DE68911279T2 - Kontrolle des Mikrobenwachstums mit Nisin/Lysozym-Formulierungen. - Google Patents
Kontrolle des Mikrobenwachstums mit Nisin/Lysozym-Formulierungen.Info
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Description
- Dies ist eine Continuation-in-Part-Anmeldung der gleichzeitig anhängigen Anmeldung der Seriennr. 287 719, eingereicht am 21. Dezember, 1988.
- Nisin ist ein antimikrobielles Peptid, das von bestimmten Stämmen von Lactococcus lactis (früher Streptococcus lactis) produziert wird. Es wird durch die Reinkultur-Fermentierung dieser Bakterien mit anschließendem Reinigen und Trocknen hergestellt. Erstmals wurde die Verwendung von Nisin als Nahrungsmittelkonservierungsstoff 1951 erwähnt, als es zur Wachstumskontrolle von Clostridium butyricum und c. tyrobutyricum in Käse verwendet wurde (Hirsch et al., 1951, J. Dairy Research 18: 205-206).
- Nisin kommt normalerweise dimer mit einem Molekulargewicht von etwa 7000 vor. Es enthält unter seinen insgesamt 34 Aminosäuren mehrere ungewöhnliche Aminosäuren einschließlich β-Methyllanthionin, Dehydroalanin und Lanthionin. Es gibt fünf ungewöhnliche Thioether-Bindungen in dem Peptid, die zu seiner Stabilität in sauren Lösungen beitragen. Nisin ist eines der am genauesten charakterisierten Bakteriocine und teilt mit anderen Bakteriocinen, z.B. Subtilin und Epidermin [Buchmann et al., 1988, J. Bio. Chem. 263, (31): 16260- 16266] eine bemerkenswerte Homologie in Struktur und Wirkung. Es ist für eine Klasse von Bakteriocinen repräsentativ, die als Lantiotide (Schnell et al., 1988, Nature, 333: 276-278) bezeichnet werden. Neuere Untersuchungen von Nisin, seine physikalischen Eigenschaften und Verwendungen sind in "Bacteriocines of Lactic Acid Bacteria", T. R. Klaenhammer, 1988, Biochimie 70: 337-349; "Nisin", A. Hurst, 1981, Avd. Appl. Microbiol. 27: 85-121; und US-Patent 4 740 593 enthalten. Nisin ist der Sammelname, der mehrere eng miteinander verwandte Substanzen beschreibt, die ähnliche Aminosäurezusammensetzungen und einen ziemlich begrenzten Bereich antibiotischer Aktivität aufweisen. Dieses Phänomen wird von E. Lipinska in "Antibiotics and Antibiosis in Agriculture" (M. Woodbine, Ed.) S. 103-130 beschrieben.
- Die Verwendung von Nisin zur Bekämpfung von L. monocytogenes wurde von M. Doyle berichtet; "Effect of Environmental and Processing Conditions on Listeria Monocytogenes", Food Technology, 1988, 42 (4): 169-171. Diese Literaturstelle beschreibt die anfängliche Wachstumshemmung des Organismus (während etwa 12 Stunden) und berichtet, daß L. monocytogenes bei einem so niedrigen pH-Wert wie 5,0 wachsen kann und gegen alkalischen pH resistent ist, mit der Fähigkeit, bei pH 9,6 wachsen zu können.
- Lysozyme (1,4-β-N-Acetylhexosaminodase, E. C. 3.2.1.17) aus verschiedenen Quellen, sind gut charakterisierte Enzyme. Das zuerst von W. Fleming 1922 entdeckte Eiweißlysozym war unter den ersten der sequenzierten Proteine, unter den ersten, für die eine dreidimensionale Struktur mit Hilfe der Röntgenstrahlen-Kristallographie vorgeschlagen wurde und das erste, für das ein detaillierter Aktionsmechanismus vorgeschlagen wurde. Seine antimikrobielle Aktivität gegen grampositive Bakterien ist gut belegt, z.B. durch V. N. Procter et al. in CRC Crit. Reviews in Food Science and Nutrition, 1988, 26(4): 359-395. Das Molekulargewicht von Eiweißlysozym ist ungefähr 14 300 bis 14 600, der isoelektrische Punkt bei pH 10,5 - 10,7. Es besteht aus 129 Aminosäuren, die über vier Disulfidbrücken untereinander verbunden sind. Ähnliche Enzyme sind aus anderen Quellen isoliert und charakterisiert worden, einschließlich solch unterschiedlicher Erzeuger wie Escherichia coli-Bakteriophage T4 und menschliche Tränen. Trotz geringer Unterschiede (z.B. hat das menschliche Lysozym 130 Aminosäuren) bleibt das Vermögen zur Hydrolyse von Acetylhexosamin-Polymeren im wesentlichen das gleiche.
