KR20040018598A - Ｔａｔ-ＰＴＥＮ 융합 단백질, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

Ｔａｔ-ＰＴＥＮ 융합 단백질, 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PTEN을 세포 투과성이 있는 Tat과 융합시켜 얻은 Tat-PTEN 융합 단백질, 이 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 폴리누클레오티드, 이 융합 단백질을 발현시키기 위한 벡터, 이 벡터를 이용하여 융합 단백질을 제조하는 방법, 및 녹내장 여과 수술후 섬유화 반흔 형성을 억제하기 위한 융합 단백질의 용도에 관한 것이다.

Description

Ｔａｔ-ＰＴＥＮ 융합 단백질, 이의 제조 방법 및 용도 {TAT-PTEN FUSION PROTEIN AND PROCESS FOR ITS PREPARATION AND ITS USE}
본 발명은 PTEN을 세포내로 도입하여 목적하는 세포내 활성을 나타낼 수 있도록, 세포 투과성이 있는 Tat과 융합시켜 얻은 Tat-PTEN 융합 단백질, 이 융합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리누클레오티드, 이 융합 단백질을 발현시키기 위한 벡터, 이 벡터를 이용하여 융합 단백질을 제조하는 방법, 및 녹내장 여과 수술후 섬유화 반흔 형성을 억제하기 위한 Tat-PTEN 융합 단백질의 용도에 관한 것이다.
PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome 10)은 MMAC1(mutated in multiple advanced cancers 1) 또는 TEP1(TGF βregulated and epithelial cell enriched phosphatase 1)라고도 명명되며, 종양 억제 유전자( tumor suppressor gene)로서 최근에 유방암, 뇌암, 전립선암 등에서 PTEN 유전자의 돌연변이(mutation)나 결실(deletion)이 발견되었다 [Kong DA, Suzuki TT, Zou A, Sakurada LW, Kemp S, Wakatsuki T, Yokoyama H, Yamakawa T, Furukawa M, Sato, et al., 1997. PTEN1 is frequently mutated in primary endometrial carcinomas, Nat. Genet., 17: 143-144; Li DM & Sun H, 1997, TEP1, encoded by a candidatetumor suppressor locus, is a novel protein tyrosine phosphatase regulated by transforming growth factor beta, Cancer Res., 57: 2124-2129; Steck PA, Pershouse MA, Jasser SA, Yung WK, Lin H, Ligon AH, Langford LA, Baumgard ML, Hattier T, Davis T, et al., 1997, Identification of a candidate tumour suppressor gene, MMAC1, at chromosome 10q23.3 that is mutated in multiple advanced cancers, Nat. Genet., 15: 356-362]. PTEN은 403개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 분자량은 약 47,000이고, 많은 세포주에서 발현된다 [Li J, Yen C, Liaw D, Podsypanina K, Bose S, Wang SI, Puc J, Miliaresis C, Rodgers L, McCombie R, et al., 1997, PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer. Science. 275: 1943-1947; Li DM & Sun H, 1997, TEP1, encoded by a candidate tumor suppressor locus, is a novel protein tyrosine phosphatase regulated by transforming growth factor beta. Cancer Res., 57: 2124-2129; Furnari FB, Lin H, Huang HJS, Cavenee WK, 1997, Growth suppression of glioma cells by PTEN requires a functional phosphatase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12479-12484]. PTEN은 세린/트레오닌 포스파타제(serine/threonine phosphatase) 및 티로신 포스파타제 활성(tyrosine phosphatase)을 갖는 이중 특이성(dual specificity) 단백질 포스파타제의 기능을 가지며, 또한 포스포이노시티드 3-포스파타제(phosphoinositide 3-phosphatase) 및 이노시톨 포스페이트 3-포스파타제 (inositol phosphate 3-phosphatase)의 기능을 나타내는 지질 포스파타제로서의 기능도 할 수 있다 [MyersMP, Stolarov JP, Eng C, Li J, Wang SI, Wigler MH, Parsons R, Tonks NK, 1997, P-TEN, the tumor suppressor from human chromosome 10q23, is a dual-specificity phosphatase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 9052-9057; Myers MP, Pass I, Batty IH, Kaay JVD, Stolarov JP, Hemmings BA, Wigler MH, Downes CP, Tonks NK, 1998, The lipid phosphatase activity of PTEN is critical for its tumor supressor function, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 13513-13518]. 이러한 기능들은 세포 증식(cell proliferation), 세포 생존(cell survival), 세포 이동(cell migration), 세포 침입(cell invasion) 등을 조절하여 PTEN이 종양 억제물질로서의 기능을 하도록 하는 것으로 알려져 있다 [Besson A, Robbins SM, Yong VW, 1990, PTEN/MMAC1/TEP1 in signal transduction and tumorigenesis. Eur. J. Biochem., 263: 605-611].
PTEN의 치료적 응용에 관하여는, WO 99/02704호에 PTEN 단백질, PTEN을 코딩하는 핵산 분자를 이용하여 전립선암, 유방암 등과 같은 과증식성 질환을 치료하는 방법이 개시되어 있으며, 최근 미국 특허 제 6,020,199호에는 PTEN을 코딩하는 핵산에 표적화되어 PTEN의 발현을 조절하는 안티센스 올리고누클레오티드 및 이를 이용하여 PTEN 발현과 관련된 질환, 예를 들어 당뇨병 및 과증식성 질환을 치료하는 방법에 관하여 개시되어 있다.
