KR20010022626A - 동시류 해충 박멸 방법 및 박멸 물질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비포유류 해충을 박멸하는 방법 및 박멸하는 물질에 관한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 동시목(Order Homoptera) 해충을 박멸하는데 유용한 방법 및 물질에 관한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 동시류 해충을 박멸시키는데에 유용한 신규의 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis;B.t.) 분리주. 또는 균주, 독소 및 독소-코드화 유전자를 제공한다. 균주 HD969, PS66D3 및 PS50C가 동시류 해충을 박멸시키는 것으로서 본원에 특히 구체화되어 있다. 바람직한 구체예에서, 표적 해충은 리프 하퍼(leaf hopper) 및 플랜트 하퍼(plant hopper)로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
Description
토양 미생물 바실루스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis :B.t.)(비. 티.)는 그램-양성(Gram-positive), 포자 형성 박테리아(spore-forming bacterium)로서 일반적으로 파라스포랄 결정성 단백질 함유물(parasporal crystalline protein inclusion)을 생산하는 것으로 특징지워 진다. 상기 함유물은 종종 현미경적으로 독특한 형태의 결정처럼 보인다. 상기 단백질은 해충에 대한 독성이 강한데, 이러한 독성은특이적이다. 특정의 비.티. 독소 유전자는 이미 분리 및 시퀀싱되었으며, 재조합 DNA를 기초로한 비.티. 제품이 생산 및 사용 인가되었다. 뿐만 아니라, 유전 공학 기술이 발달함에 따라 곤충에 대한 내성을 부여하기 위하여 내독소 유전자를 유전 공학적으로 조작시킨 식물을 이용하는 것과 비.티. 독소 전달 비히클로서 안정화된 완전한 미생물 세포를 이용하는 것을 포함하는, 비.티. 독소를 농업 환경에 전달하는 새로운 접근 방법을 개발중에 있다[Gaertner, F.H.,L.Kim(1988) TIBTECH 6:S4-S7 ; Beegle, C.C., T. Yamamoto,"History of Bacillus thuriensis Berliner research and development", Can. Ent. 124:587-616]. 따라서, 분리된 비.티. 독소 유전자의 상업적 가치는 증가하고 있다.
최근까지, 비.티. 살충제의 상업적 이용은 협소한 범위내의 인시류(모충) 해충으로 크게 제한되어 왔다. 수년 동안 인시류 해충의 상업적 해충제로서 비.츄린겐시스 쿠르스타키 아종(B. thuringiensis subsp. kurstaki)의 포자 및 결정체를 제조하여 사용하였다. 예를 들어, 비.츄린겐시스 쿠르스타키 변종 HD-1(B. thuringiensis var. kurstaki HD-1)은 다수의 인시류 해충 애벌레에 독성이 있는 결정성 δ-내독소를 생산한다.
현재 연구자들은 이전보다 더욱 광범위한 해충에 특이성이 있는 비.티. 살충제를 발견하였는데, 이들은 예를 들어, 비.티.의 다른 종들 즉, 이스라엘렌시스(israelensis) 및 모리소니(morrisoni)[테네브리오니스(tenebrionis), 비.티.M-7(B.t. M-7), 비.티. 샌 디에고(B.t. san diego)라고도 알려져 있음]는 쌍시류(Diptera) 목 및 초시류(Coleoptera) 목 곤충들을 박멸하는데에 상업적으로 사용되고 있다[Gaertner, F.H.(1989)"Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins:Living and Non-Living Microorganisms", in Controlled Delivery of Crop Protection Agents, R.M.Wilkins, ed.,Taylor and Francis, New York and London,1990, pp.245-255]. 또한 Couch, T.L.(1980)저, "Mosquito Pathogenicity of Bacillus thuringiensis var. israelensis", Developments in Industrial Microbiology 22:61-76 ; 및 Beegle, C.C.(1978)저 "Use of Entomogenenous Bacteria in Agroecosystems", Developments in Industrial Microbiology 20:97-104를 참조. Krieg, A., A.M. Huger, G.A.Langenbrush,W.Schnetter 저(1983) Z.ang.Ent. 95:500-508 에는 초시목에 속하는 2종류의 딱정 벌레에 대하여 활성이 있다고 하는 바실루스 츄린겐시스 테네브리오니스 변종(Bacillus thuringiensis var tenebrionis)에 대하여 기술되어 있다.
이들은 콜로라도 감자 딱정벌레, 렙티노타르사 디셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata) 및 아젤라스티카 알니(Agelastica alni)이다.
더욱 최근에, 비.티.의 신규한 아종들이 동정되었는데, 이들로부터 활성 δ-내독소 단백질의 기능을 담당하는 유전자가 분리되었다[Hofte, H.,H.R.Whitely(1989) Microbiological Reviews 52(2):242-255]. Hofte와 Whitely는 비.티. 결정성 단백질 유전자를 4개의 주된 군으로 구분하였다. 즉, CryI(인시류-특이적), CryⅡ(인시류-특이적 및 쌍시류-특이적), CryⅢ(초시류-특이적), 및 CryⅣ(쌍시류-특이적)이었다.
다른 해충들에 대해서 특이적으로 독성을 나타내는 균주들의 발견에 관하여도 보고되었다[Feitelson, J.S., J.Payne, L.Kim(1992) Bio/Technology 10:271-275]. CryⅤ는 선충류에 대해 활성이 있는 독소군으로 제안되었다. 램버트외 다수[Lambert, B.,L. Buysse, C.Decock, S.Jansens, C.Piens, B.Saey, J.Seurinck, K. van Audenhove, J.Van Rie, A.Van Vliet, M.Peferoen(1996) Appl. Environ. Microbiol 62(1):80-86]는 인시류에 독성을 갖는 Cry9 독소의 특성에 대하여 기술하고 있다. 국제공개 WO 94/05771 및 WO 94/24264에서도 인시류 곤충에 대한 활성을 갖는 비.티. 분리주에 관하여 기술되어 있다. 미국 특허 제 5,273,746호에는 PS 192M4를 포함하여 이(lice)에 대한 활성을 갖는 몇몇 비.티. 분리주에 관하여 기술되어 있다.
Gleave외 다수[(1991) JGM 138:55-62], Shevelev 외 다수[(1993) FEBS Lett. 336:79-82] 및 Smulevitch외 다수[(1991)FEBS Lett. 293:25-26]도 또한 비.티.독소에 관하여 기술하고 있다. 다수의 기타 비.티. 유전자 군이 현재 동정되어 있다.
에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli)내에서 비.티. 결정성 단백질 유전자를 클로닝 및 발현시키는 것에 대하여는 발간된 논문에 기술되어 있다[Schnepf, H.E., H.R. Whitely(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2893-2897]. 미국 특허 제 4,448,885호 및 미국 특허 제 4,467,036호 모두에는 이.콜라이(E.Coli)내에서 비.티. 결정성 단백질을 발현시키는 것에 대하여 기술되어 있다. 미국 특허 제4,990,332호; 제 5,039,523호; 제 5,126,133호; 제 5,126,133호; 제 5,164,180호; 및 제 5,169,629호에는 인시류에 대한 활성을 갖는 비.티. 독소에 대하여 기술되어 있다.
미국 특허 제 5,262,159호 및 제 5,468,636호에는 진디물 박멸에 사용되는 비.티. 분리주인 PS157C1, PS86A1 및 PS75J1에 관하여 기술되어 있다. 미국 특허 제 5,277,905호 및 제 5,457,179호에는 초시류 해충 박멸에 사용되는 비.티. 분리주 PS50C에 관하여 기술되어 있다. 미국 특허 제 5,366,892호에는 비.티. 독소인 50C(a)의 서열에 관하여 기술되어 있다. 미국 특허 제 5,286,485호 에는 인시류 해충 박멸에 사용되는 PS50C에 관하여 기술되어 있다. 미국 특허 제 5,185,148호 에는 풍뎅이 해충 박멸에 사용되는 PS50C에 관하여 기술되어 있다. 미국 특허 제 5,554,534호에는 비.티. 독소인 50C(b)의 서열에 관하여 기술되어 있다. 미국 특허 제 5,262,158호 및 제 5,424,410호에는 진드기 해충 박멸에 사용되는 PS50C에 관하여 기술되어 있다.
활발한 연구와 막대한 자본 투자의 결과로, 신규의 비.티. 분리주 및 이의 용도에 관한 기타의 특허가 공개되어 있다. Feitelson외 다수 저(상동) 문헌을 참조하시오. 그러나, 신규의 비.티. 분리주 및 이들의 신규 용도의 발견은 당 업계의 경험칙상 예측 불가능한 상태에 있다.
동시류 목에 속하는 곤충들에는 리프 하퍼(leafhopper) 및 플랜트 하퍼(planthopper)와 같은 천공성 곤충(piercing insect) 및 흡착성 곤충(sucking insect)을 포함한다. 상기 리프 하퍼(leafhopper) 및 플랜트 하퍼(planthopper)는 진화학상 근연 관계에 있다. 상기 리프 하퍼(leafhopper) 및 플랜트 하퍼(planthopper)는 전세계적으로 발견되고 있으며 곡물 및 풍치 식물(ornamental plant)을 갉아먹거나 질병을 일으키는 매개체로서 경제적으로 매우 심각한 손실을 일으키고 있다. 플랜트 하퍼로서 구체적인 예에는 현미 플랜트 하퍼(닐라파르바타 루젠스;Nilaparvata lugens)가 있다. 플랜트 하퍼 및 리프 하퍼의 천공 습성 및 흡착 습성으로 인하여, 바실루스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis) 단백질을 천연 상태인 결정으로 잎에 사용하여 이들 해충에 영향을 끼치게 하는 것은 용이하지 않다.
