CN114527118B - 一种用于细胞爬片固定过程的质量控制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于细胞爬片固定过程的质量控制方法，涉及质量评价技术领域。本发明所述质量控制方法包括采用乙酰丙酮反应液测定细胞爬片上固定剂甲醛的含量。本发明所述质量控制方法操作简便、反应时间短、结果稳定，有利于控制同一批次细胞爬片之间或不同批次之间细胞爬片的甲醛的差异，为细胞爬片的质量控制提供了依据。利用本发明所述质量控制方法，不仅可以评价细胞爬片的质量，还可以探索固定剂甲醛的最佳固定浓度和固定时间。

Description

一种用于细胞爬片固定过程的质量控制方法
技术领域
本发明属于质量评价技术领域，具体涉及一种用于细胞爬片固定过程的质量控制方法。
背景技术
甲醛可作为交联剂用于免疫荧光、免疫组化等实验，其作用在于保持组织或细胞的固有形态和结构，更重要的是保持组织或者细胞的抗原性，防止抗原失活和弥散。甲醛通过交联的方式发挥作用，醛基与细胞蛋白质的氨基交联形成羧甲基。
现有的细胞爬片使用甲醛进行固定时，通过配置一定浓度的甲醛溶液进行固定，PBS洗涤后再进行检测，或在洗涤后加入硫酸铵终止，再次洗涤、烘干后进行检测(CN202111021985.2，一种用于检测人体液中乙酰胆碱受体自身抗体的细胞爬片及其制备方法和应用)。在此过程中，PBS的洗涤会带走部分残留在爬片上的甲醛；硫酸终止也会使得已经与甲醛交联的细胞蛋白解交联，造成爬片上甲醛的含量降低。因此，控制同一批次细胞爬片之间或不同批次之间细胞爬片的甲醛含量一致是急需解决的一个问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于细胞爬片固定过程的质量控制方法，操作简便、反应时间短、结果稳定，有利于控制同一批次细胞爬片之间或不同批次之间细胞爬片的甲醛的差异，为细胞爬片的质量控制提供了依据。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于细胞爬片固定过程的质量控制方法，包括以下步骤：采用乙酰丙酮反应液测定细胞爬片上固定剂甲醛的含量。
优选的，所述细胞爬片包括同一批次细胞爬片或不同批次的细胞爬片。
优选的，利用固定剂对所述细胞爬片进行固定时，所述固定剂中甲醛的质量百分含量为0.2～5％。
优选的，所述测定包括将所述细胞爬片与乙酰丙酮反应液混合后，于50℃反应10min，测定OD412值。
优选的，所述测定还包括利用不同浓度的甲醛标准溶液与乙酰丙酮反应液混合后，于50℃反应10min，测定OD412值，建立标准曲线。
优选的，利用所述标准曲线计算所述细胞爬片的固定剂甲醛的含量。
本发明还提供了上述的质量控制方法在筛选细胞爬片时固定剂甲醛的浓度和固定时间中的应用。
本发明还提供了上述的质量控制方法在评价同批次或不同批次间细胞爬片固定质量中的应用。
有益效果：本发明提供了一种用于细胞爬片固定过程的质量控制方法，首次将检测空气、食品中的甲醛含量的乙酰丙酮法应用于细胞爬片甲醛含量的测定，操作简便、反应时间短、结果稳定，有利于控制同一批次细胞爬片之间或不同批次之间细胞爬片的甲醛的差异，为细胞爬片的质量控制提供了依据。利用本发明所述质量控制方法，不仅可以评价细胞爬片的质量，还可以探索固定剂甲醛的最佳固定浓度和固定时间。
附图说明
图1为建立的标准曲线；
图2为各浓度标准品检测值；
图3为不同浓度甲醛固定后荧光结果；
图4为0.2％甲醛固定的同一批细胞爬片的甲醛残留量；
图5为0.2％甲醛固定的同一批细胞爬片的荧光结果图；
图6为0.2％甲醛固定的不同批次细胞爬片的甲醛残留量；
图7为0.2％甲醛固定的不同批次细胞爬片的荧光结果图；
图8为甲醛固定不同项目的细胞爬片的甲醛残留量；
图9为甲醛固定不同项目的细胞爬片的荧光结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种用于细胞爬片固定过程的质量控制方法，包括以下步骤：采用乙酰丙酮反应液测定细胞爬片上固定剂甲醛的含量。
