CN103372199B - 一种预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂 - Google Patents
一种预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103372199B CN103372199B CN201210111244.8A CN201210111244A CN103372199B CN 103372199 B CN103372199 B CN 103372199B CN 201210111244 A CN201210111244 A CN 201210111244A CN 103372199 B CN103372199 B CN 103372199B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tat
- preparation
- fusion rotein
- growth factor
- brain targeting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明提供一种预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂。该新型脑部靶向制剂包含有效量的细胞生长因子与TAT穿膜肽的融合蛋白或细胞生长因子与TAT和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白、蛋白活性保护剂和适宜辅料,其中所述细胞生长因子与TAT穿膜肽的融合蛋白或细胞生长因子与TAT和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白为活性成分。本发明的新型脑部靶向制剂具有优良的突破血脑屏障性能,并能克服单一的TAT不具有细胞选择性的缺陷,特异性靶向于脑部,通过神经营养、旁分泌等作用调控脑部神经元微环境,起到预防和治疗神经退行性疾病的作用。该新型脑部靶向制剂可以制备成冻干制剂、液体制剂或粘附制剂通过静脉注射或鼻腔给药的方式进行应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂,具体地,所述脑部靶向制剂包含有效量的细胞生长因子与TAT穿膜肽的融合蛋白或细胞生长因子与TAT和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白、蛋白活性保护剂和适宜辅料,其中所述细胞生长因子与TAT穿膜肽的融合蛋白或细胞生长因子与TAT和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白为活性成分。该脑部靶向制剂可以制备成冻干制剂、液体制剂或粘附制剂通过静脉注射或鼻腔给药的方式进行应用。
背景技术
神经退行性疾病(Neurodegenerativedisease,ND)是一组以原发性神经元变性为基础的慢性进行性神经系统疾病,主要包括阿尔茨海默氏病(Alzheimer’sdisease,AD)、帕金森病(Parkinson’sdisease,PD)和Huntington舞蹈病(Huntingtondisease)等。这些疾病临床上以特定的慢性进行性神经细胞变性死亡,导致认知功能(AD)和运动功能(PD)障碍,严重影响病人生活质量。随着世界人口老龄化,神经退行性疾病明显增加。WHO在2008年提供的数据显示,AD的发病率男性为每年30.5/1000,妇女为每年48.2/1000。
全世界目前患有AD和其他痴呆的患者达2400万人,世界每71秒钟就会出现一个新发病例。而PD发病率为每年4.5~19/十万人。经年龄校正后,其发病率大约为每年9.7~13.8/十万人,仅在美国每年就有大约60,000的新发帕金森病例。到2020年,全球大于65岁的人口数量将增加一倍,患有NS疾病的人数则随着人口老龄化的加剧而逐年增加,每3个人中至少会有1人在其一生中患有CNS疾病,仅美国一年用于治疗阿尔茨海默症的费用预计将达到500亿美元。我国是世界上老年人口最多的国家,患病率和发达国家相似。研究报告显示,我国AD和PD患病人数将在今后20年急剧上升,成为全球病人数最多,增加最快的国家。目前对神经退行性疾病的机理及治疗已进行了大量的研究,但至今尚无有效成熟的方法和药物来防治这种疾病。因此,开展ND治疗新靶点的研究及创新药物的开发,对我国重大疾病的防治,提高人民的生活质量具有重要的临床应用价值,可带来显著的社会和经济效益。
神经退行性疾病(neurodegenerativedisease,ND)共同的机制是神经元变性死亡和内源性干细胞增殖分化不足,其中神经营养因子缺乏是一个重要原因,同时,在神经退行性疾病治疗中,血脑屏障(BBB)的存在是药物难以发挥作用的另一个关键要素。Kreuter提出药物透过血脑屏障的可能机制为:(1)脑血管内皮细胞可通过胞吞作用携带载体,使药物扩散入脑;(2)吸附于脑毛细血管壁,延长药物在毛细血管壁的滞留时间并提高血管内外药物的浓度梯度,从而通过被动扩散促进药物通过血管内皮进入脑内;(3)抑制高效外排泵的作用,尤其是抑制P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的外排作用,从而延长药物活性;(4)使血脑屏障的紧密连接开放,从而使药物入脑;(5)通过跨膜方式透过血脑屏障并释放药物入脑;(6)一些表面活性物质可提高血管内皮细胞膜脂质的溶解度,使膜流动性增加,提高血脑屏障对药物的通透性。这几种机制也可能联合发挥作用。借助内源性BBB运载体使药物转运入脑,如借助载体介导的转运系统、受体介导的转运系统的药物治疗策略,以及纳米技术的运用,是目前研究的热点,虽然目前都只处于实验研究和临床试验阶段,但都有着良好的应用前景。