[발명의 요약]
본 발명은 비포유류(non-mammalian) 해충의 박멸 방법 및 박멸 물질에 관한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 동시류(homopteran) 목 곤충 박멸에 유용한 방법 및 물질에 관한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 동시류 박멸에 유용한 신규의 바실루스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis :B.t.) 분리주(isolates), 균주(strain), 독소 및 독소 코드화 유전자를 제공한다. 상기 비. 티 균종(B.t. strain) HD969, PS66D3 및 PS50C는 동시류에 독성을 갖는 것으로서 본원에 특히 구체화되어 있다. 바람직한 구체예에서, 목표 해충은 리프 하퍼 및 플랜트 하퍼로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 유용한 뉴클레오티드 서열은 살충 독소를 코드화한다. 본 발명의 하나의 구체예는 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열로 형질 전환되어 목표 해충이 섭취하였을 경우 조직내에서 살충 독소를 발현시키는 식물 세포에 관한다. 이와 같은 식물의 형질 전환은 당 업계의 숙련자들에게 널리 알려진 기술을 사용하여 수행될 수 있으며, 통상적으로는 유전자를 변형시켜 식물내에서 독소 발현을 최적화시키는 것을 포함할 것이다. 이와는 달리, 본 발명의 비. 티 분리주 또는 본원 발명의 독소를 발현시키는 재조합 미생물이 해충 박멸에 사용될 수 있다.
이러한 관점에서, 본 발명은 발현된 본 발명의 독소를 함유하는 실질적으로원형 그대로의(intact) 비.티. 세포 및/또는 재조합 세포의 처리 방법을 포함하는데, 이들은 원형 그대로인 세포가 목표 해충의 환경에 투입될 때 실질적으로 살충 활성이 연장되도록 처리되어 있다. 상기 처리된 세포는 살충 독소에 대한 보호막으로서의 역할을 한다. 상기 독소는 목표 해충에 의하여 섭취되었을때 활성을 나타낸다.
결정성 비.티. 단백질 독소는 농업용 해충 박멸 방법에 사용될 수 있는데, 이의 적용 방법 및 조성은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명은 용해성의 단백질 독소를 추가로 제공한다.
본 발명의 독소는 비특이적이며 활성의 범위가 넓다는 점에서 비.티. 외독소와 뚜렷이 구별된다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명에 유용한 독소는 다수의 독소들의 일부분들을 결합시켜 제조된 키메라 독소(chimeric toxin)이다. 또한 본 발명의 독소들은 살충 효과를 강화시키기 위하여 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 리프 하퍼 및 플랜트 하퍼를 포함하는 동시류에 대하여 독성을 나타내는 비.티. 분리주 및 독소를 제공한다. 본 발명에 유용한 특이 분리주를 각각 PS50C, PS66D3 및 HD969라 한다. 상기 균주의 특징을 표 1에 나타내었다.
| 균주 | 함유물 형태 | H-혈청형 | SDS-PAGE 단백질 거동 |
| PS50C | 구형 | 18, 쿠마모토엔시스 | 133, 128 |
| PS66D3 | 평면(직사각형) | 8 | 75, 66,(58) |
| HD969 | 부정형(레몬형) | 6 | 130(s) |
PS66D3는 신규의 분리주이다. 상기 미생물은 USA, Illinois 61604, Poeria, 1815 North University Street 소재, Northern Regional Research Center의 Agricultural Research Service Patent Cultural Collection(NRRL)에 영구 보존용으로 기탁되어 있다. 기탁된 균주 배양균의 수탁 번호는 다음과 같다.
배양균: 바실루스 츄린겐시스 PS66D3(Bacillus thuringiensis PS66D3)
수탁 번호: NRRL B-21657
기탁일: 1997년 2월 19일
본 발명의 배양균은 본원의 계류중에 37 CFR 1.14 및 35 U.S.C. 122에 의거 미합중국 특허상표청장이 분양 받을 권리를 부여한 자에 대한 상기 배양균의 분양을 보장할 것을 조건으로 기탁되었다. 상기 기탁물은 본원의 대응출원 또는 그의 자출원이 출원된 나라에서 외국 특허법에 의해 요구될 때 입수될 수 있다. 그러나, 이러한 기탁물의 입수 가능성이 정부의 행위에 의해 수여된 특허권을 훼손하는 본원 발명의 실시허락을 구성하는 것은 아니라는 사실을 이해하여야만 한다.
더욱이, 본 발명의 배양균 기탁물은 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라 보관되고 공중에게 분양될 수 있는 상태에 놓일 것이다. 즉, 이들 상기 균주들은 미생물 시료의 분양에 대한 최근의 요청후 최소한 5년간, 어떠한 경우라도, 기탁일로부터 최소한 30년간 또는 그 미생물을 개시한 특허의 존속 기간 동안 생존하고 오염되지 않도록 유지하는데 필요한 모든 주의를 기울여 보관될 것이다. 기탁자는 기탁물의 상태때문에 기탁 기관이 분양 요청시 분양할 수 없는 경우에 기탁물(들)을 대체할 의무를 지닌다는 것을 인식한다. 본원의 배양균에 대한 공중의 입수에 대한 모든 제한은 그들을 개시한 특허의 허여시에 결정적으로 철회될 것이다.
하기 분리주 및 이들로부터 수득한 유전자를 함유하는 클론들은 미국 특허공보에 의해 일반이 이용할 수 있다. 이러한 분리주 및 이에 상응하는 미국 특허는 다음과 같다.
배양균 기탁 번호 기탁일 특허 번호
비. 츄린겐시스 PS50C NRRL B-18746 1991년 1월9일 5,457,179
(B. thuringiensis PS50C) 5,277,905
5,286,485
5,285,148
이.콜라이 NM522 NRRL B-18751 1991년 1월11일 5,366,892
(E.Coli NM522) 5,262,158
(pMYC1638)(MR605) 5,424,410
[50C(a)]
E.Coli NM522(pMYC1650) NRRL B-21023 1992년 12월4일 5,554,534
[50C(b)]
상기에 나타낸 바와 같은 분리주, 이들의 독소 및 유전자에 관한 사항은 본원에 참고 문헌으로서 첨부되어 있다.
분리주 HD969는 Illinois, Poeria 소재 USDA-ARS NRRL Culture Collection로부터 분양받을 수 있다. HD969는 Cry1Ac, Cry1B 및 Cry1C를 포함하는 다수의 Cry1 유전자를 갖는다. 17.8.91군 유전자에 대한 PCB 번호 또한 지정되어 있다. PS66D3은 72kDa 및 64kDa의 단백질 조를 이룬다(통상적인 3A, 3B 패턴).
72시간 이후, 균주 HD969, PS66D3 및 PS50C는 음성 대조구의 경우보다 엔. 루겐스(N.lugens) 애벌레 사멸 정도가 훨씬 컸다.
유전자 및 독소
본 발명의 추가적인 양상은 본 발명에 의하여 사용하기 위한 분리주로부터 수득할 수 있는 신규한 독소 및 유전자에 관한다.
본 발명의 독소 및 폴리뉴클레오타이드 서열은 몇가지 요소들에 의해서 정의된다. 본원에 기술된 독소의 중요한 특징은 살충 활성이다. 특정 구체예에서, 이들 독소는 동시류 해충에 대하여 활성을 갖는다. 본 발명의 독소 및 유전자는 이들의 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열에 의하여 더욱 상세히 정의될 수 있다. 상기 분자의 서열은 특정의 구체화된 서열의 유사성 또는 동일성 및 특정의 구체화된 프로브 및 프라이머로 혼성화되거나 또는 이들에 의하여 증폭되는 능력의 관점에서 정의될 수 있다. 본원에 제공된 독소들은 또한 특정의 항체들과 이들 사이의 면역 반응성을 기초로 하여 정의될 수 있다. 본원의 교시에 비추어, 당 업계의 숙련자는 본원에 기술된 다양한 독소 및 폴리뉴클레오타이드 서열을 용이하게 생산 및 사용할 수 있다.
본 발명에 유용한 유전자 및 독소는 전체 길이의(full-length) 서열 뿐만 아니라 이들 서열의 단편, 변이체, 돌연 변이체 및 본원에 특히 구체화된 신규 독소의 살충 활성을 보유하는 융합 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 유전자의 "변이체(variant)" 또는 "변이(variation)" 란 용어는 동일한 독소를 코드화하거나 또는 살충 활성이 균등한 독소를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본원에 사용된 "균등한 독소(equivalent toxin)" 란 용어는 표적 해충에 대한 생물학적 활성이 본원에 구체화된 독소와 균등한, 즉 근본적으로 균등한 독소를 의미한다.