本发明所述细胞爬片优选包括同一批次细胞爬片或不同批次的细胞爬片。本发明对所述细胞爬片的制备方法并没有特殊限定，优选包括：向已铺好细胞的爬片通过瞬时转染转入重组质粒，待细胞生长至24～72h进行下一步固定；更优选的还包括将稳转的细胞系复苏，铺至细胞爬片上，待细胞密度生长至80％及以上时进行下一步固定。本发明所述细胞爬片的直径优选为3mm～25mm。
本发明所述固定优选包括将上述细胞爬片使用PBS洗涤2次，加入甲醛溶液固定细胞爬片5～20min，更优选的在所述固定后，可直接使用PBS洗涤2次，也可以使用铵类盐终止后，再用PBS洗涤2次。本发明所述甲醛溶液的质量百分浓度优选为0.2％～5％，且针对不同的项目细胞爬片甲醛浓度略有差异。
本发明对固定后的细胞爬片进行质量控制测定，所述测定优选包括将所述细胞爬片与乙酰丙酮反应液混合后，于50℃反应10min，测定OD412值。本发明在所述混合前优选还包括将所述细胞爬片裁切为1cm2面积，直接放入200μL的乙酰丙酮反应液50℃反应10min，冷却后取100μL样品在波长412nm处进行吸光度测定。本发明所述乙酰丙酮反应液的制备方法，优选包括将5g氯化铵与1mL乙酰丙酮原液混合后，用超纯水定容至50mL。
本发明在所述测定后，优选还包括对未进行测定的新鲜爬片，使用各项目阳性血清对已经固定好的细胞进行染色，用以比较荧光信号强弱，可作为实验的补充，用以确定合适的甲醛浓度。
本发明所述测定优选还包括利用不同浓度的甲醛标准溶液与乙酰丙酮反应液混合后，于50℃反应10min，测定OD412值，建立标准曲线。本发明优选利用所述标准曲线计算所述细胞爬片的固定剂甲醛的含量。
在本发明中，采用乙酰丙酮法测定细胞爬片上固定剂甲醛的含量，乙酰丙酮在铵离子存在的条件下，与甲醛在加热的条件下反应生成稳定的黄色络合物，该络合物冷却后在412nm波长处有吸光值。通过测定同一批次不同细胞爬片之间或不同批次之间细胞爬片的甲醛含量进而判断各批次生产的细胞爬片固定剂量是否一致。
本发明还提供了上述的质量控制方法在筛选细胞爬片时固定剂甲醛的浓度和固定时间中的应用。
本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述，且荧光强度越高，甲醛浓度越适宜。
本发明还提供了上述的质量控制方法在评价同批次或不同批次间细胞爬片固定质量中的应用。本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述，当同批次或不同批次间细胞爬片经上述OD412值测定后，荧光强度一致，证明质量稳定。
下面结合实施例对本发明提供的一种用于细胞爬片固定过程的质量控制方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
标准曲线的建立及最佳甲醛固定浓度的摸索
1、标准曲线的建立
采用乙酰丙酮的方法检测甲醛标准品，建立稳定的标准曲线，其中，甲醛标准溶液浓度梯度选择0.1、0.08、0.05、0.02、0.01、0mg/ml，乙酰丙酮反应液由5g氯化铵与1mL乙酰丙酮原液组成并用超纯水定容至50mL，200μL甲醛样品与1mL乙酰丙酮，50℃反应10min，冷却后取100μL样品在波长412nm处进行吸光度测定。
2、最佳甲醛固定浓度的摸索
2.1重组质粒pcDNA3.1-Mog10的构建
获取Mog10(NM_001363610.2)的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入pcDNA3.1质粒载体中，得到重组质粒载体pcDNA3.1-Mog10，测序正确后提取质粒进行后续实验，本实施例的质粒载体构建具体包括以下步骤：
步骤1：通过PCR方法(也可选人工合成法)获得Mog10的CDS序列作为目的基因，并在目的基因两端加设SalI/NotI的酶切位点；
