CN111929374A - 植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法，包括如下步骤：制备待测植物样品溶液，在特定的色谱条件和质谱条件下采用LC‑MS/MS检测分析，根据类胡萝卜素酯类化合物的定性Q1/Q3离子对，确定待测植物中是否含有类胡萝卜素酯类化合物。该液质联用分析方法可适用于不同植物样本中类胡萝卜素酯类物质的快速分析。
Description
技术领域
本发明涉及检测分析技术领域，尤其涉及一种植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法。
背景技术
类胡萝卜素(carotenoids)是一类重要的天然色素的总称，分为胡萝卜素和叶黄素。类胡萝卜素酯类化合物是植物中叶黄素类化合物与脂肪酸通过酯化反应形成的一类物质。在植物中，类胡萝卜素一部分以游离态存在，一部分以类胡萝卜素酯类化合物的形式存在。
目前，商业化的类胡萝卜素酯类物质标准品稀少，因此，通常无法直接通过绝对定量的方式对植物中的类胡萝卜素酯类物质进行一一定量检测分析。
发明内容
基于此，有必要提供一种类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法，能够适用于不同植物样本中类胡萝卜素酯类物质的快速定性及半定量分析。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法，包括如下步骤：
确定采用LC-MS/MS检测分析的参数条件，色谱条件：采用反向色谱柱，柱温25℃～30℃，流动相A为含0.08％～0.12％甲酸、0.008％～0.012％BHT、甲醇20％～30％的乙腈溶液，流动相B为含0.008％～0.012％BHT的甲基叔丁基醚，采用梯度洗脱方式；质谱条件：采用正离子模式和MRM扫描模式；
制备待测植物样品溶液，按照所述色谱条件和所述质谱条件上机测试；
根据类胡萝卜素酯类化合物的至少两对定性Q1/Q3离子对信息确定待测植物中是否含有类胡萝卜素酯类化合物。
若待测植物中含有类胡萝卜素酯类化合物，则采用类胡萝卜素或其酯类化合物标准品，建立标准曲线法测定所述待测植物中类胡萝卜素酯类化合物的含量。
优选地，所述反向色谱柱为YMC C30柱，所述柱温为28℃，所述流动相A为含0.08％～0.12％甲酸、0.008％～0.012％BHT、甲醇23％～27％的乙腈溶液，所述梯度洗脱程序为：
0min，流动相A与流动相B的体积比为100:0；
3min，流动相A与流动相B的体积比为100:0；
5min，流动相A与流动相B的体积比为30:70；
8min，流动相A与流动相B的体积比为5:95；
9min，流动相A与流动相B的体积比5:95；
9.01min，流动相A与流动相B的体积比为100:0；
10min，流动相A与流动相B的体积比为100:0。
优选地，所述质谱条件为：APCI+离子源，离子源温度为345℃～355℃，气帘气压力为25psi，辅助加热气Gas1压力为55psi，辅助加热气Gas2压力为60psi，碰撞气压力为12psi，MRM监测窗口为120s。
在其中一些实施例中，所述定性Q1/Q3离子对的建立方法包括如下步骤：
根据已知分子结构的胡萝卜素酯类化合物的碳骨架结构以及其端羟基与脂肪酸的结合形式，推导理论上可形成的类胡萝卜素酯化合物的分子结构和分子量；
按照上述所述的参数条件，对已知胡萝卜素酯类化合物进行LC-MS/MS分析，确定主要裂解碎片信息，计算所述理论上可形成的类胡萝卜素酯化合物的所有理论二级碎片信息，并与母离子组合，推导该检测模式条件下的所有理论Q1/Q3离子对；
根据同类型类胡萝卜素酯类化合物的保留时间随着总碳原子数目增加向后移动以及随着总双键数目增加向前移动，推测待测类胡萝卜素酯类化合物的保留时间，并通过类胡萝卜素酯类化合物标准品分析校正，确定所述定性Q1/Q3离子对信息。
在其中一些实施例中，所述制备待测植物样品溶液包括如下步骤：将植物样品研磨成粉末，按照重量体积比1：(10～20)加入提取溶剂，所述提取溶剂为含0.008％-0.012％BHT以及体积比(0.8～1.2):(0.8～1.2):(1.8～2.2)的正己烷、丙酮和乙醇的混合溶剂，室温下涡旋提取2～3次，每次15～15min，离心，收集上清液；将收集的上清液进行浓缩，得浓缩液；采用复溶剂溶解所述浓缩液，即得。
