CN109486883B - 一种制备l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制备L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺的方法，包括以下步骤：S1.过表达SLC1A5的HEK293T稳定细胞系的获取；S2.向获取的细胞转染Lal，培养24小时；S3.向转染Lal后的细胞培养基中加入丙氨酸和谷氨酰胺；S4.收集S3中的细胞裂解液，并提取L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺。本发明操作简单快速，污染小，绿色环保，从提高反应底物浓度和生物反应器数目两方面来提高该酶促反应的效率，可提高L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰胺的产量。

Description

一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法。
背景技术
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺属于氨基酸的衍生物，分子式为C8H15N3O4，分子量为217，是目前国内外比较热门的氨基酸二肽产品，简称丙谷二肽，它是肠外营养的一个组成部分，适用于需要补充谷氨酰胺的病人，包括处于分解代解和高代谢状况的病人，是人体含量最丰富的氨基酸谷氨酰胺的理想替代品，因此在保健品和药用领域非常广泛。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶解度很高，是同样条件下游离谷氨酰胺的200倍，而且性质稳定，在不同的pH值条件下加热灭菌也不会产生有毒的焦谷氨酸和氨产生，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺进入机体之后，被许多器官组织中的二肽酶快速有效地分解为丙氨酸和谷氨酰胺，满足机体的需求，无任何毒副反应。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的半衰期极短，约3.8分钟，并且进入机体后仅有微量的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺从尿中排出，这表明L-丙氨酰-L-谷氨酰胺可被机体有效地利用，避免了因L-丙氨酰-L-谷氨酰胺积蓄可能引起的损伤，因此L-丙氨酰-L-谷氨酰胺在临床上受到了广泛的应用。
目前，生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法有化学合成法、微生物发酵法以及微生物转化法。由于化学合成法在合成过程中需要引入和去除保护基团，合成步骤过多，成本过高，并且需要用到有毒试剂，不适合工业生产；微生物发酵法成本低廉，环境温和，但是产量较低，离大规模生产还有一定距离；随着DNA重组技术的发展以及微生物资源的发现，使得微生物转化法生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺成为工业上很有前景的生产方法。其中微生物转化法生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺大多采用大肠杆菌作为生物反应器进行酶法合成，但其有个明显的的缺点：过表达Lal(L-型氨基酸连接酶，L-amino acid α ligase)大肠杆菌的存活率低，导致最终的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺产量低。
专利申请CN104480172A公开了一种利用重组大肠杆菌生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，通过将具有氨基酸酯酰基转移酶活性的蛋白质的基因片段重组到载体上并转入微生物细胞，得到的具有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成活性的重组微生物。上述方案虽然一定程度上增加了L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的产量，但未考虑大肠杆菌的存活率及酶反应过程中的底物从浓度问题，从而使该反应的效率低下。
发明内容
本发明针对现有技术的上述缺陷，提供一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，考虑提高酶促反应最重要的条件之一底物浓度，来提高反应效率，从而提高L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的产量。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，包括以下步骤：