1988년에 Green과 Frankel 등은 처음으로 HIV Tat 단백질이 세포막을 통과할 수 있다는 사실을 보고하였고 [Green M & Loewenstein PM, 1988, Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus Tattrans-activator protein, Cell, 55: 1179-1188; Frankel AD & Pabo CO, 1988, Cellular uptake of the Tat protein from human immunodeficiencey virus, Cell, 55: 1189-1193], 그 후 Fawell은 1994년에 Tat의 일부분을 다른 단백질에 화학적으로 가교(crosslinking)시켜 이 혼합 단백질이 세포막을 투과하는 것을 보고하였다 [Fawell S, Seery J, Daikh Y, Moore C, Chen LL, Pepinsky B, Barsoum J, 1994, Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 664-668]. 가장 최근에는 Tat이 융합된 형태의 단백질을 변성 (denaturation)된 형태로 매우 효과적으로 세포내로 형질도입(transduction)시키는데 성공하였다는 보고가 있다 [Nagahara H, Vocero-Akbani, Adamina M, Synder EL, Ho A, Latham DG, Lissy NA, Becker-hapak M, Ezhevsky SA, and Dowdy SF, 1998. Transduction of full-length Tat fusion proteins into mammalian cells: Tat-p27kip1 induces cell migration. Nature Med. 4: 1449-1452]. 이러한 단백질의 형질도입은 Tat이 단백질 형질도입 도메인(protein transduction domain: PTD)을 갖기 때문에 가능하며, 그 정확한 기작은 알려져 있지 않으나, 이는 세포막의 HSP90와 같은 샤프론(chaperone)이 변성된 단백질을 투과 및 재생(renaturation)시켜, 효소로서의 정상적인 기능을 부여하는 것으로 추정되고 있다 [Schneider C, Sepp-Lorenzino L, Nimmesgern E, Ouerfelli O, Danishefsky S, Rosen N, Hartl FU, 1996, Pharmacologic shifting of a balance between protein refolding and degradation mediated by Hsp90, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 14536-14541]. 이것은 Tat이 이종 단백질을 세포내로 함께 투과시킬 수 있다는 것을 의미하지만,모든 단백질이 Tat 단백질과 함께 세포내로 고효율로 투과하여 세포내에서 원하는 생물학적 활성을 나타낼 것인지는 확실하지 않다.
녹내장 수술은 방수유출을 증가시키거나 방수생산을 감소시켜서 안압을 낮출 수 있도록 하는 것이다. 여과 수술(filtering operation)은 방수를 결막 하로 직접 유출시켜서 안압을 조절하는 수술방법으로, 공막절제술(sclerectomy), 홍채참치술(iridencleisis), 각공막관수술(trephination)과 섬유주절제술(trebeculectomy) 등이 있다. 그러나, 여과 수술 후 여과 기능의 실패요인의 하나는 상공막에서 섬유화 반흔(fibrous scar) 조직의 형성으로 공막 절개부를 통한 방수의 흐름이 폐쇄되어 일어난다. 조직의 과도한 조작, 출혈, 염증, 섬유 조직의 인종 또는 개인별 증식 정도의 차이 등이 주요 원인이다. 여과 기능의 실패 가능성을 감소시키기 위해 미토마이신 C(Mitomycin C)와 같은 항암 항생제가 사용되어 왔는데, 이는 DNA 합성을 저해하고, DNA-의존성(dependent) RNA 형성을 억제하여 섬유아세포 증식을 방해한다. 그러나, 이러한 약제는 각막상피결손, 결막봉합누출, 전방형성부전, 낭성여과포 형성, 맥락막박리, 전방출혈, 공막괴사, 여과포위의 결막무혈관 등의 합병증을 초래한다고 알려져 있다 [윤동호, 1996, 섬유주 절제술, 녹내장, 한국녹내장 연구회, 239-256]. 따라서, 녹내장 여과 수술후 문제가 되는 섬유화 반흔 조직의 형성을 억제할 수 있는 새로운 약제의 필요성이 존재하였다.
TGF-ß(Transforming growth factor-ß)는 신체의 모든 조직에서 발육이나 배발생 단계에서 생장, 분화 등의 중요한 기능을 하는 생장조절제로 알려져 있다. 그러나, TGF-ß는 안구 조직에서 창상 치유(wound healing) 과정 중에 세포의 증식으로 인하여, 증식성 유리체망막병증(proliferative vitreoretinopathy)과 백내장형성에 영향을 미친다. 특히, TGF-β는 녹내장 여과 수술후 결막 창상 치유 (conjuctival wound healing)로 인하여 반흔 조직을 형성시키는 것으로 알려져 있다 [Cordeiro MF, 2002, Beyond mitomycin: TGF-ß and wound healing. progress in retinal and eye research. 21: 75-89; Cordeiro MF, Gay JA, Khaw PT, 1999, human anti-transforming growth factor-ß2 antibody; a new glaucoma anti-scarring agent, IOVS, 40: 2225-2234].
