-
GEBIET DER ERFINDUNG:
-
Die vorliegende Erfindung betrifft
den Schutz vor Infektionen mit eukaryotischen Mikroorganismen.
-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG:
-
Chemisch synthetisierte antimikrobielle
Mittel, die das Wachstum von eukaryotischen Mikroorganismen unterdrücken, sind
allgemein bekannt, diese Mittel werden aber hinsichtlich ihrer Sicherheit
als kritisch angesehen. Es ist ebenfalls bekannt, dass einige von
Mikroorganismen hergestellte Antibiotika das Wachstum von eukaryotischen
Mikroorganismen unterdrücken.
Diese Mittel können
aber aufgrund von gesetzlichen Einschränkungen nicht der Nahrung,
Kosmetika und industriellen Chemikalien zugesetzt werden. Extrakte
von verschiedenen Gewürzen
oder Knoblauch wurden als welche mit antimikrobieller Aktivität identifiziert,
sie haben allerdings selbst bei niedrigen Dosen einen besonderen
Duft und sind daher in ihrer Anwendung beschränkt.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:
-
Diese Erfindung betrifft sichere
antimikrobielle Mittel, die aus natürlichen Quellen stammen und
in der Lage sind, das Wachstum von eukaryotischen Mikroorganismen
zu unterdrücken,
diese können
zu Nahrungsmitteln, Kosmetika, Pharmazeutika und industriellen Chemikalien
zugegeben werden.
-
Als ein Ergebnis von Untersuchungen
zu natürlichen
Quellen, die in der Lage sind, das Wachstum von Hefen und Pilzen
zu unterdrücken,
wurde gefunden, dass von prokaryotischen erhaltene DNA das Wachstum von
eukaryotischen Mikroorganismen signifikant unterdrücken kann.
Es wird angenommen, dass ein Unterschied in den funktionellen Rollen
der aus prokaryotischen Mikroorganismen extrahierten DNA und der
aus eukaryotischen Mikroorganismen aufgrund des Unterschieds der
Methylierung und der Häufigkeit
von CG-Dinukleotidsegenzen
in beiden Mikroorganismen besteht, und dass dieser Unterschied in
Beziehung zu einer der Selbstschutzfunktionen von prokaryotischen
Mikroorganismen gegenüber
eukaryotischen Mikroorganismen steht.
-
In einem Aspekt ist diese Erfindung
auf antimikrobielle Mittel gerichtet, die wirksam gegenüber eukaryotischen
Mikroorganismen sind; bei diesen ist mindestens ein Hauptbestandteil
des antimikrobiellen Mittels eine DNA, extrahiert aus prokaryotischen
Mikroorganismen, und ein anderes Verfahren als die Behandlung von
menschlichen oder tierischen Organismen zur Unterdrückung des
Wachstums von eukaryotischen Mikroorganismen durch den Zusatz des
erfindungsgemässen
antimikrobiellen Mittels.
-
Andere Aspekte der Erfindung sind
in den Ansprüchen
dargestellt, auf diese wird Bezug genommen.
-
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:
-
In der vorliegenden Erfindung schliessen
die prokaryotischen Mikroorganismen alle gram-positiven und gram-negativen
Bakterien ein.
-
Gram-positive Bakterien schliessen
ein die Gattung Bacillus, wie B. subtilis, B. cereus, B. megaterum, B.
mesentericus, B. licheniformis, B. sphaericus, B. alvei, B. natto
und B. circulans; Milchsäurebakterien,
wie Lactobacillus plantarum, L. acidophilus, L. brevi, L. casei,
L. delbrueckii, L. fermentum und L. helveticus, und Lactococcus
lactis, Leuconostoc mesenteroides, L. dextranicum, Pediococcus pentosaceus,
P. acidilactici, Streptococcus faecium und Str. faecalis; und Cocci,
wie Micrococcus luteus, M. flavus, M. roseus, Staphylococcus aureus
und S. epidermidis.
-
Gram-negative Bakterien schliessen
ein: Aeromonas hydrophila, Alcaligenes faecalis, Enterobacter cloacae,
Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas
aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. aureofaciens, Salmonella typhimurium,
Sal. enteritidis, Serratia arcescens und Vibrio.
-
Wenn ein Nahrungsmittel vor dem Verderben
oder dem Vermischen mit einem Mycotoxin geschützt werden soll, kann erfindungsgemäss DNA von
Milchsäurebakterien
oder B. natto, eine Spezies von B. subtilis, oder DNA von Escherichia
coli verwendet werden.