步骤2：将带有酶切位点的目的基因插入pcDNA3.1质粒载体中，插入位点为SalI/NotI，得到重组质粒，将该重组质粒命名为pcDNA3.1-Mog10；
步骤3：对重组质粒pcDNA3.1-Mog10进行测序，将测序正确的带有目的基因的菌种扩大培养后进行质粒提取，得到重组质粒pcDNA3.1-Mog10。
在本实施例中，取pcDNA3.1质粒的甘油菌种接种于氨苄青霉素抗性的3mL LB液体培养基，置37℃恒温培养箱，220r/min，过夜摇菌。第二日吸取菌液500μL保存菌种，剩余2.5mL菌液用质粒小提试剂盒提取，测浓度。
pcDNA3.1载体酶切：50μL酶切体系，3μg载体，SalI、NotI酶各1μL，10x酶切Buffer5μL，ddH2O补齐至50μL，37℃水浴酶切2h。
酶切产物回收，1％琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，按照凝胶回收试剂盒说明书进行载体片段回收。
目的基因与载体片段连接：20μL连接体系，50ng pcDNA3.1载体，200ng Mog10基因片段，T4连接酶1μL，ddH2O补齐至20μL，16℃连接过夜。
将上述连接产物质粒分别转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于氨苄青霉素固体LB培养板，37℃过夜，第二日挑取5个菌株，接种于氨苄青霉素(25ug/ml)液体LB培养基，37℃过夜培养。次日质粒小提，酶切鉴定正确的质粒送测序再次鉴定。测序鉴定正确的质粒扩大培养进行质粒大提，测浓度。最终得到重组质粒载体pcDNA3.1-Mog10。
2.2pcDNA3.1-Mog10质粒的转染
293T细胞培养：DMEM高糖培养基与FBS按9:1比例配制成10％的FBS-DMEM高糖培养基，待细胞长满后按1:4传代至10cm培养皿中，每皿放入细胞爬片，置37℃、5％的CO2的细胞培养箱中过夜培养；
基因转染：将步骤2.1提取好的pCDNA3.1-Mog10质粒按照PEI转染方法进行转染，转染4～6小时更换新鲜培养液，培养48小时，获得293T-pcDNA3.1-Mog10细胞爬片；
2.3洗涤：将细胞爬片裁切为4份放至6孔板中，使用PBS洗涤2次；
2.4固定：每孔的细胞爬片分别加入不同浓度的甲醛固定0.5小时；所选用的质量百分浓度分别为2％、1％、0.5％、0.2％；
2.5洗涤：甲醛固定后的细胞爬片用PBS洗涤3次；
2.6烘干：使用37℃烘箱干燥烘干；
2.7裁片：将步骤2.4中固定好的细胞爬片裁切成1cm2面积的小爬片；
2.8一抗孵育：使用Mog10的阳性血清对已经固定好的细胞进行染色，并设置对照；
2.9洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
2.10二抗孵育：二抗孵育40min；
2.11洗涤：使用PBST洗涤3次，每次5min；
2.12，观察结果：在荧光显微镜下观察结果。
依据上述荧光度和甲醛浓度，建立如图1所示的标准曲线(四次重复)，各浓度标准品检测值如图2。各浓度标准品检测结果标准差依次为0.040、0.032、0.037、0.011、0.007、0.011，标准差均小于0.05，数据稳定，标准曲线可用于后续浓度检测。
不同浓度甲醛固定后荧光结果如图3所示，甲醛浓度越低，荧光信号越高；甲醛浓度越高，对信号的封闭程度越严，最佳的甲醛固定浓度为0.2％。
实施例2
同一批细胞爬片甲醛浓度的测定
使用实施例1中荧光信号最强的甲醛固定浓度(0.2％)固定同一批次的细胞爬片，测定甲醛残余并比较荧光信号强弱。
1、细胞培养：待293T细胞长满后按1:4传代至10cm培养皿中，放入细胞爬片，置37℃、5％的CO2的细胞培养箱中过夜培养；
2、质粒转染：将实施例1步骤2.1中获得的质粒按照PEI转染方法进行转染，转染4～6小时更换新鲜培养液，48小时后获取细胞爬片；
3、固定：PBS洗涤2次，用实施例1中荧光信号最佳的甲醛浓度固定爬片0.5小时；