이에, 본 발명자는 녹내장 여과 수술후 문제가 되는 섬유화 반흔 조직의 형성을 억제할 수 있는 약제를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, Tat-PTEN 융합 단백질이 결막하 섬유아세포를 투과하여 아폽토시스를 유도함으로써 녹내장 여과 수술후 문제가 되는 반흔 조직의 형성을 억제할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 세포내로 고효율로 전달될 수 있는 Tat-PTEN 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 폴리누클레오티드, 상기 융합 단백질을 발현시키기 위한 벡터, 이를 이용하여 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Tat-PTEN 융합 단백질을 유효 성분으로 하고, 녹내장 여과 수술후 결막하 섬유아세포의 증식으로 인한 반흔 조직 형성을 억제하기위한 약제 조성물을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따라 발현 및 정제된 Tat-PTEN 융합 단백질의 DNA 서열을 나타낸다. 도면의 서열에서 굵게 표시한 부분은 Tat 단백질의 단백질 형질도입 도메인(protein transduction domain), 밑줄친 부분은 PTEN 단백질, Tat과 PTEN 사이의 이탤릭체 부분은Xho I부위를 나타내며, Tat의 앞부분 서열은 발현 벡터에서 유래하는 서열로서, 굵은 이탤릭체 부분은 폴리히스티딘 영역, 밑줄친 이탤릭체 부분은 항-Xpress 항체 에피토프 부위를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따라 발현 및 정제된 Tat-PTEN 융합 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 pRSET A 벡터를 기본으로 하는 Tat-PTEN 발현 벡터 시스템(pTat-PTEN)의 구성을 나타낸다.
도 4는 정제된 PTEN과 Tat-PTEN 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electrophoresis)로 분석한 결과를 나타낸다. 화살표는 정제된 단백질을 표시한다.
도 5는 정제된 단백질이 융합 단백질임을 확인하기 위하여 Xpress 항체로 웨스턴 블롯(western blot) 분석한 결과를 나타낸다. 화살표는 정제된 단백질을 표시한다.
도 6은 결막하 섬유아세포에 Tat-PTEN 융합 단백질을 형질도입한 후, PTEN 항체를 사용하여 실시한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다. 화살표는 세포내로 이동된 Tat-PTEN 단백질을 표시한다.
도 7은 결막하 섬유아세포에 Tat-PTEN 융합 단백질을 형질도입한 후, Xpress 항체를 사용하여 실시한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다. 화살표는 세포내로 이동된 Tat-PTEN 단백질을 표시한다.
도 8은 결막하 섬유아세포에 각각 비처리(대조), TGF-β1, Tat-PTEN과 TGF-β1, 및 Tat-PTEN을 처리한 후 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 9는 결막하 섬유아세포에 각각 비처리, TGF-β1(10ng/ml), 및 여러 농도의 Tat-PTEN 융합 단백질(0.25uM, 0.5uM, 1uM, 및 2uM)과 TGF-β1(10ng/ml)을 처리한 후, 세포내의 융합 단백질의 양과 AKT 활성화 정도를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 나타낸다. 레인 1은 대조, 레인 2는 TGF-β1 10ng/ml로만 처리, 레인 3 내지 6은 각각 Tat-PTEN 단백질 0.25uM, 0.5uM, 1uM, 및 2uM와 TGF-β10ng/ml로 처리한 것이다.
도 10은 결막하 섬유아세포에 Tat-PTEN 융합 단백질 0.75uM을 처리 또는 비처리(대조)한 후, 세포내의 융합 단백질의 시간에 따른 추이를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 나타낸다. 레인 1은 대조, 레인 2 내지 6은 각각 Tat-PTEN 융합 단백질 0.75uM을 처리하고 30분, 5시간, 24시간, 48시간, 72시간 경과후의 결과이다.
도 11은 결막하 섬유아세포에 각각 비처리(대조), PTEN, Tat-PTEN 융합 단백질과 TGF-β1, Tat-PTEN 융합 단백질, 및 Tat-SOD 융합 단백질을 처리하고, 아넥신 V와 Pi로 염색한 다음 공촛점 현미경으로 확인한 세포의 형태를 나타낸다.
도 12는 결막하 섬유아세포에 각각 비처리(대조), TGF-β1, Tat-PTEN과 TGF-β1, 및 Tat-PTEN을 처리한 후, Pi로 핵 염색한 사진을 나타낸다.
본 발명의 한 측면은 PTEN 단백질 및 상기 PTEN 단백질의 아미노 말단에 결합된 HIV-1 Tat 단백질의 단백질 형질도입 도메인(서열 번호: 1)을 포함하는 Tat-PTEN 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은 Tat-PTEN 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 Tat-PTEN 융합 단백질을 발현시키기 위한 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 측면은 Tat-PTEN 융합 단백질을 발현시키는 벡터를 미생물에서 발현시키는 단계 및 발현된 Tat-PTEN 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함하여 Tat-PTEN 융합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 Tat-PTEN 융합 단백질을 유효 성분으로 하고, 녹내장 여과 수술후 결막하 섬유아세포의 증식으로 인한 반흔 조직 형성을 억제하기 위한 약제 조성물에 관한 것이다.