进一步，所述复溶剂优选含0.008％～0.012％BHT以及体积比(2.8～3.2):1的甲醇和甲基叔丁基醚的混合溶剂。
本发明的有益效果是：
本发明植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法通过筛选特定的色谱条件和质谱条件，依靠定性离子对以及可获得的标准品验证可靠性，能够在11min内快速实现不同植物样本中类胡萝卜素酯类的检测分析，再通过建立标准曲线法实现同一类类胡萝卜酯类物质的定量分析。
附图说明
图1为实施例1枸杞样本中zeaxanthin(C14:0/C16:0)的色谱图。
图2为实施例1枸杞样本中zeaxanthin(C16:0/C16:0)的色谱图。
图3为实施例1中5ppm标准品zeaxanthin(C16:0/C16:0)的色谱图。
图4为实施例2柑橘样本中β-cryptoxanthin(C12:0)的检测谱图。
图5为实施例2柑橘样本中β-cryptoxanthin(C14:0)的检测谱图。
图6为实施例2柑橘样本中β-cryptoxanthin(C16:0)的检测谱图。
图7为枸杞提取物中类胡萝卜素的检测谱图。
图8为实施例3柑橘提取物类胡萝卜素的检测谱图。
图9为实施例3柑橘提取物β-隐黄质酯类物质的检测谱图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
试验仪器：AB SCIEX QTRAP 6500LC-MS/MS仪器。
一实施方式的植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法，包括如下步骤：
S1，确定植物中类胡萝卜素酯类化合物的LC-MS/MS分析参数条件，如下表1和表2所示：
表1色谱条件
表2质谱条件
| Ion Mode | APCI+ | Curtain Gas | 25 |
| Nebulizer Current | 3 | Temperatμre | 350 |
| Ion Source Gas1 | 55 | Ion Source Gas2 | 60 |
| Collision Gas | Medium | Scan type | MRM |
| Entrance Potential | 10 | Collision Cell Exit Potential | 13 |
| MRM detection window | 120 | Target Scan Time | 0.3s |
S2，建立类胡萝卜素酯类化合物定性Q1/Q3离子对信息库。
根据已知分子结构的胡萝卜素酯类化合物的碳骨架结构以及其端羟基与脂肪酸的结合形式，推导理论上可形成的类胡萝卜素酯化合物的分子结构和分子量。
按照步骤S1的参数条件，对已知胡萝卜素酯类化合物进行LC-MS/MS测试分析，确定主要裂解碎片信息，计算理论上可形成的类胡萝卜素酯化合物的所有理论二级碎片信息，并与母离子组合，推导该检测模式条件下的所有理论Q1/Q3离子对。
根据同类型类胡萝卜素酯类化合物的保留时间随着总碳原子数目增加向后移动以及随着总双键数目增加向前移动，推测待测类胡萝卜素酯类化合物的保留时间，并通过类胡萝卜素酯类化合物标准品分析校正，确定所述定性Q1/Q3离子对信息，建立类胡萝卜素酯的理论二级谱库。
S3，制备待测植物样品溶液，包括如下步骤：
(1)冻干植物样本，研磨成粉末。
(2)准确称取样本粉末，按照重量体积比1：(10～20)的比例向粉末中加入提取溶剂，涡旋提取20min，离心，取上清；再往沉淀中再次加入提取溶剂，重复提取第二次，合并上清液。其中，提取溶剂为含0.01％BHT以及体积比为1:1:2的正己烷、丙酮、乙醇的混合溶剂。
(3)真空条件下浓缩步骤S2获得的上清液，得浓缩液。
(4)将浓缩液采用复溶剂溶解，复溶剂为含0.01％BHT以及体积比为3:1的甲醇和甲基叔丁基醚的混合溶剂，过滤，即得供试品溶液。
S4，按照S1步骤中的参数条件上机测试，根据类胡萝卜素酯类化合物的至少两对定性Q1/Q3离子对确定待测植物中是否含有类胡萝卜素酯类化合物。若待测植物中含有类胡萝卜素酯类化合物，则采用类胡萝卜素酯类化合物标准品，通过建立标准曲线法，测定待测植物中类胡萝卜素酯类化合物的含量。
下面进行举例说明。
