuno K，et al.Biochem Biophy Res Commun，1994；198：1161；Miyazawa K，et al.JBiol Chem，1993；268：10024)。HGF主要由间质细胞产生，在鼠、兔、人的各种组织中表达，是体内广泛分布的一种细胞因子。人HGF基因大约70kb，含有8个外显子和17个内含子，HGF基因定位于第7号染色体上(7q21.1)，人和鼠HGF cDNA序列高度保守(＞90％)，其生物学活性无明显种属差异(Nakamura T，et al.Nature，1989；342：440)。HGF是一多功能生长因子，通过与其特异性膜受体c-met结合而发挥其多样生物学作用，是间质和上皮/内皮细胞间相互作用的重要信息分子，对胚胎发育、组织器官再生、伤口愈合和血管发生起重要的调节作用(Sonnenberg E，et al.J Cell Biol，1993；123：223；Jennische E，et al.Am J Physiol.1993；265：C122；Igawa T，et al.Am J Physiol，1993；265：F61；Boccacci C，et al.Nature，1998；391：285；GiordanosS，et al.Nature，1989；339：155；Bottaro DP，et al.Science，1991；251：802；Naldini L，et al.Oncogene，1991；6：501)。HGF及其受体分布于多种器官及组织(Wolff H，et al.Hepatol，1991；14：488)，其广泛分布表明，HGF对多种组织器官有营养作用。

HGF最初被认为是一种肝细胞有丝分裂原，后来发现其对多种组织细胞的分裂、扩散和形态发生起重要的调节作用。尤其在肝脏的发育和再生中，HGF起着至关重要的作用，HGF可治疗重症肝炎、急性肝炎，防治肝纤维化、肝硬化和肝癌。HGF对肾脏疾患也有非常重要的治疗作用，可防治肾纤维化、急慢性肾功能不全等。研究表明在生理状况下HGF可促进肺上皮细胞的发生、支气管系统的管腔形成及肺支气管上皮细胞的增生，从而为HGF治疗肺纤维化、肺炎等疾患奠定了基础。HGF以其促进血管内皮细胞增生的作用使其极有可能用于临床治疗血管外伤和外周血管病、防止冠状动脉血管术后狭窄、防治动脉硬化，并可以其抗纤维化作用而用于治疗心肌炎和心肌梗死。HGF还可促进神经的发生、生存和再生，对神经有营养作用，可用于预防和治疗神经损伤。由此可见，HGF是一生物活性极为广泛的细胞因子，HGF将以其多种药理作用渗透于临床治疗的各个领域(刘克辛.《肝细胞增殖因子(HGF)分子医学研究最新进展》，天津科学技术出版社.2001，1-140)。

HGF在理论上可从多方面促进溃疡的有效、高质量愈合。首先，HGF可刺激血管内皮细胞的迁移、增殖，形成新生血管(Bussolino F，et al.J Cell Biol，1992；119：629；Morimoto A，etal.Biochem Biophys Res Commun，1991；179：1042；Sato Y，et al.Exp Cell Res，1993；204：223)，促进局部血液循环从而加速溃疡愈合；有报道HGF可浓度依存性地促进原代培养家兔胃黏膜上皮细胞的增殖，明显加速家兔胃黏膜上皮细胞损伤的修复(Watanabe S，et al.Biochem Biophys ResCommun 1994，199：1453)。除了动物体外实验模型外，Takahashi等还建立了人胃黏膜上皮细胞溃疡模型，发现前列腺素E1的抗溃疡作用是通过促进胃的成纤维细胞释放HGF来发挥的(Takahashi M，et al.J Clin Invest 1996；98：2604)。Hori K等检测了20名胃溃疡病人溃疡病灶中HGF mRNA的水平，发现HGF mRNA明显升高(Hori et al.Scand J Gastroenterol 2000，35：FGH)，这提示胃溃疡时溃疡病灶中HGF的补充对胃溃疡的修复有重要的临床意义。HGF可刺激皮肤角质细胞运动、增殖，促使伤口的再表皮化(Matsumoto K，et al.Exp Cell Res，1992；196：114)；HGF可显著抑制TGF-β的产生(Ueki T，et al.Nature Med，1999，5：226)，而TGF-β是迄今了解最多、与瘢痕形成最密切的细胞因子，HGF由于对抗TGF-β的产生而可减少瘢痕的形成；另外HGF可增强胶原酶的活性(Ueki T，et al.Nature Med，1999，5：226)，促使多余形成的胶原有效地降解。