활성 독소를 코드화하는 유전자를 몇가지 방법에 의하여 동정하여 수득할 수 있다는 사실은 당 업계의 숙련자들에게 명백할 것이다. 본원에 구체화된 특정 유전자들은 상기 배양균 기탁소에 기탁된 분리주로부터 수득할 수 있다. 상기 유전자, 이들의 일부 또는 변이체는 예를 들어, 유전자 합성기를 사용하여 합성되어 제조될 수도 있다. 유전자의 변이는 점 돌연변이(point mutation)를 일으키는 표준적 기술을 사용하여 용이하게 이루어질 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 유전자의 단편은 상업적으로 유용한 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 사용하여 표준적인 방법에 따라서 제조될 수 있다. 예를 들어서, Bal31과 같은 효소에 의하거나 또는 부위-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis) 유발 방법을 사용하여 상기 유전자의 말단으로부터 뉴클레오타이드를 차례대로 절단할 수 있다. 또한 활성 단편을 코드화하는 유전자도 다양한 종류의 제한 효소를 사용하여 수득될 수 있다. 프로테아제를 사용하여 상기 독소들의 활성 단편을 직접적으로 수득할 수 있다.
균등한 독소 및/또는 이들 균등한 독소를 코드화하는 유전자들은 본원의 교시에 따라서 비.티. 분리주 및/또는 DNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 본 발명의 살충 독소를 수득하는 방법은 많은데, 예를 들어서 본원에 기술 및 청구된 살충 독소에 대한 항체가 단백질 혼합물로부터 다른 독소를 동정 및 분리하는데에 사용될 수 있다. 구체적으로 다른 비.티. 독소와 매우 상이하며 항상적인 독소의 일부에 대한 항체 생성을 증가시킬 수 있다. 이후 상기 항체들은 면역 침강법(immunoprecipitation), 효소 결합 면역흡착 검정법(enzyme linked immunosorbent assay;ELISA) 또는 웨스턴 블럿팅(western blotting)에 의하여 특징적 활성을 갖는 균등한 독소를 동정하는데에 사용될 수 있다. 본원에 기술된 독소, 균등한 독소 또는 이들 독소의 단편에 대한 항체는 당 업계의 표준적인 방법을 사용하여 용이하게 제조될 수 있다. 이후 상기 독소들을 코드화하는 유전자들은 미생물들로부터 수득될 수 있다.
구체화된 독소의 살충 활성을 보유하는 단편 및 균등체는 본 발명의 범주내에 존재한다. 뿐만아니라, 유전적 암호가 중복성을 갖기 때문에, 다수의 상이한 DNA 서열은 본원에 기술된 아미노산 서열을 코드화할 수 있다. 이와 같은 동일한, 즉 근본적으로 동일한 독소를 코드화하는 대체적 DNA 서열(alternative DNA sequence)을 제조하는 것은 당 업계의 숙련자들에게 널리 알려진 사항이다. 이와 같은 변이 DNA 서열은 본 발명의 범주내에 존재한다. 본원에 사용된 "근본적으로 동일한(essentially the same)"서열이란, 살충 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 아미노산 치환, 결실, 첨가 또는 삽입이 발생한 서열을 의미한다. 살충 활성을 보유하는 단편들에 관하여도 본원의 범위내에 포함된다.
본 발명의 특정의 독소에 관하여는 본원에 특히 구체화되어 있다. 상기 독소는 본 발명의 예시에 불과하므로, 본 발명은 또한 구체화된 신규 독소와 동일하거나 또는 유사한 살충 활성을 갖는 독소 및 신규 유전자의 균등체 또는 변이체에 관한다는 것이 용이하게 파악될 것이다. 균등의 독소는 신규의 구체화된 독소와 아미노산 상동성을 가질 것이다. 이와 같은 균등의 유전자 및 독소는 통상적으로 본원에 구체화된 서열과 60%; 바람직하게는 75% 이상; 더욱 바람직하게는 80%이상, 가장 바람직하게는 90%이상 및 95%이상의 동일성을 가질것이다. 아미노산 상동성은 생물학적 활성을 나타내거나 또는 생물학적 활성에 궁극적으로 영향을 미치는 3차원 형태를 결정짓는데 관여하는 독소의 중요 부위에서 가장 높을 것이다. 이러한 관점에서, 특정의 아미노산 치환이 허용 가능하며 또한 상기 치환이 활성에 영향을 미치지 않는 부위에 발생하였는지 또는 상기 분자의 3차원 형태에 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환인지 여부가 추정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산은 다음과 같은 군으로 분류될 수 있다: 비극성(nonpolar), 비하전 극성(uncharged polar), 염기성(basic) 및 산성(acidic). 보존적 치환(conservative substitution)에서는 화합물의 생물학적 활성이 실질적으로 변경되지 않는한 본 발명의 범주내에서 하나의 군의 아미노산이 동일한 형태의 다른 아미노산으로 치환된다. 하기 표 2는 각각의 군에 속하는 아미노산의 예에 대한 목록을 제공한다.
| 아미노산 군 | 아미노산 예 |
| 비극성(nonpolar) | Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp |
| 비하전 극성(uncharged polar) | Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln |
| 산성(acidic) | Asp, Glu |
| 염기성(basic) | Lys, Arg, His |
몇가지 예에서, 비보존적(non-conservative) 치환도 발생될 수 있다. 중요한 점은 이와 같은 치환이 독소의 생물학적 활성을 감소시키지 않아야 한다는 점이다.
본 발명의 독소는 또한 상술한 바와 같은 독소 함유물(toxin inclusion)의 모양 및 위치에 따라서 특징지어 진다. 일반적으로 당 업계에서는 결정성 단백질이 사용되지만, 독소의 분비를 증가시키는 조건하에서 본 발명에 사용되는 분리주를 성장시킬 수도 있다. 따라서, 배양균의 상등액으로부터 본 발명에 의한 독소를 수득할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 결정성 단백질에 제한되는 것은 아니며; 가용성 단백질이 고려될 수도 있다.
본원에 사용된 "분리된(isolated)" 폴리뉴클레오타이드 및/또는 "정제된(purified)" 독소란, 상기 분자들이 자연에서 발견되는 다른 분자들과 결합되지 않은 상태를 의미한다. 그러므로 "분리되고 정제된(isolated and purified)" 상태란, 본원에 기술된 바와 같이 "인위적으로 조작된 것(hand of man)"을 의미한다. 키메라 독소 및 유전자 또한 "인위적으로 조작된 것(hand of man)"을 포함한다.
올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하면 본 발명의 독소 및 유전자를 동정하는 방법 및 추가의 신규한 유전자 및 독소가 제공된다. 프로브는 독소-코드화 유전자를 신속하게 검정하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 프로브로서 사용된 뉴클레오타이드 단편은 예를 들어서 DNA 합성기 및 표준적인 방법을 사용하여 합성될 수 있다.
키메라 독소
하나 이상의 비.티. 독소 또는 유전자의 일부를 조합하여 제조된 키메라 유전자 및 독소는 본 발명의 교시에 따라서 이용될 수도 있다.
비.티. 결정성 단백질의 일부를 조합하여 유용한 독소를 제조하기 위한 방법들이 개발되어 오고 있다. 상기 일부의 조합에 의하여 살충 활성을 갖는 키메라 단백질이 제조되는한, 조합된 부분들 자체가 살충 활성을 가질 필요는 없다. 상기 조합은 예를 들어 EP 0 228 838; Ge, A.Z.,N.L.Shivarova, D.H.Dean(1989) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:4037-4041; Ge,A.Z.,D.RIVERS, R.Milne,D.H.Dean(1991) J.Biol. Chem. 266:17954-`7958; Schnepf, H.E.,K.Tomcz, J.P.Ortega, H.R.Whitely(1990) J.Biol. Chem. 265:20923-20930; Honess, G.,D. Convents, J.Van Rie, S. Jansens, M.Peferoen, B.Visser(1991) Mol. Micrbiol. 5:2799-2806에 기술된 바와 같은 제한 효소를 사용하여 수행될 수 있다.
이와는 달리, 세포성 재조합 메커니즘(cellular recombination mechanism)을 이용한 재조합 방법으로 유사한 결과를 도출해낼 수 있다. 예를 들어, Caramori, T.,A.M.Albertini,A.Galizzi(1991) Gene 98:37-44; Widner, W.R.,H.R.Whitely(1990) J.Bacteriol. 172:2826-2832; Bosch, D.,B.Schipper, H.van der Kliej, R.A. de Maagd, W.J.Stickema(1994) Biotechnology 12:915-918을 참조. 키메라 DNA를 제조할 수 있는 다수의 다른 방법들도 당 업계에 공지되어 있다. 본 발명은 본원의 유전자 및 독소를 이용하는 키메라 단백질을 포함한다.
재조합 숙주
본 발명의 독소-코드화 유전자는 광범위한 미생물 또는 식물 숙주에 도입될 수 있다. 독소 유전자를 발현시키면 직간접적으로 살충제를 생성 및 보유시킬 수 있다. 미생물 숙주로서는 예를 들어, 슈도모나스(Pseudomonas)와 같은 미생물 이 해충이 있는 지역에 사용될 수 있는데, 상기 지역에서 미생물이 증식 및 섭취될 것이다. 그 결과 해충이 박멸된다. 이와는 달리, 독소 활성을 연장시키고 세포를 안정화시키는 조건하에서 독소 유전자를 보유하는 미생물을 사멸 및 처리시킬 수 있다. 상기 처리된 세포, 즉 독소 활성을 보유하는 세포는 이후 표적 해충의 환경에 적용될 수 있다.