实施例1
本实施例提供一种玉米黄质类酯类物质的液质联用分析方法，采用上表1和表2的参数条件进行测试，包括如下步骤：
S1，根据玉米黄质(zeaxanthin)和脂肪酸的结合形式，推导出植物样本中可能存在的类胡萝卜素酯化合物。
玉米黄质(zeaxanthin)的碳骨架的两端各有一个羟基，其中一个羟基与脂肪酸结合形成单酯，两个羟基都与脂肪酸结合形成二酯。若与两个羟基结合的脂肪酸相同便成同型二酯，若与两个羟基结合的脂肪酸不同便成异型二酯。
植物中常见脂肪酸有C4:0、C6:0、C8:0、C10:0、C12:0、C14:0、C16:0、C18:0、C14:1、C16:1、C18:1等11种。则玉米黄质可形成的单酯就有11种，可形成的同型二酯也有11种，可形成的异型二酯理论上有55种，例如zeaxanthin(C16:0/C14:0)，其中16和14分别代表羟基端连接的脂肪酸碳原子个数，0代表脂肪酸中的双键个数，这里将zeaxanthin(C16:0/C14:0)和zeaxanthin(C14:0/C16:0)视为同一化合物，其它同理。
S2，利用一种已知玉米黄质酯类化合物的精确分子量，推导出其它所有玉米黄质酯类化合物的分子量。
例如，已知zeaxanthin(C16:0/C16:0)的精确分子量为1044.887，zeaxanthin(C16:0/C14:0)相比zeaxanthin(C16:0/C16:0)少了两个亚甲基，则其分子量为1044.887-2×12-4×1.0078＝1016.8558；zeaxanthin(C16:1/C16:0)相比zeaxanthin(C16:0/C16:0)多了一个双键，即少了两个氢原子，则其分子量为1044.887-2×1.0078＝1042.8714。
S3，归纳玉米黄质类酯类物质的质谱裂解规律，推导化合物MRM模式下对应的所有理论Q1/Q3离子对。
大量实验发现：玉米黄质酯类物质的主要裂解碎片为与其酯化的脂肪酸和甲苯，例如zeaxanthin(C16:0/C16:0)，其主要碎片离子为[M+H-C16:0]+、[M+H-C16:0-C16:0]+和[M+H-92]+，利用这个规律，计算得到所有理论二级碎片信息，与相应的母离子组合(选择化合物的加氢峰做母离子)，得到所有理论Q1/Q3离子对。
S4，根据玉米黄质类酯类物质在反相色谱上表现出的规律，推测植物样本中玉米黄质类酯类物质的保留时间。
选取经前处理提取的植物样本(样本种类要尽可能多)供试品溶液，在优化好的液质条件下，MRM模式上机测试。同类型类胡萝卜素酯类物质的保留时间随着总碳原子数目增加后移，推测第一保留时间；另外，同类型类胡萝卜素酯类物质的保留时间随着总双键数目增加前移，推测第二保留时间，两者相互比较验证。
例如，zeaxanthin(C14:0/C16:0)和zeaxanthin(C16:0/C16:0)离子对的出峰情况分别如图1和图2所示，由图可以看到zeaxanthin(C14:0/C16:0)和zeaxanthin(C16:0/C16:0)的离子对信息如下表3所示：
表3zeaxanthin(C14:0/C16:0)和zeaxanthin(C16:0/C16:0)的离子对信息
| 化合物 | Q1 | Q3 | RT(min) |
| zeaxanthin(C14:0/C16:0) | 1018.1 | 533.6 | 7.64 |
| zeaxanthin(C14:0/C16:0) | 1018.1 | 761.8 | 7.64 |
| zeaxanthin(C16:0/C16:0) | 1046.1 | 789.9 | 7.75 |
| zeaxanthin(C16:0/C16:0) | 1046.1 | 533.5 | 7.75 |
S5，通过可获得的玉米黄质类酯类物质标准品zeaxanthin(C16:0/C16:0)，上机测试相应的保留时间，并与推测的玉米黄质类酯类物质的保留时间进行比较及校正，谱图见图3，最终得到有效的离子对信息1018.1/533.6、1018.1/761.8、1046.1/789.9、1046.1/533.6，作为玉米黄质类酯类物质定性离子对信息。
S6，当检测到有两个或三个相关离子对出峰时，默认检测到了该类类胡萝卜素酯类物质，通过这种推算方法，可以快速确定植物样本中检测到了玉米黄质类酯类物质。
实施例2