HIV-1反式激活蛋白(TAT)中富含精氨酸的部分GRKKRRQRRRPPQ(48~60位氨基酸残基)是TAT转位的关键功能单元。TAT穿膜机制尚未明确,可能的机制有直接穿膜、形成反向微团后穿膜以及通过细胞内吞作用穿膜。大量实验证明:分子带正电是使多肽具有穿膜能力的关键,穿膜肽内在化的作用机制有可能依赖于其碱性电荷与细胞膜上带负电荷的磷脂之间的相互作用。目前大量研究已经证实,细胞膜表面存在着几种带负电荷的物质,包括:肝素、硫酸乙酰肝素、软骨素硫酸脂等。Wender等把Tat49-57蛋白中的中性谷酰胺残基替代成丙氨酸,发现对细胞摄入量影响不大,但替代任何的碱性残基都将导致细胞摄入量显著降低(70-90%)。Rothbard等把高碱性、带正电的精氨酸七聚体片断与环孢菌素A相连接后,环孢菌素能够有效地进入小鼠真皮的T淋巴细胞,并有效抑制炎症发生。
目前,TAT已在神经细胞和中枢神经系统中成功应用。Huang等构建及表达了Tat-aFGF融合蛋白,小鼠模型显示,注射1小时后,该蛋白顺利到达大脑皮层以及海马区,并能持续8小时以上;Dietz等证明Tat与抗凋亡因子的融合蛋白(Tat-Bcl-XL)能很快进入到小脑颗粒神经元,并能对抗钾缺乏引发的小脑颗粒细胞凋亡;Fu等将用于合成乙酰胆碱的乙酰转移酶与穿膜肽Tat-PTD结合,然后递送到AD模型鼠的脑部,行为学检测实验中发现,这些小鼠的长期记忆和立体的记忆任务表现得到显著改善,显示有效抑制AD疾病中基底前脑中胆碱能神经元的丢失;Kilic等将穿膜肽TAT与GDNF连接后,使得该融合蛋白在静脉注射后有效穿过血脑屏障,并能通过抑制细胞凋亡进程而发挥其对脑梗塞模型的神经保护作用。
虽然TAT的穿膜作用显著,能有效介导大分子蛋白药物穿透BBB,但缺乏细胞选择性,不能靶向于脑部。在脑内毛细血管内皮细胞腔面上高表达的转铁蛋白受体(TfR)单克隆抗体是研究较多的特异性转运蛋白受体。载有药物分子的Tf需要与天然配体竞争结合TfR。因此人们设计了小鼠TfR的单克隆抗体OX26,它能与TfR的抗原决定部位而非天然Tf的结合部位结合,避免了靶向Tf的药物与天然配体的竞争,可携带不同的药物分子穿越血脑屏障入脑。利用转铁蛋白受体介导药物通过血脑屏障具有特异性高、效率高,生物利用度高的优点。如脑源性神经营养因子(BDNF)与OX26偶联形成的OX26-BDNF,对小鼠静脉注射后,在治疗大脑中动脉永久性梗死方面有着显著效果。
此外,通过改变传统给药方式和应用纳米制剂技术,可以促进蛋白类药物更好地进入脑组织,发挥药效。静脉注射蛋白类药物很难透过血脑屏障,且可导致全身性不良反应,而临床针对中枢神经系统疾病的治疗往往需要长期给药,皮下及静脉注射显然不适用。有研究者采用局部脑室植入方法提高脑内药物浓度,也有人利用高渗溶液、血管活性物质及对药物进行结构修饰增强脂溶性等方法增加血脑屏障开放,这些方法具有一定损伤性。嗅觉系统提供了一个直接联系脑和外周环境的桥梁,正是由于嗅黏膜与脑存在直接转运通路,使得一些外源性的物质可以绕过血脑屏障,避开肝脏的首过效应及胃肠道中代谢酶作用而直接入脑,赋予了鼻腔给药途径脑内递药通路的独特优势。研究发现,一些药物或粒径300nm以内的粒子可以通过鼻腔嗅部的嗅黏膜被吸收,透过筛板经嗅球入脑,从而在脑内发挥药物治疗作用。
药物经鼻黏膜吸收入脑主要有3条通路:嗅神经通路、嗅黏膜上皮通路和血液循环通路。前两条通路均与药物直接吸收入脑有关,后一条通路需药物先吸收进入血液循环再透过血脑屏障入脑。与当前使用的其他方法如脑室内给药相比,鼻腔给药是无侵入性地将药物导入脑脊液。这一非侵入性给药方法更简单、安全并且节省费用。对于那些目标受体位于中枢神经系统,且疗效与脑功能有关的药物比如用于帕金森氏病、阿尔兹海默氏病或偏头痛的药物,尤其是常规给药途径下脑内浓度极低的药物,优势更为明显。与鼻腔给药进入体循环而发挥全身治疗作用的研究相比,鼻腔给药靶向于中枢神经系统的研究尚处于探索阶段,如在作用机制方面尚不成熟,缺乏不同动物(鼠、狗、羊、猴)之间以及动物和人之间差异性的研究;在制剂学方面尚处于起步阶段,只有较少的制剂用于临床,如Pharmacia公司的用于替代性戒烟的尼古丁,Sandoz公司用于治疗偏头痛的二氢麦角胺鼻腔给药制剂。人们对脑部疾病鼻腔给药的兴趣还在日益增加,相信随着该领域研究的深入,有望使鼻腔给药在阿尔兹海默氏病、帕金森氏病、脑部肿瘤、精神分裂症、中风等脑部疾病的治疗上有所突破。
本发明通过基因工程技术分别制备了TAT(穿膜肽)-细胞生长因子、TAT(穿膜肽)-细胞生长因子-转铁蛋白受体单克隆抗体融合蛋白,和/或与人血清白蛋白进行物理包裹,并结合蛋白活性保护剂及其它适宜辅料组成系列药物组合物及其制剂(冻干制剂、液体制剂及纳米粒)。本发明的药物组合物具有优良的突破血脑屏障性能,并能克服单一的TAT不具有细胞选择性的缺陷,靶向于脑部,通过细胞生长因子的神经营养、旁分泌等作用调控脑部神经元微环境,起到预防和治疗神经退行性疾病的作用。
发明内容
为了保护和治疗中枢神经系统的神经元,本领域需要传递细胞生长因子突破血脑屏障(BBB)到脑内发挥其神经营养、旁分泌等作用以调控脑部神经元微环境从而达到预防和治疗神经退行性疾病的作用。本发明提供一种以细胞生长因子为主要活性成分的预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂,其特征在于其包含有效量的细胞生长因子与TAT穿膜肽的融合蛋白或细胞生长因子与TAT穿膜肽和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白、蛋白活性保护剂和适宜辅料,其中所述细胞生长因子与TAT穿膜肽的融合蛋白或细胞生长因子与TAT穿膜肽和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白为活性成分。