비.티. 독소 유전자가 적합한 벡터를 통하여 미생물 숙주에 도입된후 상기 숙주가 살아있는 상태로 환경에 적용될 경우, 특정의 숙주 미생물 사용이 필수적이다. 미생물 숙주는 하나 이상의 관심 있는 농작물의 "피토스피어(phytosphere)" [필로플레인(phylloplane), 필로스피어(phyllosphere), 리조스피어(rhizosphere) 및/또는 리조플레인(rhizoplane)]에 서식하는 것으로 알려진 숙주들 중에서 선택된다. 폴리펩타이드 살충제를 발현시키는 유전자를 유지 및 발현시키기 위하여, 바람직하게는 상기 살충제가 환경적으로 파괴 및 불활성화되는 것으로부터 보호하기 위하여 이와 같은 미생물들은 특정 환경(농작물 및 다른 곤충의 서식지)에서 야생형 미생물과의 생존 경쟁에서 성공적으로 승리할 수 있는 것으로 선택한다.
다수의 미생물들이 각종의 중요한 작물의 엽층(식물 잎의 표면) 및/또는 구근권(식물 뿌리 주위의 토양)에 서식하는 것으로 알려져 있다. 이들 미생물들은 세균, 조류 및 진균류를 포함한다. 특히 중요한 것은, 예컨데 속 슈도모나스 (Pseudomonas), 에르위니아 (Erwinia), 세라티아 (Serratia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 크산토모나스 (Xanthomonas), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 리조비움 (Rhizobium), 로도슈도모나스 (Rhodopseudomonas), 메틸로필리어스 (Methylophilius), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 아세토박터 (Acetobacter), 락토바실루스 (Lactobacillus), 아르스로박터 (Arthrobacter), 아조토박터 (Azotobacter), 류코노스톡 (Leuconostoc) 및 알칼리게네스 (Alcaligenes)들과 같은 일례의 세균; 속 메타리지움 (Metarihizium), 바바리아 (Bavaria), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 크립토코커스 (Cryptococcus), 클뤼베로마이세스 (Kluyveromyces), 스포로볼로마이세스 (Sporobolomyces), 로도토룰라 (Rhodotorula) 및 아우레오바시디움 (Aureobasidium)과 같은 일례의 진균류(fungi)를 포함한다. 특히 중요한 것은 슈도모나스 시린가에 (Pseudomonas syringae), 슈도모나스 플루오레스센스 (Pseudomonas fluorescens), 세라티아 마르세스센스 (Serratia marcescens), 아세토박터 크실리눔 (Acetobacter xylinum), 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens), 로도슈도모나스 스페로이데스 (Rhodopseudomonas spheroides), 크산토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris), 리조비움 멜리오티 (Rhizobium melioti) 알칼리게네스 엔트로퍼스 (Alcaligenes entrophus), 및 아조토박터 빈란디 (Azotobacter vinlandii)와 같은 세균 ; 및 로도토룰라 루브라 (Rhodotorula rubra), 알. 글루티니스 (R. glutinis), 알. 마리나 (R. marina), 알. 아우란티아카 (R. aurantiaca),
크립토코커스 알비두스 (Cryptococcus albidus), 시. 디플루엔스 (C. diffluens),
시. 라우렌티 (C. laurentii), 사카로마이세스 로세이 (Saccharomyces rosei), 에스. 프레토리엔시스 (S. pretoriensis), 에스. 세레비시아에 (S. cerevisiae), 스포로볼로마이세스 로세우스 (Sporobolomyces roseus), 에스. 오도루스 (S. odorus),
클뤼베로마이세스 베로나에 (Kluyveromyces veronae), 및 아우레오바시디움 폴루란스 (Aureobasidium pollulans)와 같은 효모 종들을 포함한다. 특히 중요한 것은 색소화된 미생물(pigmented microorganism)이다.
독소를 코드화하는 바실루스(Bacillus) 유전자들을 유전자의 안정한 유지 및 발현을 허용하는 조건하에서 미생물 숙주내로 도입시키는데는 여러 가지 방법을 이용할 수 있다. 이들 방법들은 당업자들에게 잘 알려져 있고, 예컨대 본원에 참고자료로 첨부된 미국특허 제5,135,867호에 기술되어 있다.
본 발명의 분리주, 독소 및 유전자를 사용하여 동시류(Homopteran)를 박멸하는 방법은 당 업계의 숙련자들에게 공지된 여러 가지 방법으로 수행될 수 있다. 이와 같은 방법에는 예를 들어, 비.티. 분리주를 해충(또는 해충이 서식하는 지역)에 적용시키는 방법, 재조합 미생물을 해충(또는 해충이 서식하는 지역)에 적용시키는 방법 및 식물을 본 발명의 살충 독소를 코드화하는 유전자로 형질전환시키는 방법을 포함한다. 재조합 미생물로서는, 예를 들어 비.티., 이. 콜라이 또는 슈도모나스일 수 있다. 형질 전환은 표준적인 기술을 사용하여 당 업계의 숙련자들에 의해 수행될 수 있다. 상기 형질 전환에 필요한 재료들에 관하여는 본원에 기술되어 있거나 그렇지 않으면 업계의 숙련자에 의하여 용이하게 입수할 수 있다.
숙주 세포를 형질 전환시키기 위하여 본 발명의 신규의 독소와 기능적으로 동등한 합성 유전자도 또한 사용될 수 있다. 상기 합성 유전자 제조 방법에 관하여는 예를 들어, 미국 특허 제 5,380,831호에 기술되어 있다.
세포 처리
상술한 바와 같이, 독소 활성을 연장시키고 세포를 안정화시키기 위하여 비.티. 또는 비.티. 독소를 발현시키는 재조합 세포가 처리될 수 있다. 제조된 살충제 마이크로캡슐은 안정화되어 상기 마이크로캡슐이 표적 해충 환경에 적용될 경우 독소를 보호할 수 있는 세포 구조체(cellular structure)내에 비.티. 독소를 포함한다. 적당한 숙주 세포로서는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함할 수 있는데, 보통은 포유류와 같은 고등 생물체에서 독성을 갖는 물질을 생성시키지 않는 세포들에 한정된다. 그러나, 상기 독성 물질이 불안정하거나 또는 그 독성이 포유류 숙주에서 발생될 수 있는 독소로 인한 영향을 피하기에 충분히 낮은 경우, 고등 생물체에 독성을 갖는 물질을 생성시키는 생물체가 사용될 수도 있다. 특히 관심 있는 숙주는 원핵 생물 및 곰팡이와 같은 하등 진핵 생물일 것이다.
처리시의 세포는 -어떤 경우에는 포자가 사용될 수도 있지만- 포자형이기 보다는 일반적으로 원형 그대로(intact)의 형태 및 실질적으로는 증식형일 것이다.
예를 들어, 비.티. 독소 유전자를 포함하는 미생물 세포의 처리 방법은 그 기술이 독소의 성질에 유해한 영향을 미치거나 또는 상기 독소를 보호하는 세포의 능력을 감소시키지 않는한, 화학적 또는 물리적 방법에 의하거나 또는 화학적 및/또는 물리적 방법을 조합하여 사용할 수 있다. 화학 시약의 예로서는 할로겐화제를 들 수 있으며, 구체적으로 원자 번호 17-80의 할로겐이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 온화한 조건 및 원하는 결과를 얻기에 충분한 시간 동안 요오드가 사용될 수 있다. 다른 적당한 기술로서는 글루타르알데히드와 같은 알데히드; 제피란 클로라이드 및 세틸로피리디늄 클로라이드와 같은 항감염제; 이소프로판올 및 에탄올과 같은 알코올; Lugol 요오드, Bouin 고정제, 다양한 산 및 Helly 고정제와 같은 다양한 조직학적 고정제[Humanson, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W.H.Freeman and Company, 1967 참조]; 또는 세포가 숙주 환경에 투입되었을때 세포내에서 생산되는 독소의 활성을 보존 또는 연장시키는 물리적(열) 및 화학적 제제를 조합하여 처리하는 방법을 포함한다. 물리적 방법의 예에는 예를 들어 감마선 및 X선 처리법, 동결법, UV 광선 처리법, 동결 건조법등이 있다. 미생물 세포의 처리 방법에 관하여는 미합중국 특허 제 4,695,455호 및 제 4,695,462호에 기술되어 있으며 본원에 참고 문헌으로서 첨부되어 있다.
일반적으로 세포는 환경 조건에 대한 저항성이 강화되도록 구조적 안정성을 강화시킬 것이다. 살충제가 원형(proform)으로 존재하는 경우, 세포 처리 방법은 표적 해충 병원균에 의하여 살충제가 원형에서 성숙한 형태로 변화하는 과정을 방해하지 않는 방법으로 선택되어야 한다. 예를 들어, 포름알데히드는 단백질을 가교 결합시킬 것이며 이로써 원형 폴리펩타이드 살충제의 변화 과정을 방해하게 될 것이다. 따라서 처리 방법은 적어도 독소의 생체 이용률 또는 독소의 생체 활성에 대한 실질적인 부분들을 보유해야 한다.
독소 생성을 위하여 숙주 세포를 선택하는데에 있어서 특히 관심 있는 특징에는 비.티. 유전자를 숙주 세포내에 도입 시키는 것이 용이하다는 점, 발현 시스템의 유용성, 발현 효율, 숙주내 살충제의 안정성 및 기타 부수적인 유전적 능력등을 포함한다. 살충제 마이크로 캡슐을 사용하는데에 있어서 관심 있는 특징에는 두꺼운 세포벽, 색소 침착, 및 세포내 패키징(intracelluar packaging) 또는 봉입체(inclusion body) 형성과 같은 살충제 보호 특성; 수성 환경에서의 생존성; 포유 류 독성의 흠결; 해충에 대한 섭취 선호성; 독소에 해를 끼치지 않고 용이하게 살충 및 고정시키는 능력등을 포함한다. 다른 특징으로는 제조 및 조작의 용이성, 경제성, 저장 안정성등을 포함한다.