本实施例提供一种β-隐黄质酯类物质的液质联用分析方法，采用上表1和表2的参数条件进行测试，包括如下步骤：
S1，根据β-隐黄质(β-cryptoxanthin)和脂肪酸的结合形式，推导出植物样本中可能存在的类胡萝卜素酯化合物。
S2，利用一种已知β-隐黄质酯类物质的精确分子量，推导出其它所有β-隐黄质酯类物质的分子量。
S3，归纳β-隐黄质酯类物质的质谱裂解规律，推导化合物MRM模式下对应的所有理论Q1/Q3离子对。
S4，根据β-隐黄质酯类物质在反相色谱上表现出的规律，推测植物样本中β-隐黄质酯类物质的保留时间。
例如，β-cryptoxanthin(C12:0)、β-cryptoxanthin(C14:0)和β-cryptoxanthin(C16:0)离子对的出峰情况分别如图3至图6所示，离子对信息如下表4所示：
表4β-隐黄质酯类物质的离子对信息
| 化合物 | Q1 | Q3 | RT(min) |
| β-cryptoxanthin(C12:0) | 735.8 | 535.5 | 6.85 |
| β-cryptoxanthin(C12:0) | 735.8 | 443.4 | 6.85 |
| β-cryptoxanthin(C14:0) | 763.9 | 535.5 | 7.1 |
| β-cryptoxanthin(C14:0) | 763.9 | 443.4 | 7.1 |
| β-cryptoxanthin(C16:0) | 791.9 | 535.5 | 7.29 |
| β-cryptoxanthin(C16:0) | 791.9 | 443.4 | 7.29 |
S5，确定作为β-隐黄质酯类物质定性离子对信息，包括：735.8/535.5、735.8/443.4、763.9/535.5、763.9/443.4、791.9/535.5、791.9/443.4。
S6，当检测到有两个或三个相关离子对出峰时，默认检测到了该类类胡萝卜素酯类物质，通过这种推算方法，确定植物样本中检测到了β-隐黄质酯类物质。
实施例3
本实施例提供一种枸杞中类胡萝卜素酯化合物的液质联用分析方法，包括如下步骤：
S1，制备待测植物样品溶液。
冻干枸杞，研磨成粉末。按照重量体积比1：10的比例向粉末中加入提取溶剂，涡旋提取20min，离心，取上清；再往沉淀中再次加入提取溶剂，重复提取第二次，合并上清液。其中，提取溶剂为含0.01％BHT以及体积比为1:1:2的正己烷、丙酮、乙醇的混合溶剂。真空条件下浓缩获得的上清液，得浓缩液。将浓缩液采用复溶剂溶解，复溶剂为含为0.01％BHT以及体积比为3:1的甲醇、甲基叔丁基醚的混合溶剂，过滤，即得枸杞供试品溶液。
S2，按照上表1所示的色谱条件和表2所示的质谱条件，将枸杞供试品溶液上机测试，得到枸杞样本中类胡萝卜素和类胡萝卜素酯化合物检测多峰图7。
由图7可以看出，该枸杞样本中可检出玉米黄质二棕榈酸质、玉米黄质、β-胡萝卜素、β-隐黄质等，其保留时间分别为7.75min、4.63min、6.2min和5.48min等。
实施例4
本实施例提供一种柑橘中类胡萝卜素酯化合物的液质联用分析方法，包括如下步骤：
S1，制备待测植物样品溶液。
冻干柑橘，研磨成粉末。按照重量体积比1：10的比例向粉末中加入提取溶剂，涡旋提取20min，离心，取上清；再往沉淀中再次加入提取溶剂，重复提取第二次，合并上清液。其中，提取溶剂为含0.01％BHT以及体积比为1:1:2的正己烷、丙酮、乙醇的混合溶剂。真空条件下浓缩获得的上清液，得浓缩液。将浓缩液采用复溶剂溶解，复溶剂为含为0.01％BHT以及体积比为3:1的甲醇、甲基叔丁基醚的混合溶剂，过滤，即得柑橘供试品溶液
S2，按照上表1所示的色谱条件和表2所示的质谱条件，将柑橘供试品溶液上机测试，得到柑橘样本中类胡萝卜素和类胡萝卜素酯检测多峰谱图8和图9。
由图8和图9可以看出，柑橘样本中可检出β-隐黄质酯类物质、β-胡萝卜素、紫黄质、八氢番茄红素、β-隐黄质等物质。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
确定采用LC-MS/MS检测分析的参数条件，色谱条件：采用反向色谱柱，柱温25℃～30℃，流动相A为含0.08％～0.12％甲酸、0.008％～0.012％BHT、甲醇20％～30％的乙腈溶液，流动相B为含0.008％～0.012％BHT的甲基叔丁基醚，采用梯度洗脱方式；质谱条件：采用正离子模式和MRM扫描模式；