본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 목적을 위하여, Tat-PTEN 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 폴리누클레오티드는 PTEN 유전자의 5'-말단에 HIV-1 Tat의 단백질 형질도입 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 공지된 DNA 조작 방법, 예를 들어 제한 효소 절단, DNA 리가제에 의한 결찰, PCR 방법 등을 사용하여 결찰시켜 제조할 수 있고, 화학적 DNA 합성 방법에 따라 제조할 수도 있다.
재조합 폴리누클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 재조합 폴리누클레오티드 전체를 제조한 후 이를 발현 벡터에 삽입하거나, PTEN 단백질을 코딩하는 누클레오티드 서열을 Tat 유전자를 포함하는 발현 벡터에 삽입함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 먼저 Tat 유전자를 함유하는 발현 벡터를 만들고, 사람의 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고 합성 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 PTEN 단백질을 코딩하는 cDNA를 합성하여 상기 발현 벡터에 삽입시켜 제조할 수 있다.
상기 발현 벡터로 적당한 미생물 균주, 예를 들어 대장균 BL-21을 형질전환시킨 후, 적합한 조건에서 형질전환체를 배양하여 Tat-PTEN 융합 단백질을 발현시키고 정제시켜, Tat-PTEN 융합 단백질을 수득할 수 있다.
Tat-PTEN 융합 단백질이 세포막을 투과하는 것은 결막하 섬유아세포에 Tat-PTEN 융합 단백질을 형질도입시킨 후 웨스턴 블롯으로 확인할 수 있다(도 6 및 7). 반면, Tat 도메인이 없는 PTEN 단백질은 결막하 섬유아세포내로 통과하지 않는 것으로 확인되었다(도 7).
Tat-PTEN 융합 단백질은 세포내에서 TGF-β의 신호 전달을 억제하며(도 8), 그 활성은 농도 의존적이고(도 9), 시간에 따라 활성이 소실된다(도 11).
또한, 도 11 및 12에서 볼 수 있는 바와 같이, 결막하 섬유아세포에서 Tat-PTEN 융합 단백질에 의한 아폽토시스 유도에 관한 실험에서, Tat-PTEN 단백질은 세포내로 통과하여 아폽토시스를 유도한다. 반면, Tat 도메인이 없는 PTEN 단백질은 세포내로 통과하지 못하여 아폽토시스를 유도하지 못한다. 또한, Tat-SOD 단백질은 전혀 세포에 영향을 미치지 않으며, 이는 Tat 자체의 세포독성은 없고, 상기 아폽토시스가 세포내로 도입된 PTEN으로 인한 것임을 시사한다.
전술한 바와 같이, 녹내장 수술 중 여과수술 후 문제시 되는 반흔 조직의 형성은 TGF-ß에 의한 결막 창상 치유 과정으로 인한 것이고, 본 발명의 Tat-PTEN 융합 단백질은 배양된 결막하 섬유아세포로 투과하여 세포의 아폽토시스를 유도하며, 이러한 반응 기작은 TGF-β신호 전달을 억제하는 것임이 확인된 바, 본 발명의 Tat-PTEN 융합 단백질은 녹내장 여과 수술후 문제가 되는 결막하 섬유아세포의 증식으로 인한 반흔 조직 형성을 억제할 수 있음이 분명하다.
본 발명의 Tat-PTEN 융합 단백질을 유효 성분으로 함유하는 약제 조성물은 약제학 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 배합하여 당해 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 경구, 주사, 국소 투여 형태, 또는 당 분야에 공지되어 있는 임의의 형태로 제형화할 수 있다.
경구용 조성물로는, 예를 들어 정제 및 젤라틴 캡슐 등을 언급할 수 있으며, 이러한 경구용 조성물은 활성 성분 이외에도 약제학적으로 허용되는 담체로서 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로스 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜) 등을 함유할 수 있고, 바람직하게 정제는 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염), 흡수제, 착색제, 향미제 또는 감미제를 함유할 수 있다.
주사용 조성물은 등장성 수용액, 현탁액 형태이거나 사용전에 약제학적으로 허용되는 담체의 첨가에 의해 재구성될 수 있는 동결건조된 분말 형태일 수 있다. 적합한 희석액의 예로는 등장 생리식염 용액, 표준 5% 덱스트로스 수용액, 또는 완충된 나트륨 또는 암모늄 아세테이트 용액이 있다. 상기 조성물은 멸균되며, 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 가용화제, 등장화제, 또는 완충제)를 함유할 수 있다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.