세포의 성장
선택적 배지내의 실질적으로 모든 세포가 비.티. 유전자를 보유하면, 비.티. 살충 유전자를 포함하는 숙주 세포는 DNA 구조체(DNA construct)가 선택적인 이점을 제공하는 특정의 영양 배지내에서 성장할 수 있다. 이후 상기 세포들은종래의 방법에 따라서 회수될 수 있다. 이와는 달리, 상기 세포들을 처리후 회수할 수도 있다.
본 발명의 비.티. 세포는 표준적인 배지 및 발효 기술을 사용하여 배양될 수 있다. 발효 싸이클을 마치면 당 업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 발효액으로부터 비.티. 포자 및 결정체를 1차적으로 분리하여 회수할 수 있다. 특정의 비.티. 포자 및 결정체는 널리 공지된 기술을 사용하여 수득된후 종래의 σ-내독소 비.티. 제재로서 사용될 수 있다. 예를 들어서, 상기 포자 및 결정체는 계면 활성제, 분산제, 비활성 담체 및 특정의 표적 해충으로의 처리 및 적용을 촉진시키는 다른 성분을 부가하여 습윤성 분말, 농축액, 입자 및 기타의 제재로 조제될 수 있다. 이와 같은 조제 방법 및 적용 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 이와는 달리, 본 발명에 의한 독소를 수득하기 위하여 발효 공정으로부터 수득된 상등액이 사용될 수 있다. 이후 널리 공지된 기술을 사용하여 가용성, 분비성 독소를 분리 및 정제시킨다.
해충 박멸 방법 및 제재
본 발명에 따른 분리주, 독소 및 유전자를 사용하여 동시류를 박멸시키는 방법은 당 업계의 숙련자들에게 알려진 다양한 방법으로써 수행될 수 있다. 상기 방법은 예를 들어, 해충(또는 해충 서식지)에 비.티. 분리주를 처리하는 방법, 해충(또는 해충 서식지)에 재조합 미생물을 처리하는 방법 및 본 발명의 살충 독소를 코드화하는 유전자로 식물을 형질 전환시키는 방법을 포함한다. 재조합 미생물은 예를 들어, 비.티., 이.콜라이, 또는 슈도모나스일 수 있다. 형질 전환은 표준적인 기술을 사용하여 당 업계의 숙련자들에 의해서 수행될 수 있다. 이와 같은 형질 전환에 필요한 재료들에 관하여는 본원에 기술되어 있거나 그렇지 않으면 업계의 숙련자에 의하여 용이하게 입수할 수 있다.
비.티. 분리주 또는 재조합 미생물의 독소 및 유인물을 함유하는 조제 미끼 입자는 본원에 기술된 비.티. 분리주로부터 수득할 수 있는 유전자를 포함하며 토양에 사용될 수 있다. 조제 산물은 또한 윤작(crop cycle) 후반기에 종자-피복방식, 뿌리에 처리하는 방식 또는 식물 전체에 처리하는 방식등으로 적용될 수 있다. 식물 및 토양 처리시 비.티. 세포는 무기물(필로실리케이트, 카보네이트, 설페이트, 포스페이트등)과 같은 다양한 비활성 재료들과 혼합되거나 또는 식물성 재료들(옥수수대 분말, 쌀겨, 호두 껍질등)과 혼합되어 습윤성 분말, 입자 또는 분진으로 사용될 수 있다. 상기 제재에는 스프레더 스티커 에쥬번트(spreader sticker adjuvant), 안정화제, 기타 살충 부가제 또는 계면 활성제를 포함할 수 있다. 조제액은 수성-기초 또는 비수성일 수 있으며 거품, 겔, 현탁액, 유화 농축액등의 형태로 사용될 수 있다. 상기 성분들은 유동화제(rheological agent), 계면 활성제, 유화제, 분산제 또는 중합체를 포함할 수 있다.
당 업계의 숙련자에 의하여 이해될 수 있는 바와 같이, 살충제의 농도는 특정 제재의 성질, 구체적으로 농축되어 사용되는지 아니면 직접 사용되는지에 따라서 다양할 것이다. 살충제는 1-100중량%일 수 있다. 건조 제재의 함량은 살충제의 약 1-95중량%인 반면에, 액상 제재 함량은 일반적으로 액상내 고체의 약 1-60중량%이다. 일반적으로 제재은 약 102-104cell/mg 일것이다. 세포 함유 제재들은 1헥타르당 약 50㎎(액상 또는 건조) - 1㎏ 이상의 양으로 투여될 것이다.
상기 제재은 해충의 환경, 예를 들어 토양 및 잎에 분무(spraying), 살포(dust) 및 살수(sprinkling)등의 방법으로 적용시킬 수 있다.
돌연 변이
본 발명에 의하여 수득할 수 있는 신규 분리주를 당 업계에 널리 공지된 기술에 의하여 돌연 변이시킬 수 있다. 예를 들어, 에틸메탄 설포네이트(EMS) 돌연 변이법을 통하여 분리주를 무아포성(asporogenic) 돌연 변이시킬 수 있다. 당 업계에 널리 공지된 방법으로 자외선 및 니트로소구아니딘 처리하여 돌연 변이 시킬 수 있다.
발효 기간이 연장되면 더욱 소량의 무아포성 돌연 변이체가 원형 그대로인 용균되지 않은 상태로 잔류하게 될 것이다 : 이와 같은 균종을 용균 음성(-)으로 나타낸다. 용균 음성 균종은 발효 공정의 최종 단계에서 교반 플라스크 배지내의 무아포성 돌연 변이체를 스크리닝시킨후 여전히 원형 그대로의 상태이며 독소 결정체를 함유하는 돌연 변이체를 선별함으로써 동정될 수 있다. 용균 음성 균종은 보호 및 캡슐화된 독소 단백질이 수득될 수 있는 세포 처리 공정에 적합하다.
상기 무아포성 돌연 변이체의 파지 저항성 변이체를 제조하기 위하여, 소량의 파지 용균물을 영양 아가상에 도포후 건조시킨다. 이후 상기 소량의 파지 감수성 박테리아 균종을 상기의 건조 용균물에 직접 도말시킨후 건조시킨다. 상기 배양 접시를 30℃에서 인큐베이팅시킨다. 상기 배양 접시를 2일 동안 인큐베이팅시키는데, 이때 아가상에 다수의 콜로니가 자라난 것을 볼 수 있다. 상기 콜로니들중 몇개를 찍어서 영양 아가 접시상에서 재배양시킨다. 이와 같은 내성 배양균을 파지 용균물과 교차 스트리킹(cross streaking)시켜 내성 평가를 수행한다. 파지 용균물로 이루어진 선을 상기 접시상에서 스트리킹시킨후 건조시킨다. 이어서 내성 배양균으로 추측되는 배양균들을 상기 파지의 선(phage line)을 가로질러 스트리킹시킨다. 30℃에서 밤새 인큐베이팅시킨후 관찰한 결과, 내성 박테리아 배양균은 어디에서도 용균되지 않았다. 이후 영양 아가 접시상에 내성 균주 론(lawn)을 도말시켜 파지에 대한 내성을 재확인하였다. 감수성 균종이 양성 대조구로서 사용되는 것과 같은 동일한 방식으로 도말되었다. 건조시킨후, 파지 용균물 수적을 상기 접시의 중앙 부분에 떨어뜨린후 건조시켰다. 30℃에서 24시간 동안 인큐베이팅시킨후, 파지 용균물이 존재하는 지역에서는 내성 배양균이 용균되지 않았음을 알 수 있었다.
폴리뉴클레오타이드 프로브
DNA가 염기 상보성이라고 불리우는 기본 특성을 갖는다는 사실은 널리 공지된 바이다. 본질적으로, DNA는 한 쌍의 역 평행 사슬의 형태로 존재하는데, 각각의 사슬에 존재하는 염기는 각 사슬로부터 반대쪽 사슬을 향하여 뻗어져 있다. 한쪽 사슬에 존재하는 아데닌(A) 염기는 항상 반대쪽 사슬상의 티민(T) 염기와 쌍을 이루며, 구아닌(G) 염기는 시토신(C) 염기와 쌍을 이룬다. 염기들은 이들의 수소 결합력에 의해서 특별한 방식으로 병치된다. 각각의 결합이 상대적으로 약함에도 불구하고, 다수의 인접한 수소 결합 염기에 의한 전체 영향력 및 염기 차단(base-stacking) 효과들에 의해서 2개의 상보적 사슬이 안정하게 결합된다. 상기 결합은 고 pH 처리 또는 고온 처리와 같은 처리에 의하여 파괴될 수 있으며, 이와 같은 조건들은 2개의 사슬의 분해, 즉 "변성(denaturation)"을 일으킨다. 이후 DNA를 염기의 수소 결합이 열역학적으로 선호될 수 있는 조건하에 방치시키면, 상기 DNA 사슬은 어닐링(annealing), 즉 "혼성화(hybridization)"되어 본래의 DNA 이중 사슬 구조를 형성하게 될 것이다. 상기 혼성화 반응이 적당한 조건하에서 수행되면, 상기 반응의 특이성은 매우 높아질 수 있다. 즉, 염기의 상보성이 높은 사슬만이 안정한 이중 사슬 구조를 형성할 수 있을 것이다. 반응 조건과 혼성화 특이성과의 관계는 널리 공지되어 있다. 그러므로, 혼성화 반응은 2 개의 DNA 단편이 염기 배열에 있어서 상보적인지 여부를 평가하는데에 사용될 수 있다. 프로브를 사용하여 관심 있는 DNA 서열을 용이하게 검출하고 특징화시키는 것의 원리는 혼성화 기작이다.