制备待测植物样品溶液，按照所述色谱条件和所述质谱条件上机测试；
根据类胡萝卜素酯类化合物的定性Q1/Q3离子对确定待测植物中是否含有类胡萝卜素酯类化合物。
2.根据权利要求1所述的植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法，其特征在于，所述反向色谱柱为YMC C30柱，所述柱温为28℃，所述流动相A为含0.08％～0.12％甲酸、0.008％％0.012％BHT、甲醇23％～27％的乙腈溶液。
3.根据权利要求2所述的植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序为：
0min，流动相A与流动相B的体积比为100:0；
3min，流动相A与流动相B的体积比为100:0；
5min，流动相A与流动相B的体积比为30:70；
8min，流动相A与流动相B的体积比为5:95；
9min，流动相A与流动相B的体积比5:95；
9.01min，流动相A与流动相B的体积比100:0；
10min，流动相A与流动相B的体积比为100:0。
4.根据权利要求1所述的植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法，其特征在于，所述质谱条件为：APCI+离子源，离子源温度为345～355℃，气帘气压力为25psi，辅助加热气Gas1压力为55psi，辅助加热气Gas2压力为60psi，碰撞气压力为12psi，MRM监测窗口为120s。
5.根据权利要求1至4任一项所述的植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法，其特征在于，还包括采用类胡萝卜素及其酯类化合物标准品建立标准曲线法测定所述待测植物中类胡萝卜素酯类化合物含量的步骤。
6.根据权利要求1至4任一项所述的植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法，其特征在于，所述定性Q1/Q3离子对的建立方法包括如下步骤：
根据已知分子结构的胡萝卜素酯类化合物的碳骨架结构以及其端羟基与脂肪酸的结合形式，推导理论上可形成的类胡萝卜素酯化合物的分子结构及其分子量；
按照权利要求1至4任一项所述的参数条件，对已知胡萝卜素酯类化合物进行LC-MS/MS分析，确定主要裂解碎片信息，计算所述理论上可形成的类胡萝卜素酯化合物的所有理论二级碎片信息，并与母离子组合，推导该检测参数条件下的所有理论Q1/Q3离子对；
根据同类型类胡萝卜素酯类化合物的保留时间随着总碳原子数目增加向后移动以及随着总双键数目增加向前移动，推测待测类胡萝卜素酯类化合物的保留时间，并通过类胡萝卜素酯类化合物标准品分析校正，确定所述定性Q1/Q3离子对。
7.根据权利要求1至4任一项所述的植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法，其特征在于，所述制备待测植物样品溶液包括如下步骤：
将植物样品研磨成粉末，按照重量体积比1：(10～20)加入提取溶剂，所述提取溶剂为含0.008％～0.012％BHT以及体积比(0.8～1.2):(0.8～1.2):(1.8～2.2)的正己烷、丙酮和乙醇的混合溶剂，涡旋提取，离心，收集上清液；
将收集的上清液进行浓缩，得浓缩液；
采用复溶剂溶解所述浓缩液，即得。
8.根据权利要求7所述的植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法，其特征在于，所述复溶剂为含0.008％～0.012％BHT以及体积比(2.8～3.2):1的甲醇和甲基叔丁基醚的混合溶剂。
9.根据权利要求7所述的植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法，其特征在于，所述涡旋提取的工艺条件为：室温下涡旋提取2～3次，每次15-25min。
10.根据权利要求1至4任一项所述的植物中类胡萝卜素酯类化合物的液质联用分析方法，其特征在于，所述植物为枸杞、柑橘。
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