CN101970455A - 用于蛋白质表征的高压酶消化系统 - Google Patents

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Abstract

用于获得用于蛋白组分析的样品的方法和系统，其利用压力和预选的试剂以获得在比现有技术方法显著短的一段时间内处理样品，并且维持通过准备性处理处理样品的完整性。在本发明的一个实施方式中，样品和酶组合并进行经受压力，优选在0至35kpsi之间变化的压力循环，持续一段时间优选小于60秒。该处理导致产生适于分析的样品，其优选地被引入另外的分析仪器例如质谱仪器或者其他的装置。

Description

用于蛋白质表征的高压酶消化系统
关于根据联邦政府赞助研究与开发进行发明的权利的声明
本发明是受到政府支持(根据合同DE-AC0576RLO1830由美国能源部授予)而进行的。政府具有某些本发明的权利。
优先权
本发明要求临时专利申请No.61/026,845(2008年2月7日提交，标题为″用于蛋白质表征的高压酶消化系统″)和发明专利申请No.12/183,219(2008年7月31日提交，标题为″用于蛋白质表征的高压酶消化系统″)的优先权。
发明背景
发明领域
本发明广泛地涉及分析方法和系统，更特别地涉及蛋白质或者蛋白组学的大规模分析。
背景信息
生物学中的现代科学方法已经导致各种各样的开放技术例如基因组、蛋白组学、代谢组学(metabolomics)，其已经用于研究生物系统中的关联和相互作用。这些方法和科学研究还已经大大地促进临床和生物技术分析的进步。存在于这些科目中的问题之一是制备和处理样品所需要的时间。虽然在减少分析时间方面已经做出了各种进步，但该工艺中的关键瓶颈之一发生在样品处理和制备周期期间。特别地，当需要进行大规模的研究和从而大量样品需要被处理时，更是如此。虽然已经利用各种方案企图通过加速样品准备过程来提高样品的处理量，但这些都没有被认为具有普遍吸引力。
在蛋白组学中，典型样品制备步骤包括消化复杂蛋白质样品，通过与酶温育，在缓冲培养基中持续规定的一段时间，典型地过夜或者大约12小时。这一对长时间的要求使得蛋白质样品的处理过程减速，并且使得蛋白质消化成为蛋白质分析工作流程中最耗时的步骤之一。此外，因为这样的制备过程通常是手动进行的，伴随的涉及操作员误差的风险还可以消极地影响分析。另外，手工样品处理可以引起较大的样品/试剂消耗和提高由于所涉及劳动的成本。当利用非常小的样品尺寸进行工作时，对于临床应用通常如此，自动化和迅速的蛋白质表征是必需的以限制污染及其他操作员有关误差源，和用于使用LC-MS分析达到下一水平的有效性和生产力。
因此，需要的是用于提高可以制备材料例如蛋白质用于分析和分析材料的速度的方法。还需要一种方法，其制备这些用于分析的材料，其不会消极地影响分析其所使用的工作流程。还需要一种用于生物技术样品的高通量系统，以及时的方式提供有效的、精确的、和准确的结果。本发明满足这些需要。
本发明另外的优点和新颖的特征将如下阐明，并且容易从本文所列出的描述和示范装置中显而易见。因此，本发明的下列描述应该被视为发明的说明而非以以任何方式限制。本文描述了本发明的各种的优点和新颖的特征，并且进一步本领域技术人员根据下列详细说明将显而易见。
概要
本发明是用于获得用于蛋白组分析的样品的方法和系统，其利用压力和预选的试剂以获得在比现有技术方法显著短的一段时间内处理样品，并且维持通过准备性处理处理样品的完整性。在本发明中，样品受到预选的压力典型地0.5psi和100kpsi之间的某些，持续选定的周期或者时间间隔，典型地在5和1800秒之间。通过该加压处理，各种的其他的试剂例如化学制剂、酶、微波、声、超声、热、光和其组合还可能与压力结合以影响期望的结果和产生具有期望特征的样品。