S1.过表达SLC1A5的HEK293T稳定细胞系的获取；
S2.向获取的细胞转染Lal，培养24小时；
S3.向转染Lal后的细胞培养基中加入丙氨酸和谷氨酰胺，反应2-4小时，离心收集细胞，然后将细胞破碎，离心，获取细胞裂解液；
S4.收集S3中的细胞裂解液，并提取L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
本发明为了解决微生物转化法生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺存在过表达Lal(L-型氨基酸连接酶，L-amino acid α ligase)大肠杆菌的存活率低，导致L-丙氨酰-L-谷氨酰胺产量不高的问题，提出一种增加反应底物浓度来促进酶促反应的效率的方法。本发明采用过表达SLC1A5的HEK293T稳定细胞系，其中SLC1A5能同时转运丙氨酸和谷氨酰胺，比普通细胞将丙氨酸和谷氨酰胺运到细胞内的速度大大加快，明显增加细胞内的丙氨酸和谷氨酰胺浓度，提高反应底物浓度从而提高酶反应效率，增加产量；同时再对HEK293T稳定细胞系转染Lal，从而提高L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的产量。综上，本发明操作简单快速，污染小，绿色环保，从提高反应底物浓度和生物反应器数目两方面来提高该酶促反应的效率，可提高L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的产量。
本发明的反应原理如下反应式所示：
Figure BDA0001915226270000021
优选地，S2所述细胞转染Lal的操作步骤如下：
S1.当HEK293T细胞生长状态良好且贴壁细胞密度达到50-70％即可进行转染；
S2.转染前1h换液，移去旧培养基加入9mL新鲜无抗培养基；
S3.取一干净的2mL离心管，依次加入灭菌去离子水和10μg质粒，使终体积达到450μL，加入50μL CaCl2，使三者混合均匀，将500μL的2×HBSS缓慢滴加至上述溶液中，边滴加边摇匀；
S4.取出细胞培养皿，加入5μL氯喹，然后缓慢加入S3混合好的转染液，轻轻摇匀，放回细胞培养箱。
优选地，S3所述获取细胞裂解液，具体过程为(以1皿细胞为例)：
(1)吸去培养液，用预冷的PBS在培养皿上润洗细胞1次，每次1mL；
(2)用预冷的PBS于培养皿上刮取细胞2次，每次800μL；
(3)离心收集细胞(1000×g，10min，4℃)，用预冷的PBS清洗细胞3次，每次用约细胞体积2倍的PBS将细胞重悬，最后一次洗涤时合并所有离心管中的细胞；
(4)用1mL的细胞裂解液将细胞重悬，置于冰上30min，期间用移液枪重悬细胞一次；将细胞通过G25针头20次将细胞破碎，离心(12000×g，15min)，将上清转移至新的离心管中，得到含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的细胞裂解液。
加入的细胞裂解液配方：0.61g Tris、0.88g NaCl、0.029g EDTA、lmL TritonX-100，浓盐酸调pH至8.0，加ddH2O定容到100mL。
所述质粒为去内毒素质粒。优选地，所述质粒的构建过程包括制备线性化载体、插入片段引物设计及插入片段PCR扩增、PCR产物的酶切及回收、进行重组反应、反应产物转化、涂板、克隆鉴定、去内毒素质粒的提取。
所述线性化载体根据pcDNA3质粒图谱，选定Hind III和EcoRI两个酶切位点进行酶切制备得到。
优选地，所述线性化载体制备具体过程为：向PCR管中加入Hind III 1μL、EcoRI 1μL、10×K Buffer 2μL、空载体10μL，添加ddH2O补至终体积为20μL，37℃酶切5h。
所述PCR扩增引物为上游引物：
5’-GATTACAAGGACGACGATGACAAGACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATTAGCATTTTAATA-3’；
下游引物：5’-TATGACCATGATTACGAATTCTTATTTGAGAGAACA-3’。
所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，59℃退火5s，72℃延伸1min；以上步骤循环35次，然后72℃末尾延伸5min，4℃保存。
优选地，S1所述过表达SLC1A5的HEK293T稳定细胞系通过细胞电转，然后G418筛选后获得。具体操作可参考如下：
一、电转细胞
1、2ml胰酶消化一皿细胞(10cm)。
2、吹散细胞分装于两个1.5EP管中。
3、1000rpm离心3min，弃上清。
4、PBS重悬。
5、PBS洗两次。
6、1000rpm离心3min，弃上清。
7、用400ul电转buffer重悬，加入质粒10ug(质粒的制备方法参考Lal质粒的制备)。