-
DNA von prokaryotischen Mikroorganismen
kann erfindungsgemäss
ebenfalls zum Schutz von anderen Materialien als Nahrungsmitteln,
Pflanzen und Lebewesen vor eukaryotischen Mikroorganismen verwendet
werden.
-
Die Erfindung kann verwendet werden,
um Nahrungsmittel vor dem Verderben zu schützen und Früchte vor Verschimmeln oder
Enzymen, hergestellt von den Eukaryoten. Eukaryotische Mikroorganismen,
gegen die die vorliegende Erfindung wirksam ist, schliessen solche
ein, die Mycotoxine herstellen, wie Aflatoxin, Ochratoxin, Sterigmatocystin,
Penicillium toxin und Fusarium toxin. Erkrankungen durch Eumycetes,
die erfindungsgemäss
behandelt werden können,
schliessen Infektionen durch z.B. Trychophyton und Candida, Pflanzenpathologie
und Fischpathologie ein. Schimmelpilze in Häusern, Möbeln, der Küche, dem Bad und auf Böden können erfindungsgemäss behandelt
werden.
-
Prokaryotische DNA, die durch Restriktionsenzyme
abgebaut wurde, kann ebenfalls verwendet werden und die Grösse der
DNA ist bevorzugt mindestens 1.000 Basen, um den wachstumsunterdrückenden
Effekt aufzuzeigen. Es ist ebenfalls vorteilhaft für die DNA,
eine grosse Zahl an CG-Dinukleotidsequenzen
im Molekül
zu enthalten. CG-Dinukleotidsequenz
bedeutet, dass C und G aufeinanderfolgende Basen in der Nukleotidsequenz
der prokaryotischen DNA sind.
-
Es ist bevorzugt, dass die prokaryotische
DNA CG-Dinukleotidsequenzen
einschliesst, die mit mindestens 2-facher, bevorzugter mindestens
17-facher Häufigkeit
als in der DNA von eukaryotischen Mikroorganismen vorkommt.
-
Beispiele für eukaryotische Mikroorganismen,
die gemäss
der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, sind Hefen, wie Saccharomyces
cerevisiae und Candida albicans, und filamentöse Pilze, wie Aspergillus niger
und Aspergillus fumigatus.
-
BEISPIEL 1
-
Als Beispiel zur Extraktion von DNA
aus prokaryotischen Mikroorganismen wird Bacillus natto, IFO 3336,
in einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 200 ml L-Broth-Medium
(0,1% Glucose, 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Pepton und 0,5 NaCl, pH 7,2)
bei 30°C
für 30
Stunden kultiviert. Die Zellen wurde mittels Zentrifugation geerntet
(8.000 U/min, 10 Minuten) und zweimal mit 0,85% Salzlösung gewaschen.
Die Zellsuspension in 40 ml destilliertem Wasser wurde mit 20 mg
Lysozym bei 37°C
für 20
Minuten inkubiert und anschliessend auf 65°C erhitzt, um die Zellen aufzubrechen.
Kaltes Ethanol (–20°C) wurde
graduell zu der Suspension gegeben und ca. 500 mg unlösliche DNA
wurden durch Aufwickeln der DNA auf einen Glasstab erhalten. Die
erhaltene DNA wurde mit 70%, 80% bzw. 90 Ethanollösungen gewaschen
und im Vakuum getrocknet. So wurde hochaufgereinigte DNA als eine
Lösung,
enthaltend 2 mg DNA pro ml destilliertem Wasser, hergestellt.
-
Wenn Saccharomyces cerevisiae in
einem SD-Medium in Anwesenheit von 1 mg/ml DNA pro Hefekultur (2,0%
Glucose und 0,67% aminosäurefreie
Stickstoffquelle für
Hefe) in Anwesenheit der erhaltenen DNA, wie beschrieben, bei 30°C für 24 Stunden
kultiviert wurde, war das Wachstum der Hefen komplett unterdrückt. Das
Wachstum von Saccharomyces cerevisiae war allerdings nicht in einem
Medium in Abwesenheit von prokaryotischer DNA unterdrückt.
-
BEISPIEL 2
-
(A) Herstellung der DNA:
-
Prokaryotische Mikroorganismen, Bacillus
natto (IFO 3336) und Escherichia coli K-12 (IFO 14410), wurden in
einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 200 ml L-Broth-Kulturmedium (0,1%
Glucose, 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Pepton und 0,5% NaCl, pH 7,2) bei
30°C inkubiert.
