DE60030427T2 - Antimikrobielles Mittel gegen säurebeständige und hitzebeständige Bakterien - Google Patents
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Description
- Fachgebiet der Erfindung
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein antimikrobielles Mittel gegen säurebeständige und hitzebeständige Bakterien und insbesondere ein antimikrobielles Mittel gegen säurebeständige und hitzebeständige Bakterien wie z.B. Alicyclobacillus acidoterrestris, das als einen wirksamen Bestandteil ein sicheres Peptid enthält, das sich von einem natürlichen Produkt ableitet.
- Hintergrund der Erfindung
- Als typische Bakterien, die eine Säurebeständigkeit in Kombination mit einer Hitzebeständigkeit zeigen, sind Alicyclobacillus acidoterrestris, Alicyclobacillus acidocaldarius etc. bekannt. Die Sporen von diesen Bakterien besitzen eine Resistenz gegen das normalerweise für Fruchtsaft verwendete Verfahren der Pasteurisation. Daher war in den letzten Jahren das Verderben von Fruchtsaft, das durch Alicyclobacillus acidoterrestris verursacht wurde, weltweit ein ernstes Problem.
- Um das Wachstum des Bakteriums in Fruchtsaft zu unterdrücken, ist es wirksam, ein synthetisches Konservierungsmittel wie z.B. Benzolsäure zuzugeben. Es besteht jetzt jedoch eine energische Forderung nach einem Material mit einem erhöhtem Maß an Sicherheit, das sich von einem natürlichen Produkt und nicht von einem synthetischen Produkt ableitet.
- Als ein antimikrobielles Mittel, das sich von einem natürlichem Produkt ableitet und das wirksam gegen das Bakterium ist, wurde nur von Nisin berichtet, das ein Peptid ist, das sich von einem Milchsäurebakterium ableitet (International Journal of Food Science and Technology, Bd. 34, S. 81 bis 85, 1999). Nisin enthält jedoch einen speziellen Typ von Aminosäuren wie z.B. Dehydroalanin.
- Lin Y et al. beschreiben antimikrobielle Peptide, die durch kompakte Strukturen, thermische Stabilität und antimikrobielle Aktivität gekennzeichnet sind (Food Science China, 20(11), 18–21, 1999).
-
US 5,446,127 betrifft antipathogene Peptide, DNA-Sequenzen, die diese Peptide codieren, Vektoren, die diese DNA-Sequenzen umfassen, transgene Pflanzen, die eine DNA-Sequenz umfassen, die diese Peptide codiert, Zusammensetzungen, die antipathogene Peptide enthalten, und die Verwendung dieser Peptide und Zusammensetzungen zur Kontrolle von Pflanzenpathogenen. - Yamazaki et al. beschreiben die Verhinderung des Verderbens, das durch das Bakterium Alicyclobacillus acidoterrestris verursacht wird, durch die Zugabe von Lysozm (Journal of Japanese Society of Food Science and Technology, 44(12), 905–911, 1997).
- Somit besteht ein Bedarf an einem antimikrobiellen Mittel für die Konservierung und Lagerung von Fruchtsaft, das sich von einem natürlichen Produkt ableitet und das bei einer niedrigen Konzentration wirksam gegen säurebeständige und hitzebeständige Bakterien wie z.B. Alicyclobacillus acidoterrestris ist.
- Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat die Kennzeichen von Thionin vom alpha-Typ und Thionin vom beta-Typ untersucht, die Peptide sind, die von Weizen und Gerste stammen. Nach bestem Wissen des Erfinders hat niemand über eine antimikrobielle Wirkung von den Thioninen gegen Alicyclobacillus acidoterrestris berichtet, das ein säurebeständiges und hitzebeständiges Bakterium ist, wohingegen ihre antimikrobielle Wirkung gegen phytopathogene Pilze schon zuvor bekannt war (Plant Science, Bd. 92, S. 169 bis 177, 1993). Zusätzlich enthalten solche Thionine im Gegensatz zu dem vorstehend erwähnten Nisin, das von Milchsäurebakterien stammt, keine besonderen Aminosäuren.