- Lysozym ist wohlbekannt für das Unterbinden oder Hemmen von Bakterien- und Pilzwachstum und wird in Europa verwendet, um das Wachstum des für den Verderb verantwortlichen Organismus Clostridium tyrobutyricum in Käse zu kontrollieren. Es wurde auch für die Verwendung in einer Vielfalt anderer Nahrungsmittel zur Konservierungsanwendung vorgeschlagen, und es wurde beschrieben, daß es das Wachstum von Listeria monocytogenes hemmt (und in einigen Fällen unterbindet) (Hughey et al, 1987, Appl. Environ. Microbiol. 53: 2165-2170).
- Rekombinante DNA, Proteintechnologie und chemische Modifikationstechnologien können verwendet werden, um feine Modifikationen von Peptiden und Proteinen zu bewirken, um bestimmte Gesichtspunkte der Moleküle zu ändern und eine Expression in neuen Wirten zu gestatten. Z.B. ist die Expression von Nisin in neuen Wirten im US-Patent 4 740 593 beschrieben und die Gene für T4-, menschliches- und Eiweißlysozym ebenso wie für Nisin und andere "Lantiotide" wurden geklont. Menschliches Lysozym ist in Bacillus subtilis und Saccharomyces cerevisiae exprimiert worden. Diese homologen Moleküle (Nisin, Epidermin, Subtilin usw. und T4-, menschliches- und Eiweißlysozym) sollten als gleichbedeutend mit Nisin und Lysozym im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung angesehen werden.
- Während von Nisin und Lysozym gezeigt wurde, daß sie einzeln das Wachstum einiger Bakterien und Pilze hemmen, ist es nicht klar, ob entweder Lysozym oder Nisin allein das Wachstum dieser Mikroorganismen ausreichend hemmen kann, wenn sie in ökonomisch vertretbaren Mengen eingesetzt werden.
- Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren, das Wachstums unerwünschter Mikroorganismen in einer für ihr Wachstum geeigneten Umgebung zu hemmen, umfassend das Hinzufügen einer synergistisch wirksamen Kombination von Nisin und Lysozym zu solch einer Umgebung, in einer Menge, die ausreicht, um solch mikrobielles Wachstum zu hemmen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Beobachtung, daß Nisin und Lysozym in Kombination mit signifikant geringereren Konzentrationen, als jeder Bestandteil allein, verwendet werden können, um den gleichen Grad der Kontrolle über bestimmte Mikroorganismen zu geben. Nisin und Lysozym wurden getrennt in einer Vielfalt von Konservierungsanwendungen von Nahrungsmitteln verwendet, z.B. wurden sie getrennt verwendet, um pathogene Organismen, wie z.B. Clostridium botulinum und zum Verderb führende Organismen, wie z.B. C. tyrobutyricum in Milchprodukten, verarbeiteten Fleischprodukten, Meerestieren, frischen und verarbeiteten Gemüsen, Produkten aus Meerestieren, Gemüse- und Fruchtsäften und Getränken (sowohl nicht alkoholische, als auch alkoholische Getränke) zu kontrollieren. Jedoch hat der Preis dieser Substanzen die kommerzielle Akzeptanz dieser Anwendungen verhindert. Die antimikrobiellen Eigenschaften von Nisin und Lysozym sind auch bei Anwendungen außerhalb des Lebensmittelbereichs nützlich, einschließlich der Kontrolle bestimmter Infektionen bei Mensch und Tier, die Kontrolle mikrobiellen Wachstums in chemischen Einsatzmaterialien und industriellen Produkten und bei Reinigungsanwendungen, wie z.B. Dekontamination von Oberflächen, die mikrobiell kontaminiert sind.