Nach 30 Stunden wurden die Zellen von jedem Bakterium geerntet und
mit 0,85% Salzlösung
zweimal gewaschen und anschliessend wurden die Zellen in 40 ml destilliertem
Wasser suspendiert. Nach Zugabe von 20 mg Lysozym zu der Suspension
wurde die Temperatur auf 65°C
erhöht,
um die Zellen abzubauen. 500 mg DNA, unlöslich gemacht durch graduelle
Zugabe von –20°C Ethanol,
wurden durch Aufwickeln auf einen Glasstab erhalten.
-
(B) Tests zur Unterdrückung des
Hefewachstums:
-
Die aus dem jeweiligen Bakterienstamm
erhaltene DNA, wie oben beschrieben, wurde mit einer Ethanollösung, deren
Konzentration von 70 über
80 auf 90% erhöht
wurde, gewaschen und im Vakuum getrocknet. Somit wurde eine hochaufgereinigte
DNA als Lösung,
enthaltend 2 mg DNA pro ml destilliertem Wasser, erhalten.
-
Hefe, Saccharomyces cerevisiae FT-1
(Journal of Fermentation and Bioengineering, 70, 275, 1990), die
von K. Kimura erhalten wurde, wurde in 5 ml SD-Medium (2,0% Glucose
und 0,67% Hefestickstoffquelle, aminosäurefrei) bei 30°C für 24 Stunden
kultiviert. Die von jedem Bakterienstamm erhaltene DNA wurde zu den
4 Flaschen, enthaltend 100 ml SD-Medium, zugegeben. Die Endkonzentration
der DNA in jeder Flasche war 0, 0,2, 0,4, 0,6 bzw. 0,8 mg/ml. Diese
Medien, enthaltend verschiedene Konzentrationen der DNA, wurden mit
0,1 ml des Hefestamms, der wie oben beschrieben kultiviert wurde,
angeimpft.
-
Jedes SD-Medium, enthaltend die DNA,
wurde bei 30°C
für 24
Stunden auf einem Schüttler
kultiviert und die in dem Medium gewachsenen Hefezellen wurden geerntet
und mit 0,85% Salzlösung
gewaschen. Die Zellen wurden in 10-, 100- bzw. 1.000-fachem Volumen
von 0,85% Salzlösung
suspendiert und 0,1 ml jeder dieser Zellsuspensionen wurden auf
ein YDP-Agarplattenmedium aufplattiert (2 Glucose, 2% Pepton, 1%
Hefeextrakt und 1,5% Agar, pH 5,0). Nach Kultivierung für 1 bis
2 Tage bei 30°C
wurde die Zahl der auf dem Plattenmedium gewachsenen Kolonien gezählt. Die
Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 dargestellt.
-
TABELLE
1
DNA von Bacillus natto
-
TABELLE
2
DNA von E. coli R-12
-
Diese Ergebnisse zeigen, dass die
Zugabe von mehr als 0,4 mg/ml DNA von B. natto oder E. coli K-12 deutlich
das Wachstum der Hefen unterdrückt.
-
BEISPIEL 3
-
(A) Herstellung der DNA:
-
2 ml einer Lösung von E. coli DNA (10 mg),
hergestellt wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden in 4 Teströhrchen gegeben
und ein dreifaches Volumen an kaltem Ethanol (–20°C) wurde zugegeben. Nach 24
Stunden bei –20°C wurde die
DNA durch Zentrifugation bei 1.000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert
und der Überstand
wurde verworfen. Die präzipitierte
DNA wurde im Vakuum getrocknet.
-
2 ml der Reaktionsmischung für das Restriktionsenzym
EcoRI (alle hier verwendeten Enzyme waren von Takara Shuzo Co.,
Ltd., Japan), enthaltend 50 mmol Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol und 100 mM Natriumchlorid,
wurden in ein Teströhrchen
gegossen, um die DNA aufzulösen.
2 ml-Mengen einer Reaktionsmischung für HindIII, enthaltend 10 mM
Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM Dithiothreitol
und 50 mM Natriumchlorid, wurden in zwei Teströhrchen gegeben, um die DNA
aufzulösen.
Anschliessend wurden 10.000 Einheiten eines jeden Restriktionsenzyms
zu den Teströhrchen
gegeben und bei 37°C
für 2 Stunden inkubiert.