- Zusammenfassung der Erfindung
- Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein antimikrobielles Mittel mit einem erhöhten Maß an Sicherheit zur Verfügung zu stellen, das sich von einem natürlichen Produkt ableitet und eine wachstumshemmende Aktivität gegen Alicyclobacillus acidoterrestris zeigt, das säurebeständig und hitzebeständig ist und das Verderben von Fruchtsaft verursacht. Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Konservierungsmittel für Fruchtsaft zur Verfügung zu stellen, welches das vorstehend erwähnte antimikrobielle Mittel umfasst.
- Um die vorstehend erwähnten Aufgaben zu erfüllen, hat der Erfinder der vorliegenden Erfindung ein intensives Absuchen von antimikrobiellen Substanzen gegen Alicyclobacillus acidoterrestris von verschiedenen landwirtschaftlichen Anbaupflanzen mit dem Ergebnis durchgeführt, dass sie Thionin vom alpha-Typ und Thionin vom beta-Typ gefunden haben, die Peptide von Weizen und Gerste sind und die eine wachstumshemmende Aktivität gegen diese Bakterien besitzen. Daher hat der Erfinder der vorliegenden Erfindung die vorliegende Erfindung auf der Basis dieser Befunde vervollständigt.
- Kurz zusammengefasst betrifft die vorliegende Erfindung ein antimikrobielles Mittel gegen säurebeständige und hitzebeständige Bakterien, das darin gekennzeichnet ist, dass das antimikrobielle Mittel als einen wirksamen Bestandteil Thionin vom alpha-Typ und/oder Thionin vom beta-Typ enthält, wobei das Thionin zu Fruchtsaft in einer Endkonzentration im Bereich von 5 bis 100 μg/ml im Fall des gereinigten Thionins vom alpha-Typ oder im Bereich von 10 bis 100 μg/ml im Fall des gereinigten Thionins vom beta-Typ beigegeben wird.
- Kurze Beschreibung der Zeichnungen
-
1A und1B zeigen im Zeitverlauf die Veränderungen in der Anzahl der lebenden Bakterien von Alicyclobacillus acidoterrestris in jedem Fruchtsaft, dem Thionin zugegeben wurde, wobei1A und1B die Ergebnisse zeigen, die von Orangensaft beziehungsweise Apfelsaft erhalten wurden. - Ausführliche Beschreibung der Erfindung
- Thionine, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, können aus Mehl von Getreide wie z.B. Gerste, Weizen, Hafer und Roggen durch die Extraktion mit einer Salzlösung oder Säuren wie z.B. Salzsäure, Schwefelsäure und Essigsäure erhalten werden und können zusätzlich unter Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen oder Pflanzen, die Thioningene enthalten, hergestellt werden.
- Sowohl das Thionin vom alpha-Typ als auch das Thionin vom beta-Typ sind aus etwa 45 Aminosäuren zusammengesetzt und etwa 8 Cysteine sind unter diesen enthalten und sie besitzen die molekulare Struktur, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die Cysteinreste teilweise oder vollständig durch Disulfidbrücken vernetzt sind. Die pH-Werte in Fruchtsaft liegen normalerweise in dem Bereich von 3 bis 4 und diese Thionine werden auch unter solchen sauren Bedingungen nicht denaturiert.
- Solche Thionine können durch die Konzentration eines Gersten- oder Weizenextrakts durch das Aussalzen mit Ammoniumsulfat etc., gefolgt durch eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt werden, aber jedes Gemisch (Rohreinigungsprodukt), das im Verlauf eines solchen Reinigungsprozesses hergestellt wird, kann nur auf eine ähnliche Weise in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wenn es die gewünschte antimikrobielle Aktivität zeigt.