减毒沙门氏菌是一类重要的人兽共患病原菌，目前对它的研究已很详尽，遗传背景清楚，易于操作和控制，利用它作为载体原核表达各种外源抗原已得到广泛的研究并取得良好的免疫效果(Darji A，et al.Cell 1997，91：766；Sizemore DR，et al.Vaccine ElsevierScience，1997，15(8)：804；张晓明，等.微生物学免疫学进展，2002，30(4)：54)。本研究中我们没有直接应用HGF蛋白而是采用HGF基因治疗的方法，并利用减毒沙门氏菌作为细胞载体，目的一是解决HGF蛋白直接应用存在的缺陷：细胞因子蛋白制剂存在半衰期较短，需要大剂量、反复给药才能够维持局部较高的浓度。有时即使重复应用也难以达到有效浓度，应用蛋白制剂花费较高，另外目前的纯化工艺对于人药用级生长因子蛋白的纯化还不是非常成熟，给临床治疗带来很大不便，不适合大规模的应用。利用基因治疗的方法可以克服以上缺点，提高HGF的生物利用度。二是减少用药次数及时间。基因治疗是指将基因携带在一真核表达载体上，并将其转移至损伤器官组织部位，使组织成为“微型的药物工厂”，持续分泌一定时间的重组蛋白，以达到治疗疾病的目的。三是利用减毒沙门氏菌可以口服及提高机体免疫力的优势(张晓明，等.微生物学免疫学进展，2002，30(4)：54)，减毒沙门氏菌可侵入到宿主的Peyer氏集结、肠淋巴结、肝、脾等组织，由于已减毒，最终被宿主清除。

综上所述，如何有效、快速且高质量地修复溃疡仍然是临床医学中的一大难题。而HGF这一对多器官具有营养、修复功能的多功能细胞因子却尚未应用于临床，为此，我们利用减毒沙门氏菌为细胞载体，以口服方式将HGF基因转移至损伤部位，证实其可促进创口愈合、修复胃溃疡的疗效。从而构成一种修复溃疡的生物制剂，显示出潜在的临床应用价值。

发明内容

本发明的一个目的是：构建携带人肝细胞生长因子基因的真核表达载体pcKH，包含有人肝细胞生长因子基因、卡那霉素抗性基因序列；人肝细胞生长因子基因受巨细胞病毒启动子、牛生长激素基因的聚腺苷酸信号调控。

本发明的另一个目的是：将携带人肝细胞生长因子基因的真核表达载体pcKH转入减毒沙门氏菌株中，形成携带人肝细胞生长因子基因的减毒沙门氏菌工程菌株。

本发明的再一个目的是将携带人肝细胞生长因子基因的减毒沙门氏菌工程菌株经过大规模发酵后，收集菌体冻干后与分散剂和辅料制成分散片或胶囊制剂。

本发明的又一个目的是：将减毒沙门氏菌工程菌株作为制备治疗修复胃溃疡、十二指肠溃疡、口腔溃疡、皮肤溃疡或其它溃疡药物的应用。将携带人肝细胞生长因子基因的减毒沙门氏菌工程菌株制成的制剂以口服或外用的方式修复溃疡，并通过治疗哺乳动物胃溃疡模型，观察其防治胃溃疡的效果及初步的毒副作用。