8、混匀，加入细胞电转杯中。
9、400V，40us，电击。
10、向电击杯中加入400ul含10％血清的DMEM，混匀，分装到3个6孔板中。
二、G418筛选
1、将电转后的细胞铺平板，密度要低，细胞与细胞之间没有接触。
2、待细胞贴壁之后加入G418，G418的终浓度一般为500ug/ml到800ug/ml。
3、一般2周左右，未稳定转染的细胞都死掉。
4、将存活的细胞进行扩大培养。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明为了解决微生物转化法生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺存在过表达Lal(L-型氨基酸连接酶，L-amino acid α ligase)大肠杆菌的存活率低，导致L-丙氨酰-L-谷氨酰胺产量不高的问题，提出一种增加反应底物浓度来促进酶促反应的效率的方法。本发明操作简单快速，污染小，绿色环保，从提高反应底物浓度和生物反应器数目两方面来提高该酶促反应的效率，可明显提高L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的产量。
附图说明
图1为pcDNA3质粒图谱。
图2为SLC1A5蛋白表达情况的检测图(1：过表达SLC1A5的HEK293T稳定细胞系；2：HEK293T细胞)。
图3为Flag-Lal蛋白表达情况的检测图(1.未转染pcDNA3-Flag-Lal质粒；2.转染pcDNA3-Flag-Lal质粒)。
图4为Lal基因PCR扩增结果图。
图5为大肠杆菌菌液PCR结果图。
图6为转染Lal后1天细胞贴壁密度统计图；其中，对照组为转染Lal的普通HEK293T细胞(即未稳定表达SLC1A5的HEK293T细胞)，试验组为转染Lal的过表达SLC1A5的HEK293T稳定细胞。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合说明书附图和具体实施例，对本发明进一步详细说明，但本发明要求的保护范围并不局限于实施例。
具体实施例
一、pcDNA3-Flag-Lal质粒的构建：
Lal基因序列：本实施方式中Lal基因序列，见Genbank ACCESSION CP011051。
1、制备线性化载体：
线性化克隆载体由酶切制备，本试验采用双酶切线性化，由于其线性化完全，转化背景(假阳性克隆)低。根据pcDNA3质粒图谱，选定Hind III和EcoRI两个酶切位点进行酶切。向PCR管中加入Hind III 1μL、EcoRI 1μL、10×K Buffer 2μL、空载体10μL，添加ddH2O补至终体积为20μL。37℃酶切5h。
2、插入片段扩增引物设计及插入片段PCR扩增(扩增结果如图4)
(1)插入片段扩增引物设计：
Figure BDA0001915226270000051
II引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15bp～20bp)。
上游引物：
5’-GATTACAAGGACGACGATGACAAGACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATTAGCATTTTAATA-3’；
下游引物：
5’-TATGACCATGATTACGAATTCTTATTTGAGAGAACA-3’。
(2)插入片段PCR扩增：在PCR管中加入模板1.5μL，上、下游引物各2μL，2×PrimeSTAR 25mL，添加ddH2O补至终体积为50μL。PCR程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，59℃退火5s，72℃延伸1min(以上三步循环35次)，72℃末尾延伸5min，4℃保存。
3、PCR产物的酶切及回收
(1)PCR产物的酶切：所扩增的PCR产物的酶切与空载体的酶切体系一致，向PCR管中加入Hind III 1μL、EcoRI 1μL、10×K Buffer 2μL、PCR产物10μL，添加ddH2O补至终体积为20μL。37℃酶切5h。为保证回收后的PCR产物的浓度较高，可同时酶切多管。
(2)PCR产物的回收：将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，当溴酚蓝指示剂迁移至足够距离时，在长波紫外灯下观察，根据DNA分子标准用干净的刀片切下含有目的片段的胶块。根据琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书回收酶切产物。
4、进行重组反应
Figure BDA0001915226270000061
II重组反应体系最适克隆载体使用量为0.03pmol；最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，即最适插入片段使用量为0.06pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：