- Der Prozess der Extraktion und Reinigung von Thioninen aus Gerste wurde zum Beispiel in Planta, Bd. 176, S. 221 bis 229 (1988) beschrieben und es ist ebenfalls möglich, die Extraktion und Reinigung von anderen Varietäten des Weizen und der Gerste gemäß des Prozesses durchzuführen.
- Die vollständigen Aminosäuresequenzen von den Thioninen, die von Gerste, Weizen und Hafer hergestellt werden, (Plant Molecular Biology, Bd. 26, S. 25 bis 37, 1994) sowie die Aminosäurezusammensetzung von Thionin des Roggen sind bereits bekannt (Journal of Agricultural and Food Chemistry, Bd. 26, S. 794 bis 796, 1978). Es sollte berücksichtigt werden, dass in Abhängigkeit von der Sippe des Weizens und der Gerste Peptidvarianten existieren können, die eine oder mehrere Aminosäurereste besitzen, die einen Austausch, eine Addition oder Deletion vollzogen haben, wenn sie mit der bekannten Aminosäurezusammensetzung und Aminosäuresequenzen verglichen werden, und solche Peptidvarianten sind in den Thioninen eingeschlossen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, wenn sie die angezielte antimikrobielle Aktivität zeigen.
- In dem Fall, dass Thionin als ein antimikrobielles Mittel gegen säurebeständige und hitzebeständige Bakterien oder als ein Konservierungsmittel für Fruchtsaft verwendet wird, wird Thionin oder Rohthionin zu Fruchtsaft in einer Endkonzentration im Bereich von 5 bis 100 μg/ml im Fall des gereinigten Thionins vom alpha-Typ oder im Bereich von 10 bis 100 μg/ml im Fall des gereinigten Thionins vom beta-Typ zugegeben, um das Wachstum von säurebeständigen oder hitzebeständigen Bakterien wie z.B. Alicyclobacillus acidoterrestris in Fruchtsaft zu hemmen.
- Weil Thionin die antimikrobielle Aktivität nicht verliert, nachdem es unter sauren Bedingungen bei 100°C für 10 min erhitzt wurde (Agricultural and Biological Chemistry, Bd. 34, S. 1089 bis 1094, 1970), kann die antimikrobielle Aktivität von Thionin erhalten werden, auch wenn es zu Fruchtsaft zugegeben wird, gefolgt von einer Pasteurisierung.
- Von der Tatsache, dass bisher kein Bericht über einen Thionin resistenten, mutierten Mikroorganismus veröffentlicht wurde und dass Thionin schnell von Verdauungsenzymen wie z.B. Trypsin abgebaut wird (Journal of the Japanese Society for Food Science and Technology, Bd. 47, S. 423 bis 429, 2000), kann seine Wirkung auf Enterobakterien als sehr gering angesehen werden. Zusätzlich wurde berichtet, dass 1 orale Verabreichung von Thionin an Mehrschweinchen mit einer Dosis von 103 bis 229 mg/kg Körpergewicht, gefolgt von einer Beobachtung für 7 Tage, nicht zu einem Nachweis von Anomalien führte (Cereal Chemistry, Bd. 19, S. 301 bis 307, 1942.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein antimikrobielles Mittel mit einem hohen Maß an Sicherheit zur Verfügung gestellt, das Thionin als einen wirksamen Bestandteil enthält und das sich von einem natürlichen Produkt ableitet. Des weiteren stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls das Konservierungsmittel für Fruchtsaft zur Verfügung, das Thionin als einen wirksamen Bestandteil enthält. Das antimikrobielle Mittel und das Konservierungsmittel zeigen eine Wachstumshemmung gegen säurebeständige und hitzebeständige Bakterien wie z.B. Alicyclobacillus acidoterrestris, welche das Verderben von Fruchtsaft verursachen. Zusätzlich wird Thionin auch nach dem Erhitzen unter sauren Bedingungen nicht denaturiert und ist daher wirksam für die Verhinderung des Verderbens von Fruchtsaft. Wässrige Lösungen von Thioninen sind klar und geruchlos und beeinflussen daher nicht den Geschmack von Fruchtsaft.