상기 프로브는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 통상적으로 프로브의 길이는 약 10base 이상, 더욱 통상적으로는 약 18base 이상인데, 이는 약 50base 이상까지 제조될 수 있으며, 만일 상기 프로브가 합성하여 제조되는 경우에는 약 200base 미만인 것이 보통이다. 그러나, 더욱 장쇄인 프로브가 용이하게 사용될 수 있는데, 이러한 프로브의 길이는 예를 들어, 수 킬로베이스에까지 달한다. 상기 프로브 서열은 관심있는 독소를 코드화하는 유전자의 일부와 실질적으로 상보적이도록 디자인된다. 상기 프로브는 그것과 혼성화되는 서열과 완벽하게 상보적일 필요는 없다, 상기 프로브는 당 업계의 숙련자들에게 널리 공지된 기술을 사용하여 라벨링될 수 있다.
통상적으로 유용한 혼성화 방법중의 하나는 관심있는 DNA 샘플을 화학적으로 분리시킨후 정제하는 초기 과정을 포함한다. 용균된 세균 또는 세균으로부터 분리된 분획 핵산 전부가 사용될 수 있다. 세포들은 공지된 기술을 사용하여 처리될 수 있으며 그 결과 DNA (및/또는 RNA)를 유리시킬 수 있다. 적당한 제한 효소를 사용하여 DNA 샘플을 절단할 수 있다. 그 결과 생성된 절편들은 일반적으로 아가로즈 또는 아크릴아미드와 같은 겔내에서 수행되는 전기 영동에 의해서 크기별로 분리될 수 있다. 이후 관심 있는 단편들을 그 형태를 유지시키면서 고정화 막으로 이동시킬 수 있다. 이후 상기 막을 건조시킨후 미리 혼성화(prehybridization)시켜 이후의 혼성화 용액내 침수시를 대비하여 평형화시킨다. 핵산을 고형 지지체에 고정시키는 방법은 다양할 수 있다. 이후 과정에서의 DNA 고정화(fixing)는 실험실에서 사용하는 것을 떠나서, 이 기술이 속한 분야의 연구에 사용되기에 고부가 가치를 갖는다.
본 발명에서는 특정의 혼성화 기술이 필수적인 것은 아니다. 혼성화 기술이 개선됨에 따라 이들을 용이하게 적용시킬 수 있다.
당 업계에 널리 공지된 바와 같이, 프로브 분자 및 핵산 샘플이 그들 사이에 강한 비공유 결합을 형성하여 혼성화되면, 상기 프로브 및 샘플이 근본적으로 동일하다는 것을 추측할 수 있다. 상기 프로브의 검출성(detectable) 라벨은 혼성화가 발생되었는지 여부를 알 수 있는 수단을 제공한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 이들로부터 수득된 프로브는 표준 방법에 따라 DNA 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 뉴클레오타이드 단편을 프로브로서 사용하는 경우, 특정 프로브는 방사성 라벨 또는 비방사성 라벨을 포함하는 당 업계의 숙련자들에게 공지된 특정의 적당한 라벨로 라벨링된다. 일반적인 방사성 라벨에는32P,35S등을 포함한다. 방사성 동위 원소로 라벨링된 프로브는 DNase 및 DNA 중합효소를 사용하는 종래의 닉 트랜스레이션(nick-translation) 반응에 의하여 DNA 샘플과 상보적인 뉴클레오타이드 서열로부터 제조될 수 있다. 이후 상기 프로브 및 샘플을 혼성화 완충 용액내에서 화합시킨후 어닐링(annealing)될 때까지 적당한 온도에 방치시킨다. 이후 상기 막을 세척하여 통상적으로 방사선 사진 촬영 및/또는 액상 섬광 계수 측정법에 의하여 검출 및 정량되는 샘플 및 이에 결합된 프로브 분자에 남아있는 외재성 잔류 물질(extraneous materials)을 제거시킨다. 합성 프로브에 있어서, 프로브로서 사용되는 DNA의 말단을 라벨링시키는데에 폴리뉴클레오타이드 키나제 또는 말단 전이 효소와 같은 효소를 사용하는 것이 가장 바람직할 수 있다.
비방사성 라벨로서는 예를 들어, 바이오틴 또는 티록신과 같은 리간드 및 하이드롤라제 또는 퍼옥시다제와 같은 효소 또는 루시페린과 같은 다양한 화학 발광 물질 또는 플루오세인 및 이의 유도체와 같은 형광성 화합물을 포함한다. 상기 프로브는 본래부터 형광성을 갖도록 제조될 수 있는데, 이에 관하여는 국제 특허 출원 제 WO93/16094에 기술되어 있다. 상기 프로브는 또한 양쪽 말단에 분리가 용이한 다른 형태의 라벨로 라벨링될 수 있는데, 예를 들어서 한쪽 말단에는 상술된 바와 같은 동위 원소를 사용할 수 있으며 다른 쪽 말단에는 바이오틴 라벨을 사용하여 라벨링시킬 수 있다.
혼성화 용액내 존재하는 라벨링된 프로브의 양은 매우 다양한데, 이는 라벨의 특성, 필터에 결합될 수 있는 라벨링된 프로브 및 혼성화의 엄격성(stringency)에 따라서 다르다. 일반적으로 프로브가 과량으로 존재할 경우 고정된 DNA에 프로브가 결합되는 속도가 증가될 것이다.
다양한 정도의 혼성화 엄격성(stringency)이 적용될 수 있다. 상기 조건이 극할수록 이중 사슬 구조 형성에 필요한 상보성은 더욱 증가하게 될 것이다. 상기 조건의 극성(severity)은 온도, 프로브 농도, 프로브 길이, 이온 강도, 시간등에 의해서 조절될 수 있다. 바람직하게, 혼성화는 예를 들어 Keller, G.H.,M.M.Manak(1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, NY.,pp.169-170에 기술된 바와 같이 당 업계에 널리 공지된 기술에 의하여 극한 조건하에서 수행될 수 있다.
본원에 사용된 혼성화에 "엄격한(stringent)" 조건이란, 본원 발명의 출원인이 사용하는 조건과 혼성화의 특이성(specificity) 정도가 동일하거나 또는 거의 동일한 정도의 조건을 의미한다. 특히, 고정화된 DNA의 혼성화는 P32-라벨링된 유전자 특이적 프로브를 사용하는 서던 블럿(Southern blot)시의 표준적 방법에 의하여 수행된다(Maniatis 외 다수). 일반적으로, 혼성화 및 그 후속 조치로서 행하여 지는 세척은 본 발명의 독소 유전자와 상동성을 갖는 표적 서열을 검출할 수 있는 엄격한 조건하에서 수행된다. 이중 DNA 유전자 프로브에 있어서 혼성화는 6X SSPE, 5X Denhartdt 용액, 0.1% SDS, 0.1㎎/㎖의 변성 DNA 존재하, DNA 혼성체의 용융 온도(melting temperature; 이하 Tm이라 칭함) 이하인 20-25℃에서 밤새 수행된다. 상기 용융 온도는 하기 공식에 의하여 설명될 수 있다[Beltz, G.A., K.A.Jacobs, T.H.Eickbush, P.T. Cherbas, 및 F.C.Kafatos(1983) Methods of Enzymology, R.Wu, L. Grossman 및 K.Moldave(eds.) Academic Press, New York 100:266-285 참조].
Tm = 81.5℃+16.6 Log[Na+]+0.41(% G+C)-0.61(% 포름알데히드)-600/이중 염기쌍의 길이
통상적으로 세척은 하기와 같이 수행된다.
(1) 1X SSPE, 0.1% SDS 내, 실온에서 15분 동안 2회 세척(저 엄격성 세척;low stringency wash)
(2) 0.2X SSPE, 0.1% SDS 내, Tm 20℃에서 15분 동안 1회 세척(중간 엄격성 세척;moderate stringency wash)
올리고뉴클레오타이드 프로브에 있어서 혼성화는 6X SSPE, 5X Denhartdt 용액, 0.1% SDS, 0.1㎎/㎖의 변성 DNA 존재하, DNA 혼성체의 용융 온도(melting temperature; 이하 Tm이라 칭함) 이하인 10-20℃에서 밤새 수행된다. 상기 용융 온도는 하기 공식에 의하여 설명될 수 있다
Tm(℃) = 2(T/A 염기쌍 수) + 4(G/C 염기쌍 수)
[Suggs, S.V.,T.Miyake, E.H.Kawashime, M.J.Johnson, K.Itakura 및 R.B.Wallace(1981) ICN-UCLA Symp. Dev. Biol. Using Purified Genes, D.D.Brown(ed.), Academic Press, New York, 23:683-693 참조]
통상적으로 세척은 하기와 같이 수행된다.