其中所述的细胞生长因子选自aFGF(SEQIDNo:1,GenBank登录号:NM_000800.3)、bFGF(SEQIDNo:2,GenBank登录号:AAQ73204.1)、或NGF(SEQIDNo:3,GenBank登录号:CAA36832.1中S122-241aa),所述TAT(穿膜肽)的氨基酸序列为RKKRRQRRR(SEQIDNo:4),所述转铁蛋白受体单克隆抗体选自OX-26(SEQIDNo:6,GenBank登录号:AAF70240.1)、8D3(SEQIDNo:7)、或RI7-127(可购自英国abcam公司);适用于本发明的脑部靶向制剂的蛋白活性保护剂可以选自人血白蛋白、多糖、环糊精、杆菌肽等,优选人血白蛋白;适用于本发明的脑部靶向制剂的辅料包括支撑剂(例如,甘露醇、或海藻糖等)、PBS缓冲液、泊洛沙姆、卡波、透明质酸、磷脂等。本领域技术人员可以根据实际应用的需要选择适当的蛋白活性保护基和适宜的辅料。并且,对于本发明的脑部靶向制剂中活性成分的有效量,可以由本领域技术人员或有经验的临床医师来确定。
根据本发明的某些实施方案中的一个方面,将细胞生长因子与富含精氨酸的TAT穿膜肽制成融合蛋白利用TAT穿膜肽介导细胞生长因子穿过血脑屏障进入脑,或将细胞生长因子与TAT穿膜肽和内源性BBB运载体(例如,转铁蛋白受体单克隆抗体)一起制成融合蛋白,TAT穿膜肽和内源性BBB运载体(例如,转铁蛋白受体单克隆抗体)可以协同作用介导细胞生长因子穿过血脑屏障入脑,并且可以进一步用人血清白蛋白以共价或物理方式包裹上述细胞生长因子融合蛋白以保护细胞生长因子融合蛋白的活性并增强其穿透BBB的能力和靶向性,在实际应用时该新型脑部靶向制剂可以制备成冻干制剂、或液体制剂、或粘附制剂通过静脉注射或鼻腔给药的方式进行应用。
根据本发明的优选实施方案中的一个方面,提供了一种预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂,其特征在于包含有效量的作为活性成分的细胞生长因子与TAT穿膜肽的融合蛋白或细胞生长因子与TAT穿膜肽和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白和人血清白蛋白,并且人血清白蛋白可以共价或物理方式包裹所述融合蛋白。
本发明所述的脑部靶向制剂可以制备成冻干制剂(例如,纳米粒冻干制剂)、液体制剂、或粘附制剂。本发明所述的脑部靶向制剂可以通过鼻腔给药、静脉内注射的方式施用。本领域技术人员应该理解,冻干制剂也可以复溶于适当的无菌缓冲溶液而制成注射剂。
根据本发明的某些实施方案中的一个方面,提供了一种预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂,其特征在于包含有效量的细胞生长因子与TAT穿膜肽的融合蛋白或细胞生长因子与TAT穿膜肽和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白,和/或人血清白蛋白,并且该制剂可以制备成冻干制剂。
根据本发明的某些实施方案中的一个方面,提供了一种预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂,其特征在于包含有效量的细胞生长因子与TAT穿膜肽的融合蛋白或细胞生长因子与TAT穿膜肽和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白,和/或人血清白蛋白,并且该制剂可以复配适宜的冻干支撑剂(例如,甘露醇或海藻糖)制备成冻干制剂。
根据本发明的某些实施方案中的一个方面,提供了一种预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂,其特征在包含有效量的细胞生长因子与TAT穿膜肽的融合蛋白或细胞生长因子与TAT穿膜肽和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白,和/或人血清白蛋白,并且该制剂可以添加蛋白活性保护剂和磷脂制备成纳米粒冻干制剂。
根据本发明的某些实施方案中的一个方面,提供了一种预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂,其特征在于包含有效量的细胞生长因子与TAT穿膜肽的融合蛋白或细胞生长因子与TAT穿膜肽和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白,和/或人血清白蛋白,并且该制剂可以添加蛋白活性保护剂制备成液体制剂。
根据本发明的某些实施方案中的一个方面,提供了一种预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂,其特征在于包含有效量的细胞生长因子与TAT穿膜肽的融合蛋白或细胞生长因子与TAT穿膜肽和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白,和/或人血清白蛋白,并且该制剂可以加入生物黏附材料制备成黏附制剂用于鼻腔给药的方式。