- Beispiele
- Die vorliegende Erfindung wird ausführlich mit Bezugname auf die Beispiele beschrieben, aber die Erfindung soll dadurch nicht begrenzt werden.
- Herstellungsbeispiel 1
- Körner von hülsenfreier Gerste (Varietät: "ICHIBAN-BOSHI") wurden mit einer Zyklonmühle gemahlen und zu Pulver verarbeitet und 100 g des Pulvers wurden mit 300 ml destilliertem Wasser vermischt, gefolgt durch das Rühren für 1 Stunde bei 4°C und dem Durchführen einer Zentrifugation, um den so erhaltenen Überstand zu entfernen.
- Anschließend wurde das Präzipitat mit 200 ml 1 M wässriger Natriumchloridlösung vermischt und das Gemisch wurde für 2 Stunden bei 4°C gerührt und eine Zentrifugation wurde durchgeführt. Dem so erhaltenen Überstand wurde Ammoniumsulfat (50 bis 90% gesättigt) zugegeben und das erhaltene Präzipitat wurde in einem Phosphatpuffer suspendiert, gefolgt durch eine Zentrifugation. Der so erhaltene Überstand wurde für eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie verwendet, um gereinigtes Thionin vom alpha-Typ und Thionin vom beta-Typ aus Gerste zu erhalten. In der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wurde Wakosil 5C4-200, 4,6 mmΦ × 250 mm (geliefert von Wako Pure Chemicals Ind., Japan) als eine Säule verwendet und die Elution mittels Konzentrationsgradienten wurde mit Wasser (pH-Wert 2,1), das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt, und 0 → 40% (0 → 40 min) Acetonitril mit einer Flussrate von 0,5 ml/min durchgeführt. Anschließend wurden die gewonnenen Fraktionen mit einer Verdampfungszentrifuge zur Trockenheit verdampft, gefolgt von einer Aminosäureuntersuchung und einer Massenspektralanalyse, wodurch sie als Thionin vom alpha-Typ und Thionin vom beta-Typ identifiziert wurden. Es wurden 37 mg Thionin vom alpha-Typ beziehungsweise 12 mg Thionin vom beta-Typ in Bezug auf 1 kg gepulverte Körner von "ICHIBAN-BOSHI" gewonnen.
- Herstellungsbeispiel 2
- 100 g im Handel erhältliches, weiches Weizenmehl wurde mit 300 ml 0,15 N Salzsäure vermischt und das so erhaltene Gemisch wurde gerührt. Man ließ das Gemisch anschließend für 30 Minuten bei 37°C ruhen und es wurde erneut gerührt, gefolgt von einer Zentrifugation. Der so erhaltene Überstand wurde durch das Zutropfen von 10 N wässriger Natriumhydroxidlösung neutralisiert und anschließend wurde erneut eine Zentrifugation durchgeführt.
- Dem so erhaltenen Überstand wurde Ammoniumsulfat (50 bis 90% gesättigt) zugegeben und das gewonnene Präzipitat wurde in einem Phosphatpuffer suspendiert. Der durch eine Zentrifugation getrennte Überstand wurde für eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter den gleichen Bedingungen wie bei der Herstellung in Beispiel 1 verwendet, um gereinigtes Thionin vom alpha-Typ aus Weizen zu erhalten.
- Die gewonnenen Fraktionen wurden mit einer Verdampfungszentrifuge zur Trockenheit verdampft, gefolgt von einer Aminosäureuntersuchung und einer Massenspektralanalyse, wodurch sie als Thionin vom alpha-Typ identifiziert wurden. Es wurden 40 mg Thionin vom alpha-Typ in Bezug auf 1 kg weiches Weizenmehl gewonnen.