-
Zu einem der Teströhrchen,
die mit HindIII reagiert wurden, wurde das 2-fache Volumen an eiskaltem Ethanol
(–20°C) wieder
hinzugegeben und die Mischung wurde bei –20°C für 1 Tag gehalten. Nach Zentrifugation
bei 10.000 U/min für
10 Minuten wurde die DNA präzipitiert
und im Vakuum getrocknet. Die Reaktionsmischung für die DNase
(100 mM Natriumacetat, pH 5,0 und 0,5 mM MgSO4)
wurde zu der gelösten
DNA gegeben und anschliessend wurde die Lösung mit 1.000 Einheiten DNase
I bei 15°C
für 2 Stunden
inkubiert. Die molekulare Grösse
der DNA, abgebaut durch diese Restriktionsenzyme, war ca. 2 bis
3.000 Basen im Durchschnitt.
-
(B) Tests zur Unterdrückung des
Hefewachstums:
-
Hefe, Saccharomyces cerevisiae FT-1
(J. of Fermentation and Bioengineering 70, 275, 1990) wurde in 5
ml SD-Medium (2,0% Glucose und 0,67% Hefestickstoffquelle, aminosäurefrei)
bei 30°C
für 24
Stunden kultiviert. Die hergestellte DNA-Lösung, wie oben beschrieben,
wurde zu 100 ml SD-Medium gegeben, darin war die Konzentration an
DNA 0,5 mg/ml und die vorkultivierten Hefen wurden in einem Massstab
von 1 : 1.000 angeimpft.
-
Die Zahl der Hefezellen wurde durch
spektrofotometrische Messung bei 610 nm der optischen Dichte unter
Verwendung eines HITACHI Spektrofotometers, U-1100, gemessen, nachdem
die Hefen für
24 Stunden auf einem Schüttler
inkubiert worden waren. Tabelle 3 zeigt die Unterdrückung des
Wachstums der Hefen durch die DNA, abgebaute mit dem jeweiligen
Enzym.
-
-
Diese Ergebnisse zeigen, dass die
durch das Restriktionsenzym abgebaute DNA eine schwächere wachstumsunterdrückende Aktivität aufzeigt.
Allerdings war die Aktivität
von DNA, abgebaut durch sowohl EcoRI als auch DNase, grösser als
ohne DNA.
-
Die Daten von Tabelle 3–1 wurden
in der gleichen Weise wie in Tabelle 3 erhalten und zeigen, dass der
antimikrobielle Effekt durch CG-Dinukleotidsequenzen erzielt werden
kann.
-
-
BEISPIEL 4
-
Tests zur Unterdrückung des
Wachstums von filamentösen
Pilzen:
-
Nach Zugabe der DNA, erhalten von
E. coli und von B. natto, zu 5 ml SD-Medium (2,0% Glucose, 0,67 Hefestickstoffquelle,
aminosäurefrei,
pH 5,2), worin die Endkonzentration der DNA 0,2 mg/ml betrug, wurde ein
filamentöser
Pilz, Aspergillus niger (IFO 4034), vorkultiviert im SD-Agarmedium,
mit einer Animpfschlaufe in das SD-Medium, enthaltend die DNA, angeimpft
und bei 30°C
für 12,
24, 36 bzw. 48 Stunden auf einem Schüttler kultiviert.
-
Das Mycel von A. niger wurden nach
Filtration des Kulturmediums durch ein Filterpapier (Advantec Nr. 5)
erhalten und das Nassgewicht (g) des Mycels, das nicht durch das
Papier ging, wurde mit einer Elektrowaage, TOP FX-320, bestimmt.
-
Tabelle 4 zeigt die Wachstumsunterdrückung für jede DNA.
-
-
Diese Ergebnisse zeigen, dass jede
DNA-Probe das Wachstum der Pilze bei 48-stündiger Kultivierung im Gegensatz
zu keiner Zugabe von DNA unterdrückt.
-
BEISPIEL 5
-
Konservierungstest für eine Sosse
für Grillfleisch:
-
2 Vol.-% Wasser wurden zu einer kommerziell
erhältlichen
Sosse für
Grillfleisch, hergestellt von Ebara-Shokuhin Co., Ltd., Japan, gegeben
(die Konzentration an NaCl war nach Zugabe des Wassers 7,3%) und weiterhin
wurden 0,02 oder 0,04% der aus B. natto hergestellten DNA zu der
Sosse gegeben. Um die konservierenden Wirkungen der DNA zu testen,
wurde die Sosse während
der angegebenen Zeit auf 30°C
gehalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
TABELLE
5
- -:
- keine Veränderung;
- +,
- ++: erhöhtes Gasvolumen
-
Es stellte sich heraus, dass die
Zugabe von 0,02 bis 0,04% DNA die Sosse vor Hefen schützt. + zeigt ein
leicht erhöhtes
Volumen, ++ zeigt ein sichtbares erhöhtes Volumen.