국소 투여 형태로서 점안제, 안연고 등을 들 수 있고, 점안제에는 수성 점안제, 수성 현탁액 점안제, 점조성 점안제 및 가용화된 점안제와 같은 수성 제형 뿐만 아니라 비수성 점안제 및 비수성 현탁액 점안제와 같은 비수성 제형이 있다. 수성 점안제는 완충제(예를 들어, 포스페이트 완충제, 보레이트 완충제, 시트레이트 완충제, 타르타레이트 완충제, 아세테이트 완충제, 아미노산, 나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트 등), 등장화제(예를 들어, 소르비톨, 글루코오스 및 만니톨과 같은 당류, 글리세린, 농축 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜과 같은 다가 알코올류), 보존제 또는 방부제(예를 들어, 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 메틸 p-옥시벤조에이트 또는 에틸 p-옥시벤조에이트와 같은 p-옥시벤조에이트, 벤질 알코올, 페네틸 알코올, 소르브산 또는 그의 염, 티메로살, 클로로부탄올 등), 용해보조제 또는 안정화제(예를 들어, 시클로덱스트린 및 그의 유도체, 폴리비닐 피롤리돈과 같은 수용성 중합체, 폴리소르베이트 80(Tween 80)과 같은 계면활성제), pH 조정제(예를 들어, 염산, 아세트산, 인산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄 등), 증점제(예를 들어, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스 및 그의 염들), 킬레이트화제(예를 들어, 나트륨 에데테이트, 나트륨 시트레이트, 축합 인산나트륨) 등과 같이 일반적으로 혼입되는 각종 첨가제들을 함유할 수 있다. 수성 현탁액 형태의 점안제는 상기 열거된 첨가제들 외에도, 현탁제(예를 들어, 폴리비닐 피롤리돈, 글리세린 모노스테아레이트) 및 분산제(예를 들어, 티록사폴(tyloxapol) 및 폴리소르베이트 80과 같은 계면활성제, 나트륨 알기네이트와 같은 이온성 중합체)도 함유하여, 점안제가 더 균일한 미립자물이고, 충분히 분산된 수성 현탁액이 되도록 할 수 있다. 수성 현탁액 형태의 점안제는, 바람직하게는 완충제로서 나트륨 시트레이트 또는 나트륨 아세테이트, 등장화제로서 농축글리세린 및/또는 프로필렌 글리콜 및 현탁제로서 폴리비닐 피롤리돈을 함유한다. 바람직한 분산제는 계면활성제 및/또는 나트륨 알기네이트이다. 계면활성제는 바람직하게는 티록사폴 또는 폴리소르베이트 80이다. 안연고는 정제 라놀린, 바셀린, 플라스티베이스(plastibase), 액체 파라핀, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같이 공지된 연고 기재가 사용될 수 있다.
이와 같이 제조된 약제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식으로, 예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내 주사 등 당분야에 공지된 기타 투여 방식으로 투여될 수 있고, 투여량은 일일 2㎍/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 점안제 등의 형태로 국소 투여할 경우에는 유효 성분을 약 0.5 내지 2ng/ml의 농도로 함유하는 약제를 증상에 따라 적절하게 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
본 발명을 예증하기 위해 하기에 실시예를 제공한다. 그러나, 본 발명의 범주가 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: Tat-PTEN 융합 단백질의 발현 및 정제
Tat-PTEN 발현 벡터는 HIV-1의 기본 도메인(basic domain)인 Tat와 사람 PTEN을 융합시키기 위하여 다음과 같이 제작되었다. Tat 단백질 형질도입 도메인 은 YGRKKRRQRRR [Nagahara et al., 1998](서열 번호: 2)의 각 양 말단에 글리신(G)을 첨가시킨 형태로 만들기 위해 상위쇄(top strand)는 5'-(gatcc)GGT-TAC-GGT-CGT-AAG-AAA-CGT-AGA-CAG-CGC-AGA-CGT-GGT(c)3'(서열 번호: 3)으로, 하위쇄(bottom strand)는 5'-(tcgag)ACC-ACG-TCT-GCG-CTG-TCT-ACG-TTT-CTT-ACG-ACC-GTA-CCA-3'(서열 번호: 4)으로 누클레오티드를 합성하였으며, 괄호안은BamH I와Xho I의 제한 효소의 제한 부위(restriction site)를 만들기 위해 첨가하였다. 융합 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터로서, 정제를 용이하게 하기 위한 히스티딘 태그, 면역검출을 용이하게 하기 위한 항체 에피토프, 및 N-말단 융합 태그를 제거하기 위한 엔테로키나제 절단 부위를 포함하는 Xpress System Protein Expression pRSET(Invitrogen, USA)를 사용하고,BamH I와Xho I의 제한 효소로 잘려진 상기 벡터에 합성된 이중쇄 올리고누클레오티드(double stranded oligonucleotide)를 직접 결찰(ligation)시킨 후, Automatic DNA sequencer(ABI 3100 DNA Analyzer system, Perkin-Elmer)로 염기 서열을 확인하였다.