根据本发明的某些实施方案中的一个方面,提供了一种预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂,其特征在于包含有效量的细胞生长因子与TAT穿膜肽的融合蛋白或细胞生长因子与TAT穿膜肽和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白,和/或人血清白蛋白,并且该制剂通过静脉注射、或鼻腔给药的方式用于神经退行性疾病的预防和治疗。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中,本发明的上述特征和优点将更明显,其中:
图1SAMP8小鼠Morris水迷宫行为学检测(定位航行实验、空间探索实验)(A)定位航行试验小鼠运动轨迹.(B)定位航行试验潜伏期.(C)空间探索实验平台所在象限小鼠停留时间百分比.(D)空间探索试验小鼠运动轨迹.(aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001);
图2各处理组小鼠大脑切片,N:正常组;M:模型组;T1:Tat-aFGF30μg/kg组;T2:Tat-aFGF100μg/kg组;T3:Tat-aFGF300μg/kg组;aFGF:aFGF300μg/kg组;Memantine:美金刚组;NGF:神经细胞生长因子组;
图3APP/PS1小鼠Morris水迷宫行为学检测(定位航行实验、空间探索实验)APP/PS1小鼠潜伏期、平台所在象限小鼠停留时间百分比、所行距离百分比(*P<0.05vs模型组,#P<0.05,vsA组);
图4APP/PS1小鼠Aβ1-42免疫组化检测结果图(Control:SAMR1小鼠+生理盐水;Model:SAMP8小鼠+生理盐水;T1:TAT-aFGF低剂量组35μg/kg;T2:TAT-aFGF中剂量组100μg/kg;T3:TAT-aFGF高剂量组300μg/kg;A:aFGF14-154300μg/kg;红棕色:Aβ1-42斑块);
图5对Aβ25-35致大鼠海马神经元细胞毒性的拮抗作用(P<0.01),A:Aβ25-35(10uM),B:药物组合物+10μMAβ25-35,C:药物组合物+10μMAβ25-35,D:aFGF14-154+10μMAβ25-35,E:aFGF27-154+10μMAβ25-35,F:对照。结果表示为对照MTT值的百分数。数据表示为平均值±SEM(n=6).**P<0.01vsAβ25-35(10μM);
图6aFGF改构体抗Aβ1-42诱导的原代海马细胞凋亡的Bcl-2、Bax、caspase-3mRNA表达情况(A):Bcl-2基因的表达情况;(B):Bax基因的表达情况;(C):Caspase-3基因的表达情况。与Aβ1-42组比较*P<0.05,与control组比较#P<0.05;
图7新西兰兔单剂量注射aFGF(220,440,880μg/kg,A)和鼻腔给予aFGF(220μg/kg,B)后的血浆药物浓度-时间曲线图
图8新西兰兔分别静脉注射(iv)和鼻腔(in)给予TAT-haFGF14-154(220μg/kg)后兔脑脊液(CSF)里药物浓度-时间图
图9新西兰兔分别静脉注射(iv)和鼻腔(in)给予TAT-haFGF14-154(220μg/kg)后兔脑组织里药物浓度-时间图
aP<0.05vs对照组;bP<0.05vshaFGF14-154静脉注射组;cP<0.05vsTAT-haFGF14-154静脉注射组;
图10新西兰兔分别静脉注射(iv)和鼻腔(in)给以haFGF14-154和TAT-haFGF14-154后2h大脑皮层和海马区药物分布的免疫组化定性分析结果(×400);图中箭头指向棕红色为阳性结果;
图11AOX26-TAT-bFGF融合蛋白(毕赤酵母偏好)碱基序列(SEQIDNo:10),其中斜体部分为OX26碱基序列,下划线部分为连接肽碱基序列,阴影部分是TAT序列,黑色粗体部分为bFGF序列;图11BOX26-TAT-bFGF氨基酸序列(SEQIDNo:11),其中斜体部分为OX26氨基酸序列,下划线部分为连接肽氨基酸序列,阴影部分是TAT氨基酸序列,黑色粗体部分为bFGF氨基酸序列。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进一步说明,本领域技术人员应该理解,所述实施例仅是举例说明的目的,并不限制本发明。
还应该理解,除非另外,下述实施例中所用的试剂等均为市售分析纯级别的试剂,所述的纯化柱、质粒等都是商购的。
实施例1
TAT-aFGF融合蛋白的构建、表达和纯化
将编码TAT-aFGF的DNA片段(SEQIDNo:8)克隆到原核表达载体pET-3c(载体购自invitrogen)中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)(细胞购自invitrogen),氨苄抗性筛选重组子。以终浓度为1mMIPTG进行诱导表达,然后通过阳离子交换(CM-SepharoseFF)层析、肝素亲和层析(Heparin-SepharoseCL-6B)和凝胶排阻层析(SephadexG-25)联用方法分离纯化融合蛋白。MTT法检测融合蛋白对Balb/c3T3细胞的促增殖活性。
实施例2
TAT-bFGF/OX26融合蛋白的构建、表达和纯化
采用常规的基因克隆和PCR重叠技术构建含αfactor信号肽基因的毕赤酵母菌pAO815α-TAT-bFGF/OX26转移质粒来表达融合蛋白TAT-bFGF/OX26(其中TAT-bFGF/OX26的序列见SEQIDNo:10,质粒pAO815α购自invitrogen公司),使用甲醇作为唯一酵母菌生长碳源,融合蛋白被直接分泌到酵母菌体外培养液中。通过阳离子交换(CM-SepharoseFF)层析、肝素亲和层析(Heparin-SepharoseCL-6B)和凝胶排阻层析(SephadexG-25)联用方法分离纯化融合蛋白。