4、烘干：甲醛固定后的爬片用PBS洗涤3次，使用37℃烘箱干燥烘干；
5、甲醛浓度检测：将步骤4中的爬片裁切为1cm2面积，随机选取6张，直接放入200μL的乙酰丙酮反应液50℃反应10min，冷却后取100μL样品在波长412nm处进行吸光度测定；
6、荧光信号比较：使用阳性血清对已经固定好的细胞进行染色。
用0.2％浓度的甲醛固定细胞爬片，利用实施例1建立的标准曲线方法测定6张细胞爬片残留的甲醛浓度如表1和图4所示，标准差为0.002；0.2％浓度的甲醛固定后荧光结果如图5所示，相同浓度的甲醛固定同一批次的细胞爬片，荧光信号强弱一致。
表1细胞爬片残留的甲醛浓度
不同爬片 甲醛残留浓度
1cm<sup>2</sup>爬片1 0.020mg/ml
1cm<sup>2</sup>爬片2 0.023mg/ml
1cm<sup>2</sup>爬片3 0.018mg/ml
1cm<sup>2</sup>爬片4 0.019mg/ml
1cm<sup>2</sup>爬片5 0.020mg/ml
1cm<sup>2</sup>爬片6 0.021mg/ml
实施例3
不同批细胞爬片甲醛浓度的测定
为了验证甲醛固定不同批次细胞爬片后，甲醛残余是否稳定，使用实施例1中荧光信号最强的甲醛固定浓度固定不同批次的细胞爬片，测定甲醛残余并比较荧光信号强弱。
1、细胞培养：待293T细胞长满后按1:4传代至10cm培养皿中，每皿放入细胞爬片，置37℃、5％的CO2的细胞培养箱中过夜培养，测定六批细胞爬片；
2、质粒转染：将实施例1步骤2.1中获得的质粒按照PEI转染方法进行转染，转染4～6小时更换新鲜培养液，48小时后获取细胞爬片；
3、固定：PBS洗涤2次，用实施例1中荧光信号最佳的甲醛浓度固定爬片0.5小时；
4、烘干：甲醛固定后的爬片用PBS洗涤3次，使用37℃烘箱干燥烘干；
5、甲醛浓度检测：将步骤4中的爬片裁切为1cm2面积，直接放入200μL的乙酰丙酮反应液50℃反应10min，冷却后取100μL样品在波长412nm处进行吸光度测定；
6、荧光信号比较：使用阳性血清对已经固定好的细胞进行染色。
用0.2％浓度的甲醛固定不同批次细胞爬片，细胞爬片残留的甲醛浓度如表2和图6所示，标准差为0.002，说明甲醛固定后不同批次之间细胞爬片的甲醛残留无差异；荧光结果如图7所示，不同批次的细胞爬片用相同浓度的甲醛固定后荧光信号强度无差异。
表2不同批次细胞爬片残留的甲醛浓度
不同批次爬片 甲醛残留浓度
批次1 0.023mg/ml
批次2 0.019mg/ml
批次3 0.018mg/ml
批次4 0.019mg/ml
批次5 0.022mg/ml
批次6 0.020mg/ml
实施例4
不同项目细胞爬片甲醛浓度的测定
为了验证甲醛残留的检测方法是否具有普遍适用性，向293T细胞转染不同质粒，摸索最佳的甲醛固定浓度，测定甲醛残余并比较荧光信号强弱。
1、细胞培养：待293T细胞长满后按1:4传代至10cm培养皿中，每皿放入细胞爬片，置37℃、5％的CO2的细胞培养箱中过夜培养；
2、质粒转染：将实验室构建好的重组载体pCDNA3.1-AQP4、pCDNA3.1-AMPA1、pCDNA3.1-CASPR2按照PEI转染方法进行转染，转染4～6小时更换新鲜培养液，48小时后获取细胞爬片；
其中，重组质粒的构建方法如下：
获取AQP4(NM_001364286.1)、AMPA1(NM_000827.4)、CASPR2(NM_014141.6)的CDS序列作为目的基因，将带有酶切位点的目的基因插入pcDNA3.1质粒载体中，得到重组质粒载体pCDNA3.1-AQP4、pCDNA3.1-AMPA1、pCDNA3.1-CASPR2，测序正确后提取质粒进行后续实验，本实施例的质粒载体构建具体包括以下步骤：
步骤1：通过PCR方法(也可选人工合成法)获得AQP4、AMPA1、CASPR2的CDS序列作为目的基因，在三种目的基因两端均加设SalI/NotI的酶切位点；