在本发明的一个实施方式中，样品和酶组合并进行经受压力，优选在0至35kpsi之间变化的压力循环，持续一段时间优选小于60秒。该处理导致产生适于分析的样品。
该方法可以在用于蛋白组分析的系统中实现，该系统包括样品制备装置，其利用压力和预选的试剂处理蛋白质样品，其例子已经在之前讨论。然后样品制备装置可操作地连接到分析仪器，其允许转移处理的样品至分析仪器用于发生分析。在本发明的一个实施方式中，分析仪器是具有加压样品回路的高压液相色谱(LC)系统。然后该装置可以与另外的分析仪器连接在一起例如质谱法仪器或者其他的装置。可以对该系统进行各种的修改和改造以运行其他的任务例如利用材料例如放射性同位素为处理样品加标签。
虽然已经提供了这些实施例，但显然地可以理解本发明不限于此，但可以替换地根据需要和使用者的需要来进行各种配置。
上述简介的目的是整体上使得美国专利局和公众特别是本领域中的科学家、工程师和从业者(不熟悉专利或者法定期限或者术语)能够通过粗略研究本申请的技术公开的特征和实质而实现迅速地测定。所述简介并不打算限定本申请的发明(由权利要求控制)，也不打算以任何方式限制所述发明的范围。
该文描述了该发明的各种的优点新颖的特征，并且进一步该领域技术人员根据下列详细说明将显而易见。在本发明优选实施方案的前述和后续描述中，提供了执行本发明所设计的最佳方式的例证。正如能够认识到的，本发明能够在各种的方面进行修改而没有离开本发明。因此，此后提出的优选实施方案的图和描述被认为是实际上说明性的，而不是限制性的。
附图简要的说明
图1a和1b显示本发明一个实施方式的试验结果。
图2a和2B显示发明一个实施方式的另外的试验结果。
图3a-3f显示本发明一个实施方式的比较结果。
图4a-4c显示本发明的实施方式的另外的比较结果。
图5a-5c显示本发明的各种的实施方式。
图6a-6g显示本发明的一个实施方式以及各种的结果和其修改。
图7a-7c显示本发明一个实施方式的各种的结果。
图8a-8b显示本发明的另外的实施方式。
图9a-9c显示本发明一个实施方式的结果。
图10a-10b显示本发明一个实施方式的结果。
图11a-11d显示本发明一个实施方式的结果。
图12显示本发明的另外的实施方式。
图13显示利用图12所示实施方式运行的试验的结果。
发明的详细说明
在一个实施方式中，本发明是新的方法用于在高压下迅速蛋白水解消化蛋白质，其利用在5至35kpsi w范围内的压力循环技术以制备样品用于蛋白组分析，以及执行这样的方法的系统。虽然已经显示了这些具体的实施例，但显然地大概理解本发明不限于此，但可以替换地根据需要和特别的使用者的需要来进行各种具体化。在本发明的方法和系统中，利用该方法成功地实现了在60s内溶液消化单一的蛋白质和复杂的蛋白质混合物，然后通过反相液相色谱-电喷射离子化作用离子阱-质谱法分析。通过该方法制备的样品的结果与通过传统的现有技术方法制备的样品的结果一致。然而，在本发明中描述的方法提供了大大简化的样品处理，容易执行，没有样本间交叉污染和成本有效性。
在后面描述的一组实验中，将本发明的一个实施方式与常见的过夜消化处理进行比较。在该特别的应用中，将牛血清清蛋白(BSA)用作标准蛋白质以在不同的条件下评价本方法。首先，将6mgBSA在8M尿素中变性，并在25mM碳酸氢铵(pH 8.25)在37℃用10mM DTT还原1小时。添加碘乙酰胺达到最终浓度50mM，并将所得到的混合物在室温下在黑暗中温育45分钟。将12份50μg等分试样稀释4倍以降低尿素浓度，利用25mM碳酸氢铵、20％MeOH或者80％MeOH。添加胰蛋白酶(蛋白酶与蛋白质的比率1∶50)，至最终容积1.4mL，并将溶液置于脉冲管中。从Pressure BioSciences(West Bridgewater，MA，USA)获得BarocyclerTM NEP-3229仪器和一次性聚丙烯PULSE管FT-500，并用于所有实验。将脉冲管进行BarocyclerTM程序，其使用4-8个压力脉冲，持续每轮总计1分钟。最后，将酶消化物转移至新离心管，酸化，用液氮冷冻以停止反应。然后，通过离心蒸发干燥样品，并在-20℃储存。