本发明首先从人胎盘cDNA文库得到的人肝细胞生长因子基因克隆至自行构建的真核表达载体pcK上，获得人肝细胞生长因子基因的真核表达载体pcKH，并将其转入减毒沙门氏菌Ty-21a菌株，构成携带人肝细胞生长因子基因的减毒沙门氏菌工程菌株，并制成生物制剂。本发明的特点是将人肝细胞生长因子可快速修复溃疡的功能及减毒沙门氏菌作为细胞载体和提高机体免疫的功能相结合，以治疗各种溃疡。胃溃疡动物模型实验结果表明，口服携带人肝细胞生长因子基因的减毒沙门氏菌工程菌株制剂后，目的基因在胃组织表达较高，溃疡病变缩小，肉芽组织形成，毛细血管增生较明显，部分见腺体增生和神经纤维增生；对照组动物胃体变小，黏膜面有显著出血及溃疡，镜下溃疡明显，未见明显增生现象。本发明提供的治疗溃疡的新的基因治疗制剂，口服后使溃疡面快速彻底地修复，打破了以抗酸、抑酸的基础上保护胃肠粘膜的传统治疗方法的思路，以完全修复溃疡面而达到根治胃溃疡为目的。国内外未见类似报道。

附图说明

图1从人胎盘cDNA克隆的HGF cDNA琼脂糖凝胶电泳结果

lane 1：lambda DNA/Eco RI+Hind III Marker；

lane 2：HGF cDNA PCR；lane 3：negative control

图2携带人肝细胞生长因子基因的真核表达载体pcKH示意图

HGF：人肝细胞生长因子基因；kana：卡那霉素抗性基因；

pCMV：巨细胞病毒启动子；BGHpA：牛生长激素基因的聚腺苷酸；

ORI：复制子

图3质粒pcKH转入减毒沙门氏菌Ty-21a菌株的菌落生长

图4利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV及目的基因HGF

lane 1：真核表达启动子CMV；lane 2：HGF cDNA；

lane 3：negative control

图5 BamHI和ApaI酶切质粒pcKH结果

Lane 1：pcK用Bam HI酶切；Lane 2：pcKH用Bam HI和Apa I双酶切；

Lane 3：pcKH用Bam HI酶切；Lane 4：lambda DNA/Eco RI+Hind III Marker

图6 pcK-GFP的减毒沙门氏菌菌株的筛选(挑取菌落在荧光显微镜下观察见绿色荧光)

图7重组沙门氏菌(pcK-GFP)有效转染小鼠巨噬细胞(荧光显微镜下观察)

图8重组沙门氏菌(pcKH)感染小鼠巨噬细胞检测目的蛋白表达

图9大鼠胃溃疡模型

图10灌胃后目的基因在胃组织高效转染

图11对大鼠胃溃疡模型的治疗效果

(a)对照组  (b)实验组

具体实施方式

实施例1：从人胎盘cDNA克隆人肝细胞生长因子(HGF)cDNA

按文献报道(Miyazawa K，et al.BBRC，1989，163：967-973；Nakamura T，et al.Progressin Growth Factor Research 1991，3：67-85)的人肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)cDNA序列设计引物，并在正向引物中引入BamHI酶切位点，反向引物中引入SalI酶切位点。正向引物的寡核苷酸序列为5’-ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc-3’，反向引物的寡核苷酸序列为5’-tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt-3’，从人胎盘cDNA文库(购自Clontech)克隆人肝细胞生长因子基因。PCR参数为：94℃ 60sec，55℃ 60sec，72℃ 90sec，循环数为30，72℃延伸7min。PCR产物(图1)克隆至pBluescript SK(pSK)载体(购自Clontech)的BamHI(购自Promega)和SalI酶(购自Promega)酶切位点中，命名为pSK-HGF。