实施例3
bio-TAT-aFGF/OX26-SA融合蛋白的构建、表达和纯化
融合表达bio(生物素)-TAT-aFGF,将其与连有抗生物素的OX26-SA(购自英国abcam公司)通过共价结合形成bio-TAT-aFGF/OX26-SA。纯化后制备成冻干制剂,临用前用生理盐水溶解,进行静脉注射或鼻腔给药。
实施例4
TAT-FGF人血清白蛋白纳米粒子的制备和OX26修饰
pH-凝聚法制备TAT-FGF(包括TAT-aFGF或TAT-bFGF)人血清白蛋白纳米粒子:将TAT-FGF及交联剂4%戊二醛溶于白蛋白水溶液,用10%稀磷酸调pH值为5.5后加入乙醇,制得TAT-FGF白蛋白纳米粒,离心纯化。该纳米粒再与转铁蛋白受体的单克隆抗体OX26共价结合(例如,对OX26巯基化后采用马来酞亚胺法进行共价连接)。
实施例5
TAT-FGF人血清白蛋白纳米粒子的制备和RI7-127修饰
pH-凝聚法制备TAT-FGF(包括TAT-aFGF或TAT-bFGF)人血清白蛋白纳米粒子:将TAT-FGF及4%戊二醛为交联剂溶于白蛋白水溶液,10%稀磷酸调pH值为5.5后加入乙醇,制得TAT-FGF白蛋白纳米粒,离心纯化。该纳米粒再与转铁蛋白受体的单克隆抗体RI7-127共价结合(例如,对RI7-127巯基化后采用马来酞亚胺法进行共价连接,其中RI7-127购自英国abcam公司)。
实施例6
TAT-FGF阳离子纳米脂质体的制备和OX26修饰
pH-梯度法制备TAT-FGF纳米脂质体:制备空白阳离子纳米脂质体(制备方法可参见CN101491498,“一种aFGF脂质体、制备方法及其应用”;王倩,张敏静,张卉,苏志坚,项琪,黄亚东.酸性成纤维细胞生长因子脂质体的制备及体外释药动力学研究[J].中国药科大学学报.2010,41(3):248~252),用10%稀磷酸调pH值为5.5后加入TAT-FGF,制得TAT-aFGF阳离子纳米脂质体。收集TAT-FGF阳离子纳米脂质体再与转铁蛋白受体的单克隆抗体OX26共价结合(例如,对OX26巯基化后采用马来酞亚胺法进行共价连接)。
实施例7
包含有效量的实施例1制备的TAT-aFGF融合蛋白和人血清白蛋白纳米
脂质体冻干制剂鼻腔用药对早老化鼠(SAM,Senescence-acceleratedmouse)
的治疗作用
对SAM快速老化小鼠(购自天津中医药大学第一附属医院实验动物中心/老年病研究室)分组给药后进行Morris水迷宫实验。
将有效量的在上述实施例1中制备的TAT-aFGF融合蛋白和人血清白蛋白混合,并按常规技术制成纳米脂质体冻干制剂,并将该冻干制剂(在鼻腔用药前,将冻干制剂用PBS复溶)分别以30、100和300μg/kg的剂量鼻腔用药,以美金刚(购自Sigma公司)和神经细胞生长因子(NGF)(购自美国R&D公司)作为阳性药物对照,4周后进行行为学认知功能检测,病理形态学观察和相关的蛋白表达机制研究。重组蛋白能够显著改善早衰小鼠老年痴呆症的行为学症状,促进神经元细胞的修复,在30-100μg/kg的剂量范围呈现量效依赖关系。
(1)定位航行实验(placenavigation):
实验分5天进行:
1)前3天进行动物学习训练,每天训练两次(上午、下午各一次),即在120s内观察小鼠能否找到平台,如果能找到则记录找到平台所用时间,如果未找到则将动物放置平台上停留10s,然后将小鼠拿出。该阶段可考察动物的学习能力,电脑设置好后可自动识别记录。
2)第4天和第5天上午分别在同样时间测定小鼠找到平台的潜伏期,以考察动物的记忆能力。测试过程保持室内安静,周围实验人员及物体位置固定不变。
(2)空间探索实验(spatialprobe):
定位航行实验结束后在第5天下午撤除平台,选择一入水点将小鼠放入水中,测定120s内小鼠跨越原平台位置的次数及观察运动轨迹(软件记录),120s后电脑自动停止记录,将小鼠拿出。
(3)实验结果:
行为学结果(图1)表明,三种剂量的Tat-aFGF组与阳性模型组相比,学习记忆能力明显提高,有显著性差异。与相同的剂量aFGF相比,Tat-aFGF组学习记忆能力较强,有显著性差异。
结论:行为学结果参见图1,该结果表明,三种剂量的Tat-aFGF能提高AD模型鼠的学习记忆能力,相同剂量Tat-aFGF与aFGF相比,Tat-aFGF的疗效优于aFGF。
另外,从各处理组小鼠大脑切片(图2)可以看出,模型组SAM小鼠CA1区神经细胞层不完整、排列松散,细胞周围出现大量间隙,其中较多细胞结构破坏,有变性。正常对照组小鼠海马CA1区神经细胞形态规则,层次丰富,细胞排列整齐密集,胞核、胞质清晰,未见变性。给药组、美金刚组及NGF组海马CA1区神经细胞形态有明显改善,海马神经细胞内核固缩现象明显减轻,排列较模型组整齐。其中,中、高剂量重组蛋白的效果较好。
实施例8
包含有效量的实施例5制备的细胞生长因子与TAT和转铁蛋白受体单
克隆抗体的融合蛋白和人血清白蛋白的纳米脂质体尾静脉注射或鼻腔给
药对APP/PS1双转基因AD小鼠的治疗作用
本实施例将实施例5制备的细胞生长因子与TAT和转铁蛋白受体单克隆抗体RI7-127的融合蛋白与人血清白蛋白配制成组合物,制成纳米脂质体,通过尾静脉注射给药和鼻腔给药进行下述检测。在所述纳米脂质体中,TAT-FGF-RI7-127融合蛋白的含量为10重量%,人血清白蛋白含量为5重量%,制成纳米脂质体,并且冻干。在使用之前,用无菌PBS混匀尾静脉注射给药和鼻腔给药。活性成分的剂量折算成aFGF或bFGF的量来给药。
实验分组:
对照组(SAMR1小鼠)+盐水
模型组(SAMP8小鼠)+盐水
T35(组合物低剂量组):35μg/kg