沙雷菌(Shewanella oneidensis)菌株MR-1，完整细胞蛋白胰蛋白酶消化物是通过由珠打击(bead beating)进行裂解制备的，其使用0.1mm氧化锆/氧化硅珠在微型珠打击仪中在4500rpm进行180s。收集裂解物并立即放置冰上以抑制蛋白水解，然后利用8M尿素、25mM碳酸氢铵、10mM DTT(pH 8)变性，在37℃温育1h。添加碘乙酰胺达到最终浓度50mM，并将得到的混合物在室温下在黑暗中温育45分钟。稀释混合物4倍，并在添加胰蛋白酶后(蛋白酶与蛋白质的比例为1∶50)在37℃温育过夜或者利用PCT在35kpsi温育1分钟。
制备在12.5mM碳酸氢铵中最终浓度为1μM蛋白质的溶液，进行肌球蛋白实验。添加胰蛋白酶，并在BarocyclerTM中压力循环过程中消化样品(蛋白酶与蛋白质的比例为1∶50)。处理后，通过LC-MS/MS分析500fmol蛋白质消化物。使用40-nL富集柱和43mm×75μm分析柱(填充5μm ZORBAX 300SB C18颗粒)进行分离。采用流速1μL/min进行富集，之后为600nL/min。使用5分钟梯度洗脱肽，从5％至90％溶剂B(0.5％甲酸，90％乙腈；溶剂A：在水中的0.5％甲酸∶乙腈97∶3)，其中分离窗口为大约2分钟。总分析时间为12分钟。每份样品分析三遍。为了防止不同样品之间的交叉污染，在每组重复之间运行空白。
在调查中获取的数据扫描500至1600amu(3次微扫描)，随后是5次数据依赖性MS/MS扫描，使用3amu的分离宽度，35％的标准化碰撞能量，和2分钟的动态排除时间。使用Spectrum Mill软件针对内部FASTA数据库对MS/MS数据进行分析，其中所述FASTA数据库是从沙雷菌MR-1和BSA蛋白质获得的。手动确认与BSA匹配的光谱。
对于复杂的蛋白质混合物分析，利用定制的在线偶联至线性离子截留质谱仪(具有内部开发的ESI源)的毛细管LC系统分析2μg沙雷菌消化物。以数据依赖性MS/MS模式(m/z 400-2,000)运转LTQ质谱仪，其中完全的MS扫描之后是十次MS/MS扫描，利用35％标准化碰撞能量，动力学排除为1分钟。利用SEQUEST进行蛋白质鉴定以从沙雷菌MR-1基因组序列推导蛋白质序列。数据库调查参数包括对于Met氧化进行动态修饰调查(即调查存在和缺少修饰)，以及对于Cys上的脲基甲基化进行静态调查(即仅调查修饰的存在)。如同以前报告的，计算肽鉴定的误差率。
为了研究肌球蛋白折叠，通过注射器泵以1μL/min直接将蛋白质(有或没有之前的压力处理)注入Agilent TOF MS内通过ESI界面。以1次扫描/秒的扫描速度记录500-2500m/z范围上的MS数据。
现在参考图1a和1b，显示了在每种压力下，在5，10，20和35kpsi持续60s的就蛋白质蛋白水解产物而言的酶活性。图1a中的色谱表示在所有压力下，胰蛋白酶活性都没有受到破坏。然而，正如图1b中所示，在5kpsi下，所鉴定肽的消化不如更高压力下完全，尽管在5，10，和20kpsi的色谱相似。尽管，属于35kpsi样品的色谱与其他相比看上去显著不同。手动MS色谱的研究显示了色谱之间相同的肽。在将压力施加于含有BSA但不存在胰蛋白酶的溶液时，没有观察到蛋白质降解产物，这表明压力处理本身并不能造成蛋白质片段化。