最适克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)
最适插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)
本实施例中，克隆载体碱基对数为5400，插入片段碱基对数为1227，结合各自所测得的浓度，于冰水浴中配制如下反应体系：
ddH2O 9.5μL
5×CE II Buffer 4μL
线性化克隆载体 2.4μL
插入片段扩增产物 2.1μL
Figure BDA0001915226270000062
II 2μL
体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡(请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)。置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。之后，反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
5、反应产物转化、涂板
取20μL冷却反应液，加入到200μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激45～90s，冰水浴孵育2min。加入900μL SOC或LB培养基，37℃孵育10min充分复苏。37℃摇菌45min。取100μL菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。
6、克隆鉴定
当观察到有肉眼可见的分散的单菌落时，在超净工作台上取100mg/mL Kan溶液50μL，加入到50mL无菌LB液体培养基中，混匀后取1mL溶液分装到2mL离心管中，用塑料吸头从平皿上挑取单菌落，将粘有菌的吸头置于离心管中，37℃225r/min振荡培养5-6h。取1μL的菌液为模板进行Lal基因PCR扩增，扩增的产物进行电泳检测(结果如图5)。然后对阳性克隆进行测序，测序确定为正确的克隆后进行扩大培养提取质粒。
Lal基因PCR扩增结果如图4所示。菌液PCR结果如图5所示，菌液PCR所使用的上游引物为通用引物CMV及该基因的下游引物，由于通用引物与目的基因的距离为800bp左右，使得菌液PCR所得目的条带大于2000bp。
二、去内毒素质粒的提取：
去内毒素质粒提取试剂盒为北京全式金生物技术有限公司产品，根据试剂盒产品说明书提取去内毒素质粒。
三、细胞转染(以一个10cm的培养皿为例)
(1)过表达SLC1A5的HEK293T稳定细胞系的获取。
(2)当HEK293T细胞生长状态良好且贴壁细胞密度达到50-70％即可进行转染。
(3)转染前1h换液。移去旧培养基加入9mL新鲜无抗培养基。
(4)取一干净的2mL离心管，依次加入灭菌去离子水和10μg质粒，使终体积达到450μL，加入50μL CaCl2，使三者混合均匀，将500μL的2×HBSS缓慢滴加至上述溶液中，边滴加边摇匀。
(5)取出细胞培养皿，加入5μL氯喹，然后缓慢加入上一步混合好的转染液，轻轻摇匀，放回细胞培养箱。
(6)预计24h左右进行丙氨酸和谷氨酰胺的添加，反应2-4小时后，离心收集细胞，然后将细胞破碎，离心，获取细胞裂解液；
(7)收集细胞裂解液，并提取L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，提取方法为：将所得细胞裂解液在沸水浴中加热5-8分钟，冷却至室温后通过离子交换柱层析法分离出丙氨酸和谷氨酰胺，再将溶液置于温度(-50)～(-40)℃下冷冻干燥或在加料流量5-10mL/min，入口温度160-180℃下喷雾干燥，得到L-丙氨酰-L-谷氨酰胺粉末。
上述过表达SLC1A5的HEK293T稳定细胞中SLC1A5蛋白表达情况的检测如图2所示，转染Lal后的Flag-Lal蛋白表达情况的检测如图3所示。说明本发明成功获得所述转染Lal的过表达SLC1A5的HEK293T稳定细胞系。
蛋白表达的检测采用Western blot进行，具体步骤如下：
1制胶与电泳
(1)洗玻板，搭架子，检漏30min。
(2)配胶：按目的蛋白的分子量大小配制分离胶和浓缩胶。
分离胶浓度和蛋白质分离范围：
Figure BDA0001915226270000081
10％分离胶10mL，配制如下：
Figure BDA0001915226270000082
5％浓缩胶5mL，配制如下：
Figure BDA0001915226270000083
Figure BDA0001915226270000091
先配分离胶，配好后每边加75％酒精，等待分离胶凝固后(1h左右)，倒掉剩余的酒精，用吸水纸洗掉缝隙中残留的酒精。开始配浓缩胶，配好之后，每边加2.5mL，立即插上梳子，等浓缩胶凝固后(1h左右)，拔掉梳子，将架子中加满电泳液。