- Eine Vielfalt von Mikroorganismen ist beschrieben worden, die durch Nisin oder Lysozym beeinträchtigt werden. Bei Nisin sind dies in erster Linie grampositive Bakterien, einschließlich einiger Spezies von Clostridia, Bacilli, Lactococci, Staphylococci, Pediococci, Mikrococci, Mikrobakteria und Lactobacilli-Gattungen. Lysozym erwies sich gegen die meisten Bakterien entweder allein oder in Kombination mit anderen Mitteln als wirksam. Eine Vielfalt von Substanzen ist für die Verwendung in Kombination mit Lysozym vorgeschlagen worden. Diese umfassen Chelatbildner, wie z.B. EDTA und Phytinsäure, Butyl-p-hydroxybenzoat, p-Hydroxybenzoesäureester, Aminosäuren, Wasserstoffperoxid und organische Säuren. Diese sind von Procter et al., siehe oben, beschrieben. Die synergistische Kombination von Lysozym mit Benzoesäure oder Sorbinsäure ist in der deutschen Patentanmeldung DE 3704-004, eingereicht am 10. Februar 1987, und für Gallensäure, Phytinsäure oder Betain und eta-Poly-Lysin in der japanischen Patentanmeldung JP 3109762, eingereicht am 28. Oktober 1986, erörtert. Eine baktericide Zusammensetzung, die Glucoseoxidase, Peroxidase, Thiocyanat und Lysozym enthält, wurde in der PCT-Anmeldung W088/102600, veröffentlicht am 21. April, 1988, vorgeschlagen. Knorr et al. berichten über die Verwendung von Lysozym zur Lyse von Hefe. (J. Food Sci., 1979, 44: 1362).
- Der Wirkungsmechanismus von Nisin ist noch nicht bekannt, aber zahlreiche Forscher haben die tödliche Wirkung dieses Peptids mit den irreversiblen Veränderungen in den Zellmembranen der anfälligen Organismen in Verbindung gebracht. Die Widerstandsfähigkeit der meisten Organismen gegen Nisin ist vermutlich auf das Fehlen eines Zugangs des Peptids zu seiner Wirkungsstelle, entweder wegen einer physikalischen Sperre oder wegen des Fehlens geeigneter Rezeptormoleküle, zurückzuführen.
- Der Mechanismus der Zell-Lyse durch n-Acetylhexosaminodasen, wie z.B. Eiweißlysozym, umfaßt die hydrolytische Spaltung des Strukturbestandteils der Zellwand; im Falle der Bakterien, des N-Acetylmuraminsäure-N-acetylglucosmain-Polymers und im Falle von Pilzen des Chitins (ein N-Acetylglucosamin- Polymer). Der Synergismus von Nisin und Lysozym kann daraus resultieren, daß jeder Bestandteil das Substrat für den anderen zugänglicher macht. Beim Abbau des Strukturbestandteils der mikrobiellen Zellwände, kann Lysozym die Zugangsfähigkeit für Nisin an die empfindlichen Zellmembranen steigern, die sonst unter der Zelloberfläche verborgen sind. Basierend auf dem Wirkungsmechanismus dieser antimikrobiellen Stoffe und ihrer bekannten Zielmikroorganismen, kann geschlossen werden, daß das Wachstum vieler grampositiver und gramnegativer Bakterien, sowie bestimmter Pilze gehemmt wird, indem sie der Kombination von Nisin und Lysozym in ähnlicher Weise, wie für L. monocytogenes beschrieben wurde, ausgesetzt werden.
- Unter den problematischen grampositiven Bakterien ist L. monocytogenes eine besondere Plage, weil sie die Fähigkeit hat, bei Kühlschranktemperaturen zu wachsen und wegen ihrer pathogenen Natur, die zu ernsten Folgen führen kann, wenn sie mit der Nahrung aufgenommen wird. In den letzten Jahren war L. monocytogenes in mehrere Fällen mit tödlichem Ausgang verwickelt, besonders bei nachfolgenden Listerioseausbrüchen im Zusammengahng mit Milch, Krautsalat und weichgereiftem Käse. Das US-Centrum für Gesundkeitskontrolle schätzt, daß in den USA über 1600 Fälle von Listeriose auftreten, die in über 400 jährlichen Todesfällen resultieren. Mütter, ungeborene Kinder, neugeborene Kinder und immungeschwächte Personen sind besonders gefährdet. L. monocytogenes-Infektionen können zu Meningitis oder Septikämie führen, wobei 30% der diagnostizierten Fälle tödlich verlaufen.
- Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Befund, daß Nisin und Lysozym in Kombination das Wachstum unerwünschter Mikroorganismen zu einem höheren Grad hemmen, als jeder Stoff für sich allein und daß die kombinierte Hemmwirkung dieser Substanzen größer ist, als die additive Wirkung, wenn Nisin oder Lysozym einzeln verwendet werden. Wird Nisin als antimikrobielles Mittel verwendet, wird im allgemeinen ein Belastungsgrad von 200 bis 300 Internationalen Einheiten (IU) pro Gramm oder mehr des zu behandelnden Substrats empfohlen, um die maximale Wirkung zu erreichen. Ähnlich wird reines Lysozym typischerweise mit einer Belastung von 20 bis 100 Mikrogramm oder mehr pro Gramm des zu behandelnden Materials eingesetzt. Obwohl jedes der Materialien selbst bei diesen hohen Belastungen wirksam sein kann, sind solche Grade für viele Anwendungen ökonomisch nicht tragbar. Der Befund, daß Nisin und Lysozym in Kombination in einer synergistischen Weise wirken, um das Wachstum unerwünschter Mikroorganismen zu hemmen, erleichtert die Verwendung dieser Materialien zur Hemmung von Bakterienwachstum mit größerer Wirksamkeit und Wirtschaftlichkeit als jedes Material für sich.
- In einem typischen Beispiel sollte ein gegen unerwünschtes mikrobielles Wachstum resistent zu machendes Substrat vorzugsweise sowohl Nisin, als auch Lysozym enthalten. Die Gesamtmenge an Nisin des zu behandelnden Materials reicht typischerweise von etwa 25 IU/ml (oder IU/g in Feststoffsystemen) bis zu 2000 IU/ml. Für die meisten Anwendungen ist eine Nisinkonzentration von 100 bis 500 IU/ml ausreichend. Das Verhältnis Nisin:Lysozym (IU/ml:ug/ml) reicht von 9:1 bis 1:2, wobei ein Verhältnis 2:1 bevorzugt ist. Die Konzentrationen in festen Substraten sind die gleichen, außer daß sie vom Bezug auf ein Volumen zum Bezug auf ein Gewicht umgewandelt werden. Eine Oberflächenbehandlung kann durch Suspendieren und Aufbewahren eines zu behandelnden Substrats in der Nisin/Lysozym-Lösung erreicht werden. Alternativ kann das Substrat in die Lösung eingetaucht werden oder es kann auf die Oberfläche des Substrats aufgesprüht werden. Die Nisin/Lysozym-Kombination kann in Folien oder Gelen aufgenommen werden, die auf die Substratoberfläche angewandt werden, oder die Kombination kann direkt in die zu behandelnde Umgebung aufgenommen werden, wie z.B. indem sie zu Milch für die Käsezubereitung hinzugefügt wird. Bei Anwendungen für eine Folienschichtung, wie z.B. Tunken, Filme, Gele oder Ummantelungen, können sich die Ausgangskonzentrationen des Nisins und Lysozyms ihren Löslichkeitsgrenzen nähern, um ein Endprodukt bereitzustellen, das nach der Anbringung und Diffusion Restspiegel an Nisin/Lysozym enthält, die innerhalb der vorgeschriebenen Grenzen liegen. Wenn die Substratoberfläche behandelt wird, können einige Routine-Experimente erforderlich sein, um die wirksamsten Konzentrationen an Nisin/Lysozym festzustellen.
- Die Milchsäurebakterien und insbesondere Lactococcus lactis werden zur Herstellung fermentierter Nahrungsmittelprodukte, wie z.B. Käse, verwendet. Da einige Stämme von L. lactis Nisin produzieren, wurde vorgeschlagen, diese Organismen absichtlich zu einigen Fermentierungen hinzuzufügen, so daß Nisin überall in dem fermentierten Nahrungsmittelprodukt verteilt ist. Ein Hauptpunkt bei diesem Weg ist, daß die erreichten Nisinkonzentrationen variieren oder zu niedrig sein können, um zu wirken. Jedoch ist durch Hinzufügen von Lysozym zu dem fermentierenden Produkt gemäß der vorliegenden Erfindung die Menge des für eine wirksame Kontrolle benötigten Nisins vermindert, so daß die antimikrobielle Wirkung auch bei niedrigen Nisinkonzentrationen verwirklicht ist.