为评价高低压力之间的快速循环对胰蛋白酶活性的影响，在压力下消化BSA，利用4或者8个差动压力循环持续总共60s。为了进一步分析在存在有机溶剂时压力对胰蛋白酶消化的综合影响，在存在下列时对相同的BSA蛋白质等分试样进行压力消化：1)碳酸氢铵，2)碳酸氢铵∶甲醇的80∶20(v/v)混合物，和3)碳酸氢铵∶甲醇的20∶80(v/v)混合物。混合有机-含水溶剂系统中的酶的性能受诸如下列的因素的影响：蛋白质结构、相界面的存在、介电常数等等，所有这些都有助于酶在它的生物催化系统中的性能。
图2a中的直方图显示了对于在相当的消化缓冲液中消化的样品获得了就独特肽鉴定的数目而言几乎相同的结果，而与循环的数目无关。图2b中的色谱特征对于相当的缓冲液也非常相似。对于在循环压力下获得的这些结果与在恒压下获得的那些结果的比较显示没有重大差别，这暗示至少对于胰蛋白酶，在消化期间没有由于利用PCT的差动压力循环数目的活性的显著影响。此外，鉴定肽的数目在含水的(即碳酸氢铵)和20％甲醇消化4或8周期方案之间没有显著地不同(图2a)。
还通过应用PCT至蛋白组样品然后利用鸟枪(shotgun)蛋白组方法对其分析来评价本发明的该实施方式。将来自沙雷菌细胞制品的总蛋白组提取物分成两个相同的等分试样，在60s期间内将其一进行35kpsi下的PCT辅助消化持续8个循环，将另一个根据传统的过夜方法进行胰蛋白酶消化，以达到比较的目的。PCT条件反映了BarocyclerTM能够运行的最高的周期数和最高的压力，，其之前显示能够实现良好的胰蛋白酶活性。通过反相HPLC利用100分钟梯度分析消化的肽混合物。
为了比较，在图3中(a和b)提供了来自利用在典型常压的传统方法和PCT辅助消化的胰蛋白酶消化的LC-MS/MS分析的总离子流色谱。注意，这些色谱展示了非常相似的强度特征，尽管消化条件不同；然而，使用压力规程获得的鉴定肽的数目比通过传统方法获得的那些要稍高(大约10％)(图3c)。来自更严谨的鉴定肽的结果(即，假结果率(FDR)＜1％)显示具有超过1个错失切割的肽的数目比传统规程低得多(图3d)，而大约超过95％的PCT辅助消化肽的错失切割小于2个。
然而，两个实验就鉴定肽而言具有宽重叠，其中PCT辅助消化规程产生更多的肽鉴定(图3e)。在两种样品中，非胰蛋白酶水解形成的肽(non-tryptic peptide)的数目都不显著(图3f)，并且在我们设定的用于鉴定肽的误差范围内(即＜1％FDR)。对于两种消化，半胰蛋白酶水解形成的肽(semi-tryptic peptide)的群集(定义为一个末端不是胰蛋白酶水解形成的)非常相似。
最后，为检验更好的消化收率是由于起因于压力的去折叠作用的假设，在直接注射入质谱仪之前，将肌球蛋白溶于12mM碳酸氢铵并经受10kpsi持续60s。为了进行比较，还通过TOF-MS分析未经受压力处理的天然肌球蛋白蛋白质样品。如图4所示，在中性的pH获得的压力处理和非压力处理蛋白质的光谱是完全不同的。显著地，对应于天然蛋白质的电荷状态比对应于压力处理蛋白质的那些低得多。天然蛋白质在MW 17,568Da产生最大信号，而压力处理蛋白质的电荷状态则转变到更高的电荷状态，MW相当于16,952Da。该发现表明血红素基团(616Da)的损失和蛋白质的完全的变性作用仅由于压力处理；天然蛋白质的去折叠允许电荷-电荷斥力的减少，接着这允许较大的质子化度。
这些结果证明压力增加如何显著地提高蛋白组样品中蛋白质的酶消化速度。本发明提供的优点包括自动化样品制备，高试样处理量(在我们的设置中最高达到三个样品每分钟)而没有破坏消化收率，高再现性，没有气溶胶化(当应用HIFU时发生的常见的作用)和在短得多的时间段内(即1分钟)获得与使用常规消化规程获得的那些相当的结果。因为消化可以在20℃完成，因此能够避免不希望的蛋白质修饰。