TEMED强神经毒性，防止误吸，操作时快速，存放时密封。
(3)准备样品：95℃，加热6min，冰上冷却至室温，重悬后点样。蛋白Marker不用加热。
(4)电泳跑胶：
浓缩胶U＝80v T＝1.0h
分离胶U＝120v T＝2.5h
整个电泳过程3.5h。
2转膜
(1)根据样品数目准备PVDF膜:剪切一张能覆盖目的蛋白的PVDF膜，先以甲醇浸湿PVDF膜5min，最后以电转液平衡PVDF膜10-15min。
(2)电转移夹层的组装：依次将下面的物品平铺于转移装置的夹板上：
A:单层海绵(在黑色夹板一面)
B:一张如凝胶大小的滤纸(预先以电转液浸湿)
C:SDS-PAGE凝胶
D:PVDF膜
E:一张如凝胶大小的滤纸(预先以电转液浸湿)
F:单层海绵(在红色夹板一面)
(3)滴加少许电转液驱赶气泡，合上封闭转移装置后放入电转槽，完成组装(注意夹板的黑面朝向槽的黑面，夹板的红面朝向槽的红面)。
(4)恒流300mA，电压超过160v即好，时间1h左右。
3封闭与杂交
(1)漂洗：TBST洗一次，5min。
(2)封闭：在含5％脱脂奶粉的TBST封闭液中，室温下缓慢摇动1h。
(3)漂洗：TBST洗3次，每次5min。
(4)一抗孵育：每张膜加3-5mL。
(5)将膜浸入一抗溶液中并在摇床上低速摇晃，最后4℃冰箱过夜。
(6)第二天早上，从冰箱中取出膜，在摇床上，室温低速遥30min。
(7)回收一抗，TBST洗3次，每次5min。
(8)二抗孵育：每张膜加3-5mL，将膜浸入二抗溶液中并在摇床上，低速摇晃1h。
(9)回收二抗，TBST洗3次，每次5min。
(10)TBS洗2次，每次5min。
4发光或显色鉴定
采用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法
(1)将膜平铺在暗盒的板子上。
(2)配显色液：根据膜的大小配显色液，保证每张膜均能覆盖显色液(注：配显色液时A液与B液按1:1加入)，配显色液时注意避光，振荡均匀。
(3)将显色液覆盖在膜表面，静置1min。
(4)在暗室中将X胶片，覆盖在膜的上面，关闭胶盒，根据所见荧光强度确定曝光时间。
(5)取出胶片立即完全浸入显影液中并轻轻摇晃，约3min后将胶片取出，清水漂洗一下后放在定影液中至胶片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析和扫描。
性能测试
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的检测
试验组：往转染Lal的过表达SLC1A5的HEK293T细胞培养基中加入丙氨酸和谷氨酰胺，培养4小时后测试细胞内和细胞外的Ala(丙氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、Ala-Ala(丙氨酰-丙氨酸)、Ala-Gln(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)浓度；对照组为普通HEK293T细胞(即未稳定表达SLC1A5的HEK293T细胞)转染Lal后的细胞培养基，加入丙氨酸和谷氨酰胺，培养4小时后测试细胞内和细胞外的Ala(丙氨酸)、Gln(谷氨酰胺)、Ala-Ala(丙氨酰-丙氨酸)、Ala-Gln(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)浓度。在加入丙氨酸和谷氨酰胺之前，试验组和对照组的细胞密度相当(见图6)。
测试方法为高效液相检测方法，测试条件如下：
(1)色谱条件：
高效液相色谱仪：Agilent1260Infinity；
色谱柱：AgilentZORBAXSB-Aq，5μm，4.6×250mmC18柱；
检测器：Agilent1260Infinity荧光检测器；
流动相组成：乙腈与磷酸盐缓冲液的体积比为12：88，磷酸调节流动相pH至7.4；
流动相流速：1.0ml/min；
柱室温度：40℃；
检测波长：激发波长Ex338nm，发射波长Em450nm；
运行时间：20min。
(2)标准品配制：
于分析天平上分别精确称取一定质量的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，L-谷氨酰胺，L-丙氨酸甲酯盐酸盐，L-谷氨酸，L-丙氨酰-L-丙氨酸，统一用10mL容量瓶配制成浓度为4mM的母液。后续试验所需标品都用4mM母液搭配稀释获得。
(3)流动相的配制：
磷酸盐缓冲液的配制：分别配制浓度同为12.5mM的磷酸氢二钾与磷酸二氢钾溶液，二者互调pH至7.4。将上述磷酸盐缓冲液与色谱纯乙腈按88：12比例进行等度洗脱即可。
(4)衍生剂配制：
50mg邻苯二甲醛，100μLβ-巯基乙醇，加入300μL甲醇溶解，加入1.6mL硼砂缓冲液(pH10.0)混匀既得。pH10.0的硼砂缓冲液配制：分别配制0.05M硼砂溶液与0.2M氢氧化钠溶液，准确移取50mL硼砂溶液与23mL氢氧化钠溶液到200mL容量瓶中，混合均匀，并用水稀释到刻度线既得。