- Die vorliegende Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele verdeutlicht.
- Eine Kultur von Listeria monocytogenes Scott A wurde über Nacht in Brain-Heart-Infusions-Nährbouillon (BHI, Difco Laboratories; Inc.) wachsengelassen. Überschichtungsplatten wurden unter Verwendung von 25 ml BHI-Agar, der mit 4 ml BHI-Agar, enthaltend 10 ul der Übernachtkultur, überschichtet wurde, hergestellt. Sterile, antibiotische Sensibilitätsplättchen wurden mit 10 ul Nisin, Lysozym oder Nisin/- Lysozym-Mischungen bei verschiedenen Konzentrationen betupft, auf die Oberfläche der Überschichtungsplatten gelegt und über Nacht bei 37 ºC inkubiert.
- Es wurde keine Hemmung des Bakterienwachstums mit Nisin bei Konzentrationen von unter 50 IU/ml beobachtet, noch wurde eine Hemmung mit Lysozym bei Konzentrationen bis zu einschließlich 125 ug/ml beobachtet. Wenn eine Lösung mit 50 IU/ml Nisin und 50 ug/ml Lysozym verwendet wurde, war jedoch ein klarer und deutlich sichtbarer Hemmhof um die Plättchen herum zu beobachten. Da die Konzentrationen von Nisin und Lysozym am äußeren Rand des Hemmhofs viel geringer als diejenigen gewesen sein müssen, die ursprünglich auf das Plättchen aufgebracht worden waren, kann man schließen, daß geringe Mengen Nisin und Lysozym synergistisch wirken, um das Wachstum von Lysteria monocytogenes Scott A zu hemmen.
- Eine Kultur von Listeria monocytogenes Scott A wurde über Nacht in BHI-Nährbouillon wachsengelassen und mittels Zentrifugation geerntet. Die geernteten Zellen wurden mit 0,067 M Kaliumphosphatpuffer (pH 6,6) gewaschen und in 0,067 M Kaliumphosphatpuffer bei verschiedenen pH-Wertn bis zu einer Endabsorption von etwa 1,0 bei 540 nm wie in einem Bausch & Lomb Spektrometer 20 nachgewiesen wurde, resuspendiert. Die Lyse der Bakterien wird von einem Absorptionsverlust bei 540 nm begleitet. Nisin und Lysozym wurden zu diesen Lösungen zu den Endkonzentrationen von 100 IU/ml Nisin und 10 ug/ml Lysozym hinzugegeben und die Lösungen wurden in ein 37 ºC Wasserbad gestellt, woraufhin die Absorptionsänderung bei 540 nm überwacht wurde.
- Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Figur 1 graphisch dargestellt. Keine signifikante Änderung trat in einer Nisin- oder Lysozym-freien Kontrolle nach 5 Stunden in Erscheinung. Die Lyse von L. monocytogenes durch Nisin allein lag wenig unterhalb von pH 5,5 oder oberhalb von pH 8,3, wobei das Maximum der Lyse zwischen pH 7 und 8 auftrat. Eine Lyse mit Lysozym allein hatte ihr Maximum bei pH 6,0 - 6,5. Bei pH-Wertn oberhalb von 6,5 wurde eine eindeutige synergistische Wirkung zwischen Lysozym und Nisin mit diesen besonderen Konzentrationen der antimikrobiellen Stoffe beobachtet. Die arithmetische Summe der Lyse durch Nisin und Lysozym ist in der Graphik für Vergleichszwecke aufgeführt. Der Vergleich verdeutlicht die synergistische Wirkung, die durch die Nisin/Lysozym-Kombination hervorgerufen wird.