用XhoI酶(购自Promega)酶切pSK-HGF，0.8％琼脂糖(西班牙原装)凝胶电泳分离后，分别回收(凝胶回收试剂盒，购自Promega)大小约3.5kb、1.1kb、0.6kb的DNA片段，将3.5kb片段用T4DNA连接酶(购自BioLabs)自连得到pSK-HGF1，再将1.1kb和0.6kb片段分别插入pSK载体的XhoI酶切位点中，分别命名为pSK-HGF2和pSK-HGF3。测序反应策略是：pSK-HGF1用T3引物作一反应；pSK-HGF2用T3和T7引物分别作一反应；pSK-HGF3用T7引物作一反应。用Sanger双脱氧终止法测定人HGF cDNA序列(上海生工生物工程技术服务公司)。对pSK-HGF1、pSK-HGF2、pSK-HGF3分别用T3、T7引物作四个反应后测序并进行综合分析，将测得的人HGF全长cDNA序列与文献报道的人HGF全长cDNA序列进行比较分析表明，我们克隆的人HGFcDNA序列与文献报道的人HGF全长cDNA序列完全一致。

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实施例2：携带人肝细胞生长因子基因的真核表达载体pcKH构建

将pcDNA3载体(购自Clontech)用SspI(购自Promega)及AvrII(购自Promega)双酶切，切去氨苄基因(约0.6kb)，pEGFP-N1(购自Invitrogen)用AvrII酶切，分别回收大片段(约4.8kb)及小片段(1.1kb的DNA片段，该片段含有完整的卡那霉素基因)用T4 DNA连接酶(购自BioLabs)连接，获得卡那霉素抗性的pcDNA3载体，命名为pcK。分别用BamHI(购自Promega)和ApaI(购自Promega)双酶切pcK及pSK-HGF，分别回收大片段及小片段(2.2kb的DNA片段，该片段含有完整的人HGF基因)用T4 DNA连接酶连接，获得携带人肝细胞生长因子基因的真核表达载体，含卡那霉素抗性基因，命名为pcKH(图2)。

实施例3：携带HGF基因的减毒沙门氏菌菌株的制备

1.减毒沙门氏菌的电穿孔转化

将减毒沙门氏菌Ty21a冻存菌液50μL接种于5ml不含抗生素的LB培养液，震荡培养至对数生长中期(菌液A值约0.4)，4℃条件下，4000r.min^-1离心收集菌体，用预冷的无菌去离子水洗涤细胞2次，洗涤后的细菌悬于1ml冰预冷的无菌去离子水。用电穿孔法(Multiporator 4308 Eppendorf电转仪)将pcKH、pcK和pcK-GFP(携带绿色荧光蛋白的真核表达载体，用于示踪观察转染效率，本室保存)质粒各0.2μg转化200μL预处理的减毒沙门氏菌。电穿孔条件：电压2.5kV，电容25μF，电阻200Ω，放电时间0.5s。加入SOC培养基1ml，37℃轻柔震荡培养45min，涂布于含卡那霉素(100mg.L^-1)固体LB培养基平皿，37℃培养16h后各挑取2个菌落进行鉴定。

2.阳性工程菌的筛选

从培养板(图3)各挑取2个单菌落，分别接种于3mL含卡那霉素的LB培养液中，37℃震摇培养。转入pcKH的减毒沙门氏菌菌株的筛选通过卡那霉素抗性、PCR(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV及目的基因HGF(图4))及提取质粒后BamHI/ApaI双酶切鉴定(图5)；转入pcK的减毒沙门氏菌菌株的筛选通过卡那霉素抗性及PCR筛选(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV)；转入pcK-GFP的减毒沙门氏菌菌株的筛选通过卡那霉素抗性及PCR筛选(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV及在荧光显微镜下观察GFP(图6))。扩增真核表达启动子CMV的引物为：上游5’-ccc agt aca tga cct tat ggg-3’，下游5’-gga gac ttg gaa ate ccc gt-3’，PCR参数为：94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，循环数为30，72℃延伸5min。扩增HGF的引物为：

上游5’-ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc-3’