그런 다음, PTEN 유전자는 사람 간 cDNA 라이브러리(Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 주형(template)으로 사용하여 TaqPlus Precision 중합효소(Clontech, Palo Alto, CA, USA)로 증폭시켰으며, 사람 Cu/Zn SOD(Superoxide dismutase)를 동일한 방법으로 증폭시켜 대조로 이용하였다. PTEN과 SOD는 각각 GenBank에 등록된 U93051(서열 번호: 5) 및 X02317(서열 번호: 6)의 누클레오티드를 이용하였다. PTEN과 SOD의 전장(full length) cDNA를 증폭시키기 위해 GenBank를 바탕으로 프라이머가 다음과 같이 합성되었다. PTEN의 프라이머의 상위쇄는 5'-AAA-CTC-GAG-ATG-ACA-GCC-ATC-ATC-AAA-GA-3'(서열 번호: 7)이고 하위쇄는 5'-AAA-AAG-CTT-TCA-GAC-TTT-TGT-AAT-TTG-TGT-ATG-CTG-3'(서열 번호: 8)이며, SOD 프라이머의 상위쇄는 5'-AAA-CTC-GAG-ATG-GCG-ACG-AAG-GCC-GTG-TGC-GTG-3(서열 번호: 9)이고 하위쇄는 5'-AAA-AAG-CTT-TTA-TTG-GGC-GAT-CCC-AAT-TAC-ACC-3'(서열 번호: 10)이다. 모든 상위쇄는Xho I의 제한 효소 부위를 가지며, 하위쇄는Hind III의 제한 효소 부위를 갖도록 제작하였다. PCR 반응은 94℃에서 5분간 예비변성(pre-denaturation)시킨 후, 94℃에서 30초, 62℃에서 30초, 68℃에서 1분을 25사이클 수행하였으며, 68℃에서 10분간 최종 연장(last-extension)을 하였다. 이 PCR 산물을 아가로즈 겔(agarose gel)에서 분리해낸 다음 TA-클로닝 벡터(Promega)에 결찰시킨 후, 대장균 BL21 콤피텐트 세포(competent cell)(Invitrogen)에 형질전환(transformation)시켜 콜로니를 선별하였다. PTEN과 SOD cDNA를 가진 TA-벡터를Xho I과Hind III의 제한 효소로 처리한 후, pRSET 벡터에 서브클로닝(subcloning)하여 Tat-PTEN 단백질 발현 벡터(도 3), PTEN 단백질 발현 벡터 및 Tat-SOD 단백질 발현 벡터를 제작하였다. 제작된 발현 벡터로 대장균 균주 BL21(DE3)pLysS(F-,ompThsdSB (rB-mB-)gal dcm(DE3) pLys (CamR))(Invitrogen)를 형질전환시킨 후, 형질전환체를 100ug/ml의 암피실린을 포함하는 LB 플레이트(plate)에서 선별하였다. 선별된 colony를 100ug/ml의 암피실린을 포함하는 LB 브로쓰(broth) 3ml에 접종하고 37℃에서 200rpm으로 하루 동안 진탕 배양한 다음, 다음날 각각 100ug/ml의 암피실린을 포함하는 LB 브로쓰 400ml에 옮겨 37℃에서 OD600=0.6 정도에 도달할 때까지 배양한 후, 농도 1mM의 IPTG(isopropyl-1-thio-ß-D-galactopyranoside)를 첨가한 후 8시간 동안 배양하였다. 이 세포들을 10000×g에서 10분간 원심분리하여 모은 후, 침전물을 Buffer A(20mM HEPES (pH 8.0), 100mM NaCl, 20mM 이미다졸) 20ml로 녹인 다음, 소니케이터(sonicator)로 4분 동안 파쇄한 후 12500×g에서 30분간 원심분리하여 상청액을 버린 후, 침전물을 다시 8M 우레아가 포함된 Buffer A로 녹여 박테리아의 봉입체(inclusion body)를 Tat-PTEN 및 PTEN의 합성 단백질 추출에 이용하였다. 반면에 Tat-SOD 단백질의 경우는 10000×g에서 10분간 원심분리하여 모은 침전물을 바로 8M의 우레아를 포함하는 Buffer A로 녹여, 단백질 분리에 이용하였다. 재조합 Tat-PTEN, PTEN, Tat-SOD를 정제하기 위한 칼럼의 준비는 50% 슬러리 His·Bind resin (Novagen)을 잘 섞어 그 중 2.5ml을 칼럼에 충전한 후 칼럼의 전하와 평형시키기 위해 3부피의 증류수, 5부피의 1×하전 완충액(charge buffer)(50mM NiSO4)와 3부피의 1×결합 완충액(binding buffer)(8M 우레아, 5mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)를 차례로 중력 흐름(gravity flow)으로 흘려주었다. 준비된 칼럼에 합성 단백질 추출액을 로딩한 다음 칼럼 세척을 위해 10부피의 1×결합 완충액, 6부피의 1×세척 완충액(60mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)와 용리 완충액(100mM 이미다졸, 0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.9)를 차례로 흘려준 후 이미다졸 농도를 250mM과 500mM로 높인 용리 완충액 2ml을 이용하여 순서대로 용리하였다. 정제된 Tat-PTEN과 PTEN 단백질을 7.5% SDS-PAGE로 확인하였다. 정제된 단백질의 농도는 우혈청 알부민을 표준물질로 하여 브래드포드 (Bradford)법을 이용하여 측정하였다.
정제된 PTEN과 Tat-PTEN을 SDS-PAGE 전기영동 후 쿠마시 염색(coomassie staining)한 결과, PTEN은 약 59kDa, Tat-PTEN는 약 60kDa의 밴드가 관찰되었다(도 4의 화살표).
정제된 단백질이 융합 단백질임을 확인하기 위해 Xpress 항체(Invitrogen)로 웨스턴 블롯을 실시한 결과, 예측된 크기의 밴드가 나타나 Tat-PTEN, PTEN 단백질이 확인되었다(도 5).
실시예 2: 세포 배양
사람의 하결막(inferior conjuctiva)으로부터 얻어진 테논낭(Tenon capsule) 조직으로 결막하 섬유아세포를 세포 배양하였다. 조직을 10% 우태아 혈청, 50ug/ml 농도의 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)으로 37℃, 5% CO2인큐베이터에 침지시켰다. 섬유아세포의 1차 배양이 컨플루언트(conflent)해지면, 0.05% 트립신, 5mM EDTA로 떼어낸 후 100-mm 디쉬에서 배양하였으며, 3차 내지 5차 계대(passage)까지 실험에 이용하였다.