- Diese Ergebnisse verdeutlichen den Synergismus von Nisin und Lysozym bei verschiedenen pH-Werten, besonders bei den pH-Werten, bei denen die Einzelbestandteile für sich selbst keine antimikrobielle Aktivität haben. Das ist besonders in Systemen, bei denen der pH normalerweise auf niedrigen Werten gehalten wird, wie z.B. in Käse, wichtig. Obwohl der pH von Käse für gewöhnlich niedrig ist, nähern sich die Außenränder von Oberflächen-gereiftem Käse oft der Neutralität, wegen der Wirkung der Reifungsorganismen im Käse. Wenn das auftritt, können in den Nahrungsmitteln entstandene pathogene Keime, wie z.B. L. monocytogenes, auf der Oberfläche des Käserades wachsen. Die Aufnahme von Nisin/Lysozym in den Käse bei den vorher genannten pH-Werten durch Anbringung auf der Oberfläche oder ihr Hinzufügen zu der Milch für den Käse, kontrolliert dieses mikrobielle Wachstum.
- Der L. monocytogenes Scott A-Stamm wurde wie vorher beschrieben, wachsengelassen, gewaschen und in Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,0 resuspendiert. Die Änderung verschiedener Kulturpräparate in der Absorption nach 1 Stunde Inkubation bei 37 ºC, ist in Figur 2 aufgeführt. Aus den in dieser graphischen Darstellung dargestellten Daten kann nachgewiesen werden, daß es möglich ist, signifikant weniger Nisin und Lysozym in Kombination, als von jedem dieser Materialien für sich zu verwenden, um eine gegebene Menge Zell-Lyse zu erreichen.
- Für eine optimale Lyse der Bakterien durch Nisin allein wird eine Nisinkonzentration von etwa 200 IU/ml verlangt. Im Falle des Lysozyms werden Konzentrationen, die 50 ug/ml (im allgemeinen etwa 100 ug/ml) überschreiten, gefordert. Es kann aus Figur 2 bestimmt werden, daß die gleiche Lysegeschwindigkeit, die bei 200 IU/ml Nisin erreicht wird, mit etwa 10 IU Nisin in Kombination mit etwa 25 ug/ml Lysozym erreicht werden kann. Aus Figur 2 kann auch bestimmt werden, daß das Ausmaß der Lyse, das mit weniger als 10 IU/ml Nisin und 25 ug/ml Lysozym erreicht wird, größer ist, als das, was mit 200 IU/ml Nisin oder 50 ug/ml Lysozym, wenn sie einzeln verwendet werden, erreicht wird. Dies ermöglicht eine potentielle, signifikante Kostenersparnis, weil aus historischen Gründen Nisin für etwa den doppelten Preis wie Lysozym verkauft wird. Beide Produkte sind verhältnismäßig teuer durch die Standards für Nahrungsmittelinhaltsstoffe, die die Verwendung von Nisin mit 200 IU/g oder Lysozym mit 100 ug/ml fordern, wodurch sie für viele Anwendungen unerschwinglich teuer sind. Die vorliegende Erfindung stellt Möglichkeiten zur Verfügung, eine signifikante Verminderung in der Verwendung von Nisin und Lysozym zu erreichen, wodurch Behandlungskosten von nur 10% der vorhergesagten Kosten bei alleiniger Nisinverwendung und weniger als 45% der Kosten, die auftreten, wenn Lysozym das einzige antimikrobielle Mittel ist, resultieren.
- L. monocytogenes kann bei 5 ºC wachsen und stellt für einige verarbeitete Fleischsorten eine Bedrohung dar. Seine Kontrolle kann die Verminderung in der Wachstumsgeschwindigkeit, die bakteriostatischen Wirkungen und, was am meisten gewünscht wird, die baktericiden Wirkungen einschließen. Der Synergismus der Nisin/Lysozym-Kombination wurde in einem komplexen Nahrungsmittelsystem (rohe Schweinefleischwurst) unter Verwendung eines hohen Inokulationsgrades (über 10&sup5; Bakterien/Gramm) gezeigt, um den Nutzen der vorliegenden Erfindung unter Schlimmstfall-Bedingungen zu verdeutlichen.