-
BEISPIEL 6
-
Eine kommerziell erhältliche
Nudelsuppe (hergestellt von Ninben Co., Ltd., Japan) wurde mit einem 3-fachen
Volumen Wasser verdünnt
(die Konzentration an NaCl war 2,8% nach der Verdünnung).
Die von E. coli hergestellte DNA (beschrieben in Beispiel 2) wurde
zu der Suppe auf ein Niveau von 0,01% bzw. 0,04% gegeben. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 6 gezeigt. TABELLE
6
- -:
- keine Veränderung;
- +:
- Trübung;
- ++:
- Trübung und
erhöhtes
Volumen
-
Die DNA zeigte eine konservierende
Wirkung auf die Nudelsuppe.
-
BEISPIEL 7
-
Tests zur Hemmung des
Wachstums von pathogenen eukaryotischen Mikroorganismen:
-
Die minimal hemmende Konzentration
(MIC) von B. natto DNA und E. coli DNA gegenüber Human-pathogenen eukaryotischen
Mikroorganismen wurde wie in Tabelle 7 gezeigt bestimmt.
-
-
Verwendetes Medium: Kartoffeldextrosemedium
Kultivierungsbedingungen: 25°C,
1 bis 3 Wochen (filamentöse
Pilze) 48 Stunden (Hefen)
-
Es zeigte sich, dass die DNA das
Wachstum von typischen Human-pathogenen eukaryotischen Mikroorganismen
bei Konzentrationen von 0,02 bis 0,04% hemmen kann.
-
In der gleichen Weise wie in Beispiel
7 wurden Tests zur Hemmung des Wachstums von Aflatoxin-produzierenden
eukaryotischen Mikroorganismen durchgeführt und die Ergebnisse sind
in Tabelle 7–1
gezeigt.
-
-
BEISPIEL 8
-
Die hemmende Wirkung der DNA auf
das Wachstum von Pflanzen-pathogenen und Fisch-pathogenen eukaryotischen
Mikroorganismen wurde untersucht und ist in Tabelle 8 dargestellt.
-
-
Verwendetes Medium: Kartoffeldextrosemedium
Kultivierungsbedingungen: 25°C,
7 Tage (Pilze) 48 Stunden (Hefen)
-
Die DNA hemmte das Wachstum von typischen
Pflanzenpathogenen eukaryotischen Mikroorganismen bei einem Niveau
von 0,02 bis 0,03%.
-
BEISPIEL 9
-
Anwendung für Kosmetika
(Konservierungstest für
Haartonikum vom Milchlotionstyp):
-
Ein Haartonikum vom Milchlotionstyp
wurde unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Komponenten
hergestellt. Es wurde in einem offenen System hergestellt, da eine
mikrobielle Infektion aus der Luft erwartet wurde.
| (A)
gereinigtes Jojobaöl | 10,8 |
| Benzylnicotinoat | 2 |
| Lanolin | 2 |
| Isopropylmyristat | 2,5 |
| Polyoxyethylencetylalkohol | 1,8 |
| Sorbitanmonostearat | 0,8 |
| (B)
Triethanolamin | 1 |
| Glycerin | 4 |
| entionisiertes
Wasser | 75 |
| Duftstoffe | geeignete
Menge |
-
Die Ölphase (A) bzw. die wässrige Phase
(B) wurden auf 85°C
erwärmt.
Anschliessend wurden (A) und (B) vermischt und gerührt, um
bei der gleichen Temperatur ein Emulgat zu bekommen. Nachdem die
Mischung auf Normaltemperatur heruntergekühlt worden war, wurde ein Haartonikum
hergestellt.
-
Das hergestellte Haartonikum wurde
in eine Flasche mit 0,03% DNA gegossen. Die Flasche wurde verschlossen
und bei 37°C
für Konservierungstests
aufbewahrt. 0,1% Ethyl-p-hydroxybenzoat
wurde zu dem Haartonikum als Kontrolle anstelle der DNA gegeben.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. TABELLE
9
- +:
- Pilze traten auf
-
Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe
von 0,03% DNA zum Schutz eines Haartonikums vom Milchlotionstyp
gegenüber
Pilzinfektionen wirksam war.
