CN118086453A - 一种谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系在检测酶活性和酶底物的方法中的应用 - Google Patents

一种谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系在检测酶活性和酶底物的方法中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于物质的检测技术领域，具体而言，涉及一种谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系在检测酶活性和酶底物的方法中的应用。本发明首次将谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系应用于酶活性和酶底物的检测过程中，该检测方法通过双酶循环催化反应测定的原理测定激酶和转氨酶的活性及相应的底物测定。本发明基于两种循环反应体系可实现对果糖、丙酮酸的检测，通过双循环酶动力学法测定的原理，实现对果糖检测的特异性高，灵敏度高，检测范围较广，同时为激酶活性检测和转氨酶活性检测提供一种新的手段。

Description

一种谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系在检测酶活性 和酶底物的方法中的应用
技术领域
本发明属于物质的检测技术领域，具体而言，涉及一种谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系在检测酶活性和酶底物的方法中的应用。
背景技术
果糖是一种广泛存在于自然界中最为常见的己酮糖。果糖中含6个碳原子，也是一种单糖，是葡萄糖的同分异构体，是蔗糖的组成成份。
当人体摄入果糖后，通过肠道吸收后不依赖胰岛素直接进入细胞内代谢，是引起人体器官内脂肪沉积的重要因素之一。当饮食中果糖太多时，对肝脏、动脉和心脏都会有潜在危险。糖尿病人也存在血液循环中果糖水平的升高，果糖激酶失去功能突变引起的先天性果糖尿，患者在进食含果糖丰富是食物后，血中果糖含量升高，并从尿液中排出。
但是现有的果糖检测手段特异性不高，灵敏度差，检测范围受限，因此提出一种基于酶循环反应体系的果糖检测方法和果糖激酶检测方法，同时该反应体系，也可确定谷丙转氨酶的活性和基于此反应的丙酮酸的检测。丙酮酸是一种重要的代谢中间产物，是糖酵解的代谢终产物，同时也是线粒体代谢重要的底物，因此检测丙酮酸含量对研究代谢有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系在检测酶活性和酶底物的方法中的应用。本发明首次将谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系应用于检测酶活性和酶底物的方法中，通过检测NADH在340nm处吸光度可以间接测定果糖含量，以及其他酶活性和酶底物例如丙酮酸含量、果糖激酶活性等，该方法准确度高。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明的一个方面提供了一种谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系在检测酶活性和酶底物的方法中的应用。
优选地，按照总容量100μL计，所述谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系包括以下含量的组分：反应液I：45-55μL；1M NH4Cl：1-9μL；4mM NADH：1-9μL；500mM谷氨酸：1-3μL；谷丙转氨酶GPT2：1-9μL；0.4units/mL谷氨酸脱氢酶bGDH：1-9μL；Assay buffer：25-31μL。
优选地，按照总容量100μL计，所述谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系包括以下含量的组分：反应液I：50μL；1M NH4Cl：5μL；4mM NADH：5μL；500mM谷氨酸：2μL；谷丙转氨酶GPT2：5μL；0.4units/mL谷氨酸脱氢酶bGDH：5μL；Assay buffer：28μL。
优选地，按照总容量100μL计，所述反应液I包括以下含量的组分：1M Tris-HCl：5-15μL；0-10mM果糖：5-15μL；250mM ATP：0.1-0.7μL；60mM MgCl2：2-3μL；1M KCl：5-15μL；100mM磷酸烯醇式丙酮酸PEP：0.5-1.5μL；1M缓冲液HEPES：0.5-1.5μL；500units/mL丙酮酸激酶PK：0.1-0.3μL；果糖激酶KHK：5-15μL；超纯水：50-60μL。
优选地，按照总容量100μL计，所述反应液I包括以下含量的组分：1M Tris-HCl：10μL；0-10mM果糖：10μL；250mM ATP：0.4μL；60mM MgCl2：2.5μL；1M KCl：10μL；100mM磷酸烯醇式丙酮酸PEP：1μL；1M缓冲液HEPES：1μL；500units/mL丙酮酸激酶PK：0.2μL；果糖激酶KHK：10μL；超纯水：54.9μL。
优选地，所述检测酶活性和酶底物的方法包括以下步骤：
步骤1：分别构建果糖激酶质粒和谷丙转氨酶质粒获得果糖激酶蛋白和谷丙转氨酶蛋白，然后进行蛋白的纯化，得到活性果糖激酶和谷丙转氨酶；
步骤2：建立双酶循环反应体系I和II：
反应体系I，为果糖激酶和丙酮酸激酶反应体系：通过丙酮酸激酶及催化的磷酸烯醇丙酮酸与丙酮酸之间的反应及果糖激酶反应的酶循环反应，实现ATP与ADP的循环利用，该反应体系产物为丙酮酸；
反应体系II，为谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶反应体系：以反应体系I中的丙酮酸为起始物，通过谷丙转氨酶与谷氨酸脱氢酶的酶循环反应体系，建立基于谷丙转氨酶和谷氨酸脱氢酶为循环反应体系的酶循环反应，实现谷氨酸和α-酮戊二酸在谷丙转氨酶与谷氨酸脱氢酶反应之间循环使用；