- Rohe Wurst wurde mit L. monocytogenes aus einer BHI Übernachtkultur inokuliert; verschiedene Mengen Nisin und/oder Lysozym wurden in die Wurst hineingebracht. Die behandelte Wurst wurde entweder 3 oder 21 Tage bei 5 ºC gehalten, worauf die lebensfähigen L.monocytogenes gezählt wurden. Ein Modell einer Oberflächen-Antwort wurde über einem Bereich von 0-500 IU/gl Nisin und 0-500 ppm Lysozym errichtet. Das Modell der Oberflächenantwort der Daten nach 3 Tagen ist in der folgenden Figur 3 dargestellt. Die Figur zeigt, daß Lysozym allein für die Kontrolle von L. monocytogenes in diesem Nahrungsmittelsystem unwirksam war, während Nisin allein eine gewisse Hemmwirkung hatte. Die Ergebnisse zeigen signifikant, daß ein Teil des Nisins durch Lysozym bei Aufrechterhaltung des gleichen Kontrollgrades ersetzt werden kann und in einigen Fällen eine signifikant bessere Leistung nur durch die Kombination erreicht wurde. Z.B. zeigt Figur 3, daß keine Menge Nisin oder Lysozym allein in der Lage war, den Listeria-Spiegel auf 5,68 bis 11,6% des Spiegels der unbehandelten Kontrolle in drei Tagen zu vermindern, aber eine Mischung von etwa 300 IU/Gramm Nisin und 75 ppm Lysozym befähigt war, diesen Kontrollgrad zu erreichen. Ähnliche Synergismen zeigen sich bei anderen Mengen von Nisin und Lysozym. Daher können für jeglichen gewünschten Kontrollgrad hohe Nisinkonzentrationen durch signifikant niedrigere Konzentrationen von mit Lysozym kombiniertem Nisin ersetzt werden. Diese Ergebnisse waren unerwartet, besonders da Lysozym allein in diesem Nahrungsmittelsystem unwirksam war.
Claims (14)
1. Verfahren zur Ausschaltung oder Hemmung des Wachstums
unerwünschter Mikroorganismen in einer für ihr Wachstum
geeigneten Umgebung, umfassend das Hinzufügen von einer
synergistisch wirksamen Kombination aus Nisin und
Lysozym zu solch einer Umgebung in einer Menge, die
ausreicht, um solches mikrobielles Wachstum auszuschalten
oder zu hemmen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Lysozym eine
N-Acetylhexosaminodase ist, die aus Hühnereiweiß stammt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Lysozym eine
N-Acetylhexosaminodase ist, die vom Menschen, Rind,
T4-Bakteriophage oder herkömmlichen oder rekombinanten Quellen
stammt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Nisin durch einen
herkömmlichen oder rekombinanten Mikroorganismus
produziert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Nisin durch reine
Kulturfermentation eines Nisin erzeugenden Stammes von
Lactococcus lactis produziert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Mikroorganismus aus
der Gruppe, die aus grampositiven Bakterien,
gramnegativen Bakterien und Pilzen besteht, ausgewählt ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5, worin das Nisin und/oder
Lysozym von einem Nisin und/oder Lysozym erzeugenden
Organismus bereitgestellt wird, der in einer Umgebung
wächst, in der das mikrobielle Wachstum kontrolliert
werden soll.
8. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nisinkonzentration
in der Umgebung, in der mikrobielles Wachstum
kontrolliert werden soll, von 25 IU/ml bis 2000 IU/ml reicht
und das Verhältnis von Nisin:Lysozym von 9:1 bis 1:2
reicht.
9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Nisinkonzentration
von 100 bis 500 IU/ml reicht.
10. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Nisin/Lysozym
Kombination zu einem Nahrungsmittelprodukt hinzugegeben
ist, um das mikrobielle Wachstum darin zu kontrollieren.
11. Verfahren nach Anspruch 1, worin der unerwünschte
Mikroorganismus ein Bakterium der Spezies Listeria
monocytogenes ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, worin L. monocytogenes ein
Scott A Stamm ist.
13. Verfahren zum Kontrollieren des Wachstums von L.
monocytogenes in Nahrungsmitteln, wobei das Verfahren das
Kombinieren solcher Nahrungsmittel mit einer Kombination
aus Nisin/Lysozym umfaßt, worin das Nisin in einer Menge
von 100 bis 500 IU/ml (oder dem Gewichtsäquivalent
davon) zur Verfügung gestellt ist und das Verhältnis von
Nisin:Lysozym von 9 IU/ml:1 ug/ml bis 1 IU/ml:2 ug/ml
reicht.
14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das Verhältnis Nisin
zu Lysozym 2:1 ist.
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