(5)柱前自动化在线衍生程序：
吸取2μL样品，2μL衍生剂混合3次，吸取16μL硼酸缓冲液混合15次，最后在吸取20μL流动相混合5次后进样。该程序可表示为：2μL样品+2μL衍生剂+16μL硼酸缓冲液+20μL流动相。每次吸取完毕后，都需运行洗针程序。
检测结果如表1所示，从表1的数据可看出，本发明试验组往转染Lal的过表达SLC1A5的HEK293T细胞培养基中加入丙氨酸和谷氨酰胺，培养4小时后细胞内的丙氨酸和谷氨酰胺浓度相较于对照组显著提高，由此得到的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的产量也明显高于对照组。由此说明，本发明技术方案可明显增加细胞内的丙氨酸和谷氨酰胺浓度，提高反应底物浓度从而提高酶反应效率，增加L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的产量。
表1
Figure BDA0001915226270000121
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (8)

1.一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.过表达SLC1A5的HEK293T稳定细胞系的获取；
S2.向获取的细胞转染Lal，培养24小时；
S3.向转染Lal后的细胞培养基中加入丙氨酸和谷氨酰胺，反应2-4小时，离心收集细胞，然后将细胞破碎，离心，获取细胞裂解液；
S4.收集S3中含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的细胞裂解液，并提取L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
2.根据权利要求1所述一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，S2所述细胞转染Lal的操作步骤如下：
S1.当HEK293T细胞生长状态良好且贴壁细胞密度达到50-70％即可进行转染；
S2.转染前1h换液，移去旧培养基加入9mL新鲜无抗培养基；
S3.取一干净的2mL离心管，依次加入灭菌去离子水和10μg质粒，使终体积达到450μL，加入50μL CaCl2，使三者混合均匀，将500μL的2×HBSS缓慢滴加至上述溶液中，边滴加边摇匀；
S4.取出细胞培养皿，加入5μL氯喹，然后缓慢加入S3混合好的转染液，轻轻摇匀，放回细胞培养箱。
3.根据权利要求2所述一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述质粒为去内毒素质粒，所述质粒的构建过程包括制备线性化载体、插入片段扩增引物设计及插入片段PCR扩增、PCR产物的酶切及回收、进行重组反应、反应产物转化、涂板、克隆鉴定、去内毒素质粒的提取。
4.根据权利要求3所述一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述线性化载体根据pcDNA3质粒图谱，选定Hind III和EcoRI两个酶切位点进行酶切制备得到。
5.根据权利要求4所述一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述线性化载体制备具体过程为：向PCR管中加入Hind III 1μL、EcoRI 1μL、10×K Buffer 2μL、空载体10μL，添加ddH2O补至终体积为20μL，37℃酶切5h。
6.根据权利要求3所述一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述PCR扩增引物为
上游引物：
5’-GATTACAAGGACGACGATGACAAGACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATTAGCATTTTAATA-3’；
下游引物：5’-TATGACCATGATTACGAATTCTTATTTGAGAGAACA-3’。
7.根据权利要求3所述一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性10s，59℃退火5s，72℃延伸1min；以上步骤循环35次，然后72℃末尾延伸5min，4℃保存。
8.根据权利要求3所述一种制备L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，其特征在于，S1所述过表达SLC1A5的HEK293T稳定细胞系通过细胞电转，然后G418筛选后获得。
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