本发明的方法可以通过诸如示于图5a-5c中的系统的系统来执行。图5a显示离线系统，而图5b和5c显示在线的消化系统，其降低样品操作步骤的数目用于高通量蛋白组。在该实施方式中，加压样品回路被引入到基于液相色谱的分离系统中，其中样品和酶(例如胰蛋白酶)两者都能够被同时引入以产生完全的、超速消化。在该实施方式中，系统的流体组分由下列组成：具有5μL样品回路的六端注射阀，额定为15,000psi的四端阀。将10,000psi注射器泵用于将移动相供给至该系统。在7,000psi恒压下操作快速在线消化系统(FOLDS)并使用水作为流动相。执行若干修改以将FOLDS在线结合至质谱仪。在示于图5b的实施方式中，仅仅在ESI之前，将填充90％乙腈和1％甲酸的第二注射器泵用来再酸化样品。在第三构造中，将FOLDS结合至装备纳米流动泵的Agilent LC 1100系统。利用10到60％溶剂B的梯度洗脱肽(溶剂A：0.5％甲酸。溶剂B0.5％甲酸，80％乙腈)。
FOLDS的运转和显示阀、端口和样品回路放置的细节示于图5。在三部分中描述系统功能，这对应样品处理的几个阶段：上样、消化和分析或者收集。图5举例说明了最初在样品上样阶段，将回路填充5μl样品以及溶解的胰蛋白酶。为了开始加速的蛋白质消化，将第一个阀换到注射位置使得系统加压至7,000psi，但是流到系统其余部分的流体被阻断，因为第二阀处于上样位置并且端口被关闭。在消化阶段，样品回路变成反应室并且允许消化继续1至3分钟。当完成压力辅助消化时，将第二阀换到注射位置开始样品分析阶段。将消化的样品直接地注入质谱仪，收集用于离线分析，或者导入反相柱进行色谱分离。
开始，以离线方式采用ODS(图5a)以表征消化效率。一旦收集样品，就将其干燥，将它们再悬浮在10μL 40％MeOH∶水、0.1％甲酸缓冲液中，并利用TriVersa Nanomate电喷射入修改的Bruker 12T APEX-QFTICR质谱仪，如同之前所描述的11。每2s记录每个质谱，并且将3个质谱的平均值用于数据分析。对于在线应用，使用两个不同的设置。如图5b所示，ODS连接至引入家用IMS仪器(具有Agilent 6210 oTOF MS)的平台。在另一组实验中，ODS连接至毛细管RPLC分离，之后是运行离子阱，如前所描述的(图5c)。
将蛋白质溶解于12.5mM碳酸氢铵缓冲液(pH 8.2)中，并且与测序等级的改性胰蛋白酶混合，酶底物比例为1∶50。然后将混合物输入加压系统。收集消化物用于离线实验或者直接利用MS分析。首先用10mM DTT在37摄氏度还原牛血清清蛋白1小时，并且用50mM IAA在室温下烷基化45分钟。根据在其他地方所述准备沙雷菌并且用作对照。如果没有明确说明，以与上面所述相同的方式制备可溶性蛋白组。
对于那些只采用高精确度MS的分析而言，使用MASCOT搜索引擎进行蛋白质鉴定。由于样品的低复杂性，如果评分在不确定的区域之外，则考虑该蛋白质被鉴定。为了进行MS/MS分析，使用SEQUESTTM数据库搜索引擎。为了计算与肽鉴定相关的误差率，使用与之前公开相同的方法。
第一个实验使用在12mM碳酸氢铵中的1pmol肌球蛋白，其中胰蛋白酶被注射入FOLDS(图5a)。施加压力持续1分钟，并且在0到7000psi之间变化。一分钟后，收集样品在反应管中，并使用ESI芯片辅助直接注入12T FTICR MS中进行分析(图6)。FOLDS的使用允许我们能够同时地检测任何非消化完整的蛋白质以及蛋白水解的肽。当不施加压力时，从FOLDS洗脱的蛋白质被检测为具有对应11到15的电荷状态。当FOLDS中的压力提高至500psi时，观察到蛋白质更高的电荷状态，但没有肽片段。这很可能由于蛋白质三级结构的显著的改变，导致之前未曝露的位置被质子化。在第三实验中，将压力增加到1000psi。MS分析显示消化和变性处理开始发生，其显示肽和完整的蛋白质两者的混合物。在该压力下产生和鉴定的肽提供100％蛋白质覆盖，其具有小于三个的错失切割。最后，为了确认高压和消化速度之间的关联，我们提高FOLDS中的压力最高达到7000psi。结果，在一分钟内实现了完全的蛋白质消化，如图6b-6f所示。