- Beispiel 1
- YPGB-Kulturmedium (0,25% Hefeextrakt, 0,5% Polypepton, 0,1% D-Glucose, 0,05% Magnesiumsulfat-7-hydrat (MgSO4·7H2O), 0,2% Kaliumchlorid, pH-Wert 4) wurde mit Alicyclobacillus acidoterrestris, Stamm ATCC 49025, beimpft, gefolgt durch eine Züchtung über 2 Tage bei 37°C, und das Kulturmedium wurde für eine Stunde bei 60°C behandelt, um eine Sporensuspension herzustellen.
- Das YPGB-Kulturmedium, das die vorgegebene Menge von jedem der verschiedenen Thionine enthielt, wie sie in den Herstellungsbeispielen 1 und 2 erhalten wurden, wurden individuell mit der Sporensuspension mit einer Rate von 1 × 104 Sporen/ml beimpft und die Züchtung wurde für zwei Tage bei 37°C durchgeführt, gefolgt von der Untersuchung des Bakterienwachstums.
- Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt. In der Untersuchung wurde das Bakterienwachstum auf der Basis der visuellen Beobachtung des Trübheitsgrades von jedem Kulturmedium geschätzt, aber im Fall von 50 μg/ml und 100 μg/ml Zugabe von Thionin wurde das Bakterienwachstum durch die Plattenkultur des verdünnten Mediums beurteilt, weil das Kulturmedium durch Thionin getrübt wurde. Des weiteren wurde in dem Fall, in dem als Kontrollen keine Thionine zugegeben wurden, das Bakterienwachstum in jeder Testgruppe beobachtet. Tabelle 1
- +:
- Bakterienwachstum wurde beobachtet
- –:
- Bakterienwachstum wurde nicht beobachtet
- Beispiel 2
- Zu im Handel erhältlichen 100% Orangensaft und Apfelsaft (pH-Wert 3,6 für beide Säfte) wurde Thionin vom alpha-Typ der Gerste in einer Endkonzentration von 20 μg/ml zugegeben und die Säfte wurden anschließend mit einer Rate von 1 × 106 Sporen/ml mit der Sporensuspension von Alicyclobacillus acidoterrestris, Stamm ATCC 49025, die in Beispiel 1 hergestellt wurden, beimpft und bei 37°C inkubiert. Die Anzahl der lebenden Bakterien in jedem Fruchtsaft wurde nach einem Zeitablauf durch die Verdünnungsplattenkultur (für 2 Tage bei 37°C) in einem Kartoffel-Dextrose-Agar-Medium (geliefert von Nissui Seiyaku Co., Japan) gezählt. Die Ergebnisse, die in
1A und1B gezeigt werden, wurden erhalten. In den Figuren zeigt1A das Ergebnis, das von Orangensaft erhalten wurde, und1B das Ergebnis, das von Apfelsaft erhalten wurde. - Wie von den Figuren ersichtlich ist, sinkt die Anzahl der lebenden Bakterien von Alicyclobacillus acidoterrestris im Zeitverlauf drastisch, was zu der Schlussfolgerung führt, dass die Wirkung der Zugabe von Thionin des alpha-Typs der Gerste bestätigt wurde.
Claims (2)
- Verwendung von Thionin vom α-Typ und/oder Thionin vom β-Typ als ein antimikrobielles Mittel gegen säurebeständige und hitzebeständige Bakterien, wobei das Thionin zu Fruchtsaft in einer Endkonzentration im Bereich von 5 bis 100 μg/ml im Fall des gereinigten Thionins vom α-Typ oder im Bereich von 10 bis 100 μg/ml im Fall des gereinigten Thionins vom β-Typ beigegeben wird.
- Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Thionin ein Thionin ist, das sich aus Gerste, Weizen, Hafer oder Roggen ableitet.
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