(1) 1X SSPE, 0.1% SDS내, 실온에서 15분 동안 2회 세척(저 엄격성 세척;low stringency wash)
(2) 1X SSPE, 0.1% SDS내, 15분 동안 1회 세척(중간 엄격성 세척;moderate stringency wash)
이중 구조체 형성 및 안정성은 혼성체의 2 개의 사슬 사이의 실질적 상보성에 따라서 다르며, 상기된 바와 같이, 어느 정도의 미스매취(mismatch)는 크게 문제되지 않는다. 따라서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 돌연 변이(단일 부위 또는 다수 부위), 결실, 삽입 및 이들을 조합한 경우를 포함하는데, 이때 상기 돌연 변이, 삽입 및 결실의 경우는 관심 있는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 안정적으로 혼성화될 수 있다. 돌연 변이, 삽입 및 결실은 주어진 폴리뉴클레오타이드 서열내에서 다양한 방식으로 발생될 수 있으며, 이와 같은 방법들은 보통의 숙련자에게 공지된 방법이다. 다른 방법들도 장래 공지될 수 있을 것이다.
공지의 방법은
(1) 서열을 화학적으로 합성시키거나 또는 공지의 서열에 인위적으로 돌연 변이, 삽입, 결실시키는 단계;
(2) 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 프로브로서 사용하여 혼성화시켜 신규의 서열을 수득하거나 또는 프로브 서열을 돌연 변이, 삽입 또는 결실시키는 단계;
(3) 시험용 서열을 시험관내 또는 생체내에서 돌연 변이, 삽입 또는 결실시키는 단계
를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
주어진 프로브로부터 생성된 돌연 변이성, 삽입성 및 결실성 변이체가 원래의 프로브보다 다소 효율적이라는 것을 알 수 있는 것은 매우 중요하다. 이와 같은 효율상의 차이점에도 불구하고, 상기 변이체들은 본 발명의 범주내에 포함된다.
그러므로 기술된 뉴클레오타이드 서열의 돌연 변이성, 삽입성 및 결실성 변이체는 당 업계의 숙련자들에게 널리 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 상기 변이체들은 또한 그들이 원래 서열과 실질적으로 상동성이 있는한 프라이머 서열로서 사용될 수도 있다. 본원에 사용된 '서열의 실질적 상동성(substantial homology)'이란, 상기 변이체가 원래의 프로브와 동일한 기능을 갖기에 충분히 상동적임을 의미한다. 바람직하게, 변이체는 구체화된 서열과 아미노산 또는 뉴클레오타이드에 있어서 동일성(identity)이 50% 이상; 더욱 바람직하게는 75% 이상; 및 가장 바람직하게는 90% 이상일 것이다. 상기 변이체가 의도하는 바와 같은 기능을 갖는데에 필요로 하는 상동성의 정도는 서열의 의도된 용도에 따라 상이할 것이다. 서열의 기능을 개선시키거나 또는 방법론적으로 유리하도록 디자인된 돌연 변이체 즉, 삽입성 및 결실성 돌연 변이체를 제조하는 방법은 당 업계의 숙련자들에게 공지되어 있다.
PCR 기술
중합 효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction;PCR)은 핵산 서열의 반복적이고 효소적인, 프라이머에 의한 합성 방법이다. 상기 방법은 당 업계의 숙련자들에 의하여 널리 공지되고 일반적으로 사용되는 방법이다[Mullis, 미국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호 및 제 4,800,159 호; Saiki, Randall K., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Arnheim(1985) "Enzymatic Amplification of β-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia", Science 230:1350-1354 참조]. PCR은 표적 서열의 반대편 서열에 혼성화되는 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 접하고 있는, 관심 있는 DNA 단편을 효소적으로 증폭시키는 것에 그 원리를 두고 있다. 상기 프라이머는 3' 말단이 서로를 향하게 방향지워 진다. PCR은 주형의 열변성, 상보적 서열로의 프라이머의 어닐링 및 어닐링된 프라이머를 DNA 중합효소로 연장시켜 PCR 프라이머의 5' 말단으로 한정되는 단편을 증폭시키는 단계를 반복적으로 순환시킴으로써 수행된다. 각각의 프라이머의 연장 생성물이 다른 프라이머의 주형으로 사용될 수 있기 때문에, 근본적으로 각각의 단계는 전 단계에서 생성된 DNA 단편의 양을 2배로 증폭시킨다. 이로써 특정 표적 단편은 단 몇시간 내에 수백만배 이상으로 기하 급수적으로 축적된다. 서머스 아쿠아티쿠스(Thermus Aquaticus)와 같은 호열성 세균으로부터 분리된 Taq 중합 효소와 같은 내열성 DNA 중합 효소를 사용하여 증폭 과정을 완전히 자동적으로 진행시킬 수 있다.
본 발명에 의하여 수득될 수 있는 DNA 서열은 PCR 증폭 반응용 프라이머로서 사용될 수 있다. PCR 증폭 반응 수행시, 프라이머와 주형 사이의 어느 정도의 미스매취는 큰 문제가 되지 않는다. 그러므로 본원의 관점에서 수득된 프라이머를 돌연 변이, 결실 및 삽입(특히 5' 말단에 부가하는 것)시키는 것은 본 발명의 범주내에 속한다. 주어진 프라이머내에서의 돌연 변이, 삽입 및 결실은 통상의 숙련공에게 공지된 방법에 의하여 제조될 수 있다. 주어진 프로브로부터 생성된 돌연 변이성, 삽입성 및 결실성 변이체가 원래의 프로브보다 다소 효율적이라는 것을 알 수 있는 것은 매우 중요하다. 이와 같은 효율상의 차이점에도 불구하고, 상기 변이체들은 본 발명의 범주내에 포함된다.
본원과 관련된 모든 미국 특허는 본원에 참고 문헌으로서 첨부되어 있다.
이하는 본 발명을 실시하는 방법을 나타내는 실시예이다. 하기 실시예는 본원 발명을 한정하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 하기의 모든 퍼센트는 중량부이며 용매 혼합 비율은 특별히 언급되지 않은한 부피부이다.
실시예 1. - 분리주 제조
비.티. 균주를 이들이 포자를 형성할 때까지 펩톤, 글루코오스 염 배지에서 배양시켰다. 이후 이들을 원심 분리시킨후 냉동 건조시켜 분말로 수득하였다. 37℃, pH 10.7-11.0의 소듐 카보네이트, 2-머캅토에탄올 완충액내에서 상기 샘플로부터 독소 단백질을 추출하였다. 상기 단백질 추출물을 원심 분리, pH 9.5의 0.05M 소듐 카보네이트에 대하여 투석시켜 수득하였으며, 필요한 경우 마이크로콘센트레이터(microconcentrator)의 "스핀 컬럼(spin column)"을 사용하여 1㎎/㎖ 이상의 단백질로 농축시켰다. 단백질 농도는 우혈청 알부민을 표준으로 사용하여 레이저 농도계(laser densitometry)로써 측정하였다. 상기 조건하에서, HD969 균주로부터 수득된 추출물은 크기가 130-62kDa인 단백질을 함유하였으며(마이너 밴드(minor band) 수도 동일), PS66D3는 약 64kDa에서 메이저 밴드(major band)가 나타났고, 약 52kDa 및 30kDa에서 마이너 밴드(minor band)가 나타났으며, PS50C는 약 62kDa에서 메이저 밴드가 나타났으며 다수의 마이너 밴드가 나타났다.
실시예 2. - 현미 플랜트 하퍼인 닐라파르바타 루겐스(Nilaparvata lugens)에 대한 제조물의 생물 검정
본 생물 검정법은 곤충을 실시예 1에서 제조된 비.티. 제조물을 함유하는 인조 먹이에 노출시키는 것으로 구성하였다. 애벌레 상태인 곤충을 72시간 동안 시험 용액에 노출시켰다. 24시간후 꿀 생산을 실패한 것으로써 판단되는, 먹이를 제대로 섭취하지 않는 특정의 곤충들을 제거하였다. 이후 해충들을 0시간, 24시간, 48시간 및 72시간마다 관찰하여 생존 곤충의 수를 측정하였다. 각각의 생물 검정법을 따로따로 분리하여 1회당 10마리의 곤충을 사용하여 총 3회 복제시켰다. 각각의 복제 생물 검정법의 일환으로서, 추가로 10마리의 곤충을 사용하여 완충 대조 실험을 수행하였다. 상기 생물 검정법의 결과를 표 3에 나타내었다.
| 생존률(%) | |||||
| 샘플 | 마리수 | 0시간 | 24시간 | 48시간 | 72시간 |
| HD969 | 31 | 100 | 71 | 45 | 16 |
| 66D3 | 30 | 100 | 93 | 57 | 33 |
| 50C | 30 | 100 | 93 | 70 | 40 |
| 완충대조 실험 a | 30 | 100 | 93 | 83 | 62 |
| 완충대조 실험 b | 31 | 100 | 87 | 63 | 60 |
| 완충대조 실험 c | 31 | 100 | 87 | 84 | 74 |
실시예 3.- 식물의 형질 전환
본 발명의 하나의 양상은 본 발명의 살충 독소를 코드화하는 유전자로 식물을 형질 전환시키는 것이다. 형질 전환된 식물은 표적 해충의 공격에 대하여 내성을 갖는다.