T100(组合物中剂量组):100μg/kg
T300(组合物高剂量组):300μg/kg
H300(aFGF14-154):300μg/kg
NGF(阳性药物对照):250μg/kg
给药方式:尾静脉注射给药和鼻腔给药二种方式,每两天给药一次,持续5周
实验结果:
1)行为学检测-水迷宫实验(Watermazetest)结果表明Tat-aFGF中、高剂量给药组小鼠学习认知能力明显改善,小鼠找到平台潜伏期明显缩短,并在平台所在象限停留时间明显增加。
2)Aβ1-42免疫组化检测表明TAT-aFGF能显著减少APP/PS1小鼠脑部Aβ1-42沉积,使老年斑块减少。
实施例9
实施例1制备的TAT-aFGF融合蛋白体外对海马神经元细胞保护和抗凋
亡的作用
将实施例1制备的TAT-aFGF融合蛋白溶解在PBS中,制成下文所示的相应浓度的溶液进行下述检测。
1)对Aβ25-35致大鼠海马神经元细胞毒性的拮抗作用
细胞处理:培养7d的海马细胞加相应浓度的aFGF改构体(aFGF14-154和TAT-aFGF14-154)预保护2h后加相应浓度的aFGF改构体和1μM的Aβ1-42培养48h,检测细胞存活情况和相关信号通路蛋白的表达情况。aFGF14-154和TAT-aFGF14-154的浓度设为60ng/ml、300ng/ml和1500ng/ml。MTT检测细胞存活情况结果。
结果(对应图5)显示aFGF改构体在60ng/ml的浓度就可起到抗Aβ诱导的原代神经细胞凋亡的作用,1500ng/ml时改构体的抗凋亡效果最佳。
2)原代海马细胞实时PCR结果
用1500ng/ml的aFGF14-154和TAT-aFGF14-154分别预保护细胞2h,后加1μMAβ1-42和1500ng/ml的aFGF14-154和TAT-aFGF14-154孵育48h,用1μM的Aβ1-42做对照,溶剂组加1‰的DMSO处理48h。收集细胞,抽提细胞总mRNA,测RNA浓度,每组取500ng总mRNA反转录成cDNA,用于实时PCR检测。RT-PCR检测RPS、Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达情况。
结果如图6所示,Aβ1-42处理细胞48h后凋亡基因Bax、Caspase-3较正常组细胞明显上调,抗凋亡基因Bcl-2较正常组细胞明显下调。加1μMAβ的同时加aFGF14-154和TAT-aFGF14-154处理后Bax和Caspase-3基因较Aβ1-42处理后下调,抗凋亡基因Bcl-2较Aβ1-42处理后上调。
实施例10
实施例4制备的OX26修饰后的TAT-FGF纳米粒冻干制剂,临用时以
PBS复溶后鼻腔给药后在新西兰兔体内的药代动力学及血脑屏障通透性研
究
本实施例利用上述实施例4制备的脑部靶向制剂进行,以活性成分TAT-aFGF的量(220μg/kg)来进行剂量的换算。
对健康新西兰家兔(购自广东省医学实验动物中心)分别滴鼻给药(intranasal,in)和静脉注射(iv)后的药动学过程进行了研究(图7),Elisa法测定了给药后血浆和脑脊液内FGF的浓度(图8),并采用免疫组化法检测新西兰兔脑中蛋白的定位(图9)。结果显示:滴鼻给药(in)后绝对生物利用度约为50%,2h在脑脊液内FGF浓度达到峰值,进入脑内的FGF含量明显高于iv。
实施例11
人血清白蛋白包裹的TAT-bFGF纳米粒治疗帕金森病的疗效
国内外学者已证实FGF在血管形成、促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生和神经组织生长发育过程中起着十分重要的作用。但FGF在帕金森病治疗方面的研究还处于实验阶段,由于血脑屏障的影响,大部分实验还是应用细胞学方法进行体外观察。
本发明人针对TAT-bFGF在帕金森病的治疗方面进行了大量前期工作,应用现代药理学方法建立帕金森病模型动物(参照《大鼠脑立体定位图谱》和《现代医学实验方法》提供的帕金森病模型制备方法,采用整体动物用6-羟多巴(6-OHDA)脑内注射构造PD大鼠模型),,并进行了在体疗效初步观察,实验结果发现:
①TAT-bFGF脑部给药于帕金森病模型大鼠(PD大鼠),一周后,能明显改善PD大鼠的症状;
②朴吗啡诱导行为学观察表明,bFGF能使帕金森大鼠的旋转次数降低;
③脑中纹状体的单胺类神经递质多巴胺检测表明,PD大鼠脑中多巴胺减少,而在脑部给药FGF后,神经递质多巴胺、3,4二羟基苯乙酸和高香草酸的含量与模型组比较分别升高了158.2%、63.99%和398.6%;
以上实验结果表明,TAT-bFGF具有治疗帕金森病的作用。
应该理解,尽管参考其示例性的实施方案,已经对本发明进行具体地显示和描述,但是本领域的普通技术人员应该理解,在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下,可以在其中进行各种形式和细节的变化,可以进行各种实施方案的任意组合。
Claims (8)
1.一种治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂,其特征在于其包含有效量的细胞生长因子与TAT穿膜肽和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白、蛋白活性保护剂和适宜辅料,其中所述细胞生长因子与TAT穿膜肽和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白为活性成分,并且所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNo:11。