下游5’-tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt-3’

PCR参数为：94℃60sec，55℃60sec，72℃90sec，循环数为30，72℃延伸7min。

实施例4：重组沙门氏菌感染小鼠巨噬细胞检测目的蛋白表达

取2只BALB/C小鼠，脱颈处死。无菌条件下，用无血清RPMI-1640培养基灌洗小鼠腹腔，灌洗液分别收集于50ml细胞培养瓶。37℃孵育2h，使之贴壁。然后用无抗生素RPMI-1640培养基洗涤细胞2次，洗去非贴壁细胞，加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，所地贴壁细胞即为小鼠腹腔灌洗巨噬细胞。将腹腔巨噬细胞接种于60mm细胞培养皿，80％融合后以PBS洗4遍，再分别加入重组沙门氏菌Ty-21a-HGF、Ty-21a-GFP(1×10⁵/ml细菌)，室温放置1h后以含50μg/ml庆大霉素的DMEM洗2遍，再加同样培养基放置于37℃，5％CO2细胞培养箱培养，4h后改用含50μg/ml庆大霉素和10μg/ml四环素的DMEM培养，48h后观测转染效率(图7)及目的蛋白表达(图8)。

实施例5：治疗效果观察

1.胃溃疡大鼠动物模型的制备

大鼠术前禁食不禁水24小时，3％戊巴比妥钠溶液40mg/kg体重腹腔注射麻醉，剑突下0.5cm纵向切开腹壁约2cm，自肝后找出胃，轻轻移出腹腔，用微量注射器在胃前壁胃窦部浆膜下近肌层处注射0.05ml乙酸，覆盖网膜并间断缝合腹膜、腹壁各层组织、皮肤，其后单笼饲养。

2.模型组大鼠分组及基因药物转移

将模型组大鼠(图9)随机分为实验组及对照组，每组20只。将携带HGF基因的减毒沙门氏菌菌株、不携带目的基因的减毒沙门氏菌株及携带GFP基因的减毒沙门氏菌菌株分别接种于2ml含卡那霉素的LB培养液中，震荡过夜，次日取50μL加入50ml含卡那霉素的LB培养液中，2小时后收集菌体，PBS清洗后，用10％的NaHCO3悬浮，调整细菌数为1×10⁹个/ml，每只灌胃0.2ml。隔日一次，共3次。

3.效果观察

灌胃后第3天和第5天将灌携带GFP基因的减毒沙门氏菌菌株的大鼠处死，取胃、肠、肝、脾、肾组织制备成冰冻切片，荧光显微镜下观察转染情况，结果在胃肠观察到较强的荧光(见图10)，在肝、脾、肾组织也观察到微弱的荧光。体内结果可见实验组动物(灌携带HGF基因的减毒沙门氏菌菌株组)溃疡病变缩小，肉芽组织形成，毛细血管增生较明显，部分见腺体增生和神经纤维增生(见图11b)；对照组动物(灌不携带HGF基因的减毒沙门氏菌菌株组)胃体变小，黏膜面有显著出血及溃疡，镜下溃疡明显，未见明显增生现象(见图11a)。

Claims (5)

1.一种携带人肝细胞生长因子基因的真核表达载体pcKH。

2.一种将权利要求1所述的真核表达载体pcKH转入减毒沙门氏菌形成的携带人肝细胞生长因子基因的减毒沙门氏菌工程菌株。

3、根据权利要求2所述的工程菌株，其特征是：所述减毒沙门氏菌为Ty-21a菌株。

4、一种将权利要求3所述的减毒沙门氏菌工程菌株经过大规模发酵后，收集菌体冻干后，与分散剂和辅料制成分散片或胶囊制剂。

5、一种将权利要求3所述的减毒沙门氏菌工程菌株的医疗用途，作为制备治疗修复胃溃疡、十二指肠溃疡、口腔溃疡、皮肤溃疡或其它溃疡药物的应用。

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