실시예 3: Tat-PTEN 융합 단백질의 형질도입 및 TGF- ß1 처리
Tat-PTEN과 PTEN의 형질도입을 위해 배양된 결막하 섬유아세포를 70% 컨플루언시(confluency)로 배양한 후, 무혈청 DMEM으로 교체하고 무혈청 조건에서 융합 단백질을 2시간 동안 37℃, 5% CO2인큐베이터에서 처리하였다. 그 후, 무혈청 DMEM으로 3회 세척하여 융합 단백질을 제거한 후, TGF-ß1(R & D Systems)을 무혈청 DMEM에서 10ng/ml의 농도로 20시간 동안 처리하였다. 그 후에 무혈청 DMEM으로 2회 세척한 후 웨스턴 블롯을 수행하였다. 웨스턴 블롯은 추출한 단백질을 SDS-PAGE 전기영동후 니트로셀룰로스막(nitrocellulose membrane)에 옮겨 수행하였다. 옮겨진 막(transfer membrane)은 0.1% Tween-20과 5% 무지방 분유(Nonfat milk powder)를 포함한 TBS(Tris-buffered saline)로 1시간 동안 블로킹(blocking)시킨 다음 블로킹 완충액(blocking buffer)에 희석된 1차 항체(primary antibody: Xpress antibody, Invitrogen, USA)를 넣어 4℃에서 16시간 동안 처리하고, 세척한 후 블로킹 완충액에 1:1000으로 희석된 2차 항체(secondary antibody: horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse, anti-rabbit secondary antibody, Amersham)를 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척한 막을 ECL 검출 시약(Amersham)으로 1분간 처리한 후, 하이퍼필름(Amersham)으로 현상하였다.
배양된 결막하 섬유아세포로 Tat-PTEN 융합 단백질의 형질도입 확인
배양된 결막하 섬유아세포에 Tat-PTEN 융합 단백질을 2시간 동안 처리한 후,PTEN 항체로 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 도 6에 도시된 바와 같이 Tat-PTEN 단백질이 세포내로 이동하였음이 확인되었다. 대조 세포에서는 내인성 PTEN만 약하게 나타났다.
배양된 결막하 섬유아세포에 Tat-PTEN 융합 단백질을 2시간 동안 처리한 후, Xpress 항체로 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 도 7에 도시된 바와 같이 Tat-PTEN 융합 단백질이 세포내로 이동하였음이 확인되었다. 반면에, 대조 세포와 Tat 도메인이 없는 PTEN으로 형질도입한 세포에서는 밴드가 나타나지 않아, Tat 도메인이 없으면 세포내로 통과하지 않음을 알 수 있었다.
Tat-PTEN 융합 단백질에 의한 TGF-ß1 의 시그날 조절
도 8에 도시된 바와 같이 결막하 섬유아세포에 TGF-ß1을 처리하면 P-AKT, P-ERK1/2, P-P38은 인산화가 증가되어 활성화되나, Tat-PTEN은 TGF-ß1의 시그날을을 저해하는 것으로 나타났다. 또한 TGF-ß1에 의해 세포외 기질(extracellular matirx)인 피브로넥틴(fibronectin)도 증가하였으나, Tat-PTEN은 이를 감소시켰다.
Tat-PTEN 융합 단백질 활성의 농도 및 시간 의존성
결막하 섬유아세포에 Tat-PTEN 합성 단백질을 농도별로 0.25uM에서 2uM로 증가시켜서 처리한 후 각각 10ng/ml의 TGF-ß1을 처리하면, TGF-ß1에 의해 활성화되는 AKT 인산화가 융합 단백질의 농도 의존적으로 활성을 잃게 됨을 알 수 있다(도 9).
또한, Tat-PTEN 융합 단백질은 2시간 동안 처리 후 수 시간 동안 원상태로 유지되다가, 점차 그 농도가 시간별로 감소되고 3일 이상 지속됨을 알 수 있었다(도 10).
실시예 4: 아폽토시스 검정(Apoptosis Assay)
아넥신 V-FITC 검정(Annexin V-FITC assay)
Tat-PTEN 융합 단백질이 세포내에서 어떠한 영향을 미치는 지에 대해 알아보기 위해, TACSTM annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (TEVIGEN)를 사용하여 초기 아폽토시스(early apoptosis) 및 후기 아폽토시스(late apoptosis)에 관하여 조사하였다. 슬라이드 챔버에서 배양된 결막하 섬유아세포에 Tat-PTEN 융합 단백질, Tat이 없는 PTEN 단백질을 2시간, 그리고 TGF-ß1을 20시간 동안 차례로 처리한 후, 차가운 PBS로 세척하고 아넥신 V-FITC 시약(1ug/ml 아넥신 V-FITC, 5ug/ml 프로피디움 요다이드)과 실온에서 반응시켰다. 그 다음 결합 완충액(10mM HEPES, pH 7.4, 150mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgCl2, 1.8mM CaCl2)으로 세척한 후, 봉입(mounting)된 세포를 공초점 현미경(confocal microscope)으로 조사하였다.