2.如权利要求1所述的新型脑部靶向制剂,其中所述蛋白活性保护剂选白人血白蛋白、多糖或杆菌肽。
3.如权利要求2所述的新型脑部靶向制剂,其中所述蛋白活性保护剂是环糊精。
4.如权利要求2所述的新型脑部靶向制剂,其中所述蛋白活性保护剂是人血白蛋白。
5.如权利要求4所述的新型脑部靶向制剂,其特征在于人血清白蛋白以共价或物理方式包裹所述细胞生长因子与TAT穿膜肽和转铁蛋白受体单克隆抗体的融合蛋白。
6.如权利要求1所述的新型脑部靶向制剂,其中所述适宜辅料选自PBS缓冲液、泊洛沙姆、卡波姆、透明质酸、磷脂、甘露醇或海藻糖。
7.如权利要求1所述的新型脑部靶向制剂,其中所述制剂为冻干制剂、液体制剂或粘附制剂。
8.如权利要求1所述的新型脑部靶向制剂,其中所述制剂通过鼻腔给药或静脉内注射的方式施用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210111244.8A CN103372199B (zh) | 2012-04-16 | 2012-04-16 | 一种预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201210111244.8A CN103372199B (zh) | 2012-04-16 | 2012-04-16 | 一种预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103372199A CN103372199A (zh) | 2013-10-30 |
CN103372199B true CN103372199B (zh) | 2015-12-16 |
Family
ID=49458443
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201210111244.8A Active CN103372199B (zh) | 2012-04-16 | 2012-04-16 | 一种预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103372199B (zh) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104387472A (zh) * | 2014-10-24 | 2015-03-04 | 广东工业大学 | 一种具有脑靶向作用的多亚基蛋白质及其制备方法、用途 |
CN104628822B (zh) * | 2015-01-30 | 2017-12-12 | 暨南大学 | 一种晚期糖基化终产物受体的特异性拮抗肽及其衍生物与应用 |
WO2017025057A1 (en) * | 2015-08-11 | 2017-02-16 | Coherent Biopharma | Multi-ligand drug conjugates and uses thereof |
CN110016083A (zh) * | 2019-04-19 | 2019-07-16 | 温州医科大学 | 一种fgf-1融合蛋白及其在脊髓损伤治疗中的用途 |
CN113925962A (zh) * | 2020-07-11 | 2022-01-14 | 杭州星鳌生物科技有限公司 | 一种新型免疫激动剂复合物的组成及其在制备防治阿尔茨海默症药物中的应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101711874A (zh) * | 2008-10-08 | 2010-05-26 | 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心 | 穿膜肽Tat介导的生长因子在透皮转运中的应用 |
-
2012
- 2012-04-16 CN CN201210111244.8A patent/CN103372199B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101711874A (zh) * | 2008-10-08 | 2010-05-26 | 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心 | 穿膜肽Tat介导的生长因子在透皮转运中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
"Tat-aFGF融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达、纯化及对海马神经元的保护作用";林健聪;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20101015(第10期);摘要第1-2页 * |
"脑靶向给药载体的研究进展";伍三兰等;《中国医院药学杂志》;20081130;第28卷(第22期);第1951页2.1.1,和第1952页第2.2.2项下第2段 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103372199A (zh) | 2013-10-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
McGonigle | Peptide therapeutics for CNS indications | |