步骤2：将带有酶切位点的三种目的基因分别插入pcDNA3.1质粒载体中，插入位点为SalI/NotI，得到重组质粒，将该重组质粒命名为pcDNA3.1-AQP4、pCDNA3.1-AMPA1、pCDNA3.1-CASPR2；
步骤3：对获得的三种重组质粒测序，将测序正确的带有目的基因的菌种扩大培养后进行质粒提取。
pcDNA3.1载体酶切：50μL酶切体系，3μg载体，SalI、NotI酶各1μL，10x酶切Buffer5μL，ddH2O补齐至50μL，37℃水浴酶切2h。
酶切产物回收，1％琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，按照凝胶回收试剂盒说明书进行载体片段回收。
目的基因与载体片段连接：20μL连接体系，50ng pcDNA3.1载体，200ng基因片段，T4连接酶1μL，ddH2O补齐至20μL，16℃连接过夜。
将上述连接产物质粒分别转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于氨苄青霉素固体LB培养板，37℃过夜，第二日挑取5个菌株，接种于氨苄青霉素(25ug/ml)液体LB培养基，37℃过夜培养。次日质粒小提，酶切鉴定正确的质粒送测序再次鉴定。测序鉴定正确的质粒扩大培养进行质粒大提，测浓度。最终得到重组质粒载体pCDNA3.1-AQP4、pCDNA3.1-AMPA1、pCDNA3.1-CASPR2。
3、固定：PBS洗涤2次，每个项目分别用不同质量百分浓度的甲醛固定0.5小时；所选用的质量百分浓度分别为1％、0.5％、0.2％，固定0.5小时；
4、烘干：甲醛固定后的爬片用PBS洗涤3次，使用37℃烘箱干燥烘干；
5、甲醛浓度检测：将步骤4中的爬片裁切为1cm2面积，直接放入200μL的乙酰丙酮反应液50℃反应10min，冷却后取100μL样品在波长412nm处进行吸光度测定；
6、荧光信号比较：每皿爬片使用各项目阳性血清对已经固定好的细胞进行染色。
甲醛固定不同项目的细胞爬片，残留的甲醛浓度如表3和图8所示，AQP4细胞爬片残留甲醛浓度标准差分别为0.001、0.002、0.002；AMPA1细胞爬片残留甲醛浓度标准差分别为0.002、0.002、0.002；CASPR2细胞爬片残留甲醛浓度标准差分别为0.002、0.001、0.001，各项目甲醛浓度趋于稳定，说明该甲醛残留的测定方法具有普遍适用性；荧光结果如图9所示，AQP4细胞爬片最佳的甲醛固定质量分数浓度为1％；APMA1细胞爬片最佳的甲醛固定质量分数浓度为0.5％；CASPRA2细胞爬片最佳的甲醛固定质量分数浓度为0.5％。
表3甲醛固定不同项目的细胞爬片残留的甲醛浓度(mg/ml)
Figure BDA0003527234760000101
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种用于细胞爬片固定过程的质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：采用乙酰丙酮反应液测定细胞爬片上固定剂甲醛的含量；
所述细胞爬片包括同一批次细胞爬片或不同批次的细胞爬片；
利用固定剂对所述细胞爬片进行固定时，所述固定剂中甲醛的质量百分含量为0.2～5％；
所述测定包括将所述细胞爬片与乙酰丙酮反应液混合后，于50℃反应10min，测定OD412值；
所述测定还包括利用不同浓度的甲醛标准溶液与乙酰丙酮反应液混合后，于50℃反应10min，测定OD412值，建立标准曲线；
利用所述标准曲线计算所述细胞爬片的固定剂甲醛的含量。
2.权利要求1所述的质量控制方法在筛选细胞爬片时固定剂甲醛的浓度和固定时间中的应用。
3.权利要求1所述的质量控制方法在评价同批次或不同批次间细胞爬片固定质量中的应用。
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