도 11에서 확인되는 바와 같이, Tat이 없는 PTEN 단백질은 세포내로 통과하지 못하여 전혀 영향을 주지 않았으나, Tat-PTEN 융합 단백질은 아폽토시스를 유도하였다. Tat-PTEN과 TGF-β1을 처리한 세포는 Pi로 염색되지 않는 것으로 나타나 초기 아폽토시스 현상을 확인할 수 있었으며, TGF-β1을 처리하지 않고 Tat-PTEN만을 처리한 세포는 핵도 염색이 되는 후기 아폽토시스 현상을 나타내었으며, 핵응축(nuclear condensation) 및 아폽토시스체(apoptotic body) 등의 전형적인 아폽토시스 형태를 나타내어, TGF-β1이 PTEN에 의한 아폽토시스를 억제시킴을 알 수있었다. Tat-SOD 융합 단백질 처리시에는 전혀 세포에 영향을 미치지 않았으므로 Tat 자체의 세포독성은 없는 것으로 확인되었고, 이는 상기 아폽토시스가 세포내로 도입된 PTEN으로 인한 것임을 나타낸다.
프로피디움 요다이드-핵 염색
핵의 모양을 관찰하기 위하여 슬라이드 챔버에서 배양된 결막하 섬유아세포에 융합 단백질과 TGF-ß1을 아넥신 V-FITC 검정과 동일한 방법으로 처리한 후, 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, PBS에 녹인 0.2% 트리톤 X-100으로 투과화( permeabilization)시킨 후, PBS로 세척하고 100ug/ml의 프로피디움 요다이드(PI, Sigma)를 사용하여 핵을 염색하였다. 커버 슬립으로 봉입한 후 올림퍼스 형광 현미경(Olympus Fluorescence microscope, BX60)으로 분석하였다.
도 12에서 볼 수 있는 바와 같이, 대조와 TGF-β1을 처리한 세포는 핵이 전혀 영향을 받지 않았으나, Tat-PTEN 융합 단백질을 처리한 세포의 핵은 전형적인 아폽토시스의 형태인, 핵응축, 아폽토시스체, 하프문(half-moon), 홀스슈(horse shoe)를 나타내었다. 반면에 TGF-β1과 Tat-PTEN을 처리한 세포의 대부분의 핵은 정상 세포의 핵보다 훨씬 작아진 형태만 나타내었다.
본 발명에 따르면, PTEN 단백질을 세포내 투과성을 갖는 HIV-1 Tat 단백질과 융합시킨 Tat-PTEN 융합 단백질, 이 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 폴리누클레오티드, 이 융합 단백질을 발현시키기 위한 벡터, 이를 이용하여 융합 단백질을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 Tat-PTEN 융합 단백질은 결막하 섬유아세포로 투과되어, TGF-β신호 전달을 억제함으로써 세포의 아폽토시스를 유도하므로 녹내장 여과 수술후 문제가 되는 결막하 섬유아세포의 증식으로 인한 반흔 조직 형성을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

  1. PTEN 단백질 및 상기 PTEN 단백질의 아미노 말단에 결합된 HIV-1 Tat 단백질의 단백질 형질도입 도메인(서열 번호: 1)을 포함하는 Tat-PTEN 융합 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 서열 번호: 12의 아미노산 서열로 표시됨을 특징으로 하는 Tat-PTEN 융합 단백질.
  3. 제 1항의 Tat-PTEN 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 폴리누클레오티드.
  4. 제 3항에 있어서, 서열 번호: 11의 DNA 서열로 구성됨을 특징으로 하는 재조합 폴리누클레오티드.
  5. 제 3항 또는 제 4항의 재조합 폴리누클레오티드를 포함하는 Tat-PTEN 융합 단백질을 발현시키는 벡터.
  6. 제 5항에 있어서, 도 3에 기재된 개열 지도로 구성되는 것을 특징으로 하는 Tat-PTEN 융합 단백질을 발현시키는 벡터.
  7. 제 5항의 벡터를 미생물에서 발현시키는 단계 및
    발현된 Tat-PTEN 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함하여 Tat-PTEN 융합 단백질을 제조하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 미생물이 대장균임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항의 Tat-PTEN 융합 단백질을 유효 성분으로 하고 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 녹내장 여과 수술후 결막하 섬유아세포의 증식으로 인한 반흔 조직 형성을 억제하기 위한 약제 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112225821A (zh) * 2020-10-21 2021-01-15 徐州医科大学 一种具有抗肿瘤作用的多肽及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999002704A2 (en) * 1997-07-08 1999-01-21 Cold Spring Harbor Laboratory Dual specifically phosphatase and methods of use
US6020199A (en) * 1999-07-21 2000-02-01 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of PTEN expression

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999002704A2 (en) * 1997-07-08 1999-01-21 Cold Spring Harbor Laboratory Dual specifically phosphatase and methods of use
US6020199A (en) * 1999-07-21 2000-02-01 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of PTEN expression

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PTEN/MMAC1/TEP1 in signal transduction and tumorigenesis. Eur J Biochem. 1999 Aug;263(3):605-11. *
Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Jan 18;91(2):664-8. *
Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nat Med. 1998 Dec;4(12):1449-52. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112225821A (zh) * 2020-10-21 2021-01-15 徐州医科大学 一种具有抗肿瘤作用的多肽及其应用

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