因为7000psi压力促进完全的和迅速的消化，我们进一步研究消化动力学。图7a-7c显示即使在30秒反应时间，也能够实现满意的消化。通过利用高通量精确(high mass accuracy)12T FTICR MS分析在30秒消化中产生的肽，我们能够获得良好的蛋白质覆盖，但有相当多水平的错失切割。
为了提高装置的灵敏度，将通过独立的注射器泵递送的有机缓冲液(90％甲醇，1％甲酸)与FOLDS洗脱液混合，其中ESI放射器产生改善的电离效率。酸化溶剂的回流是由FOLDS泵的更高的压力防止的。研究肌球蛋白的示意视图，利用施加一分钟压力，有和没有胰蛋白酶。图9显示由IMS-TOF-MS得到的肌球蛋白消化结果与FTMS报道的那些一致。从开始注射直到获得光谱的总分析时间小于90秒。该速度增大关键来源是在气相阶段IMS-TOF MS迅速地分离离子的能力，其主要依赖于他们的电荷和气体动力横截面。
图10显示肌球蛋白和β乳球蛋白等摩尔混合物(各1pmol)的分析结果，其利用连接至IMS-TOF MS的FOLDS。在加压下消化该混合物1分钟，并将产物递送至IMS-TOF MS，如上所述。肽质量指纹分析产生了具有高MASCOT得分的蛋白质以及高蛋白覆盖二者的鉴定，正如在图10b的表中所概括的。在线直接输入配置中ODS的缺点之一是蛋白组样品处理常常要求使用盐和离液剂，这可能产生提高的化学制剂噪音和降低的电离效率削弱精确的蛋白质鉴定。
为了解决该限制并达到更高的灵敏度，我们将FOLDS连接至RPLC分离以对消化后样品进行脱盐。在该研究中，将10pmol BSA在8M尿素中还原和烷基化，用12.5mM碳酸氢铵稀释10倍并且与胰蛋白酶混合。将1pmol得到的溶液注入FOLDS中。在7,000psi消化1分钟之后，将肽产品上样到反相柱，流速为大约10μL/min，然后使用20min梯度在实验部分描述的条件下分离。利用LCQ质谱仪以MS/MS模式分析LC洗脱液。图11a显示实现了高蛋白质覆盖，大约70％的氨基酸序列，并且所有48种鉴定的肽被均匀地在蛋白质序列上分布。
在一个实验中，研究沙雷菌的细菌蛋白组。可溶性蛋白组再悬浮在25mM碳酸氢铵中，添加胰蛋白酶，酶∶蛋白质为1∶50，并且将5μg总蛋白量注入系统中，并且在7,000psi下消化1分钟。将使用传统的规程和FOLDS获得的蛋白水解消化物进行分析以用于有和没有还原/烷基化程序的比较。在传统的利用胰蛋白酶的蛋白组消化中，将5μg等分试样沙雷菌进行环境压力下常规消化5小时，不添加离液剂并且没有还原或者烷基化蛋白质。消化用FOLDS消化相同的样品，没有离液剂和还原/烷基化。结果，利用常规程序鉴定肽的数目发现低于从FOLDS处理样品所鉴定的。
因为先前的肌球蛋白研究已经显示压力会使蛋白质变性，同时加速反应动力学，因此第二组实验目的在于评价变性的作用。将5微克沙雷菌蛋白组在存在8M尿素时还原和烷基化，然后经受胰蛋白酶消化利用传统的和FOLDS规程两者。图11b显示利用常规程序鉴定肽的数目接近利用FOLDS获得的那些。该研究表明不仅提高压力加速消化速度，还因为作为变性剂而不需要添加离液剂，促进酶分子和底物之间复合物的形成。此外，在高压下处理肌球蛋白所观察的这些数据和结构变化暗示不仅提高压力加速蛋白水解消化，而且它还能够使蛋白质变性如离液剂。需要进一步研究证实该假设。然而，因为压力使蛋白质变性，但是胰蛋白酶仍然工作，因此我们相信以其催化三联体(catalytic triad)对高温非常稳定的方式以及以相同方式对待压力，设计胰蛋白酶测序。