본원에 기술된 살충 독소를 코드화하는 유전자는 당 업계에 널리 공지된 다양한 방법으로 식물 세포내 삽입될 수 있다. 예를 들어, 고등 식물에 외부 유전자를 삽입시키기 위한 제조물로서는 이.콜라이내 복제 시스템 및 형질 전환된 세포가 선별될 수 있도록 만들어 주는 마커를 포함하는 다수의 클로닝 벡터가 유용하다. 상기 벡터에는 예를 들어, pBR322, 일련의 pUC들, 일련의 M13mp들, pACYC184등이 있다. 따라서 비.티. 독소를 코드화하는 서열이 벡터내 적당한 제한 부위에 삽입될 수 있다. 결과로 제조된 플라스미드를 이.콜라이 내로의 형질전환시 사용하였다. 상기 이.콜라이 세포를 적당한 영양 배지내에서 배양시킨후 수득하여 용균시켰다. 그 결과, 플라스미드가 수득되었다. 분석 방법으로서는 서열 분석, 제한 분석, 전기 영동 및 기타 생화학-분자 생물학적 방법이 일반적으로 수행된다. 각각의 조작을 수행한후, 사용된 DNA 서열을 절단시켜 다음의 DNA 서열에 연결시켰다. 각각의 플라스미드 서열을 동일한 또는 다른 플라스미드내에 클로닝시켰다. 원하는 유전자를 식물내에 삽입시키는 방법에 따라서, 기타의 DNA 서열이 필요할 수도 있다. 예를 들어, 만일 Ti 또는 Ri 플라스미드가 식물 세포의 형질 전환시 사용되려면, 최소한 Ti 또는 Ri 플라스미드 T-DNA의 우측 경계 부위 - 때때로 Ti 또는 Ri 플라스미드 T-DNA의 좌측 또는 우측 경계 부위 - 가 삽입된 유전자의 측면과 접하여 연결된다.
식물 세포의 형질 변환시 사용되는 T-DNA 의 사용에 관하여는 EP 120 516; Hoekema(1985)저 "The Binary Plant Vector System" Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter5; Fraley외 다수, Crit.Rev.Pant Sci. 4:1-46; 및 An외 다수(1985) EMBO J. 4:277-287에 충분히 기술되어 있다.
삽입된 DNA가 일단 게놈내 융합되면, 이 DNA는 게놈내에서 비교적 안정하여 대게는 다시 외부로 방출되지 않는다. 일반적으로 상기 DNA는 예를 들어 카나마이신, G418, 블레오마이신, 하이그로마이신 또는 클로르암페니콜과 같은 항생제에 대한 내성을 식물에게 부여하는 선별 마커를 포함한다. 각각 사용된 마커는 DNA가 삽입되지 않은 세포보다 형질 전환된 세포의 선별을 가능하게 한다.
다수의 기술들이 식물 숙주 세포에 DNA를 삽입시키는데에 유용하다. 이와 같은 기술에는 아그로박테리움 튜미페이션스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes)를 형질 전환제로서 사용하는 T-DNA 형질 전환, 융합, 주사, 바이오리스틱스(biolistics)(미세 입자 충격법;microparticle bombardment) 또는 전기 영동 및 다른 가능한 방법을 포함한다. 아그로박테리아가 형질 전환에 사용되는 경우, 삽입될 DNA는 특정 플라스미드, 즉 중간 벡터(intermediate vector) 또는 2원 벡터(binary vector)내에 클로닝되어야 한다. 상기 중간 벡터는 T-DNA내 서열과 상동적인 서열로 인한 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 Ti 플라스미드 또는 Ri 플라스미드내에 삽입될 수 있다. 상기 Ti 플라스미드 또는 Ri 플라스미드는 상기 T-DNA를 전이시키는데에 필요한 vir 영역을 포함한다. 중간 벡터 자체는 아그로박테리아내에서 복제하지 못한다. 상기 중간 벡터는 헬퍼 플라스미드(helper plasmid)를 사용하여 아그로박테리움 튜미페이션스(Agrobacterium tumefaciens)내에 전이될 수 있다(컨쥬게이션). 2원 벡터 자체는 이.콜라이와 아가로박테리아 모두에서 복제하지 못한다. 이들은 우측 및 좌측 T-DNA 경계 부위로 틀이 구성된 선별 마커 유전자 및 링커 또는 폴리링커를 포함한다. 이들은 아가로박테리아내에 직접적으로 형질 전환된다[Holsters외 다수, 1978, Mol.Gen. Genet. 163:181-187]. 숙주 세포로 사용된 아가로박테리아는 vir 영역을 갖는 플라스미드를 포함할 것이다. 상기 vir 영역은 T-DNA를 식물 세포내에 전이시키는데에 필요하다. 추가의 T-DNA가 포함될 수도 있다. 이와 같이 형질 전환된 박테리아는 식물 세포의 형질 전환에 사용된다. 식물 세포내에 DNA를 전이시키기 위하여 아그로박테리움 튜미페이션스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes)와 식물 외식편(plant explant)을 함께 배양시키는 것이 바람직하다. 이후 적당한 배지에서 감염시킨 식물 재료(예를 들어 입 조각, 줄기 조각, 분열 조직, 뿌리 및 원형질 또는 현탁 배양 세포)로부터 식물 개체를 재발생시킬 수 있는데, 이때 선별을 위하여 항생제 또는 살생물제를 포함할 수도 있다. 이후 이와 같이 수득된 식물에 대하여 삽입 DNA의 존재 여부를 시험하였다. 주사(injection) 또는 전기 천공법(electroporation) 수행시 특별한 조건이 필요한 것은 아니다. 예를 들어 pUC 유도체와 같은 보통의 플라스미드를 사용할 수도 있다. 바이오리스틱스 형질 전환(biolistics transformation)시, 플라스미드 DNA 또는 선형 DNA가 사용될 수 있다.
상기 형질 전환된 세포는 통상의 방식에 따라 형태학적으로 정상인 식물로 재발생된다. 만일 형질 전환 세포가 생식 세포를 포함하는 경우에는, 삽입된 DNA 및 이에 상응하는 형질은 자손 식물에 전이될 것이다. 이와 같은 식물은 정상적으로 성장할 수 있으며 형질 전환된 유전 인자 또는 기타의 유전 인자를 갖는 식물과 교잡될 수 있다. 결과로 형성된 잡종 개체는 이에 상응하는 표현형을 나타낼 것이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 식물은 식물에 사용되기에 최적화된 코돈인 유전자로 형질 전환될 것이다. 예를 들어 미합중국 특허 제 5,380,831호를 참조. 바람직하게는 분절된 독소를 코드화하는 식물이 사용될 것이다. 상기 분절된 독소는 일반적으로 전체 길이 독소의 약 55-80%를 코드화할 것이다. 식물에 사용되는 비.티. 유전자를 합성하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다.
본원에 기술된 실시예 및 구체예는 본 발명을 단지 예시하기 위하여 기술된 것으로서 당 업계의 숙련자들에 의하여 다양하게 변경 및 수정이 가능하며 이는 또한 본원 발명의 사상과 범주 및 첨부된 청구 범위내에 포함된다.
Claims (17)
- HD969, PS66D3 및 PS50C로 구성되는 그룹으로부터 선택된 바실루스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis) 분리주로부터 수득할 수 있는 독소를 동시류 해충과 접촉시키는 단계를 포함하는 동시류 해충 박멸 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 분리주가 HD969인 것을 특징으로 하는 동시류 해충 박멸 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 분리주가 PS66D3인 것을 특징으로 하는 동시류 해충 박멸 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 분리주가 PS50C인 것을 특징으로 하는 동시류 해충 박멸 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 독소가 플란타(planta)내에서 발현되는 것을 특징으로 하는 동시류 해충 박멸 방법.
- HD969, PS66D3 및 PS50C로 구성되는 그룹으로부터 선택된 바실루스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis) 분리주로부터 수득할 수 있는 독소 또는 상기 독소의 동시류-활성 부분으로서, 상기 독소가 동시류 해충에 대하여 독성을 가지는 것을 특징으로 하는 독소.
- 제 6항에 있어서, 상기 분리주가 HD969인 것을 특징으로 하는 독소.
- 제 6항에 있어서, 상기 분리주가 PS66D3인 것을 특징으로 하는 독소.
- 제 6항에 있어서, 상기 분리주가 PS50C인 것을 특징으로 하는 독소.
- HD969, PS66D3 및 PS50C로 구성되는 그룹으로부터 선택된 바실루스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis) 분리주로부터 수득할 수 있는 독소 또는 상기 독소의 동시류-활성 부분을 코드화할 수 있는 유전자로서, 상기 독소가 동시류 해충에 대하여 독성을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
- 제 10항에 있어서, 상기 분리주가 HD969인 것을 특징으로 하는 독소.
- 제 10항에 있어서, 상기 분리주가 PS66D3인 것을 특징으로 하는 독소.
- 제 10항에 있어서, 상기 분리주가 PS50C인 것을 특징으로 하는 독소.
- HD969, PS66D3 및 PS50C로 구성되는 그룹으로부터 선택된 바실루스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis) 분리주로부터 수득할 수 있는 독소 또는 상기 독소의 동시류-활성 부분에 의해 형질 전환된 숙주 세포로서, 상기 독소가 동시류 해충에 대하여 독성을 가지는 것을 특징으로 하는 형질 전환된 숙주 세포.
- 제 14항에 있어서, 상기 분리주가 HD969인 것을 특징으로 하는 형질 전환된 숙주 세포.
- 제 14항에 있어서, 상기 분리주가 PS66D3인 것을 특징으로 하는 형질 전환된 숙주 세포.
- 제 14항에 있어서, 상기 분리주가 PS50C인 것을 특징으로 하는 형질 전환된 숙주 세포.
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