步骤3：通过检测反应体系II中NADH/NAD+在340nm波长吸光度值的变化确定反应体系I和II中的酶活性和酶底物含量。
优选地，按照总容量100μL计，所述反应体系I的组成为：1M Tris-HCl：5-15μL；0-10mM果糖：5-15μL；250mM ATP：0.1-0.7μL；60mM MgCl2：2-3μL；1MKCl：5-15μL；100mM磷酸烯醇式丙酮酸PEP：0.5-1.5μL；1M缓冲液HEPES：0.5-1.5μL；500units/mL丙酮酸激酶PK：0.1-0.3μL；果糖激酶KHK：5-15μL；超纯水：50-60μL；优选为：1M Tris-HCl：10μL；0-10mM果糖：10μL；250mM ATP：0.4μL；60mM MgCl2：2.5μL；1M KCl：10μL；100mM磷酸烯醇式丙酮酸PEP：1μL；1M缓冲液HEPES：1μL；500units/mL丙酮酸激酶PK：0.2μL；果糖激酶KHK：10μL；超纯水：54.9μL。
优选地，按照总容量100μL计，所述反应体系II的组成为：反应液I：45-55μL；1MNH4Cl：1-9μL；4mM NADH：1-9μL；500mM谷氨酸：1-3μL；谷丙转氨酶GPT2：1-9μL；0.4units/mL谷氨酸脱氢酶bGDH：1-9μL；Assay buffer：25-31μL；优选为：反应液I：50μL；1M NH4Cl：5μL；4mM NADH：5μL；500mM谷氨酸：2μL；谷丙转氨酶GPT2：5μL；0.4units/mL谷氨酸脱氢酶bGDH：5μL；Assay buffer：28μL；所述反应液I为反应体系I的组成。
优选地，通过结合反应体系I和II，可确定果糖激酶活性和果糖浓度。
优选地，通过反应体系II可确定谷丙转氨酶活性和丙酮酸浓度。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：本发明基于原有的激酶活性测定中多采用激酶催化后ATP转化为ADP，再以磷酸烯醇丙酮酸(PEP)为底物，在丙酮酸激酶(PK)的催化下生成丙酮酸，之后通过乳酸脱氢酶(LDH)反应测定。因为LDH反应灵敏度的障碍，现有方法存在检测灵敏度的不足。例如基于此方法的果糖激酶(KHK)的检测和基于KHK开发的果糖浓度检测，果糖检测只能测到25μM以上的果糖，不能满足更低浓度果糖检测的需求。因此本发明提供了一种谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系在检测酶活性和酶底物的方法中的应用，本发明首次将谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系应用于酶活性和酶底物的检测过程中，该检测方法通过双酶循环催化反应测定的原理测定激酶和转氨酶的活性及相应的底物测定。本发明基于两种循环反应体系可实现对果糖、丙酮酸的检测。通过双循环酶动力学法测定的原理，实现对果糖检测的特异性高，灵敏度高，检测范围较广，同时为激酶活性检测和转氨酶活性检测提供一种新的手段。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。
附图说明
图1为本发明的双酶循环法的反应设计的示意图；
图2为本发明pET-28a-KHK质粒图谱的示意图；
图3为本发明pET-28a-GPT2质粒图谱的示意图；
图4为本发明不同批次KHK蛋白洗脱液的SDS-PAGE凝胶电泳结果的示意图；
图5为本发明不同批次GPT2蛋白洗脱液的SDS-PAGE凝胶电泳结果的示意图；
图6为本发明GPT2酶反应在不同浓度谷氨酸条件下的反应曲线；
图7为本发明GPT2酶反应在不同反应时间下的反应曲线；
图8为本发明GPT2的酶动力学曲线；
图9为本发明基于GPT2的酶反应的丙酮酸的标准曲线；
图10为本发明KHK不同反应时间的酶反应曲线；
图11为本发明KHK酶动力学反应曲线；
图12为本发明果糖在双酶循环反应体系I和II下的水溶液中的标准曲线；
图13为本发明果糖在双酶循环反应体系I和II下的血液类似物溶液中的标准曲线；
图14为本发明果糖在双酶循环反应体系I和II下的尿液类似物溶液中的标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，本发明涉及两个酶循环反应体系，在谷氨酸脱氢酶(GDH)和谷丙转氨酶(GPT2)循环反应体系(即为反应体系II)中，丙酮酸在谷丙转氨酶(GPT2)的作用下转化为丙氨酸，同时α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的作用下转化为谷氨酸，谷氨酸接着又在在谷丙转氨酶的作用下转化为α-酮戊二酸，在此循环反应过程中涉及到氢原子在载体还原性辅酶I(NAD+)的作用下进行传递的过程。基于该反应体系中的起始物丙酮酸可由果糖激酶KHK和丙酮酸激酶PK反应体系(即为反应体系I)生成，具体过程为：果糖在果糖激酶KHK的作用下转化为果糖-1-磷酸，该过程ATP失去一个磷酸基团转化为ADP；与此同时，磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)在丙酮酸激酶(PK)的作用下转化为丙酮酸，该过程ADP得到一个磷酸基团转化为ATP，形成循环反应。反应体系I的产物丙酮酸可作为反应体系II的起始物。因此，通过检测NADH在340nm处吸光度可以间接测定果糖含量，以及其他酶活性和酶底物例如丙酮酸含量、果糖激酶活性等。而目前尚未有报道披露将谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系应用于检测酶活性和酶底物的方法中。
实施例1：果糖激酶(KHK)和谷丙转氨酶(GPT2)蛋白原核表达
该实施例的构建方法参考本申请人申请的申请号为：202210395204.4，公布号为：CN 114480571A的专利中的方法，具体为：
1、原核表达体系的构建
果糖激酶质粒构建：目的基因按照标准程序合成，使用大肠杆菌表达载体质粒pET-28a，在酶切位点XhoⅠ/NcoⅠ处插入KHK蛋白基因构建重组表达载体pET-28a-KHK，卡那霉素抗性基因筛选，HIS标签蛋白纯化(见图2)。
谷丙转氨酶质粒构建：目的基因按照标准程序合成，使用大肠杆菌表达载体质粒pET-28a，在酶切位点：NdeI/HindIII处插入GPT2蛋白基因构建重组表达载体pET-28a-GPT2，卡那霉素抗性基因筛选，HIS标签蛋白纯化(见图3)。
2、原核重组蛋白的表达与纯化
2.1KHK和GPT2蛋白的表达
(1)常规方法转化到表达菌
1.在超净工作台将2μL pET-28a-KHK/pET-28a-GPT2质粒加入50μL BL21(DE 3)感受态中混合，冰浴30min；
2.热激：将混合物放入水浴锅，42℃水浴热激90s后迅速拿出；
3.冰浴3min后，在超净工作台向混合物加入900μL无抗生素的液体LB培养基并放到37℃摇床，220转/分钟转速摇45min；
4.2000转/分钟转速离心2min；
5.在超净工作台弃大部分上清，留大约50μL培养液重悬菌体，吸出加入有Kan抗生素(50μg/mL)的固体LB培养板上，滚珠涂布法降菌液涂布均匀，倒置放入37℃培养箱中过夜培养。
(2)诱导表达
1.在超净工作台中操作，从培养板中挑选单菌落到加入5mL含有Kan抗生素(50μg/mL)的液体LB培养基，37℃，220转/分钟转速过夜培养；
2.在超净工作台中操作，将过夜培养的菌液转接到含有200mL液体LB培养基的锥形瓶中，加入Kan抗生素，37℃，220转/分钟转速培养；
3.培养3-4h左右时，从中吸取1mL菌液检测OD600值，直到OD600在0.6-0.8之间，加入诱导剂IPTG(100mM)按照1:1000的比例加入锥形瓶中进行诱导表达，37℃，220转/分钟转速培养12h左右；
4.收集菌液：4℃，12000转/分钟，离心20min，弃上清，PBS洗涤一遍，44℃，12000转/分钟，离心20min，弃上清。
2.2蛋白的纯化
重组蛋白KHK和GPT2均携带HIS标签，使用HIS标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白。
a.离心收集细菌沉淀，按照每克细菌沉淀湿重加入4mL(2-5mL均可)非变性裂解液的比例加入裂解液，充分重悬菌体。如有必要，可以在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，例如碧云天的P1030/P1031蛋白酶抑制剂混合物(His-Tag蛋白纯化用，100X)；
注：后续试剂用量均按照1克菌重和4mL裂解液用量进行；
b.加入溶菌酶至终浓度为1mg/mL并混匀，冰水浴或冰上放置30min；
注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/mL的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20℃保存；
c.冰上超声裂解细菌，超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次；
注：具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。
d.(可选做)如果超声处理后裂解液非常粘稠，可以加入RNase A至10μg/mL及DNase I至5μg/mL，冰上放置10-15min。或者也可以使用适当的装好了较细针头的注射器，反复抽吸数次，以剪切粘稠的基因组DNA等；
e.4℃，10000g离心20-30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上，可以取20μl上清留作后续检测用；
注：上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化，上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度；
f.取1mL混合均匀的用50％ BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin(耐变性剂型)做表达蛋白的纯化：
4℃离心(1000g×10s)弃去储存液，向凝胶中加入0.5mL非变性裂解液混匀以平衡凝胶，4℃离心(1000g×10s)弃去液体，再重复平衡1-2次，弃去液体。将约4mL细菌裂解液上清加入其中，4℃在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60min；
注：BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin(耐变性剂型)也可以不平衡直接使用，但蛋白的得率有可能会有5-20％的下降；
g.将裂解液和BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin(耐变性剂型)的混合物装入试剂盒提供的亲和层析柱空柱管中；
注：也可先取1mL混合均匀的50％ BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin(耐变性剂型)装柱，然后用0.5mL非变性裂解液平衡2-3次后加入约4mL细菌裂解液上清，后续可以把穿流液收集后重复上柱3-5次以充分结合目的蛋白。先混合后装柱的方式操作起来相对麻烦一些，但更有利于带有His标签重组蛋白与镍柱的充分结合，特别是当His标签被蛋白本身部分遮挡或His标签重组蛋白浓度很低时与镍柱的结合效率会高一些；
h.将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，收集约20μl穿流液作后续分析用；
i.洗柱5次，每次加入0.5-1mL非变性洗涤液，每次均收集约20μL穿柱的洗涤液用于后续的分析检测用，洗柱及下一步洗脱过程中可以用Bradford法(P0006)简单快速地检测每次洗涤液和洗脱液中的蛋白含量，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数；
注：如果出现后续获得蛋白纯度不够高的情况，可以再增加洗柱次数2-3次；
j.洗脱目的蛋白6-10次，每次用0.5mL非变性洗脱液洗脱，将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中，收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。
3、SDS-PAGE凝胶电泳
3.1灌胶与上样
玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
(1)配胶
分离胶和浓缩胶的制备：按下表1和2中溶液的顺序及比例，配置12％的分离胶和5％的浓缩胶。
表1分离胶的配制组成
表2浓缩胶的配制组成
试剂 5％分离胶(10mL)
30％Acr-Bis(mL) 0.66
1.5M Tirl-HCI pH 6.8(mL) 0.5
ddH2O(mL) 2.75
10％SDS(μL) 40
10％APS(μL) 40
TEMED(μL) 4
(2)配胶步骤
配12％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，灌胶时，可用3mL的吸管或10mL枪吸取适量的胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可，然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。)
当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了，再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
按前面方法配5％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶，将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中，灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平，由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶，待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
(3)上样
用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。取出上样样品至0.5mL离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×，上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。
加足够的电泳液后开始准备上样。用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡，将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
3.2电泳
加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电压控制在100～200V，大约15～20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电压升到200V，电泳过程保持电压稳定，当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1～2cm处即停止电泳，约0.5-1小时，如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。
3.3染色、脱色
电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25％的考马斯亮蓝染液，染色2～4h，必要时可过夜。
弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。
凝胶电泳结果见图4和图5。请参阅图4，KHK蛋白约33kDa，His蛋白约0.6Kd。请参阅图5，GPT2蛋白为65.3kDa。
4、蛋白浓度测定
4.1制作蛋白标准曲线
1.从-20℃取出冻存的5mg/mL蛋白标准(碧云天，P0007)，室温完全融化并混匀后备用；
2.按照下表3配制0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5mg/mL蛋白标准品，蛋白标准品和样品均溶于0.9％ NaCl，每次稀释时注意充分混匀。
表3蛋白标曲建立
编号 稀释液体积 标准品体积 最终浓度
1 70μL 5mg/mL BSA 30μL 1.5mg/mL
2 30μL 从1管取60μL 1mg/mL
3 20μL 从2管取60μL 0.75mg/mL
4 30μL 从3管取60 μL 0.5mg/mL
5 60μL 从4管取60μL 0.25mg/mL
6 60μL 从5管取60μL 0.125mg/mL
7 60μL 0μL 0mg/mL
4.2.蛋白浓度测定
1.取5μL不同浓度蛋白标准加到96孔板的蛋白标准孔中；
2.取5μL待测样品到96孔板的样品孔中；
3.各孔加入250μL G250染色液；
4.用酶标仪测定A595波长的吸光度，在2小时内完成测定；
5.根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品中的蛋白浓度，结果见表4。
表4洗脱液中蛋白浓度测定结果
二、建立谷丙转氨酶GPT2酶动力学检测方法(基于谷丙转氨酶/谷氨酸脱氢酶(GPT2/GDH)循环反应体系II)
2.1.材料和试剂
384孔板
纯化的重组His标签的GPT2
bGDH(GDH from bovine liver)
4mMβ-Nicotinamide adenine dinucleotide,reduced disodium salt hydrate(NADH)；
500mM Glutamate
1M NH4Cl
Assay buffer(Tris-acetate 10mM,0.01mM EDTA,pH 8.0)
待评估化学物：丙酮酸(Pyruvate)
2.2、设备
CLARIOstar多功能酶标仪；湘仪平板离心机；上海新苗电热恒温培养箱。
2.3、程序
2.3.1反应混合物包括2mM NADH；500mM谷氨酸(Glutamate)；1M NH4Cl，5μL重组蛋白谷丙转氨酶GPT2和5μL谷氨酸脱氢酶bGDH，用Assay buffer将体积补为100μL，具体组成见表5：
表5谷丙转氨酶反应体系组成
Stock solutions Added in reaction mix(μL)
NH4Cl(1M) 5
NADH(4mM) 5
谷氨酸(500mM) 2
GPT2 5
bGDH(0.4units/mL) 5
Assay buffer 88
注：Assay buffer(Tris-acetate 10mM,0.01mM EDTA,pH 8.0)。
2.3.2GPT2浓度检测
为了计算所选底物的酶动力学参数，至少选择五种不同浓度的底物。其中，谷氨酸(Glutamate)为谷丙转氨酶(GPT2)的底物，首先选取适宜浓度的GPT2对谷氨酸(Glutamate)的最适宜浓度进行检测。本实验选取4个谷氨酸(Glutamate)浓度分别为0.5、2.5、10、20mM，丙酮酸(Pyruvate)设置为0-200μM，设置12个浓度梯度，从最高浓度2mM(体系中200μM)开始倍比稀释并设置浓度为0mM作为空白对照。
其次，选取适宜浓度的GPT2对丙酮酸(Pyruvate)进行检测，在体系中浓度范围为0至100/500μM，设置12个浓度梯度，从最高浓度5mM(体系中500μM)开始倍比稀释并设置丙酮酸浓度为0mM作为空白对照。建立基于谷丙转氨酶GPT2和谷氨酸脱氢酶GDH为循环反应体系的酶循环反应体系II，实现谷氨酸和α-酮戊二酸(α-KG)在谷丙转氨酶GPT2和谷氨酸脱氢酶GDH反应之间循环使用，通过检测NADH/NAD+反应体系中340nm波长吸光度(OD)值的变化确定GPT2的酶活性。
在CLARIOstar多功能酶标仪中，通过加入不同浓度底物开始连续测定反应，并通过追踪340nm处吸光度的变化来测定活性，这对应于NADH向NAD+的转化，该测定在室温下进行反应，得到反应曲线如图6所示。
NADH的降低速率与GDH活性成正比使用以下公式计算NADH的消耗量：
ΔA340 nm空白-ΔA340 nm测试
得到不同谷氨酸(Glutamate)检测结果的对应数值输入Graphpad Prism软件中进行分析，使用line方程的回归线拟合进行分析，确定平均值±标准误差(n＝4)。
2.4样品检测
配制三个不同浓度的丙酮酸样品(n＝4)对本实验方案的精确度进行检测，结果见表6。由表6可知，变异系数较小，实验结果可靠。
C.V＝SD/mean×100％
其中，C.V＝变异系数(coefficient of variation)
SD＝标准差
Mean＝平均值
表6样品检测结果统计分析
样品 Mean SD CV
样品1 0.106 0.004 3.318
样品2 0.113 0.006 4.889
样品3 0.122 0.001 0.820
三、基于谷丙转氨酶GPT2的酶动力学检测建立丙酮酸检测
3.1.材料和试剂
384孔板
纯化的重组His标签的GPT2
bGDH(牛肝GDH)
4mMβ-Nicotinamide adenine dinucleotide,reduced disodium salt hydrate(NADH)；
500mM Glutamate
1M NH4Cl
Assay buffer(Tris-acetate 10mM,0.01mM EDTA,pH 8.0)
待评估化学物：丙酮酸
3.2、设备
CLARIOstar多功能酶标仪；湘仪平板离心机；上海新苗电热恒温培养箱
3.3程序
3.3.1反应混合物包括2mM NADH；500mM谷氨酸；1M NH4Cl,5μL重组蛋白GPT2和5μLbGDH，用Assay buffer将体积补为100μL，谷丙转氨酶反应体系组成见表7：
表7谷丙转氨酶反应体系组成
Stock solutions Added in reaction mix(μL)
NH4Cl(1M) 5
NADH(4mM) 5
谷氨酸(500mM) 2
GPT2 5
bGDH(0.4units/mL) 5
Assay buffer 88
3.3.2丙酮酸浓度检测
为了计算所选底物的酶动力学参数，至少在五种不同浓度的底物。首先，选取适宜浓度的谷丙转氨酶GPT2对丙酮酸进行检测，综合考虑选取谷氨酸(Glutamate)最佳实验浓度为10mM。丙酮酸在体系中浓度范围为0至100/500μM，设置12个浓度梯度，从最高浓度5mM(体系中500μM)开始倍比稀释并设置丙酮酸浓度为0mM作为空白对照。建立基于谷丙转氨酶GPT2和谷氨酸脱氢酶GDH为循环反应体系II的酶循环反应，实现谷氨酸和alpha-酮戊二酸(α-KG)在GPT2和GDH反应之间循环使用，通过检测NADH/NAD+反应体系中340nm波长吸光度(OD)值的变化确定GPT2的酶活性。
在CLARIOstar多功能酶标仪中，通过加入不同浓度底物开始连续测定反应，并通过追踪340nm处吸光度的变化来测定活性，这对应于NADH向NAD+的转化，该测定在室温下进行反应，得到反应曲线如图7所示。
NADH的降低速率与GDH活性成正比使用以下公式计算NADH的消耗量：
ΔA340 nm空白-ΔA340 nm测试
得到不同丙酮酸检测结果的对应数值输入Graphpad Prism软件中进行分析，使用line方程的回归线拟合进行分析，确定平均值±标准误差(n＝4)。
3.4样品检测
选取三个不同浓度的样品(n＝4)对本实验方案的精确度进行检测，结果见表8。由表8可知，变异系数较小，实验结果可靠。
C.V＝sd/mean×100％
C.V＝变异系数(coefficient of variation)
SD＝标准差
Mean＝平均值
样品检测结果统计分析见表8：
表8样品检测结果分析
样品 Mean SD CV
样品1 0.106 0.007 6.292
样品2 0.187 0.006 3.402
样品3 0.355 0.007 1.974
四、建立果糖激酶(KHK)酶动力学检测方法(基于双酶循环反应体系，即酶循环反应体系I和酶循环反应体系II)
4.1材料和试剂
384孔板
纯化的重组His标签的KHK
纯化的重组His标签的GPT2
bGDH(GDH from bovine liver)
PK(PK enzymes from rabbit muscle)
100mM PEP(Phospho(enol)pyruvic acid tri(cyclohexylammonium)salt)
1M KCl；
100mM ATP；
1M Tris-HCl(pH 7.5)；
4mMβ-Nicotinamide adenine dinucleotide,reduced disodium salt hydrate(NADH)；
100mM MgCl2；
1M KCl；
500mM Glutamate；
1M NH4Cl；
Assay buffer(Tris-acetate 10mM,0.01mM EDTA,pH 8.0)
待评估化学物：D-(-)-果糖；
4.2设备
CLARIOstar多功能酶标仪；湘仪平板离心机；上海新苗电热恒温培养箱
4.3程序
4.3.1.反应溶液体系：
反应体系I混合物包括：100mM Tris-HCl(pH 7.5)，0-1mM果糖，0.5mM ATP(现配现用)，100mM KCl，1.5mM MgCl2，1mM磷酸烯醇式丙酮酸PEP，10mM HEPES，0.2μL丙酮酸激酶PK(使用前储存在-20℃)，以及10μL的果糖激酶KHK，加超纯水定容至总体积为100μL，具体组成见表9；
反应体系II混合物包括：20mM谷氨酸，100mM NH4Cl，0.4mM NADH，Tris-acetate10mM,0.01mM EDTA，10μL重组酶GPT2和10μL bGDH，具体组成见表10；
50μL反应体系I+50μL反应体系II＝100μL最终反应体系。
4.3.2.用于测定KHK活性的反应混合物的组成
表9反应体系I的组成
Stock solutions Added in reaction mix(μL)
Tris-HCl(pH 7.5)(1M) 10
果糖(0-10mM) 10
ATP(250mM) 0.4
MgCl2(60mM) 2.5
KCl(1M) 10
PEP(100mM) 1
HEPES(1M) 1
PK(600-1,500units/mL) 0.2
KHK 10
Ultra-pure water 54.9
表10反应体系II的组成
*Assay buffer(pH 8.0):Tris-acetate 10mM,0.01mM EDTA
4.4GPT2活性检测实验：
4.4.1谷氨酸最佳浓度的确认：通过用不同的谷氨酸浓度，包括0.5mM,2.5mM,10mM和20mM谷氨酸浓度的尝试，确定10mM的谷氨酸为最佳实验条件；(见图6)
4.4.2酶促反应时间的确定：通过尝试不同的反应时间，包括2小时，4小时、5小时、6小时及过夜(大约18小时)，最终确定该酶促反应基本在2小时已经完成；(见图7)
4.4.3数据分析：将不同底物浓度及ΔOD值输入Graphpad Prism软件中进行分析，每个数据点为平均值±标准误差(n＝4)；
4.4.4GPT2酶活性：如图8所示，通过对不同浓度底物(丙酮酸)对应的GPT2酶活性的计算，确定GPT2的酶动力学在此酶循环反应体系下，丙酮酸的Km为117.8μM；
4.4.5丙酮酸检测：根据GPT2的酶动力学特点，丙酮酸在浓度0.5μM至100μM的ΔOD值呈现线性关系，公式为：Y＝0.005108*X+0.01395。以此为依据，可以实现对丙酮酸浓度的确认，最低可以检测至0.5μM的丙酮酸浓度；(见图9)。
4.5KHK活性检测实验
如图1所示，为了计算所选底物的酶动力学参数，至少在五种不同浓度的底物和固定浓度的ATP存在下进行单独的酶反应。其中，果糖为果糖激酶KHK的特异性底物，首先选取两种不同浓度的KHK对果糖进行检测，在体系中浓度范围为0至1mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度10mM(体系中1mM)开始倍比稀释并设置果糖浓度为0mM作为空白对照。
在CLARIOstar多功能酶标仪中，通过加入不同浓度底物开始连续测定反应，并通过追踪340nm处吸光度的变化来测定活性，这对应于NADH向NAD+的转化，该测定在25℃下进行检测，取0-125μM部分作为标准曲线，得到反应曲线如图11所示。
得到不同浓度果糖检测结果的对应数值输入Graphpad Prism软件中进行分析，使用line方程的回归线拟合进行分析，确定平均值±标准误差(n＝4)。
4.5.1样品检测
选取三个不同浓度的样品(n＝4)对本实验方案的精确度进行检测，结果见表11。由表11的结果可知，变异系数(coefficient of variation)较小，实验结果可靠。
C.V＝SD/MEAN×100％；
C.V＝变异系数；
SD＝标准差；
Mean＝平均值。
样品检测结果统计分析见表11：
表11样品检测结果统计
样品 Mean SD CV
样品1 0.089 0.004 4.424
样品2 0.206 0.008 3.855
样品3 0.465 0.013 2.829
4.6具体酶促反应：在体系I中果糖浓度范围为0至1.0mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度10mM(反应体系中的终浓度为1.0mM)开始倍比稀释并设置果糖浓度为0mM作为空白对照，在CLARIOstar多功能酶标仪中，通过加入不同浓度底物开始酶促反应，并通过检测340nm处吸光度的变化来测定活性，及检测刚加入底物后的吸光度OD值(0小时)，之后在37℃温箱中孵育分别为2小时、4小时及6小时，之后再次测定OD值，通过计算OD值的变化(ΔOD)，此ΔOD对应于NADH向NAD+的转化；
4.7反应时间的确认：双酶循环反应的时间分别设定为2小时、4小时和6小时，确认反应在2小时已经基本完成，(见图10)；
4.8数据分析：将不同底物浓度及ΔOD值输入Graphpad Prism软件中进行分析，每个数据点为平均值±标准误差(n＝4)；
4.9KHK酶动力学：反应2小时的KHK酶动力学表现为果糖Km值为589.6μM，(见图11)；
4.10基于KHK酶学反应的果糖浓度测定：
果糖溶解于纯水的标准曲线建立：称取适量果糖溶于纯水中，果糖最高浓度设置为10mM，稀释后反应体系中后终浓度为1mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度开始倍比稀释并设置果糖浓度为0mM作为空白对照；
根据KHK酶动力学特点，果糖浓度在4至250uM为线性关系，因此建立果糖(溶于纯水)的检测标准曲线：y＝0.001709X–0.02108，R2为0.9945。以此为依据，可以实现对果糖浓度的确认，最低可以检测至4μM的丙酮酸浓度(见图12)。
五、其它检测领域拓展
为将本发明的检测方法应用于其他样本检测服务，选取目前在医学和健康领域关注度较高的检测项目，如血液、尿液中果糖含量。
5.1血清中果糖含量的检测
为检测血液中果糖含量，使用血浆类似物(r-SBFA)作为溶剂溶解不同浓度果糖，加入已建立的KHK检测方法的反应体系中，制作检测标准曲线。
血浆类似物(r-SBFA)配制方法见表12：
表12血浆类似物(r-SBFA)配制方法
Reagent Quantity(g/1L) Quantity(g/100mL)
NaCl 5.403 0.540
NaHCO3 0.740 0.074
Na2CO3 2.046 0.205
KCl 0.225 0.023
KH2PO4 0.138 0.014
MgCl2 0.143 0.0143
HEPES 11.928 1.193
CaCl2·2H20 0.388 0.039
NaSO4 0.072 0.007
BSA 40.000 4.000
5.1.1标准曲线建立
以血浆类似物(r-SBFA)为溶剂，果糖最高浓度设置为10mM，每孔加入量10μL，加入反应体系中后终浓度为1mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度开始倍比稀释并设置果糖浓度为0mM作为空白对照，反应体系I结束后加入等体积反应体系II。在CLARIOstar多功能酶标仪中，通过加入不同浓度底物开始连续测定反应，并通过追踪340nm处吸光度的变化来测定活性，这对应于NADH向NAD+的转化，该测定在室温下进行反应，取0-125μM部分作为标准曲线，得到反应曲线如图13。
5.1.2样品检测
选取三个不同浓度的样品(n＝3)对本实验方案的精确度进行检测，结果见表13。由表13可以看出，变异系数(coefficient of variation)较小，实验结果可靠。
C.V＝SD/Mean×100％；
C.V＝变异系数；
SD＝标准差；
Mean＝平均值。
样品检测结果统计分析见表13：
表13样品检测结果统计分析
样品 Mean SD CV
样品1 0.154 0.008 4.966
样品2 0.271 0.007 2.685
样品3 0.499 0.014 2.860
5.2尿液中果糖含量的检测
为检测尿液中果糖含量，使用人工尿液(MP-AU)作为溶剂溶解不同浓度果糖，进行样本处理后，加入已建立的KHK检测方法的反应体系中，制作检测标准曲线。
人工尿液(MP-AU)配制方法见表14：
表14人工尿液(MP-AU)配制方法
5.2.1人工尿液(MP-AU)配制要点
按表14中提供的顺序将相关试剂添加至100mL超纯水中，将磁力搅拌器转速设置为500rpm进行搅拌混匀，在此期间使用搅拌器的加热功能将溶液的温度保持在37.5℃。
MP-AU溶液的pH值为在37℃下24h后将稳定在6.00±0.08左右，因本实验对pH要求严格，所以在实验前24h完成配制。
5.2.2标准曲线建立
称取适量果糖溶于人工尿液(MP-AU)，果糖最高浓度设置为10mM，每孔加入量10μL，加入反应体系中后终浓度为1mM，设置12个浓度梯度，从最高浓度开始倍比稀释并设置果糖浓度为0mM作为空白对照，反应体系I结束后加入等体积反应体系II并在固定时间检测。在CLARIOstar多功能酶标仪中，通过加入不同浓度底物开始连续测定反应，并通过追踪340nm处吸光度的变化来测定活性，这对应于NADH向NAD+的转化，该测定在室温下进行反应，取0-125μM部分作为标准曲线，得到反应曲线如图14。
5.2.3样品检测
选取三个不同浓度的样品(n＝3)对本实验方案的精确度进行检测，结果见表15。由表15可以看出，变异系数较小，实验结果可靠。
C.V＝SD/Mean×100％；
C.V＝变异系数(coefficient of variation)；
SD＝标准差；
Mean＝平均值。
样品检测结果统计分析见表15：
表15样品检测结果统计分析
本发明首次将谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系应用于酶活性和酶底物的检测过程中，该检测方法通过双酶循环催化反应测定的原理测定激酶和转氨酶的活性及相应的底物测定。本发明基于两种循环反应体系可实现对果糖、丙酮酸的检测，通过双循环酶动力学法测定的原理，实现对果糖检测的特异性高，灵敏度高，检测范围较广，同时为激酶活性检测和转氨酶活性检测提供一种新的手段。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系在检测酶活性和酶底物的方法中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，按照总容量100μL计，所述谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系包括以下含量的组分：反应液I：45-55μL；1MNH4Cl：1-9μL；4mMNADH：1-9μL；500mM谷氨酸：1-3μL；谷丙转氨酶GPT2：1-9μL；0.4units/mL谷氨酸脱氢酶bGDH：1-9μL；Assay buffer：25-31μL。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，按照总容量100μL计，所述谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶循环反应体系包括以下含量的组分：反应液I：50μL；1MNH4Cl：5μL；4mM NADH：5μL；500mM谷氨酸：2μL；谷丙转氨酶GPT2：5μL；0.4units/mL谷氨酸脱氢酶bGDH：5μL；Assaybuffer：28μL。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，按照总容量100μL计，所述反应液I包括以下含量的组分：1M Tris-HCl：5-15μL；0-10mM果糖：5-15μL；250mM ATP：0.1-0.7μL；60mMMgCl2：2-3μL；1M KCl：5-15μL；100mM磷酸烯醇式丙酮酸PEP：0.5-1.5μL；1M缓冲液HEPES：0.5-1.5μL；500units/mL丙酮酸激酶PK：0.1-0.3μL；果糖激酶KHK：5-15μL；超纯水；50-60μL。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，按照总容量100μL计，所述反应液I包括以下含量的组分：1M Tris-HCl：10μL；0-10mM果糖：10μL；250mM ATP：0.4μL；60mM MgCl2：2.5μL；1M KCl：10μL；100mM磷酸烯醇式丙酮酸PEP：1μL；1M缓冲液HEPES：1μL；500units/mL丙酮酸激酶PK：0.2μL；果糖激酶KHK：10μL；超纯水：54.9μL。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测酶活性和酶底物的方法包括以下步骤：
步骤1：分别构建果糖激酶质粒和谷丙转氨酶质粒获得果糖激酶蛋白和谷丙转氨酶蛋白，然后进行蛋白的纯化，得到活性果糖激酶和谷丙转氨酶；
步骤2：建立双酶循环反应体系I和II：
反应体系I，为果糖激酶和丙酮酸激酶反应体系：通过丙酮酸激酶及催化的磷酸烯醇丙酮酸与丙酮酸之间的反应及果糖激酶反应的酶循环反应，实现ATP与ADP的循环利用，该反应体系产物为丙酮酸；
反应体系II，为谷氨酸脱氢酶和谷丙转氨酶反应体系：以反应体系I中的丙酮酸为起始物，通过谷丙转氨酶与谷氨酸脱氢酶的酶循环反应体系，建立基于谷丙转氨酶和谷氨酸脱氢酶为循环反应体系的酶循环反应，实现谷氨酸和α-酮戊二酸在谷丙转氨酶与谷氨酸脱氢酶反应之间循环使用；
步骤3：通过检测反应体系II中NADH/NAD+在340nm波长吸光度值的变化确定反应体系I和II中的酶活性和酶底物含量。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，按照总容量100μL计，所述反应体系I的组成为：1M Tris-HCl：5-15μL；0-10mM果糖：5-15μL；250mM ATP：0.1-0.7μL；60mM MgCl2：2-3μL；1M KCl：5-15μL；100mM磷酸烯醇式丙酮酸PEP：0.5-1.5μL；1M缓冲液HEPES：0.5-1.5μL；500units/mL丙酮酸激酶PK：0.1-0.3μL；果糖激酶KHK：5-15μL；超纯水：50-60μL；优选为：1MTris-HCl：10μL；0-10mM果糖：10μL；250mM ATP：0.4μL；60mM MgCl2：2.5μL；1M KCl：10μL；100mM磷酸烯醇式丙酮酸PEP：1μL；1M缓冲液HEPES：1μL；500units/mL丙酮酸激酶PK：0.2μL；果糖激酶KHK：10μL；超纯水：54.9μL。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，按照总容量100μL计，所述反应体系II的组成为：反应液I：45-55μL；1M NH4Cl：1-9μL；4mM NADH：1-9μL；500mM谷氨酸：1-3μL；谷丙转氨酶GPT2：1-9μL；0.4units/mL谷氨酸脱氢酶bGDH：1-9μL；Assay buffer：25-31μL；优选为：反应液I：50μL；1M NH4Cl：5μL；4mM NADH：5μL；500mM谷氨酸：2μL；谷丙转氨酶GPT2：5μL；0.4units/mL谷氨酸脱氢酶bGDH：5μL；Assay buffer：28μL；所述反应液I为反应体系I的组成。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过结合反应体系I和II，可确定果糖激酶活性和果糖浓度。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，通过反应体系II可确定谷丙转氨酶活性和丙酮酸浓度。
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