在另一组实验中，我们证明同位素标记肽(使用双重在线消化系统)的可能性，通过将消化缓冲液中常规的水替换为富含18O的水，图12。这是酶催化的反应，其中所有产生的肽都可以被至少一个18O原子标记，最高达到羧基末端的两个。反应是在上面的方案中所描述的，其中蛋白酶引入两个O-18原子，通过由丝氨酸蛋白酶家族的酶分子对肽进行反向连接。
引入稳定的同位素能够在不同样品之间进行全面的定量比较，由于在各个样品中引入同位素所造成的质量差别。作为该观点的证据，图12显示BSA肽的等摩尔混合物。两份相同的BSA蛋白的等分试样已经被在线消化，同位素标记和利用LC-MS进行分析。利用优化的工作流程(引入FOLDS强化消化和标记)获得的结果与利用传统的，更耗时的蛋白组工作流程获得的结果相当，表明数据质量并没有因为运转更快而被破坏。该双重FOLDS系统可以在全面蛋白质分析通量中提供显著的改进，用于包括大量样品的生物学应用，例如用于生物标记发现的临床研究。
使用FOLDS结合MS用于鉴定消化产物已经完成了许多目标。首先，不再需要延长的温育时间以达到有效的蛋白质消化，因为应用高压加速了蛋白质水解动力学。第二，使用溶液中的胰蛋白酶消除了利用固定化酶观察到的非特异性结合。第三，将FOLDS连接至IMS-TOF MS获得了分析平台，其具有快速检测肽离子数目的能力，其以非常流行的方式可以用于单蛋白质鉴定或者监控。这种峰值能力可以被进一步提高，通过将毛细管RPLC分离连接至IMS-TOF MS仪器。在所有报道的设置中，省去了许多样品处理步骤，使得这些方法的自动化可以实行。
尽管显示和描述了本发明的各种优选实施方案，但需要特别理解的是本发明不限于此，而且可以以各种方式实现，在后面权利要求的范围内。根据前面的描述，显而易见，可以进行各种改变，而不离开后面权利要求所限定的本发明的主旨和范围。

Claims (15)

1.用于选择性地加速大分子片段化的方法，其特征在于同时施加压力以及至少一种预选的试剂至预选的材料以在预选的时段内获得经过处理的样品。
2.权利要求1的方法，其中，所述预选的试剂包括化学制剂、酶、微波、声、超声、热、光和其组合。
3.权利要求2的方法，其中，所述试剂是酶。
4.权利要求3的方法，其中，所述预选的时段在5秒和1800秒之间。
5.前述权利要求任一项的方法，其中，所述压力提供于压力循环中，其在0.5psi至100kpsi的范围内。
6.权利要求5的方法，其中，所述预选的材料选自蛋白质、蛋白质高分子、预选长度的肽、有机分子和无机分子。
7.权利要求6的方法，其中，所述预选的材料存在于固体载体中。
8.权利要求7的方法，其中，所述预选的材料存在于凝胶基质中。
9.前述权利要求任一项的方法，其进一步包括下列步骤：除了所述压力和预选的试剂之外，利用同位素处理所述预选的材料，以在所述处理样品上形成预选的标记。
10.用于蛋白组分析的系统，其特征在于样品制备装置利用压力结合预选的试剂片段化蛋白质样品，其中所述预选的试剂选自化学制剂、酶、微波、声、超声、热、光和其组合。
11.权利要求10的系统，其进一步含有分析仪器。
12.权利要求10-11任一项的系统，其中，所述样品制备装置可操作地与所述分析仪器连接。
13.权利要求12的系统，除了所述压力和所述预选的试剂之外，其进一步含有同位素。
14.权利要求12的系统，其中，所述分析仪器是具有加压样品回路的高压液相色谱(LC)系统。
15.权利要求14的系统，其中，所述分析仪器进一步含有质谱仪器。
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