Xue et al. | MSC-derived exosomes can enhance the angiogenesis of human brain MECs and show therapeutic potential in a mouse model of Parkinson's disease | |
US9044436B2 (en) | Compositions and methods for the treatment of angiogenesis-related eye diseases | |
CN103372199B (zh) | 一种预防和治疗神经退行性疾病的新型脑部靶向制剂 | |
EP2823823B1 (en) | Polypeptides for the preparation of drugs for treatment or prevention of rheumatoid arthritis | |
Bender et al. | Intranasal administration of glial-derived neurotrophic factor (GDNF) rapidly and significantly increases whole-brain GDNF level in rats | |
Cheng et al. | Protective effects of Tongxinluo on cerebral ischemia/reperfusion injury related to Connexin 43/Calpain II/Bax/Caspase-3 pathway in rat | |
McCall et al. | Pathogen-inspired drug delivery to the central nervous system | |
EP2605790A2 (en) | Intranasal delivery of cell permeant therapeutics | |
Yi et al. | Brain delivery of proteins via their fatty acid and block copolymer modifications | |
CN109718363B (zh) | 预防、缓解或治疗阿尔茨海默病的肽及其应用 | |
EP2799445B1 (en) | Integrin blocker polypeptide for use in the treatment of rheumatoid arthrits | |
Wang et al. | Synergic treatment of Alzheimer’s disease with brain targeted nanoparticles incorporating NgR-siRNA and brain derived neurotrophic factor | |
JP2010517593A (ja) | 組換え白血球阻害因子とヒルゲンキメラタンパク質及びその薬物組成物 | |
US20150209335A1 (en) | Methods and small molecule therapeutics comprising fused elps | |
Zhang et al. | Neuroprotective effects of insulin-like growth factor-2 in 6-hydroxydopamine-induced cellular and mouse models of Parkinson’s disease | |
US20210030848A1 (en) | Elevated intracranial pressure treatment | |
D'Andrea et al. | VEGF mimic peptides: Potential applications in central nervous system therapeutics | |
Rong et al. | A novel antitumor peptide inhibits proliferation and migration and promotes apoptosis in glioma cells by regulating the MKK6/p38 signaling pathway. | |
AU2019202876B2 (en) | Administration of Recombinant Collagen 7 for the Treatment of Age Related Disorders | |
Zhang et al. | Novel XTENylated AWRK6 analog with hypoglycemic activity, and anti-HSV-2 potential in combination with double shRNA | |
CN102871969A (zh) | 促红细胞生成素微球在制备治帕金森病运动并发症药物中的应用 | |
WO2022029810A1 (en) | Peptides able to bind angiotensin-converting enzyme 2 (ace2) and medical uses thereof | |
CN116917482A (zh) | 嵌合蛋白和治疗中枢神经系统疾病的方法 | |
EP4041272A1 (en) | Molecular guide system peptides and uses thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |